KR100589878B1

KR100589878B1 - 사람 성장 호르몬을 함유한 수성 의약 조성물

Info

Publication number: KR100589878B1
Application number: KR1019990001217A
Authority: KR
Inventors: 다쓰미마사후미; 이노우에가쓰라; 가지하라준이찌
Original assignee: 니홍 케미칼 리써치 가부시키가이샤
Priority date: 1998-02-04
Filing date: 1999-01-18
Publication date: 2006-06-15
Also published as: AU9723198A; DE69827357T2; EP0938902A1; CN1229676A; US6150331A; CA2256942A1; JP3723857B2; KR19990072277A; DE69827357D1; TW522016B; EP0938902B1; CN1173739C; AU738413B2; JPH11222441A

Abstract

본 발명은 액상 제품으로 제공될 수 있는 사람 성장 호르몬의 안정한 수성 제제를 제공함에 있어서, 매회 주입시 통증을 경감시킨 제제를 제공한다. 본 조성물은 사람 성장 호르몬을 함유한 수성 의약 조성물로서, 사람 성장 호르몬을 염화 벤잘코늄을 함유한 미(微)산성 내지 약(弱)산성 완충액, 바람직하게는 말레산염을 완충제로 사용한 완충액중에 용해시킨 것을 특징으로 한다.

Description

사람 성장 호르몬을 함유한 수성 의약 조성물 {HUMAN GROWTH HORMONE-CONTAINING AQUEOUS PHARMACEUTICAL COMPOSITION}

본 발명은 사람 성장 호르몬을 함유한 주사용 약제, 구체적으로 사람 성장 호르몬을 함유한 용액 형태의 약제에 관한 것이다.

사람 성장 호르몬 ("hGH" 로 약기) 은 단쇄 폴리펩티드 호르몬으로, 천연적으로 생성되는 형태는 191 개의 아미노산 잔기로 이루어진다. hGH 는 일반적으로, 생물학적으로 활성인 단량체 형태로 생성되지만, 약제 생산 중의 교반과 같은 기계적 스트레스 또는 열적 스트레스 하에서는 이량체로, 이어서 중합체로 응집하여 생물학적 활성을 잃게 된다 (Becker, G.W. 등, (1987) Biotechnol. Appl. Biochem., 9, p.478).

한편, hGH 수용액을 장기간 보존하면, hGH 분자의 중합체 생성은 줄어들지만 탈아미드체가 점차적으로 생성되는 것으로 알려져 있다. 탈아미드화 hGH 는 생물학적 활성에는 변화가 없지만 (Becker, G.W. 등 (1988) Biotechnol. Appl. Biochem., 10, p.326), 품질 저하를 일으킨다는 점에서 의약품으로는 바람직하지 못하며, 이것의 허용 함량은 일반적으로 함량 규격에 기재되어 있다.

또한, 응집에 의한 hGH 의 변성은 주로 물리적 스트레스 하에서 일어나고, 탈아미드화에 의한 변성은 주로 화학적 스트레스 하에서 일어나는 것으로 알려져 있다.

이러한 문제점으로 인해, hGH 의 최적 수성 제제를 개발할 수 없고, 주사하기 전에 용해시켜 사용하는 동결건조 제제가 일반적이다.

단신장 (dwarfism) 을 개선하기 위한 hGH 에 의한 치료는 년 단위의 장기간이 걸리기 때문에, 자가 주사 (self-injection) 가 허용되며, 일반적으로 투여를 시작할 때부터 가정에서 행해진다. hGH 동결건조 제제를 사용할 때에는, 환자 자신 (주로, 어린이) 또는 환자의 가족이 첨부된 용매에 제제를 용해시킨 다음, 피하 또는 근육내로 주사한다. 따라서, 동결건조된 제제를 용해시키는 과정은 환자 또는 환자의 가족이 수행한다. 그러므로, hGH 의 생물학적 활성을 감소시키는 응집 형성을 피하기 위해, 의사는 용해법을 충분히 설명할 필요가 있다. 첨부 문서중에는 또한, hGH 는 서서히 회전시킴으로써 용해되어야 한다는 주의 사항 및 지시 사항이 포함되어 있다.

응집체 생성은 동결건조 제제의 제조 단계에서 볼 수 있으므로, 중합체 생성을 억제하기 위한 여러 가지 시도가 있어 왔다. 그러나, 사용하기 전에 용해시키는 통상적인 제제 보다 다루기 쉽고 안정한 제제의 개발이 여전히 요구되고 있다. 최근, 주사기를 연결하여 사용하는 키트 (kit) 제제를 사용하게 되었다. 그러나, 이것은 주사기 내에서 동결건조 hGH 를 용해시키도록 하는 복잡한 구조를 가지고 있어서, 환자 또는 환자의 가족에게 사용법을 특별히 주의하여 설명하여야만 한다. 또한, 예측 불가능한 오조작의 위험을 제거할 수 없다.

이와 같이, hGH 는 일반적으로 가정에서 환자 또는 환자의 가족이 주사하므로, 용해 과정이 제거된 수성 hGH 제제 형태의 제형이 더욱 편리할 것이다. 이와 같은 수성 제제의 적당한 형태는, 사용하기 전에 용해시켜야 하는 종래의 2 챔버 (chamber) 방식 제품, 예컨대, 동결건조 hGH 및 칸막이에 의해 분리된 용해액을 포함한 펜(pen)형 제품에 사용된 복잡한 구조의 기구 없이 손쉽게 조작할 수 있으므로, 환자 및 환자의 가족에게 부담을 덜어줄 수 있다.

hGH 수성 제제에 관련된 대표적인 특허 출원을 하기에 나타낸다.

