CN103319610A - 新型重组融合蛋白及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新型重组融合蛋白及其制法和用途。具体地,本发明公开了一种融合蛋白,具有包括VEGFR1第二膜外区D2的元件A和免疫球蛋白元件B,二者串联在一起。本发明的融合蛋白具有很强的VEGF的结合活性,从而可有效抑制配体的生物学活性。本发明还提供了新型重组融合蛋白药在治疗肿瘤等疾病中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域。更具体地,本发明涉及一种新型重组融合蛋白及其制法和用途。
背景技术
血管发生(Angiogenesis)是由血管内皮细胞生长因子VEGF所诱导的新的血管形成,主要通过VEGF与血管内皮细胞膜表面的VEGF受体(VEGFR1、VEGFR2)结合,诱导VEGFR2的磷酸化,从而引起一系列信号传导,导致血管内皮细胞增生。如果在某种疾病状态下(如肿瘤、湿性老年黄斑变性)VEGF过度分泌,就有可能诱导血管的异常增生,增生的结果则是促进肿瘤细胞的增殖和转移、促进眼睛脉络膜血管增生并导致湿性黄斑变性。
目前针对VEGF的靶向治疗药物已有广泛的研究,已获得批准的针对VEGF的靶向治疗药物有单克隆抗体及基因重组融合蛋白。前者包括阿瓦斯汀(Avastin)、雷珠单抗注射液(Lucentis),后者为阿柏西普(Zaltrap,Aflibercept,又称VEGF-Trap)。阿瓦斯汀用于治疗大肠癌及肺癌,雷珠单抗注射液用于治疗湿性老年黄斑变性,阿柏西普用于治疗大肠癌及湿性老年黄斑变性。国内一家公司研发的基因重组融合蛋白KH902也完成了治疗湿性老年黄斑变性的临床试验,正待等新药报批阶段。
因此,开发新结构的重组融合蛋白药在VEGF靶向治疗药物的研究中具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型重组融合蛋白及其制法和用途。
本发明的第一方面,提供了一种融合蛋白,所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所述结构:
C-A-B (Ia),或
C-B-A (Ib)
其中,
A为包括血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR1)第二膜外区D2的蛋白元件,并且元件A的长度为94-103个氨基酸;
B为免疫球蛋白元件;
C为任选的信号肽序列;
“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。
在另一优选例中,所述元件A具有SEQ ID NO.:1中第25-117位所示的氨基酸序列(核心序列)并且长度为94、95、96、97、98、99、或100个氨基酸。
在另一优选例中,所述元件A的长度为100个氨基酸。
在另一优选例中,所述元件A中位于SEQ ID NO.:1中第25-117位所示的氨基酸序列(核心序列)两侧的氨基酸序列分别来自于天然VEGFR1的第二膜外区D2(Domain2,)两侧氨基酸序列。
在另一优选例中,所述元件A的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1中第20-119位所示。
在另一优选例中,所述D2具有侧翼序列,所述侧翼序列包括:
位于D2氨基端的第一侧翼序列;和/或
位于D2羧基端的第二侧翼序列。
在另一优选例中,所述第一侧翼序列由1-5个氨基酸残基组成。
在另一优选例中,所述第二侧翼序列由1-2个氨基酸残基组成。
在另一优选例中,所述的第一和第二侧翼序列分别来自天然VEGFR1的第二膜外区D2(SEQ ID NO.:1中第25-117位)两侧氨基酸序列。
在另一优选例中,所述第一侧翼序列为SDTGR。
在另一优选例中,所述第二侧翼序列为NT。
在另一优选例中,所述元件B为人免疫球蛋白IgG1的Fc片段。
在另一优选例中,所述的肽接头的长度为0-10氨基酸,较佳地为1-5个氨基酸。更佳地,肽接头为EF(SEQ ID NO.:1中第120-121位)。
在另一优选例中,所述融合蛋白还包括信号肽元件C。
在另一优选例中,所述融合蛋白不含信号肽,并且结构式为
A-B (IIIa),或
