CN1234731C - 具有高度生物活性的人促红细胞生成素的Fc融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本文公开了一类在摩尔基础上，具有与rHuEPO类似或更高生物活性的人EPO的Fc融合蛋白。这类HuEPO-L-vFc融合蛋白含有人EPO、约20个或更少氨基酸的柔性肽接头、和人IgG Fc变体。这种Fc变体无裂解性，且显示极小的不良Fc-介导的副作用。本文还公开了一种高表达水平制备或产生这类融合蛋白的方法。这种HuEPO-L-vFc融合蛋白表现出血清半衰期延长，且生物活性增加，从而改善药物动力学和药效，因此在治疗时间内所需的注射次数较少。

Description

具有高度生物活性的人促红细胞生成素的Fc融合蛋白

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，涉及一种具有高度生物活性的人促红细胞生成素的Fc融合蛋白，及其制法和用途。

背景技术

促红细胞生成素(EPO)是分子量30.4千道尔顿(kDa)的糖蛋白激素，其促进红细胞祖细胞的增生并维持它们分化成成熟的红细胞(参见，如Krantz，Blood，77：419-434，1991)。EPO在成年人的肾和胎儿的肝中产生。在成年人中，EPO主要是肾细胞应答缺氧或贫血而产生的，并在血流中循环。EPO靶向几乎只在骨髓红细胞祖细胞表面上的66kDa的特异性受体(EPO-Rc)。与EPO结合后，受体被激活，并发生同源二聚化，随后发生酪氨酸磷酸化。随后，发生一系列细胞内的信号转导，从而增加祖细胞的数量，祖细胞成熟成红细胞(参见，如Lodish等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，60：93-104，1995)。

重组人EPO(rHuEPO)已广泛应用于在晚期和透析前阶段因肾病引起的慢性贫血患者的治疗中。施用EPO也已成功治疗了患者由癌症的化疗、类风湿性关节炎、HIV感染的AZT治疗和骨髓发育不良综合症所引起的贫血。

正常人血清中的EPO浓度为约0.01到0.03单位/毫升。对EPO产生减少的肾衰竭，补充EPO是一种理想的治疗方法。静脉内注射(i.v.)的rHuEPO的血清清除半衰期约为4到13小时。皮下注射(s.c.)rHuEPO的血清最高浓度为注射后的5到24小时，清除半衰期为17小时。因此，相同剂量皮下注射比静脉内注射在血液中能有更长的保留时间。血清清除EPO的机制依旧不明。在动物试验中，肾排泄了5％都不到。而迅速除去唾液基(asialated)的EPO的肝，未显示在清除EPO中起作用(参见，例如Fried，Annu.Rev.Nutr.15：353-377，1995)。

IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21天。已有报导说将IgG的Fc区域与其它蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合而形成融合蛋白(参见，如Capon等人，Nature，337：525-531，1989；Chamow等人，Trends Bi otechnol.，14：52-60，1996；美国专利No.5,116,964和5,541,087)。原型融合蛋白是通过IgG Fc绞链区中的半胱氨酸残基连接的同源二聚体蛋白质，使蛋白质类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现出与类似同种型的人IgG相当的体外药物动力学特性。这种方法已用于一些临床上很重要的细胞因子(如IL-2和IFN-α2a)和可溶性受体(如TNF-Rc和IL-5-Rc)(参见，如美国专利No.5,349,053和6,224,867)。

然而，迄今为止尚没有既具有半衰期显著延长的令人满意的EPO衍生物。因此，本领域迫切需要开发新的半衰期显著延长且生物活性保留或提高的EPO衍生物。

发明内容

本发明的一方面涉及一种HuEPO-L-vFc融合蛋白。这种HuEPO-L-vFc融合蛋白含有人EPO、肽接头(以L表示)和人IgG Fc变体(以vFc表示)。较佳地，使用约20或更小氨基酸长度的柔性肽和含有或由以下2个或多个氨基酸构成的柔性肽接头：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。IgG Fc变体是非裂解性的，且与天然IgG Fc相比含有氨基酸突变。

本发明的另一实施例为人Ig Fc，它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的绞链区、CH2和CH3区域。这种CH2区域在228、234、235和331位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，从而降低Fc的效应子功能。

在本发明的另一实施例中，公开了一种从哺乳动物细胞系如CHO衍生的细胞系制备或生产这种重组融合蛋白的方法。培养转染的细胞系，使得重组融合蛋白在其生长培养基中在24小时期间以超过10(较佳地为30)μg/106细胞的水平下表达。这些HuEPO-L-vFc融合蛋白显示出高度的体外生物活性和更长的血清半衰期而无不良副作用，从而改善了药物动力学和药效，进而降低了实现类似药效所需的剂量和注射次数。

附图说明

图1显示了人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和它们变体的绞链区和CH2区域的氨基酸序列的比对。比较这三个部分：氨基酸区域228、234-237和330-33 1。用粗斜体显示这些变体的氨基酸突变。将EU编号体系用于氨基酸残基。

图2显示了分别在pEFP表达载体内作为HindIII-EcoRI片段的以下融合蛋白的核苷酸序列及推导的氨基酸序列：(2A)HuEPO-L-vFc_γ2(SEQ ID NO：IDNO：17-18)、(2B)HuEPO-L-vFcγ₄(SEQ ID NO：ID NO：19-20)，和(2C)HuEPO-L-vFc_γ1(SEQ ID NO：ID NO：21-22)。氨基酸残基-27到-1是人EPO的前导肽。成熟蛋白含有人EPO(氨基酸残基1到165)、肽接头(氨基酸残基166到181)和Fc变体(vFc_γ2的氨基酸残基182到409，vFc_γ4的氨基酸残基182到410，和vFc_γ1的氨基酸残基182到408)。在Fc区域中，粗体的核苷酸和相应的氨基酸变体还用下划线标出。

