CN101555484B - 重组人hmbox1表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组人HMBOX1表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用，属基因工程技术领域。本发明详细阐述了人HMBOX1表达载体的构建、HMBOX1表达产物的制备及、HMBOX1表达产物的抗体的制备，可以进一步了解HMBOX1的生化性质和特点，深入研究HMBOX1的蛋白三级构象。利用重组人HMBOX1表达载体的表达产物制备的抗人HMBOX1蛋白抗体不仅可以用于研究人HMBOX1蛋白在人体各组织中的表达情况，还可以对HMBOX1在疾病中的差异表达作进一步分析。另外，此抗体可应用于HMBOX1在细胞信号传导中的机制研究，阐明HMBOX1蛋白的结合位点以及和其它转录因子的相互作用。

Description

重组人HMBOX1表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用

技术领域

本发明涉及重组人HMBOX1表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用，属基因工程技术领域。

背景技术

人HMBOX1基因是一种功能性新基因，广泛表达在人体组织中，其中在脑、胰腺、胎盘、前列腺、胸腺和睾丸组织中高表达。并且人HMBOX1基因和小鼠、大鼠、鸡、蟾蜍相比具有较高同源性，所以在遗传上具有高度保守性。人HMBOX1蛋白由421个氨基酸组成，含有和HNF(Hepatocyte Nuclear Factor)相同的功能域，提示其功能可能与HNF相关。HMBOX1是一种转录抑制因子，其与胰腺疾病具有相关性，并且与免疫杀伤功能有一定关系，但其具体机制尚不清楚。人HMBOX1抗体可以与HMBOX1特异性结合，对于研究HMBOX1在人体中的作用具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种重组人HMBOX1表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用。

一种重组人HMBOX1表达载体，通过如下步骤构建制得：

(1)从人自然杀伤(NK)细胞系NK92细胞中扩增得到人HMBOX1基因，其序列为SEQ IDNO.1所示；

(2)将步骤(1)制得的人HMBOX1基因与pGEM easy T载体(购自Promega公司)连接构建成pGEM-HMBOX1；连接方法参见pGEM easy T载体使用说明书。

(3)以步骤(2)制得的pGEM-HMBOX1为模板进行PCR扩增，设计引物时分别在5’端和3’端设计BamH I和Hind III酶切位点，得扩增产物，扩增产物序列为SEQ ID NO.2所示；

(4)将步骤(3)制得的扩增产物经BamH I和HindIII双酶切后与载体pET22b(购自Novagen公司)连接，构建得到表达产物C端带有6×Histidine标签的pET22b-HMBOX1表达基因载体，并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，得到重组人HMBOX1表达载体。连接方法参见pET22b载体使用说明书。

上述步骤(3)中，引物序列如下：

5’端引物为5’-CGCGGATCCTATGCTTAGTTCCTTTCCAGTGGTT-3’，

3’端引物为5’-CCCAAGCTTCCAGTCATCATCCAGGGCC-3’。

上述步骤(3)中，PCR反应条件为：

95℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸90s，循环25次。

上述重组人HMBOX1表达载体的表达产物，具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

上述重组人HMBOX1表达载体的表达产物的制备方法，具体步骤如下：

(1)将重组HMBOX1表达载体接种到含氨苄青霉素的LB培养基中培养，培养至OD₆₀₀为0.4后，加入异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)至终浓度1mM，在30℃继续诱导培养4小时，得诱导菌液；

(2)将步骤(1)制得的诱导菌液用Ni-NTA交联的琼脂糖亲和层析进行纯化，纯化后的HMBOX1蛋白再一次进行Ni-NTA交联的琼脂糖亲和吸附，并直接在柱上呈梯度降低变性剂尿素的浓度对蛋白进行复性，最后收集复性蛋白，即为重组人HMBOX1表达载体的表达产物。

上述重组人HMBOX1表达载体的表达产物的制备方法步骤(2)中的具体步骤如下：

1)用蒸馏水浸湿空柱，弃去蒸馏水。

2)吸取2mlNTA-Resin树脂到空柱中(下端封闭)，使其自然沉积，然后拔掉下端塞子，使液体流出。

3)依次用3ml蒸馏水、5ml 1×Charge Buffer(50mMNiSO4)、3ml 1×Binding Buffer(0.5M NaCl 20mM Tris.HCl 5mM imidazol 6M尿素pH7.9)过柱子，加载Ni离子。