B-A (IIIb)
式中,A、B和“-”的定义如上所述。
在另一优选例中,所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第1-19位所示。
在另一优选例中,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中,所述融合蛋白具有以下特性:
a)与VEGF的结合活性ED50=50-200pM(较佳地为ED50=60-80pM);
b)可阻断VEGF诱导的VEGFR2磷酸化;
c)可阻断VEGF诱导的体外或体内血管形成;
d)可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭;和
e)血浆半衰期≥5天。
本发明的第二方面,提供了一种蛋白二聚体,所述的二聚体由两个第一方面所述的任一融合蛋白形成。
在另一优选例中,所述二聚体具有式IIa或式IIb所述结构:
其中,
A为包括VEGFR1第二膜外区D2的蛋白元件,并且元件A的长度为94-103个氨基酸;
B为免疫球蛋白元件;
C为任选的信号肽序列;
“-”表示连接上述元件的肽键或肽接头;
“‖”表示二硫键。
在另一优选例中,所述融合蛋白不含信号肽,并且结构式为
其中,
A为包括VEGFR1第二膜外区D2的蛋白元件,并且元件A的长度为94-103个氨基酸;
B为免疫球蛋白元件;
“-”表示连接上述元件的肽键或肽接头;
“‖”表示二硫键。
本发明的第三方面,提供了一种分离的多核苷酸,所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。
本发明的第四方面,提供了一种载体,它含有第三方面所述的多核苷酸。
本发明的第五方面,提供了一种宿主细胞,它含有第四方面所述的载体或基因组中整合有第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞(如CHO细胞、NS0细胞、或293细胞)。
本发明的第六方面,提供了一种产生蛋白的方法,它包括步骤:
在适合表达的条件下,培养第五方面所述的宿主细胞,从而表达出第一方面所述的融合蛋白;和
分离所述融合蛋白或由所述融合蛋白形成的二聚体。
本发明的第七方面,提供了一种药物组合物,所述组合物包含:
第一方面所述的融合蛋白和/或第二方面所述的蛋白二聚体,以及
药学上可接受的载体。
本发明的第八方面,提供了本发明第一方面所述的融合蛋白和/或第二方面所述的蛋白二聚体的用途,用于制备治疗疾病的药物。
在另一优选例中,所述的疾病选自:肿瘤、湿性黄斑变性或肝脏纤维化。
在另一优选例中,所述肿瘤包括:大肠癌、肺癌。
在另一优选例中,所述的疾病为血管发生相关疾病。
本发明的第九方面,提供了一种抑制血管发生或治疗血管发生相关疾病的方法,包括步骤:给需要的对象施用第一方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中,所述的融合蛋白以单体和/或二聚体形式施用。
在另一优选例中,所述的对象是人。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1A为重组融合蛋白VEGFR1D2-Fc的结构示意图。
图1B显示了本发明一种重组融合蛋白VEGFR1D2-Fc的核苷酸序列。
图1C显示了本发明一种重组融合蛋白VEGFR1D2-Fc的氨基酸序列。
图2显示了VEGFR1D2-Fc蛋白SDS-PAGE电泳图,各泳道如下:1为非还原条件、2为Marker、3为还原条件。
图3显示了VEGFR1D2-Fc蛋白与靶点VEGF结合活性测试结果。
图4显示了VEGFR1D2-Fc可阻断VEGF所诱导的VEGFR2磷酸化。
图5显示了VEGFR1D2-Fc可阻断VEGF所诱导的血管内皮细胞管状形成。
图6显示了VEGFR1D2-Fc对斑马鱼体内血管形成具有抑制作用,将不同剂量的VEGFR1D2-Fc(4.4、14.7、44ng)注射到斑马鱼血液循环内,记录不同条件下肠下血管的数量。
图7显示了恩度和洛伐他汀二者对斑马鱼体内血管形成抑制的实验的比较。恩度(44、100ng)和洛伐他汀(4ng)注射到斑马鱼血液循环内,记录不同条件下肠下血管的数量。
图8和9显示了VEGFR1D2-Fc具有抑制肺癌细胞(A549)生长的活性。
