PT1484338E - Métodos e composições para inibição do crescimento de células neoplásicas. - Google Patents

Description

ΕΡ 1 484 338 /PT

DESCRIÇÃO "Métodos e composições para inibição do crescimento de células neoplásicas"

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a métodos e composições para inibição do crescimento de células neoplásicas. Em particular, o presente invento refere-se a composições antitumorais e métodos para o tratamento de tumores. 0 presente invento refere-se ainda a métodos de pesquisa para identificação de compostos inibidores do crescimento, p. ex., antitumorais.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Os tumores malignos (cancros) são a segunda principal causa de morte nos Estados Unidos logo após as doenças cardíacas (Boring et al., CA Cancel J. Clin., 43:7 [1993]). 0 cancro caracteriza-se por um aumento do número de células anómalas ou neoplásicas derivadas de um tecido normal que proliferam para formar uma massa de tumor, pela invasão de tecidos adjacentes por essas células neoplásicas de tumor e pela geração de células malignas que eventualmente se espalharão através do sistema sanguíneo ou linfático para nódulos linfáticos locais e para localizações distantes (metástase). Num estado canceroso uma célula prolifera em condições sob as quais células normais não cresceriam. 0 cancro manifesta-se numa grande variedade de formas caracterizadas por diferentes graus de invasão e agressividade.

Apesar dos avanços recentes na terapia do cancro, existe uma grande necessidade de novos agentes terapêuticos capazes de inibir o crescimento de células neoplásicas. Assim, é um objectivo do presente invento identificar compostos capazes de inibir o crescimento de células neoplásicas tais como células de cancro. 2

ΕΡ 1 484 338 /PT WO 00/37284, WO 00/68380 e WO 00/69884, que foram publicados depois da data de apresentação, relatam a identificação de sequências semelhantes à de PRO320, aqui divulgada.

SUMÁRIO DO INVENTO A. Concretizações O presente invento refere-se a meios para o tratamento de tumores, incluindo cancros, tais como cancro da mama, da próstata, do cólon, do pulmão, do ovário, renal e do SNC, leucemia, melanoma, etc., em pacientes mamíferos, de preferência humanos. O presente invento refere-se a meios para o tratamento de um tumor num mamífero compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido PRO320 ou de um seu agonista, tal como definido nas reivindicações. O tumor é de preferência um cancro.

Noutro aspecto, o presente invento refere-se a um método in vitro para inibição do crescimento de uma célula tumoral compreendendo exposição da célula a uma quantidade eficaz de um polipéptido PRO320 ou de um seu agonista, tal como definido nas reivindicações. Numa concretização particular, o agonista é um anticorpo agonista anti-PRO320.

Numa concretização, o presente invento utiliza um anticorpo agonista anti-PRO320.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID NO:l) de um ADNc contendo uma sequência nucleotídica codificando PRO320 de sequência nativa, em que a sequência nucleotídica (SEQ ID NO:l) é um clone aqui designado como DNA32284-1307. Também apresentadas a cheio e sublinhadas estão as posições dos respectivos codões de início e de terminação. A Figura 2 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:2) de um polipéptido PRQ320 de sequência nativa 3 ΕΡ 1 484 338 /PT derivado da sequência de codificação de SEQ ID N0:1 mostrada na Figura 1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 termo polipéptido ou proteína "PRO320", quando aqui utilizado, engloba polipéptidos PRO320 de sequência nativa e variantes de PRO320 (que são mais bem definidas aqui) . 0 polipéptido PRO320 pode ser isolado a partir de uma variedade de fontes, tais como de tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou preparados através de métodos recombinantes e/ou sintéticos.

Um "PRO320 de sequência nativa" compreende um polipéptido possuindo a mesma sequência de aminoácidos que o polipéptido PRO320 derivado da natureza. Tal polipéptido PRO320 de sequência nativa pode ser isolado a partir da natureza ou pode ser produzido através de meios recombinantes e/ou sintéticos. 0 termo "PRO320 de sequência nativa" engloba especificamente formas de ocorrência natural, truncadas ou segregadas (p. ex., uma sequência do domínio extracelular), formas de ocorrência natural variantes (p. ex., formas de processamento alternativo) e variantes alélicas de ocorrência natural do polipéptido PRO320.

