WO2007112675A1 - Protéine de fusion du récepteur du vegf et son utilisation - Google Patents

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WO2007112675A1
WO2007112675A1 PCT/CN2007/001021 CN2007001021W WO2007112675A1 WO 2007112675 A1 WO2007112675 A1 WO 2007112675A1 CN 2007001021 W CN2007001021 W CN 2007001021W WO 2007112675 A1 WO2007112675 A1 WO 2007112675A1
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immunoglobulin
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kdr
receptor fusion
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Yu, Dechao, Michael
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    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • VEGF receptor fusion protein its pharmaceutical composition
  • the present invention relates to VEGF receptor fusion proteins, pharmaceutical compositions thereof and their use in the manufacture of a medicament for the treatment of various ophthalmic diseases caused by the growth of new blood vessels. Background technique
  • the retinal vasculature and the choroid (chorodia 1) vascular system are important components of the retina. Abnormal changes in the structure or function of the vessel wall caused by trauma or disease are the main causes of decreased or lost vision. For example, diabetic retinopathy (diabet ic ret inopathy) is caused by diabetes leading to retinal vascular proliferation, which in turn causes retinal detachment. It is the main cause of vision loss. It may also cause the growth of new blood vessels in the retina after an eye injury or during recovery from surgery. This type of retinal vascular proliferation is also an important cause of decreased vision or blindness in the eye (Nature 438: 932-938, 2005).
  • Age-related macular degeneration is a disease caused by degeneration of cells or tissues in the central region of the retina and angiogenesis. Can be divided into dry and wet. Among them, wet AMD is the most common form of choroidal neovascularization, and it is also the main cause of blindness in the eye.
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • Am. J. Pathol. 167: 1451-1459, 2005 VEGF stimulates endothelial cell division and promotes the growth of new blood vessels to provide nutrients and oxygen to tissue cells.
  • hepatic atrophy the concentration of VEGF in the retina begins to increase, thereby promoting neovascular growth. This process is called “angiogenesis” (angiogenes i s ).
  • angiogenesis angiogenes i s
  • the newly formed blood vessels are different in morphology from normal blood vessels, the lumen is irregular, and the wall of the tube is leaky. Abnormal hyperplasia of such highly permeable or leaky blood vessels often leads to scarring on the retina and further detachment, which affects vision.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF inhibitors block the interaction between VEGF and VEGF receptors on the endothelial cells (fit-1, KDR, etc.), thereby preventing VEGF-mediated signaling and inhibiting neovascularization caused by high expression of VEGF.
  • VEGF inhibitors include Macugen (pegaptanib sodium), Lucent i s, VEGF-Trap, Avas t in (bevacizumab) and AdPEDF. Macugen and Avas t in have been approved for marketing by the US Food and Drug Administration (FDA). Summary of the invention
  • novel VEGF-inhibiting fusion proteins FP7 and FP8 are provided, the amino acid sequences of which are shown in SEQ ID NO: 2 and 4, respectively, in the Sequence Listing.
  • FP7 consists of the second immunoglobulin-like region of FLT-1, the third and fourth immunoglobulin-like regions of KDR; FP8 is derived from the first immunoglobulin-like region of FLT-1 and the third immunoglobulin-like region of KDR Regional composition.
  • vascular endothelial growth factor VEGF receptor fusion proteins FP7 and FP8 are provided, the nucleotide sequences of which are shown in SEQ ID NO: 1 and 3, respectively, in the Sequence Listing.
  • an expression vector comprising the above-described vascular endothelial growth factor VEGF receptor fusion protein FP7 and/or FP8 is provided.
  • the expression vector may be a plasmid vector, a phage, a virus or the like which is commonly used in the art.
  • a method for producing a fusion protein FP7 and FP8 capable of inhibiting VEGF which comprises amplifying a Fi t-1 and KDR gene, digesting, obtaining a Fi t - 1 fragment, a KDR fragment,
  • the second immunoglobulin-like region of FLT-1, the third and fourth immunoglobulin-like regions of KDR are linked together or the second immunoglobulin-like region of FLT-1 and the third immunoglobulin-like region of KDR Linked together; construct a vector for the linker gene; and introduce the vector into a genetically engineered cell to express the fusion protein.
  • a pharmaceutical composition for an ophthalmic disease comprising one or more of a therapeutically effective amount of a VEGF receptor fusion protein FP1, FP2, FP3, FP4, FP5, FP6 FP7 and FP8, for example, FP7 and/or FP8,
  • An optional conventional pharmaceutical carrier especially for the formulation of a medicament for the treatment of an ophthalmic disease.
  • a fusion protein capable of inhibiting VEGF for the preparation of a medicament for treating an ophthalmic disease caused by growth of a new blood vessel
  • the fusion protein is a receptor recombination capable of binding to VEGF
  • the fusion protein is FP1, FP2, FP3, FP4, FP5 described in Chinese Patent Application No. CN200510073595. 4, entitled "Inhibition of Angiogenesis and Its Use" FP6 and any one or combination of FP7 and FP8 provided by the present invention.
  • FP6 is disclosed in the specification of the above-mentioned patent application CN200510073595. 4 (the disclosure of which is incorporated herein by reference) a second immunoglobulin-like region of -1, a third immunoglobulin-like region of DR, and a human immunoglobulin FC; FP2 is derived from a first immunoglobulin-like region of KDR, and a second immunoglobulin-like form of FLT-1 Region, KDR of the third immunoglobulin-like region and human immunoglobulin FC; FP3 from FLT-1 of the first immunoglobulin-like region, KDR of the third and fourth immunoglobulin-like regions and human immunoglobulin FC composition; FP4 consists of a first immunoglobulin-like region encoding FLT-1, a third immunoglobulin-like region of KDR, a fourth immunoglobulin-like region of FLT-1, and human immunoglobulin FC; The second immunoglobulin-like region of FLT-1, the 3-5th
  • the amino acid sequences of the fusion proteins FP7 and FP8 are shown in Sequence 2 and Sequence 4 in the Sequence Listing of the present specification; the ophthalmic diseases caused by the growth of new blood vessels include, but are not limited to, age-related macular degeneration, diabetes Retinopathy, diabetic macular tumor gland, diabetic macular edema, retinal vascular occlusion, treatment failure caused by neovascular growth such as laser coagulation, surgical retinal transplantation.
  • a method of treatment comprising administering a therapeutically effective amount of FP3, FP7 and/or FP8 to a patient.
  • the present invention provides a method for treating an ophthalmic disease associated with neovascularization, which comprises VEGF receptor fusion proteins FP1, FP2, FP3, FP4, FP5, FP6, FP7 and FP8 One or more, such as FP3, FP7 and/or FP8, are administered to the patient; the ophthalmic diseases include, but are not limited to, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, diabetic macular tumor gland, diabetic macular edema, retinal blood vessels Obstruction, treatment failure caused by neovascular growth such as laser coagulation, surgical retinal transplantation.
  • the fusion protein may be present in the form of a pure compound, in the form of a solvate, in the form of a salt, or as a solvate of a salt.
  • the fusion proteins described herein encompass all of these forms.
  • the fusion protein of the present invention which is a receptor for VEGF, can be prepared by the method described in the specification of the patent application CN200510073595. 4 or a similar method, wherein FP1, FP2, FP3, FP4, FP5, FP6 are known. FP7 and FP8 are new substances.
  • the present invention provides a preparation method and a preferred embodiment thereof, the preparation principle of which is similar to that described in the above-mentioned patent application specification of CN200510073595.
