CN103073643B - 利用GST表达体系制备的Fertilin Beta胞外段高效价抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，涉及利用GST表达体系制备的Fertilin Beta胞外段高效价抗体及应用。利用基因工程技术，将Fertilin Beta基因胞外段克隆到原核表达载体中，经酶切鉴定后，用重组质粒转化大肠杆菌，并IPTG诱导产生GST-Fertilin Beta融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清并用ProteinA/G纯化。抗体的效价及特异性采用ELISA和Western blot检测，并应用免疫荧光检测了Fertilin Beta蛋白特异性定位于精子头后部。该抗Fertilin Beta多克隆抗体效价与特异性良好，可以应用于细胞中Fertilin Beta蛋白的检测并能有效检出Fertilin Beta蛋白特异性定位于精子头后部，对于系统研究Fertilin Beta蛋白功能意义重大。
Description
技术领域
本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及利用GST原核表达体系制备GST-Fertilin Beta融合蛋白的多克隆抗体及应用。
背景技术
受精素β(Fertilin Beta)是一种精子表面特异性跨膜糖蛋白，定位在人类8号染色体上，其特异性的表达在人类睾丸组织和精子中，在精子发生、精子成熟、精子获能及精卵结合和融合中发挥重要作用。
Fertilin Beta蛋白功能及作用机制应深入的研究和探索：受精素在精卵结合和融合中怎样发挥作用；受精素在精子成熟过程中的促进作用等等。而研究一种新的蛋白质的功能，抗体是最有力的工具之一，在蛋白质的检测和功能研究中广泛应用的免疫组织化学、免疫印迹和免疫沉淀等一系列技术，都是基于抗原-抗体相互作用发展起来的。因此我们制备的FertilinBeta蛋白高效价抗体对于系统研究Fertilin Beta在精子发生、精子成熟、精子获能及精卵结合和融合中的作用机制意义重大。
发明内容
本发明的目的是建立一种能够用于Fertilin Beta蛋白的检测的模型，为从蛋白水平深入研究Fertilin Beta蛋白功能及相关疾病提供必要的实验工具。
利用基因工程技术，将Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸对应DNA片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后，用重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-Fertilin Beta融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清，并应用ProteinA/G将其纯化，获得多克隆抗体。抗体的效价及特异性采用ELISA和Western blot检测，并应用免疫荧光检测了Fertilin Beta蛋白特异性定位于精子头后部。
本发明的GST-Fertilin Beta融合蛋白是将利用特殊序列(Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸对应DNA片段)构建GST-Fertilin Beta融合蛋白原核表达载体，转化BL21得到的高效表达特异性的GST-Fertilin Beta融合蛋白，这段341-373位氨基酸序列为：
Glu Ala Ile His Phe Ser Gly Val Lys Ile Phe Ser Asn Cys Ser
1 6 11
Phe Glu Asp Phe Ala His Phe Ile Ser Lys Gln Lys Ser Gin Cys
16 21 26
Leu His Asn
31
其对应核苷酸序列为：
gaagcaattc atttcagtgg tgtgaagatc tttagtaact gcagcttcga agactttgca60
cattttattt caaagcagaa gtcccagtgt cttcacaat99
这种GST-Fertilin Beta融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下步骤：
第一步，克隆载体的构建
从人Fertilin Beta基因全长上应用PCR技术以基因组为模板，扩增得到的目的片段与pMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。
第二步，原核表达载体pGEX-4T-1的构建
将克隆质粒和质粒pGEX-4T-1双酶切后，利用回收试剂盒获得Fertilin Beta基因该区片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定。
第三步，GST-Fertilin Beta融合蛋白的诱导表达和纯化
重组质粒PGEX-4T-1/Fertilin Beta转化大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，GST-Fertilin Beta融合蛋白的表达。以SDS-PAGE进行鉴定，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细菌，所获蛋白用Glutathione-Sepharose4B柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化产物。
第四步，兔抗Fertilin Beta抗血清的制备及纯化
