CN1869207A - 鼠抗人巨噬细胞迁移抑制因子单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鼠抗人巨噬细胞迁移抑制因子单克隆抗体及其应用。该鼠抗人巨噬细胞迁移抑制因子单克隆抗体，是由杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体。杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体、衍生于该单克隆抗体的单链抗体、人－鼠嵌合抗体或Fab片段可以用于治疗败血症，全身炎症反应综和症或急性肺损伤等炎症反应；可以用于治疗类风湿性关节炎，哮喘，多发性硬化症，糖尿病或红斑狼疮等自身免疫性疾病；还可以抑制肿瘤的生成；上述单克隆抗体及其衍生物能够与糖皮质激素联合用药，降低糖皮质激素的用量及副作用。

Description

鼠抗人巨噬细胞迁移抑制因子单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种鼠抗人巨噬细胞迁移抑制因子单克隆抗体及其应用。
背景技术
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是早期发现的细胞因子之一。MIF的cDNA编码一个具有115个氨基酸的蛋白质，该蛋白不属于任何一个细胞因子超家族，与哺乳动物细胞中其他任何蛋白都不具有很强同源性。所有哺乳类动物的MIF蛋白(包括人、大鼠、小鼠、牛)大约有90％的同源性。物种间MIF的保守性显示了MIF可能有重要的生物学功能。
免疫系统中的巨噬细胞是产生MIF的主要细胞，在其他组织分布也很广。值得注意的是，表达MIF的细胞或是组织，如肺、皮肤上皮层、胃肠道、泌尿生殖道等，和宿主的自然环境直接相关。MIF的另一个与众不同的性质是：一些内分泌系统的组织可以高水平表达MIF，特别是那些和应激反应有关的器官，如下丘脑、垂体、肾上腺等。
糖皮质激素是一种广谱的抗炎药物，而MIF是人们发现的第一个糖皮质激素功能的拮抗蛋白。MIF一经释放，就可以使类固醇(糖皮质激素)的免疫抑制效应失效，从而表现出独特的生理作用，就好像是一种由糖皮质激素诱导产生的负调控因子(Bucala，R.(1996).MIF re-discovered：pituitary hormone andglucocorticoid-induced regulator of cytokine production.Cytokine GrowthFactor Rev.7，19-24；Donnelly，S.C.and Bucala，R.(1997).Macrophagemigration inhibitory factor：a regulator of glucocorticoid activity witha critical role in inflammatory disease.Mol.Med.Today 3，502-507.)。
MIF作为一个细胞因子在固有性免疫系统中有着重要的作用。LPS，TNF-α，IFN-γ等刺激巨噬细胞释放MIF，当MIF释放到组织或在全身循环时，它就充当一个经典的促炎症细胞因子，通过巨噬细胞、T细胞活化而促进固有性和适应性免疫应答。
高水平的MIF生成在急性感染中是有害的。在动物模型中，抑制MIF的作用，对于败血症，急性肺损伤以及全身炎症反应综合症都具有明显的治疗效果(Calandra，T.and Bucala，R.(1995).Macrophage migration inhibitory factor：a counter-regulator of glucocorticoid action and critical mediator ofseptic shock.J.Inflamm.47，39-51；Calandra，T.，Echtenacher，B.，Roy，D.L.，Pugin，J.，Metz，C.N.，Hultner，L.，Heumann，D.，Mannel，D.，Bucala，R.，andGlauser，M.P.(2000).Protection from septic shock by neutralization ofmacrophage migration inhibitory factor.Nat.Med.6，164-170)。由于全身炎症反应综合症是SARS和人禽流感的重要致死原因，抗MIF抗体对这类突发性的急性呼吸道感染应有很好的疗效。
MIF与类风湿性关节炎，哮喘，多发性硬化症，糖尿病等自身免疫疾病也有重要联系。例如在大鼠关节炎模型中，抗MIF抗体可以很好地减缓大鼠的病情发展，100％地抑制死亡率。由于MIF对糖皮质激素的拮抗作用，抗MIF抗体与低剂量糖皮质激素联用，有可能增强激素的抗炎症作用，降低激素的副作用(Baugh，J.A.andDonnelly，S.C.(2003).Macrophage migration inhibitory factor：aneuroendocrine modulator of chronic inflammation.J.Endocrinol.179，15-23；Morand，E.F.(2005).New therapeutic target in inflammatory disease：macrophage migration inhibitory factor.Intern.Med.J.35，419-426)。MIF在肿瘤生成中也起到关键作用，研究表明，多种肿瘤细胞高表达MIF，而MIF对肿瘤细胞的存活以及肿瘤血管的生成是必须的(Nishihira，J.，Ishibashi，T.，Fukushima，T.，Sun，B.，Sato，Y.，and Todo，S.(2003).Macrophage migrationinhibitory factor(MIF)：Its potential role in tumor growth andtumor-associated angiogenesis.Ann.N.Y.Acad.Sci.995，171-182；Mitchell，R.A.and Bucala，R.(2000).Tumor growth-promoting properties ofmacrophage migration inhibitory factor(MIF).Semin.Cancer Biol.10，359-366)。
综上所述，MIF是一个非常重要的细胞因子，对MIF活性的抑制可望给患有严重败血症和炎症，自身免疫性疾病及癌症的病人提供新的治疗选择。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种分泌特异性结合人巨噬细胞迁移抑制因子的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
该杂交瘤细胞系为杂交瘤细胞株10C3CGMCC No.1717。
杂交瘤细胞株10C3CGMCC No.1717已于2006年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址是中国北京市海淀区中关村北一条13号，其保藏编号为CGMCC No.1717。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种特异性结合人MIF蛋白的单克隆抗体，或者衍生于这种单克隆抗体的单链抗体，Fab片段，或者人-鼠嵌合抗体。
本发明所提供的单克隆抗体是杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体；所述单克隆抗体的衍生物为单链抗体、Fab片段或人-鼠嵌合抗体。
所述杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体、由所述单克隆抗体衍生的Fab片段或人-鼠嵌合抗体的重链可变区具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列，轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列。
