CN102225968A - 重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域。所述重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα，是由花鳗鲡促卵泡刺激素β亚基和促性腺激素α亚基通过序列（Gly-Ser）×3连接的融合蛋白。该融合蛋白的制备方法是将其编码基因连接载体pPICZαA后转化毕赤酵母X33，甲醇诱导表达。该融合蛋白可以应用于制备诱导鱼类性腺成熟的制剂。本发明的FSHβα与天然花鳗鲡促卵泡雌激素功能相似，且制备方法简单，表达水平高、易纯化，产物单一，生产成本低，适合工业化生产，在水产养殖领域具有广泛的应用前景。

Description

重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα及其制备方法和应用。

背景技术

促性腺激素（Gonadotropin Hormone，GTH）包括促卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone，FSH）和促黄体生成激素（Luteinizing Hormone，LH），是由脑垂体分泌的、由异源二聚体组成的糖蛋白激素，它们由共同的α亚基通过非共价键与特异的β亚基相连。即促卵泡刺激素（FSH）由GTHα与FSHβ组成，促黄体生成激素（LH）由GTHα与LHβ组成。不同的促性腺激素的功能主要由不同的β亚基决定。GTHα、FSHβ、LHβ三个亚基分别由不同的基因编码。

鱼类的生殖活动受到脑-脑垂体-性腺轴调控。下丘脑分泌促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing Hormone, GnRH）刺激脑垂体促性腺激素GTHs的合成与释放。促性腺激素与其特异性受体促性腺激素受体（Gonadotropin Hormone Receptor，GTHR）结合，诱导性腺细胞产生性类固醇激素，促进性腺的发育与成熟。同时，性类固醇激素对GnRH和GTHs的合成与分泌具有反馈作用。FSH主要是在鱼类性腺发育早期，刺激性腺分泌雌二醇、睾酮等性类固醇激素，调节性腺的发育和配子的形成。

一部分鱼类GTH基因已经得到克隆并在原核或者真核表达系统中成功表达。这些重组的促性腺激素表现出了与天然促性腺激素相同的生物活性，通过注射的方法对鱼类进行处理后能促进鱼类性腺的发育。

花鳗鲡（Anguilla.Marmorata）为降海洄游性鱼类，属鳗鲡目，鳗鲡科，鳗鲡属，是一种大型珍贵的食用鱼类，俗称花鳗、雪鳗等，属国家二级野生保护动物。它们在淡水里生长，在河湖内性腺不发育，当在成年时的冬季降河洄游到江河口附近时性腺才开始发育，然后入海进行产卵繁殖。同时在养殖条件下，鳗鲡性腺不能正常发育，主要是由于GTH不足。只有采用外源激素才能诱导鳗鲡性腺发育成熟。

采用基因工程方法合成促卵泡激素的报道不多，仅中国专利申请（公开号101067118，公开日2007年11月7日）公开了一种重组牛促卵泡激素在毕赤酵母中的表达，采用人工合成方法得到牛促卵泡激素α亚基和带6×his-tag的β亚基的cDNA序列，将α和β亚基共构建与同一表达载体pHIL-bFSH-Zeocin并转化毕赤酵母，分泌表达重组bFSH。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中没有关于花鳗鲡性激素的药物的不足，提供一种重组花鳗鲡粗性腺激素中的促卵泡刺激素FSHβα。

本发明的另一目的是提供上述重组蛋白的制备方法。

本发明的再一目的是提供上述重组蛋白的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα，是由花鳗鲡促卵泡刺激素β亚基和促性腺激素α亚基通过序列Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser连接的融合蛋白。此linker的作用是在β与α亚基之间能够提供足够的空间供亚基的折叠，形成与内源蛋白结构相近、并能与其受体结合。

所述FSHβα的氨基酸序列具体如SEQ ID NO:1所示。

所述FSHβα的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

以Genbank上公布的花鳗鲡促性腺激素中的促卵泡刺激素FSHβ和共同的GTHα亚基的氨基酸序列为依据，根据酵母表达的密码子的偏好性，人工合成了促卵泡刺激素的双亚基融合基因序列，即上述SEQ ID NO:2。

含有上述编码基因的表达载体，出发载体为pPICZαA，将编码基因连接与出发载体即得到重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα的表达载体。