图3显示了HuEPO-L-vFc_γ2与rHuEPO纯化蛋白刺激32D1.9细胞的增殖能力。

图4显示了纯化融合蛋白HuEPO-L-vFc_γ2静脉注射前后对大鼠红细胞计数(RBC)的影响。

图5显示了纯化融合蛋白HuEPO-L-vFc_γ2静脉注射前后对大鼠血红蛋白(Hb)值的影响。

图6显示了纯化融合蛋白HuEPO-L-vFc_γ2静脉注射后大鼠血浆药物浓度-时间曲线。

具体实施方式

通过如本发明所公开的和/或所述那样，制造含有与人IgG蛋白质的Fc区域相连的EPO的融合蛋白，将有利延长EPO的循环半衰期和/或增加它的生物活性。

在大部分已报导的Fc融合蛋白分子中，绞链区作为Fc区域与细胞因子或可溶性受体(氨基末端)间的间隔，使这分子的这两部分功能分开(参见，如Ashkenazi等人，Current Opinion in Immunology，9：195-200，1997)。相对于EPO单体，由两个完整EPO功能域(所述功能域被3-或7-氨基酸肽接头分隔开)构成的融合蛋白显示减弱的活性(Qiu等，J.Biol.Chem.，273：11173-11176，1998)。然而，当两个EPO结构域之间的肽接头长达17个氨基酸时，二聚体EPO分子显示体外和体内活性客观的增强。已显示在小鼠中增强的活性是由于体外活性的增加，并且该活性具有不同的药物动力学特性(参见，例如Sytkowski等人，J.Biol.Chem.，274：24773-24778，1999；美国专利号6,187,564)。在HuEPO和Fc部分间带有合适肽接头的人EPO融合蛋白(HuEPO-L-Fc)具有高度生物活性，即在摩尔基础上，具有与rHuEPO类似或更高的体外生物活性。本发明发现，在人EPO和人IgG Fc变体间添加的肽接头以两种方式提高HuEPO-L-Fc的体外生物活性：(1)使Fc区域远离EPO上的EPO-Rc结合位点，和(2)使一个EPO远离另一个EPO结构域，从而使两个EPO区域能分别与红细胞样细胞祖细胞上的EPO-Rc反应。对本发明而言，优选长度约为20个或更少氨基酸的柔性肽接头。优选是使用包含两个或多个选自以下氨基酸的肽接头：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。

人免疫球蛋白的Fc区域在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。IgG的效应子功能由Fc介导而通过两种主要机制：(1)与细胞表面Fc受体(FcgRs)的结合，导致通过抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)途径，由杀伤细胞通过吞噬作用或裂解作用而摄食病原体，或(2)与第一补体成分Cl的Clq部分的结合，引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG同种型中，IgG1和IgG3能有效地结合FcgR。IgG4与FcgR的结合亲和力比IgG1或IgG3的低一个数量级，而IgG2与FcgR的结合低得难以测定。人IgG1和IgG3还能有效地结合Clq，并激活补体级联反应。人IgG2对补体的固定作用很弱，而IgG4似乎在激活补体级联反应的能力方面相当有缺陷(参见，如Jefferis等人，Immunol.Rev.，163：59-76，1998)。对应用于人的治疗而言，当HuEPO-L-Fc结合于红细胞样细胞祖细胞表面上的EPO-Rc时，融合蛋白的Fc区域必须不能有不良效应子功能，因而不会裂解或除去这些祖细胞。因此，HuEPO-L-Fc的Fc区域必须是非裂解性的，对结合子FcgRs和Clq从而触发效应子功能方面，Fc区域必须是无活性的。显然，没有一种天然的IgG同种型适合产生HuEPO-L-Fc融合蛋白。为了得到非裂解性的Fc，必须使天然Fc区域中的一些氨基酸突变，以减少其效应子功能。

通过比较人和鼠的IgG同种型的氨基酸序列，已显示，CH2区域N末端附近的Fc部分在IgG Fc与FcgRs的结合中起作用。其在234位到237位基序的重要性已用基因工程抗体证明(参见，如Duncan等人，Nature，332：563-564，1988)。氨基酸残基编号是按Kabat等人所述的EU编号体系(《SEQUENCESof PROTEINS of IMMUNOLOGICAL INTEREST》，第5版，United StatesDepartment of Health and Human Services，1991)。在四种人IgG同种型中，IgG1和IgG3与FcgRs的结合最好，且具有相同的序列Leu234-Leu-Gly-Gly237(图1仅显示了IgG1)。在以低亲和力与FcgRs结合的IgG4中，其序列含有单个氨基酸取代，即在234位上Phe取代Leu。在不结合FcgRs的IgG2中，有两个取代和一个删除，从而形成Va1234-Ala-Gly237(图1)。为了减少Fc与FcgR的结合和ADCC活性，用Ala替代IgG4中的Leu235(参见，如Hutchins等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：11980-11984，1995)。在此基序中已用IgG2序列中的Pro233-Val-Ala235替代Glu233-Leu-Leu235来改变IgG1。这种替代使IgG1变体在小鼠中失去了FcgR-介导的除去靶细胞的能力(参见，如Isaacs等人，J.Immunol.，161：3862-3869，1998)。

对FcgR与Clq结合至关重要的第二部分位于人IgG的CH2区域羧基端附近(参见，如Duncan等人，Nature，332：738-740，1988)。在四种人IgG同种型中，这部分中仅有一个位点显示取代：IgG4中的Ser330和Ser331替换了IgG1、IgG2和IgG3中的Ala330和Pro331(图1)。Ser330的存在不影响FcgR与Clq的结合。用Ser替代Pro331使IgG1失去了与Clq的结合亲和力，而用Pro替代Ser331部分保留了IgG4的补体固定活性(参见，如Tao等人，J.Exp.Med.，178：661-667，1993：Xu等人，J.Biol.Chem.，269：3469-3474，1994)。

我们发现，可以设计至少三种Fc变体(vFc)用于产生HuEPO-L-vFc融合蛋白(图1)。人IgG2不结合FcgR，但显示出弱的补体活性。具有Pro331Ser突变的Fc_γ2变体应比天然Fc_γ2的变体活性更低，而且仍旧不结合于FcgR。IgG4 Fc在激活变体级联中有缺陷，且它与FcgR的结合亲和力比活性最高的同种型(IgG1)低约一个数量级。与天然Fc_γ4相比，具有Leu235Ala突变的Fc_γ4变体应表现出最小化的效应子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fc_γ1也表现出比天然Fc_γ1低得多的效应子功能。这些Fc变体都比天然存在的人IgG Fc更适于制备EPO融合蛋白。在非裂解Fc的制备中也可引入其它替换，而不危及循环半衰期或导致不良的构型变化。

