CN1263771C

CN1263771C - 骨保护素融合蛋白的制备方法和用途

Info

Publication number: CN1263771C
Application number: CN 03129304
Authority: CN
Inventors: 倪健; 杨武剑; 罗鹏; 杨子义; 迟志永
Original assignee: SHANGHAI FUCHUN ZHONGNAN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Guizhou Ankang Medical Inspection Center Co., Ltd.
Priority date: 2003-06-16
Filing date: 2003-06-16
Publication date: 2006-07-12
Anticipated expiration: 2023-06-16
Also published as: CN1566157A

Abstract

本发明涉及一种OPG融合蛋白的生产方法和用途，它为R1-L-R2形式，其中R1为OPG蛋白、其变体或片段，R2为Fc蛋白、其变体或片段；L为接头。本发明获得的融合蛋白可用于治疗骨质疏松和肿瘤相关骨损失等。

Description

骨保护素融合蛋白的制备方法和用途

技术领域

本发明涉及使用甲醇酵母表达生产重组骨保护素(OPG)融合蛋白的方法、含有由该方法生产的重组OPG蛋白的药物制剂以及该药物制剂在制备预防或治疗哺乳动物骨丢失中的药物中的用途。

技术背景

OPG由几个研究小组独立发现。Simonet等(Cell.1997 Apr 18；89(2)：309-19)在分析大鼠肠cDNA时发现了一个新的基因。他们在分析了大鼠、小鼠、人的cDNA后，根据序列的同源性，确定该新的基因为TNF受体家族的一员，将其命名为OPG(osteoprotegerin，骨保护素)。而Tsuda等(J-Biol-Chem.1998 Oct 16；273(42)：27091-6)在人肺纤维细胞系IMR-90的培养基中，分离到一种肝素结合的碱性的糖蛋白，命名为OCIF(osteoclastogenesis inhibitory factor，破骨细胞生成抑制因子)，然后又从IMR-90的cDNA中克隆到其cDNA。此外，Tan等(Cell.1998 Apr 17；93(2)：165-76)在分析不同的细胞系文库时发现了OPG基因，Kwon等(FASEB Journal1998，Vol 12，p845-854)在表达序列标签库中寻找TNF受体中富半胱氨酸区域的同源序列时，发现了OPG基因，但他命名为TR1(TNF receptor-related molecule-1，TNF受体相关的分子-1)。还有，Yun等(J-Immunol.2001 Feb 1；166(3)：1482-91)从FDC-1细胞系中克隆到OPG基因，命名为FDCR-1(follicular dendritic cellreceptor-1，小结树突细胞受体-1)。

人、小鼠、大鼠的OPG蛋白均为401个氨基酸，人和小鼠的OPG蛋白与大鼠分别有85％和94％的同源性。前面21个氨基酸为信号肽，翻译后被切除，形成380个氨基酸的成熟OPG蛋白。成熟蛋白共可形成7个结构域(D1-7)。N端D1-4，富含半胱氨酸，与TNFR家族其它成员的胞外域一样参与配体的结合；C端D5-6为两个紧密串联的死亡域(death domain homologues regions，DDH)，类似于TNFR超家族中的几种成员(如TNFR1、Fas)，参与调节细胞凋亡，不同的是TNFR1、Fas等仅含一个DDH；D7参与结合肝素和形成二聚体。研究发现，D1-4片段具有致破骨细胞(osteoclast，OC)形成的活性，切除194位后的C端对此活性没有影响。

OPG是一种糖蛋白，有4-5个潜在的N糖基化位点，OPG单体在还原条件下大约为55-62kD，而去除糖基化后为40kD。OPG一般通过二硫键形成二聚体，在非还原条件下电泳大小为110-120kD。

人OPG基因是单拷贝基因，位于8q23-24区，全长29kb，编码5个外显子。实验证实在成纤维细胞IMR 90中存在3种mRNA，分别为2.4kb、4.2kb、6.5kb。2.4kb mRNA不含内含子，为直接编码OPG的模板，而4.2kb、6.5kb mRNA是DNA的选择性剪接形式，分别含部分或全部内含子。OPG蛋白的表达非常广泛。在人胚胎组织中，肺、肾、肝和脑组织中高表达。而成人组织中，OPG在胎盘、肝、胸腺、脊髓、脑中高表达，此外，在各种免疫组织、造血组织和间质中有表达。

