CN102115748A

CN102115748A - 斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用

Info

Publication number: CN102115748A
Application number: CN 201010598396
Authority: CN
Inventors: 张双全; 闵翠; 梁臻宁
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2010-12-21
Publication date: 2011-07-06

Abstract

斑马鱼B淋巴细胞刺激因子（zBAFF)cDNA及其克隆方法和重组应用，涉及生物基因工程领域。斑马鱼B淋巴细胞刺激因子基因的克隆方法如下：TRIzol法提取斑马鱼脾脏总RNA并进行逆转录；通过Clustalw软件分析虹鳟鱼,大西洋鲑鱼,斑点绿河豚BAFFcDNA以及虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰BAFFcDNA保守区设计兼并引物进行PCR扩增，获得807bp全长cDNA。所述斑马鱼B淋巴细胞刺激因子和增殖诱导配体cDNA可通过现有基因工程方法，生产重组斑马鱼的BAFF。

Description

斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆和重组应用。

背景技术

BAFF具有很强的B细胞趋化性，在体外作为B细胞增殖和分化的共刺激因子，能诱导活化的B细胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等。对于休眠B细胞，BAFF虽不能独立激活使之进入细胞周期循环，但通过上调细胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-X_L的表达，可延长休眠B细胞的寿命。在体内，它可以促进脾脏内T1-B细胞向T2-B细胞以及成熟B细胞的发育。BAFF的正常表达是GC形成、抗体亲和力成熟、记忆性B细胞形成及B细胞正常发育的必须条件BAFF^-/-小鼠的次级淋巴器官囊外及过渡区B细胞完全缺失，而BAFF转基因小鼠则由于B220⁺细胞数目剧增而引起脾脏、淋巴结、派尔斑(Peyer’s patch)肿大，血清中IgM、IgG、IgA、IgE滴度上升，8周后出现与典型SLE(系统性红斑狼疮)相似的症状。最近的研究显示BAFF还具有调节B细胞分化的作用。BAFF在体外能促进B系淋巴瘤的增殖，并抑制FasL-Fc和TACI-Fc的促凋亡作用，提示其还可能具有抑制细胞凋亡的作用。

由于T细胞表面表达BAFF特异性受体BAFF-R，且用抗BAFF-R的单克隆抗体能阻断BAFF对T细胞的增殖效应，因此推测BAFF通过BAFF-R对T细胞的激活和分化起共调节作用。

有专家认为,BAFF是B细胞存活的关键因子，犹如针对B细胞的一个精妙的安检站。过度表达BAFF可以减少B细胞的耐受性，产生免疫反应。目前临床实验得到的结果证明了BAFF在类风湿性关节炎(RA)发病中的病理学角色。研究发现，存在于骨髓中的B细胞的发育和选择不依赖于BAFF，但当B细胞离开骨髓，便成为外周B细胞存活和成熟以及T、B细胞激活的主要细胞因子。

BAFF不仅是B细胞的存活因子，还对T细胞激活有共刺激作用。最新研究表明，BAFF的表达水平与感染和炎症反应密切相关。

T、B细胞在自身免疫疾病中起到了重要作用，而BAFF主要表达在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和活化的T细胞表面，分泌细胞因子、生长因子和各种介质，使B细胞活化为浆细胞，分泌大量免疫球蛋白，包括自身抗体，使机体出现炎性反应和破坏。

BAFF是B细胞活化的正调节蛋白。通过实验研究发现，与正常对照组比较，RA患者的BAFF血清水平明显增高，B细胞活化的标记物可溶性CD23(sCD23)同样有明显升高，但二者相比无相关性。进一步研究发现，BAFF与RF具有相关性，表明BAFF在RA中作用是诱导自身抗体的产生，而不是B细胞的活化。

干燥综合征中BAFF及其受体在唾液腺局部表达的作用，进一步研究表明这些细胞因子具有活性，可以延长正常B细胞的存活。在SS中，BAFF的表达不仅来源于上皮细胞和T细胞，还来自于B细胞，通过自分泌发挥免疫作用

各种研究表明，许多恶性B系肿瘤异常表达BAFF和APRIL，并且这些肿瘤细胞表面表达一种或多种BAFF与APRIL受体。人们也研究了“诱饵受体”BCMA-Fc、TACI-Fc及BAFF的单克隆抗体对这些B系肿瘤抑制的影响，发现这些抗体及抗体类似物均能恢复这些肿瘤细胞的凋亡作用。