카비(CABI) 사는 특허 공개 공보 제 508156/1994 호 (이하 "카비사 출원 공보" 로 표기) 에서, 완충제로서 2∼50 mM 의 시트르산을 pH 5∼7.5 로 함유한 hGH 또는 그의 활성 유사체의 주사용 조성물을 개시하였다. 상기 공보에는 인산염 보다 시트르산염을 사용하면 더욱 안정성이 좋아지며, 약 6.0∼7.0 의 pH 가 비교적 바람직하다고 기재되어 있다.

상기 카비사 출원 공보에는, 이 공보에서 제공된 제제가 적어도 12 개월 동안 안정하다고 기재되어 있다. 그러나, 상기 공보에는 단량체에 대한 "안정" 을 처음 함량의 85 % 이상 함량을 유지하는 것으로 정의되어 있다. 단량체의 함량 규격이 일반적으로 90 % 이상임을 고려하면, 카비사의 제제는 충분한 안정성을 가진다고 보기 어렵다.

한편, 본 발명자들은 상기 카비사와는 별도로, 품질 및 안정성의 개선을 위한 연구를 통해, 용액 형태의 hGH 제제의 제조에는 pH 가 매우 중요한 요인이며, pH 를 5∼7 로, 바람직하게는 5.5∼6.5 로 유지시킬 수 있는 완충제를 사용하는 것이 바람직하고, 이러한 완충제의 예로는 시트르산염이 유효하다는 것을 알게 되었다 (특허 공개 공보 제 92125/1996 호).

또한, 제넨테크사 (Genentech Inc.) 는 특허 공개 공보 제 509719/1995 호 (이하 "제넨테크사 출원 공보" 로 표기) 에, hGH, 만니톨, 완충제 및 비이온성 계면활성제를 함유한 액상 hGH 제제를 기재하였다. 이 공보에는 시트르산염 완충제가 바람직한 것으로 예시되어 있다.

더욱이, 특허 공개 공보 제 507497/1993 호에는, 노보 노르디스크 파마 (Novo Nordisk Pharma) 사가 2가 양이온, 예로 Zn²⁺ 의 존재하에 아세톤 또는 에탄올을 첨가함으로써 hGH 를 결정화한 다음, 이 결정을 동결건조시키고, 건조 결정을 인산염, 아세트산 아연, 글리세롤 및 벤질알콜을 함유한 pH 6.1∼6.2 의 현탁액으로 만든 제제를 기재하였다. 상기 공보에는 탈아미드화 및 분해의 형태에 대해 이온 교환 HPLC 및, 이합체 및 중합체 함량에 대해 GPC 를 각각 사용한, hGH 결정으로 만든 현탁액에 대한 22∼24 ℃ 에서의 6 개월 안정성 시험 결과가 보고되어 있다. 6 개월 후, 제제 중의 데스아미드 (desamide) 체의 함량이 5.0 %, 디데스아미드 (didesamide) 체 함량이 1.8 %, 이합체 함량이 1.2 %, 그리고 중합체 함량이 0.3 % 이며, 이중 어느 것도 종래의 동결건조 제제를 용해시킨 용액보다 안정성 시험 결과가 낮은 것으로 보고되어 있다. 상기 공보에는 큰 결정을 수득하 기 위해서는 결정화에 Zn²⁺ 가 필수적인 것으로 기재되어 있다. 또한, 아세톤 또는 에탄올과 같은 수용성 용매가 hGH 의 결정화에 필요하지만, 현탁액 중의 hGH 결정의 2차 또는 고차 구조상의 변화에 대한 언급이 없으므로 불명료한 점이 남아 있다.

아세톤 및 에탄올은 단백질을 정제하여 침전물 중에서 수득하는 데에 자주 사용된다. 이 방법은 단백질의 유기 용매중의 낮은 용해도를 이용한 것이다. 상기 공보에서 이러한 유기 용매의 농도는 단백질 침전물을 형성시키는 데에 사용되는 것보다는 낮지만, 사람에게 투여되는 약제용으로는 바람직하지 않다.

이러한 배경하에 본 발명자들은 개선된 수성 hGH 제제를 위한 연구를 더욱 추진하였다. 본 연구의 과정에서, 다양한 액체 상태의 수성 hGH 제제를, 본 발명자들에 의한 상기 특허 공개 공보 및 카비사 출원 공보에 기재된 것에 따른 시트르산염 완충제를 사용하여 제조하고, 이것에 대한 여러 가지 기간 동안의 안정성 시험을 수행하였다. 이로써 상기 제제중 어느 것이라도 응집물로부터 구분되는, 육안으로 겨우 보이는 미립자가 생성되는 것으로 나타났다. 이러한 미립자는 예를 들어 0.22 ㎛ 필터에 의해 제거할 수 있지만, 장기간의 보존 또는 교반과 같은 스트레스 하에서 다시 생성될 수 있다. 이러한 미립자의 생성은 의약품의 품질면에서 문제점이 될 수 있으므로, 이러한 입자 생성을 억제한 새로운 수성 제제가 요구된다.