  • the product prepared by the recombinant technology of the invention has been purified to a medicinal purity, and then prepared according to the needs of different preparation dosage forms, mixed with a conventional medicinal carrier and/or other auxiliary materials, and prepared by a conventional preparation method of the pharmaceutical preparation.
  • a suitable pharmaceutical preparation are suitable for intravenous administration, intravitreal injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, topical intraocular administration such as administration as an ophthalmic drop; preferably a solution preparation or a dry powder preparation; as a dry powder preparation, When used, the dry powder is dissolved to make it a solution.
  • the concentration of the fusion protein ranges from 0.01 mg/fflL to 1000 mg/fflL; the specific amount is determined according to the form of preparation and clinical needs, as a general guide, for example, per 0. lmg - 3000mg, preferably 1mg - 2000mg, can be administered daily, every 2 days, every 3 days, every 4 days, every 5 days, every 6 days, every week, every two weeks, every three weeks, every It is administered once a month or more, or once a day, for example, two to three times.
  • the pharmaceutically acceptable carrier can be any pharmaceutically acceptable carrier in the form of a formulation suitable for the present invention, preferably selected from one or more of the following: sodium phosphate, sodium succinate, sodium succinate His t idine , manni tol , trehalose dihydrate , polysorbate 20 , sodium chlor ide , sucrose , trishydroxymethylaminopurine Pit (trometaniol), Cellulose, modified cellulose or lactose.
  • the above preparation may contain a pH buffer such as phosphate, citrate, acetate, succinate, tris.
  • trometamol also known as Tris
  • Mstidine histidine
  • osmotic pressure regulating agents such as sodium chloride (sodi chloride), (concentration in the range of 0 to 200 mM, such as 1-100 mM), glucose (dextrose) (concentration in the range of 0% to 50%, such as 1-30%); It may contain stabilizers such as amino acids, glycerol > cyclodextrin sucrose, trehalose dihydrate, etc., and their concentration may range from 0% to 40%, preferably 1 - 30%; may contain a preservative such as thimerosal, sodium bisulfite, benzyl alcohol or the like.
  • excipients such as mannitol and the like may be contained at a concentration of 0% to 40%, preferably 0.1 to 10%; for solution preparations, a surfactant such as polysorbate 20 or 80 may be contained. Sodium dodecyl sulfate (SDS), etc., in a concentration ranging from 0% to 2%, preferably from 0.01 to 1%.
  • the formulations of the present invention may also include preservatives, stabilizers, solvents, solubilizers and the like.
  • the solvent is preferably selected from water for injection, an organic solvent such as ethanol, glycerol, or other isotonic solution.
  • the present inventors have unexpectedly discovered that the fusion protein according to the present invention has excellent treatment for various eye diseases caused by the growth of new blood vessels, such as age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, diabetic macular tumor gland, and diabetic macular edema.
  • Retinal vascular occlusion Treatment failure caused by neovascular growth such as laser coagulation, surgical retinal transplantation, and good stability, high safety, small side effects, and excellent results.
  • the present invention demonstrates the beneficial effects of the present invention by experimental data, and is specifically described in the following examples.
  • Figure 1 Schematic diagram of the structure of the eight fusion proteins of the present invention
  • Figure 2 Comparison of the affinity of fusion proteins for binding to VEGF
  • Figure 3 Effect of fusion protein on neovascularization induced by retinal ischemic atrophy
  • Figure 4 Effect of fusion protein on choroidal neovascularization.
  • the fusion protein FP7 is expressed by the primers FU - 1 D2 (F) 5 -cctttcgtagagatgtacagtga-3 , Fit — 1 D2 ( R ) 5 -tatgattgtattggtttgtccat-3 , KDR D3 ( F ) 5 -gatgtggttctgagtccgtctca-3 ' and KDR D3 - 4 ( R ) 5 -cggtgggacatacacaaccaga-3'
  • the Flt-1 and KDR gene fragments obtained from the cDNA synthesized from HUVEC cells were synthesized as cDNAs.
  • PCR amplification was carried out under conditions of denaturation at 95 ° C for 30 minutes, annealing at 56 ° C for 45 seconds, extension at 72 ° C for 2 minutes, and 30 cycles to obtain Flt-1 and KDR lgG.
  • the PCR product of the domain was cloned into the PCR2.1 plasmid using the TA cloning kit, and transferred to E. coli, white colonies were selected, added to LB medium, and cultured overnight.
  • the plasmid was extracted with the Qiangen plasmid extraction kit, and then identified by enzyme digestion and sequencing.
  • the Fit-1 fragment, the KDR fragment, and the ribonucleic acid of the local sequence of the IgG hinge region were ligated together using a splicing PCR (Sewing PCR) method.
  • the EcoRl restriction site was designed in both primers.
  • the DNA fragment was purified by the Qiangen Purification Kit and inserted into the pcDNA3.1 plasmid. Recombinant plasmid E. coli, positive colonies were selected, added to LB medium, and cultured overnight. The plasmid was extracted from the Q iangen plasmid and digested and sequenced.
  • the confirmed plasmid was transfected into CH0 cells to obtain a cell line stably expressing the fusion protein FP7.
  • the amino acid sequence of FP7 is shown in SEQ ID NO: 3, and the specific nucleotide sequence for expression of FP7 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • a partial sequence of a hinge region is retained at the C-terminus of the fusion protein.
  • the fusion protein FP8 was directly amplified by PCR using FP7 as a template.
  • the primers used for PCR were fit - 1D 2 (F) 5, -cctttcgtagagatgtacagtga-3' and KDR D3-hing (R).
  • the latter nucleotide sequence is: 5 ' -aggtgctgggcacagtgggcatgtgtgagtttttgtcttttcatggaccctgacaaatg-3,. It includes a sequence complementary to the KDR third immunoglobulin-like region and a partial nucleotide sequence of the human IgG Fc hinge region.
  • the present invention determines the ability of various fusion proteins to bind to VEGF by measuring the amount of VEGF.
  • a certain amount of VEGF (10PM) was added to the test tube, and then the diluted, various amounts of various fusion proteins were added to the test tube containing VEGF, and after mixing, culture at 37 ° C. Save in the box for an hour.
  • the free VEGF in the test tube was determined by a kit for detecting VEGF provided by R&D Systems, a VEGF assay kit.
  • the results obtained were processed by software to obtain the results shown in Figure 2.
  • Figure 2 shows that FP1, FP3, FP7 and FP8 can effectively bind to VEGF affinity, and their binding affinity can be determined by IC 5 .
  • the seven-day-old pups were placed in an incubator containing a high oxygen partial pressure (75% ⁇ 2%) and controlled to a temperature of 23 ⁇ 2 ° C for daylight illumination. After a few days of incubation under these conditions, avascular neoplasia occurred in the center of the retina; after five days, the pups were returned to the normal oxygen partial pressure incubator. Hypoxia conditions in the retina of young rats due to relatively low oxygen partial pressure concentrations in the room, thereby stimulating new life similar to diabetic retinopathy and other retinopathy due to ischemic atrophy Vascular reactivity 0
  • FP1, FP3 and FP 7 the three fusion proteins (FP1, FP3 and FP 7) inhibition in ischemic retinopathy atrophy related aspects of the generation of new blood vessels to make an assessment.
  • the pups were placed in a high oxygen partial pressure incubator and returned to the incubator in a normal oxygen partial pressure chamber five days later.
  • the young rats were divided into five groups of 10 each, and the fusion protein was intraperitoneally injected into the young rats at a dose of 30 mg/kg one day, and injected once every two days for a total of four injections.