含有上述表达载体的宿主，出发菌株为毕赤酵母X33，上述表达载体转入毕赤酵母X33，获得重组工程菌。

重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα的制备方法，包括以下步骤：

（1）人工合成FSHβα编码基因，转入克隆载体pGEMT，构建pGEMT-FSHβα重组质粒；

（2）以pGEMT-FSHβα重组质粒为模板，设计引物，上游引物序列如SEQ ID NO:3，下游引物序列如SEQ ID NO:4，进行PCR扩增；

（3）PCR扩增产物用Eco R Ι和Xba Ι酶切、纯化，连接到表达载体pPICZαA，得到酵母重组表达载体pPICZαA-FSHβα；

（4）将酵母重组表达载体pPICZαA-FSHβα转化毕赤酵母X33，形成重组菌株；

（5）将重组菌株接种到含zeocin的培养基中，室温振荡培养至OD为2.0~6.0；

（6）收集菌液，甲醇诱导表达，每24小时补充甲醇至浓度为0.7%，连续诱导5天；

（7）表达产物分离纯化，得到重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα。

其中步骤（5）所述抗生素zeocin优选浓度为1000μg/ml。最终选择这个浓度是因为在高浓度下能生长的菌落，说明其拷贝数更高，本发明的重组菌株在此高浓度下能生长良好。

所述FSHβα在制备诱导鱼类性腺成熟的制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下的收益效果：

本发明提供的重组花鳗鲡促卵泡刺激素基因通过与表达载体pPICZαA连接后可在毕赤酵母菌株中高效表达，分离纯化后可提高重组促卵泡刺激素的纯度，且具有表达水平较高，易纯化等优点。通过本发明的技术方案，可以大量地生产重组促卵泡刺激素，降低了生产成本，且是单一的产物，这种来源稳定、成本低的重组促卵泡刺激素促进鳗鲡性腺的成熟，可应用于水产养殖业，有助于花鳗鲡的人工繁殖。

附图说明

图1：重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα的PCR人工合成基因及其表达载体构建过程示意图；

图2：构建表达载体时以pGEMT-FSHβα为模板扩增FSHβα的电泳图，其中：M为分子量标准；1和2为PCR扩增产物。箭头所指为目的条带所在位置。

图3：酵母表达载体pPICZαA-FSHβα的PCR鉴定电泳图，其中M为分子量标准；N为阴性对照，1和2为PCR扩增产物；

图4：酵母表达载体pPICZαA-FSHβα的双酶切鉴定电泳图，其中M为分子量标准，1为表达质粒pPICZαA-FSHβα；箭头所指为双酶切后目的条带所在位置；

图5：重组酵母诱导表达第4天胞外蛋白的SDS-PAGE图谱，其中M为蛋白分子量标准，N为转化pPICZαA-X33的阴性对照；1-6分别为不同转化pPICZαA-FSHβα的单克隆。箭头所指为目的条带所在位置；

图6：用His-Tag作为一抗、羊抗鼠Ig-G为二抗的western blot图谱，其中N为阴性对照，1-6为不同转化pPICZαA-FSHβα的单克隆。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1 制备重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα

1. 构建表达载体pPICZαA-FSHβα

根据Genbank上公布的花鳗鲡促性腺激素中的促卵泡刺激素FSHβ和共同的GTHα亚基的核苷酸序列为基础，并根据毕赤酵母的密码子偏好性，生物合成能编码FSHβα的基因片段，所编码的氨基酸序列不变，如SEQ ID NO:1所示，但该片段的密码子已经改成适合在毕赤酵母中表达的基因片段，如SEQ ID NO:2所示，构建克隆载体pGEMT-FSHβα。

根据上述编码基因的核苷酸序列及表达载体pPICZαA多克隆位点的序列设计一对引物。上游引物序列如SEQ ID NO:3所示；下游引物序列如SEQ ID NO:4所示。以构建的pGEMT-FSHβα载体为模板，用上述引物进行PCR扩增FSHβα基因，扩增出来的片段约690bp，与预期PCR产物大小一致（见图2）。

将回收纯化的基因片段用EcoRⅠ和Xba1双酶切后，与经同样双酶切的线性载体pPICZαA连接，构建表达质粒pPICZaA-FSHβα，转化入E.coli.DH5α。挑取数个单菌落，用上述引物进行菌液验证。结果扩增出一条与预期大小（约690bp）相符的特征片段（见图3）。用双酶切检测重组质粒，酶切产物包括与PCR产物大小（约690bp）一致的片段，以及与线性载体pPICZαA（3.6kb）一致的片段（见图4）。表明FSHβα基因已经插入表达载体pPICZαA中（构建示意图见图1）。