研究发现，骨重建和骨丢失由TNF超家族的四个因子之间的平衡所控制：OPG、OPGL、RANK、TRAIL。OPGL是OPG的配体，也称为破骨细胞分化因子(osteoclast differentiation factor，ODF)，又称TRANCE(TNF-related activation-induced cytokine，TNF相关的诱导激活的细胞因子)、RANKL(receptor activator ofnuclear factor κB ligand，核因子κB受体激活剂的配体)。OPGL整合在成骨细胞(osteoblast，OB)的细胞膜上，参与破骨细胞前体向破骨细胞分化中最基本的信号传递，通过与破骨细胞前体细胞膜上的RANK(receptor activator of nuclear factorκB，核因子κB受体激活剂)接触，从而调节基因表达，促进OC后期的分化成熟。而OC在骨表面聚集、附着，合成并分泌多种溶酶体酶，这些酶降解胶原等有机骨基质，形成骨吸收小凹，因而是骨质疏松的重要因素之一。OPG通过与OPGL的结合，阻断了OPGL和RANK之间的信号传导，从而抑制了破骨细胞的成熟。此外，OPG与TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TNF相关的诱导凋亡的配体)结合，抑制TRAIL介导的凋亡。反之，TRAIL可以抑制OPG对OC的抑制作用。由此可见，OPG在维持四个因子间的平衡起着关键的作用。

OPG对于OC的分化和活性起着核心调节作用，其它骨吸收影响因子(如，PGE2，转化生长因子TGFβ、骨形态发生蛋白BMPs、甲状旁腺激素PTH、糖皮质激素、雌激素)的作用是通过调节成骨细胞系的OPG和ODF表达，进而调节破骨细胞的分化和活性。OPG基因敲除小鼠成年后由于OC生成增加表现为严重的骨质疏松症：而注射人重组OPG的小鼠出现明显的骨量增加，伴随OC数量减少，且其它组织未见明显病变。OPG作用还具有特异性，即仅作用于骨组织，这为OPG的应用创造了较好的条件，因而具有良好的应用前景。目前，国外正在深入研究骨质疏松症的发病机制，特别是OPG及其配体在分子水平上的精细调控机制；在应用方面则着力开发药用OPG。

Fc指包括抗体的非抗原结合部分序列的分子或序列，优选人源，可以来自任何一种同工型，如IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。Fc与OPG融合蛋白相比OPG具有更高的稳定性，而且在体内的半衰期更长。而且研究发现，截短的OPG多肽融合于Fc的氨基端具有更大的优势。

而甲醇酵母表达体系是近几年发展起来的高效表达系统，相比于大肠杆菌、哺乳动物细胞以及昆虫细胞表达体系而言，甲醇酵母表达体系具有很好的表达可控制、可分泌表达、蛋白易于纯化、表达量高、成本较低等优点。

我们将OPG和Fc基因同时克隆到一个表达载体中，转化甲醇酵母，筛选到了高表达菌株，然后摸索了发酵、纯化工艺，实现了OPG融合蛋白的大规模生产，为其临床应用奠定了基础。使用本工艺生产OPG融合蛋白，表达量可以达到400mg/L，纯化得率在60％以上。与已知的CHO表达系统相比，用甲醇酵母表达OPG融合蛋白具有更高的表达量、更高的可控性，而且生产成本更低，更容易实现大规模生产。

发明内容

本发明的一个目的在于提供用甲醇酵母表达OPG融合蛋白并分离纯化制备OPG融合蛋白的生产方法。

本发明还提供一种OPG融合蛋白，及其在制备用于预防和治疗哺乳动物骨丢失的药物中的用途。

本发明的另一个目的是提供含有本发明OPG融合蛋白和药学上可接受的载体的药物制剂。

本发明所述的OPG融合蛋白指OPG或其活性变体、片段与Fc或其变体、片段融合而成的蛋白。

本发明提供一种编码OPG与Fc融合蛋白的核酸序列。众所周知，一种氨基酸可以有多种密码子编码。本发明分别提供一种编码OPG蛋白的核酸序列(SEQ IDNO：3)和编码Fc蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：4)，但在某些实施方案中，可以根据实际需要对核酸密码子进行突变，特别是选用甲醇酵母偏爱密码子，但编码OPG融合蛋白的氨基酸序列不变。