Numa concretização do presente invento, o polipéptido PRO320 de sequência nativa é um polipéptido PRO320 de sequência nativa maduro ou de comprimento completo tal como mostrado na Figura 2 (SEQ ID N0:2). Também, embora seja mostrado que o polipéptido PRO320 divulgado na Figura 2 (SEQ ID N0:2) começa com o resíduo de metionina aí designado como aminoácido da posição 1, é conceptível e possível que outro resíduo de metionina situado a montante ou a jusante do aminoácido da posição 1 na Figura 2 (SEQ ID N0:2) possa ser empregue como resíduo de aminoácido de início para o polipéptido PRO320. 0 "domínio extracelular" ou "ECD" de um polipéptido aqui divulgado refere-se a uma forma do polipéptido que é essencialmente isenta dos domínios transmembranares e citoplasmáticos. Vulgarmente, um ECD do polipéptido terá menos de cerca de 1% de tais domínios transmembranares e/ou 4

ΕΡ 1 484 338 /PT citoplasmáticos e, de preferência, terá menos de cerca de 0,5% de tais domínios. Entender-se-á que qualquer ou quaisquer domínios transmembranares identificados para os polipéptidos do presente invento são identificados segundo critérios rotineiramente empregues na especialidade para identificação desse tipo de domínio hidrófobo. Os limites exactos de um domínio transmembranar podem variar mas muito provavelmente em não mais de cerca de 5 aminoácidos em cada uma das extremidades do domínio tal como inicialmente identificado e como mostrado nas figuras anexas. Como tal, numa concretização do presente invento, o domínio extracelular de um polipéptido do presente invento compreende os aminoácidos 1 a X da sequência de aminoácidos madura, em que X é qualquer aminoácido dentro de 5 aminoácidos de ambos os lados dos limites do domínio extracelular/domínio transmembranar. A localização aproximada dos "péptidos de sinal" dos vários polipéptidos PRO aqui divulgados é mostrada nas figuras anexas. Nota-se, contudo, que o limite C-terminal de um péptidos de sinal pode variar, mas muito provavelmente em não mais de cerca de 5 aminoácidos de cada lado do limite C-terminal do péptido de sinal conforme inicialmente identificado aqui, em que o limite C-terminal do péptido de sinal pode ser identificado segundo critérios rotineiramente empregues na especialidade para identificação desse tipo de elemento da sequência de aminoácidos (p. ex., Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6, 1997 e von Heinje et al., Nucl. Acids.

Res. 14:4683-4690, 1986). Para além disso, reconhece-se também que, nalguns casos, a clivagem da sequência de sinal a partir de um polipéptido segregado não é inteiramente uniforme, resultando em mais de uma espécie segregada. Estes polipéptidos maduros, onde o péptido de sinal é clivado dentro de não mais de cerca de 5 aminoácidos de cada lado do limite C-terminal do péptido de sinal tal como aqui identificado, e os polinucleótidos que os codificam, são contemplados pelo presente invento. "Polipéptido PRO320 variante" significa um polipéptido PRO320 activo (diferente de um polipéptido PRO320 de sequência nativa) tal como definido abaixo, possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos 5

ΕΡ 1 484 338 /PT com a sequência de aminoácidos de (a) resíduos 1 ou cerca de 22 a 338 do polipéptido PRO320 mostrado na Figura 2 (SEQ ID N0:2), (b) X a 338 do polipéptido PRO320 mostrado na Figura 2 (SEQ ID NO: 2), em que X é qualquer resíduo de aminoácido de 17 a 26 da Figura 2 (SEQ ID N0:2), ou (c) outro fragmento especificamente derivado da sequência de aminoácidos mostrada na Figura 2 (SEQ ID N0:2).

Tais variantes de PRO320 incluem, por exemplo, polipéptidos PRO320 em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados ou suprimidos do terminal N ou C, bem como dentro de um ou mais domínios internos da sequência nativa.

Normalmente, uma variante de PRO320 terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 81% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 82% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 83% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 84% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 86% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 87% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 88% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 89% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência de aminoácidos e 6

ΕΡ 1 484 338 /PT ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com os resíduos (a) 1 ou cerca de 22 a 338 do polipéptido PRO320 apresentado na Figura 2 (SEQ ID N0:2), (b) X a 338 do polipéptido PRO320 apresentado na Figura 2 (SEQ ID N0:2), em que X é qualquer resíduo de aminoácido de 17 a 26 da Figure 2 (SEQ ID N0:2), ou (c) outro fragmento derivado especificamente da sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2 (SEQ ID N0:2).

Os polipéptidos PRO320 variantes não abrangem a sequência do polipéptido PRO320 nativo. Normalmente, os polipéptidos PRO320 variantes têm pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, frequentemente pelo menos cerca de 20 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 30 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 40 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 50 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 60 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 70 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 80 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 90 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 100 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 150 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 200 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 250 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 300 aminoácidos de comprimento, ou mais.

Tal como mostrado abaixo, a Tabela I proporciona o código-fonte completo para o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. Este código-fonte pode ser rotineiramente compilado para utilizar num sistema operativo UNIX para proporcionar o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2.