4)将以6M尿素溶解的包涵体蛋白通过柱子，最适流速10ml/h。

5)然后依次用5ml 1×Binding Buffer和5ml 1×Wash Buffer(0.5MNaCl 20mMTris.HCl60mM imidazol 6M尿素pH7.9)洗涤柱子。

6)依次加入以下梯度尿素1×Binding Buffer溶液：6M尿素2ml、5.5M尿素1ml、5M尿素1ml、4.5M尿素1ml、4M尿素1ml、3.5M尿素1ml、3M尿素1ml、2.5M尿素1ml、2M尿素1ml、1.5M尿素1ml、1M尿素1ml、0.5M尿素1ml、0M尿素2ml。

7)加入5ml 1×Wash Buffer(0.5M NaCl 20mM Tris.HCl 60mM imidazol pH7.9)洗涤。

8)加入4ml 1×Elute Buffer(0.5M NaCl 20mM Tris.HCl 1M imidazol pH7.9)洗脱，收集流出液，为复性蛋白，即重组人HMBOX1表达载体的表达产物。

该重组人HMBOX1表达载体的表达产物主要是以包涵体的形式存在，该表达产物具有SEQID NO.3序列特征。

上述重组人HMBOX1表达载体的表达产物的抗体，通过如下步骤制备：

(1)用重组人HMBOX1表达载体的表达产物免疫8周龄BALB/c小鼠，首次每只50μg，每间隔两周免疫一次，每次25μg，腹腔注射，用间接ELISA测定血清抗体效价，达到1∶1×10⁵时，取免疫小鼠脾细胞，备用；

(2)复苏SP2/0骨髓瘤细胞，保证融合时细胞处于对数生长期，并用8-氮鸟嘌呤筛选，保持HGPRT缺陷，得备用骨髓瘤细胞；

(3)取8周龄BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，接种到96孔的孔板上，静置24小时，备用；

(4)取步骤(1)制得的免疫小鼠脾细胞与步骤(2)制得的备用骨髓瘤细胞混合，加入50％的PEG4000进行细胞融合，然后加入到步骤(3)制备好的含有饲养细胞的96孔的孔板上，培养10-14天后，取培养上清，用间接ELISA检测抗人HMBOX1抗体效价，对抗人HMBOX1抗体效价高的阳性孔进行三次单克隆培养，直至所有克隆孔均成阳性，得单克隆抗体杂交瘤细胞溶液，该单克隆抗体杂交瘤细胞溶液每毫升含有1×10⁶个单克隆抗体杂交瘤细胞；

(5)先用石蜡油腹腔注射BALB/c小鼠，饲养一周，得备用小鼠；

(6)取步骤(4)制得的单克隆抗体杂交瘤细胞溶液0.5ml，腹腔注射步骤(5)制得的备用小鼠，2-3周后收集小鼠腹水，12000r/min离心20min后收集上清，即为含有抗HMBOX1的单克隆抗体，经过饱和硫酸铵沉淀和Protein A亲和纯化后，得到重组人HMBOX1表达载体的表达产物的抗体。

上述实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规实验方法，上述实验试剂均为市售产品。

利用重组人HMBOX1表达载体和重组人HMBOX1表达载体的表达产物可以进一步了解HMBOX1的生化性质和特点，深入研究HMBOX1的蛋白三级构象。利用重组人HMBOX1表达载体的表达产物制备的抗人HMBOX1蛋白抗体不仅可以用于研究人HMBOX1蛋白在人体各组织中的表达情况，还可以对HMBOX1在疾病中的差异表达作进一步分析。另外，此抗体可应用于HMBOX1在细胞信号传导中的机制研究，阐明HMBOX1蛋白的结合位点以及和其它转录因子的相互作用。

附图说明

图1为人HMBOX1 cDNA PCR产物琼脂糖凝胶电泳。M为Marker，1为目的基因。

图2为pET22b-HMBOX1载体构建的PCR和双酶切验证。M1和M2为DNA marker，1-4为载体的四个克隆菌株质粒。左边四道为PCR验证结构，右边四道为BamHI和Hind III双酶切验证结果。

图3为pET22b-HMBOX1载体在大肠杆菌Rosseta(DE3)中的表达。M为蛋白质分子量marker，C为pET22b空质粒诱导组，1-7为pET22b-HMBOX1质粒载体诱导组，箭头所指处为表达的目的蛋白。

