JP2009531036A - Vegf受容体融合タンパク質およびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Flt−1のIgドメイン2とIgドメイン3とを、またはFlt−1のIgドメイン2とKDRのIgドメイン3とKDRのIgドメイン4とを含む血管内皮細胞成長因子(VEGF)受容体融合タンパク質、融合タンパク質をコードする遺伝子、融合タンパク質を含む薬学的組成物、ならびに融合タンパク質の薬学的使用を提供する。当該融合タンパク質は、糖尿病性網膜症のような血管形成を含む眼疾患のための処置に用いることができる。
Description
〔発明の分野〕
本発明は、血管形成に起因する多様な眼疾患のための、VEGF受容体融合タンパク質、VEGF受容体融合タンパク質を含む薬学的組成物、および関連する治療用途に関する。
本発明は、血管形成に起因する多様な眼疾患のための、VEGF受容体融合タンパク質、VEGF受容体融合タンパク質を含む薬学的組成物、および関連する治療用途に関する。
〔発明の背景〕
網膜血管および脈絡膜(chorodial)血管は、網膜の必須の構成要素である。創傷および疾患に起因する血管壁構造および血管の機能の異常な変化は、視力低下および失明を導く主な要因である。例えば、網膜血管の過形成およびそれ以後の網膜の分離をもたらす真性糖尿病を原因とする糖尿病性網膜症(diabetic retinopathy)は、失明を導く主な要因である。また、網膜血管新生は、眼の傷または手術からの回復の間に起こる。網膜血管におけるこの種の過形成は、精神的変化または失明を導く重要な要因である(Nature 438: 932-938, 2005)。
網膜血管および脈絡膜(chorodial)血管は、網膜の必須の構成要素である。創傷および疾患に起因する血管壁構造および血管の機能の異常な変化は、視力低下および失明を導く主な要因である。例えば、網膜血管の過形成およびそれ以後の網膜の分離をもたらす真性糖尿病を原因とする糖尿病性網膜症(diabetic retinopathy)は、失明を導く主な要因である。また、網膜血管新生は、眼の傷または手術からの回復の間に起こる。網膜血管におけるこの種の過形成は、精神的変化または失明を導く重要な要因である(Nature 438: 932-938, 2005)。
加齢性黄斑変性症(AMD)は、網膜の中心領域で起こる細胞もしくは組織の分解および血管増殖を原因とする疾患である。AMDは、ウエットフォーム(浸出性形態)およびドライフォームに分類できる。ウエットAMDは、脈絡膜血管新生を最も一般的に原因とし、かつ失明を導く主要な要因でもある。
血管内皮細胞成長因子(VEGF)は、特に、血管形成を媒介するタンパク質である(Am. J. Pathol. 167: 1451-1459, 2005)。VEGFは、内皮細胞の分裂および増殖を刺激し、血管新生の開始を誘導し、かつ酸素および栄養素を組織細胞へ提供する。多くの研究は、一度栄養素の不足により網膜の光受容体細胞が変性(虚血性萎縮症)し始めると、網膜におけるVEGFの濃度が増加し始めて血管新生を促進することを示している。この過程は血管形成(angiogenesis)と呼ばれる。眼において、新たに生成された血管は、形態に関して正常の血管とは異なり、その血管内腔は、不規則であり、かつ多くの場合、その血管壁は漏れやすい。高い浸透性のまたは漏れやすい血管のこの種の異常な成長は、多くの場合、次々と視力に影響を与える網膜における傷、および分離でさえももたらす。
多くの研究において、ウエットAMD患者の脈絡膜組織が高レベルのVEGF発現を示すことが示されている(Invest. Opthal. Vis. Sci 37: 855-868, 1996; Microvascular Res. 64: 162-169, 2002)。VEGFの発現レベルとウエットAMDとの間の相関関係を考慮すると、VEGFは、AMD診断において生化学的指標として用いることができる(Br. J. Opthalmol. 88: 809-815, 2004)。
いくつかのVEGF抑制剤は、内皮細胞のVEGFとVEGF受容体(flt−1、KDRなど)との間の相互作用を阻害できる。従って、上記VEGF抑制剤は、網膜の出血を予防しかつ止めるように、VEGFによって媒介される情報伝達を阻害でき、かつ高レベルのVEGF発現に起因する血管形成を阻害する。この種のVEGF阻害剤としては、マクゲン(ペガプタニブソディウム(pegaptanib sodium))、ルセンティス(Lucentis)、VEGF−Trap、アバスチン(Avastin)(べバシズマブ)(bevacizumab)、およびAdPEDFなどが挙げられる。特に、マクゲンおよびアバスチンは米国食品医薬品庁(FDA)により承認されており、かつ市場に流通している。
〔発明の要旨〕
本発明の一態様は、アミノ酸配列が配列番号2および4として示される、VEGFを抑制する新規の融合タンパク質FP7およびFP8を提供することである。
本発明の一態様は、アミノ酸配列が配列番号2および4として示される、VEGFを抑制する新規の融合タンパク質FP7およびFP8を提供することである。
FP7は、FLT−1の2番目のIg様ドメインとKDRの3番目のIg様ドメインとKDRの4番目のIg様ドメインとからなる。FP8は、FLT−1の2番目のIg様ドメインとKDRの3番目のIg様ドメインとからなる。
本発明の他の態様は、DNA配列が配列番号1および3として示される、VEGF受容体融合タンパク質FP7およびFP8をコードする遺伝子を提供することである。
本発明の他の態様は、VEGF受容体融合タンパク質FP7およびFP8をコードする上記遺伝子を含む発現ベクターを提供することである。上記発現ベクターは、プラスミドベクター、ファージ、ウイルスなどのような、任意の一般的なベクターであってよい。
本発明の他の態様は、VEGF抑制性融合タンパク質FP7およびFP8の調製方法を提供することである。当該方法は、Flt−1およびKDRの遺伝子増幅、制限酵素消化によるFlt−1およびKDR断片の調製、Flt−1の2番目のIg様ドメインとKDRの3番目のIg様ドメインと4番目のIg様ドメインとの、もしくはFlt−1の2番目のIg様ドメインとKDRの3番目のIg様ドメインとのライゲーション;ライゲーションの結果産物を含む発現ベクターの構築;ならびに融合タンパク質を産生するための上記ベクターの宿主細胞への形質移入を含む。