한편, 시트르산염은 미산성 내지 약산성 조건으로 하기 위한 완충제로서 주사 제제에 널리 사용되지만, 이러한 용액은 hGH 의 경우에서와 같이 피하 또는 근육내로 주사될 때에 통증을 가져오는 것으로 보고되어 있다 (특허 공개 공보 제 510031/94 호). 본 발명자들도 직접, 상기 카비사 출원 공보 및 상기 본 발명자들의 특허 공개 공보의 상세한 설명에 따라 제조한 제제를 시험하여, 이들 시트르산염 함유 hGH 주사제가, 그 용액이 주입될 때 실질적인 통증을 유발하는 것을 발견하였다.

제제의 안정성 문제와는 달리, 주입시의 통증은 제제의 품질면에서 중요한 문제점이 아니다. 그러나, hGH 제제를 장기간 잦은 빈도로 주사하고, 환자가 어린이인 것을 고려할 때, 환자의 고통을 줄이는 동시에, 이로써 컴플라이언스 (compliance)를 유지하기 위해서는 주사 용액 자체가 통증을 유발하지 않는 것이 요망된다. 지금까지 치료에서는 조성물을 주입할 때 환자에게 통증을 주지 않는 제제를 실질적으로 사용하지 못했다. 그러므로, 주입시 통증의 관점에서, 상기 카비사 출원 공보 및 제넨테크사 출원 공보 (후자는 시트르산 완충제가 바람직하다고 기재함) 에 기재된 제제 뿐만 아니라, 본 발명자들의 상기 특허 출원에 따른 제제는 어느 것이라도 개선의 여지가 남아있다. 통증의 제거 또는 감소는 환자에게 유리할 것이다.

본 발명의 첫째 목적은 주사용 hGH 수성 제제의 상기 안정성 문제를 해결하는 것, 즉 탈아미노화, 중합 및 응집이 충분히 억제되고 상기 미립자의 형성도 억제된 안정한 hGH 수성 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피하 또는 근육내 주사중 주입시의 조성물로 인한 통증이 제거되거나 감소된 hGH 수성 제제를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 동결건조 전에 우연히 저장된 각종 hGH 제제를 이용하여, 말레산염 완충제 또는 숙신산염 완충제로 pH 가 6 으로 유지된 수용액중에 hGH 를 용해시킴으로써 수득된 제제가, 시트르산염 완충제를 이용하여 동일 pH 를 유지한 용액 (특허 공개 공보 제 92125/1996 호 기재) 과 비교하여 상대적으로 안정하고, 이합체 또는 중합체를 형성하지 않으며 탈아미드체도 형성하지 않는다는 것을 발견하였다. 사람 성장 호르몬의 품질면의 변화를 최대한 반영하기 위해 하기 시험들을 수행하였다 : 크기 배제 고속 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC) 에 의한 단량체 함량 측정, 역상 칼럼을 사용한 고속 액체 크로마토그래피에 의한 탈아미드체 함량 측정, 성상 관찰, 및 pH 측정. 열적 스트레스의 조건하에서 제조한 수성 제제에 대해 냉소에서 6 개월간 저장한 후, 추가로 집중적인 실험을 한 결과, 피루브산염 완충제, 아세트산염 완충제, 인산염 완충제, 시트르산염 완충제, 숙신산염 완충제 및 말레산염 완충제 중에서 말레산염 완충제, 숙신산염 완충제 및 시트르산염 완충제가 적당한 완충력을 가지는 것으로 선택되었다.

이와 같은 적당한 완충제를 사용함으로써 미산성 또는 약산성 pH 에서 hGH 의 안정화를 수득할 수 있음을 다시금 확인하였다. 그러나, 면밀한 관찰을 한 결과, 미산성 내지 약산성 조건하에서 제제를 제조하였을 때, 빛을 산란시켜 응집체로부터 구별되는, 육안으로 겨우 보이는 미립자가 검측된다는 것이 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명자들은 미립자의 형성을 억제하기 위한 방법을 찾기 위해 다수의 화합물의 효과를 평가하였다. 그 결과, 본 발명자들은 저농도의 염화 벤잘코늄이 미립자의 형성을 효과적으로 억제할 수 있음을 발견하였다. 이러한 발견을 토대로 더욱 연구한 결과, 염화 벤잘코늄을 함유한 미산성 내지 약산성 pH 의 용액에 hGH 를 용해시킨 수성 제제의 특정 제형을 이용하여, 탈아미노화, 중합 및 응집 뿐만 아니라 미립자 형성도 억제된 안정한 hGH 수성 제제를 제조할 수 있음이 명확해졌다. 이렇게 하여 본 발명을 완성하였다.

한편, 이와 같은 미산성 내지 약산성 수성 제제를 더욱 연구한 결과, 시트르산염 완충제를 사용하여 pH 범위를 유지시킨 용액은 피하 주사에서 주입시 실질적인 통증을 유발하는 반면, 폴리카르복실산염과 유사한 말레산염 또는 숙신산염을 사용한 용액은 통증을 실질적으로 유발하지 않음을 예상치 못하게 발견하였다. 이러한 발견을 토대로, 양호한 안정성을 가지며 주입시 통증을 유발하지 않는, 바람직한 hGH 함유 수성 의약 조성물을 성공적으로 제조하였다.

본 발명은 사람 성장 호르몬을 염화 벤잘코늄을 함유한 미산성 내지 약산성 완충액중에 용해시킨, 사람 성장 호르몬을 함유한 주사용 수성 의약 조성물을 제공한다.

