CN103342742A

CN103342742A - 鲟鱼卵母细胞成熟相关蛋白及其相关生物材料

Info

Publication number: CN103342742A
Application number: CN2013102312728A
Authority: CN
Inventors: 胡红霞; 宋超; 朱华; 王巍; 董颖
Original assignee: Beijing Fisheries Research Institute
Current assignee: Beijing Fisheries Research Institute
Priority date: 2013-06-09
Filing date: 2013-06-09
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2033-06-09
Also published as: CN103342742B

Abstract

本发明公开了鲟鱼卵母细胞成熟相关蛋白及其相关生物材料。该鲟鱼卵母细胞成熟相关蛋白为如下a）或b）或c）的蛋白质：a）氨基酸序列如SEQ ID No.2第1-221位所示的蛋白质；b）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；c）将a）或b）经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与鲟鱼卵母细胞成熟相关的由a）衍生的蛋白质。本发明的鲟鱼卵母细胞成熟相关蛋白具有诱导鲟鱼卵母细胞最后成熟的生物活性。

Description

鲟鱼卵母细胞成熟相关蛋白及其相关生物材料

技术领域

本发明涉及鲟鱼卵母细胞成熟相关蛋白及其相关生物材料。

背景技术

鲟形目鱼类是一类古老的软骨硬鳞鱼类，有活化石之称，在鱼类进化史上具有重要地位。同时还具有重要的经济价值，在全球范围内均处于不同程度的濒危状态，全部被列为《濒危动植物种国际贸易公约》附录II物种。

为了挽救鲟鱼资源以及商业目的，世界各地人工养殖鲟鱼不断兴起。但鲟鱼的人工繁殖存在诸多困难：主要因为鲟鱼性成熟时间晚，繁殖周期长，繁殖间隔时间一般为2-3年；此外天然和养殖环境下都发现有雌鱼性腺发育的不同步现象，由于养殖条件与天然环境相差较大，许多养殖鲟鱼的性腺不能正常发育。

在养殖鲟鱼的人工繁殖实践中，往往需要注射一些催产剂来促使亲鱼产卵。目前，在鱼类养殖中广泛使用的催产剂有三种：脑垂体、绒毛膜促性腺激素和促黄体生成素释放激素类似物（LRH-α）。但这些催产剂都存在各自的不足之处，例如脑垂体虽然有显著的催熟作用，但获取困难，代价高昂；而另外两种催产剂的效果有时并不理想。开发容易制备、成本低的新型催产剂将促进鲟鱼的人工养殖。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鲟鱼卵母细胞成熟相关蛋白及其相关生物材料及其应用。

本发明所提供的鲟鱼卵母细胞成熟相关蛋白，名称为GtHIIβα，是如下a）或b）或c）所示的人工合成蛋白质：

a）氨基酸序列如SEQ ID No.2第1-221位所示的蛋白质；

b）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

c）将a）或b）经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与鲟鱼卵母细胞成熟相关的由a）衍生的蛋白质。

其中，SEQ ID No.2由227个氨基酸残基组成，第222-227位为6个组氨酸标签。

为了使上述a）中的蛋白便于纯化，可在上述a）的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c）中的蛋白质可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

编码GtHIIβα的核酸分子也属于本发明的保护范围。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述核酸分子具体可为如下1）-6）中任一所述的基因：

1）编码GtHIIβα的DNA分子；

2）其编码序列是SEQ ID No.1的第11-694位核苷酸的DNA分子；

3）其编码序列是SEQ ID No.1的第11-673位核苷酸的DNA分子；

4）核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

5）在严格条件下与与2）、3）或4）限定的DNA分子杂交且编码GtHIIβα的DNA分子；

6）与2）、3）或4）限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码GtHIIβα的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，SEQ ID No.1由709个核苷酸组成，第674-691位为6个组氨酸标签的编码基因。