以纯化的Fertilin Beta融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500μg融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500μg纯化的GST-Fertilin Beta融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1∶100000时，颈动脉放血，收集血清。用ProteinA/G纯化抗Fertilin Beta血清，准备蛋白A sepharose CL-4B亲和柱，亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，将抗体洗脱，达到纯化目的，SDS-PAGE鉴定纯化产物，获得该发明的多克隆抗体。应用多种免疫学方法检测其效价及特异性，结果显示该抗体可特异性的与Fertilin Beta蛋白结合。
利用Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸基因序列成功构建GST-Fertilin Beta融合蛋白原核表达载体，转化BL21后可高效表达特异性的GST-Fertilin Beta融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获得抗GST-Fertilin Beta融合蛋白的高效价抗体经多种免疫学方法检测抗体效价及特异性，结果表明抗体效价高达1∶1000000且特异性良好。抗体可应用于精子中Fertilin Beta蛋白的检测，对于系统研究Fertilin Beta蛋白在精子发生、精子成熟、精子获能及精卵结合和融合过程中的作用机制意义重大。另外，Fertilin Beta蛋白为精子表面特异性蛋白，我们制备的Fertilin Beta抗体为精子分离研究奠定了基础。
附图说明：
图1：PCR扩增出的Fertilin Beta基因341-373氨基酸片段DNA琼脂糖凝胶电泳图；
图2：双酶切质粒pGEX-4T-1；
图3：pGEX-4T-1/Fertilin Beta重组体酶切鉴定结果；
图4：纯化后的GST及GST-Fertilin Beta融合蛋白SDS-PAGE图；
图5：ProteinA/G纯化后的Fertilin Beta抗体和纯化前的抗Fertilin Beta血清SDS-PAGE图；
图6：间接ELISA法测定抗体的效价；
图7：Fertilin Beta抗体特异性的Western blot分析；
图8：免疫荧光分析Fertilin Beta蛋白在精子细胞上的定位；
具体实施方式：
实施例1：抗GST-Fertilin Beta血清的在制备
1.PCR-PMD18-T/Fertilin Beta重组质粒的构建
Fertilin Beta基因全长从Genebank得到，基因序列号为GenBank:AAC51110.1。以基因组为模板，上游引物为5’-GAA TTC GAA GCA ATT CAT TTC AGT(含EcoRI酶切位点)；下游：5，-CTC GAG ATT GTG AAG ACA CTG GGA(含XhoI酶切位点)。应用PCR成功扩增出了Fertilin Beta基因胞外段314-373位氨基酸对应DNA序列长度99bp【图1】。扩增得到的片段与PMD18-T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以EcoRI和SalI单酶切鉴定。
2.原核表达载体pGEX-4T-1的构建
将含有Fertilin Beta基因胞外段341-373位氨基酸片段的pMD18-T质粒经EcoRI和XhoI双酶切后(片段约0.1kbp)，利用回收试剂盒获得Fertilin Beta基因该区片段，同时用相同的 酶处理质粒pGEX-4T-1(约5kbp)【图2】。然后将回收的Fertilin Beta基因胞外段341-373位氨基酸片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜。酶切鉴定重组体，结果显示该Fertilin Beta基因胞外段341-373位氨基酸片段正确【图3】。
3.GST-Fertilin Beta融合蛋白的诱导表达和纯化
重组质粒PGEX-4T-1/Fertilin Beta转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落接入LB/Amp+培养基中，37℃振摇培养过夜。次日，将培养物按1∶50的比例转接于含Amp+的LB培养基中，继续在37℃摇床培养至对数生长中期。在培养液的A600为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.08mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25℃继续培养4～5h。离心收集菌体，以SDS-PAGE进行鉴定GST-Fertilin Beta融合蛋白的表达，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。以5000r/min于4℃离心5min，收集菌体，用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液的沉淀。用超声裂解细菌，再以9600rpm，于4℃离心15min，取上清，过Glutathione-Sepharose4B柱，先以等体积洗脱缓冲液1(含20mM谷胱甘肽、50mM Tris-Cl，pH＝8.0)洗脱，收集洗脱液，再以等体积洗脱缓冲液2(含100mM谷胱甘肽)洗两遍，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定纯化产物【图4】。