BAFF/APRIL配体-受体系统极有可能成为对抗多种恶性肿瘤的分子靶点库。

根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前已知BAFF基因序列的鱼类包括虹鳟鱼, 大西洋鲑鱼, 斑点绿河豚；APRIL基因序列包括虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰,并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，序列号分别是ABC84582、NP_001135232、SINFRUP00000153079、EF451543、DY736744、CB940845。斑马鱼B淋巴细胞刺激因子(zBAFF) cDNA还未被克隆出来，关于斑马鱼BAFF基因的研究在整个国内外还处于完全空白状态。

斑马鱼(Danio rerio)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio)的一种硬骨鱼。原产自印度东部、巴基斯坦、缅甸、孟加拉国等南亚地区，是一种常见的热带鱼。斑马鱼是国际标准化组织认可的5种鱼类实验动物之一，已经成为发育生物学、遗传学、毒理学等研究常用的模式生物。

60年代末70年代初，Streisinger首先对这种生物进行了单倍体培育，建立了第一个用紫外线突变的突变体。随着纯合子培养技术的成熟和广泛高效的突变剂ENU的出现，位于Tübingen和Boston等地的几个实验室自1993年开始对斑马鱼进行ENU大规模系统突变筛选和建库工作。1994年，在冷泉港召开的斑马鱼研究专题会议，标志着斑马鱼已成为继小鼠，果蝇，线虫后又一生物学研究的重要模式生物。

虽然斑马鱼最初主要被用来进行遗传学及发育生物学研究，但近几年，随着对斑马鱼了解的日趋深入，其在免疫学中的应用也越来越为人们所重视。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种从斑马鱼提取的B淋巴细胞刺激因子cDNA，并提供斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法及重组应用。

本发明从斑马鱼中克隆到B淋巴细胞刺激因子cDNA，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。

斑马鱼B淋巴细胞刺激因子，它具有SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明的斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法如下：

（1）从斑马鱼脾脏组织总RNA

（2）利用RT-PCR方法通过同源克隆（homology cloning）策略并结合cDNA末端快速扩增法（RACE）克隆斑马鱼全长BAFF的cDNA序列。

上述斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法具体操作如下：

（1）利用Trizol试剂一步法提取斑马鱼脾脏组织总RNA

（2）通过Clustal w软件分析虹鳟鱼, 大西洋鲑鱼, 斑点绿河豚BAFF cDNA保守区，设计兼并引物

zBAFF1：5'-TTGTNCCNTGGCTTCTNAGCTTTAA-3'；(SEQ ID NO.3)

zBAFF2：5'-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3' (SEQ ID NO.4)

（3）进行PCR扩增，得到807bp的片段，如SEQ ID NO.1所示。

通过CLUSTAL软件分析，比对斑马鱼与虹鳟鱼、大西洋鲑鱼、斑点绿河豚的BAFF氨基酸序列(Genbank ABC84582, NP_001135232, EN:SINFRUP00000153079)结果如图3所示，它们的同源性分别为67.6, 61.4和66.9%，并且可溶部分比跨膜区和胞内区在进化上更保守。其开放阅读框如SEQ ID NO.1所示。

上述斑马鱼B淋巴细胞刺激因子（zBAFF）的cDNA的重组应用，通过现有基因工程方法，生产重组zBAFF。具有绿色荧光活性的重组蛋白，其可溶性、稳定性及生物学活性达到了预期的良好效果，为进一步进行相关的研究提供了生物工程工具的前体。

附图说明

图1 zBAFF(GenBank NO. FJ587513)的cDNA序列及对应的蛋白序列

图2保守氨基酸用黑色阴影标注，跨膜区域用虚线标注，(★)为三个保守的Cys残基，箭头所指为N-糖基化位点，双线标注部位为Flap环，划线部分为胞外可溶区。

图3是EGFP和EGFP-zsBAFF的荧光光谱测定。

图4是zsBAFF空间结构预测模型 (aa 116-268) hsBAFF空间结构模型比较(aa 134-285)。(a)和(b)表示zsBAFF3D结构的卡通示意模型和空间填满模型，(c)和(d) 表示hsBAFF 3D结构的卡通模型和空间填满模型。