下述1）-4）中的任一种与GtHIIβα相关的生物材料也属于本发明的保护范围：

1）含有编码GtHIIβα的核酸分子的表达盒。

2）含有编码GtHIIβα的核酸分子、或1）所述表达盒的重组载体。

3）含有编码GtHIIβα的核酸分子、或1）所述表达盒、或2）所述重组载体的重组微生物。

4）含有编码GtHIIβα的核酸分子、或1）所述表达盒、或2）所述重组载体的转基因细胞系。

上述生物材料中，1）所述的含有编码GtHIIβα的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达GtHIIβα的DNA，该DNA不但可包括启动GtHIIβα基因转录的启动子，还可包括终止GtHIIβα转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。在本发明的一个实施例中，含有编码GtHIIβα的核酸分子的表达盒由来自酿酒酵母α-交配因子（α-factor）的信号肽、A0X15’端启动子、编码GtHIIβα的核酸分子和A0X13’端终止序列组成。2）所述的含有编码GtHIIβα的核酸分子的重组载体具体可为用编码GtHIIβα的核酸分子替换pPICZαA的Xho I和Not I之间片段得到的表达GtHIIβα的重组表达载体pPICZαA-GtHIIβα-A。3）所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia）；所述酵母可为巴斯德毕赤酵母。4）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。

本发明还保护以GtHIIβα为活性成分的诱导鲟鱼卵母细胞的生发泡破裂产品（如药物或催产剂）或诱导鲟鱼卵母细胞成熟产品（如药物或催产剂）。

本发明还保护鲟鱼卵母细胞成熟相关蛋白及其相关生物材料的下述应用：

1）GtHIIβα或与GtHIIβα相关的生物材料在制备诱导鲟鱼卵母细胞的生发泡破裂产品（如药物或催产剂）中的应用；

2）GtHIIβα或与GtHIIβα相关的生物材料在制备诱导鲟鱼卵母细胞成熟产品（如药物或催产剂）中的应用。

实验证明，0.8μg/ml GtHIIβα溶液和0.4μg/ml GtHIIβα溶液都能够诱导鲟鱼卵母细胞的生发泡破裂，即能够诱导卵细胞最后成熟，其中，0.8μg/ml GtHIIβα溶液诱导22小时的卵母细胞的生发泡破裂率高于1μg/ml的孕酮溶液。说明GtHIIβα具有诱导鲟鱼卵母细胞最后成熟的生物活性。

生物材料信息

分类命名：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）

菌株编号：GtHIIβαA1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2013年04月01日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7394

下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。

附图说明

图1为重组质粒pPICZαA-GtHIIβα-A和pPICZαA-GtHIIβα-B的构建流程图。

图2为DH5α/pPICZαA-GtHIIβα-A和DH5α/pPICZαA-GtHIIβα-B的PCR扩增电泳图。

1-5:DH5α/pPICZαA-GtHIIβα-A的PCR扩增产物；

6-8:DH5α/pPICZαA-GtHIIβα-B的PCR扩增产物；

9：SEQ ID No.1所示的GtHIIβα-A的PCR产物作为阳性对照；

10:大肠杆菌DH5α作为阴性对照；

11:将SEQ ID No.3所示的GtHIIβα-B的的PCR产物作为阳性对照；

M:DNA marker，单位是bp。

图3为考马斯亮蓝SDS-PAGE检测巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA1表达产物图谱。

1:巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA1表达产物；

M:蛋白marker。

图4为Western Blot检测巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA1表达产物。

1:巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA1表达产物；

M:蛋白marker。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、GtHIIβα及其编码基因的制备