  • Young rats in the control group were injected with the same amount of Fc protein.
  • 6 mice were taken from each group, and the heart was injected with fluorescein FAM.
  • the retina of the young rats was taken for analysis of neovascularization. The retina was placed flat during operation, and neovascularization and fluorescence leakage were observed under a fluorescence microscope.
  • FP3 and FP7 received a total of 5 injections, one day before laser treatment and days 3, 6, 9, and 12 after laser treatment, respectively.
  • the rats received 50 mg of fluorescently labeled dextran intravenously, then anesthetized, the eyes were removed, the choroid was removed as soon as possible, and it was cut into flat or frozen embedded for sectioning. CNV lesions.
  • These fusion proteins can be used to treat a range of ophthalmic diseases associated with diseased neovascularization, including age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy (diabet ic), by appropriate means, such as intravitreal or intravenous administration. Ret inopathy ), diabet ic macular edema, and centra l ret ina l vein occlus ion.
  • AMD age-related macular degeneration
  • Ret inopathy diabetic macular edema
  • centra l ret ina l vein occlus ion can also be used in combination with other therapeutic methods, such as photocoagulat ions or in combination with laser therapy to reduce the chance of treatment failure caused by neovascular growth after laser treatment.
  • These fusion proteins can also be used in conjunction with surgery.
  • AMD patients establish a basic baseline after passing a normal eye exam and then inject a fusion protein (such as FP3 or FP7) into the body by vitreous injection. After treatment, the patient will go to the hospital for observation and examination to record the effect of these fusion proteins on AMD. They are usually examined once on days 1, 1, 6, 14, 30 and 90 after receiving treatment. At the same time, the patient may need to receive multiple treatments, which may be injected every two to eight weeks. The amount of each injection is in the range of 10 micrograms to 5 milligrams per eye. Samples of age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, and diabetic macular edema were collected and clinical control experiments were performed on fusion proteins FP3 and FP7.
  • a fusion protein such as FP3 or FP7
  • the evaluation criteria are as follows: According to the Ministry of Health, the guidelines for the evaluation of efficacy in the Guidelines for the Clinical Research of New Drugs for the Treatment of Senile Macular Degeneration
  • the central visual acuity is increased by more than 4 lines; (iii) the central dark spot of the central visual field is slightly narrowed or markedly lightened; (iv) the exudate and hemorrhage in the macular area are significantly absorbed, and the neuroepithelial and pigment epithelial detachment disappears or shrinks significantly. Narrow; (V) Fundus fluorescein angiography showed no development or slight atrophy of subretinal neovascularization, fluorescein leakage was significantly reduced; contrast sensitivity improved slightly.
  • the above items can be judged by having four items.
  • the above items can be judged by 2-3 items.
  • the fusion protein FP3 has a significant effect on age-related diseases.
  • the evaluation criteria are the same as those in O O.
  • the fusion protein FP7 is not less effective than photodynamic therapy in the treatment of age-related macular degeneration, and its efficacy o o may be superior to photodynamic therapy.
  • control group used fundus retinal laser photocoagulation; the experimental group used FP3
  • Control 105 31( 29. 5 ) 44( 41. 9 ) 30( 28. 6 ) 0 ( 0. 0 )
  • Efficacy evaluation criteria The evaluation criteria for the efficacy of diabetic retinopathy refer to the Guiding Principles for Clinical Research of New Drugs in Traditional Chinese Medicine (Trial). The clinical efficacy of new Chinese medicine treatment for diabetic retinopathy is based on the criteria for efficacy evaluation, which is divided into marked, effective, ineffective, and deteriorating.
  • Fundus changes indicate that the number of retinal microangiomas is reduced from (+++) to (++), or from (++) to (+), or from (+) to disappearance; the amount of retinal hemorrhage is (++) +) reduced to (+), or by (++) to disappear; the amount of bleed is reduced from (+++) to (++), or reduced from (++) to (+), or by (+) To disappear.
  • the visual acuity examination adopts the international standard visual acuity chart (1-point system). If it is less than 0.1, it is counted as one row for each in.
  • Fundus change indicators are determined by ophthalmoscope or color fundus photographs, and microangioma should be based on fundus fluorescein angiography negative.
  • (+) means less, easy to count; (++) means more, not easy to count; (+++) means microvascular There are many tumors, uncountable, bleeding and exudation, and they are fused into pieces.
  • the fusion protein FP3 is equivalent to retinal laser photocoagulation for diabetic retinopathy.
  • Test group 42 19 (45.24%) 18 ( 42.86%) 5 (11.90%) 0.261 P> .05 Control group 45 20 ( 44.44%) 18 ( 40.00% ) 7 (15.56%)
  • Test group 42 20 ( 47.62%) 18 ( 42.86% ) 4 ( 9.52% ) 0.64 ⁇ 0.05 Control group 45 18 ( 40.00% ) 21 ( 46.67% ) 6 ( 13.33% )
  • Control group 45 28 ( 66.22% ) 17 ( 37.78% )
  • Judgment criteria for changes in visual acuity The international standard visual acuity chart is used. After treatment, the visual acuity is improved by two or more lines (effectiveness), and those with visual loss of two or more lines are decreased (invalid), otherwise there is no change in visual acuity (effective). If the visual acuity is less than 0.1 before treatment, the visual acuity will be improved or decreased with the visual acuity increase or decrease of 0.02 as the standard, otherwise there will be no change in visual acuity.
  • Macular edema regression grade According to fundus fluorescein before and after laser treatment, determine the macula The degree of regression of edema. After treatment, there was no obvious leakage or leakage in the macular area. One of the quadrants and above was absorbed by the edema (effective), and the leakage was not significantly reduced or even increased without absorption (invalid).
  • VEGF receptor fusion protein FP3 plays an important therapeutic role in laser treatment of macular edema.