本发明有许多优点。血清中HuEPO-L-vFc融合蛋白的高度活性和存在时间的延长，能减低剂量以及减少注射的频率。血清中药物浓度波动的减少已意味着安全性和耐受性的改善。注射频率的减低能使患者有更好的顺应性和生活品质。因此具有非裂解Fc变体的HuEPO-L-vFc融合蛋白能显著地有助于治疗包括肾衰竭、癌症化疗、类风湿性关节炎、HIV感染的AZT治疗和脊髓发育不良综合征等病况导致的贫血。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.构建编码HuEPO-L-vFc融合蛋白的基因

1.1构建编码HuEPO-L-vFc_γ2融合蛋白的基因

融合蛋白是用数个DNA片段装配而成的。为了获得编码人EPO的前导肽和成熟蛋白的基因，用人肾的cDNA文库(从Invitrogen，Carlsbad，CA获得)作为聚合酶链式反应(PCR)的模板。为了便于克隆，将引入限制性酶内切位点(HindIII)的SEQ ID NO：1用作5’寡核苷酸的引物。表1列出了用于克隆HuEPO-L-vFc融合蛋白的寡核苷酸序列。

表1.寡核苷酸序列

SEQ ID NO：1	5’-cccaagcttggcgcggagatgggggtgca-3’
		SEQ ID NO：2	5’-cggatccgtcccctgtcctgcaggcct-3’
SEQ ID NO：3	5’-gagcgcaaatgttgtgtcga-3’
		SEQ ID NO：4	5’-ggaattctcatttacccggagacaggga-3’
SEQ ID NO：5	5’-tggttttctcgatggaggctgggaggcct-3’
		SEQ ID NO：6	5’-aggcctcccagcctccatcgagaaaacca-3’
SEQ ID NO：7	5’-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagagcgcaaatgttgtgtcga-3’
		SEQ ID NO：8	5’-gagtccaaatatggtccccca-3’
SEQ ID NO：9	5’-ggaattctcatttacccagagacaggga-3’
		SEQ ID NO：10	5’-cctgagttcgcggggggacca-3’
SEQ ID NO：11	5’-gagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacc tgagt tcgcggggggacca-3’
		SEQ ID NO：12	5’-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagagtccaaatatggtccccca-3’
SEQ ID NO：13	5’-gacaaaactcacacatgccca-3’
		SEQ ID NO：14	5’-acctgaagtcgcggggggaccgt-3’
SEQ ID NO：15	5’-gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagtcgcggggggaccgt-3’
		SEQ ID NO：16	5’-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagacaaaactcacacatgccca-3’

3’引物(SEQ ID NO：2)除去了EPO末端密码子并引入了BamHI位点。将得到的长度约为600bp的DNA片段插入到接受载体(pUC19)的HindIII和BamHI位点，得到pEPO质粒。由DNA测序验证人EPO基因的序列。

用从人白细胞制备的RNA和合适的5’(SEQ ID NO：3)和3’(SEQ ID NO：4)引物，通过逆转录和PCR得到编码人IgG2的Fc区域(Fc_γ2)的基因。将得到的含有IgG2的绞链、CH2和CH3区域完整序列的Fc_γ2的DNA片段作为模板，产生Fc_γ2Pro33lSer(vFc_γ2)变体，其中Fc_γ2中331位的Pro被Ser替代。为了引入此突变，产生两个片段，然后用天然Fc_γ2作为模板在重叠PCR中将它们装配起来。用SEQ ID NO：3作为5’引物并用SEQ ID NO：5作为3’引物生成5’片段。用SEQ ID NO：6作为5’引物并用SEQ ID NO：4作为3’引物生成3’片段。然后用SEQ ID NO：7作为5’引物和SEQ ID NO：4作为3’引物，将这两个片段在覆盖Pro331Ser突变的区域连接起来。SEQ ID NO：7引物含有编码16氨基酸Gly-Ser肽接头(包括BamHI限制性内切酶位点)的序列。将得到的长度约为700bp的DNA片段插入接受载体(pUC19)的BamHI和EcoRI位点，得到pL-vFc_γ2质粒。用DNA测序验证该基因的序列。

为了制备HuEPO-L-vFc_γ2融合基因，用HindIII和BamHI从pEPO质粒上切下EPO片段，然后用琼脂糖凝胶电泳纯化。然后将纯化的片段插入pL-vFc_γ2质粒肽接头的5’末端，得到pEPO-L-vFc_γ2质粒。该融合基因含有HuEPO、Gly-Ser肽接头和Fc_γ2变体基因。

在EPO和Fc部分间存在的肽接头，增加了EPO区域的柔性，因而提高了其生物活性(见例如Sytkowski等，J.Biol.Chem.274：24773-8，1999)。对本发明而言，优选的是长度为约20个或更少氨基酸的肽接头。可使用含有2个或更多选自以下氨基酸的肽接头：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。一种肽接头的例子含有Gly-Ser肽构件，如GlyGl yGlyGlySer。图2A显示了融合基因(SEQ ID NO：17)，它含有编码HuEPO序列、16个氨基酸的肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGly GlySerGLyGlyGlyGlySer)和Fc_γ2Pro331Ser变体的序列(SEQ ID NO：18)。

然后将编码HuEPO-L-vFc融合蛋白的完整基因插入哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位点。最终的表达载体质粒(称为pEFP2)含有在哺乳动物细胞中高水平表达所需的巨细胞病毒早期基因启动子-增强子。该质粒还含有可选择性标记基因，从而在细菌中赋予氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中赋予G418抗性。另外，当宿主细胞DHFR基因表达缺陷时，pEFP2表达载体含有二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase，DHFR)基因，从而能在氨甲蝶呤(Methotrexate，MTX)存在下共扩增HuEPO-L-vF_γ2融合基因和DHFR基因(见例如美国专利No.4,399,216)。