1、GtHIIβα基因表达载体构建

本实施例人工合成了两种编码SEQ ID No.2所示的GtHIIβαDNA分子，名称分别是GtHIIβα-A和GtHIIβα-B。GtHIIβα-A的核苷酸序列是SEQ ID No.1，其编码序列是SEQ ID No.1的第11-694位，第5-10位为Xho I识别位点（CTCGAG），第698-705位为NotI识别位点（GCGGCCGC）。GtHIIβα-B的核苷酸序列是SEQ ID No.3，其编码序列是SEQ ID No.3的第11-694位，第5-10位为Xho I识别位点（CTCGAG），第698-705位为NotI识别位点（GCGGCCGC）。

将SEQ ID No.1所示的GtHIIβα-A的PCR产物用Xho I和Not I进行酶切，与同样酶切处理的毕赤酵母表达载体pPICZαA（Invitrogen）连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（Takara），经过抗生素Zeocin筛选，得到阳性菌株。以阳性菌株的菌液为模板，以BIIA-F（5’CGGCCTCGAGCTTAGATTGTGTGAACCAGTC3’）和BIIA-R（5’GACGGCGGCCGCTTATCAGTGATGGTGATGGTGATGGGTTTTATGGTAGTAACAGGT3’）为引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃45sec，58℃45sec，72℃45sec，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，大小与预期的一致（图2）。取PCR检测阳性的菌液进行测序验证，将含有SEQ ID No.1所示的GtHIIβα-A的PCR阳性菌株命名为DH5α/pPICZαA-GtHIIβα-A。按照Omega质粒提取试剂盒的要求从DH5α/pPICZαA-GtHIIβα-A中提取质粒，得到重组表达载体pPICZαA-GtHIIβα-A。pPICZαA-GtHIIβα-A是用SEQ ID No.1所示的GtHIIβα-A替换pPICZαA的Xho I和Not I之间片段得到的表达SEQ ID No.2所示的GtHIIβα的重组表达载体。

按照相同的方法，将SEQ ID No.3所示的GtHIIβα-B的的PCR产物用Xho I和Not I进行酶切，与同样酶切处理的毕赤酵母表达载体pPICZαA（Invitrogen）连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（Takara），经过抗生素Zeocin筛选，得到阳性菌株。以阳性菌株的菌液为模板，以BIIB-F（5’cggcctcgagctgcgcttgtgtgagccggtg3’）和BIIB-R（5’GACGGCGGCCGCTTATCAGTGATGGTGATGGTGATGGGTTTTATGGTAGTAGCAGGT3’）为引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃45sec，58℃45sec，72℃45sec，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，大小与预期的一致（图2）。取PCR检测阳性的菌液进行测序验证，将含有SEQ ID No.3所示的GtHIIβα-B的PCR阳性菌株命名为DH5α/pPICZαA-GtHIIβα-B。按照Omega质粒提取试剂盒的要求从DH5α/pPICZαA-GtHIIβα-B中提取质粒，得到重组表达载体pPICZαA-GtHIIβα-B。pPICZαA-GtHIIβα-B是用SEQ ID No.3所示的GtHIIβα-B替换pPICZαA的Xho I和Not I之间片段得到的表达SEQ ID No.2所示的GtHIIβα的重组表达载体。

pPICZαA-GtHIIβα-A和pPICZαA-GtHIIβα-B的构建流程如图1所示，其中的GtHIIβα表示GtHIIβα-A或GtHIIβα-B。

2、重组酵母工程菌的构建和鉴定

分别用pPICZαA-GtHIIβα-A和pPICZαA-GtHIIβα-B转化巴斯德毕赤酵母X-33，构建GtHIIβα重组酵母工程菌。具体实验方法如下：取重组质粒pPICZαA-GtHIIβα-A或pPICZαA-GtHIIβα-B20μg，用SacⅠ在37℃酶切12hr，回收线性化质粒，溶解于15μL灭菌水中，得到线性化质粒。