图4为重组HMBO1蛋白复性的非还原SDS-PAGE和western blot验证。左图为非还原SDS-PAGE验证结果，右图为western blot验证结果，M为蛋白质分子量marker，1为包涵体未复性蛋白，2为复性蛋白。结构显示，复性蛋白的迁移速度稍快，并有二聚体形成。

图5为竞争ELISA检测抗体的特异性。

图6为western blot检测单克隆抗体的特异性。分别展示了HMBOX1蛋白在大肠杆菌Rosseta(DE3)、HEK293T细胞中的表达。1为HEK 293T细胞，2为HEK 293T(SiRNA)细胞，3为Rosetta(pET22b)，4为Rosetta(pET22b/HMBOX1)，5为纯化的融合蛋白HMBOX1-6His。结果显示单克隆抗体能检测到HMBOX1在HEK 293T细胞中表达，并且经HMBOX1特异性SiRNA干扰，HMBOX1表达水平下降；而且单克隆抗体能检测原核系统中HMBOX1的表达。

图7为免疫组织化学检测单克隆抗体的特异性。展示了HMBOX1蛋白在HEK293T细胞中的表达，并且经HMBOX1特异性SiRNA干扰，HMBOX1表达水平下降。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售产品。

实施例

1、目的基因的获得和含有目的基因克隆载体的构建

以人自然杀伤(NK)细胞系NK92细胞的cDNA为模板，用5’端引物5’-GGTACCGGATATTGATCCGCCTCATG-3’和3’端引物5’-CTCGAGGGTGCTACGTCTAAACTAAGTT-3’进行PCR扩增人HMBOX1基因，其中5’端引物含有Kpn I酶切位点，3’端引物含有XhoI酶切位点。PCR反应条件为：95℃变性60s，57℃退火60s，72℃延伸120s，先循环6次；然后94℃变性60s，50.5℃退火60s，72℃延伸90s，再循环30次。扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，显示为一条1300bp左右的特异性扩增条带，与预期1336相符(如图1所示)。将扩增得到的HMBOX1片段切胶回收纯化并定量后与pGEM easy T载体(Promega公司产品)连接构建成pGEM-HMBOX1，然后转化大肠杆菌DH5α。转化子经PCR和双酶切验证，筛选获得有目的基因片段的菌株。经测序证明与GeneBank序列一致，该基因序列为SEQ ID NO.1所示。

2、含有目的片段的重组表达载体的构建

以pGEM-HMBOX1为模板进行PCR扩增，5’端引物为5’-CGCGGATCCTATGCTTAGTTCCTTTCCAGTGGTT-3’，3’端引物为5’-CCCAAGCTTCCAGTCATCATCCAGGGCC-3’。其中5’端引物含有BamHI酶切位点和起始密码，3’端引物含有HindIII酶切位点并使终止密码突变。PCR反应条件为：95℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸90s，循环25次。扩增产物经双酶切连接到表达载体pET22b，构建表达产物C端带有6×Histidine标签的pET22b-HMBOX1表达质粒载体。将重组质粒载体转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，转化子经PCR和双酶切验证(如图2所示)，筛选获得有目的基因片段的菌株，并且经测序证明与GeneBank序列一致，该基因序列为SEQ ID NO.2所示。

3、目的蛋白的诱导表达与亲和纯化

含有重组HMBOX1基因的大肠杆菌Rosetta(DE3)接种到放入含氨苄青霉素的LB培养基中培养，培养至OD₆₀₀为0.4后，加入异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside.IPTG)至终浓度1mM诱导，在30℃继续培养4小时，取1ml诱导菌液进行SDS-PAGE分析。与空载体诱导株和pET22b-HMBOX1未诱导株相比，发现pET22b-HMBOX1诱导菌株在60kD左右有特异性条带的表达(如图3所示)，说明pET22b-HMBOX1在宿主菌Rosetta(DE3)中表达了重组HMBOX1融合蛋白，其序列为SEQID NO.3所示。由于表达的HMBOX1重组蛋白含有6×Histidine标签，可以利用Ni-NTA交联的琼脂糖亲和层析进行纯化，可依次用3ml蒸馏水、5ml 1×Charge Buffer(50mMNiSO4)、3ml 1×Binding Buffer(0.5MNaCl 20mMTris.HCl5mM imidazol 6M尿素pH7.9)过柱子，加载Ni离子，然后以6M尿素溶解的包涵体蛋白通过柱子，流速10ml/h，然后再用5ml 1×Binding Buffer和5ml 1×Wash Buffer(0.5M NaCl20mM Tris.HCl 60mM imidazol 6M尿素pH7.9)洗涤柱子，最后用4ml 1×Elute Buffer(0.5MNaCl 20mM Tris.HCl 1M imidazol 6M尿素pH7.9)洗脱，收集流出液，即为纯化蛋白，为了验证纯化蛋白是否是人HMBOX1蛋白，在纯化蛋白透析除盐后，进行6×Histidine亲和标记的western blot鉴定，并且经Q-TOF2质谱测序，有5个肽段与人HMBOX1蛋白完全一致，证明所获得的蛋白序列正确。