图5是SDS-PAGE分析EGFP-zsBAFF在大肠杆菌中的表达：1 重组蛋白非诱导；2 重组蛋白诱导20h；3 纯化后蛋白EGFP-zsBAFF；4 western blotting图。

图6是EGFP-zsBAFF对小鼠淋巴细胞的促存活作用。

图7是EGFP-zsBAFF与小鼠淋巴细胞结合的激光共聚焦检测结果。(a)和(d)为透射光(相位差)。(b)和(e)为(a)和(d)在488nm激发下的EGFP荧光(绿色)。(c)和(f)为 a/b or d/e两图的合并。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

实施例1

斑马鱼购自南京大学模式动物遗传中心

（1）引物设计：通过Clustal w软件分析虹鳟鱼, 大西洋鲑鱼, 斑点绿河豚BAFF cDNA保守区，设计兼并引物zBAFF1：5'-TTGTNCCNTGGCTTCTNAGCTTTAA-3'；zBAFF2：5'-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3'。

（2）提取总RNA：应用RNA抽提试剂TRIzol（Invitrogen 公司）按照其操作手册提取斑马鱼脾脏细胞的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。

（3）RT-PCR：以上述zBAFF1及zBAFF2为引物进行PCR扩增，得到807bp的片段P1。

①逆转录

在DEPC处理的1.5ml Eppendorf管中依次加入总RNA抽提物3μl，Oligo d(T)₁₈1μl，10mmol/L dNTP 2μl，DEPC水5μl置于；65 °C，15min后立即冰浴5min；再在上述体系中加入5×RT反应缓冲液4μl，RNase inhibitor 0.5μl(20u)，AMV反转录酶2μl，DEPC水2.5μl至总体积为20μl的反应液，于42 °C反应1.5h，94 °C，10min终止反应，置于冰上；

②PCR

利用逆转录所得模板进行PCR，体系为50μl，10μmol/L上、下游引物各2.5μl，2.5mmol/L dNTP 4μl，25mmol/L MgCl₂ 3μl，10×缓冲液5μl，cDNA模板5μl，rTaq酶1μl，加ddH₂O 27μl。反应程序为：94 °C 5min，94 °C 30s，56 °C 30s，72°C 1min，30个循环，最后72 °C孵育5min。

反应完成后将产物于1%琼脂糖凝胶中电泳分离，用胶回收试剂盒回收得到约340bp的DNA条带，克隆入pMD18-T载体，经含Amp抗生素（50mg/ml）的琼脂糖平板筛选转化子，挑出阳性克隆送往上海英骏测序公司进行碱基序列测定。

（4）同源检索：将所得序列P1通过CLUSTAL软件分析，比对斑马鱼与虹鳟鱼、大西洋鲑鱼、斑点绿河豚的BAFF氨基酸序列(Genbank ABC84582, NP_001135232, EN:SINFRUP00000153079)结果如图2所示，它们的同源性分别为67.6, 61.4和66.9%，并且可溶部分比跨膜区和胞内区在进化上更保守。

实施例2：

斑马鱼BAFF重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达

根据已知的zsBAFF序列和EGFP序列为模板分别设计引物Al、A2和A3、A4。其中Al的5’端具有BamHⅠ酶切位点，A4的5’端具有HindⅢ酶切位点，而A2和A3含有在EGFP和zsBAFF之间编码(Gly₄Ser)₂ linker的碱基序列。通过over-lap PCR扩增EGFP-zsBAFF基因片段。两轮PCR后，将PCR产物割胶回收及pET-28a载体分别用BamHⅠ和HindⅢ酶切，T4 DNA Ligase连接，连接产物转化E.coliDH5a中，获得含pET28a-EGFP-zsBAFF重组菌株。挑选阳性重组菌株，扩大培养提取pET28a-EGFP-zsBAFF重组质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性菌株诱导表达。引物序列如下：

A1: CGCGGATCCATGGTGAGCAAG (SEQ ID NO.5)

A2: GCTGCCACCTCCACCGCTACCGCCGCCTCCCTTGTACAGCTC(SEQ ID NO.6)