4.兔抗Fertilin Beta抗血清的制备
以纯化的GST-Fertilin Beta融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500μg融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500μg纯化的GST-Fertilin Beta融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1∶1000000时，颈动脉放血，收集血清。
5.ProteinA/G纯化抗Fertilin Beta血清
将ProteinA/G sepharose CL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，加pH2.7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定。染色结果显示纯化效果明显，纯化后的样品有清晰的轻、重链带【图5】。
实施例2：GST-Fertilin Beta抗体的分析及应用
1.GST-Fertilin Beta抗体效价的测定
用GST-Fertilin Beta融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照，将纯化后的GST-Fertilin Beta抗体先稀释10倍再倍比稀释后，用间接ELISA测定抗体的效价。结果显示， 免疫前的兔血清未测出抗融合蛋白GST-Fertilin Beta的抗体，GST-Fertilin Beta抗体的滴度高达1∶1000000以上【图6】。
2.GST-Fertilin Beta抗体应用于组织中Fertilin Beta蛋白的检测
收集小鼠睾丸组织和培养的特异性不表达Fertilin Beta蛋白的细胞，裂解超声后用BCA蛋白定量试剂盒对其进行蛋白定量，之后将样品等蛋白量进行SDS-PAGE，再电转移至硝酸纤维素膜上。以5％脱脂奶粉封闭1h，依次滴加兔抗Fertilin Beta抗体(室温2h、PBS洗3次)及山羊抗兔IgG2HRP(室温反应1h、PBS洗涤3次)，最后加底物DAB显色，并拍照。结果显示【图7】，我们制备的Fertilin Beta抗体与小鼠睾丸组织所表达的Fertilin Beta蛋白发生了抗原-抗体反应而，在Marker指示的82KD处出现了一条特异的蛋白带，而特异性不表达FertilinBeta蛋白的细胞没有出现，证明Fertilin Beta抗体特异性好。
3.精子表面膜蛋白定位分析
将人精子(约105个精子/孔)均匀涂于十二孔板中后置于孵箱干燥，4％多聚甲醛固定(室温2h、PBS洗3次)，此次滴加PBS(对照组)或兔抗抗Fertilin Beta抗体(室温2h、PBS洗3次)，及避光处理异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔IgG(室温反应1h、PBS洗涤3次)和DAPI(室温1min、PBS洗3次)，荧光显微镜观察，并拍照。结果显示【图8】，Fertilin Beta蛋白特异性表达于精子头后部，与报道相符，证明Fertilin Beta抗体具有良好的特异性。
<110>东北师范大学
<120>利用GST表达体系制备的Fertilin Beta胞外段高效价抗体及应用
<160>2
<210>1
<211>99
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
gaagcaattc atttcagtgg tgtgaagatc tttagtaact gcagcttcga agactttgca 60
cattttattt caaagcagaa gtcccagtgt cttcacaat 99
<210>2
<211>33
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Glu Ala Ile His Phe Ser Gly Val Lys Ile Phe Ser Asn Cys Ser
1 6 11
Phe Glu Asp Phe Ala His Phe Ile Ser Lys Gln Lys Ser Gln Cys
16 21 26
Leu His Asn
31
Claims (2)
1.原核表达GST-Fertilin Beta融合蛋白的多克隆抗体，其特征在于利用GST表达体系以Fertilin Beta蛋白341-373位氨基酸对应DNA片段作为特异序列制备的GST-Fertilin Beta融合蛋白作为抗原免疫动物产生抗血清而获得，该抗血清中抗GST-Fertilin Beta抗体的滴度高达1∶1000000，并经过Western blot鉴定该Fertilin Beta抗体具有较好的特异性，其中，341-373位氨基酸序列为：
Glu Ala Ile His Phe Ser Gly Val Lys Ile Phe Ser Asn Cys Ser
1 6 11
Phe Glu Asp Phe Ala His Phe Ile Ser Lys Gln Lys Ser Gln Cys
16 21 26
Leu His Asn
31
其对应核苷酸序列为：
gaagcaattc atttcagtgg tgtgaagatc tttagtaact gcagcttcga agactttgca 60
cattttattt caaagcagaa gtcccagtgt cttcacaat 99。