本发明制得的OPG融合蛋白，其为R1-L-R2和R1-R2形式，其中R1为OPG蛋白、或其变体或片段，R2为Fc蛋白、或其变体或片段，L为接头。

所述OPG蛋白、或其变体、片段选自；

(a)SEQ ID NO：1所示的OPG蛋白序列；

(b)氨基酸序列22-X，其中X为SEQ ID NO：1所示的包括位置185-401的任何残基，尤其是第22-201位氨基酸；

(c)在(b)所述的氨基酸序列前加上Ile-Asp两个氨基酸；或

(d)在(b)所述的氨基酸序列前加上Met。

所述Fc蛋白、或其变体或片段选自：

(a)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

(b)亚部分(a)的氨基酸序列，在以下一个或多个位置具有取代或缺失的不同氨基酸，其中的编号采用SEQ ID NO：2的序列编号：

i.一个或多个半胱氨酸残基；

ii.一个或多个酪氨酸残基；

iii.缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；

iv.缺失或用谷氨酰胺取代位置20的谷氨酸；

v.缺失或用丙氨酸取代位置130的谷氨酸；

vi.缺失或用丙氨酸取代位置105的赖氨酸；

vii.缺失或取代位置107的赖氨酸；

viii.缺失N端1-17位的氨基酸序列；

ix.取代或缺失一个或多个残基以消除Fc受体结合位点；

x.取代或缺失一个或多个残基以消除补体(C1q)结合位点：或

xi.亚部分i-x的组合。

所述接头选自：

(a)ala-(ala)n-ala，n可以是1-4间的整数；

(b)gly-(gly)n-gly，n可以是0-4间的整数；

(c)gly-pro-gly；

(d)gly-gly-pro-gly-gly；

(e)val；

(f)tyr-val；

(g)ser-gly-(gly)6-gly；或

(h)亚部分(a)-(g)的任何组合。

本发明中所指的甲醇酵母包括巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、Pichiamathonolica等能够利用甲醇作为唯一碳源的酵母。本发明使用的表达载体可以选用各种已知的载体，如商业化的载体：pHIL-D2、pPIC9、pPICZα、pPIC3.5K等。将重组表达载体通过电转化或原生质体转化等方法转入宿主细胞，利用合适的条件筛选重组子，可以诱导表达OPG融合蛋白。

在本发明的一个优选的实施例中，在合适的条件下发酵培养工程菌的步骤包括：

将经筛选的工程菌株活化，然后将其接入培养液(例如BMGY、YPD培养液)中，制备种子液。培养过夜后接种至发酵罐中，发酵用培养基为基础培养基(例如基础盐培养基)。发酵条件控制为pH4.0-8.0，较佳为4.5-6.0，最佳为pH5.0，温度28℃-37℃，较佳为29℃-32℃，最佳为30℃，溶氧控制在30％以上。培养4-24小时后开始补料，加入甘油或葡萄糖等。当菌体OD值达到高密度(OD₆₀₀为15-200)时，加入诱导剂(如甲醇)诱导表达，控制pH在3.0-7.0，最佳为pH3.0，诱导12-84小时结束。

在本发明一个优选的实施例中，从发酵产物中纯化分离出OPG融合蛋白包括以下要点：

收集发酵产物，OPG融合蛋白表达产物存在于培养液或菌体中；如果表达产物存在于菌体中，则需破菌；经多步纯化获得产物(包括Protein A亲和柱层析、离子柱层析、反向层析、透析、超滤或凝胶过滤等)；用SDS-PAGE和RP-HPLC检验，获得纯度大于95％的OPG融合蛋白。

该方法与已知的CHO表达系统相比，具有更高的OPG融合蛋白表达量、更高的可控性，而且生产成本更低，更容易实现大规模生产。

已确证，OPG融合蛋白在临床应用上是安全有效的。因此，该多肽是安全的并适宜于药物使用。

由采用本发明方法获得的多肽和常规载体及助剂组成的药物制剂，包括仅含有采用本发明方法获得的多肽的药物制剂，或以本发明多肽作为活性成分，与传统的辅剂和添加物一起组成的药物制剂。这类制剂包括注射针剂、口服制剂、含服制剂及肺部、气道、鼻腔给药制剂及其他非肠道给药组合物。

注射针剂含有采用本发明方法获得的活性多肽，优选以无菌冻干物储存。在给药前与合适的等渗溶液混合，等渗溶液包括传统的适于注射或注入的等渗水系统，其中含有用于注射液的普通添加物如稳定剂和促溶剂，优选生理盐水或通过缓冲液调成的等渗溶液。

口服制剂含采用本发明方法获得的活性多肽，包括按已知方法制备的固体组合物、液体组合物及喷雾组合物。这类组合物为含有采用本发明方法获得的活性多肽与至少一种常用的惰性稀释剂混合。这类组合物在一般情况下，也可加入惰性稀释剂之外的其他添加物，如润滑剂(例如硬脂酸镁)、悬浮剂、崩解剂(如甘醇酸纤维素钙)、稳定剂(例如乳糖)、助溶剂(例如谷氨酸、天冬氨酸)、甜味剂、芳香剂以及防腐剂等。

含服制剂及肺部、气道、鼻腔给药制剂及其他非肠道给药组合物含有采用本发明方法获得的活性多肽，包括采用本发明方法获得的活性多肽与普通添加物如惰性稀释剂、稳定剂、乳化剂、润滑剂等混合，然后采用已知方法制得的喷剂、搽剂、栓剂、药膏等。