取80μL巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）X-33感受态细胞（Invitrogen），加入预冷的0.2cm灭菌电激杯，再加入10μl已酶切线性化的DNA，混匀。将电激杯置于冰上5min，在Eppendorf电激仪上电激（2000V，25μΩ）。电激结束后迅速加入1ml1M山梨醇，至于冰上5min。将电激液转入一灭菌的10ml培养管中，28℃静置2hr。将转化的细胞涂布在100μg/ml Zeocin YPDS（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂，含100μg/ml Zeocin）上。30℃培养2-4天，直至长出清晰的菌落即为阳性重组子。将在100μg/ml Zeocin YPDS平板上长出来的单克隆依次接种到500μg/ml Zeocin YPD平板（将100μg/ml Zeocin YPDS中的Zeocin浓度调整为500μg/ml）、1000μg/ml Zeocin YPD平板（将100μg/ml Zeocin YPDS中的Zeocin浓度调整为1000μg/ml），对每个单克隆进行编号，筛选出抗1000μg/ml Zeocin的单克隆，一般认为具有高抗性的单克隆具有高拷贝目的基因。对pPICZαA-GtHIIβα-A转化巴斯德毕赤酵母X-33筛选出的抗1000μg/ml Zeocin的单克隆用上述BIIA-F和BIIA-R作为引物进行PCR鉴定，PCR阳性的重组菌株，提取质粒，进行酶切鉴定，并且测序，共得到4株含有SEQ ID No.1所示的GtHIIβα-A的重组巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）的菌株，分别命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA1、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA2、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA3和巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）GtHIIβαA4。

对pPICZαA-GtHIIβα-B转化巴斯德毕赤酵母X-33筛选出的抗1000μg/mlZeocin的单克隆用上述BIIB-F和BIIB-R作为引物进行PCR鉴定，PCR阳性的重组菌株，提取质粒，进行酶切鉴定，并且测序，共得到3株含有SEQ ID No.3所示的GtHIIβα-B的重组巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）的菌株，分别命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαB1、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαB2和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαB3。

将上述巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA1、巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）GtHIIβαA2、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA3、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA4、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαB1、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαB2和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαB3这7株菌分别接种至内容25ml BMGY培养基的250mL三角瓶中，28-30℃，250-300rpm（旋转半径13mm），摇至OD600=2-6。室温1500g离心5min，收集菌体，去除上清，用BMMY重悬菌体至OD600=1.0，按照10%（体积百分含量）的接种量接入1L三角瓶（内装200ml BMGY培养基）中，加甲醇至终浓度为0.5%（体积百分含量），28-30℃，250-300rpm进行诱导表达。每24小时，加甲醇至终浓度为0.5%（体积百分含量）以继续诱导表达。在诱导发酵过程中，分别在24、48、72、96和120h取发酵物室温1500g离心5min后收集上清，得到蛋白粗提物，用BCA法检测蛋白浓度。对蛋白粗提物用考马斯亮蓝染色进行凝胶浓度（凝胶溶液中单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺的总质量浓度）为18%的SDS-PAGE和用抗6个组氨酸标签的单克隆抗体（Novagen）作为一抗进行Western Blot鉴定。结果表明巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA1、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA2、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA3、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA4均得到了大小在22-40kDa的蛋白条带，这四株菌诱导表达96h得到的蛋白粗提物中蛋白浓度最高，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA1诱导表达96h得到的蛋白粗提物中蛋白浓度最高，分别是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA2的1.2倍、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA3的1.35倍、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA4的1.51倍。已将巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA1于2013年04月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.7394。

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαB1、巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）GtHIIβαB2和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαB3在SDS-PAGE和Western Blot鉴定中均未检测到蛋白条带。

将巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA1发酵96h的蛋白粗提物倒入处理好的His标签亲和层析纯化柱（美国，默克），依次加入binding buffer（0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM咪唑（imidazole），pH=7.9）、wash buffer（0.5MNaCl，60mM Tris-HCl，20mM imidazole，pH=7.9）和elute buffer（0.5M NaCl，1M Tris-HCl，20mM imidazole，pH=7.9），收集最后得到的液体。将收集得到的液体分别在-80℃冷冻，结冰后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥24小时，收集粉末，得到巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA1表达的GtHIIβα纯品。