由所述单克隆抗体衍生的人-鼠嵌合抗体的轻链具有序列表中序列8的氨基酸残基序列，重链具有序列表中序列9的氨基酸残基序列。其名称为ch-10C3。
由所述单克隆抗体衍生的单链抗体具有序列表中序列3的氨基酸残基序列，其名称为10C3scFV。
上述单克隆抗体及其衍生物的编码基因。
由所述单克隆抗体衍生的人-鼠嵌合抗体的轻链编码基因可具有序列表中序列6的核苷酸序列，重链编码基因可具有序列表中序列7的核苷酸序列。
单链抗体10C3scFV的编码基因可具有序列表中序列10的核苷酸序列。
实验证明杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体、衍生于该单克隆抗体的单链抗体10C3scFV、人-鼠嵌合抗体ch-10C3或Fab片段与人MIF的解离常数分别为3nM，30nM，3nM，10nM。杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体、衍生于该单克隆抗体的单链抗体10C3scFV、人-鼠嵌合抗体ch-10C3或Fab片段可以阻断人MIF刺激Raw264.7细胞产生炎症因子NO和TNF-alpha，在LPS诱导的小鼠败血症模型中具有保护作用。
上述单克隆抗体及其衍生物能够高亲和力特异性识别人巨噬细胞迁移抑制因子，并中和其生物学活性，可以用于治疗败血症，全身炎症反应综和症或急性肺损伤等炎症反应；可以用于治疗类风湿性关节炎，哮喘，多发性硬化症，糖尿病或红斑狼疮等自身免疫性疾病；还可以抑制肿瘤的生成；上述单克隆抗体及其衍生物能够与糖皮质激素联合用药，降低糖皮质激素的用量及副作用。
上述单克隆抗体及其衍生物可用于临床检验MIF的水平。
附图说明
图1为ELISA检测杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体与人MIF的解离曲线
图2为杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体抑制人MIF刺激Raw264.7细胞产生NO曲线
图3为杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体抑制人MIF刺激Raw264.7细胞产生TNF-alpha的结果
图4为注射LPS和注射LPS和杂交瘤细胞株10C3CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的小鼠的存活情况
具体实施方式
下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、抗MIF单克隆抗体的制备和鉴定
1、杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的制备
本发明用大肠杆菌表达的人MIF蛋白(huMIF)(将huMIF的编码区克隆至删除了GST编码区的PET-41a载体(Novagen，USA)，克隆的质粒在DH5α里扩增，再经由BL21中表达。融合蛋白中带有6×his Tag，通过Ni-NTA亲和层析纯化。)免疫NZB/W F1小鼠(南京大学模式动物研究所)，80微克人MIF加MPL+TDM乳液状佐剂(sigma)足底免疫，一周一次，共三次。第三次免疫3天后的NZB/W F1小鼠取淋巴结中的免疫细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞以5∶1比例混合，用聚乙二醇进行融合，HAT筛选后得到杂交瘤。
分泌特异性结合MIF抗体的杂交瘤检测：以大肠杆菌表达的GST-MIF重组蛋白(10微克/毫升)(将huMIF的编码区克隆至PET-41a载体(Novagen，USA)，克隆的质粒在DH5α里扩增，再经由BL21中表达。融合蛋白中带有GST Tag，通过谷胱甘肽亲和层析纯化。)包板，杂交瘤上清(进行梯度稀释)为一抗，HRP偶联的羊抗小鼠IgG多克隆抗体(R&D Systems)为二抗进行ELISA检测，获得解离曲线。ELISA最大读数的50％相对应的抗体浓度为抗体的解离常数。
亚克隆：用限制性稀释法多次克隆分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，最后获得杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717。ELISA检测杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体与MIF的解离曲线如图1所示，表明杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体与人MIF的解离常数为3nM(即480ng/ml)。图1的横坐标是杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的浓度，纵坐标是ELISA显色后的光吸收值。
抗体亚型鉴别实验：以大肠杆菌表达的GST-MIF重组蛋白(10微克/毫升)包板，杂交瘤上清为一抗，HRP偶联的大鼠抗小鼠IgG1，IgG2a，或IgG2b单克隆抗体(BD Pharmingen)为二抗进行ELISA检测。实验证明杂交瘤细胞株10C3 CGMCCNo.1717分泌的单克隆抗体为IgG2b亚型。
腹水的制备方法：Balb/C小鼠腹腔注射降植烷0.5ml/只十天后，将杂交瘤细胞悬液接种于小鼠腹腔，待小鼠腹腔有明显肿胀后收集腹水，离心取上清。通过蛋白A/G亲和层析柱(Pierce)纯化抗体，0.1M Glycine/HCl(pH2.5)洗脱。
2、杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的生物活性鉴定
(1)杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体可以阻断人MIF刺激Raw264.7细胞产生NO
重组人MIF(制备方法同上)和步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体混合后刺激Raw264.7细胞16小时。共设六个处理：终浓度为3ug/ml重组人MIF和终浓度为100ug/ml的步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体混合处理、终浓度为3ug/ml重组人MIF和终浓度为33.3ug/ml的步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体混合处理、终浓度为3ug/ml重组人MIF和终浓度为11.1ug/ml的步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体混合处理、终浓度为3ug/ml重组人MIF和终浓度为3.7ug/ml的步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCCNo.1717分泌的单克隆抗体混合处理、终浓度为3ug/ml重组人MIF和终浓度为1.23ug/ml的步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体混合处理、终浓度为3ug/ml重组人MIF和终浓度为0.41ug/ml的步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体混合处理。细胞培养液中新产生的一氧化氮量用Griess试剂显色法测量。结果如图2所示，表明步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体(抗体起始浓度为100ug/ml，3倍稀释)与MIF混合后能显著降低MIF刺激Raw264.7细胞引起的NO的分泌。反应中加过量的多粘菌素B以消除步骤1纯化过程中残留的LPS影响。图2的横坐标是杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的浓度。
(2)杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体可以阻断MIF刺激Raw264.7细胞产生肿瘤坏死因子(TNF-a)