图10和11显示了VEGFR1D2-Fc具有抑制大肠癌细胞(COLO-205)生长的活性。
图12显示了VEGFR1D2-Fc的药代动力学实验结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现在VEGFR1第二膜外区D2(Domain2)增加侧翼序列,并将其与IgG1的Fc片段连接后组成的融合蛋白具有很强的VEGF结合活性,由此开发出一类新型重组融合蛋白类药物,例如VEGFR1D2-Fc。在此基础上完成了本发明。
以VEGFR1D2-Fc为例,它具有以下功能:1)可阻断VEGF所诱导的VEGFR2磷酸化;2)可阻断VEGF所诱导的体外或体内血管形成;3)可剂量依赖性的抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。
在一个实施例中,本发明人通过试验证实,表达的VEGFR1D2-Fc具有很强的VEGF结合活性,ED50=60-80pM。由于在某些疾病状态下,(如肿瘤、老年眼黄斑变性、肝脏纤维化),体内VEGF分泌过量,导致血管异常增生,从而诱导疾病发生或加重病情。因此VEGFR1D2-Fc可以用以治疗肿瘤、湿性黄斑变性或肝脏纤维。
VEGFR1及其膜外区
VEGFR蛋白属于受体酪氨酸激酶超家族,是一种膜镶嵌蛋白。VEGFR的膜外部分大约有750个氨基酸残基,由7个与免疫球蛋白结构相似的Ig结构域组成。当与其相应配体结合以后,根据其相应的受体特性,VEGFR蛋白可诱导一系列不同的生物学功能反应。VEGFR蛋白包括:VEGFR1(Flt-1)、VEGFR2(KDR/FLk-1)、VEGFR3(Flt-4)或其组合。在本发明中,优选为VEGFR1(Flt-1),优选天然型VEGFR1为野生型的。
本发明的D2指VEGFR1(Flt-1)的第二个膜外区(Domain2)。一种代表性的D2序列为SEQ ID NO.:1中第25-117位。研究表明,VEGFR2(KDR/FLk-1)和VEGFR3(Flt-4)的D2均不能VEGF结合,并且现有技术(The EMBO Journal vol.15no.18pp.4919-4927,1996)表明,仅由D2区构成的多肽不具有VEGF结合活性,例如仅由D2区与Fc构成的融合蛋白不具有VEGF结合活性(The EMBO Journalvol.15no.18pp.4919-4927,1996)。
免疫球蛋白G元件
在本发明中,适用的免疫球蛋白G元件没有特别限制,可以是来自人或其他哺乳动物的免疫球蛋白元件,或其突变物和衍生物。优选来自人的免疫球蛋白的元件。
人免疫球蛋白G包括四个亚类:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。这四个亚类的蛋白结构有很大的相似性,都有四个区域:一个可变区(VH),三个恒定区(CH1、CH2、CH3)。Fc片段由两个恒定区(CH2-CH3)所组成,其中在CH2区域有一个二硫键,使得两个Fc片段单体组成共价结合的同源二聚体。正常生理条件下,人体血浆内IgG的浓度以IgG1最高,IgG2次之,IgG3和IgG4浓度较低。
一种优选的G元件是人IgG1Fc片段,或其突变物、衍生物。
融合蛋白及其制备
在本发明中,“重组融合蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”可互换使用,指具有式Ia或Ib所述结构,即含有包括VEGFR1第二个膜外区D2的蛋白元件和免疫球蛋白元件(优选Fc)的融合蛋白。一个代表性的例子是VEGFR1D2-Fc。本发明蛋白可以是单体或由单体形成的多聚体(如二聚体)。此外,应理解,所述术语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“分离的重组融合蛋白”是指重组融合蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化重组融合蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