本発明の他の態様は、眼疾患に関連する血管形成を処置するための薬学的組成物を提供することである。当該薬学的組成物は、薬学的有効量のVEGF受容体融合タンパク質FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、およびFP8の任意の1つまたは組み合わせ(例えば、FP7および/またはFP8など)、ならびに任意に1以上の薬学的に受容可能な担体(特に1以上の一般的に眼科の処置に用いられる担体)を含む。
本発明のさらなる態様は、血管形成に関連する眼疾患の処置におけるVEGFを抑制する融合タンパク質の使用を提供することである。ここで、上述の融合タンパク質は、VEGFに結合可能である組み換え受容体融合タンパク質である。より具体的には、上述の融合タンパク質は、中国特許出願第200510073595.4号明細書(抗血管形成融合タンパク質およびそれらの利用)に記載されたFP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、ならびに本明細書に記載したFP7およびFP8からなる群より選択された任意の1つまたは組み合わせである。上記融合タンパク質の中でも、融合タンパク質FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6のアミノ酸配列は、上記中国特許出願第200510073595.4号明細書(上述の明細書は、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる)に開示された。FP1は、FLT−1の2番目のIg様ドメイン、KDRの3番目のIg様ドメイン、およびヒト免疫グロブリンFcからなる。FP2は、KDRの1番目のIg様ドメイン、FLT−1の2番目のIg様ドメイン、KDRの3番目のIg様ドメイン、およびヒト免疫グロブリンFcからなる。FP3は、FLT−1の2番目のIg様ドメイン、KDRの3番目および4番目のIg様ドメイン、ならびにヒト免疫グロブリンFcからなる。FP4は、FLT−1の2番目のIg様ドメイン、KDRの3番目のIg様ドメイン、FLT−1の4番目のIg様ドメイン、およびヒト免疫グロブリンFcからなる。FP5は、FLT−1の2番目のIg様ドメイン、KDRの3番目から5番目のIg様ドメイン、およびヒト免疫グロブリンFcからなる。FP6は、FLT−1の2番目のIg様ドメイン、KDRの3番目のIg様ドメイン、FLT−1の4番目から5番目のIg様ドメイン、およびヒト免疫グロブリンからなる。融合タンパク質FP7およびFP8のアミノ酸配列は、配列表における配列番号2および4として示される。眼疾患に関連する上述の血管形成は、限定されないが、AMD、糖尿病性網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、網膜血管閉塞、処置(例えば、レーザー凝固法、および外科的網膜移植)の失敗に関する血管形成を含む。
本発明の他の態様は、処置を必要とする患者に対して、薬学的有効量のFP3、FP7および/またはFP8の投与を含む処置方法を提供することである。
本発明の他の態様は、VEGF受容体融合タンパク質FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、およびFP8からなる群から選択した任意の1つまたは組み合わせを上記疾患に罹患した患者に対して投与することにより、血管形成に関連する眼疾患を処置する方法を提供することである。ここで、当該眼疾患は、限定されないが、AMD、糖尿病性網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、網膜血管閉塞、処置(例えば、レーザー凝固法、および外科的網膜移植)の失敗に関する血管形成を含む。
上記融合タンパク質は、精製された形態において使用され得るか、またはそれらの溶媒和物、または塩、または塩の溶媒和物として使用され得る。本発明において述べられる上記融合タンパク質は、これらの全ての形態を含む。
本発明において述べられるVEGF受容体融合タンパク質FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、およびFP6は、中国特許出願第200510073595.4号明細書に記載されており、かつ当該明細書中の方法および他の同様の方法に従って調製され得る。FP7およびFP8は、新規の化合物であり、その調製は、中国特許出願第200510073595.4号明細書に記載された方法と同様の方法により実施され得る。そして、以降の本発明の実施例に当該調製の詳細について記載されている。
遺伝子組み換え技術により得られた本発明の組み換えタンパク質は、医薬品品位に精製され得、そしてそれから、所望の製剤の必要に応じて、従来の薬学的に受容可能な担体および/または他の補助剤と混合され得、かつ従来の製剤方法論に従って好適な薬学的製剤として調製され得る。これらの製剤は、静脈内投与、硝子体内投与、腹腔内投与、皮下投与、眼に局所的な投与(例えば、点眼)に関して使用され得;中でも、好ましいのは、溶液製剤、または使用前に水分補給されて溶液になり得る凍結乾燥製剤である。
本発明において記載されている製剤において、融合タンパク質の濃度は、0.01mg/mL〜1000mg/mLの間である。具体的な投与量は、製剤の形態、臨床的な必要性などに依存する。一般的なガイドラインでは、各処置ごとに0.1mg〜3000mg、好ましくは1mg〜2000mgを毎日、2日に1回、3日に1回、4日に1回、5日に1回、6日に1回、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、1月に1回、または1日に数回(例えば、1日に2〜3回)投与することを提案している。