重组人MIF(制备方法同上)和步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体混合后刺激Raw264.7细胞3小时后收集上清液，稀释成1/100来刺激L929细胞，16h后加入5mg/ml MTT 20ul/孔，继续培养3h后弃上清，加入150ul DMSO，震荡后测A590吸光值。用未经刺激的Raw264.7细胞上清样品的吸光值减去刺激后的Raw264.7细胞上清样品的吸光值，得到相对杀伤，对比鼠TNF-a标准曲线，得到对应的浓度，再乘以样品体积，得到TNF-a的量。其中，重组人MIF和步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体共有六种混合处理：终浓度为0ug/ml重组人MIF和终浓度为0ug/ml的步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体混合处理、终浓度为3ug/ml重组人MIF和终浓度为0ug/ml的步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体混合处理、终浓度为0ug/ml重组人MIF和终浓度为100ug/ml的步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体混合处理、终浓度为3ug/ml重组人MIF和终浓度为100ug/ml的步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体混合处理、终浓度为3ug/ml重组人MIF和终浓度为33ug/ml的步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体混合处理、终浓度为3ug/ml重组人MIF和终浓度为11ug/ml的步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体混合处理。结果如图3所示，表明步骤1纯化的杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体与MIF混合后能显著降低MIF刺激Raw264.7细胞引起的TNF-a的分泌。图3中，10C3Ab表示杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体。
实施例2、抗MIF人-鼠嵌合抗体ch-10C3的制备
鼠抗体在人体内会产生免疫排斥反应，因此只能由于急症的治疗，一旦人体内产生针对鼠抗体的抗抗体，作为药物的鼠抗体就会失效。为了克服这一缺点，本发明对鼠抗体进行了人源化，制备了人-鼠嵌合抗体ch-10C3。该抗体的可变区序列来自鼠抗体-杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体，不变区序列来自人IgG1。这种抗体保持了鼠单抗的抗原结合特异性，同时降低了在人体内诱导的免疫排斥反应。制备嵌合抗体的步骤如下：
从杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717中分离纯化mRNA，用oligo-dT合成第一链cDNA。用PCR方法分别扩增抗体轻链和重链可变区，轻链引物为5’GAY ATTGTG MTS ACM CAR WCT MCA 3’和5’CTC CAG ATG TTA ACT GCT CAC 3’；重链引物为：5’ATG SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC 3’和5’GGT CAA GGT CAC TGG CTCAGG3’。其中，R＝G或A，Y＝T或C，M＝A或C，S＝G或C，W＝T或A，N＝G或A或C或T。将PCR产物分别克隆到T载体中测序。结果表明杂交瘤细胞株10C3CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的重链可变区的编码基因具有序列表中序列4的核苷酸序列，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的重链可变区；杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的轻链可变区的编码基因具有序列表中序列5的核苷酸序列，编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的轻链可变区。
将杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的轻链和重链可变区基因分别与人的轻链和重链不变区基因连接，构建可编码嵌合抗体ch-10C3的融合基因，该嵌合抗体轻链的编码基因具有序列表中序列6的核苷酸序列，编码具有序列表中序列8的氨基酸残基序列的ch-10C3轻链；该嵌合抗体重链的编码基因具有序列表中序列7的核苷酸序列，编码具有序列表中序列9的氨基酸残基序列的ch-10C3重链。
将该嵌合抗体轻链的编码基因插入到有选择性标记(鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，gpt)和基因表达调控区(CMV启动子，终止子)的表达载体pCI-gpt(以promega载体pCI为模板构建，将鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的编码基因插入pCI的多克隆位点得到表达载体pCI-gpt)中，得到该嵌合抗体轻链表达载体pCI-gpt-10C3L。将该嵌合抗体重链的编码基因插入到有选择性标记(二氢叶酸还原酶DHFR)和基因表达调控区(CMV启动子，终止子)的表达载体pCI-DHFR(以promega载体pCI为模板构建，将二氢叶酸还原酶的编码基因插入pCI的多克隆位点得到表达载体pCI-DHFR)中，得到该嵌合抗体重链表达载体pCI-DHFR-10C3H。
用电转染的方法将含有嵌合抗体基因的表达载体pCI-gpt-10C3L和pCI-DHFR-10C3H一同导入到哺乳动物细胞NS/O(购自ECACC)中。用霉酚酸酯(Mycophenolate)在含黄嘌呤(Xanthine)的培养基中筛选转化细胞，获得稳定转染的细胞株。按照实施例1的方法用ELISA鉴定抗体的分泌，结果显示得到的ch-10C3抗体保留了杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的特异性和亲和力，ch-10C3抗体与MIF的解离常数为3nM。
实施例3、抗MIF单链抗体10C3scFV的制备
PCR方法分别扩增杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的轻链和重链可变区基因，然后用PCR方法将重链和轻链可变区用富含甘氨酸和丝氨酸的15氨基酸片段连接起来，获得抗MIF单链抗体10C3scFV的编码基因序列(序列10)。将10C3 scFV的编码基因序列克隆到表达载体pET-26b(Novagen，USA)中，克隆的质粒在DH5α里扩增，再经由BL21中表达。融合蛋白中带有6×his Tag，通过Ni-NTA亲和层析纯化。表达的10C3 scFV具有序列表中序列3的氨基酸残基序列。
按照实施例1的方法用ELISA鉴定抗MIF单链抗体10C3scFV，结果显示抗MIF单链抗体10C3 scFV保留了杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的特异性和亲和力，抗MIF单链抗体10C3scFV与MIF的解离常数为30nM。
实施例4、抗MIF的Fab片段10C3Fab的制备