  • formulation buffer formulat ion buffer, 10 mmol / L histidine + 9% trehalose + 0. 05% polysorbate - 20, pH 6. 0
  • qualified stock solution FP3 drug subs tance after after thawing
  • formulation buffer to a protein concentration (10 rag / raL) a desired filter sterilized with a pipette / dispensing apparatus, as required by the amount dispensed into clean vials (specification : 0. 5 mL / 2 mL )
  • a clean butyl rubber stopper half-plug
  • Example 8 Preparation of FP3 fusion protein ophthalmic solution preparation
  • Example 11 Preparation of FP2 fusion protein ophthalmic preparation
  • Example 12 Preparation of FP4 fusion protein ophthalmic preparation
  • Example 9 Preparation of 3 FP5 fusion protein ophthalmic preparation
  • Example 14 Preparation of FP6 fusion protein ophthalmic preparation
  • Example 15 Preparation of FP7 fusion protein ophthalmic preparation

Description

VEGF受体融合蛋白、 其药物组合物和
在制备治疗眼科疾病的药物中的应用 技术领域
本发明涉及 VEGF受体融合蛋白、 其药物组合物和它们在制备治疗因 新生血管的生长而引发的各种眼科疾病的药物中的应用。 背景技术
视网膜血管系统和脉络膜 (chorodia 1) 血管系统是组成视网膜的重 要组成部分。 创伤或疾病而引起的血管管壁结构或功能的异常改变是导 致视力下降或丧失的主要原因。 例如， 糖尿病视网膜病变 （diabet ic ret inopathy )是由于糖尿病而导致视网膜血管增生， 进而造成视网膜脱 落。 它是造成视力丧失的主要原因。 在眼睛受伤后或手术后的恢复过程 中也可能造成视网膜内新生血管的生长。 这一类视网膜血管增生也是造 成视力下降或眼睛失明的重要原因 （Nature 438: 932-938, 2005 )。
年龄相关的黄斑变性（AMD )是一种由视网膜中心区的细胞或组织退 化和血管增生而引起的疾病。 可分为干性和湿性两种。 其中湿性 AMD是 脉络膜新生血管形成的最常见形式， 它也是引起眼睛失明的主要原因。
血管内皮生长因子 （VEGF )是一种专一性调控新生血管生长的蛋白 质 ( Am. J. Pathol. 167: 1451-1459, 2005 )。 VEGF刺激内皮细胞分裂增 生， 进而促进新生血管生长， 以提供营养和氧气给组织细胞。 很多研究 表明， 一旦眼睛视网膜的感光细胞由于营养不足而开始萎缩 （称作 "缺 血性萎缩"）， VEGF在视网膜内的浓度便开始升高， 从而促进新生血管生 长。 这一过程称为 "新生血管的形成" （angiogenes i s )。 在眼内， 新生 的血管在形态上与正常血管不同， 管腔不规则， 管壁多有渗漏。 这种高 通透性或渗漏的血管的异常增生常导致视网膜上产生疤痕， 并进一步可 发生脱落， 从而影响到视力。
许多研究表明， 湿性 AMD病人的脉络膜组织中有高水平的 VEGF表达 ( Inves t. Opthal. Vi s. Sci 37 ： 855 - 868, 1996 ； Microvascular Res. 64: 162 - 169, 2002 )。由于 VEGF表达水平与湿性 AMD之间的相关性， VEGF 可以被用作诊断 AMD 的一个生化指标 （Br. J. Optha lmol. 88: 809 - 815, 2004 )。
一些 VEGF抑制剂可以阻断 VEGF与内皮细胞上 VEGF受体（ f i t一 1、 KDR等）之间的相互作用，从而阻止由 VEGF介导的信息传导，抑制由 VEGF 高表达而引起的新生血管的生长， 以达到预防和阻止视网膜上出血的目 的。 这类 VEGF抑制剂包括 Macugen (pegaptanib sodium) , Lucent i s, VEGF- Trap, Avas t in (bevacizumab) 和 AdPEDF 等。 其中 Macugen 和 Avas t in已由美国国家食品和药物管理局 （FDA )批准上市。 发明内容
按照本发明的一个方面， 提供了新的能抑制 VEGF的融合蛋白 FP7和 FP8 , 其氨基酸序列分别如序列表中的序列 2和 4所示。
FP7由 FLT- 1的第 2免疫球蛋白样区域、 KDR的第 3和第 4免疫球蛋 白样区域组成； FP8由 FLT-1的第 1免疫球蛋白样区域和 KDR的第 3免疫 球蛋白样区域组成。
根据本发明的另一个方面， 提供了编码血管内皮生长因子 VEGF受体 融合蛋白 FP7和 FP8的基因， 其核苷酸序列分别如序列表中序列 1和 3 所示。
根据本发明的又一个方面， 提供了含有上述血管内皮生长因子 VEGF 受体融合蛋白 FP7和 /或 FP8的基因的表达载体。 该表达载体可以是质粒 载体、 噬菌体、 病毒等本领域常用载体。
按照本发明的又一个方面， 提供了制备能抑制 VEGF的融合蛋白 FP7 和 FP8的方法， 该方法包括扩增 Fi t- 1和 KDR基因， 酶切， 获得 Fi t - 1 片段、 KDR片段， 将 FLT- 1的第 2免疫球蛋白样区域、 KDR的第 3和第 4 免疫球蛋白样区域连接在一起或将 FLT - 1的第 2免疫球蛋白样区域和 KDR 的第 3免疫球蛋白样区域连接在一起； 构建该连接基因的载体； 以及将 该载体导入基因工程细胞， 表达该融合蛋白。
按照本发明的另一个方面， 提供了一种用于治疗由病变血管新生引 起的眼科疾病的药物组合物， 它包含治疗有效量的 VEGF 受体融合蛋白 FP1、 FP2 , FP3、 FP4、 FP5 , FP6 FP7和 FP8的一种或多种， 例如， FP7 和 /或 FP8、 以及任选的常规药用载体， 尤其用于配制治疗眼科疾病的药 物的载体。