1.2  编码HuEPO-L-vFc_γ4融合蛋白的基因的构建

由于绞链区域中重链间二硫键的解离，人IgG4部分会形成被视为半抗体的分子。而这种情况在其它三种人IgG同种型中却没有观察到。用Pro(在IgG1和IgG2中的该位置发现的残基)替代Ser228的单氨基酸取代，导致IgG4完整的抗体分子(参见，例如Angal等人，Molec.Immunol.，30：105-108，1993；Owens等人，Immunotechnology，3：107-116，1997；美国专利No.6,204,007)。含有Leu235Ala突变以降FcγR结合的Fc_γ4变体，加上Ser228Pro突变，也会产生这种同型的融合蛋白制备物。

用从人白细胞制备的RNA和合适的5’引物(SEQ ID NO：8)和3’引物(SEQID NO：9)，通过逆转录和PCR得到编码人IgG4的Fc区域(Fc_γ4)的基因。将得到的含有IgG4的绞链、CH2和CH3区域完整序列的Fc_γ4的DNA片段作为模板，产生Ser228Pro和Leu235Ala突变的Fc_γ4变体(vFc_γ4)，其中Ser228和Leu235分别被Pro和Ala替代。用3’引物(SEQ ID NO：9)和含有Leu235Ala突变的5’引物(SEQ ID NO：10)扩增CH2和CH3区域。用SEQID NO：12作为5’引物和SEQ IDNO：9作为3’引物，在PCR中将这种扩增的片段与合成的长度为60个碱基且含Ser228Pro和Leu235Ala突变的寡核苷酸(SEQ ID NO：11)连接起来。SEQ IDNO：12引物含有编码16氨基酸Gly-Ser肽接头(包括BamHI位点)的序列。将得到的长度约为700bp的DNA片段插入接受载体(pUC19)的BamHI和EcoRI位点.得到pL-vFc_γ4质粒。用DNA测序验证该基因的序列。

为了制备HuEPO-L-vFc_γ4融合基因，用HindIII和BamHI从pEPO质粒上切下HuEPO片段，然后插入pL-vFc_γ4质粒肽接头的5’末端，得到pEPO-L-vFc_γ4质粒。此融合基因含有HuEPO、16个氨基酸的Gly-Ser肽接头和Fc_γ4变体基因，然后将其插入哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位点(如HuEPO-L-vFc_γ2融合蛋白所述)。将这种最终表达的载体质粒命名为pEFP4。图2B显示了融合基因(SEQID NO：19)，它含有编码HuEPO、16个氨基酸的肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)、和具有Ser228Pro和Leu235Ala突变的Fc_γ4变体(SEQ ID NO：20)的融合基因。

1.3构建编码HuEPO-L-vFc_γ1融合蛋白的基因

人IgG1重链的绞链区域含有包括3个半胱氨酸的15个氨基酸残基(GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysPro)。在这3个半胱氨酸残基中，第2和第3个参与两个重链间二硫键的形成。第1个半胱氨酸残基参与与IgG轻链的二硫键结合。由于Fc融合蛋白分子中不存在轻链，该半胱氨酸残基可能与其它半胱氨酸残基配对，而导致非特异性二硫键合。可以将Fc、1的绞链区域切短，以消除第1个半胱氨酸残基(AspLysThrHisThrCysProProCys Pro)。用从人白细胞制备的RNA和合适的5’引物(SEQ ID NO：13)和3’引物(SEQ ID NO：4)，通过逆转录和PCR得到编码Fc_γ1区域的基因。将得到的含有Fc_γ1截短的绞链区域和CH2及CH3完整序列的DNA片段用作模板，产生具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro33 lSer突变的Fc_γ1变体(vFc_γ1)。

一种引入这些突变的方法如下：产生两个片段，然后用天然Fc_γ1作为模板在重叠PCR中将它们装配起来。用SEQ ID NO：14作为5’引物并用SEQ IDNO：5作为3’引物生成5’片段。此5’引物含有Leu234Val、Leu235Ala突变，3’引物含有Pro331Ser突变。用SEQ ID NO：6作为5’引物并用SEQ ID NO：4作为3’引物生成3’片段。然后用SEQ ID NO：14作为5’引物和SEQ ID NO：4作为3’引物，将5’和3’片段在覆盖Pro33 1Ser突变的区域连接起来。用SEQ IDNO：16作为5’引物、SEQ ID NO：4作为3’引物，通过PCR将此扩增的长度约650bp的片段和合成的55碱基的寡核苷酸(SEQ ID NO：15)(含有Leu234Val和Leu235Al a)连接起来。SEQ ID NO：16引物含有编码16个氨基酸Gly-Ser肽接头(包括BamHI位点)的序列。将得到的长度约为700bp的DNA片段插入接受载体(pUC19)的BamHI和EcoRI位点，得到pL-vFc_γ1质粒。用DNA测序验证该基因的序列。

为了制备HuEPO-L-vFc_γ1融合基因，用HindIII和BamHI从pEPO质粒上切下EPO片段，然后插入pL-vFc_γ1质粒肽接头的5’末端，得到pEPO-L-vFc_γ1质粒。此融合基因含有HuEPO，16个氨基酸Gly-Ser肽接头和Fc_γ1变体基因，然后将其插入哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位点(如对HuEPO-L-vFc_γ2融合蛋白所述)。将这种最终表达的载体质粒命名为pEFP1。图2C显示了融合基因(SEQ ID NO：21)，它含有编码HuEPO、16个氨基酸肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)、和具有Ser234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fc_γ1变体(SEQ ID NO：22)的融合基因。

实施例2.在转染的细胞株中融合蛋白的表达

将重组pEFP1、pEFP2或pEFP4表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞株，以表达HuEPO-L-vFc融合蛋白。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞株是DHFR酶缺陷的CHO细胞(参见，例如美国专利No.4,818,679)。一种优选的转染方法是电穿孔。也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉淀、脂转染和原生质融合。在电穿孔中，用设置为250V电场和960μFd电容的GenePulser Electroporator(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，在比色杯内的2-5×10⁷个细胞中加入10μg用BspCI线性化的质粒DNA。在转染2天后，将培养基改成含0.18mg/ml G418的生长培养基。用抗人IgG Fc ELISA，测试对选定药物具有抗性的转染子是否分泌融合蛋白。也可用抗-HuEPO试验，通过ELISA进行表达的融合蛋白的定量分析。通过在96孔板上极限稀释，亚克隆产生高水平Fc融合蛋白的孔。