Adicionalmente, as Tabelas 2A-2D mostram exemplificações hipotéticas para utilizar o método abaixo descrito para determinar a % de identidade de sequência de aminoácidos (Tabelas 2A-2B) e a % de identidade de sequência de ácido nucleico (Tabelas 2C-2D) utilizando o programa de computador 7 ΕΡ 1 484 338 /PT de comparação de sequências ALIGN-2, em que "PRO" representa a sequência de aminoácidos de um hipotético polipéptido PRO320 de interesse, "Proteína de Comparação" representa a sequência de aminoácidos de um polipéptido contra a qual o polipéptido "PRO" de interesse está a ser comparado. "PRO-ADN" representa uma sequência de ácido nucleico hipotética codificando o PRO320 de interesse, "ADN de Comparação" representa a sequência nucleotídica de uma molécula de ácido nucleico contra a qual a molécula de ácido nucleico "PRO-ADN" de interesse está a ser comparada, "X", "Y" e "Z" representam cada um diferentes resíduos de aminoácidos hipotéticos e "N", "L" e "V" representam cada um diferentes nucleótidos hipotéticos.

Tabela 1 /*

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ΕΡ 1 484 338 /PT /· ·/

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ΕΡ 1 484 338 /PT Ρ Neeileman-WeijA alignmeni program » ' usage: prog» Tilei Tde2 * where Tilei aad Tile2 are iwo dna «r lm> proiein scquences. * The sequencei cie be ia uppcr- ar lowcr<Mt an may cnniain ambiguhy * Any lines beginxing wiih *;*.' >' or ‘ <' arc ignortd * Max Tile lenglb b 63535 Oimited by unsigntd short * io ih* jrnp jiruei)

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* Original versioo dcvelopcd under BSD 4.) on a vax 3650 V fflndude “nw.h'

Mnclude *day.h* ítatlc dbval|2i] = { 1.14,2,13,0,0.4.II.0.0.I2.0.3.I5.0.0.O.5.M.8.7.9.0.10.0 }; ítatlc _pbval[2í] ·= { l, 2|{K <(*D‘-’A'))I(I < <(’N - A·». d. B. 16. 32.6*. 128,255, OxFFFFJTF. 1<<10. K<ll. IC <12.1 < <13, l<<14, 1 << 15, !<<I6.1<<17, I<<18. I< <19. 1<<20, l<<21, l<<22, I < <23.1 < <24, 1 < <2S|(I < <(Έ···Α'»|(1 < <CQ*.iA')) ); roain nuin(ac, av) mt ac; char *a»0: { prog e av[0|; IT (ac I = 3) { fpiiml(aden,*us>gt: %s filei fite2Vn*. prog); fprintf(siderr,’vtiere tilei and fllc2 are two dna ortvo pratein sequencex.Vn'); fpriiuf(u<lerr.~The sequences can be io uppcr- or lowcr-caseto’); fpriraf(jtderr,'Ary lines begiiming whh ’;· or · < ’ are ignoredVn*): fpiintfUiden,'Output Is ín lhe Tile \*align.out\*\n*); e»b(l): } namexfOJ » av|l); namex[l] = a*P); seqx[01 - geneq(iumtx(0|. AlenO); scqx|l| » getseq(iumex(lj. Ateai); xbm “ (dn>)7 .dbvsl: .pbval;

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ΕΡ 1 484 338 /PT /* da lhe alígnmeni. reium besi scort: nuiiio * dm: valees in Fitch and Smith. PNAS, HO, 1182-1386. 1981 *pro: PAM 250 valws * When sccrts gre equal. wt prefei miunaiches to any gap. prtfer * a eew gap lo eatending an ongoing gap, and pierer a gap in seqx Mo a gap in scq y.

V n*0 nw ehtf *p». *py; /* seqs and ρπχ ·/ int- •nddy. ‘dely; 1* Keep tradt of dely V int ' ndelx. delx: /*keep rock of delx */ int •ιηφ: /♦ (oi swapping rowO. rowi */ int mis; /· aeore for cach lype V int insO, insl; /· inseitioo penal lies */ rcgbter id; /* diagonal índex '1 rcglster ij: /* jmp índex ·/ rtglster •c«10,*eoll; /· sçore for curr. last row ·/ rtglster **.W /· índex inlo seqa V di = (itrucl dbg ‘Jg^altocCto get diags", tenO+leol-l-1. six«ef(itnict djag}); { nddy = (Int *)g_calloe(*io gel ndely", leni + 1, xíte»f(lnt)): dely a (Int *)g_cnlli>c(’io get dely*. Ienl+1, sãzeofQnt)); celO a (Int ')g_calIoc(*to get coto*, leni 41, sizeof(inl)); coll = (Int *)g callocfio get coll*. lenl + l. si«cf(íní)); insO = (dna)? DINSO: P1NSO; iosl » (dm)? DINS1 : PINSI; smu = -10000; 1? (enjgaps) { for (co!0[0) e dely(0) = -insO,yy =» I; yy <= leni;yy+ +) ( eolO[yy) - dely[yy) = eo)0(yy-l] - ira); ndelyby) = yy; > co)0|0] » 0; I* Wateraun Buli Malh Bie) 84 >/ > tUe for (yy ·= 1; yy < = leni; yy++) dely|yyl ” -insO; /· fill in nuteh mairix ·/