按照本发明的再一个方面， 提供了一类能抑制 VEGF的融合蛋白在制 备治疗由于新生血管的生长而引发的眼科疾病的药物中的应用； 所述融 合蛋白是能够与 VEGF结合的受体重组融合蛋白； 更具体而言， 所述融合 蛋白是第 CN200510073595. 4 号、发明名称为 "抑制血管新生的融合蛋白 质及其用途" 的中国专利申请中描述的 FP1、 FP2、 FP3、 FP4、 FP5、 FP6 和本发明提供的 FP7和 FP8中的任何一种或其组合。 其中融合蛋白 FP1、 FP2、 FP3、 FP4、 FP5. FP6的氨基酸序列在上述专利申请 CN200510073595. 4 号的说明书中公开（该公开中的有关内容在此声明并入本发明申请）， 其 中 FP1由 FLT- 1的第 2免疫球蛋白样区域、 DR的第 3免疫球蛋白样区域 和人免疫球蛋白 FC组成； FP2由 KDR的第 1免疫球蛋白样区域、 FLT-1 的第 2免疫球蛋白样区域、 KDR的第 3免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白 FC组成； FP3由 FLT- 1的第 1免疫球蛋白样区域、 KDR的第 3和第 4免疫 球蛋白样区域和人免疫球蛋白 FC组成； FP4由编码 FLT- 1的第 1免疫球 蛋白样区域、 KDR的第 3免疫球蛋白样区域、 FLT-1的第 4免疫球蛋白样 区域和和人免疫球蛋白 FC组成； FP5由 FLT-1的第 2免疫球蛋白样区域、 DR的第 3-5免疫球蛋白样区域和和人免疫球蛋白 FC组成； FP6由 FLT- 1 的第 1免疫球蛋白样区域、 KDR的第 3免疫球蛋白样区域、 FLT- 1的第 4-5 免疫球蛋白样区域和和人免疫球蛋白 FC组成。 而融合蛋白 FP7和 FP8的 氨基酸序列请见本发明申请说明书的序列表中的序列 2和序列 4;所述由 于新生血管的生长而引发的眼科疾病包括、 但不限于年龄相关性黄斑变 性， 糖尿病视网膜病变， 糖尿病黄斑瘤腺体， 糖尿病黄斑水肿， 视网膜 血管阻塞， 由新生血管生长而引发的治疗失败如激光凝固体， 手术视网 膜移植。
按照本发明的再一个方面， 提供了一种治疗方法， 该方法包括将治 疗有效量的 FP3、 FP7和 /或 FP8给药于患者。 按照本发明的再一个方面， 本发明提供了一种治疗与新生血管有关 的眼科疾病的方法， 该方法包括将 VEGF的受体融合蛋白 FP1、 FP2、 FP3、 FP4、 FP5、 FP6、 FP7和 FP8之一或多种， 例如 FP3、 FP7和 /或 FP8给药 于患者； 所述眼科疾病包括、 但不限于年龄相关性黄斑变性， 糖尿病视 网膜病变， 糖尿病黄斑瘤腺体， 糖尿病黄斑水肿， 视网膜血管阻塞， 由 新生血管生长而引发的治疗失败如激光凝固体， 手术视网膜移植。
所述融合蛋白可以以纯化合物的形式， 溶剂化物的形式， 盐的形式， 或盐的溶剂化物形式存在。 本发明所述的融合蛋白涵盖了所有这些形式。
本发明所述的、 可作为 VEGF 的受体的融合蛋白可以通过 CN200510073595. 4 号专利申请说明书中记载的方法或相似方法制备， 其 中 FP1、 FP2、 FP3、 FP4、 FP5、 FP6是已知物， FP7和 FP8是新物质。 对 于这些新物质， 本发明提供了其制备方法和优选的实施例， 其制备原理 和上述 CN200510073595. 4 号专利申请说明书中的记载相似。
本发明经过重组技术制成的制品经过纯化达到了药用纯度， 然后根 据不同制剂剂型的需要， 再使之与常规药用载体和 /或其他辅料混合、 采 用药物制剂的常规制备方法而制成适宜的药物制剂。 这些制剂适合于静 脉注射给药， 玻璃体内注射给药， 腹腔注射， 皮下注射， 局部眼内给药 如以眼用滴剂的方式给药； 优选的是溶液制剂或干粉制剂； 作为干粉制 剂， 使用时将干粉溶解使其成为溶液。
在按本发明制剂中， 融合蛋白的浓度范围在 0. 01 mg/fflL 至 1000 mg/fflL之间； 其具体用量根据制剂形式和临床的需要而定，作为一般性指 导， 例如， 可以按照每次 0. lmg - 3000mg, 优选 lmg - 2000mg给药， 可以 每日、 每 2 日、 每 3 日、 每 4 日、 每 5 日、 每 6 日、 每周、 每两周、 每 三周， 每一个月等给药一次， 或者每日给药一次以上， 例如两次到三次。
所说的药用载体可以是任何适合本发明的制剂形式的药用载体， 优 选的选自以下的一种或多种： 磷酸钠 （sodium phosphate )、 琥珀酸钠 ( sodium succ inate ), 組氨酸 ( his t idine )、 甘露醇 ( manni tol )、 海 藻糖 ( trehalose dihydrate ), 聚山梨醇酯 ( polysorbate 20 )、 氯化钠 (sodium chlor ide)、 蔗糖（sucrose )、 三羟甲基氨基曱坑（trometaniol)、 纤维素、 改性纤维素或乳糖。上述制剂可含有 pH緩冲系统（formulation buffer )如騎酸盐（ phosphate )、 4宁檬酸盐（ citrate )、乙酸盐（ acetate ), 琥珀酸盐 （ succinate )、 三羟甲基氨基甲烷（trometamol, 又名 Tris) 或组氨酸（Mstidine)等中的一种或多种， 浓度的范围在 0至 100 mM, 例如 1 - lOOmM, pH的范围在 3至 9;可含有渗透压调节剂如氯化钠（ sodi皿 chloride), (浓度的范围在 0 至 200 mM, 例如 1-100 mM)、 葡萄糖 (dextrose) (浓度的范围在 0%至 50%, 例如 1-30%)等； 可含有稳定剂 如氛基酸 ( amino acids )、 甘油 ( glycerol )> 环糊精 ( cyclodextrin ) 蔗糖（sucrose)、 海藻糖（ trehalose dihydrate )等， 它们的浓度范围 可在 0%至 40%, 优选 1 - 30%; 可含有防腐剂如噻汞撒 ( thimerosal )、 亚 硫酸氢钠 ( sodium bisulfite )、 苯基乙醇 (benzyl alcohol )等。 对于 冻干制剂， 可含有赋形剂如甘露醇 (mannitol )等， 浓度在 0%至 40%, 优选 0.1 - 10%; 对于溶液制剂， 可含有表面活性剂如聚山梨醇酯 (polysorbate20或 80)、 十二烷基磺酸钠（ SDS )等， 浓度的范围在 0% 至 2%, 优选 0.01至 1%。 本发明的制剂还可以包括防腐剂， 稳定剂， 溶 剂， 助溶剂等。 溶剂优先选自注射用水、 有机溶剂例如乙醇、 甘油 ( glycerol ), 或其他等渗溶液。
本发明人意外地发现， 根据本发明的融合蛋白具有优良的、 治疗由 于新生血管的生长而引发的各种眼病， 例如年龄相关性黄斑变性， 糖尿 病视网膜病变， 糖尿病黄斑瘤腺体， 糖尿病黄斑水肿， 视网膜血管阻塞， 由新生血管生长而引发的治疗失败如激光凝固体， 手术视网膜移植的作 用， 而且稳定性好， 安全性高， 副作用小， 效果优良。 本发明通过实验 数据证明了本发明的有益效果， 具体见下列实施例。 附图说明
图 1: 本发明的 8种融合蛋白的结构示意图；
图 2: 融合蛋白与 VEGF结合的亲和力的比较；
图 3: 融合蛋白对视网膜缺血性萎缩引起的新生血管形成的影响; 图 4: 融合蛋白对脉络膜新生血管生长的影响。 具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明， 但不应理解为构成对本发明的 任何限制。 实施例 1 FP7的构建