OPG融合蛋白可以用于预防和治疗骨丢失类疾病，如：骨质疏松症(原发性骨质疏松症、内分泌性骨质疏松症、青少年骨质疏松症和废用性骨萎缩)、佩吉特病(变形性骨炎)、继发性高钙血症、特发性或继发性骨坏死的进行性骨丢失、类风湿性和骨性关节炎引起的骨丢失和关节软骨损伤、牙周骨丢失、溶骨性的骨肿瘤和恶性肿瘤骨转移，并且可以阻止骨与人工假体界面发生骨吸收从而预防假体松动。

附图说明

图1显示本发明重组质粒1的构建示意图。

图2显示OPG融合蛋白在甲醇酵母中的表达。

图3显示本发明重组质粒2的构建示意图。

图4显示本发明重组质粒3的示意图。图中“Ampicillin”指氨苄青霉素抗性基因。

图5显示本发明重组质粒4的示意图。

图6为Protein A柱子层析图谱及收集样品电泳图。

图7为Sephacryl S-200HR层析图。

具体实施方式

实施例1：表达载体为pPICZαC的工程菌构建

本例利用Invitrogen公司的EasySelect^TM Pichia表达系统表达OPG融合蛋白。用pPICZαC为表达载体，将OPG基因与Fc基因克隆于α因子信号肽基因后。

1.1基因的克隆与重组质粒1的构建(图1)。

设计并合成引物OPG1，OPG2，Fc1，Fc2(SEQ ID NO：5、6、7、8)，以OPG1、OPG2为引物，以从肝组织中抽提的总RNA为模板合成的第一链cDNA为模板，PCR扩增OPG基因序列，其中在5’端和3’端分别引入Cla I和Eco RI位点。以Fc1、Fc2为引物，以从外周血淋巴细胞中抽提的总RNA为模板合成的第一链cDNA为模板，PCR扩增Fc基因，在5’端和3’端分别引入Kpn I和Xba I位点。PCR条件为：94℃1分钟，52℃1分钟，72℃1分30秒，此为一循环，共35轮循环。PCR产物回收后，将其克隆至pGEM-T载体中，得到重组质粒pGEM-T-OPG和pGEM-T-Fc，经测序确定为OPG和Fc的基因序列。

用KpnI和Xba I切开表达质粒pPICZαC，然后与经KpnI和Xba I处理的Fc基因片段连接，将所得连接物转化大肠杆菌TOP10F′(购自Invitrogen公司)。然后将该转化的TOP10F′涂布到含有25μg/ml Zeocin^TM的低盐LB平板上。筛选转化子得到重组质粒，然后用Cla I和Eco RI切开重组质粒，与经Cla I和Eco RI处理的OPG基因片段连接，然后转化大肠杆菌TOP10F’。将该转化的TOP10F′涂布到含有25ug/ml Zeocin^TM的低盐LB平板上，筛选转化子得到重组质粒1。经DNA序列分析与设计序列相同。

1.2用重组质粒1转化宿主菌X-33

大量抽提重组质粒1，用Sac I线性化，然后用无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后晾干，溶于适量的TE溶液中(浓度约为1μg/μL)。然后电转化制备好的X-33宿主菌，将其涂布到含有100ug/ml Zeocin^TM的YPDS筛选培养基上。30℃培养3天，得到酵母转化子。

1.3表达筛选

从转化子中挑选20个单克隆，分别接种到25ml的BMGY培养基中，30℃培养至OD₆₀₀到5.0，离心收集菌体，悬浮到150ml的BMMY培养基中诱导表达，每24小时加入1.5ml甲醇，诱导表达72小时，取样进行SDS-PAGE，看到在100kd左右有明显的表达条带，为OPG融合蛋白的二聚体，筛选高表达菌株为工程菌(图2)。

实施例2：表达载体为pPIC9的工程菌的构建

本例使用Invitrogen公司的巴斯德毕赤酵母表达系统表达OPG融合蛋白。

2.1重组质粒2的构建(图3)