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ΕΡ 1 484 338 /PT ...nw for <py a seq*|l), yy = l;yy <= lesil:py++,yy+e·) { mis = co!0|yy-l|, lf fdna) mis 4- = <ibml,p*-'A,J&»bm(*py- A ))? DMAT : DMIS; el» mi; + = _dsyl*P*-A)|*py-A); /* update penalty for del in x seq; * favor new dei o ver oagong dei * ignore MAXGAP if weighting endgaps •f if (endgaps f | ndelylyy) < MAXGAP) { if (eolOlyyJ - insO > = dety|yy)) { de)y[yy) = colOlyy] · (insO+insl); ndelyly] = I; )ebe{ delylyy) -*» insl; ndely(yy]++; > }elst{ if (wlO[yy) · (insO+insl) > = delylyy]) { delylyy) = cnlO[yy) - (insO+insl); nddytyy] => I; } eise «delylyy]++; ) /* update penaliy for del in y seq; * favor new del over ongong del ·/ lf (endgaps 11 odelx < MAXGAP) { if (eolllyy-l) - insO > c delx) ( delx = coll(yy-l) - (insO+insI); ndelx I: )the{ deb insl; ndelx+ + ; } )ebe{ if (colllyy-l| - (insO+insl) > = delx) { deb - ooll[yy-l]. (insO+iajI); ndeb = 1; ) (be ndeb-f +: ) /* pick the maxímum score; we’re favoríng * mis over any del and delx over deiy ·/ 12

12 ΕΡ 1 484 338 /PT „.nw id = u - yy 4 leni * I; lí (mli > = delx AA mis > = delylyyl) colljyy) = mis: else If (deli > = delylyy]) { toll(yy] = delx: ij a dx(id].ijmp:

if (dx(id].jp.n(01 && (ídna 11 (ndelx > » MAXJMP AA xx > dx|id).jp.*tU1+M50 || mis > dx[id).4cert4DINS0)) ( dx(id|.ijflip4 +; lf(4 4ij>o MAXJMP) { writejmpstid): ij « dx(id).ijmp = 0; dx(id].offsei = offset; offeet 4 = rótor(3iact jmp) 4 staeof(«ITsei); ) ) dx[id).jp.n|ij) « ndelx; dx(id].jp.*Iijl = xx; dx[id].scúrt o delx; > da { colllyy) =* delylyy]; ij = dx[id).ijmp;

if (dxlid) jp.nJO) &£ (Idna 11 (ndely(yy] > - MAXJMP AA xx > dx(id|.jp.xtij|+MX) 11 mil > dx(id) j«re+D1NS0)) { difid].ijmp+ + ; ir(++U >=» MAXJMP){ wrilejirpsfid); ij = <tx|id).ijinp » 0; dx|id|.offset » cffsel; o ff sei 4 o siztof(stnKt jmp) 4 sbeoltaffjcl); > ) di[id].jp.n[ij) = -ndelylry): dx[id].Jp.x(lj) o xx; dx[id).score o delylyy]; if (xx oo IcnO&Ayy < leni) { /Masicol •f if (endgxpi) colllyy) -o iiuO4ijul*0*n>-yy): ir (colllyy] > M { enux = coli|yy); droxx = id; ) > ] tf (endgaps &£ u < tenO) colllyy-l] *° miO-f ίωI•(IcnO-xx); if (coll(yy-l) > smax) { snux = colllyy-l|; dmax 3 id; tmp a colO: coU> ° cnll; còH » imp; > (vold) fieettchar *)nde)y); (»old) fieeftchar *)dely); (rold) ffcc((diar *)colO); (Toií) fiee((diai· *)cnll); > 13

ΕΡ 1 484 338 /PT /* » piiatO - only roininc aitible outside thij module m * Slltif.