为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，转染的融合蛋白基因与DHFR基因共扩增。能在高达1μg/ml MTX培养基中生长的转染子，再次通过极限稀释法进行亚克隆。通过测定分泌率，对亚克隆的细胞株进行进一步的分析。分泌率水平超过约10(较佳地约30)μg/10⁶(即百万)个细胞/24小时的细胞株，适合使用无血清生长培养基的悬浮培养。然后用条件培养基纯化融合蛋白。其中之一细胞株，定号E1-6，可以20μg/10⁶(百万)个细胞/24小时的速率分泌HuEPO-LvFC_γ2。将此细胞株在100毫升之旋转培养瓶逐步适应成悬浮细胞培养。十天后，培养液内之融合蛋白之浓度可累积至约200微克/毫升(μg/ml)。培养液内HuEPO-L-vFc_γ2融合蛋白之浓度用酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量分析测定，以纯化之HuEPO-L-vFc_γ2融合蛋白作标准溶液。E1-6经单细胞亚克隆后，得一亚细胞株，定号E1-6-A18，分泌HuEPO-L-vFc_γ2的速率可达38μg/10⁶(百万)个细胞/24小时。

糖侧链接构对于EPO的体内活性是关键的。Asn-连接的碳水化合物的末端糖链含有唾液酸，重复的聚-N-乙酰乳糖酰胺和半乳糖。已知在一些哺乳动物细胞，例如NSO细胞中表达的重组HuEPO，得到的是具有低唾液酸含量的蛋白质。除去唾液酸会导致暴露次末的半乳糖残基，这提高了肝脱唾液酸糖蛋白结合性凝集素的亲和力。该捕获途径导致在整个动物内测量的体内生物活性下降。在CHO细胞中产生的重组HuEPO显示与天然EPO中发现的非常相似的糖基化模式(见例如Takeuchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：7819-22，1989)。根据本发明表达和生产的HuEPO-L-vFc融合蛋白，在摩尔基础上，具有最少与rHuEPO类似的体外生物活性。

实施例3.融合蛋白的纯化和定性

用1N NaOH将含有融合蛋白的条件培养基滴定到pH7到8，然后用0.45微米的硝酸纤维素过滤器过滤。将滤液加样到磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡的Prosep A柱上。待融合蛋白结合于Prosep A后，弃去流穿组分。用PBS洗涤该柱，直到280nm处的OD值低于0.01。然后用0.1M pH3.75的柠檬酸缓冲液洗脱结合的融合蛋白。用0.4体积的1M K₂HPO₄中和，合并含有纯化蛋白的组分，并用PBS透析。然后溶液用0.22微米的硝酸纤维素过滤器过滤，并存储在4℃。在非还原条件下，由SDS-PAGE测得纯化的HuEPO-L-vFc蛋白质的分子量范围为120到140kDa。在还原条件下，纯化的蛋白迁移至约65kDa。HPLC分析显示无显著聚合物存在。用BSA作为标准，通过BCA蛋白质分析定量该融合蛋白。

实施例4.体外生物分析

体外生物活性可以转染子或纯化蛋白质刺激32D1.9细胞的增殖能力测定之。32D1.9细胞为表达人EPO-Rc转殖基因的小鼠细胞。如同TF-1细胞(Kitamura等，J.Cell.Physiol.，140：323-334，1989)，32D1.9细胞在其表面表达EPO-Rc，并对EPO反应。将细胞维持在生长培养基(RPMI-1640培养基，含有10％FCS和1-5ng/ml人IL-5)。收集对数期的32D1.9细胞，并用分析培养基洗涤(不含人IL-5的生长培养基)。将每份共1×10⁴个细胞的32D1.9细胞样品(50μ.l)加到96孔组织培育板的各孔中。用50μl含有0.001-30 nM各种浓度HuEPO-L-vFc融合蛋白或rHuEPO对照的分析培养基培养这些细胞。在37℃、5％CO₂湿润培养箱中培养该平板4天，然后在各孔中添加10μl噻唑兰(Methylthiazolylphenyl-tetrazolium bromide，MTT，用PBS配制成2.5mg/ml)。然后在各孔中添加10μl MTT(用PBS配制成2.5g/ml)。4小时后，在每孔中加入100μl 10％SDS的0.01N HCl，以溶解细胞和所形成的Formazan。然后在550nm对该平板进行光密度读数，其中参考光束设为690nm。OD读数相对于rHuEPO或融合蛋白的浓度作图。S形曲线的拐点表示产生50％最大效果(ED50)的浓度。因此可使HuEPO-L-vFc与rHuEPO的生物活性定量地相对比较。图3显示了HuEPO-L-vFc_γ2与rHuEPO纯化蛋白刺激32D1.9细胞的增殖能力。按摩尔计，重组融合蛋白表现出与rHuEPO类似的体外生物活性，约为3-4×10⁶单位/μmol。

HuEPO-L-vFc的体外生物活性也可以转染子或纯化蛋白悬浮液刺激人骨髓祖细胞增生和分化形成红血细胞集落(集落形成单位-红细胞样细胞(CFU-E))的能力来测试。方法如下。洗涤用Ficoll-Pague离心的人骨髓的低密度细胞，并以1×10⁶细胞/ml悬浮在含有5％FCS的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)中。在37℃和5％CO₂下，将这些细胞在组织培育皿中培养过夜，以除去所有粘附的细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞)。然后将悬浮液中的细胞调节成1×10⁵细胞/ml含5％FCS的IMDM。混合0.3ml细胞、15微升20μg/ml干细胞因子、2.4ml甲基纤维素和0.3ml含数种浓度HuEPO-L-vFc(或rHuEPO对照)的培养基，以便分析。将1ml这种细胞混合物置于35-mm培养皿上。然后将此培养皿置于37℃、5％CO₂中保持10-14天，然后计数集落量。与rHuEPO的浓度相对，可以对HuEPO-L-vFc浓度作剂量反应曲线图。

