CN103665126B

CN103665126B - 橡胶树来源的HbsHsp2蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN103665126B
Application number: CN201310657133.1A
Authority: CN
Inventors: 李德军; 邓治; 郭会娜; 杜磊
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2013-12-09
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2033-12-09
Also published as: CN103665126A

Abstract

本发明公开了一种橡胶树来源的HbsHsp2蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质是如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆境胁迫能力相关的由序列1衍生的蛋白质；（c）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与微生物耐逆境胁迫能力相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供的蛋白质及其编码基因在提高植物抗盐胁迫和高温胁迫、提高橡胶树产量中将发挥重要作用。

Description

橡胶树来源的HbsHsp2蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种橡胶树来源的HbsHsp2蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

天然橡胶为四大工业原料之一，是关系国计民生的基础产业和重要战略物资，在国民经济中占有重要地位。巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Mull.Arg.)具有产量高、品质好、产胶周期长、栽培措施易于掌握、采胶方便和生产成本低等优点，是唯一一种人工栽培的产胶植物，其生产的天然橡胶占世界天然橡胶总产量的90%以上。此外，橡胶产业也是东南亚一些国家农民的主要经济来源。

巴西橡胶树属大戟科，巴豆亚科，橡胶树属，原产于南美洲亚马逊河流域，属典型的热带高大乔木。我国植胶区位于北纬18-24度之间，属非传统植胶区域，橡胶树经常受低温、干旱、风害等非生物逆境条件影响。与传统植胶区域相比，我国橡胶树受逆境影响较大，产量偏低。我国是天然橡胶消费大国，对天然橡胶的需求量日益增长，造成我国天然橡胶供需矛盾日益突出。目前，我国天然橡胶自给率已不足18%。天然橡胶产业属典型的资源约束型和技术依赖型产业，我国植胶区域有限，提高单产是保障我国天然橡胶供给能力的唯一出路。提高橡胶树在逆境胁迫下的抗性及对逆境胁迫的适应能力将有助于增加橡胶树胶乳产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种橡胶树来源的HbsHsp2蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的蛋白质，获自橡胶树（Hevea brasiliensis），命名为HbsHsp2蛋白，是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆境胁迫能力相关的由序列1衍生的蛋白质；

（c）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与微生物耐逆境胁迫能力相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH

FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）或（c）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）或（c）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质的基因（HbsHsp2基因）也属于本发明的保护范围。

所述基因具体可为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）或（6）的DNA分子：

（1）编码区如序列表的序列2自5’末端第77-703位核苷酸所示的DNA分子；

（2）序列表的序列2所示的DNA分子；

（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；

（4）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码微生物耐逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；

（5）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码植物耐逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；

（6）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码微生物耐逆境胁迫相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5% SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1% SDS和1×SSC、0.1% SDS各洗膜一次。

含有所述HbsHsp2基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。所述重组载体具体可为将所述HbsHsp2基因插入pET28a(+)载体的多克隆位点得到的重组质粒。

所述重组菌具体可为将所述重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌Transetta(DE3)。

本发明还保护一种培育重组微生物的方法，是将所述HbsHsp2基因导入目的微生物中，得到耐逆境胁迫能力高于所述目的微生物的重组微生物。所述目的微生物可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌Transetta(DE3)。所述逆境胁迫为盐胁迫或高温胁迫。所述高温具体可为43℃以上。

扩增所述HbsHsp2基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明还保护所述HbsHsp2蛋白的应用，为如下（Ⅰ）或（Ⅱ）：（Ⅰ）参与植物或微生物的对逆境胁迫的应答；（Ⅱ）提高植物或微生物对逆境胁迫的耐逆性。所述微生物可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌Transetta(DE3)。所述逆境胁迫为盐胁迫或高温胁迫。所述高温具体可为43℃以上。

橡胶树活跃的乳管代谢和高效的胁迫适应能力是保证橡胶树高产的主要原因，本发明的发明人发现了HbsHsp2蛋白，经过实验鉴定，该蛋白可提高大肠杆菌抗盐胁迫和高温胁迫的能力，增强其在盐胁迫和高温胁迫条件下的成活率，从而确定该蛋白具有抗盐胁迫和高温胁迫的功能。本发明提供的蛋白质及其编码基因在提高植物抗盐胁迫和高温胁迫、提高橡胶树产量中将发挥重要作用。