薬学的に受容可能な上述の担体は、本発明に記載される製剤の形態に好適な任意の担体、好ましくは以下のもの:リン酸ナトリウム(sodium phosphate)、コハク酸ナトリウム(sodium succinate)、ヒスチジン(histidine)、マンニトール(mannitol)、トレハロース無水物(trehalose dihydrate)、ポリソルベート20(polysorbate 20)、塩化ナトリウム(sodium chloride)、スクロース(sucrose)、トロメラモル(tromeramol)、セルロース、修飾されたセルロースまたはラクトースのうちの1つ以上であり得る。上述の製剤は、0〜100mM(例えば、1〜100mM)の濃度、および3〜9まで変動するpHを有する、リン酸塩(phosphate)、クエン酸塩(citrate)、酢酸塩(acetate)、コハク酸塩(succinate)、トロメラモル(toromeramol)(トリス(Tris))、ヒスチジン(histidine)、またはそれらの組み合わせのようなpH製剤緩衝液(formulation buffer)を含むことができ;そしてまた、塩化ナトリウム(sodium chloride)(0〜200mM、例えば1〜100mMまで変動する濃度)、ブドウ糖(dextrose)(0%〜50%、例えば1%〜30%まで変動する濃度)のような浸透圧調節剤を含むことができ;そして、0%〜40%、好ましくは1%〜30%の濃度を有する、アミノ酸(amino acid)、グリセロール(glycerol)、シクロデキストリン(cyclodextrin)、スクロース(sucrose)、トレハロース無水物(trehalose dihydrate)のような安定化剤を含むことができ;チメロサール(thimerosal)、亜硫酸水素ナトリウム(sodium bisulfite)、ベンジルアルコール(benzyl alcohol)などの保存剤を含むことができる。凍結乾燥製剤において、マンニトール(mannitol)のような賦形剤は、0%〜40%、好ましくは0.1%〜10%の濃度を有して含まれ得る。一方、溶液製剤において、ポリソルベート20(polysorbate 20)またはポリソルベート80(polysorbate 80)、SDSのような界面活性剤は、0%〜2%、好ましくは0.01%〜1%の濃度を有して含まれ得る。また、本発明において記載した上記製剤は、保存剤、安定化剤、溶媒、共溶媒を含むことができる。好ましい溶媒は、注入のための水、エタノール、グリセロール(glycerol)のような有機溶媒、またはその他の等浸透圧溶液である。
驚くべきことに、本発明では、本明細書における融合タンパク質が眼疾患に関連する多様な血管形成の処置に有効であることを見出している。当該眼疾患は、例えば、AMD、糖尿病性網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、網膜血管閉塞、処置(例えば、レーザー凝固法、および外科的網膜移植)の失敗に関する血管形成である。加えて、当該融合タンパク質は、安定性が高く、安全性が高く、副作用が小さく、効果的である。実験によって、以下の実施例において詳細が示されるとともに、本発明の利点が実証されている。
〔図面の簡単な説明〕
図1:本発明に記載された融合タンパク質の8つの融合タンパク質の模式図;
図2:融合タンパク質のVEFG結合親和性の比較;
図3:虚血性萎縮症を原因とする網膜の血管形成における融合タンパク質の効果;
図4:脈絡膜血管新生における融合タンパク質の効果。
図1:本発明に記載された融合タンパク質の8つの融合タンパク質の模式図;
図2:融合タンパク質のVEFG結合親和性の比較;
図3:虚血性萎縮症を原因とする網膜の血管形成における融合タンパク質の効果;
図4:脈絡膜血管新生における融合タンパク質の効果。
〔本発明を実施する最良の形態〕
以下の実施例では、本発明をさらに明確にするが、当該実施例は、本発明の保護範囲を限定ために解釈されるべきではない。
以下の実施例では、本発明をさらに明確にするが、当該実施例は、本発明の保護範囲を限定ために解釈されるべきではない。
(実施例1.FP7の構築)
融合タンパク質FP7は、鋳型としてHUVEC細胞由来のmRNA抽出物、および以下のプライマーを用いた増幅によって得られたcDNAのFlt−1遺伝子断片およびKDR遺伝子断片から構築された。
融合タンパク質FP7は、鋳型としてHUVEC細胞由来のmRNA抽出物、および以下のプライマーを用いた増幅によって得られたcDNAのFlt−1遺伝子断片およびKDR遺伝子断片から構築された。
FLT−1 D2(F):5’-cctttcgtagagatgtacagtga-3’
FLT−1 D2(R):5’-tatgattgtattggtttgtccat-3’
KDR D3(F):5’-gatgtggttctgagtccgtctca-3’
KDR D3−4(R):5’-cggtgggacatacacaaccaga-3’。
FLT−1 D2(R):5’-tatgattgtattggtttgtccat-3’
KDR D3(F):5’-gatgtggttctgagtccgtctca-3’
KDR D3−4(R):5’-cggtgggacatacacaaccaga-3’。
具体的な条件は、Flt−1およびKDRIg様ドメインのPCR産物を得るための、95℃において30分間の変性、56℃において45秒間のアニーリング、72℃において2分間の伸張の、30サイクルのPCR増幅である。上記PCR産物をTAクローニング(cloning)キットを用いて、PCR2.1プラスミドにクローニングした。その後、E.coliを形質転換し、白いコロニーを選択し、かつLB培地で一晩培養した。上記プラスミドをキアゲン(Qiangen)プラスミド精製キットで抽出し、そしてそれから制限酵素消化および塩基配列の確認を行った。Flt−1断片、KDR断片、およびIgGヒンジ領域のcDNAをソーイングPCR(Sewing PCR)により共にライゲーションした。EcoRI部位を末端のプライマーに導入した。PCR産物は、キアゲンキットを用いて精製され、EcoRIを用いた制限酵素消化に続いて、そしてそれから、pcDNA3.1プラスミドにクローニングされた。上記組み換えプラスミドを使用してEcoliが形質転換され、続いて陽性コロニーが選択され、LB培地で一晩培養された。上記プラスミドをキアゲン(Qiagen)キットで抽出し、かつ制限酵素消化および塩基配列の確認を行った。確認したプラスミドを用いて、融合タンパク質FP7を安定して産生する細胞株を得るために、CHO細胞がトランスフェクトされた。FP7のアミノ酸配列は、配列番号3に示されており、FP7のDNA配列は、配列番号1に示されている。ヒンジ(hinge)領域の部分は、融合タンパク質のC末端に維持された。
(実施例2.FP8の構築)
融合タンパク質FP8を鋳型としてFP7、およびプライマーflt−1 D2(F):5’-cctttcgtagagatgtacagtga-3’を用いてPCR増幅した。後者のDNA配列は、KDR D3−hing(R):5’-aggtgctgggcacagtgggcatgtgtgagttttgtctttttcatggaccctgacaaatg-3’であった。融合タンパク質FP8は、KDRの3番目のIg様ドメインの相補的な配列、およびヒトIgGFcヒンジの部分配列を含む。PCR反応の増幅条件および遺伝子クローニングは、実施例1と同様に行った。最後に、クローニングしたFP8を有するPcDNA3.1プラスミドを用いてCHO細胞にトランスフェクトし、かつFP8融合タンパク質を産生するための安定した細胞株を得た。FP8のアミノ酸配列は、配列番号4に示され、そのDNA配列は配列番号2に示される。