融 合 蛋 白 FP7 是 在 由 引 物 FU - 1 D2 (F) 5 -cctttcgtagagatgtacagtga-3 ， 、 Fit — 1 D2 ( R ) 5 -tatgattgtattggtttgtccat-3 ， 、 KDR D3 ( F ) 5 -gatgtggttctgagtccgtctca-3 ' 和 KDR D3 - 4 ( R ) 5 -cggtgggacatacacaaccaga-3' 从 HUVEC细胞提取到的 mRNA作为模板合 成的 cDNA上得到的 Flt— l和 KDR基因片段重组而成。 具体的条件是， 在变性 95°C、 30分钟， 退火 56°C、 45秒钟， 延伸 72°C、 2分钟的条件 下， 进行 PCR扩增， 30个循环， 获得 Flt— l和 KDR lgG样结构域的 PCR 产物。 用 TA cloning试剂盒， 把 PCR 产物克隆到 PCR2.1质粒中， 并转 ： E. coli, 选取白色菌落， 加入 LB培养基， 培养过夜。 用 Qiangen质粒 提取试剂盒提取质粒后，酶切及测序鉴定。 采用拼接 PCR (Sewing PCR) 方法， 把 Fit - 1片段、 KDR片段和 IgG铰链区局部序列的核糖核酸一起 连接。在两端引物中设计 EcoRl酶切位点。 PCR终产物在用 EcoRl酶切后， 经 Qiangen纯化试剂盒純化 DNA片段， 并插入 pcDNA3.1质粒。 重组质粒 E.coli, 选取阳性菌落， 加入 LB培养基， 培养过夜。 Q iangen质粒 提取质粒后酶切， 并测序鉴定。 已获证实的质粒再转染 CH0细胞， 就得 到稳定表达融合蛋白 FP7的细胞系。 FP7的氨基酸序列如序列 3, 而表达 FP7 的具体核苷酸序列见序列 1。 在此融合蛋白 C 末端保留有铰链区 (hinge) 的部分序列。 实施例 2 FP8的构建
融合蛋白 FP8是以 FP7为模板直接用 PCR扩增而成， PCR所用引物 是 fit - 1D2(F) 5， -cctttcgtagagatgtacagtga-3' 和 KDR D3-hing (R)。 后 者 的 核 苷 酸 序 列 为 ： 5 ' -aggtgctgggcacagtgggcatgtgtgagttttgtctttttcatggaccctgacaaatg-3 ，。 它包括与 KDR第三免疫球蛋白样区相互补的序列和人 IgG Fc绞链区 的部分核苷酸序列。 PCR扩增和基因克隆的方法与实例 1相同。最终将插 入了 FP8的 Pc DNA3.1质粒转染 CH0细胞， 并获得稳定细胞珠， 用于蛋 白质的表达。 FP8的氨基酸序列见序列 4, 相应的核苷酸序列见序列 2。 实施例 3 融合蛋白与 VEGF结合亲和力的实验
本发明用测定 VEGF的量的办法来确定各种融合蛋白结合 VEGF的能 力。 在这一试验中， 将一定量的 VEGF (10PM)加入试管中， 然后将经稀 释的、 含有不同量的各种融合蛋白加到含有 VEGF的试管中， 混合好后， 在 37°C的培养箱中保存一个小时。 一个小时以后， 试管中游离的 VEGF 由 R&D系统公司 （R&D systems)提供的检测 VEGF量的试剂盒一一VEGF 检测试剂盒（VEGF assay Kit ) 测定。 测定到的结果经软件处理而得到 如图 2所示的结果， 图 2表明， FP1、 FP3 、 FP7和 FP8都能有效地与 VEGF 亲和结合，其结合亲和能力可由 IC5。表示，分别是 11.2PM、 4.3PM、 4.1 PM 和 11.2PM。 这个实验证明， FP3和 FP7在体外与 VEGF的结合能力相似， FP8和 FP1的结合能力相似， 且前两者的结合能力高于后两者。 FP1—— FP6对 VEGF的结合能力在中国专利申请 CN200510073595.4说明书实施例 3、 说明书附图 2中已记载。
这个试验结果进一步说明了， KDR的第四免疫球蛋白样区域的氨基酸 序列可增进融合蛋白对 VEGF的结合能力。 实施例 4 融合蛋白阻止由视网膜缺血性萎缩引起的新生血管形成的实 验结果
将出生七天的幼鼠放在含高氧分压 (75% ±2% )的培养箱内， 并控 制温度为 23±2°C, 日光照明。 在此条件下培养几天之后， 视网膜中心无 血管新生发生； 五天之后， 将幼鼠放回到正常氧分压的培养箱中。 由于 室内相对较低的氧分压浓度而对幼鼠的视网膜产生低氧条件， 从而刺激 产生类似于糖尿病视网膜病变和其他由于缺血性萎缩视网膜病变的新生 血管反应0
利用这个模型， 对三种融合蛋白 （FP1、 FP3和 FP7 )在缺血性萎缩 视网膜病变相关的新生血管生成方面的抑制作用做出了评估。
将幼鼠放在高氧分压的培养箱中， 五天之后带回到正常氧分压室内 的培养箱中。 幼鼠被分成五个组， 每組 10只， 一天之后以 30 mg/kg的 量将融合蛋白经腹腔注射幼鼠， 每两天注射一次， 一共注射 4 次。 对照 组的幼鼠则被注射含相同量的 Fc蛋白。 治疗期结束后， 从各组取小鼠 6 只， 心脏注射荧光素 FAM, 10分钟后， 幼鼠的视网膜被摘取用来分析新 生血管的生成情况。 操作时将视网膜放平， 在荧光显微镜下观察新生血 管及荧光渗漏情况，各组其余四只小鼠的眼睛用石蜡包埋， 切片后用 H&E 染色。 镜下计数血管内皮细胞核的数目， 从而判断融合蛋白对新生血管 生长的影响 ( Inves t igat ive Ophthalomogy vi sua l science 43, 1994— 2000, 2002 结果如图 3所示。 接受 Fc蛋白注射的幼鼠视网膜都表现 出严重的病变。 在视网膜表面内脉膜上可观察到大量杂乱无章的血管。 在经融合蛋白处理过的幼鼠其视网膜上则无明显的血管生长（如图 3 )。 其中 FP3最为有效， FP1和 FP7也较有效， 可能是因缺失 Fc片段而影响 它在体内的稳定性。
同时， 我们也试验了将这些融合蛋白在通过玻璃体内给药的情况下 对新生血管的影响。 试验采用同样的动物模型， 在动物回到正常氧分压 的培养箱内一天后， 以每只眼睛 0. 5 4敖克的量进行玻璃体内注射， 每只 动物只接受一次治疗。 给药之后第七天， 动物的视网膜按上述方法收集 和处理。 融合蛋白对新生血管的影响如图 3所示。 结果表明， 经玻璃体 内注射， 这些融合蛋白对新生血管的生长具有显著的抑制作用。 玻璃体 内注射的作用效果要优于腹腔注射。 同时， 通过这组实验， 我们观察到 FP7的效果类似于 FP3， 两者都要好于 FP1。 在这个试验中， 由于是玻璃 体内注射， FP7不需经体内血液循环。 因此， 其血液内稳定性较低的物质 不会影响它的疗效。 实施例 5 融合蛋白对激光诱发的脉络膜新生血管生长的影响 根据 发 表 的 文 献 资料 ( Amer ican Journal Pathology 153， 1641- 1646， 1998 )，我们利用激光处理， 在大鼠的眼睛上建立能诱发 眼底脉络膜新生血管生成的 AMD模型。 将 150只左右的大鼠分成四组， 对照组的 10 只大鼠通过皮下注射接受 Fc蛋白 （20 mg/kg )，处理过的每 10只大鼠分别通过皮下注射 20 mg/kg的 FP1、 FP3和 FP7总共接受 5次 注射， 分别在激光处理前一天和激光处理之后的第 3、 6、 9和 12天。 在 激光处理后第 15天，大鼠通过静脉注射接受 50 mg荧光标记的右旋糖苷， 然后经麻醉处理， 将眼睛摘除， 尽快剥离脉络膜， 剖成扁平状或冷冻包 埋做切片， 用于分析 CNV病变情况。 如图 4所示， 结果表明， 经融合蛋 白处理小鼠的 CNV面积都比对照 ( Fc )要小， 其中 FP3的效果要优于 FP1 和 FP7。 FP7与 FP1的抑制 CNV生成方面效果相当。 实施例 6 融合蛋白在治疗眼疾中的应用