对重组质粒进行双向测序，其序列与预期完全一致，没有碱基突变，且读码框正确。

2．重组毕赤酵母表达菌株pPICZaA-FSHβα（X33）的构建

取15μg表达载体pPICZαA-FSHβα用限制性内切酶Dra Ι进行单酶切，酶切完全后用胶回收试剂盒进行纯化，溶解于40μl双蒸水中，取100μl毕赤酵母X33感受态细胞，与酶切好的载体在冰上混匀，静止5分钟。将混合物转入电击杯中，2000kv电压电击转化。电击结束后迅速加入1ml 1Msorbital，28℃静置2小时后涂布在YPDS平板（200μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml Zeocin 浓度）。28℃培养3天后均长出具有抗性的酵母单克隆pPICZαA-FSHβα（X33）。选用高浓度的抗生素可以选择高拷贝的重组菌株，1000μg/ml Zeocin 浓度的培养平板上重组菌株生长良好。

3. 重组酵母的甲醇利用型鉴定

将单克隆pPICZαA-FSHβα（X33）对应点在MDH和MMH平板上，先点MDH，后点MMH。在两种平板上生长均良好的克隆为甲醇利用快型，只在MDH平板上生长良好的克隆为甲醇利用慢速型。结果表明转化子为甲醇利用快速型。

4．重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα在毕赤酵母中的诱导表达

挑取6个在高浓度抗生素（1000μg/ml Zeocin 浓度）培养平板上生长良好的目标基因转化子pPICZαA-FSHβα（X33），即重组酵母，和1个阴性对照转化子（pPICZαA-X33），即对照酵母，先将菌种接种到含抗生素Zeocin（200μg/ml）的BMGY培养基中，28℃，220rpm培养至OD为2.0~6.0，离心收集细胞，重悬于含以甲醇为碳源的培养基BMMY诱导表达。每24小时补充甲醇至终浓度为0.7%，连续诱导5天。离心收集上清，用DOC-TCA法沉淀蛋白，取沉淀蛋白样品进行SDS-PAGE和western blot分析，Western blot所用一抗为His-Tag单克隆抗体，二抗为羊抗鼠IgG。

SDS-PAGE结果如图5，western blot结果如图6，表明FSHβα在毕赤酵母中有表达。N为转化pPICZαA-X33的阴性对照；1-6分别为不同转化pPICZαA-FSHβα的单克隆。箭头所指为目的条带所在位置，其中单克隆1的表达量最高，其次为2、3、5；单克隆4和6没有表达。由于western blot检测方法更灵敏，能检测出单克隆4和6有少量的表达，但是在SDS-PAGE中看不到表达条带。

5. 表达产物常规方法分离纯化，最终获得重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα蛋白。

结论

本发明制备的重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα，是由花鳗鲡促卵泡刺激素β亚基和促性腺激素α亚基通过linker序列结合的融合蛋白。与花鳗鲡体内自身合成的促卵泡刺激素蛋白功能结构域没有差别，将Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser作为linker是在β与α亚基之间能够提供足够的空间供亚基的折叠，形成与内源蛋白结构相近、并能与其受体结合的蛋白空间结构，并且此linker为促卵泡刺激素蛋白的非关键部位氨基酸残基，因此对该蛋白的生物活性没有影响。本发明的重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα可实现促卵泡激素中的异源二聚体β、α亚基蛋白的同时、等量的表达，且利于形成类内源促卵泡刺激素的结构，以保证蛋白的活性。实验证实本发明得到的重组蛋白能够促进花鳗鲡的性腺成熟。

促卵泡刺激素主要是在鱼类性腺发育早期，刺激性腺分泌雌二醇、睾酮等性类固醇激素，调节性腺的发育和配子的形成。在雄性鱼中，脑垂体分泌的促卵泡刺激素随血液循环到达精巢，与其组织中Leydig细胞膜上的受体结合，刺激Leydig细胞产生睾酮（testosterone，T）和11-酮睾酮（11-ketotesttosterone，11-KT）等性类固醇激素。性类固醇激素再刺激Sertoli细胞分泌激动素B，激动素B再通过某些因子刺激精母细胞的分裂和精子生成。而雌性鱼，在脑垂体分泌的促性腺激素作用下，卵巢卵母细胞将胆固醇合成为雄激素，随后雄激素转移到颗粒层细胞并芳香化为17β-E2并随血液循环的作用，到达肝脏，与肝脏中特定受体结合，形成激素受体复合物与核内DNA作用，促进肝细胞卵黄蛋白原的合成。合成的卵黄蛋白原随血液循环到达卵巢,在促卵泡刺激素的作用下,通过微胞饮作用进入卵母细胞。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  中山大学