2.权利要求1所述的原核表达GST-Fertilin Beta融合蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于利用GST表达系统获得GST-Fertilin Beta融合蛋白，再经免疫兔获得抗GST-Fertilin Beta抗血清，具体包括五步：
第一步，PCR-PMD18-T/Fertilin Beta重组质粒的构建
Fertilin Beta基因全长从Genebank得到，基因序列号为AAC51110.1，以基因组为模板，上游引物为5’-GAA TTC GAA GCA ATT CAT TTC AGT(含EcoRI酶切位点)；下游：5’-CTC GAG ATT GTG AAG ACA CTG GGA(含XhoI酶切位点)，扩增得到的片段与pMD18-T载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以EcoRI和SalI分别单酶切鉴定；
第二步，原核表达载体pGEX-4T-1的构建
将含有Fertilin Beta蛋白341-373位氨基酸对应DNA片段的pMD18-T质粒经EcoRI和XhoI双酶切后，利用回收试剂盒获得Fertilin Beta基因该区片段，同时用相同的酶处理质粒pGEX-4T-1，然后将回收的Fertilin Beta蛋白341-373位氨基酸对应DNA片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜，酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定；
第三步，GST-Fertilin Beta融合蛋白的诱导表达和纯化
重组质粒PGEX-4T-1/Fertilin Beta转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落接入LB/Amp+培养基中，37℃振摇培养过夜，次日，将培养物按1∶50的比例转接于含Amp+的LB培养基中，继续在37℃摇床培养至对数生长中期，在培养液的A600为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.08mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25℃继续培养4～5h，离心收集菌体，以SDS-PAGE进行鉴定GST-Fertilin Beta融合蛋白的表达，并优化表达条件，进行大量扩增诱导，以5000r/min于4℃离心5min，收集菌体，用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液的沉淀，用超声裂解细菌，再以9600rpm，于4℃离心15min，取上清，过Glutathione-Sepharose4B柱，先以等体积含20mM谷胱甘肽、50mM Tris-Cl，pH＝8.0的洗脱缓冲液1洗脱，收集洗脱液，再以等体积含100mM谷胱甘肽的洗脱缓冲液2洗两遍，收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定纯化产物；
第四步，兔抗Fertilin Beta抗血清的制备及纯化
以纯化的Fertilin Beta融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500μg融合蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射，免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照，2wk后进行第1次加强免疫，500μg纯化的Fertilin Beta融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射，之后每隔2wk加强免疫1次，于末次免疫后1wk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1∶1000000时，颈动脉放血，收集血清，将ProteinA/G sepharose CL-4B填料缓慢装柱，平衡柱子后加入经过稀释的抗血清，控制流速保证抗血清与填料的结合，即亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，加pH2.7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱，收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度，将含抗体的收集管混合，纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定；
第五步，Fertilin Beta抗体的免疫学检测
用GST-Fertilin Beta融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照，将纯化后的GST-Fertilin Beta抗体先稀释10倍再倍比稀释后采用间接ELISA方法测定抗体的效价，并采用Western blot方法分析Fertilin Beta抗体特异性，将纯化的融合蛋白GST-FertilinBeta样品，经SDS-PAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上，以5％脱脂奶粉封闭1h，依次滴加兔抗Fertilin Beta抗体，室温2h、PBS洗3次，山羊抗兔IgG2HRP，室温反应1h、PBS洗涤3次，最后加底物DAB显色，并拍照。
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