* getmatO - trace back besi path. ctmni maiches: primO

* pr_alignO - prini alignmenl ol descri bed in array p|): pimtO

* dumpblockO - dump a block of lincs with numbcrí, ttars: pf alignO

* rnimsO · pvt out · numher line; dumpblockO

* putlineO - pio out a linc (nime, (num), scq, |num|): dumpblockO

* sursO - rpul a linc of stare: dumpblockO

* SlripnimeO - strip any path and prtfia from a seqnaine •I

dinclude *nw.h* fátímt SPC I //define P_UNE 256 /· maiiimim oulpui line ·/ «define P^SPC 3 /* space hetween name t» num and set) */ extern _day|26)[26); int olen: FILE *fx: /* set output line length V /· output file ·/ print

printO í int U, ly, firstgap, laugap; /* ovctlap */ if (ffx = fopenCofilt. ’w')) => = O) ( í)rintf(stdert.‘Sj: can't wrhe SstiT. prog. ofile); deamipO): ) fprimf(fs. '<first sequente: Ss Otngth = %d)\n\ namulOI. lenO); fprimíirx. *<secondset]uence: fc (lengtb = %d)3n\ namti(l), leni); olen = 60; lx = lenO; ly “ leni; fimgip = laatgap » 0;

If (dmae < leni -1) { f* leading gap in x *I pp[0)jsyc o firstgap u leni - dmax - 1; ly ·» MOJ.spc; ) eue If (dma* > leni -1) ( /» leadisg gap in y */ ppllj.spc =» firstgap = dmax - (leni -1); lx-= ppPJspc; )

If (dmaaO c lenO -1) ( /* tniling gap ma*/ lastgap = lenO - dmaaO -1; la - = lastgap; ) «lse lf (dmaaO > lenO ·>>(/* Irailing gap in y V lastgap a dmaaO - (lenO -1); ly -= lastgap; ) geimai(la, ly, firstgap. lastgap); pr aJigflO: } 14

ΕΡ 1 484 338 /PT /·

'trace baci lhe ben palh, couni matehts V statlc < gímtatfl». Ijr. firatgap, lastgap) Ini ix, ly; /· 'core* (minus endgaps) ·/ Int firslgap, lastgap; /· leading trailing overlap V In! nm. iO.il, suO, sizl; chsr outx|32J; doufcte pet; registar nO. nl: nglstcr dar *p0, *pl; getreat /* get total matches, seore ·/ 0 = M = SÍlO = SÍ2l = 0; pO *» se^a|0) + pp|l).spe; pl = setpll) + pp|0J.spc; i>0 =» pplll^pc + I; nl = pplOJ.spe 4- I; nxn =0: whlle(*pO*& *pl ){ if (siiO> { pi + +: nl + +; sliO-; > die If (sizl) { po++: n0++; sizl—; > d» { ΙΓ (»bm|*(0-"A‘JA*bntl*pl-‘A')) nm++; if («t0++ = = pp[0).*[iOJ) lirO = ppl0).nli0++ J;

if („1 + + pp[l].«{ÍID sizl = pp(l).n(il + +); pO+-f; pl++; > ) /*pethomology: * if penaliiing endgaps, base is tht shoner stq * elie. knock o ff ovcrtungi and lake shoner core ·/ ΪΓ (endgaps)

Ix = (lenO < leni)? lenO ; leni; tbt

Ix = (ta c ly)? li: ly; pet “ 100.*(dsuble)nm/(doyble)lx; fprintfffx. "In·); fj)rintf(íx, * < %d matchSs in an overlap of 55 d: 55.2fpereem similarilyln*, nm. (nro “ = 1)? ": ’es*. U. pei): 15

ΕΡ 1 484 338 /PT fprintfrt», ‘<gaps infirst scqemcc: %d‘.gapa): ...gétmat if(gap«)( (vold) sprmif(ouix. ‘ (Rd %lSSs)'. ngapr, (diu)? 'bjseVrtiidue*. (ngipx q a 1)7 **;·}·); fpiimftfx.· 8s". ouix); fprintf(fj,gapi in seaind sequente; ftd\ gapy); if(í>py){ (vold) spriatflouu,' (Rd R$%s}\ ngspy. (dna)7 "baseVicsidue*, (ngipy == 1)? fprmif(fx.‘Ss*. oulx): }

If (dm) fpnmfXf». '\n<score: %d (matth e Sd, mismatch ^ %d. gap pcnalry = %á + %d pcrbase)\n“, smu, DMAT. DMIS. DINSO, DlNSl); cise (printflfx. •\n<score: Sd (Dsyhoff PAM 250 mstrix, gap peruliy o Rd + Rd per itsidue)Vn*. ,mJX.PlNS0, PINSI):

If(emlgaps) fprinifffx. '<endgapspenslii«l. lefi endgap: Rd %i%s. righl endgap: Rd Rs%s\n‘, firsgap. (dia)? ‘base1 ; “residue*, (fintgap = " »7 " : *$“,