 

<120>  重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα及其制备方法和应用

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  201

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  1

 

Gly Leu Ala Asn Ile Ser Ile Ser Val Glu Asn Glu Glu Cys Gly Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Cys Ile Thr Phe Asn Thr Thr Ala Cys Ala Gly Leu Arg Phe Thr Gln

            20                  25                  30         

 

 

Asp Ser Val Tyr Lys Ser Ser Leu Lys Pro Tyr Pro Gln Gln Ala Cys

        35                  40                  45             

 

 

Asn Phe Arg Asp Val Val Tyr Glu Thr Val His Leu Pro Gly Cys Pro

    50                  55                  60                 

 

 

Ser Gly Met Asp Leu His Phe Thr Tyr Pro Val Ala Leu Ser Cys Glu

65                  70                  75                  80 

 

 

Cys Ser Lys Cys Asn Thr Asp Ser Thr Asp Cys Gly Pro Leu Asn Thr

                85                  90                  95     

 

 

Glu Val Ser Gly Cys Leu Thr His Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asn Asn

            100                 105                 110        

 

 

Glu Met Ala Arg Gly Gly Cys Asp Glu Cys Arg Leu Gln Glu Asn Lys

        115                 120                 125            

 

 

Ile Phe Ser Lys Pro Ser Ala Pro Ile Phe Gln Cys Val Gly Cys Cys

    130                 135                 140                

 

 

Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys Val Ala Arg Glu

                165                 170                 175    

 

 

Val Thr Arg Leu Asp Asn Met Lys Leu Glu Asn His Thr Asp Cys His

            180                 185                 190        

 

 

Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Phe

        195                 200    

 

 

<210>  2

<211>  603

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ggtttggcta acatctccat ctccgttgag aatgaggagt gcggtggttg catcaccttc     60

 

aacaccaccg cctgtgctgg tttgagattc acccaggatt ctgtctacaa gtcctccttg    120

 

aagccatacc cacaacaggc ttgcaacttc agagacgtcg tctatgagac tgtccacttg    180

 

ccaggttgtc catctggtat ggacttgcac ttcacctacc cagttgcttt gtcctgtgag    240

 

tgctccaagt gcaacaccga ctccactgac tgtggtccat tgaacaccga ggtctctggt    300

 

tgtttgaccc acggttctgg ttctggttct aacaacgaga tggctagagg tggttgcgac    360

 

gagtgcagat tgcaggagaa taagatcttc tccaagccat ctgctccaat cttccagtgc    420

 

gttggttgct gtttctccag agcttaccca actccattga gatccaagaa gaccatgttg    480

 

gtcccaaaga acatcacctc tgaggctact tgctgcgttg ctagagaggt tactagattg    540

 

gacaacatga agttggagaa ccacaccgac tgccactgct ccacctgcta ctaccacaag    600

 

ttc                                                                  603

 

 

<210>  3

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ccggaattcg gtttggctaa catctcc                                         27

 

 

<210>  4

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gctctagaga acttgtggta gtagca                                          26

Claims (8)

1.一种重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα，是由花鳗鲡促卵泡刺激素β亚基和促性腺激素α亚基通过序列Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser连接的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1所述重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.含有权利要求3所述编码基因的表达载体，其特征在于出发载体为pPICZαA。

5.含有权利要求4所述表达载体的宿主，其特征在于出发菌株为毕赤酵母X33。

6.权利要求1所述重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα的制备方法，包括以下步骤：

（1）人工合成FSHβα编码基因，转入克隆载体pGEMT，构建pGEMT-FSHβα重组质粒；

（2）以pGEMT-FSHβα重组质粒为模板，设计引物，上游引物序列如SEQ ID NO:3，下游引物序列如SEQ ID NO:4，进行PCR扩增；

（3）PCR扩增产物用Eco R Ι和Xba Ι酶切、纯化，连接到表达载体pPICZαA，得到酵母重组表达载体pPICZαA-FSHβα；

（4）将酵母重组表达载体pPICZαA-FSHβα转化毕赤酵母X33，形成重组菌株；

（5）将重组菌株接种到含zeocin的培养基中，室温振荡培养至OD为2.0~6.0；

（6）收集菌液，甲醇诱导表达，每24小时补充甲醇至浓度为0.7%，连续诱导5天；

（7）表达产物分离纯化，得到重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤（5）所述zeocin浓度为1000μg/ml。

8.权利要求1所述重组花鳗鲡促卵泡刺激素FSHβα在制备诱导鱼类性腺成熟的制剂中的应用。

Images