如本文所用,术语“引物”指的是在与模板配对,在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA,也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸,但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如,在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列,这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合,非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物,从而进行扩增。
本发明融合蛋白或其元件(如VEGFR1D2)的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据已公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
通过常规的重组DNA技术,可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体
本发明中,“抗体”、“配体”可互换使用,是指对本发明蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体。这里,“特异性”是指抗体能分别结合于本发明蛋白或其片段。较佳地,指那些能与本发明蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab'或(Fab)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子;或嵌合抗体。
肽接头
本发明提供了一种融合蛋白,它可任选地含有肽接头。肽接头大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常,肽接头应当具有足够的长度和柔韧性,以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。
连接肽的长度一般为0-10个氨基酸,较佳地1-5个氨基酸。
药物组合物及施用方法
本发明还提供了一种组合物,它含有有效量的本发明的融合蛋白,以及药学上可接受的载体。通常,可将本发明的融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地,pH约为6-8。
如本文所用,术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量,如0.001-99wt%;较佳的0.01-95wt%;更佳的,0.1-90wt%。
如本文所用,“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的融合蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:本发明融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。针对肿瘤患者,通常,当本发明的融合蛋白每天以约0.5mg-5mg/kg动物体重(较佳的2mg-4mg/kg动物体重)的剂量给予,能得到令人满意的效果。例如,由治疗状况的迫切要求,可每天给予若干次分开的剂量,或将剂量按比例地减少。
本发明的融合蛋白及其二聚体或多聚体主要包括以下优点:
1)具有很强的VEGF的结合活性,ED50=60-80pM;
2)可阻断VEGF诱导的VEGFR2磷酸化;
3)可阻断VEGF诱导的体外或体内血管形成;
4)可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。
5)可阻断VEGF诱导肝脏纤维化。
6)与现有的针对VEGF的靶向治疗重组融合蛋白相比,具有分子量小,结构简单等优点。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
构建VEGFR1D2-Fc表达载体