4、重组HMBOX1蛋白的复性

将步骤3制得的纯化蛋白再一次进行Ni-NTA琼脂糖亲和吸附，并直接在柱上呈梯度降低变性剂尿素的浓度，梯度浓度为(1×Binding Buffer溶液)：6M尿素2ml、5.5M尿素1ml、5M尿素1ml、4.5M尿素1ml、4M尿素1ml、3.5M尿素1ml、3M尿素1ml、2.5M尿素1ml、2M尿素1ml、1.5M尿素1ml、1M尿素1ml、0.5M尿素1ml、0M尿素2ml，然后加入5ml 1×WashBuffer(0.5M NaCl 20mM Tris.HCl 60mM imidazol)洗涤，最后加入4ml 1×Elute Buffer(0.5MNaCl 20mM Tris.HCl 1M imidazol pH7.9)洗脱，收集流出液，为复性蛋白，即重组人HMBOX1表达载体的表达产物。复性蛋白经透析除盐，超滤浓缩，得到浓度为1mg/ml的复性HMBOX1蛋白。复性HMBOX1蛋白经非还原SDS-PAGE验证，证明其构象恢复，并且有二聚体形成(如图4所示)。

5、抗人HMBOX1多克隆抗体的制备

(1)新西兰兔免疫：选择体重2kg以上的健康兔，采用背部皮下多点注射，初次免疫每只200μg，以后每两周注射一次，每只100μg，用间接ELISA测定血清抗体效价，达到1∶1×10⁴时，可采血分离血清。

(2)采血分离血清：最后一次加强免疫后的第七天采血。采血前禁食12小时，但不禁水。动物麻醉固定，从颈动脉一次性放血，血液37℃放置1小时，再放4℃过夜，使血清充分析出。离心取上清，分装-80℃保存。

6、抗人HMBOX1单克隆抗体的制备

(1)小鼠免疫：用复性的重组人HMBOX1蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠(购自中国上海斯莱克实验动物有限公司)，首次每只50μg，每间隔两周免疫一次，每次25μg，腹腔注射，用间接ELISA测定血清抗体效价，达到1∶1×10⁵时，取免疫小鼠脾细胞以备融合。

(2)细胞融合筛选：细胞融合前复苏SP2/0鼠骨髓瘤细胞(购自上海麦莎生物科技有限公司)，保证融合时细胞处于对数生长期，并用8-氮鸟嘌呤筛选，保持HGPRT缺陷。融合前一天取8周龄BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，接种到96孔的孔板上。一天后取免疫小鼠脾细胞与上述培养的SP2/0细胞混合，加入50％的PEG4000进行细胞融合，加入到预先制备好的含有饲养细胞的96孔的孔板上。培养14天后，观察融合细胞克隆生长，取培养上清，用间接ELISA检测抗人HMBOX1抗体效价。对抗人HMBOX1抗体效价高的阳性孔进行三次单克隆培养，每次用ELISA检测抗体效价，直至所有克隆孔均成阳性，一共得到2株针对融合HMBOX1蛋白不同抗原表位的单克隆抗体杂交瘤细胞系，即2A5F4和4A4F2，抗体亚型为IgG亚类。

(3)单克隆抗体的大量制备

将一定量的杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠，注射前一周预先用石蜡油腹腔注射此小鼠。2-3周后收集小鼠腹水，离心后收集上清，即为含有抗HMBOX1的单克隆抗体。然后进行饱和硫酸铵沉淀和Protein A亲和纯化。

(4)单克隆抗体的特异性检测

①ELISA：免疫阳性血清或杂交瘤细胞株的培养上清能与重组HMBOX1蛋白反应，而未免疫阴性血清不能与重组蛋白反应。说明多克隆抗体和单克隆抗体特异性针对重组HMBOX1蛋白(如图5所示)。