实施例5.大鼠中体内药物动力学研究

5.1实验方法：

平均体重约为200公克的雄性SD大鼠100只，给药前从眼眶静脉采血，测红细胞计数(RBC)及血红蛋白(Hb)值。选取RBC值相近的57只大鼠作为实验动物，每三只为一组，其中一组作为空白对照组，给予生理盐水0.25ml/kg，其余18组作为给药组，静脉注射HuEPO-L-vFc_γ2纯化融合蛋白100mg/kg大鼠体重。在第十天再次采血，分别在采血前1min、2.5min、5min、10min、20min、1h、2h、4h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d给药。在腹主动脉采血3ml，其中2ml全血3500 rpm离心15min，取血清0.5ml，在-70℃冷冻储藏直到测药物浓度。给药2天至10天的动物取其余的1ml全血进行血液学检测，所得结果与对照组相比，经t检验检查给药前后不同时间RBC及Hb值的变化差值有否显著性差异。

5.2 HuEPO-L-vFc_γ2给药前后对红细胞计数(RBC)的影响：试验结果表明，纯化融合蛋白HuEPO-L-vFc_γ2静脉注射后，红细胞计数在给药后随时间而增加，在第5天起与对照组差异显著(P＜0.1)，如表2与图4。

表2、HuEPO-L-vFc_γ2给药对RBC的影响(10⁶细胞/微升；±s，n＝3)

组别	给药前	给药后	差值
				对照组	6.11±0.10	6.88±0.60	0.78±0.52
48h	6.10±0.06	7.05±0.30	0.95±0.34
				72h	6.10±0.16	6.59±0.23	0.49±0.38
96h	6.09±0.04	7.18±0.54	1.09±0.58
				120h	6.04±0.15	7.66±0.30	1.62±0.22*
144h	6.10±0.16	7.35±0.16	1.25±0.02
				168h	6.07±0.22	7.47±0.06	1.40±0.27
192h	6.09±0.14	7.84±0.06	1.75±0.09**
				216h	6.09±0.10	7.59±0.08	1.50±0.08*
240h	6.08±0.17	8.00±0.26	1.92±0.10**

^*P＜0.1，^**P＜0.05与对照组比较

5.3  HuEP0-L-vFc_γ2给药前后对血红蛋白(Hb)的影响：试验结果表明，纯化融合蛋白HuEPO-L-vFc_γ2静脉注射后，血红蛋白有明显的增加，在第72小时后与对照组差异显著(P＜0.1)，如表3与图5。

表3、HuEPO-L--vFc_γ2给药对Hb的影响(公克/公升；±s，n＝3)

组别	给药前	给药后	差值
				对照组	140±2.52	151±8.9	10.7±8.4
48h	134±2.09	158±6.4	24.0±8.2
				72h	143±10	158±3.5	15.0±13.2*
96h	139±1.5	167±12.1	28.3±10.7*
				120h	141±5.7	176±4.2	35.0±5.0**
144h	139±2.7	166±1.2	27.3±2.5**
				168h	140±2.3	170±8.9	29.7±6.7**
192h	141±3.1	183±1.2	42.0±2.0***
				216h	139±3.6	172±2.5	32.7±4.0**
240h	139±7.2	185±3.8	45.3±6.0***

^*P＜0.1，^**P＜0.05，^***P＜0.01与对照组比较

5.4血浆药物浓度和药物代谢动力学

血浆中的HuEPO-L-vFc_γ2融合蛋白以抗HuEPO与抗人IgG Fc试剂，通过ELISA进行定量分析。表4为测定的血浆药物浓度-时间关系。血浆药物浓度与时间的关系曲线见图6。将资料常规方法计算得到HuEPO-L-vFc_γ2的药物代谢动力学参数，结果见表5。根据数次计算，本品的药物代谢动力学特性符合两室模型，权重以1/c为好。故按血药浓度计算时，HuEPO-L-vFc_γ2融合蛋白的t_1/2α和t_1/.2β分别为0.63小时和14.16小时。在大鼠试验中，静脉注射rHuEPO的t_1/2β约为2到3小时(参见，如Spivak等人，Blood，73：90-99，1989；Fukuda等人，Blood，73：84-89，1989；Kinoshita等人，Arzneimittel forschung，42：174-178，1992)。试验结果表明了在大鼠中，HuEPO-L-vFc_γ2的血清清除半衰期比rHuEPO增长许多。

表4、静脉注射HuEPO-L-vFc_γ2后血浆药物浓度测定值

给药后时间	血浆药物浓度(ng/ml)
						大鼠1	大鼠2	大鼠3	平均值±标准差	校正值
	1Min.	2989	2654	2282	2641.7±353.7						2624.5
2.5Min.						2866	2614	2170	2550.0±352.4	2532.9
	5Min.	2866	2747	2974	2862.3±113.5						2845.2
10Min.						2790	2635	2419	2614.7±186.3	2597.5
	20Min.	2549	2384	2798	2577.0±208.4						2559.9
1Hr.						1244	1545	1694	1494.3±229.2	1477.2
	2Hr.	1149	1067	1134	1116.7+43.7						1099.5
4Hr.						1108	1054	1182	1114.7±64.3	1097.5
	1天	250	240	288	259.3±25.3						242.2
2天						103	170	100	124.3±39.6	107.2
	3天	98	44	109	83.7±34.8						66.5
4天						56	44	63	54.3±9.6	37.2
	5天	24	26	16	22.0±5.3						4.9
6天						30	33	35	32.7±2.5	15.5
	7天	16	17	15	16.0±1.0						-1.1
8天							19	20	19.5±0.7	2.4
	9天	19		13	16.0±4.2						-1.1
10天						22	14	15	17.0±4.4	-0.1

表5、静脉注射HuEPO-L-vFc_γ2的药代动力学参数(两室模型，权重1/c)