VEGFR1-D2基因编码序列由300个核苷酸组成,如SEQ ID NO.:2中第58-357位所示,其中包括D2编码序列279个核苷酸、上游侧翼序列15个核苷酸、下游侧翼序列6个核苷酸。在其5'端加上了57个来自于小鼠IgG重链的信号肽编码序列(即SEQ ID NO.:2中第1-57位),组成357个核苷酸。在这357个核苷酸的氨基端再加上“Kozack”序列及“HindIII”基因克隆位点、在羧基端加上“EcoRI”基因克隆位点,组成了一个含有378个核苷酸的基因片段。
合成产物(南京金斯瑞生物科技公司合成)经过酶切(HindIII/EcoRI),克隆至pHB-Fc质粒载体,形成pHB-VEGFR1D2-Fc蛋白表达载体。pHB-Fc质粒载体的制法如下:以pcDNA/HA-FLAG(Accession#:FJ524378)载体为出发质粒,在内切酶EcoRI后面加上了人IgG1的Fc序列,在内切酶HindIII前面加上了人类巨细胞病毒(HCMV)促进子序列(Accession#:X17403),在氨苄青霉素耐受基因后面、HCMV促进子前面加上了中国仓鼠谷氨酰胺合成酶基因(Accession#:X03495)。序列设计好以后,委托上海捷瑞生物工程有限公司予以合成改造。
序列SEQ ID NO:2为编码重组融合蛋白的核苷酸序列,如图1B所示。全长1059bp,其中1-57bp为信号肽编码序列,58-357bp为VEGFR1D2编码序列,358-363bp为EcoRI的酶切位点GAATTC,364-1059bp为Fc片段,TGA为终止密码。
图1A为重组融合蛋白VEGFR1D2-Fc的结构示意图。该示意图仅起到示意作用,不代表本发明的融合蛋白的具体真实结构。
序列SEQ ID NO:1为编码重组融合蛋白的氨基酸序列,如图1C所示。全长353个氨基酸,分子量约为80kDa。其中1-19位氨基酸为信号肽,20-119位为含侧翼序列(下划线标出)的VEGFR1D2片段,120-121位为EcoRI酶切位点的2个氨基酸,122-353位氨基酸为Fc片段。
实施例2
VEGFR1D2-Fc的表达
蛋白表达所用的宿主细胞是购自ATCC公司的CHO-K1细胞(Cat#CCL-61)。该细胞经过一系列驯化步骤,驯化成可在无血清培养基(EX-CELLTM302)中进行悬浮培养的CHO-K1细胞。
利用该细胞,通过电转的方法,将pHB-VEGFR1D2-Fc质粒转入细胞。具体方法是:在无菌条件下收集处于对数生长期的细胞,离心沉淀(1200rpm x5min)后重悬于完全培养基,并调整细胞密度至1x107cells/ml。取350ul细胞悬液转移至0.4cm电转杯,在设定电转条件下(电压范围200到350V,一般260V,时间20ms左右)脉冲1次。加入10–30ug质粒DNA至含有细胞的电转杯中,轻轻混匀后,将电转杯放入电转仪中,通脉冲。取出电转杯,静置5分钟,加0.6ml细胞培养基,混匀后吸出来,转到培养皿中,放入培养箱培养。24-48小时后检查蛋白表达。如有蛋白表达,证明基因转入成功,此时将细胞用培养基进行稀释,然后转移至20块96孔细胞培养板中,每孔细胞数3000-5000个。细胞经过一系列压力(谷氨酰胺合成酶抑制剂)筛选,最终筛选出能够高表达VEGFR1D2-Fc的细胞株。
蛋白生产时,将高表达VEGFR1D2-Fc的细胞株细胞接种至含有3升EX-CELLTM302培养基的细胞反应器中,细胞密度为3x105cells/ml,培养条件为37℃、5%CO2。细胞在培养过程中经过pH、葡萄糖、谷氨酰胺等检测,并根据各项指标适时补加营养成分。当细胞密度达5-6x106cells/ml时,将培养温度从37℃降至33℃,继续培养至细胞活率达60-70%时进行收获。收获的细胞培养上清经过超滤浓缩,以及Protein A亲和层析株进行纯化。纯化的蛋白利用Lowry法进行定量测定(参照2010版中国药典),蛋白定量标准品为牛血白蛋白(批号140619-201120,中国药品食品检定研究院)。生产的蛋白经SDS-PAGE电泳分析大小与理论值基本吻合,内毒素含量低于标准要求。
图2显示了VEGFR1D2-Fc蛋白SDS-PAGE电泳图。
实施例3
VEGFR1D2-Fc与靶点(VEGF)结合活性检测
利用酶联免疫吸附检测(ELISA)方法,测定融合蛋白与靶点(VEGF)结合特性。具体步骤如下:
用包被缓冲液CBS(Sigma-Aldrich Co.,Product code:1001329288C3041-100CAP)将VEGF-165(Cat:11066-HNAH,Sino biological Inc.)稀释至500ng/ml,取100ul加入到ELISA板(NuncTM,Cat:442404)中,每孔50ng。将包被板置于4oC冰箱过夜。检测时先用0.05%PBS-T洗涤包被板一次,再用3%脱脂牛奶室温封闭1小时。将稀释好的D2-Fc蛋白(50、25、...、0.0244nM)加入到包被板中,每孔100ul。室温孵育一个小时以后,弃样品,用0.05%PBS-T洗涤5次,然后加入100ul经过稀释(1:20000)的HRP-Rabbit Anti-Human IgG Fc(洛阳佰奥通,Cat#:C030222),室温孵育一个小时,洗涤液洗涤5次,加入HRP底物,避光显色10-20分钟以后用2N H2S04终止显色反应,于酶标仪上读取0D450值。
结果显示,D2-Fc具有很强的VEGF结合活性(如图3所示),ED50在纳摩尔以下(ED50=~67pM)。
实施例4
VEGFR1D2-Fc可抑制VEGF诱导的VEGFR2磷酸化以及HUVEC细胞增殖
由于VEGF与VEGFR2结合后,受体首先自身磷酸化,继而激活磷脂酰肌醇代谢的信号转导通路和丝裂原活化的蛋白激酶,表现出VEGF的有丝分裂原特性,诱导人血管内皮细胞(HUVEC)的增殖。因此抑制VEGF诱导的VEGFR2的磷酸化即可抑制血管内皮细胞的增殖。
VEGFR2磷酸化实验的具体步骤如下:
将HUVEC细胞用培养液(澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司,产品编号:HUVEC-004)调浓度为2×105/ml,将细胞加入到6孔细胞培养板中,每孔加入4ml细胞悬液,培养箱中培养过夜。第二天,弃去培养液,用PBS轻轻洗涤两次,然后加入4ml含有VEGF(R&D,Cat#293-VE/CF)及不同浓度VEGFR1D2-Fc蛋白的培养液,37℃培养箱内孵育13分钟,取出6孔板,弃去培养液,每孔加入150ul裂解液(100mMPMSF、Protease Inhibitor cocktail、100mM Sodium Orthovanadete溶液,这三种蛋白酶抑制剂按1:100的量加入到裂解液中),冰上反应2min后轻轻吹打细胞,收集悬液,13000rpm离心1.5min,取上清。细胞裂解液用8%的SDS-PAGE分离胶分离,然后转入到PVDF膜(Merck&Co.,IPVDF.,Cat No:IPVH00010)。PVDF膜在PBST中清洗1分钟,然后用封闭液室温封闭0.5小时。用经过稀释(1:750)的抗VEGFR2磷酸化抗体(Cell Signaling Technology,Cat#3770S)与PVDF膜一起低温(4oC)孵育过夜,用PBST清洗3次,每次10分钟。将PVDF膜与二抗(1:2000)(HRP-Goat Anti-Rabbit IgG,洛阳佰奥通,Cat No:C030212)低温(4℃)温孵育2小时。用PBST清洗3次,每次10分钟。将ECL试剂盒的A液和B液两种试剂在试管内等体积混合,然后加在PVDF膜的正面,温育大概2分钟,在PVDF膜上盖一层保鲜膜,擦去多余的发光剂,最后用全自动化学发光图像分析系统中检测显影条带。
结果显示,VEGFR1D2-Fc可显著抑制VEGF所诱导的VEGFR2的磷酸化,抑制活性具有剂量依赖性(如图4所示),即使在最小剂量(1nM)也可显著抑制VEGFR2的磷酸化。
HUVEC细胞增殖及管状形成实验的具体步骤如下:
将HUVEC细胞调浓度至3×105/ml,将细胞加入到含有Matrigel的96孔培养板中,每孔50ul。然后将配制好的含有VEGF(20ng/ml)及不同浓度VEGFR1D2-Fc(1、5、10、20ug/ml)的培养液加入到培养板中,每孔50ul。培养板置于培养箱培养,并于不同时间点(0h,2h,4h,6h,8h,24h)显微镜下拍照存档。
结果显示,VEGFR1D2-Fc可抑制HUVEC细胞的增殖及HUVEC细胞在凝胶培养基中的管状形成(如图5所示)。
实施例5
VEGFR1D2-Fc可剂量依赖性抑制体内血管形成
利用血管荧光转基因斑马鱼模型,评价待测样品VEGFR1D2-Fc对血管形成的影响。
1)斑马鱼准备方法:
血管荧光转基因斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行。每次交配准备4~5对成年斑马鱼,平均每对能产200~300个胚胎。在受精后6小时(即6hpf)和24hpf对胚胎进行清理(移除已死亡胚胎),并根据胚胎的发育阶段挑选合适的胚胎。在28℃条件下用养鱼用水孵育胚胎(养鱼用水水质:每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐,电导率为480~510μS/cm;pH为6.9~7.2;硬度为53.7~71.6mg/L CaCO3)。因为胚胎可以从自身的卵黄囊中获取营养物质,所以在受精后9天内(9dpf)不需要喂食。实验完成后,用三卡因甲磺酸对各个发育阶段的斑马鱼进行过度暴露处理,从而将斑马鱼麻醉处死。麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会(AVMA)对动物麻醉处死的规范要求。
2)实验方法:
A.确定待测样品的最大非致死浓度(MNLC)
–使用显微注射仪,将样品注射到荧光转基因斑马鱼体内(血液循环注射),每种待测样品设置多个不同的浓度,每个浓度均处理30尾斑马鱼;
–待测样品的三个初始检测浓度。
–阴性对照组:溶剂组;
–空白对照组用于证明溶剂不会对斑马鱼造成有害影响;
–所有实验组(除空白对照组)均含有相同浓度的溶剂;
–样品处理结束后,统计各实验组的斑马鱼死亡数量,使用JMP统计学软件绘制最佳的浓度效应曲线,并计算MNLC;
–如果在最初的浓度检测实验中不能得到MNLC,将扩大待测样品的检测浓度范围,上限为待测样品的最大溶解度或原液。
B.定量评价样品对血管形成的抑制作用
–依据浓度致死曲线,每种待测样品选取3个浓度进行检测(通常为最大非致死浓度(MNLC)、1/3MNLC和1/10MNLC);
–每个浓度均处理(血液循环注射)30尾血管荧光转基因斑马鱼;
–阳性对照组:恩度和洛伐他汀;
–阴性对照组:溶剂组;
–空白对照组用于证明溶剂不会对斑马鱼产生有害影响;
–所有实验组(除空白对照组)均含有相同浓度的溶剂;
–样品处理结束后,每组随机取10尾斑马鱼在荧光显微镜下观察、拍照并保存图片;
–样品抑制血管形成的药效计算公式如下:
–用方差分析和Dunnett's T-检验进行统计学分析,p<0.05表明具有显著性差异;
–提供具有代表性的实验图谱。
血管荧光转基因斑马鱼胚胎在受精后48小时通过显微注射仪将不同剂量的VEGFR1D2-Fc(4.4、14.7、44ng)以及阳性对照药物恩度(44、100ng)和洛伐他汀(4ng)注射到斑马鱼血液循环内,72小时显微镜观察斑马鱼肠下血管,并拍照存档、记录不同条件下肠下血管的数量。
3)实验结果:
溶剂组(1×PBS)与空白对照比较没有统计学意义(p>0.05),说明注射溶剂对斑马鱼的血管形成没有影响。4ng洛伐他汀的血管抑制率为(45.6±2.2)%(4ng的给药量为洛伐他汀的最大非致死给药量,因此,此时的血管抑制率是洛伐他汀的最大抑制率),与溶剂组相比,有统计学意义(p<0.001)。44ng和100ng恩度的血管抑制率分别为(9.7±2.8)%和(20.1±2.6)%,与溶剂组相比,均有统计学意义(p<0.05,p<0.001)。两种不同的阳性对照化合物对斑马鱼的血管均有显著的抑制作用,所以此评价模型是可靠的。
给药量为4.4ng的VEGFR1D2-Fc血管形成抑制率为7.5±3.5%,但与溶剂组相比,没有统计学意义(p>0.05);给药量为14.7ng和44ng的VEGFR1D2-Fc血管形成抑制率分别为(15.2±3.3)%和(21.4±2.4)%,与溶剂组相比,均有统计学意义(p<0.01,p<0.001),说明VEGFR1D2-Fc有显著的抑制血管形成作用。给药量在4.4ng至44ng的范围内,VEGFR1D2-Fc对斑马鱼血管形成的抑制率随着给药量的增加而增加,呈现抑制血管形成的VEGFR1D2-Fc给药量依赖性。
正常的斑马鱼肠下血管一般有完整的6-8根,若血管形成被抑制,则完整的肠下血管数目减少。4.4ng VEGFR1D2-Fc的斑马鱼完整肠下血管数为5-6根,14.7ng VEGFR1D2-Fc的斑马鱼完整肠下血管数为3-4根,44ng VEGFR1D2-Fc的斑马鱼完整肠下血管数为2-3根;这样也定性地说明了VEGFR1D2-Fc有抑制血管形成作用(图6)。