设计并合成引物OPG3、OPG4、Fc3、Fc4(SEQ ID NO：9、10、11、12)，引物OPG3中引入XhoI酶切位点和酵母α信号肽切割位点(KEX2酶识别位点)，引物OPG4引入Sna BI，引物Fc3和Fc4分别引入Sna BI和Not I位点。以pGEM-T-OPG为模板，以OPG3、OPG4为引物，PCR扩增OPG基因，电泳回收基因片段，用Xho I和Sna BI酶切处理并回收。同时用XhoI和Sna BI酶切pPIC9质粒，电泳回收后与XhoI和Sna BI处理后的OPG基因片段连接，然后转化大肠杆菌DH5α(购自Invitrogen公司)，筛选转化子得到重组质粒pPIC9-OPG。然后以pGEM-T-Fc为模板，以Fc3、Fc4为引物，PCR扩增Fc基因，电泳回收基因片段，用Sna BI和Not I酶切处理并回收。同时用Sna BI和Not I酶切pPIC9-OPG质粒，电泳回收后与Sna BI和Not I处理的Fc基因片段连接，然后转化大肠杆菌DH5α。将转化的DH5α涂布到在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上，筛选转化子得到重组质粒2。DNA序列分析证明基因序列正确。

2.2用重组质粒2转化宿主菌GS115

大量抽提重组质粒2，用SalI线性化，然后用无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后晾干，溶于适量的TE溶液中(浓度约为1μg/μL)。然后电转化制备好的GS115宿主菌，涂布在MD筛选培养基上，30℃培养3天，得到酵母转化子。

2.3表达筛选

从MD平板上选20个单克隆分别接种到3ml MGY培养基中，30℃培养48小时后加入27ml MM培养基进行诱导，表达72小时，取样进行SDS-PAGE检测，筛选高表达的菌株为工程菌株。

实施例3：表达载体为pMETαA的工程菌的构建

本例使用Invitrogen公司Pichia mathonolica表达系统表达OPG融合蛋白。

3.1重组质粒3的构建

用Xho I和Not I双酶切实施例2中的重组质粒2，回收OPG和Fc融合蛋白基因片段，与经Xho I和Not I酶切处理的pMETαA质粒连接，转化大肠杆菌DH5α。将转化的大肠杆菌涂布到含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上，筛选转化子得到重组质粒3(图4)。

3.2重组质粒3转化宿主菌PMAD11

大量抽提重组质粒3，用Apa I线性化，然后用无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后晾干，溶于适量的TE溶液中(浓度约为1μg/μL)。然后电转化制备好的PMAD11宿主菌，涂布在MD筛选培养基上，30℃培养3天，得到酵母转化子。

3.3表达筛选

从MD平板上挑选20个单克隆分别接种到50ml的BMDY培养基中，30℃培养到OD₆₀₀为6.0，离心收集菌体，重新悬浮到5ml的BMMY培养基中诱导表达，每24小时补加50ul的甲醇，诱导表达72小时，取样进行SDS-PAGE，筛选高表达菌株为工程菌。

实施例4：表达载体为pGAPZαA的工程菌的构建

本例使用Invitrogen公司的连续表达载体pGAPZα载体表达OPG融合蛋白。

4.1重组质粒4的构建

用Xho I和Not I双酶切实施例2中的重组质粒2，回收OPG和Fc融合蛋白基因片段，与Xho I和Not I酶切处理的pGAPZαA质粒连接，转化大肠杆菌TOP10F’，涂布含有25ug/ml Zeocin^TM的低盐LB平板上，筛选转化子得到重组质粒4(图5)。

4.2重组质粒1转化宿主菌X-33

大量抽提重组质粒1，用Avr II线性化，然后用无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后晾干，溶于适量的TE溶液中(浓度约为1μg/μL)。然后电转化制备好的X-33宿主菌，涂布含有100ug/ml Zeocin^TM的YPDS筛选培养基上，30℃培养3天，得到酵母转化子。

4.3表达筛选

从转化子中挑选20个单克隆，分别接种到50ml的YPD培养基中，30℃培养表达72小时，取样进行SDS-PAGE，筛选高表达菌株为工程菌。

实施例5：工程菌的发酵

将自存的实施例1中获得的工程菌株接种于BMGY培养基中30℃培养24小时后，作为种子液接种于发酵罐中。发酵培养基为加入了微量元素的基础培养基溶液，发酵温度30℃，pH5.0，控制溶解氧不低于30％。菌体生长24小时后开始补加甘油，同时将pH下调到4.0。菌体OD达到200时开始加入甲醇诱导表达，同时加1％蛋白胨保护目的蛋白。起始甲醇添加量控制为每升每小时1-2ml，随后逐渐增大为每升每小时至5-10ml，通过调节搅拌速度和通气量保持溶氧值大于20％，必要时通入纯氧。连续诱导培养72小时后收获培养液，离心收集上清，4.0℃或-20℃保存。测得OPG融合蛋白表达量为400mg/L。