Uxlgap, (dna)? "buc"; ‘residuc’, (lastgap == 1)7 " ; 'j'); elsc rprintfCr*, ‘ <endgaps r»t peMliiaftn*); static nm: /* matehci in ene - for cheeging ·/ statk lmax: /* lengdu of stripped file nunes »/ siatlc UP1; /· jmp imfcx for a palh ·/ statk ncP): f* number M slart of curreiu line */ static niPI; ;· cvrrent eltm number — for gapping ·/ sLatic xitP): static char •pMIl: ;· ptr «o turrem element ·/ statlc char •poP); l‘ ptrto nexl oulpul char slot ·/ statlc char muCHPJUNE]; /· output line */ static char siar(P_LWE]; /· sei by sursO ·/ /* * prirn alignrmni of desaibed tn slititl pitb ppO V statk pr_align0 λ Int nn; /· char count */ Int more; rvglster í; pr_align for (i = 0. Ima» » 0; i < 2: i++) ( nn o siripnune(iume>|Í]); 1Γ (nn > lmax) lmax = nn; mH = I; ni(i) ·= I; sit[i) » ij|i) = 0; pi(i) = stqxli]; po(i) = oul(i]; 16

ΕΡ 1 484 338 /PT ...praJign forfnn = nm = 0. more » I; more;) { for (i > more » 0; i < 2: i+ +) ( /· • do we hsve more of th ir Sequente? ·/ continue: more+ + : if (pptil-spc] ( /♦ leíding spacc ·/ *j>ofij+ + pplil.spc—: } clieif (sii|i]) ( / magap·/ *p»|i)+ + = sizH]-. ) «1m { /· we're putling a seq «temem

V •pofi) - if (islowcrt^slil)) •pslH ” touppcr('pi[iD; nofil++: psÍ0++; ;· • are we at oexi gap foi this aeq?

•I II (ni[i) == PpTi) iluIi)l) { /· • we need u merge all gaps * at Ibis location ·/ íialil = pp[i).n|ij[l] + +); whlte (nilQ = = ppliJiIijlOJ) lilfi) ♦ = pp(i]-n(ij[il+ +|; > ni|i]++: > > lf(++nn = * olen || imore &&m) { dumpblockQ: for fi => O: i < 2; i*+) poli) = tiutli); nn = O: ) ) } /·

• dump a bludt cf Imes, including ramberj. siars: pr,align0 V statk dutnpblock

dOmpblocJtO { reglster i: for (í a 0; I < 2; í ++) •poli)- e '\0‘: 17

ΕΡ 1 484 338 /PT .dumpblock (void) putcfUi'. fj); for (> 0: i < I:i++) { ΙΓ (*flutli) íiít (*oiii|i)! = ‘ '11 ‘(pol® ! = '')) { if (i = o 0) mimsfi); if<i== 0ΛΛ *001(11) uarsO; piulínt(i);

If Ci == 044 *oai(IJ) fprin',((ÍA. siai): if(i == 1) nunu(i); > ) }

/· * pui crat a number line: dumpblockO V siatic nurmfa) int íz: /* índex m oul|] Holding seq tine *i { Aar nlinc[P_LINEJ; rcgUter i.j: reglntr char >. *P». *PT nums for (pn » nline. i « 0; i < Imez+PSPC: . pi>++) *pn« for (í « Rc(á). py =* oraja); *py; py++, pn+ +) { lf (*py ae · ' j| *py *-·) *pn * * ’; d» { if(i*IO==0|| (i "= 1 liA.ne(u| !*= |» { j = (i < 0)’ -i: i: for (p« <= pn; j; j I= 10. pn-> •pi<=j»IO+ '0'; if(i <0) *px «* ) «fe< *pn “ "·- i++; ) } •pn « Λ0'; nc(iij = i; for (pn a nline; *pn; pn+ +) (void) putc(*pn, fx); (void) ρικεΙΛη’» ft): } /·

' p<u out a line (namc, [num], stf|. [mim]): dumpblockQ V slatic puiline(ii) inl ix; { putline 18

ΕΡ 1 484 338 /PT ...putline inl i; rcgbttr cbar *pi; for (px b naroei|ii). i = 0; *px&& *px 1“ ’:';ρχ·*·+, i4 ♦) (vold) pute(*p», fl); for (; i < Imax+PSPC; i+ +) (wld) putcffx); I* ihtse coum fram 1: * ni[| is (urrem etemeni (from 1) • κΠ i« number at surt of currcni lint

V for (px = out[ix): *px; px4 +) (v«d) pulc(’pxdt0x7F, fx); (»old)puic('\n·, fi); > /* * put a linc of sian (seqi always In out|0), out(l)); dumpblockO •t xtallc «arcO stars {