44ng VEGFR1D2-Fc的血管形成抑制率为(21.4±2.4)%,而44ng恩度的血管形成抑制率为(9.7±2.8)%;在同样的给药量(44ng)下,VEGFR1D2-Fc的抑制血管形成效果明显优于恩度(p<0.01)(图7)。
实施例6
VEGFR1D2-Fc可剂量依赖性抑制肿瘤细胞
利用本领域技术人员熟知的常规技术,混合以下组分,制得终浓度为1wt%重组蛋白溶液,其配方如下:
重组蛋白 10mg
生理盐水 加至10ml
调节pH至6.8-7.1。
给Balb/c裸鼠皮下注射5x106个肺癌(A549)或大肠癌(COLO-205)细胞,待肿瘤生长至130-170mm3时随机分组,治疗组分别腹腔注射高(20mg/kg)、低剂量(5mg/kg)的VEGFR1D2-Fc蛋白,每周两次,连续6次给药,阴性对照为PBS注射,阳性对照为阿霉素(3mg/kg)(大肠癌)或阿瓦斯汀(Avastin)(5mg/kg、20mg/kg)(肺癌)。每周两次测量肿瘤体积。
结果表明,高剂量时对大肠癌和肺癌的抑制率均达90%以上,而低剂量时对大肠癌的抑制率仍然达94%以上(如图10和11所示),对肺癌的抑制率达85%以上(如图8和9所示)。
实施例7
VEGFR1D2-Fc的药代动力学分析
对16只正常Balb/c小鼠分别皮下注射50ugVEGFR1D2-Fc,并分别于注射后的1、2、4、8、24、48、96、及144小时通过眼雌静脉采集血浆,用ELISA方法检测血浆内VEGFR1D2-Fc的含量。结果表明,VEGFR1D2-Fc的血浆半衰期至少可达5天(120小时)(如图12所示)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1.一种融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所述结构:
C-A-B (Ia),或
C-B-A (Ib)
其中,
A为包括血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR1)第二膜外区D2的蛋白元件,并且元件A的长度为94-103个氨基酸;
B为免疫球蛋白元件;
C为任选的信号肽序列;
“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。
2.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述D2具有侧翼序列,所述侧翼序列包括:
位于D2氨基端的第一侧翼序列;和/或
位于D2羧基端的第二侧翼序列。
3.如权利要求1所述融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白具有以下特性:
a)与VEGF的结合活性ED50=50-200pM;
b)可阻断VEGF诱导的VEGFR2磷酸化;
c)可阻断VEGF诱导的体外或体内血管形成;
d)可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭;和
e)血浆半衰期≥5天。
4.一种蛋白二聚体,其特征在于,所述的二聚体由两个权利要求1-3中任一所述的融合蛋白形成。
6.一种分离的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。
7.一种载体,其特征在于,它含有权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞,其特征在于,它含有权利要求7所述的载体或基因组中整合有权利要求6所述的多核苷酸。
9.一种产生蛋白的方法,其特征在于,它包括步骤:
在适合表达的条件下,培养权利要求8所述的宿主细胞,从而表达出权利要求1所述的融合蛋白;和
分离所述融合蛋白或由所述融合蛋白形成的二聚体。
10.一种药物组合物,其特征在于,所述组合物包含:
权利要求1所述的融合蛋白和/或权利要求4所述的蛋白二聚体,以及
药学上可接受的载体。
11.如权利要求1所述的融合蛋白和/或权利要求4所述的蛋白二聚体的用途,其特征在于,用于制备治疗疾病的药物。
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