这些融合蛋白可以通过适当的方式， 如玻璃体内注射或静脉给药， 可用于治疗与病变新生血管生长相关的一系列眼科疾病， 其中包括年龄 相关性黄斑变性 （AMD )、 糖尿病视网膜病变（diabet ic ret inopathy )、 糖尿病黄斑水肿（diabet ic macular edema)和视网膜血管阻塞 ( centra l ret ina l vein occlus ion )。 同时这些融合蛋白也可以和其他治疗方法一 起结合使用， 如和光敏药物 （photocoagulat ion )或者与激光疗法结合 使用， 以降低在激光处理之后由新生血管生长引起的治疗失败机率。 这 些融合蛋白还可以和手术结合使用。 如在视网膜移植之后， 由于新生血 管的生长而使视网膜移植的手术失败。 如果在手术的同时， 病人接受这 些融合蛋白的治疗， 就可以提高视网膜移植的成功率。 AMD病人在通过正 常眼科检查之后， 建立基本的基准线， 然后通过玻璃体注射的方法将融 合蛋白（如 FP3或 FP7 )注入体内。 经处理后病人将到医院接受观察和检 查， 以记录这些融合蛋白对 AMD的影响。一般在接受治疗之后第 1、 1、 6、 14、 30和 90天分别检查一次。 同时， 病人可能需要接受多次治疗， 可以 是每两到八周注射一次。 每次注射的量为每只眼睛 10微克至 5毫克范围 内。 分别收集了年龄相关性黄斑变性、 糖尿病视网膜病变、 糖尿病黄斑水 肿病人样本， 对融合蛋白质 FP3、 FP7 进行了临床对照实验。
(一 ) 年龄相关性黄斑水肿
1、 融合蛋白 FP3疗效比较
对照组采用光动力疗法； 试验組使用 FP 3。
疗效比较
组别 眼数 显效 有效 无效 有效率 （％) 试驗组 46 13 27 8 86. 9
对照组 40 4 19 14 57. 5
评判标准为： 根据卫生部 《中药新药治疗老年性黄斑变性的临床研究指 导原则》 中的疗效判断标准制定
( 1 )显效： （ i ) 眼前暗影即视物变形等症状有较明显好转； （ ϋ )
中心视力提高 4行以上； （iii ) 中心视野中央暗点略有缩 窄或明显变淡； （ iv )黄斑区渗出物及出血有较明显吸收， 神经上皮及色素上皮脱离范围消失或明显缩窄； （ V ) 眼 底血管荧光造影见视网膜下新生血管不发展或略有萎缩， 荧光素渗漏明显减少； 对比敏感度略有好转。
以上各项具备 4项即可判定。
( 2 )有效： （ i ) 眼前暗影即视物变形等症状有好转； （ ii ) 中心 视力提高 2行以上； （iii ) 中心视野中央暗点变淡； （ iv ) 黄斑区渗出物及出血有部分吸收， 神经上皮及色素上皮脱离 范围有不同范围缩窄； （ V ) 眼底血管荧光造影荧光素渗 漏减少； 对比敏感度可有好转。
以上各项具备 2-3项即可判定。
( 3 )无效： 未达到有效标准。
可以看出， 融合蛋白 FP3对年龄相关性疾病有显著效果。
2、 FP7疗效比较
对照组采用光动力疗法； 试验组使用 FP 7。 疗效比较
组别 眼数 显效 有效 无效 有效率 （％) 试验组 45 16 21 8 82. 2
对照组 42 6 19 17 59. 5
评判标准同上O O例。
可以看出： 融合蛋白 FP7 治疗年龄相关性黄斑变性疗效不低于光 动力疗法， 且其疗效o o可能优于光动力疗法。
(二） 糖尿病视网膜病变
对照組采用眼底视网膜激光光凝术； 试验組使用 FP3
疗效比较
组别 例 疾病疗效 Z P
数 显效（％) 有效（％) 无效（％) 恶化（％)
试^ r 107 43( 40. 2 ) 44( 41. 1 ) 20( 18. 7 ) 0 ( 0. 0 ) -1. 963 0. 050 组
对照 105 31( 29. 5 ) 44( 41. 9 ) 30( 28. 6 ) 0 ( 0. 0 )
组 两组总有效率比较
組别 例数 疾病疗效 Z P 显效 +有效（％ ) 无效 +恶化（％ )
试验组 107
对照组 105
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疗效评定标准： 糖尿病视网膜病变的疗效评定标准参照《中药新药临 床研究指导原则》（试行）。 中药新药治疗糖尿病视网膜病变的临床研究 指导原则中的疗效判定标准， 分为显效、 有效、 无效、 恶化 4 级进行评 定。
1.显效: ( 1 )视力进步> 4排， 或视力 > 1. 0。
( 2 )眼底改变显示视网膜微血管瘤数由（+++)减少到（++)、 或由（++) 减少到（+)、或由 (+)到消失;眼底出血量由（+++)減少到（+)、或由 (++) 到消失； 渗出量由（+++)减少到（++)、 或由（++)减少到（+)、 或由（+) 到消失。 血管瘤、 出血、 渗出改变有二项以上指标达到要求。
( 3 ) 眼底荧光血管造影显示视网膜平均循环时间明显缩短、 黄斑水 肿程度明显减轻、视网膜毛细血管无灌注区缩小、血管渗漏明显减轻。 改变有二项以上指标达到要求。 变化程度 > 20°/。。
2.有效：
( 1 )视力进步> 2排。
( 2 )眼底改变显示视网膜微血管瘤数由（+++)减少到（++)、 或由（++) 减少到（+)、或由（+)到消失；眼底出血量由 (+++)减少到（+)、或由（++) 到消失； 渗出量由（+++)到（++)、 或由（++)减少到（+)、 或由（+)到消 失。 微血管瘤、 出血、 渗出改变有一项以上指标达到要求。
( 3 ) 眼底荧光血管造影显示视网膜平均循环时间缩短、 黄斑水肿程 度减轻、 视网膜毛细血管无灌注区缩小， 血管渗漏明显减轻。
改变有二项以上指标达到要求。 变化成度> 10%。
3.无效： 各项指标未达到上述有效标准者。
4.恶化：
( 1 )视力退步 2排以上。
( 2 ) 眼底彩色照相显示视网膜出现新生血管等增殖性改变。
( 3 ) 眼底荧光血管造影显示视网膜毛细血管无灌注区扩大， 黄斑水 肿加重， 血管渗漏增加。
注：
①视力检查采用国际标准视力表（ 1分制）， 不及 0. 1者， 每进 0. 02 计为一排。
②眼底变化指标以眼底镜或彩色眼底照片判定， 微血管瘤应以眼底 荧光血管造影负片为准。
③（+)表示较少、 易数； （++)表示较多、 不易数； （+++)表示微血管 瘤很多、 不可数， 出血及渗出量多、 融合成片。
④疗效评定时， 视力、 眼底改变及荧光造影三项中须具备二项。
可以看出， 融合蛋白 FP3对糖尿病视网膜病变的疗效与眼底视网膜 激光光凝术相当。
(三） 糖尿病黄斑水肿
对照组采用激光光凝术， 试验组使用 FP 3。
疗效比较 组别 眼数 (只） 视力变化 P
显效（％ ) 有效（％ ) 无效 （ % )
试验组 42 19 (45.24%) 18( 42.86%) 5 (11.90%) 0.261 P> .05 对照组 45 20 ( 44.44%) 18( 40.00%) 7 (15.56%)
试睑组 42 20 ( 47.62%) 18( 42.86%) 4 (9.52%) 0.64 ^0.05 对照组 45 18 ( 40.00%) 21( 46.67%) 6 ( 13.33%)
黄斑水肿吸收率 P
2
有效（％ ) 无效（ % ) 0.83 P>0.05
3月 试验组 42 30 ( 71.43%) 12 ( 28.57%)
对照组 45 28 ( 66.22% ) 17 ( 37.78%)
6月 试驗组 42 32 ( 76.19%) 10 (23.81%) 1.43 AO.05 对照组 45 29 ( 64.44%) 16 ( 35.56%)