②Western blot：分别用重组HMBOX1蛋白和细胞系蛋白作为检测样品，经western blot鉴定，结果在47kD左右有一条特异性条带，进一步验证了多克隆抗体和单克隆抗体能够特异性结合重组HMBOX1蛋白，并且可以和天然蛋白特异性结合，用于western blot鉴定(如图6所示)。

③免疫组织化学：利用制备的抗体检测HEK 293T细胞(包括经SiRNA干扰的HEK 293T细胞)，免疫组织化学结果显示HMBOX1蛋白在此细胞中有表达，而且表达水平有差异，证明制备的抗体可与天然构象的HMBOX1蛋白结合，用于免疫组织化学的检测(如图7所示)。

SEQUENCE LISTING

<110>山东大学

<120>重组人HMBOX1表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用

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<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1348

<212>DNA

<213>人

<400>1

ggtaccggat attgatccgc ctcatgtaaa gtatgcttag ttcctttcca gtggttttgc     60

tggaaaccat gtctcattat acagatgaac ccagatttac catagagcag atagatctgc    120

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<210>2

<211>1282

<212>DNA

<213>人

<400>2

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agatgaaccc agatttacca tagagcagat agatctgctt cagcgacttc ggcgtactgg     120

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<210>3

<211>443

<212>PRT

<213>人

<400>3

Met Asp Ile Gly Ile Asn Ser Asp Pro Met Leu Ser Ser Phe Pro Val

1               5                   10                  15

Val Leu Leu Glu Thr Met Ser His Tyr Thr Asp Glu Pro Arg Phe Thr

             20                  25                  30

Ile Glu Gln Ile Asp Leu Leu Gln Arg Leu Arg Arg Thr Gly Met Thr

        35                  40                  45

Lys His Glu Ile Leu His Ala Leu Glu Thr Leu Asp Arg Leu Asp Gln

    50                  55                  60

Glu His Ser Asp Lys Phe Gly Arg Arg Ser Ser Tyr Gly Gly Ser Ser

65                  70                  75                  80

Tyr Gly Asn Ser Thr Asn Asn Val Pro Ala Ser Ser Ser Thr Ala Thr

                85                  90                  95

Ala Ser Thr Gln Thr Gln His Ser Gly Met Ser Pro Ser Pro Ser Asn

            100                 105                 110

Ser Tyr Asp Thr Ser Pro Gln Pro Cys Thr Thr Asn Gln Asn Gly Arg

        115                 120                 125

Glu Asn Asn Glu Arg Leu Ser Thr Ser Asn Gly Lys Met Ser Pro Thr

    130                 135                 140

Arg Tyr His Ala Asn Ser Met Gly Gln Arg Ser Tyr Ser Phe Glu Ala

145                 150                 155                 160

Ser Glu Glu Asp Leu Asp Val Asp Asp Lys Val Glu Glu Leu Met Arg

                165                 170                 175

Arg Asp Ser Ser Val Ile Lys Glu Glu Ile Lys Ala Phe Leu Ala Asn

            180                 185                 190

Arg Arg Ile Ser Gln Ala Val Val Ala Gln Val Thr Gly Ile Ser Gln

        195                 200                 205

Ser Arg Ile Ser His Trp Leu Leu Gln Gln Gly Ser Asp Leu Ser Glu

    210                 215                 220

Gln Lys Lys Arg Ala Phe Tyr Arg Trp Tyr Gln Leu Glu Lys Thr Asn

225                 230                 235                 240

Pro Gly Ala Thr Leu Ser Met Arg Pro Ala Pro Ile Pro Ile Glu Asp

                245                 250                 255

Pro Glu Trp Arg Gln Thr Pro Pro Pro Val Ser Ala Thr Ser Gly Thr

            260                 265                 270

Phe Arg Leu Arg Arg Gly Ser Arg Phe Thr Trp Arg Lys Glu Cys Leu

        275                 280                 285

Ala Val Met Glu Ser Tyr Phe Asn Glu Asn Gln Tyr Pro Asp Glu Ala

    290                 295                 300

Lys Arg Glu Glu Ile Ala Asn Ala Cys Asn Ala Val Ile Gln Lys Pro

305                 310                 315                 320

Gly Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Arg Val Thr Ser Leu Lys Val Tyr