Inl í; rtgbur char *p0, *pl.ci, *px; lf (!*oui|0) || (·οοΙ|0) == " ** -(pofOX) = = ' ) || t*oui[]] 11 (*oui|l) =>= · '&& *(po(l)) == ·)) rttum; px b slar; for Π « lmox-t-P_5PC; I; P) *px+ + = ' for (pO o out|0]. pl = omfl): *p0 AA ·ρΙ;ρ0+4, pl++J{ tf (iulpha(*p0) Λ& iulph»(*pl)) { lf <xbm[*pO-’A')*xbm|*pl- A J) { cx = ·*·; > dtt lf fidnx AA .dxy[*pO-'Al|*pI- A·) > 0) cx b <lx« cx =" > ebe ti s *px+ + = ex; } •px+ + a An'; •px » AO*; > • xirip parti or prcfix from pn, rcivim len: pr ílignO ·/ futie $trtpmme(pn) 5trípname thar *pn; /· file name (may be parti) *f < rtgbler cbar *px. *py; py = ft for (px b p»; *px; px++) lf('px ==T) py = px + I; if(py) (roíd) Jtrcpyfpo, py); rclum(strlen(pn»; ) 19

ΕΡ 1 484 338 /PT /* * deamipO - eteamip any imp file * gctteqO rtad ii> uq. mi dna, len. toulett * g_C3llixO ·· calIncO wilh «rui dudcin * leadjmpsO - gei the good jmpi. frem imp fite if neceiuty * wriíqmpsO - wriíe a íillcd array uf jmps to a tmp file: nv»0 ·/ finchide 'nw.h* /ftodude <.rya/file.h> char *jnaine = Vimp/tiomgXXXXXX': FILE Tf. ínt cleanupf); long laeekO: /· * remnvc any tmp file if we blow V dcsmipfi) ini i; < if(0) (vold) unttnkljTume); > /* * read, rctum ptr to scq, sei duo, len, maileo * sfcip tina muing w«h '·/, *<*,or*>* * stq m upptr or towtr ca» V char · geueq(file, leo) char "file; l* file fuarc */ Int *)en; /* scqlen ·/ { char 1012(1024), *piq; rcgister char p*. ‘w; ínt naigc, tlen; RLE tf (<fp = fupe»{fitc, V» - - 0) { fpriraf(uderí,-Si: on i retd %s\n\ prog, nie); e*it(l);

/· imp file for jmpj V

/· deanup ισφ fila T deanup B«sw| > den “ natgc » 0; wfade (fgcuftirc- 1024. fp}) í

IfClint II Mine == || ·Ιιμ ==. ·>·) continue; for (pn ta linc, ·ρχ != ’\n'; pa-M-) if(inqiper(*px) || ialowerfp»)) if «pseq = malloc((uiu[gnt<lt(llen+d))) == 0) { fprintf(íiderr,'Ss; mallocO fáiled to get Bd byttj for Si\o\ prog, tlen+« file)· uit(l): } psrq|0) = psnq|IJ = p5M)|J| = p«cq|3J - ‘'0';

20 ΕΡ 1 484 338 /PT py = p*q +»: •leu s Utn: rewindffp): whlle (fgesfline, 1024, fp}> { if (Mine fsr (px ...getseq >} •py++ = Λ0': •py = ΛΟ'; (void) fdoit(fp): diu - natgc > (tlcn/3); retuni(psa)+4);> *h»r · g_dllac(TOg, nx, si) || Mine =- || Mine = = >) conlimii; line; *px!- '\n‘; px-M-) { ff (isvppcr(*px)) l«,xi α ·η«· YJ · Γ· else If (Blowcr(*pi)) •py++ = touppcr(*px): íf (imfcx(’ATGCU'.*(py-1))) nelgc++:

Aar •mjg; /· pregram. talling routine ·/ int tu, sz; /* nuisber and sue of clcmtms ·/ thar •p*. *»Uoc0; if((px ~ eellocUnnsignedliu, (unsigntd)sxB O) ( if(*msg)( g_calloc fprintfjsldfrr. "$*: gjallerO faifcd *i (n=5td, prog, msg.)} muni(pi);) r· * jct final jmps írom tfxf) or trop file, set ppQ* reset dnux: mainQ ·/ readjmpsO { Jof fâ ® -J; tnl siz, ιΟ, íl; »£g»(£r «(©{ (void) fcIue(Q); If {(fd = open(iiume, O.RDONLY. 0)) < 0) ( fprintflsiderr. "Ss: ean'l openQ %iin\ piog, jnarae); deanupfl);} for (i = iO b il = 0. dmuO = dnux. *x = lenO:; i++) ( whlle (I) { for (j = dx(dmax).ijmp: j >»0 && dxldtaax).jp.x(j) > « xx; j··) nx, sz); rtadjmps 21

21 ΕΡ 1 484 338 /PT -..readjmps tf g c 0 A&dsldmaxl.offst» && I}) { (vold) IstcWW. dxldmaxj.offiei. 0); (veld) readlld, (char *)&di|dmax).jp, sizeef[slrucS jmp)): (vold) read|fd, (chnr *)ifcdj|dinax)offset. siieof(di|dmxx].oirszi)); dx|dmix).ijnip = MAXJMP-I; ) cise brtak; )