利用ImmunoPure@Fab制备试剂盒(Pierce)中的固定化木瓜蛋白酶消化杂交瘤细胞株10C3CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体，将全长抗体降解成为Fab和Fc片段。酶解后的产物用试剂盒中提供的固定化蛋白A柱纯化得到Fab的抗体片段。按照实施例1的方法用ELISA鉴定杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的Fab片段10C3Fab，结果显示杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的Fab片段10C3Fab保留了杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体的特异性和亲和力，抗MIF的Fab片段10C3Fab与MIF的解离常数为10nM。
实施例5、抗MIF抗体在败血症小鼠模型中的应用
8周龄C57BL/6雌性小鼠20只，重17.5g--18.5g，按体重匹配均分为两组：LPS组(LPS)和抗体组(LPS+anti-MIF)。实验前在SPF级动物房中同笼48小时，自由进食及水。注射前2小时禁食。LPS组和抗体组小鼠依体重给予LPS(SigmaO111：B4)22.5mg/kg。抗体组在给LPS后，给予杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体100ug/只。两种药物均用无菌PBS稀释到终体积200ul，腹腔内注射。将两组分笼喂养，观察给药后情况。在12hr后，均出现相似的颤抖，体毛直立，对外界刺激不敏感表现。16小时后，LPS组和抗体组开始有小鼠死亡；60小时，抗体组的存活率为40％，LPS组的存活率为20％(图4)。说明杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体在LPS诱导的小鼠败血症模型中具有保护作用。
                               序列表
<160>10
<210>1
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Tyr Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>2
<211>109
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Ser Ile Ile Ala Ser Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Arg Ser Ser Ile Ser Ser Thr
            20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Leu Asp Ser Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Glu Thr Ser Asp Thr Leu Thr Ile Ser Cys Met Gln
65                  70                  75                  80
Asp Glu Val Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
            100                 105
<210>3
<211>245
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Tyr Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser
         115                 120                 125
Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro
    130                 135                 140
Val Ser Ile Ile Ala Ser Arg Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg
145                 150                 155                 160
Ala Arg Ser Ser Ile Ser Ser Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys
                165                 170                 175
Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala
            180                 185                 190
Ser Gly Val Leu Asp Ser Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Ser Asp
        195                 200                 205
Thr Leu Thr Ile Ser Cys Met Gln Asp Glu Val Ala Ala Thr Tyr Tyr
    210                 215                 220
Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Leu Glu Leu Lys Arg
                245
<210>4
<211>363
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
caagtacagc tggaggagtc tgggggagcc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc    60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt acctatgcca tgtcttgggt tcgccagact    120
ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtgatta cacccactat    180
ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctatac    240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt tttactgtgc aagaccctac    300
tacggcagta gttactggtt ctacgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc    360
tca                                                                  363
<210>5
<211>327
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gatattgtgc tgacccaaac tccagtgtcc ataattgctt ctcgagggga gaaggtcacc    60
atcacctgcc gtgccagatc aagtataagt tccacttact tacactggta ccagcagaag    120
ccaggatcct cccctaaact tttgatttat aggacatcca tcctggcatc tggagtccta    180
gacagcttca gtggcagtgg gtctgagacc tctgacactc tgacaatcag ctgcatgcag    240
gacgaagttg ctgccactta ctattgtcag caggggagta gtagcccgct cacgttcggt    300
gctgggacca agctggagct gaaacgg                                        327