实施例6：发酵产物的纯化

将实施例5获得的发酵液用磷酸盐缓冲液调节pH至7.4～7.6，用MWCO20KD的超滤膜浓缩至原体积的1/5，上样至Protein A Sepharose FF亲和层析柱，目的蛋白结合后，用280nm紫外检测仪监测下，用0.1mol/L、pH7.6的磷酸盐缓冲液冲洗至基线。图6显示Protein A柱子层析图谱及收集样品的电泳图谱。在图6A中，从左向右，第一峰为上样峰，第二峰为pH3.5洗脱峰，为目的蛋白，第三峰为pH2.0洗脱杂蛋白峰。

用0.1mol/L pH3.5的乙酸盐缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，用50mM的磷酸盐缓冲液调节pH至7.2，然后用Sephacryl S-200HR层析收集第二洗脱峰为目的蛋白峰。SDS-PAGE显示蛋白纯度大于95％。图7为Sephacryl S-200HR层析图，图中，最后一个蛋白峰为目的蛋白。纯化得率在60％以上。

实施例7：活性试验

取小鼠骨髓单核巨噬细胞系RAW264.7和骨髓间质细胞，含有20％灭活小牛血清的DMEM液调整细胞密度为1×10⁶/ml、4×10³/ml，加入24孔板中(1ml/孔)，加入1×10^-8mol/ml的1，25-(OH)₂D₃和1×10^-7mol/ml的地塞米松Dex，在37℃，5％CO₂条件下培养7天。破骨细胞分化实验组加入实施例6中获得的骨保护素融合蛋白(100ng/ml)，对照组、实验组各有2孔内加入骨片；破骨细胞活性抑制实验组在第7天观察孔内有多核巨细胞后，加入实施例6中获得的骨保护素融合蛋白(100ng/ml)培养24小时。

破骨细胞活性观察：(1)抗酒石酸盐酸性磷酸酶染色(Leder-Stutt改良萘酚AS-TR磷酸酯法)：实验组和对照组的4孔进行TRACP染色，具有酸性磷酸酶活性的多核巨细胞呈红色，胞核呈绿色(甲基绿复染)。(2)骨吸收陷窝：将骨片用0.25％戊二醛固定，TRACP染色，TRACP阳性的、含有三个细胞核以上的巨细胞为成熟的破骨细胞；骨片放入50mM的氨水中超声振荡冲洗，去除骨片上的破骨细胞，对骨片进行甲苯胺蓝染色，显微镜下观察骨吸收陷窝；再次采用超声振荡冲洗骨片，在浓度递进的酒精溶液中进行系列脱水，自然风干后，扫描电镜封固前将骨片置于真空干燥机中数小时，骨片镀金(厚度为30nm)，扫描电镜下观察骨吸收陷窝。(3)吸取24小时细胞培养的上清液，测酸性磷酸酶的浓度(干片法)。

实验结果：

(1)分化抑制实验：培养7天后，对照组出现了较多的多核巨细胞，TRACP染色为阳性，而实验组(加入骨保护素融合蛋白)无多核巨细胞出现，并且TRACP染色为阴性。

骨吸收陷窝观察：TRACP染色：(×40)第5组骨片上附着有红染的多核巨细胞，而第6组的骨片上无TRACP阳性染色；甲苯胺蓝染色：(×400)第5组骨片上可以看到蓝色的骨片出现孤立的、黑色边缘围绕的、中央部淡染的卵圆形凹陷，而第6组骨片的表面则是光滑的；扫描电镜观察：(×5,000)第5组骨片上出现穿凿样、溶岩状卵圆形凹陷。

(2)活性抑制实验组

加入骨保护素融合蛋白的3孔继续培养24小时，TRACP染色转为阴性，而对照组的另3孔TRACP染色仍为阳性。

结论：单核细胞与骨髓间质细胞共育方法可用于体外培养破骨细胞；体外实验证实实施例6中获得的OPG融合蛋白对于破骨细胞的分化和活性均有抑制作用。

序列表

<110>上海富纯中南生物技术有限公司

<120>骨保护素融合蛋白的制备方法和用途

<130>032708

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>401

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(401)

<223>OPG蛋白

<400>1

Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile

1 5 10 15

Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp

20 25 30

Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr

35 40 45

Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro

50 55 60

Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys

65 70 75 80

Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu

85 90 95

Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr

100 105 110

Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe

115 120 125

Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg

130 135 140

Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys

145 150 155 160

Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys

165 170 175

Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr

180 185 190

Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg

195 200 205

Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val

210 215 220

Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile

225 230 235 240

Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu

245 250 255

Trp Lys His Gln Asn Lys Ala Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln

260 265 270

Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala

275 280 285

Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly

290 295 300

Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys

305 310 315 320

Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn

325 330 335

Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser

340 345 350

Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr

355 360 365

Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu

370 375 380

Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys

385 390 395 400

Leu

<210>2

<211>232

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(232)