附图说明

图1为HbsHsp2基因在不同组织中的表达模式分析。

图2为HbsHsp2基因在低温处理、氯化钠胁迫处理和伤害处理条件下的表达模式分析。

图3为SDS-PAGE图谱。

图4为重组菌和对照菌的对盐胁迫的耐逆性鉴定结果。

图5为重组菌和对照菌对高温胁迫的耐逆性鉴定结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果表示为平均值。

巴西橡胶树热研7-33-97：种植于中国热带农业科学院试验场和国家橡胶树种质资源圃。pET28a(+)载体：NOVAGEN公司，产品号为69864-3。大肠杆菌Transetta(DE3)，又称出发菌：NOVAGEN公司，产品号为69450-3。

实施例1、HbsHsp2蛋白及其编码基因的获得

建立橡胶树树皮转录组深度测序数据库，从巴西橡胶树热研7-33-97中发现一段799bp EST片段，该EST片段如序列表的序列2所示，包含完整的开放阅读框，编码序列表的序列1所示的蛋白质。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为HbsHsp2蛋白。将编码HbsHsp2蛋白的基因命名为HbsHsp2基因，其开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第77-703位核苷酸所示。

分别取巴西橡胶树热研7-33-97的树皮、胶乳、叶片、雄花、雌花和花药，提取总RNA并反转录为cDNA，采用F1和R1组成的引物对检测HbsHsp2基因的相对表达量。结果见图1。结果表明，HbsHsp2基因表达无组织特异性，在胶乳中表达最高，在雄花中表达最低。

取橡胶树热研7-33-97的组培苗，分别进行低温处理（参照文献“安泽伟,陈根辉,程汉,赵彦宏,谢黎黎,黄华孙.橡胶树冷应答转录组cDNA-AFLP分析.林业科学,2010,46:62-67.”进行）、氯化钠胁迫处理（参照文献““王瑞刚,陈少良,刘力源,郝志勇,翁海娇,李鹤,杨爽,段杉.盐胁迫下3种杨树的抗氧化能力与耐盐性研究.北京林业大学学报,2005,27:46-52.”)和伤害处理（参照文献“Tang CY,Huang DB,Yang JH,Liu SJ,Sark S,Li HP,et al.The sucrose transporter HbSUT3playsan active role in sucrose loading to laticifer and rubber productivity inexploited trees of Hevea brasiliensis(para rubber tree).Plant Cell Environ2010,33(10):1708–20.”），取低温和氯化钠胁迫处理后0h、3h、24h和48h的叶片，取伤害处理后0h、6h、24h和48h的叶片。提取总RNA并反转录为cDNA，采用F1和R1组成的引物对检测HbsHsp2基因的相对表达量。结果见图2。结果表明：氯化钠胁迫处理后，

HbsHsp2基因的表达在3h和24h显著升高，48h降低（图2A）；低温处理后HbsHsp2基因的表达持续升高（图2B）；伤害处理后，HbsHsp2基因表达的6h和24h略有下降，48h后又升高（图2C）。

F1：5′-cttctcagacgtggtggatc-3′；

R1：5′-ggtctcacgaacgtcccag-3′。

实施例2、HbsHsp2蛋白的功能验证

一、重组质粒的构建

1、提取巴西橡胶树热研7-33-97树皮的总RNA并反转录得到cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F2：5’-gcggatcc atggcttcctcactggctc-3’；

R2：5’-gcgaattc ttactcgaccttgacatggaa-3’。

3、用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切步骤2得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切pET28a(+)载体，回收约5400bp的载体骨架。

5、将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-HbsHsp2。根据测序结果，对重组质粒pET28a-HbsHsp2进行结构描述如下：在pET28a(+)载体的BamH I和EcoR I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第77-703位核苷酸所示的双链DNA分子。

二、重组菌的构建

将重组质粒pET28a-HbsHsp2导入大肠杆菌Transetta(DE3)，得到重组菌。

将pET28a(+)载体导入大肠杆菌Transetta(DE3)，得到对照菌。

将重组菌和对照菌分别进行如下实验：（1）取单菌落，接种至3mL含100mg/L卡那霉素的LB液体培养基，振荡培养过夜；（2）取步骤（1）得到的菌液，按1:100的体积比转接至含100mg/L卡那霉素的液体LB培养基，37℃、200rpm/min振荡培养至OD_600nm=0.4左右；（3）完成步骤（2）后，加入IPTG至浓度为1mmol/L，37℃、200rpm/min振荡培养（诱导）一定时间；（4）完成步骤（3）后，离心收集菌体，加入等体积的2×上样缓冲液，超声破碎后95℃煮5min使蛋白变性，然后12000rpm/min离心1min，收集上清液；（5）将步骤（4）得到的上清液进行SDS-PAGE。