<210>6
<211>645
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gatattgtgc tgacccaaac tccagtgtcc ataattgctt ctcgagggga gaaggtcacc    60
atcacctgcc gtgccagatc aagtataagt tccacttact tacactggta ccagcagaag    120
ccaggatcct cccctaaact tttgatttat aggacatcca tcctggcatc tggagtccta    180
gacagcttca gtggcagtgg gtctgagacc tctgacactc tgacaatcag ctgcatgcag    240
gacgaagttg ctgccactta ctattgtcag caggggagta gtagcccgct cacgttcggt    300
gctgggacca agctggagct gaaacggact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg    360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc    420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc    480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg    540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag    600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt                    645
<210>7
<211>1359
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
atgcaagtac agctggagga gtctggggga gccttagtga agcctggagg gtccctgaaa    60
ctctcctgtg cagcctctgg attcactttc agtacctatg ccatgtcttg ggttcgccag    120
actccagaga agaggctgga gtgggtcgca accattagta gtggtggtga ttacacccac    180
tatccagaca gtgtgaaggg tcgattcacc atctccagag acaatgccag gaacacccta    240
tacctgcaaa tgagcagtct gaggtctgag gacacggcca tgttttactg tgcaagaccc    300
tactacggca gtagttactg gttctacgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc    360
tcctcagcgt cgaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc    420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg    480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag    540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc    600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt    660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg    720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg    780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc    840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag    900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat    960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc    1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg    1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc    1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct    1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc    1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac    1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga                           1359
<210>8
<211>215
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Ser Ile Ile Ala Ser Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Arg Ser Ser Ile Ser Ser Thr
            20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Leu Asp Ser Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Glu Thr Ser Asp Thr Leu Thr Ile Ser Cys Met Gln
65                  70                  75                  80
Asp Glu Val Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala
            100                 105                 110
Ala Pro Ser Val PheIle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
        115                120                 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
    130                 135                 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asm Ser
145                 150                 155                 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
                165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
            180                 185                 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