参数	单位	值	标准误差(S.E.)
				A	ng/ml	1743.15	220.29
α	1/hr	1.1019	0.3856
				B	ng/ml	1072.20	207.27
β	1/hr	0.04894	0.00829
				V(c)	(μg/kg)/(ng/ml)	0.00710
t1/2α	hr	0.6291
				t1/2β	hr	14.1632
AUC	ng.hr/ml	23490.4
				CL(s)	μg/kg/hr/(ng/ml)	0.0085

r＝0.9927

以上实施例仅起说明的作用。不能也不应将它们视为对本发明范围或精神的限制。本领域技术人员可以理解对于本发明的目的而言，可使用其它变化或替代形式，而本发明的目的仅由本说明书和所附权利要求书定义。

                            序列表

<110>旭华(上海)生物研发中心有限公司

<120>具有高度生物活性的人促红细胞生成素的Fc融合蛋白

<130>030297

<160>22

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

cccaagcttg gcgcggagat gggggtgca                                        29

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

cggatccgtc ccctgtcctg caggcct                                          27

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<223>引物

<400>3

gagcgcaaat gttgtgtcga                                                  20

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>引物

<400>4

ggaattctca tttacccgga gacaggga                                         28

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<223>引物

<400>5

tggttttctc gatggaggct gggaggcct                                        29

<210>6

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<400>6

aggcctccca gcctccatcg agaaaacca                                        29

<210>7

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<223>引物

<400>7

cggatccggt ggcggttccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcag agcgcaaatg      60

ttgtgtcga                                                              69

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<223>引物

<400>8

gagtccaaat atggtccccc a                                                21

<210>9

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<223>引物

<400>9

ggaattctca tttacccaga gacaggga                                         28

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<223>引物

<400>10

cctgagttcg cggggggacc a                                                21

<210>11

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

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<400>11

gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcgc ggggggacca      60

<210>12

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>12

cggatccggt ggcggttccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcag agtccaaata      60

tggtccccca                                                             70

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<223>引物

<400>13

gacaaaactc acacatgccc a                                                21

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>引物

<400>14

acctgaagtc gcggggggac cgt                                              23

<210>15

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>15

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag tcgcgggggg accgt           55

<210>16

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>16

cggatccggt ggcggttccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcag acaaaactca      60

cacatgccca                                                             70

<210>17

<211>1332

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1332)

<223>HuEPO-L-vFcγ2的核苷酸序列

<400>17

aagcttggcg cggagatggg ggtgcacgaa tgtcctgcct ggctgtggct tctcctgtcc      60

ctgctgtcgc tccctctggg cctcccagtc ctgggcgccc caccacgcct catctgtgac     120

agccgagtcc tggagaggta cctcttggag gccaaggagg ccgagaatat cacgacgggc     180

tgtgctgaac actgcagctt gaatgagaat atcactgtcc cagacaccaa agttaatttc     240

tatgcctgga agaggatgga ggtcgggcag caggccgtag aagtctggca gggcctggcc     300

ctgctgtcgg aagctgtcct gcggggccag gccctgttgg tcaactcttc ccagccgtgg     360

gagcccctgc agctgcatgt ggataaagcc gtcagtggcc ttcgcagcct caccactctg     420

cttcgggctc tgggagccca gaaggaagcc atctcccctc cagatgcggc ctcagctgct     480

ccactccgaa caatcactgc tgacactttc cgcaaactct tccgagtcta ctccaatttc     540

ctccggggaa agctgaagct gtacacaggg gaggcctgca ggacagggga cggatccggt     600

ggcggttccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcag agcgcaaatg ttgtgtcgag     660

tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa     720

cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg     780

agccacgaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat     840

gccaagacaa agccacggga ggagcagttc aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc     900

accgttgtgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa     960

ggcctcccag cctccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aagggcagcc ccgagaacca    1020

caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc    1080

tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag    1140

ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc cttcttcctc    1200

tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc    1260

gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt    1320

aaatgagaat tc                                                        1332

<210>18

<211>436

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(436)

<223>HuEPO-L-vFcγ2的氨基酸序列

<400>18

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                 60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                150                  155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

        195                 200                 205

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

    210                 215                 220

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

225                 230                 235                 240

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

                245                 250                 255

His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

            260                 265                 270

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

        275                 280                 285

Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn

    290                 295                 300

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Ser

305                 310                 315                 320

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

                325                 330                 335

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

            340                 345                 350

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

        355                 360                 365

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Ash Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

    370                 375                 380

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

385                 390                 395                 400

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

                405                 410                 415

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

            420                 425                 430

Ser Pro Gly Lys

        435

<210>19

<211>1335

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1335)

<223>HuEPO-L-vFcg4的核苷酸序列

<400>19

aagcttggcg cggagatggg ggtgcacgaa tgtcctgcct ggctgtggct tctcctgtcc    60

ctgctgtcgc tccctctggg cctcccagtc ctgggcgccc caccacgcct catctgtgac   120

agccgagtcc tggagaggta cctcttggag gccaaggagg ccgagaatat cacgacgggc   180

tgtgctgaac actgcagctt gaatgagaat atcactgtcc cagacaccaa agttaatttc   240

tatgcctgga agaggatgga ggtcgggcag caggccgtag aagtctggca gggcctggcc   300

ctgctgtcgg aagctgtcct gcggggccag gccctgttgg tcaactcttc ccagccgtgg   360

gagcccctgc agctgcatgt ggataaagcc gtcagtggcc ttcgcagcct caccactctg   420

cttcgggctc tgggagccca gaaggaagcc atctcccctc cagatgcggc ctcagctgct   480

ccactccgaa caatcactgc tgacactttc cgcaaactct tccgagtcta etccaatttc   540

ctccggggaa agctgaagct gtacacaggg gaggcctgca ggacagggga cggatccggt   600

ggcggttccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcag agtccaaata tggtccccca   660

tgcccaccat gcccagcacc tgagttcgcg gggggaccat cagtcttcct gttcccccca   720

aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac   780

gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat   840

aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc   900

ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac   960

aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagag  1020

ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg  1080

acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg  1140

cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc  1200

ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc  1260

tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg  1320

ggtaaatgag aattc                                                   1335

<210>20

<211>437

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(437)

<223>HuEPO-L-vFcg4的氨基酸序列

<400>20

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Ash Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr I1e