疗效判断标准参照： 任炼儿 氩激光治疗糖尿病视网膜病变的临床研 究 [J] 眼科 1998 7 ( 2 )： 86-88
视力变化的判断标准： 采用国际标准视力表， 治疗后视力增进二行 或以上者为提高 （显效） ，视力减退二行或以上者为下降（无效） ，否则 为视力无变化（有效）。 治疗前视力低于 0.1者，则以视力增减 0.02为标 准判定视力进步或下降，否则为视力无变化。
黄斑水肿消退分级： 根据激光治疗前后进行眼底荧光造影，确定黄斑 水肿的消退程度。 治疗后黄斑区无明显渗漏或渗漏减少 1 个象限及以上 者为水肿吸收（有效）， 渗漏无明显减少甚至加重者为未吸收即（无效）。
由此可见： 黄斑水肿患者行玻璃体内注射 VEGF受体融合蛋白， 其疗 效无论在治疗后相对较短的时期内 （3个月）或是在相对较长时期内 （6 个月）， 均较激光治疗疗效好。 说明： VEGF受体融合蛋白 FP3在黄斑水肿 的激光治疗中可起到重要治疗作用。
(四） 视网膜静脉阻塞
对照组采用激光光凝术， 实验组使用 FP 3。
疗效比较
組别 眼数 显效 有效 无效 有效率 （％) 实验组 71 25 33 13 81. 69
对照组 68 10 43 15 77. 94
疗效标准： 张惠容，视网膜静脉及其治疗的评价。北京医学院学报,
1982 , 14： 118 实施例 7 FP3融合蛋白眼用冻干制剂的制备
先配制好制剂緩冲液（formulat ion buffer , 10 mmol/L 组氨酸 +9% 海藻糖 +0. 05%聚山梨醇酯- 20， pH6. 0 ) , 将合格的原液 FP3 ( drug subs tance )解冻后， 用制剂緩冲液稀释到所需的蛋白浓度（10 rag/raL )a 进行过滤除菌后， 用移液器 /分装器按要求装量分装至洁净的西林瓶（规 格： 0. 5 mL/2 mL ) 中， 往瓶口加洁净的丁基橡胶塞（半压塞）。 放入冷 冻干燥机中， 设定好合适的冻干曲线（包括预冻、 冷冻、 抽真空、 升温 各阶段的时间、 温度、 真空度等参数的设定）， 进行冻干。 当冻干过程结 束后， 压紧胶塞， 取出西林瓶， 在胶塞上加铝塑盖， 用轧盖器轧紧。 往 西林瓶上贴标签， 装入纸盒， 存放于适宜的温度。 实施例 8 FP3融合蛋白眼用溶液制剂的制备
先配制好制剂緩冲液 ( formulat ion buffer , 5 mmol/L磷酸氢二钠 +5 mmol/L 柠檬酸 +100 mmol /L 氯化钠 +20%蔗糖 +0. 1%聚山梨醇酯- 20 , pH6. 0 ), 将合格的原液 FP3 ( drug subs tance )解冻后， 用制剂緩沖液稀 释到所需的蛋白浓度 ( 10 mg/mL )。 进行过滤除菌后， 用移液器 /分装器 按要求装量分装至洁净的西林瓶（规格： 5 mL/20 mL ) 中， 往瓶口加洁 净的丁基橡胶塞， 塞紧。 在丁基橡胶塞上加铝塑盖， 用轧盖器轧紧。 往 西林瓶上贴标签， 装入纸盒， 存放于适宜的温度。 实施例 9 FP 3融合蛋白眼用溶液制剂的制备
先配制好制剂緩冲液（10 隱 ol/L 丁二酸钠 +9%海藻糖 +0. 05%聚山梨 醇酯- 20， pH6. 0 ), 将合格的原液 FP3解冻后， 用制剂緩冲液稀释到所需 的蛋白浓度（10 mg/mL )。 进行过滤除菌后， 用移液器按要求装量（ < 200 μ ΐ )分装至洁净的西林瓶（规格： 0. 5raL ) 中， 或用玻璃注射器（规格： lmL, 带灰橡胶活塞、 27号针头）抽吸至要求装量（ < 100 μ υ。 对于西 林瓶， 在瓶口端加洁净的丁基橡胶塞， 塞紧， 在丁基橡胶塞上加铝塑盖， 用轧盖器轧紧， 往西林瓶上贴标签； 对于注射器， 在活塞处加装橡胶塞， 在针头上加装灰橡胶罩， 在橡胶罩外再加装硬塑套， 用铝封袋（已印好 标签）封装（另配有带螺纹的塑料活塞杆、 白色法兰盘接头， 用不同的 铝封袋封装）。 装入纸盒， 存放于适宜的温度。 实施例 10 FP1融合蛋白眼用制剂的制备
除了用 FP1融合蛋白替代 FP3融合蛋白外 , 其余物料和制备方法同 实施例 9。 实施例 11 FP2融合蛋白眼用制剂的制备
除了用 FP2融合蛋白替代 FP3融合蛋白外 , 其余物料和制备方法同 实施例 9。 实施例 12 FP4融合蛋白眼用制剂的制备
除了用 FP4融合蛋白替代 FP3融合蛋白外 , 其余物料和制备方法同 实施例 9。 实施例 1 3 FP5融合蛋白眼用制剂的制备
除了用 FP5融合蛋白替代 FP 3融合蛋白外， 其余物料和制备方法同 实施例 9。 实施例 14 FP6融合蛋白眼用制剂的制备
除了用 FP6融合蛋白替代 FP 3融合蛋白夕卜， 其余物料和制备方法同 实施例 9。 实施例 15 FP7融合蛋白眼用制剂的制备
除了用 FP7融合蛋白替代 FP3融合蛋白夕卜， 其余物料和制备方法同 实施例 9。

Claims

权 利 要 求
1. 血管内皮生长因子 VEGF的受体融合蛋白 FP7和 FP8 , 其氨基酸 序列分别如序列表中的序列 2和序列 4所示。
2. 编码血管内皮生长因子 VEGF受体融合蛋白 FP7和 FP8的基因， 其核苷酸序列分別如序列表中序列 1和 3所示。
3. 含有如权利要求 1所述的血管内皮生长因子 VEGF受体融合蛋白 FP7和 /或 FP8的基因的表达载体。
4. 一种制备如权利要求 1所述的 VEGF的受体融合蛋白 FP7和 FP8 的方法， 包括如下步骤： 扩增 FU-1和 KDR基因， 酶切， 获得 Fi t - 1片 段、 KDR片段， 将 FLT- 1的第 1免疫球蛋白样区域、 KDR的第 3和第 4免 疫球蛋白样区域连接在一起或将 FLT-1 的第 1免疫球蛋白样区域和 KDR 的第 3免疫球蛋白样区域连接在一起； 构建该连接基因的载体； 以及将 该载体导入基因工程细胞， 表达该融合蛋白。
5. 一种用于治疗由病变血管新生引起的眼睛疾病的药物组合物， 包 含治疗有效量的 VEGF的受体融合蛋白 FP7和 FP8之一或两种以及任选的 一种或多种药物学上可接受的载体。
6. 根据权利要求 5所述的药物组合物， 其中所述药物学上可接受的 载体选自水、 甘露醇、 甘油、 乙醇、 聚山梨醇酯、 葡萄糖中的一种或多 种。
7. 能抑制 VEGF的融合蛋白在制备治疗由于新生血管的生长而引发 的眼科疾病的药物中的应用， 所述融合蛋白选自 FP1、 FP2、 FP3、 FP4、 FP5、 FP6、 FP7和 FP8中的任何一种或其组合。
8. 根据权利要求 7所述的应用， 其中所述由于新生血管的生长而引 发的眼科疾病选自年龄相关性黄斑变性， 糖尿病视网膜病变， 糖尿病黄 斑瘤腺体， 糖尿病黄斑水肿， 视网膜血管阻塞， 由新生血管生长而引发 的治疗失败如激光凝固体， 手术视网膜移植。
9. 一种治疗与新生血管有关的眼科疾病的方法， 该方法包括将 VEGF 的受体融合蛋白 FP1、 FP2、 FP3、 FP4、 FP5、 FP6、 FP7和 FP8之一或多 种， 例如 FP3、 FP7和 /或 FP8给药于患者。
10、 根据权利要求 9 所述的方法， 其中所述眼科疾病选自年龄相关 性黄斑变性， 糖尿病视网膜病变， 糖尿病黄斑瘤腺体， 糖尿病黄斑水肿， 视网膜血管阻塞， 由新生血管生长而引发的治疗失败如激光凝固体， 手 术视网膜移植。
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