        195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
<210>9
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<400>9
Met Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly
1               5                   10                  15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr
            20                  25                  30
Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser
    50                  55                  60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Tyr Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
    210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
            260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
        275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
    290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
                325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
            340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
        355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
    370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
                405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
            420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
        435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
    450
<210>10
<211>735
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
caagtacagc tggaggagtc tgggggagcc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc    60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt acctatgcca tgtcttgggt tcgccagact    120
ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtgatta cacccactat    180
ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctatac    240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt tttactgtgc aagaccctac    300
tacggcagta gttactggtt ctacgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc    360
agcggcagca gcggcagcgg cagcagcggc agcggcagca gcggcagcga tattgtgctg    420
acccaaactc cagtgtccat aattgcttct cgaggggaga aggtcaccat cacctgccgt    480
gccagatcaa gtataagttc cacttactta cactggtacc agcagaagcc aggatcctcc    540
cctaaacttt tgatttatag gacatccatc ctggcatctg gagtcctaga cagcttcagt    600
ggcagtgggt ctgagacctc tgacactctg acaatcagct gcatgcagga cgaagttgct    660
gccacttact attgtcagca ggggagtagt agcccgctca cgttcggtgc tgggaccaag    720
ctggagctga aacgg                                                     735

Claims (10)

1、杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717。
2、杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体及其衍生物，所述单克隆抗体的衍生物为单链抗体、Fab片段或人-鼠嵌合抗体。
3、根据权利要求2所述的单克隆抗体及其衍生物，其特征在于：所述杂交瘤细胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的单克隆抗体、由所述单克隆抗体衍生的Fab片段或人-鼠嵌合抗体的重链可变区具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列，轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列。
4、根据权利要求3所述的单克隆抗体衍生物，其特征在于：由所述单克隆抗体衍生的人-鼠嵌合抗体的轻链具有序列表中序列8的氨基酸残基序列，重链具有序列表中序列9的氨基酸残基序列。
5、根据权利要求2所述的单克隆抗体及其衍生物，其特征在于：由所述单克隆抗体衍生的单链抗体具有序列表中序列3的氨基酸残基序列。
6、权利要求2-5中任一所述的单克隆抗体及其衍生物的编码基因。
7、根据权利要求6所述的基因，其特征在于：由所述单克隆抗体衍生的人-鼠嵌合抗体的轻链编码基因具有序列表中序列6的核苷酸序列，重链编码基因具有序列表中序列7的核苷酸序列；由所述单克隆抗体衍生的单链抗体编码基因具有序列表中序列10的核苷酸序列。
8、权利要求2-5中任一所述的单克隆抗体及其衍生物在制备药物中的应用，所述药物为治疗由人巨噬细胞迁移抑制因子参与的炎症反应的药物、治疗由人巨噬细胞迁移抑制因子参与的自身免疫性疾病的药物或治疗由人巨噬细胞迁移抑制因子参与的肿瘤的药物。
9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述炎症反应为败血症，全身炎症反应综合症或急性肺损伤；所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎，哮喘，多发性硬化症，糖尿病或红斑狼疮。
10、权利要求2-5中任一所述的单克隆抗体及其衍生物在检验人巨噬细胞迁移抑制因子中的应用。
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