미산성 내지 약산성 pH 는 바람직하게는 5 이상 7 미만, 더욱 바람직하게는 5.5∼6.5, 더욱더 바람직하게는 5.75∼6.25, 특히 바람직하게는 약 pH 6 이다.

안정성의 관점에서, 본 발명의 조성물에 함유되는 염화 벤잘코늄의 양은 제조 과정과 장기간의 저장 중에 미립자의 형성을 억제할 수 있는 범위 내에서 폭넓게 결정될 수 있다. 그러나, 그 양은 바람직하게는 피하 또는 근육내 주사용 약제를 위해 허용되는 양인 0.002∼0.03 mg/ml, 더욱 바람직하게는 0.005∼0.02 mg/ml 이다.

완충제에 대해서는, pH 를 7 미만, 바람직하게는 6.5 이하로 조정하여 하한선 이상의 pH 를 유지할 수 있는 완충력을 가지며, hGH 침전을 일으키지 않는 것이 적당하다. 이러한 완충제는 바람직하게는 pH 5 ∼ 7미만, 더욱 바람직하게는 5.5∼6.5 의 완충 작용을 갖는 것이 유리하게 사용될 수 있다. 특히 바람직한 완충제의 예로는 말레산염, 숙신산염 및 시트르산염이 포함된다.

완충제의 농도에 대해서는 완충력이 유지된다면 특별한 제한이 없지만, 통상적으로 1∼100 mM, 더욱 바람직하게는 1∼50 mM, 더욱더 바람직하게는 2∼20 mM 이다. 본 명세서에서, 완충제에 대한 용어 "농도" 는 완충제를 구성하는 유리 유기 산및 그의 1 단계 이상의 해리에 의해 생성된 공여 염기를 모두 합한 화학종의 총농도를 의미한다.

이러한 완충제 중에서, 말레산염 및 숙신산염이, 본 발명에 따른 조성물을 피하 또는 근육내 주입할 때 용액의 조성에 의한 실질적인 통증을 일으키지 않으므로 특히 유리하다. 특히, 말레산염은 피하 및 근육내 주사용 완충제로서 실제로 많이 사용되는 것이므로 가장 바람직하다.

그러므로, 본 발명은 또한, 사람 성장 호르몬을 함유한 주사용 수성 의약 조성물에 있어서, 염화 벤잘코늄을 함유한 미산성 내지 약산성 완충액 중에 사람 성장 호르몬을 용해시키고, 말레산염 또는 숙신산염, 특히 바람직하게는 말레산염을 완충제로서 사용함으로써, 주입할 때 통증을 경감시킨 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 hGH 의 높은 안정성을 유지할 뿐만 아니라 환자에게 매회 투여시 고통을 덜어 줄 수 있으므로 더욱 유리하다.

[발명의 실시의 형태]

본 발명에서 용어 "사람 성장 호르몬" 또는 그 약자인 "hGH" 은 191 개의 아미노산으로 이루어진 천연형 hGH 를 포함한다. 그 기원은 한정되지 않으므로, 유전자 재조합 기술 또는 뇌하수체로부터의 추출과 같은 임의의 경로를 통해 수득될 수도 있다. 또한, 상기 용어는 유전자 재조합에 의해 수득되는, N-말단 메티오닌을 가지며 192 개의 아미노산으로 구성된 생리학적 활성형 뿐만 아니라, 일부 아미노산이 소실, 치환 또는 첨가되고 천연형 사람 성장 호르몬과 실질적으로 필적하는 활성을 가진 다른 변형체도 포함한다.

본 발명의 조성물에 함유되는 사람 성장 호르몬의 양에 대해서는 특별한 제한이 없다. 즉, 그 상한선은 사용되는 완충액에 용해될 수 있는 최대의 양일 수 있고, 그 하한선은 제제중에 일반적으로 사용되는 임의의 양일 수 있다. 바람직하게는, 사람 성장 호르몬의 양은 일반적인 제제 함량인 약 10 mg/ml 이하이다.

본 발명의 조성물의 제조에서, 염화 벤잘코늄은 약제 제조에 첨가제로서 허용되는 정도라면, 액상 또는 고체상으로 사용될 수 있다.

주사액의 삼투압은 피하 및 근육내 주사에서 특히 중요하므로, 주의를 요한다. 주사액은 고장성 또는 저장성일 때 주입시 통증을 유발한다. 통상적으로, 주사액의 삼투압은 생리 식염수에 대한 상대 삼투압으로 0.9∼1.6, 더욱 바람직하게는 1.0∼1.4 가 권장된다.

본 발명의 조성물을 상기 상대 삼투압으로 조정하기 위해 D-만니톨 및 중성 염을 단독으로 또는 혼합하여 포함할 수 있다. D-만니톨은, 상대 삼투압이 0.9∼1.6, 바람직하게는 1.0∼1.4 로 되도록 본 발명의 조성물 1 ml 당 30∼100 mg 로 포함될 수 있다. 또한, 중성염, 예를 들어 염화 나트륨은, 상대 삼투압이 0.9∼1.6, 바람직하게는 1.0∼1.4 로 되도록 본 발명의 조성물 1 ml 당 5∼20 mg 로 포함될 수 있다.

현재, 의약품으로 사용되는 hGH 의 투여량은 1 주당 체중 1 kg 당 0.5 [IU] 로 제한되기 때문에, 그 동결건조 제제는 경우에 따라 수회에 걸쳐 나누어 주사된다. 이 때문에, 저장중 박테리아 등으로 오염되는 것을 방지하기 위해 방부제가 종종 첨가된다.