经检测，在上述发酵条件下，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA1诱导表达96小时，1升BMGY培养基产出0.5g GtHIIβα纯品。

实施例2、促进鲟鱼卵母细胞成熟

1、实验材料

1.1卵母细胞培养液

1.1.1RMS（Ringer’s solution modified for sturgeons）：NaCl6.5g，KCl0.25g，CaCl₂0.3g，NaHCO₃2g，用水定容到1L。

1.1.2孕酮溶液：用RMS稀释1mg/ml的孕酮母液使孕酮终浓度分别为1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml，得到1μg/ml孕酮溶液（P1溶液）、0.5μg/ml孕酮溶液（P2溶液）和0.25μg/ml孕酮溶液（P3溶液）。

其中，孕酮母液按照如下方法配制；将孕酮（progesterone，P）（Sigma,P0130）溶于乙醇中得到孕酮浓度为1mg/ml的孕酮母液。

1.1.3GtHIIβα溶液：用RMS稀释0.04mg/ml的GtHIIβα母液使GtHIIβα终浓度分别为0.8μg/ml和0.4μg/ml，得到0.8μg/ml GtHIIβα溶液（G1溶液）和0.4μg/ml GtHIIβα溶液（G2溶液）。

其中，GtHIIβα母液按照如下方法配制：将实施例1得到的巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GtHIIβαA1表达的GtHIIβα纯品溶于pH7.0的50mM Tris-HCl缓冲溶液中，得到GtHIIβα浓度为0.04mg/ml的GtHIIβα母液。

2、实验方法

选取性成熟雌性小体鲟(北京北水华通鲟鱼繁育有限责任公司)进行诱导卵母细胞最终成熟的离体孵育试验，验证重组蛋白生物活性。每条小体鲟取IV时相的卵母细胞300粒随机分为6组：空白对照组、P1组、P2组、P3组、G1组和G2组，每组50粒卵母细胞。同时进行下述实验：每个培养皿中放50粒卵母细胞，加入相应培养液15-16℃培养，计时（10-12小时换液一次），分别于加入培养液0小时、12小时、14小时、18小时和22小时取卵母细胞检测；每次每组取10粒卵母细胞，放到烧瓶里煮沸5min；体视镜下沿极轴切卵，观察并记录卵母细胞的生发泡破裂率(germinalvesicle breakdown,GVBD)。其中，空白对照组中加入的相应培养液是RMS，P1组加入的相应培养液是P1溶液（1μg/ml孕酮溶液），P2组加入的相应培养液是P2溶液（0.5μg/ml孕酮溶液），P3组加入的相应培养液是P3溶液（0.25μg/ml孕酮溶液），G1组加入的相应培养液是G1溶液（0.8μg/ml GtHIIβα溶液），G2组加入的相应培养液是G2溶液（0.4μg/ml GtHIIβα溶液）。其中，卵母细胞的生发泡破裂率是生发泡破裂的卵母细胞数目与所培养的卵母细胞数目的比值。以卵母细胞的细胞核膜破裂、核仁消失为生发泡破裂。

6条小体鲟共1800粒IV时相的卵母细胞培养不同时间的卵母细胞的生发泡破裂率如表2所示，结果表明：0.8μg/ml GtHIIβα溶液和0.4μg/ml GtHIIβα溶液都能够诱导小体鲟卵母细胞的生发泡破裂，即能够诱导卵细胞最后成熟，其中，0.8μg/mlGtHIIβα溶液在22小时的卵母细胞的生发泡破裂率高于1μg/ml的孕酮溶液。说明GtHIIβα具有诱导鲟鱼卵母细胞最后成熟的生物活性。

表2.小体鲟卵母细胞在不同培养液下培养不同时间的生发泡破裂率（%）