融合タンパク質FP8を鋳型としてFP7、およびプライマーflt−1 D2(F):5’-cctttcgtagagatgtacagtga-3’を用いてPCR増幅した。後者のDNA配列は、KDR D3−hing(R):5’-aggtgctgggcacagtgggcatgtgtgagttttgtctttttcatggaccctgacaaatg-3’であった。融合タンパク質FP8は、KDRの3番目のIg様ドメインの相補的な配列、およびヒトIgGFcヒンジの部分配列を含む。PCR反応の増幅条件および遺伝子クローニングは、実施例1と同様に行った。最後に、クローニングしたFP8を有するPcDNA3.1プラスミドを用いてCHO細胞にトランスフェクトし、かつFP8融合タンパク質を産生するための安定した細胞株を得た。FP8のアミノ酸配列は、配列番号4に示され、そのDNA配列は配列番号2に示される。
(実施例3.融合タンパク質のVEGFに対する結合親和性実験)
本発明において、VEGFの量を測定するることで、多くの融合タンパク質のVEGFに対する親和力を決定した。実験において、既知量のVEGF(10PM)を試験管に添加し、そしてそれから異なる程度まで希釈された融合タンパク質(図2に示されている)を等しい量にして、添加し、そして混合して、37℃で1時間インキュベートした。1時間後、試験管における遊離VEGFの量をVEGF分析キット(VEGF assay Kit)(R&D systems)を用いて決定した。分析後のアッセイの結果を図2に示す(FP1、FP3、FP7、およびFP8は、それぞれ11.2PM、4.3PM、4.1PM、および11.2PMのIC50として示される親和性を有して、VEGFと効率的に結合できることを実証している)。この実験は、FP3およびFP7が、インビトロにおいてVEGFに対する同様の親和性を有し、一方、FP8およびFP1が、同様であるが、前者の2つよりも低い親和性であることを証明している。FP1〜FP6のVEGF親和性は、実施例3に記載した中国特許出願第200510073595.4号明細書に既に記載されている。
本発明において、VEGFの量を測定するることで、多くの融合タンパク質のVEGFに対する親和力を決定した。実験において、既知量のVEGF(10PM)を試験管に添加し、そしてそれから異なる程度まで希釈された融合タンパク質(図2に示されている)を等しい量にして、添加し、そして混合して、37℃で1時間インキュベートした。1時間後、試験管における遊離VEGFの量をVEGF分析キット(VEGF assay Kit)(R&D systems)を用いて決定した。分析後のアッセイの結果を図2に示す(FP1、FP3、FP7、およびFP8は、それぞれ11.2PM、4.3PM、4.1PM、および11.2PMのIC50として示される親和性を有して、VEGFと効率的に結合できることを実証している)。この実験は、FP3およびFP7が、インビトロにおいてVEGFに対する同様の親和性を有し、一方、FP8およびFP1が、同様であるが、前者の2つよりも低い親和性であることを証明している。FP1〜FP6のVEGF親和性は、実施例3に記載した中国特許出願第200510073595.4号明細書に既に記載されている。
この実験は、KDRの4番目のIg様ドメインのアミノ酸配列が、融合タンパク質のVEGF結合能をさらに増強できることを示している。
(実施例4.網膜虚血萎縮症に起因する血管形成を阻害する融合タンパク質の実験結果)
7日齢の新生マウスを、高酸素分圧(75%±2%)、23±2℃に制御された温度、および日照条件を有するインキュベーターに置いた。数日後には、網膜の中心に血管新生が起こっておらず;さらに5日後、上記幼いマウスを正常の酸素分圧のインキュベーターに戻した。比較的低い酸素分圧にに起因する、マウスの網膜における低酸素状態のために、虚血性萎縮症に起因する糖尿病性網膜症およびその他の網膜の変性における血管形成成長と同様に、血管形成成長が誘導された。
7日齢の新生マウスを、高酸素分圧(75%±2%)、23±2℃に制御された温度、および日照条件を有するインキュベーターに置いた。数日後には、網膜の中心に血管新生が起こっておらず;さらに5日後、上記幼いマウスを正常の酸素分圧のインキュベーターに戻した。比較的低い酸素分圧にに起因する、マウスの網膜における低酸素状態のために、虚血性萎縮症に起因する糖尿病性網膜症およびその他の網膜の変性における血管形成成長と同様に、血管形成成長が誘導された。
モデルを用いて、3つの融合タンパク質(FP1、FP2、およびFP7)を、網膜虚血萎縮症と関連する血管形成への抑制性の影響について評価した。
高酸素分圧を有するインキュベーターに5日間おいた後、幼いマウスを正常の酸素分圧のインキュベーターに戻した。幼いマウスは、各10匹ずつ5群に分けれら、かつそれから、1日後に30mg/kgの融合タンパク質を腹腔内に投与された。上記投与を、2日に1回、計4回行った。コントロール群におけるマウスは、同量のFcタンパク質を用いて注射された。処置の後、各群からの6匹のマウスは、蛍光FAMの心臓注入を受けた。10分後、幼いマウスの網膜が取り出されて、血管形成成長を分析した。蛍光顕微鏡下において、網膜を水らにし、かつ血管形成および蛍光の漏れについて観察した。各群の他の4匹のマウスについては、眼を取り出してパラフィンで包埋した。そしてそれから、切片化してH&Mで染色した。顕微鏡下において、血管内皮細胞核の数を数えて、血管形成に対する融合タンパク質の影響を分析した(Investigative Ophthalomogy Visual Science 43, 1994-2000, 2002)。その結果を図3に示す。Fcタンパク質の注入を受けた幼いマウスの網膜は、いくつもの病変を示している。多くの不規則な血管が脈絡膜上に観察され得る。融合タンパク質の注入を受けた幼いマウスの網膜は、明らかな血管形成を全く示していない(図3に示されている)。中でも、FP3は最も有効であり、かつFP1およびFP7も効果的であった(Fc領域の不足が、おそらくこれらの安定性に影響を及ぼしている)。