본 발명의 조성물에 방부제를, hGH 의 품질에 영향을 주지 않고 방부 효과를 나타내는 양으로 첨가하는 것도 허용된다. 일반적으로, 본 발명의 조성물용으로 적당한 방부제로는 벤조산 나트륨이 권장되지만, 벤조산, 페놀 등도 사용할 수 있다. 사용하기 전해 용해시켜야 하는 동결건조 hGH 제제에 일반적으로 사용되는 벤질 알콜, 메타크레졸 및 메틸 p-히드록시벤조산염을 본 발명의 조성물에 첨가하면, 벤조산 나트륨, 벤조산 또는 페놀의 첨가와 비교하여 탈아미드체의 형성을 다소 촉진하기 쉬우므로 권장하지 않는다. 방부제의 양은 주사제에 일반적으로 사용되는 양을 참조하여 편리하게 조절할 수 있다. 벤조산 나트륨의 경우, 사용량은 예를 들면, 본 발명의 조성물 1 ml 당 0.1∼5 mg, 바람직하게는 0.5∼3 mg 일 수 있다.

본 발명의 조성물은 비이온성 계면활성제를 함유할 수 있다. 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 을 본 발명의 조성물 1 ml 당 0.5∼5 mg, 더욱 바람직하게는 1∼2 mg 으로 첨가하면 조금이지만 안정성을 더욱 높일 수 있다.

본 발명의 조성물의 제조는 수성 주사제의 제조를 위한 통상적인 과정에 따라 수행할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 냉소, 특히 2∼8 ℃ 에서 보관한다.

본 발명의 조성물은 수용액이므로, 사용하기 전에 용해시켜야 하는 종래의 제제 보다 편리한 형태로 제공될 수 있다. 공급을 위한 용기내로 조성물을 충전하는 것은 일액형 (single-solution-type) 주사제 제조를 위한 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있지만, 교반의 영향을 감소시켜 저장중에 안정성을 유지하기 위해서는 충전한 후 기포를 남기지 않는 것이 바람직하다.

<안정성 시험>

hGH 의 물성 변화로는 이합체, 중합체 및 탈아미드체의 형성이 알려져 있다. 전자의 2 가지는 크기 배제 HPLC (SE-HPLC) 에 의해, 후자는 역상 HPLC (RP-HPLC) 에 의해 해결할 수 있다. 또한, 크기 배제 HPLC 에 의해 검출된 hGH 단량체의 피크 면적과 생물학적 활성 간의 관계가 관찰되어 있으므로, 공지된 생물학적 활성을 표준으로 사용한 hGH 함량의 물리화학적 측정도, hGH 생물학적 분석에 적당한 대안적인 측정 방법으로 인정된다 (Yuki 등, Iyakuhin Kenkyu, 25:383 (1994)). 그러므로, 상기 두 가지 HPLC 를 사용한 hGH 평가는 단량체 및 탈아미드체의 평가 뿐만 아니라 hGH 의 생물학적 활성의 측정도 제공한다.

본 발명자들은 상기 측정 방법들에 의해 본 발명의 hGH 수성 제제의 안정성을 평가하였다. 그 결과, 탈아미드체의 점차적인 형성이 검출되었지만, 30 ℃ 및 40 ℃ 에서 저장한 후 수득된 결과를 토대로 계산함으로써, 탈아미드체의 양은 4 ℃, pH 5.5∼6.5 의 저장 조건하에 1 년 동안 12 % 내로 제한될 수 있음이 밝혀졌다. 또한, 단량체 함량은 4 ℃ 에서 1 년간 저장 후 98 % 이상으로 유지될 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 hGH 수성 의약 조성물이 냉소에서 저장되는 조건하에서, 종래 제품에 필요한 동결건조가 필요없는 제품으로 공급될 수 있음을 나타낸다. 안정성 연구의 상세한 설명을 하기에 나타낸다.

(측정 방법)

크기 배제 HPLC 및 역상 HPLC 를 Yuki 등의 방법 (Iyakuhin Kenkyu, 25: 383 (1994)) 에 따라 수행하였다.

1. 크기 배제 HPLC (SE-HPLC) : 하기의 칼럼 및 조건을 사용한다.

(1) 칼럼: TSK 겔 G3000SW_XL (7.8 mm x 30 cm)

(2) 용리액: 0.2 M 인산 나트륨 완충액 (pH 6.5), 0.2 M 염화 나트륨

(3) 유동 속도: 0.6 ml/분, 칼럼 온도: 실온, 검출 파장: 280 nm

2. 역상 HPLC (RP-HPLC): 하기의 칼럼 및 조건을 사용한다.