A3: GGTGGAGGTGGCAGCAGCTTGAGTCATGCGCCAAAC(SEQ ID NO.7)

A4: CCCAAGCTTTCAGGCCAGTTTTATTGCTCCTA(SEQ ID NO.8)

(其中A1含有BamHⅠ酶切位点，A4含有HindⅢ酶切位点；A2、A3含有编码一个linker (Gly₄Ser)₂的基因序列)

经SDS-PAGE检测(图5)显示，在大约50 kDa处为目的蛋白，经IPTG诱导20 h达到最大表达量。

重组目的蛋白的Ni+亲和纯化

IPTG低温诱导含有重组载体pET28a-EGFP-zsBAFF的大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）24小时后，4℃收菌，冰上超声破碎（160W，工作4s，暂停8s，共99次）表达菌体，4℃，13，000×g，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni⁺-NTA柱。简要过程是：3体积Binding Buffer平衡Ni⁺-NTA柱后，手动上样含可溶性重组蛋白的上清，先后用10倍体积的Binding buffer和6倍体积的Washing buffer（20 mmol/L Imidazole，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris HCl，pH 7.9）洗去杂蛋白，最后用Elute buffer(1 mol/L Imidazole，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L TrisHCl，pH 7.9)洗脱目的蛋白，分管收集，PBS除盐。SDS-PAGE检测各收集管蛋白纯度和紫外分光光度计测定蛋白浓度。如图5（条带3）所示，表达得到的目的蛋白经Ni+柱亲和纯化得到纯度达95%的活性目的蛋白。

zsBAFF空间结构预测

如图4所示，zsBAFF空间结构预测模型和hsBAFF空间结构模型比较,由此看出，其空间结构与人BAFF已知结构非常相似。

Western印记分析

Western-blot中所用一抗为鼠抗His₆单抗，二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG。其简要步骤是：将样品先进行SGS-PAGE，然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5％脱脂奶粉室温封闭1h，与一抗孵育1h，与HRP标记的二抗IgG孵育1h，每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。结果如图5（条带4）所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。

实施例3

受体结合特性

BAFF可以与其三个受体结合，它们分别是TACI，BCMA和BAFF-R。TACI

表达与B细胞和激活的T细胞表面，而BCMA和BAFF-R则大部分或绝对表达与B细胞表面。在这里EGFP-zsBAFF的结合特性我们用激光共聚焦显微镜来检测。通过激光共聚焦显微镜我们可以看到EGFP-zsBAFF可以结合与小鼠的淋巴细胞表面，而对照EGFP没有结合特性(图7)。

EGFP-zsBAFF对小鼠淋巴细胞促存活作用

在体外通过MTT细胞毒试验检测EGFP-zsBAFF对小鼠淋巴细胞的促存活作用，如图6所示，PBS为空白对照，12μg/ml EGFP-zsBAFF、12μg/ml EGFP+anti-IgM、5μg/ml EGFP和anti-IgM培养细胞为阴性对照，6μg/ml zsBAFF+ anti-IgM和2μg/ml hsBAFF+anti-IgM为阳性对照。结果表明本实验克隆得到的EGFP-zsBAFF对小鼠淋巴细胞都具有明显的促存活效应，且呈现剂量依赖效应。

实施例4：

将实施例1获得的斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，转入动物体内，增加其免疫力，在饲养中应用。

按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰斑马鱼B淋巴细胞刺激因子基因并用于所述研究和生产。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京师范大学