一方で、我々は、硝子体内投与したこれらの融合タンパク質の抗血管形成効果について試験している。同じ動物モデルにおいて、正常酸素分圧のインキュベーターに戻した1日後、各眼について0.5μgの融合タンパク質の硝子体内投与を1動物につき1回だけ行った。処置の7日後、動物の網膜を上述のように回収し、かつ処置した。血管形成に対するこれらの融合タンパク質の効果を図3に示す。その結果は、これらの融合タンパク質が、硝子体内投与後、血管形成に対する顕著な抑制を示すことを示している。硝子体内投与は、腹腔内投与と比べてよりよい有効性を示している。一方、我々は、これらの実験において、FP7はFP3同様であることをこれらの実験において観察しており、かつ両者ともFP1よりより良好であった。この実験では、硝子体内投与のために、FP7は血液循環に入る必要がなく、従って、血液の循環におけるその低い安定性は、その有効性にに影響を与えなかった。
(実施例5.レーザー誘導脈絡膜血管新生に対する融合タンパク質の影響)
公開文献(American Journal Pathology 153, 1641-1646, 1998)に従って、我々は、眼におけるレーザー誘導新血管新生による、AMDモデルをラットにおいて確立している。約150匹のラットを4群に分け、その中のコントロール群におけるラット10匹は、Fcタンパク質(20mg/kg)の皮下注射を受け、一方、各試験群におけるラット10匹は、レーザー処置の前日、およびレーザー処置の3、6、9および12日後に、計5回の20mg/kgのFP1、FP3およびFP7の皮下注射を受けた。レーザー処置の15日後、上記ラットは、50mgの蛍光標識したデキストランを受け取った。麻酔処置下で眼球を取り出した後、脈絡膜新血管新生(CNV)病変を分析するために、速やかに脈絡膜を分離し、かつ平坦化するかまたは凍結切片化し、かつそれから蝋を用いて包埋した。図4に示されるように、結果は、融合タンパク質処置を受けたラットにおいて、コントロール群に由来するCNV領域と比べてCNV領域が小さかった(中でも、FP3の有効性は、FP1またはFP7の有効性よりも良好であった)ことを示している。FP7およびFP1のCNVに対する抑制効果は同程度であった。
公開文献(American Journal Pathology 153, 1641-1646, 1998)に従って、我々は、眼におけるレーザー誘導新血管新生による、AMDモデルをラットにおいて確立している。約150匹のラットを4群に分け、その中のコントロール群におけるラット10匹は、Fcタンパク質(20mg/kg)の皮下注射を受け、一方、各試験群におけるラット10匹は、レーザー処置の前日、およびレーザー処置の3、6、9および12日後に、計5回の20mg/kgのFP1、FP3およびFP7の皮下注射を受けた。レーザー処置の15日後、上記ラットは、50mgの蛍光標識したデキストランを受け取った。麻酔処置下で眼球を取り出した後、脈絡膜新血管新生(CNV)病変を分析するために、速やかに脈絡膜を分離し、かつ平坦化するかまたは凍結切片化し、かつそれから蝋を用いて包埋した。図4に示されるように、結果は、融合タンパク質処置を受けたラットにおいて、コントロール群に由来するCNV領域と比べてCNV領域が小さかった(中でも、FP3の有効性は、FP1またはFP7の有効性よりも良好であった)ことを示している。FP7およびFP1のCNVに対する抑制効果は同程度であった。
(実施例6.眼疾患処置における融合タンパク質の応用)
これらの融合タンパク質は、血管形成に関連する多様な眼疾患を処置するために、硝子体内投与および静脈内投与のような好適な製剤形態によって投与され得る。上記眼疾患としては、AMD、糖尿病性網膜症(diabetic retinopathy)、糖尿病性黄斑浮腫(diabetic macular edema)、網膜血管閉塞(central retinal vein occlusion)が挙げられる。一方、これらの融合タンパク質は、血管形成に起因する治療の失敗の危険を減らすために、光線感作物質またはレーザー治療(光凝固)(photocoagulation)のような他の治療法と組み合わせて利用され得る。また、これらの融合タンパク質は手術(例えば、網膜移植後に、血管形成のために当該手術が失敗することもあり得る)と組み合わせられ得る。例えば、当該手術の時点においてこれらの融合タンパク質の処置を受けている場合、患者は、網膜移植の成功率を向上できることもあり得る。AMD患者は、所定の眼の検査の後、視力の基準を設定され得、かつそれからこれらの融合タンパク質(例えば、FP3またはFP7)を硝子体内投与によって受け取ればよい。処置後、AMDに対するこれらの融合タンパク質の影響を記録するために、患者は、病院で観察および検査を受けた。代表的に、検査を、処置の1、2、6、14、30、および90日後のそれぞれ1回を起こす。一方、患者は、2〜8週間毎にそれぞれの注入の複数の処置を受けてもよい。各注入投与量は、眼ごとに10μgから5mgまで変動し得る。
これらの融合タンパク質は、血管形成に関連する多様な眼疾患を処置するために、硝子体内投与および静脈内投与のような好適な製剤形態によって投与され得る。上記眼疾患としては、AMD、糖尿病性網膜症(diabetic retinopathy)、糖尿病性黄斑浮腫(diabetic macular edema)、網膜血管閉塞(central retinal vein occlusion)が挙げられる。一方、これらの融合タンパク質は、血管形成に起因する治療の失敗の危険を減らすために、光線感作物質またはレーザー治療(光凝固)(photocoagulation)のような他の治療法と組み合わせて利用され得る。また、これらの融合タンパク質は手術(例えば、網膜移植後に、血管形成のために当該手術が失敗することもあり得る)と組み合わせられ得る。例えば、当該手術の時点においてこれらの融合タンパク質の処置を受けている場合、患者は、網膜移植の成功率を向上できることもあり得る。AMD患者は、所定の眼の検査の後、視力の基準を設定され得、かつそれからこれらの融合タンパク質(例えば、FP3またはFP7)を硝子体内投与によって受け取ればよい。処置後、AMDに対するこれらの融合タンパク質の影響を記録するために、患者は、病院で観察および検査を受けた。代表的に、検査を、処置の1、2、6、14、30、および90日後のそれぞれ1回を起こす。一方、患者は、2〜8週間毎にそれぞれの注入の複数の処置を受けてもよい。各注入投与量は、眼ごとに10μgから5mgまで変動し得る。