(1) 칼럼: Vydac214TP54 (4.6 mm x 25 cm)

(2) 용리액: 50 mM 트리스 HCl 완충액 (pH 7.5) : n-프로판올 = 71:29

(3) 유동 속도: 0.5 ml/분, 칼럼 온도: 45 ℃, 검출 파장: 280 nm

<시험예 1>

[완충액 1]

1 ml 당 0.02 mg 의 염화 벤잘코늄 및 100 mg 의 D-만니톨을 함유한 20 mM 시트르산염 완충액 (pH 6.0)

[완충액 2]

1 ml 당 100 mg 의 D-만니톨을 함유한 20 mM 시트르산염 완충액 (pH 6.0)

[완충액 3]

1 ml 당 0.02 mg 의 염화 벤잘코늄 및 100 mg 의 D-만니톨을 함유한 20 mM 말레산염 완충액 (pH 6.0)

[완충액 4]

1 ml 당 100 mg 의 D-만니톨을 함유한 20 mM 말레산염 완충액 (pH 6.0)

[완충액 5]

1 ml 당 0.02 mg 의 염화 벤잘코늄 및 100 mg 의 D-만니톨을 함유한 20 mM 숙신산염 완충액 (pH 6.0)

[완충액 6]

1 ml 당 100 mg 의 D-만니톨을 함유한 20 mM 숙신산염 완충액 (pH 6.0)

상기 6 가지 각 완충액에 동일량으로 6.8 mg/ml 천연형 hGH 수용액을 첨가하고 서서히 혼합하여 수성 조성물 1∼6 을 각각 수득하였다 (최종 pH 6). 이어서, 각 용액을 공극 크기 0.22 ㎛ 의 필터를 통과시킨 다음, 각 1 ml 씩을 바늘 달린 주사기 내로 취하여 기포를 제거한 후 봉인하여 시료로 하였다.

상기 각 수성 제제의 일부를 2∼8 ℃ 에서 24 시간 동안 수평 교반 (진폭 20 mm, 220 회/분) 하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.

수성 제제 중 염화 벤잘코늄을 함유하지 않은 수성 제제 2,4 및 6 은 주사기내로 분배되는 도중 및 봉인되는 도중에 미량의 미립자가 생성되었다. 교반에 의해 미립자의 양은 증가되었다. 반대로, 염화 벤잘코늄이 첨가된 수성 제제 1, 3 및 5 는 분배 및 봉인 중에 미립자의 형성이 관찰되지 않았으며, 더욱이 활발한 교반 중에도 미립자의 형성은 억제되었다. SE-HPLC 에 의해 측정한 단량체 함량 또는 RP-HPLC 에 의해 측정한 탈아미드체 함량에 있어서는, 교반 전후의 차이가 보이지 않았으며, 염화 벤잘코늄을 첨가한 경우에도 차이가 없었다. 이러한 결과는 염화 벤잘코늄이 hGH 함유 수성 제제 중의 미립자 형성을 억제하기 위한 효과적인 안정화제임을 나타낸다.

표 1: 각종 완충액에 있어서의 염화 벤잘코늄의 유무와 안정성의 관계

<시험예 2>

1 ml 당 0.002∼0.1 mg 의 염화 벤잘코늄 및 100 mg 의 D-만니톨을 함유한, 20 mM 의 시트르산염 완충액 (pH 6.0) 및 말레산염 완충액 (pH 6.0) 각각에 동일량으로 6.8 mg/ml 천연형 hGH 수용액을 첨가하고 서서히 혼합하였다 (최종 pH 6.0). 각 용액을 공극 크기 0.22 ㎛ 의 필터를 통과시킨 다음, 각 1 ml 씩을 바늘 달린 주사기 내로 취하여 기포를 제거한 다음 봉인하였다. 이것들을 성상에 대해 평가하고, 미립자 형성을 효과적으로 억제하는 데 필요한 염화 벤잘코늄의 양을 측정하였다. 그 결과를 표 2 에 나타내었다. 염화 벤잘코늄의 양이 제제 1 ml 당 0.002 ∼ 0.03 mg 일 때 효과적인 억제가 관찰되었다.

표 2: 염화 벤잘코늄 농도와 미립자 형성 억제 효과의 관계

<시험예 3>

상기 시험예 1 의 각 수성 제제 1,3 및 5 를 항온기중 40 ℃ 및 50 ℃ 에서 0, 3, 7, 10, 14 및 21 일간 보존한 다음, 봉인을 제거하고 RP-HPLC 및 SE-HPLC 로 분석하였다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다. 안정성 평가에 대한 계산식에 따라 RP-HPLC 의 결과를 계산한 결과, 탈아미드체에 대한 제형 상한선을 12 % 로 할 때, 탈아미드체의 점차적인 생성이 있었지만, 이들 제제는 적어도 1년 동안 안정한 것으로 나타났다. 한편, SE-HPLC 분석 결과, 단량체 함량은 2∼8 ℃ 에서 1 년간 보존했을 때 98 % 이상으로 유지될 수 있는 것으로 판단되었다. 이러한 HPLC 결과로부터 여러 가지 보존 시점에서의 시료를 비교하였을 때, 완충제의 종류에 따른 차이는 보이지 않았다.

표 3 : 수성 제제 1,3 및 5 의 40 ℃ 및 50 ℃ 보존시의 안정성

<시험예 4>

[완충액 7]

[완충액 8]

[완충액 9]

상기 세 가지 완충액 각각에 동일량으로 6.8 mg/ml 천연형 hGH 수용액을 첨가하고 서서히 혼합하여 수성 조성물 7∼9 를 각각 수득하였다 (최종 pH 6.0). 각 용액을 공극 크기 0.22 ㎛ 의 필터를 통과시킨 다음, 각 1 ml 씩을 바늘 달린 주사기 내로 취하여 기포를 제거한 다음 봉인하여 시료로 하였다. 각 수용액을 2∼8 ℃ 에서 6 개월간 보존하고, 0, 1, 3 및 6 개월 보존시의 단량체 함량, 탈아미드체 함량 및 성상에 있어서의 변화를 확인하였다. 그 결과를 표 4 에 나타내었다. 미립자 형성은 어느 수성 제제에서도 관찰되지 않았다.