SDS-PAGE图谱见图3，泳道1为重组菌诱导6小时后的上清液，泳道2为重组菌诱导4小时后的上清液，泳道3为重组菌诱导2小时后的上清液，泳道4为重组菌诱导1小时后的上清液，泳道5为重组菌诱导前的上清液，泳道6为对照菌诱导6小时后的上清液，泳道M为蛋白分子量Marker（自上之下的分子量依次为170kDa、130kDa、100kDa、70kDa、55kDa、40kDa、35kDa、25kDa和15kDa）。结果表明：经IPTG诱导后，重组菌表达24kD左右的蛋白，与HbsHsp2蛋白的预期分子量基本一致；IPTG诱导前和IPTG诱导后，对照菌均未表达相应分子量的蛋白。

三、重组菌和对照菌的对盐胁迫的耐逆性鉴定

将重组菌、对照菌和出发菌分别进行如下实验：（1）取单菌落，接种至LB液体培养基，37℃振荡培养培养过夜；（2）取0.1mL步骤（1）得到的菌液，接种至100mL含100μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、200rpm振荡至OD_600nm=0.3；（3）取步骤（2）得到的菌液，分成两组，第一组加入氯化钠并使其浓度为0.4mM，第二组加入氯化钠和IPTG、使氯化钠的浓度为0.4mM、IPTG的浓度为1mmol/L，37℃、200rpm振荡培养，分别于振荡培养0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时和8小时，取样检测菌液的OD_600nm值。

第一组的结果见图4A。在无IPTG诱导的条件下，重组菌、对照菌和出发菌在各个时间点的OD_600nm值基本相同，表明两者菌体细胞密度基本一致。

第二组的结果见图4B。在IPTG诱导的条件下，在各个时间点，重组菌的OD_600nm值均显著高于对照菌，对照菌和出发菌的OD_600nm值基本相同。结果表明，在IPTG诱导的条件下，重组菌对氯化钠胁迫的耐受能力高于对照菌和出发菌。可以得出如下结论：HbsHsp2蛋白具有抗盐胁迫的作用。

四、重组菌和对照菌对高温胁迫的耐逆性鉴定

将重组菌、对照菌和出发菌分别进行如下实验：（1）取单菌落，接种至LB液体培养基，37℃振荡培养培养过夜；（2）取0.1mL步骤（1）得到的菌液，接种至100mL含100μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、200rpm振荡至OD_600nm=0.3；（3）取步骤（2）得到的菌液，分成两组，第一组不作任何处理，第二组加入IPTG并使其浓度为1mmol/L，43℃、200rpm振荡培养，分别于振荡培养0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时和6小时，取样检测菌液的OD_600nm值。

第一组的结果见图5A。在无IPTG诱导的条件下，重组菌、对照菌和出发菌在各个时间点的OD_600nm值基本相同，表明两者菌体细胞密度基本一致。

第二组的结果见图5B。在IPTG诱导的条件下，在各个时间点，重组菌的OD_600nm值均显著高于对照菌，对照菌和出发菌的OD_600nm值基本相同。结果表明，在IPTG诱导的条件下，重组菌对高温胁迫的耐受能力高于对照菌和出发菌。可以得出如下结论：HbsHsp2蛋白具有抗高温胁迫的作用。

Claims

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)的DNA分子：

(1)编码区如序列表的序列2自5’末端第77-703位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表的序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述基因插入pET28a(+)载体的多克隆位点得到的重组质粒。

6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将权利要求5所述重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌。

7.一种培育重组微生物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的微生物中，得到耐逆境胁迫能力高于所述目的微生物的重组微生物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述目的微生物为大肠杆菌。

9.权利要求1所述蛋白的应用，为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ)参与巴西橡胶树或大肠杆菌的对逆境胁迫的应答；(Ⅱ)提高大肠杆菌对逆境胁迫的耐逆性；所述逆境胁迫为盐胁迫或高温胁迫。