AMD、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫の患者からの臨床提供者に由来して、融合タンパク質FP3、FP7は、対照実験と比較されている。
(I)AMD
1.融合タンパク質FP3の有効性
コントロール群は、光凝固治療を受け;一方、試験群はFP3を受けた。
1.融合タンパク質FP3の有効性
コントロール群は、光凝固治療を受け;一方、試験群はFP3を受けた。
評価基準は、中国保健省(Chinese Department of Health)「従来の中国製医薬品および新規医薬品によるAMD処置の臨床検査指針」の有効性評価基準に従った。
(1)顕著に有効である:(i)変視症などの顕著な症状改善;(ii)中心の視野が、少なくとも4ラインだけ向上される;(iii)小さな収縮または視野中央の中心暗点の明らかな菲薄化;(iv)黄斑浸出物および出血の明らかな吸着、神経性上皮細胞および色素上皮細胞の分離の消失もしくはまたは明らかな収縮;(v)蛍光眼底血管造影法により分析した網膜の血管形成の進行がないことまたは低下;蛍光の浸出の大幅な減少;コントラスト感度の若干の改善。
上述の条件の4つを満たせば、顕著な有効性という評価がつけられる。
(2)有効である:(i)変視症などの症状改善;(ii)中心の視野が少なくとも2ラインだけ改善する;(iii)視野中央の中心暗点の菲薄化;(iv)黄斑浸出物および出血の部分的な吸着、神経性上皮および色素上皮細胞の分離のいくらかの収縮;(v)網膜血管造影法における減少した蛍光色素の浸出;コントラスト感度の若干の改善。
上記条件の2〜3つを満たせば、有効という評価がつけられる。
(3)無効である:有効な基準を満たさない。
結果は、融合タンパク質FP3がAMDの処置に関して顕著な有効性を示すことを示している。
2.FP7の有効性
コントロール群に光凝固治療を受け;一方、試験群はFP7を受けた。
コントロール群に光凝固治療を受け;一方、試験群はFP7を受けた。
評価基準は上述のものと同じである。
結果は、AMD処置に関する融合タンパク質FP7の有効性が、光凝固処置と同じか、より良好であるとを示している。
(II)糖尿病性網膜症
コントロール群は網膜光凝固を受け;一方、試験群はFP3を受けた。
コントロール群は網膜光凝固を受け;一方、試験群はFP3を受けた。
有効性評価基準は、「従来の中国製医薬品および新規医薬品の臨床検査指針」の糖尿病性網膜症の有効性評価基準に従った。上記評価基準は、4段階の有効性:SE(顕著に有効である)、E(有効である)、IE(無効である)、およびW(悪化する)を含む。
1.顕著に有効である(SE):
(1)視力が、少なくとも4ラインだけ改善するか、または1.0以上に良い。
(1)視力が、少なくとも4ラインだけ改善するか、または1.0以上に良い。
(2)網膜の微細動脈瘤の数が(+++)から(++)に減少するか、または(++)から(+)に減少するか、または(+)から消失する;網膜の出血が、(+++)から(+)に減少するか、または(++)から消失する;浸出物が(+++)から(++)に減少するか、または(++)から(+)に減少するか、または(+)から消失することが、眼底試験において示される。微細動脈瘤、出血、および浸出物の少なくとも2つが上述した要求を満たす。
(3)平均血液循環時間が顕著に減少し、黄斑浮腫が顕著に緩和し、網膜の毛細血管の非灌流領域が減少し、血管の漏れが明らかに低減することが、蛍光眼底血管造影法によって示される。上述の基準の少なくとも2つを、少なくとも20%の向上の度合いを有して、満たすべきである。
2.有効である(E):
(1)視力が少なくとも2ライン改善する。
(1)視力が少なくとも2ライン改善する。
(2)網膜の微細動脈瘤の数が(+++)から(++)に減少するか、または(++)から(+)に減少するか、または(+)から消失する;網膜の出血が(+++)から(+)に減少するか、または(++)から消失する;浸出物が(+++)から(++)に減少するか、または(++)から(+)に減少するか、(+)から消失する。微細動脈瘤、出血、および浸出物の少なくとも1つが上述の要求を満たすべきである。
(3)平均血液循環時間が減少し、黄斑浮腫が緩和し、網膜の毛細血管の非灌流領域が減少し、、血管の漏れが明らかに低減することが、蛍光眼底血管造影法によって示される。上述の基準の少なくとも2つを、少なくとも10%の向上の度合いを有して、満たすべきである。
3.無効である(IE):上述に示される要求を満たさない。
4.悪化する(W):
(1)視力が2ライン以上悪くなる。
(1)視力が2ライン以上悪くなる。
(2)眼底のカラー撮影法が、血管形成のような増殖性の変化を示す。
(3)網膜の毛細血管の非灌流領域が増加し、黄斑浮腫が悪化し、および血管の漏れが増加することが、蛍光眼底血管造影法によって示される。
注釈:
(1)視力試験は、標準の視力表を用いて行われる(1の目盛)。0.1よりも低い場合は、0.02毎に1ラインとして数える。
(1)視力試験は、標準の視力表を用いて行われる(1の目盛)。0.1よりも低い場合は、0.02毎に1ラインとして数える。
(2)眼底の変化は、検眼鏡またはカラー撮影法に従って評価され、かつ微細動脈瘤は、蛍光眼底血管造影法の陰性によって評価された。
(3)(+)は、多くないもしくは数えられる微細動脈瘤、出血、または浸出物を示;(++)は、多くのもしくは数えることが困難な微細動脈瘤、出血、または浸出物を示す;(+++)は、多くの数えることができない微細動脈瘤ならびに顕著な出血および顕著な浸出物、ならびに同時に融合したものを表す。
(4)有効性を評価する場合、視力、眼底の変化、および蛍光観察法の少なくとも2つがに注意しなければならない。
結果は、融合タンパク質FP3は、糖尿病性網膜症の処置において、レーザー光凝固と同様の有効性を有することを示している。
(III)糖尿病性黄斑浮腫
コントロール群は光凝固を受け、試験群はFP3を受けた。
コントロール群は光凝固を受け、試験群はFP3を受けた。
有効性の評価基準は、Ren Lianerによる「糖尿病性網膜症に関するアルゴンレーザー凝固の臨床試験」(Journal of Ophthalmology, 1998, 7 (2): 86-88)に従った。
視力の評価基準は標準の視力表に従った。顕著に有効である(SE)という評価は、処置後に視力が少なくとも2ライン向上した場合に、つけられた。無効である(IE)という評価は、視力が少なくとも2ライン悪化した場合に、つけられ;その他は、視力の変化無し(E)という評価がつけられた。処置前に、視力が0.1以下である場合、≧±0.02の変化が、視力の向上または悪化として評価され、その他は、変化無しとみなされた。