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

        195                 200                 205

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

    210                 215                 220

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

225                 230                 235                 240

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

                245                 250                 255

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

            260                 265                 270

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

        275                 280                 285

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

    290                 295                 300

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

305                 310                 315                 320

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

                325                 330                 335

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

            340                 345                 350

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

        355                 360                 365

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

    370                 375                 380

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

385                 390                 395                 400

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

                405                 410                 415

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

            420                 425                 430

Leu Ser Leu Gly Lys

        435

<210>21

<211>1329

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1329)

<223>HuEPO-L-vFcγ1的核苷酸序列

<400>21

aagcttggcg cggagatggg ggtgcacgaa tgtcctgcct ggctgtggct tctcctgtcc      60

ctgctgtcgc tccctctggg cctcccagtc ctgggcgccc caccacgcct catctgtgac     120

agccgagtcc tggagaggta cctcttggag gccaaggagg ccgagaatat cacgacgggc     180

tgtgctgaac actgcagctt gaatgagaat atcactgtcc cagacaccaa agttaatttc     240

tatgcctgga agaggatgga ggtcgggcag caggccgtag aagtctggca gggcctggcc     300

ctgctgtcgg aagctgtcct gcggggccag gccctgttgg tcaactcttc ccagccgtgg     360

gagcccctgc agctgcatgt ggataaagcc gtcagtggcc ttcgcagcct caccactctg     420

cttcgggctc tgggagccca gaaggaagcc atctcccctc cagatgcggc ctcagctgct     480

ccactccgaa caatcactgc tgacactttc cgcaaactct tccgagtcta ctccaatttc     540

ctccggggaa agctgaagct gtacacaggg gaggcctgca ggacagggga cggatccggt     600

ggcggttccg gtggaggcgg aagcggcggt ggaggatcag acaaaactca cacatgccca     660

ccgtgcccag cacctgaagt cgcgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc     720

aaggacaccc tcatgatctc ccggacacct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc     780

cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc     840

aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc     900

gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc     960

ctcccagcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag    1020

gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc    1080

ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg    1140

gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac    1200

agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg    1260

atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa    1320

tgagaattc                                                            1329

<210>22

<211>435

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC FEATURE

<222>(1)..(435)

<223>HuEPO-L-vFcγ1的氨基酸序列

<400>22

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1               5                   10                  15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

            20                  25                  30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

        35                  40                  45

Ala Glu Asn Ile THr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

    50                  55                  60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

            100                 105                 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

        115                 120                 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu

    130                 135                 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

                165                 170                 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

            180                 185                 190

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

        195                 200                 205

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Val Ala Gly

    210                 215                 220

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

225                 230                 235                 240

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

                245                 250                 255

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

            260                 265                 270

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

        275                 280                 285

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

    290                 295                 300

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile

305                 310                 315                 320

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly GIn Pro Arg Glu Pro Gln Val

                325                 330                 335

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

            340                 345                 350

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

        355                 360                 365

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

    370                 375                 380

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

385                 390                 395                 400

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

                405                 410                 415

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

            420                 425                 430

Pro Gly Lys

        435

Claims (16)

1.一种重组HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白含有人EPO、肽接头和人IgG Fc变体，

并且所述的人IgG Fc变体选自下组：

(i)含有Pro331Ser突变的人IgG2的绞链、CH2和CH3区域；

(ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4的绞链、CH2和CH3区域；或

(iii)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG3的绞链、CH2和CH3区域。

2.如权利要求1所述的重组HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的肽接头含有约20个或更少的氨基酸，该肽接头存在于人EPO和人IgG Fc变体之间；且所述的肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。

3.如权利要求1所述的重组HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：18、20或22所示。

4.如权利要求1所述的重组HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列是去除了第1-27位人EPO前导肽之后的SEQ ID NO：18、20或22所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的重组HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的HuEPO-L-vFc融合蛋白在摩尔基础上，具有与rHuEPO类似或更高的体外生物活性。

6.一种编码权利要求1所述的重组HuEPO-L-vFc融合蛋白的DNA分子。

7.一种CHO衍生的细胞株，其特征在于，所述的细胞在其生长培养基中在每24小时期间内，产生超过10μg/百万个细胞的如权利要求1-5任一所述的HuEPO-L-vFc融合蛋白。

8.如权利要求7所述的CHO衍生的细胞株，其特征在于，在生长培养基中，在每24小时期间内，产生超过30μg/百万个细胞的HuEPO-L-vFc融合蛋白。

9.如权利要求7所述的CHO衍生的细胞株，其特征在于，它含有编码HuEPO-L-vFc融合蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列具有SEQ ID NO：17、19或21所示的核苷酸序列。

10.一种制备权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(a)生成CHO衍生的细胞株；

(b)在重组融合蛋白在其生长培养基中在每24小时期间内表达超过10μg/106个细胞的条件下，培养这种细胞株；和

(c)纯化步骤(b)表达的蛋白质，其中重组融合蛋白在摩尔基础上，具有与rHuEPO类似或更高的体外生物活性。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在人EPO和人IgG Fc变体间存在含有约20或更少个氨基酸的柔性肽；且所述的柔性肽接头含有2个或多个选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：18、20或22所示。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列是去除了第1-27位人EPO前导肽之后的SEQ ID NO：18、20或22所示的氨基酸序列。

14.一种提高含有人EPO、柔性肽接头和人IgG Fc变体的重组融合蛋白的表达量的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(a)将编码融合蛋白的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；

(b)培养这种CHO衍生的细胞系，从而表达融合蛋白；和

(c)纯化步骤(b)表达的融合蛋白，

其中重组融合蛋白是HuEPO-L-vFc融合蛋白，其特征为表现出极高的体外生物活性，即在摩尔基础上，具有与rHuEPO类似或更高的体外生物活性；其中在人EPO和人IgG Fc变体间存在含有约20个或更少氨基酸的柔性肽接头；和柔性肽接头含有2个或多个选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸；和其中人IgG Fc变体含有选自以下的人IgG的绞链区、CH2和CH3区域：Pro331Ser突变的人IgG2；Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4；和Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：18、20或22所示。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的编码融合蛋白的DNA具有SEQ ID NO：17、19或21所示的核苷酸序列。

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