<120> 斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 807

<212> DNA

<213> Danio rerio

<400> 1

atgcctgctg aagatgttgg tccaggtcgc ggtgaacgga gaaggttgtc ctggctgttt 60

ttggtgctgg tcgccgctgc cattacctcc tcttcgctgt ctgtgatctc tctttaccat 120

gtgctggcac tgaaggccga ggtggagggt ttgagggcag aagtggctcg caagagagaa 180

gagcaaagcg ggatgctaga tgaacctgtg aacgaggcag agaaacaaac ccatcgggag 240

gaaggaggag atagtattga gtatctgcac caggccgata tggatatcac aacagaccct 300

agtgtcatgt caaaaaggag cttgagtcat gcgccaaaca aagcagaacc tcagccctgc 360

ttacagatga tggcagacaa caagaagaaa accttccaaa aagagtttgc ttttgactat 420

tgcacagcca tcccatggca ggtgggtcta aagcgcggct ccgctctgga ggaagagcag 480

ggcactattt tagtcaaaga ggaaggcttc ttctttatct acagccagct ctcattttcc 540

caggtctact atacagaccc cacgtttgcc atgggccaca ttgtgattcg cataaagaag 600

aacgtggtcg gcaatgaaag tcagcatgtg gttctgtttc gctgcattca gagcatgaat 660

cgagtcaatc actacaacac ttgctatact ggaggcgtag tgaaactgga ctctggggac 720

aaactggatc ttctgatacc tcgtgctaat gctaatatct ctctggaagg ggacgccacg 780

tttttaggag caataaaact ggcctga 807

<210> 2

<211> 268

<212> PRT

<213> Danio rerio

<400> 2

Met Pro Ala Glu Asp Val Gly Pro Gly Arg Gly Glu Arg Arg Arg Leu

1 5 10 15

Ser Trp Leu Phe Leu Val Leu Val Ala Ala Ala Ile Thr Ser Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Val Ile Ser Leu Tyr His Val Leu Ala Leu Lys Ala Glu Val

35 40 45

Glu Gly Leu Arg Ala Glu Val Ala Arg Lys Arg Glu Glu Gln Ser Gly

50 55 60

Met Leu Asp Glu Pro Val Asn Glu Ala Glu Lys Gln Thr His Arg Glu

65 70 75 80

Glu Gly Gly Asp Ser Ile Glu Tyr Leu His Gln Ala Asp Met Asp Ile

85 90 95

Thr Thr Asp Pro Ser Val Met Ser Lys Arg Ser Leu Ser His Ala Pro

100 105 110

Asn Lys Ala Glu Pro Gln Pro Cys Leu Gln Met Met Ala Asp Asn Lys

115 120 125

Lys Lys Thr Phe Gln Lys Glu Phe Ala Phe Asp Tyr Cys Thr Ala Ile

130 135 140

Pro Trp Gln Val Gly Leu Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Glu Gln

145 150 155 160

Gly Thr Ile Leu Val Lys Glu Glu Gly Phe Phe Phe Ile Tyr Ser Gln

165 170 175

Leu Ser Phe Ser Gln Val Tyr Tyr Thr Asp Pro Thr Phe Ala Met Gly

180 185 190

His Ile Val Ile Arg Ile Lys Lys Asn Val Val Gly Asn Glu Ser Gln

195 200 205

His Val Val Leu Phe Arg Cys Ile Gln Ser Met Asn Arg Val Asn His

210 215 220

Tyr Asn Thr Cys Tyr Thr Gly Gly Val Val Lys Leu Asp Ser Gly Asp

225 230 235 240

Lys Leu Asp Leu Leu Ile Pro Arg Ala Asn Ala Asn Ile Ser Leu Glu

245 250 255

Gly Asp Ala Thr Phe Leu Gly Ala Ile Lys Leu Ala

260 265

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

ttgtnccntg gcttctnagc tttaa 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

gcaccaaana angtnncntc tcc 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcggatcca tggtgagcaa g 21

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctgccacct ccaccgctac cgccgcctcc cttgtacagc tc 42

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtggaggtg gcagcagctt gagtcatgcg ccaaac 36

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccaagcttt caggccagtt ttattgctcc ta 32

Claims

1. 斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

2.一种权利要求1所述的斑马鱼B淋巴细胞刺激因子的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）TRIzol法提取斑马鱼脾脏总RNA，

（2）根据B淋巴细胞刺激因子的保守序列设计兼并引物：

正义寡核苷酸引物zBAFF1：5’-ATGCCTGCTGAAGATGTTGGTCC-3’，

反义寡核苷酸引物zBAFF2：5’- TCAGGCCAGTTTTATTGCTCC-3’，

（3）通过RT-PCR方法，以上述引物dBAFF1及dBAFF2为引物，扩增出斑马鱼全长BAFF的cDNA序列。

3.一种权利要求1所述的斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA的重组应用，是通过现有基因工程方法，生产重组斑马鱼B淋巴细胞刺激因子，作为斑马鱼类免疫增强剂。

4.斑马鱼B淋巴细胞刺激因子，其特征在于，具有SEQ ID NO.2所示的序列。