黄斑浮腫の低減の程度は、レーザーの光凝固の前または後に、眼底蛍光血管造影法に従って評価された。有効である(E)という評価は、黄斑の領域に浸出物が無いか、または浸出物が少なくとも領域の4分の1に縮小した場合に、つけられた。無効である(IE)評価は、浸出物が顕著に減少しなかったか、または増加でもした場合につけられた。
結果は、VEGF受容体融合タンパク質の硝子体内投与が、黄斑浮腫の患者における処置後に、短期(3ヶ月)または比較的長期(6ヶ月)の両者においてレーザー光凝固よりも有効性が高いことを示している。
(IV)網膜静脈閉塞
コントロール群は、光凝固を受け;一方、試験群はFP3を受けた。
コントロール群は、光凝固を受け;一方、試験群はFP3を受けた。
有効性は、Zhang Huirongによる「網膜静脈閉塞の評価」(Journal of Beijing Medical College, 1982, 14: 118)に従って評価された。
(実施例7.眼科系凍結乾燥製剤における融合タンパク質FP3の調製)
最初に、製剤緩衝液(formulation buffer)(10mmol/L ヒスチジン、9% トレハロース無水物、および0.05% ポリソルベート20(pH6.0)を含む)が調製され、それからFP3の好適な製剤原料(drug substance)が溶解され、所要のタンパク質濃度(10mg/mL)にまで上記製剤緩衝液を用いてそれが希釈され、そしてそれによって薬学的組成物が得られた。滅菌ろ過後、所要量の薬学的組成物がピペッターまたは分配器によって無菌バイアル(規格:0.5mL/2mL)に分配され、かつ当該バイアルは、無菌のブチルラバーの栓を用いて付けられた(半分締めた状態)。上記バイアルが凍結乾燥機に置かれ、それから、好適な凍結乾燥の手順(凍結前、凍結、真空ポンプ、、時間、温度、真空度の項目などを含む)を設定することによって凍結乾燥された。凍結乾燥の完成後、栓が完全に締められ、それからバイアルが凍結乾燥機から取り出され、かつアルミニウム蓋を用いて封がされた。標識した後、当該バイアルは、紙箱に収納され、かつ好適な温度下に保存され得る。
最初に、製剤緩衝液(formulation buffer)(10mmol/L ヒスチジン、9% トレハロース無水物、および0.05% ポリソルベート20(pH6.0)を含む)が調製され、それからFP3の好適な製剤原料(drug substance)が溶解され、所要のタンパク質濃度(10mg/mL)にまで上記製剤緩衝液を用いてそれが希釈され、そしてそれによって薬学的組成物が得られた。滅菌ろ過後、所要量の薬学的組成物がピペッターまたは分配器によって無菌バイアル(規格:0.5mL/2mL)に分配され、かつ当該バイアルは、無菌のブチルラバーの栓を用いて付けられた(半分締めた状態)。上記バイアルが凍結乾燥機に置かれ、それから、好適な凍結乾燥の手順(凍結前、凍結、真空ポンプ、、時間、温度、真空度の項目などを含む)を設定することによって凍結乾燥された。凍結乾燥の完成後、栓が完全に締められ、それからバイアルが凍結乾燥機から取り出され、かつアルミニウム蓋を用いて封がされた。標識した後、当該バイアルは、紙箱に収納され、かつ好適な温度下に保存され得る。
(実施例8.眼への利用のため溶液中の融合タンパク質FP3の精製)
最初に、製剤緩衝液(formulation buffer)(5mmol/L リン酸ニナトリウム、5mmol/L クエン酸、100mmol/L 塩化ナトリウム、20% スクロース、および0.1% ポリソルベート20(pH6.0)を含む)が調製され、それから、FP3の好適な製剤原料溶解され、かつ所要のタンパク質濃度(10mg/mL)にまで製剤緩衝液を用いてそれを希釈され、そしてこれらによって薬学的組成物が得られた。滅菌ろ過後、所要量の薬学的組成物が、ピペッターまたは分配器によって無菌バイアル(規格:5mL/20mL)に分配された。上記バイアルは、無菌のブチルラバーの栓を用いてしっかりと付けられ、、アルミニウムの蓋を用いて封をされ、バイアルに対して標識され、かつ好適な温度で紙箱に保存された。
最初に、製剤緩衝液(formulation buffer)(5mmol/L リン酸ニナトリウム、5mmol/L クエン酸、100mmol/L 塩化ナトリウム、20% スクロース、および0.1% ポリソルベート20(pH6.0)を含む)が調製され、それから、FP3の好適な製剤原料溶解され、かつ所要のタンパク質濃度(10mg/mL)にまで製剤緩衝液を用いてそれを希釈され、そしてこれらによって薬学的組成物が得られた。滅菌ろ過後、所要量の薬学的組成物が、ピペッターまたは分配器によって無菌バイアル(規格:5mL/20mL)に分配された。上記バイアルは、無菌のブチルラバーの栓を用いてしっかりと付けられ、、アルミニウムの蓋を用いて封をされ、バイアルに対して標識され、かつ好適な温度で紙箱に保存された。
(実施例9.眼への利用のため溶液中の融合タンパク質FP3の精製)
最初に、製剤緩衝液(10mmol/L コハク酸ナトリウム、9% トレハロース無水物、および0.1% ポリソルベート20(pH6.0)を含む)が調製され、それからFP3に好適な製剤原料(drug substance)が溶解され、所要のタンパク質濃度(10mg/mL)にまで製剤緩衝液を用いてそれが希釈され、そしてそれによって薬学的組成物が得られた。滅菌ろ過後、所要量(≦100μl)の薬学的組成物が無菌バイアル(規格:0.5mL)にピペッターによって分配された。当該バイアルは、無菌のブチルラバーの栓を用いてしっかりと付けられ、アルミニウムの蓋を用いて封をされ、バイアルに対して標識された。また、当該薬学的組成物がシリンジ(1mL、灰色のゴムピストンおよび内径27の針)に所要量(≦100μl)導入され、ゴム栓がピストンに付けられ、かつ灰色のゴムの覆いおよび硬質プラスチックさやを針に順に付けられた。それから、当該シリンジがアルミニウム袋を用いて封をされ(加えて、プラスチックのねじ込みプランジおよび白いフランジ継ぎ手が別のアルミニウム袋に封入された)。それらは、好適な温度下で紙箱に保存された。