<223>Fc蛋白

<400>2

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210>3

<211>2412

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>OPG蛋白的编码序列

<400>3

atgaacaagt tgctgtgctg cgcgctcgtg tttctggaca tctccattaa gtggaccacc 60

tacttgttca acgacacgac gcgcgagcac aaagacctgt agaggtaatt cacctggtgg 120

caggaaacgt ttcctccaaa gtaccttcat tatgacgaag aaacctctca tcagctgttg 180

gtcctttgca aaggaggttt catggaagta atactgcttc tttggagagt agtcgacaac 240

tgtgacaaat gtcctcctgg tacctaccta aaacaacact gtacagcaaa gtggaagacc 300

acactgttta caggaggacc atggatggat tttgttgtga catgtcgttt caccttctgg 360

gtgtgcgccc cttgccctga ccactactac acagacagct ggcacaccag tgacgagtgt 420

cacacgcggg gaacgggact ggtgatgatg tgtctgtcga ccgtgtggtc actgctcaca 480

ctatactgca gccccgtgtg caaggagctg cagtacgtca agcaggagtg caatcgcacc 540

gatatgacgt cggggcacac gttcctcgac gtcatgcagt tcgtcctcac gttagcgtgg 600

cacaaccgcg tgtgcgaatg caaggaaggg cgctaccttg agatagagtt ctgcttgaaa 660

gtgttggcgc acacgcttac gttccttccc gcgatggaac tctatctcaa gacgaacttt 720

cataggagct gccctcctgg atttggagtg gtgcaagctg gaaccccaga gcgaaataca 780

gtatcctcga cgggaggacc taaacctcac cacgttcgac cttggggtct cgctttatgt 840

gtttgcaaaa gatgtccaga tgggttcttc tcaaatgaga cgtcatctaa agcaccctgt 900

caaacgtttt ctacaggtct acccaagaag agtttactct gcagtagatt tcgtgggaca 960

agaaaacaca caaattgcag tgtctttggt ctcctgctaa ctcagaaagg aaatgcaaca 1020

tcttttgtgt gtttaacgtc acagaaacca gaggacgatt gagtctttcc tttacgttgt 1080

cacgacaaca tatgttccgg aaacagtgaa tcaactcaaa aatgtggaat agatgttacc 1140

gtgctgttgt atacaaggcc tttgtcactt agttgagttt ttacacctta tctacaatgg 1200

ctgtgtgagg aggcattctt caggtttgct gttcctacaa agtttacgcc taactggctt 1260

gacacactcc tccgtaagaa gtccaaacga caaggatgtt tcaaatgcgg attgaccgaa 1320

agtgtcttgg tagacaattt gcctggcacc aaagtaaacg cagagagtgt agagaggata 1380

tcacagaacc atctgttaaa cggaccgtgg tttcatttgc gtctctcaca tctctcctat 1440

aaacggcaac acagctcaca agaacagact ttccagctgc tgaagttatg gaaacatcaa 1500

tttgccgttg tgtcgagtgt tcttgtctga aaggtcgacg acttcaatac ctttgtagtt 1560

aacaaagccc aagatatagt caagaagatc atccaagata ttgacctctg tgaaaacagc 1620

ttgtttcggg ttctatatca gttcttctag taggttctat aactggagac acttttgtcg 1680

gtgcagcggc acattggaca tgctaacctc accttcgagc agcttcgtag cttgatggaa 1740

cacgtcgccg tgtaacctgt acgattggag tggaagctcg tcgaagcatc gaactacctt 1800

agcttaccgg gaaagaaagt gggagcagaa gacattgaaa aaacaataaa ggcatgcaaa 1860

tcgaatggcc ctttctttca ccctcgtctt ctgtaacttt tttgttattt ccgtacgttt 1920

cccagtgacc agatcctgaa gctgctcagt ttgtggcgaa taaaaaatgg cgaccaagac 1980

gggtcactgg tctaggactt cgacgagtca aacaccgctt attttttacc gctggttctg 2040

accttgaagg gcctaatgca cgcactaaag cactcaaaga cgtaccactt tcccaaaact 2100

tggaacttcc cggattacgt gcgtgatttc gtgagtttct gcatggtgaa agggttttga 2160

gtcactcaga gtctaaagaa gaccatcagg ttccttcaca gcttcacaat gtacaaattg 2220

cagtgagtct cagatttctt ctggtagtcc aaggaagtgt cgaagtgtta catgtttaac 2280

tatcagaagt tatttttaga aatgataggt aaccaggtcc aatcagtaaa aataagctgc 2340

atagtcttca ataaaaatct ttactatcca ttggtccagg ttagtcattt ttattcgacg 2400

ttataaaata tt 2412

<210>4

<211>1404

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Fc蛋白的编码序列

<400>4

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

ctcgggttta gaacactgtt ttgagtgtgt acgggtggca cgggtcgtgg acttgaggac 120

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 180

ccccctggca gtcagaagga gaaggggggt tttgggttcc tgtgggagta ctagagggcc 240