표 4 : 수성 제제 7∼9 의 2∼8 ℃ 에서 6 개월간 보존 결과

<시험예 5> 주입시 통증에 대한 시험

피하 주입시 조성물로 인한 통증의 평가를 위해, 시트르산염, 말레산염 또는 숙신산염 완충액 (최종 pH 6.0) 각각에 생리 식염수에 대한 상대 삼투압이 1.1 이 되는 적당량으로 D-만니톨을 첨가하여 주사 제제를 제조하였다. 그러나, hGH 는 시험의 목적이 완충제 종류에 따른 통증을 평가하기 위한 것이므로 첨가하지 않았다. 시험 목적의 적당한 설명을 한 후, 10 명의 건강한 남자 지원자에게 하기 세 가지 제제를 주입할 때 통증의 강도에 대해 시험을 수행하였다. 이들 제제의 시험은 블라인드(blind) 식으로 수행하였다. 통증의 강도를 하기와 같이 표현한다 : (++) 매우 아픔, (+) 아픔, (±) 아프다고 할 수 있음, (-) 아프지 않음.

처방 1 : 10 mM 시트르산염 완충액 + D-만니톨 (pH 6.0)

처방 2 : 10 mM 말레산염 완충액 + D-만니톨 (pH 6.0)

처방 3 : 10 mM 숙신산염 완충액 + D-만니톨 (pH 6.0)

표 5 : 완충액의 종류와 주사시 통증의 관계 (각 군당 10 명)

결과를 표 5 에 나타내었다. 표 안의 숫자는 해당하는 평가를 내린 사람의 수를 나타낸다. 시트르산염 기재의 제제에 대해서는 10 명 모두 "매우 아픔" 으로 평가한 반면, 말레산염 기재의 제제에 대해서는 10 명 모두 "아프지 않음" 으로 평가했다. 또한, 숙신산염 기재의 제제에 대해서는 10 명중 9 명이 "아프지 않음" 으로, 1 명은 "아프다고 할 수 있음" 으로 평가했다. 이러한 결과로부터, 주입시 강한 통증을 일으키는 시트르산염 기재의 제제와는 반대로, 말레산염 또는 숙신산염 기재의 제제는 통증을 일으키지 않거나 거의 일으키지 않는 것 으로 나타났다.

<시험예 6>

[완충액 10]

1 ml 당 0.02 mg 의 염화 벤잘코늄, 50 mg 의 D-만니톨, 5 mg 의 염화 나트륨 및 2 mg 의 벤조산 나트륨을 함유한 20 mM 시트르산염 완충액 (pH 6.0)

[완충액 11]

1 ml 당 0.02 mg 의 염화 벤잘코늄, 50 mg 의 D-만니톨, 5 mg 의 염화 나트륨 및 2 mg 의 벤조산 나트륨을 함유한 20 mM 말레산염 완충액 (pH 6.0)

[완충액 12]

1 ml 당 0.02 mg 의 염화 벤잘코늄, 50 mg 의 D-만니톨, 5 mg 의 염화 나트륨 및 2 mg 의 벤조산 나트륨을 함유한 20 mM 숙신산염 완충액 (pH 6.0)

상기 세 가지 완충액 각각에 동일량으로 6.8 mg/ml 천연형 hGH 수용액을 첨가하고 서서히 혼합하여 수성 조성물 10∼12 를 각각 수득하였다 (최종 pH 6). 각 용액을 공극 크기 0.22 ㎛ 의 필터를 통과시킨 다음, 각 1 ml 씩을 바늘 달린 주사기 내로 취하여 기포를 제거한 다음 봉인하여 시료로 하였다. 각 수용액을 40 ℃ 및 50 ℃ 에서 보존하고, 21 일후 개봉하여, RP-HPLC 및 SE-HPLC 로 분석하였다. 그 결과를 표 6 에 나타내었다.

표 6 : 수성 제제 10∼12 의 분석 결과

수성 제제중 어느 것에서도 40 및 50 ℃ 에서 21 일간 보존후, 단량체 함량 변화는 거의 없었다. 반면에, 탈아미드체 형성은 상기 시험예 3 에 나타낸 장기간 안정성 예측 범위 내에 있으며, 즉, 1 년간 안정성을 예측할 수 있다.

<시험예 7>

[완충액 13]

상기 완충액 13 에 동일량으로 20.4 mg/ml 천연형 hGH 수용액을 첨가하고 서서히 혼합하여 수성 제제 13 을 수득하였다 (최종 pH 6.0). 이 용액을 공극 크기 0.22 ㎛ 의 필터를 통과시킨 다음, 각 1 ml 씩을 바늘 달린 주사기 내로 취하여 기포를 제거한 후 봉인하여 시료로 하였다. 수성 제제 13 을 항온기내 40 ℃ 및 50 ℃ 에서 보존하고, 21 일후 개봉하여, RP-HPLC 및 SE-HPLC 로 분석하였다. 그 결과를 표 7 에 나타내었다.

표 7 : 수성 제제 13 의 안정성

이 제제는 40 및 50 ℃ 에서 21 일간 보존후, 단량체 함량 변화는 거의 나타내지 않았다. 반면에, 탈아미드체 형성은 상기 시험예 1 에 나타낸 장기간 안정성 예측 범위 내에 있으며, 즉, 1 년간 안정성을 예측할 수 있다.