最初に、製剤緩衝液(10mmol/L コハク酸ナトリウム、9% トレハロース無水物、および0.1% ポリソルベート20(pH6.0)を含む)が調製され、それからFP3に好適な製剤原料(drug substance)が溶解され、所要のタンパク質濃度(10mg/mL)にまで製剤緩衝液を用いてそれが希釈され、そしてそれによって薬学的組成物が得られた。滅菌ろ過後、所要量(≦100μl)の薬学的組成物が無菌バイアル(規格:0.5mL)にピペッターによって分配された。当該バイアルは、無菌のブチルラバーの栓を用いてしっかりと付けられ、アルミニウムの蓋を用いて封をされ、バイアルに対して標識された。また、当該薬学的組成物がシリンジ(1mL、灰色のゴムピストンおよび内径27の針)に所要量(≦100μl)導入され、ゴム栓がピストンに付けられ、かつ灰色のゴムの覆いおよび硬質プラスチックさやを針に順に付けられた。それから、当該シリンジがアルミニウム袋を用いて封をされ(加えて、プラスチックのねじ込みプランジおよび白いフランジ継ぎ手が別のアルミニウム袋に封入された)。それらは、好適な温度下で紙箱に保存された。
(実施例10.眼製剤用の融合タンパク質FP1の精製)
融合タンパク質FP3に代えて融合タンパク質FP1を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例9の場合と同じである。
融合タンパク質FP3に代えて融合タンパク質FP1を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例9の場合と同じである。
(実施例11.眼製剤用の融合タンパク質FP2の精製)
融合タンパク質FP3に代えて融合タンパク質FP2を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例9の場合と同じである。
融合タンパク質FP3に代えて融合タンパク質FP2を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例9の場合と同じである。
(実施例12.眼製剤用の融合タンパク質FP4の精製)
融合タンパク質FP3に代えて融合タンパク質FP4を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例9の場合と同じである。
融合タンパク質FP3に代えて融合タンパク質FP4を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例9の場合と同じである。
(実施例13.眼製剤用の融合タンパク質FP5の精製)
融合タンパク質FP3に代えて融合タンパク質FP5を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例9の場合と同じである。
融合タンパク質FP3に代えて融合タンパク質FP5を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例9の場合と同じである。
(実施例14.眼製剤用の融合タンパク質FP6の精製)
融合タンパク質FP3に代えて融合タンパク質FP6を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例9の場合と同じである。
融合タンパク質FP3に代えて融合タンパク質FP6を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例9の場合と同じである。
(実施例15.眼製剤用の融合タンパク質FP4の精製)
融合タンパク質FP3に代えて融合タンパク質FP7を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例9の場合と同じである。
融合タンパク質FP3に代えて融合タンパク質FP7を用いたこと以外は、全ての材料および方法は実施例9の場合と同じである。
Claims (10)
- それぞれ配列番号2および4に示されるアミノ酸配列を有するFP7およびFP8から選択されたVEGF受容体融合タンパク質。
- 配列番号1および3に示されるDNA配列を有するVEGF受容体融合タンパク質FP7およびFP8をコードする遺伝子。
- 請求項2に記載のVEGF受容体融合タンパク質FP7および/またはFP8をコードする遺伝子を含む発現ベクター。
- 以下の手順:
Flt−1およびKDR遺伝子の増幅、上記増幅により得られた遺伝子の制限酵素消化によるFlt−1およびKDR断片の取得、FLT−1の2番目のIg様ドメインとKDRの3番目のIg様ドメインとKDRの4番目のIg様ドメインとの、もしくはFLT−1の2番目のIg様ドメインとKDRの3番目のIg様ドメインとのライゲーション;
融合遺伝子の発現ベクターの構築;ならびに
融合タンパク質を作製するため、宿主細胞へのベクターの導入
を含む、請求項1に記載のVEGF受容体融合タンパク質FP7およびFP8の調製方法。 - 薬学的に受容可能な任意に1以上の、および薬学的に有効量の担体中に、VEGF受容体融合タンパク質FP7およびFP8の1つまたは両者を含む、異常な血管形成に起因する眼疾患の処置に用いられる薬学的組成物。
- 上記薬学的に受容可能な担体は、水、マンニトール、グリセロール、エタノール、ポリソルベート、およびグルコースの任意の1つまたは組み合わせである、請求項5に記載の薬学的組成物。
- 融合タンパク質は、FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、およびFP8の1つまたは組み合わせから選択される、血管形成に関連する眼疾患を処置するための薬物の調製におけるVEGF受容体融合タンパク質の使用。
- 上記血管形成に関連した眼疾患が、AMD、糖尿病性網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、網膜血管閉塞、処置の失敗に関する血管形成(例えば、レーザー凝固法、および外科的網膜移植)である、請求項7に記載の使用。
- 眼疾患に罹患した患者に対して、FP3、FP7および/またはFP8のように、VEGF受容体融合タンパク質FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、およびFP8からなる群から選択された1つまたは組み合わせを投与することを特徴とする、血管形成に関連する眼疾患の処置方法。
- 上記血管形成に関連する眼疾患は、AMD、糖尿病性網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、網膜血管閉塞、処置の失敗に関する血管形成(例えば、レーザー凝固法、および外科的網膜移植)からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
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