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 300

tggggactcc agtgtacgca ccaccacctg cactcggtgc ttctgggact ccagttcaag 360

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 420

ttgaccatgc acctgccgca cctccacgta ttacggttct gtttcggcgc cctcctcgtc 480

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 540

atgttgtcgt gcatggcaca ccagtcgcag gagtggcagg acgtggtcct gaccgactta 600

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 660

ccgttcctca tgttcacgtt ccagaggttg tttcgggagg gtcgggggta gctcttttgg 720

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 780

tagaggtttc ggtttcccgt cggggctctt ggtgtccaca tgtgggacgg gggtagggcc 840

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 900

ctactcgact ggttcttggt ccagtcggac tggacggacc agtttccgaa gatagggtcg 960

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1020

ctgtagcggc acctcaccct ctcgttaccc gtcggcctct tgttgatgtt ctggtgcgga 1080

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1140

gggcacgacc tgaggctgcc gaggaagaag gagatgtcgt tcgagtggca cctgttctcg 1200

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1260

tccaccgtcg tccccttgca gaagagtacg aggcactacg tactccgaga cgtgttggtg 1320

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgat aaatgtgcgt cttctcggag 1380

agggacagag gcccatttac tatt 1404

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

agcatcgatg aaacgtttcc tccaaagtac c 31

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

ctcgaattcc agggtaacat ctattccac 29

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

atcggtaccg agcccaaatc ttctgac 27

<210>8

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

tgttctagat tatcatttac ccggagacag ggag 34

<210>9

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

tctctcgaga agagagaaac gtttcctcca aagtacc 37

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

ttctacgtac agggtaacat ctattccac 29

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>11

ctgtacgtag agcccaaatc ttgtgac 27

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>12

ttcgcggccg cttatcattt acccggagac 30

Claims

1.一种产生OPG融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码OPG、其变体或片段的核苷酸序列和编码Fc蛋白、其变体或片段的核苷酸序列可操作地连于表达载体，得到OPG融合蛋白重组表达载体；

(b)将步骤(a)中的重组表达载体转入甲醇酵母，筛选获得表达OPG融合蛋白的工程菌；

(c)在合适的条件下发酵培养步骤(b)获得的工程菌；

(d)从步骤(c)中的发酵培养产物中纯化分离所述融合蛋白；其中，所述融合蛋白的形式为R1-L-R2和R1-R2，其中R1为OPG蛋白、或其变体或片段，R2为Fc蛋白、或其变体或片段，L为接头；

其中，所述OPG蛋白、或其变体、片段选自：

(1)SEQ ID NO：1所示的OPG蛋白序列；

(2)氨基酸序列22-X，其中X为SEQ ID NO：1所示的包括位置185-401的任何残基；

(3)在(2)所述的氨基酸序列前加上Ile-Asp两个氨基酸；

(4)在(2)所述的氨基酸序列前加上Met；

所述Fc蛋白、或其变体或片段选自：

(A)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

i.一个或多个半胱氨酸残基；

ii.一个或多个酪氨酸残基；

iii.缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；

iv.缺失或用谷氨酰胺取代位置20的谷氨酸；

v.缺失或用丙氨酸取代位置130的谷氨酸；

vi.缺失或用丙氨酸取代位置105的赖氨酸；

vii.缺失或取代位置107的赖氨酸；

viii.缺失N端1-17位的氨基酸序列；

ix.取代或缺失一个或多个残基以消除Fc受体结合位点；

x.取代或缺失一个或多个残基以消除补体(Clq)结合位点；

xi.亚部分i-x的组合。

2.权利要求1的所述方法，其特征在于，所述接头选自：

(a)ala-(ala)n-ala，n是1-4间的整数；

(b)gly-(gly)n-gly，n是0-4间的整数；

(c)gly-pro-gly；

(d)gly-gly-pro-gly-gly；

(e)val；

(f)tyr-val；

(g)ser-gly-(gly)6-gly；

(h)亚部分(a)-(g)的任何组合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c)包括在pH 4.0-8.0、28-37℃、溶氧控制在30％以上的条件下发酵，培养4-24小时，然后加入甘油或葡萄糖；当菌体OD600值达到15-200时，加入诱导剂诱导表达，此时控制pH为3.0-7.0，诱导12-72小时。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d)包括采用Protein A亲和层析、分子筛层析获得目的蛋白。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列22-X是第22-201位氨基酸。