[실시예]

이하에서 전형적인 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 하기 실시예에 주어진 각 성분의 양 또는 농도를 증감시키거나, 이들 성분중 하나 또는 그 이상을 다른 성분으로 대치할 수도 있고 추가의 성분을 포함할 수도 있다.

<실시예 1>

하기 처방에 따른 성분들을 혼합하여 완충액을 제조하고, 하기에 기재된 hGH 용액을 첨가한 다음 여과 멸균하여 주사 제제를 수득하였다 (최종 pH 6.0).

[완충액]

염화 벤잘코늄 0.02 mg

D-만니톨 100 mg

20 mM 시트르산염 완충액 q.s.

총량 1 ml (pH 6.0)

[hGH 용액]

6.8 mg/ml 천연형 hGH 수용액 1 ml

<실시예 2>

하기 처방에 따른 주사 제제를 실시예 1 에서와 동일한 과정으로 제조한다 (최종 pH 6.0).

[완충액]

염화 벤잘코늄 0.02 mg

D-만니톨 100 mg

20 mM 말레산염 완충액 q.s.

총량 1 ml (pH 6.0)

[hGH 용액]

6.8 mg/ml 천연형 hGH 수용액 1 ml

<실시예 3>

[완충액]

염화 벤잘코늄 0.02 mg

D-만니톨 100 mg

20 mM 숙신산염 완충액 q.s.

총량 1 ml (pH 6.0)

[hGH 용액]

6.8 mg/ml 천연형 hGH 수용액 1 ml

<실시예 4>

[완충액]

염화 벤잘코늄 0.02 mg

D-만니톨 50 mg

염화 나트륨 5 mg

벤조산 나트륨 2 mg

20 mM 시트르산염 완충액 q.s.

총량 1 ml (pH 6.0)

[hGH 용액]

6.8 mg/ml 천연형 hGH 수용액 1 ml

<실시예 5>

[완충액]

염화 벤잘코늄 0.02 mg

D-만니톨 50 mg

염화 나트륨 5 mg

벤조산 나트륨 2 mg

20 mM 말레산염 완충액 q.s.

총량 1 ml (pH 6.0)

[hGH 용액]

6.8 mg/ml 천연형 hGH 수용액 1 ml

<실시예 6>

[완충액]

염화 벤잘코늄 0.02 mg

D-만니톨 50 mg

염화 나트륨 5 mg

벤조산 나트륨 2 mg

20 mM 숙신산염 완충액 q.s.

총량 1 ml (pH 6.0)

[hGH 용액]

6.8 mg/ml 천연형 hGH 수용액 1 ml

<실시예 7>

하기 처방에 따른 주사 제제를 실시예 1 에서와 동일한 과정으로 제조한다 ( 최종 pH 6.0).

[완충액]

염화 벤잘코늄 0.002 mg

D-만니톨 100 mg

20 mM 말레산염 완충액 q.s.

총량 1 ml (pH 6.0)

[hGH 용액]

6.8 mg/ml 천연형 hGH 수용액 1 ml

<실시예 8>

[완충액]

염화 벤잘코늄 0.01 mg

D-만니톨 100 mg

20 mM 말레산염 완충액 q.s.

총량 1 ml (pH 6.0)

[hGH 용액]

6.8 mg/ml 천연형 hGH 수용액 1 ml

본 발명의 hGH 수성 의약 조성물은 안정성이 매우 높고, hGH 수성 제제의 임 상적 제공을 가능하게 하는 것을 목적으로 하며, 종래의 사용할 때 용해시키는 제형과 비교하여 환자의 불편을 덜고 오조작의 가능성을 줄일 수 있다. 또한, 통증을 일으키지 않는 완충제를 사용한 제제를 제공하여, 환자의 고통 경감 및 컴플라이언스 확보 면에서 우수한 제제를 제공할 수 있다.

Claims

사람 성장 호르몬을 함유한 주사용 수성 의약 조성물에 있어서, 사람 성장 호르몬이 염화 벤잘코늄을 함유한 완충액에 용해되어 있으며, 상기 용액의 pH 가 5 이상 7 미만이고, 완충제로서 말레산염을 사용한 것을 특징으로 하는 조성물.
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제 1 항에 있어서, 1 ml 의 조성물중 염화 벤잘코늄의 함량이 0.002∼0.03 mg 인 조성물.
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제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 조성물 중 완충제의 농도가 1∼100 mM 인 조성물.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, D-만니톨 및/또는 중성염을 추가로 함유한 조성물.
제 8 항에 있어서, 1 ml 의 조성물중 D-만니톨의 함량이 30∼100 mg 인 조성물.
제 8 항에 있어서, 중성염이 염화 나트륨인 조성물.
제 10 항에 있어서, 1 ml 의 조성물중 염화 나트륨의 함량이 5∼20 mg 인 조성물.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 방부제를 함유한 조성물.
제 12 항에 있어서, 방부제가 벤조산 나트륨, 벤조산 및 페놀로 구성된 군에서 선택된 조성물.
제 13 항에 있어서, 방부제가 벤조산 나트륨인 조성물.
제 14 항에 있어서, 1 ml 의 조성물중 벤조산 나트륨의 함량이 0.1∼5 mg 인 조성물.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 비이온성 계면활성제를 함유한 조성물.
제 16 항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80 으로 구성된 군에서 선택된 조성물.
제 16 항에 있어서, 1 ml 의 조성물중 비이온성 계면활성제의 함량이 0.5∼5 mg 인 조성물.
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