                325                 330                 335

Asn Trp Phe Ala Asn Arg Arg Lys Glu Ile Lys Arg Arg Ala Asn Ile

            340                 345                 350

Glu Ala Ala Ile Leu Glu Ser His Gly Ile Asp Val Gln Ser Pro Gly

        355                 360                 365

Gly His Ser Asn Ser Asp Asp Val Asp Gly Asn Asp Tyr Ser Glu Gln

    370                 375                 380

Asp Asp Ser Thr Ser His Ser Asp His Gln Asp Pro Ile Ser Leu Ala

385                 390                 395                 400

Val Glu Met Ala Ala Val Asn His Thr Ile Leu Ala Leu Ala Arg Gln

                405                 410                 415

Gly Ala Asn Glu Ile Lys Thr Glu Ala Leu Asp Asp Asp Trp Lys Leu

            420                 425                 430

Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His

        435                 440

Claims (5)

1.一种重组人HMBOX1表达载体，通过如下步骤构建制得：

(1)从人自然杀伤细胞系NK92细胞中扩增得到人HMBOX1基因，其序列为SEQ ID NO.1所示；

(2)将步骤(1)制得的人HMBOX1基因与pGEM easy T载体连接构建成pGEM-HMBOX1；

(3)以步骤(2)制得的pGEM-HMBOX1为模板进行PCR扩增，设计引物时分别在5’端和3’端设计BamH I和Hind III酶切位点，得扩增产物，扩增产物序列为SEQ ID NO.2所示；

(4)将步骤(3)制得的扩增产物经BamHI和Hind III双酶切后与载体pET22b连接，构建得到表达产物C端带有6×Histidine标签的pET22b-HMBOX1表达基因载体，并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，得到重组人HMBOX1表达载体；

上述步骤(3)中，引物序列如下：

5’端引物为5’-CGCGGATCCTATGCTTAGTTCCTTTCCAGTGGTT-3’，

3’端引物为5’-CCCAAGCTTCCAGTCATCATCCAGGGCC-3’。

2.如权利要求1所述的重组人HMBOX1表达载体，其特征在于，上述步骤(3)中，PCR反应条件为：

95℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸90s，循环25次。

3.一种如权利要求1所述重组人HMBOX1表达载体的表达产物，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种如权利要求3所述重组人HMBOX1表达载体的表达产物的制备方法，具体步骤如下：

(1)将权利要求1所述的重组人HMBOX1表达载体接种到含氨苄青霉素的LB培养基中培养，培养至OD₆₀₀为0.4后，加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度1mM，在30℃继续诱导培养4小时，得诱导菌液；

(2)将步骤(1)制得的诱导菌液用Ni-NTA交联的琼脂糖亲和层析进行纯化，纯化后的HMBOX1蛋白再一次进行Ni-NTA交联的琼脂糖亲和吸附，并直接在柱上呈梯度降低变性剂尿素的浓度对蛋白进行复性，最后收集复性蛋白，即为重组人HMBOX1表达载体的表达产物。

5.如权利要求4所述的重组人HMBOX1表达载体的表达产物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的具体步骤如下：

1)用蒸馏水浸湿空柱，弃去蒸馏水；

2)吸取2ml NTA-Resin树脂到空柱中，使其自然沉积，然后拔掉下端塞子，使液体流出；

3)依次用3ml蒸馏水；5ml 1×Charge Buffer，含有50mM NiSO₄；3ml 1×Binding Buffer含有0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM imidazol，6M尿素，pH7.9；过柱子，加载Ni离子；

4)将以6M尿素溶解的包涵体蛋白通过柱子，流速10ml/h；

5)然后依次用5ml 1×Binding Buffer和5ml 1×Wash Buffer洗涤柱子，其中5ml 1×Wash Buffer含有0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，60mM imidazol，6M尿素，pH7.9；

6)依次加入梯度尿素1×Binding Buffer溶液；

7)加入5ml 1×Wash Buffer含有0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，60mM imidazol，洗涤；

8)加入4ml 1×Elute Buffer含有0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1M imidazol pH7.9，洗脱，收集流出液，为复性蛋白，即重组人HMBOX1表达载体的表达产物；

所述步骤6)中的尿素的浓度梯度分别为：

6M尿素2ml、5.5M尿素1ml、5M尿素1ml、4.5M尿素1ml、4M尿素1ml、3.5M尿素1ml、3M尿素1ml、2.5M尿素1ml、2M尿素1ml、1.5M尿素1ml、1M尿素1ml、0.5M尿素1ml、0M尿素2ml。

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