If (i > = IMPS) { fpnmffsidtrr, '%>: ιοο many gaps in aligiuncnrtn*, prog): clMaup(l): } ir(j >= 0) ( siz = di[dmaz).jp.nljj; n = dx(dmax).jp.a(j|; dmax + = tiz;

If (sii < 0) { /* gsp in sccond seq */ pp|l|.rlil) = -siz; u + = siz; Ι·ϋ = xx - yy + leni -1 */ ppii(.*(iij “ xx-dmax + leni -1; gapy++; ngapy-= siz: /· ignore MAXGAP when doing cndgaps */ liz ^ (-siz c MAXGAP 11 cndgaps)? -siz : MAXGAP; il*+; > cl» if (siz > 0) { /» gap in firo scq ·/ ppIO).n(iO) o siz: ppioj.siiO) = xx: g»px++; ngapi »· = siz; /· ignore MAXGAP whcn doing cndgaps */ liz - (liz < MAXGAP 11 endgaps)? siz : MAXGAP; »++: > > else break; > /· reveree iht order of jmps *1 fcr 0=0. iO-:j < i0; j+4. ®-) { i = pp(0).nijU pp|0)zilj) = pp|0).n|i0): pplOl.nliO) = i: i o pp[0).xtj): ppioj.xlj] = ppi0).»|i0): ppI0).x[K)J = i; forO = 0.U-;j < il;j++.ii-){ i => ppm.nlj): PpDl nli) = pp)l).n|ill; ppill.nlil) = i; i - pp(l].x[j]; PpJiJ *ll) ppIU.xlil): ppIU.xlil) = i: } if(fd > - 0) (vnld) closi<fiJ): wmi (roli) unlinkOmme): 0-0; oITset = 0; ) 22

ΕΡ 1 484 338 /PT /·

wrilt a filled jmp sinm offiti of ihe pm <mt (ir any): nwO V wriiejitipi(i>) wrilejraps bil ix; char ·ιτ4ιωιρΟ; ir(mluunp(iiume) < 0) { fprinirjudcrr, "%!:can'« mkiempO SíVn", prog, jnamt); ctomipíl): lf <{fj » fopoi(jname. ’w*)) “= 0) { (primriatderr, "Is:c*n'i wriíB Bi\n‘.prOg, jnamc); e*i«l)i } (void) fwrile((cbar 'JAdJlijj.jp, jliMf(ímict jmp). I. fj); (vold) fwtitc<(ehar *)iid<Iix].offsel. ιίηβ[(ι1χ(Ιχ).οηΊα), l, (j); )

Tabela 2A PRO XXXXXXXXXXXXXXX (Comprimento = 15 aminoácidos)

Proteína de comparação XXXXXYYYYYYY (Comprimento = 12 aminoácidos) % de identidade de sequência de aminoácidos = (o número de resíduos de aminoácidos idênticos e na mesma posição entre as duas sequências de polipéptidos tal como determinado por ALIGN-2) a dividir por (o número total de resíduos de aminoácidos do polipéptido PRO) = 5 a dividir por 15 = 33,3%

Tabela 2B PRO XXXXXXXXXX (Comprimento = 10 aminoácidos)

Proteína de comparação XXXXXYYYYYYZZYZ (Comprimento = 15 aminoácidos) % de identidade de sequência de aminoácidos = (o número de resíduos de aminoácidos idênticos e na mesma posição entre as duas sequências de polipéptidos tal como determinado por ALIGN-2) a dividir por (o número total de resíduos de aminoácidos do polipéptido PRO) = 5 a dividir por 10 = 50%

Tabela 2C PRO-ADN NNNNNNNNNNNNNN (Comprimento = 14 nucleótidos) ADN de comparação NNNNNNLLLLLLLLLL - (Comprimento = 16 nucleótidos) % de identidade da sequência de ácido nucleico = (o número de nucleótidos idênticos e na mesma posição entre as duas sequências de ácido nucleico tal como determinado por ALIGN-2) a dividir por (o número total de nucleótidos da sequência de ácido nucleico PRO-ADN) = 6 a dividir por 14 = 42,9% 23

ΕΡ 1 484 338 /PT

Tabela 2D PRO-ADN NNNNNNNNNNNN (Comprimento = 12 nucleótidos) ADN de comparação NNNNLLLW (Comprimento = 9 nucleótidos) % de identidade de sequência de ácido nucleico = (o número de nucleótidos idênticos e na mesma posição entre as duas sequências de ácido nucleico tal como determinado por ALIGN-2) a dividir por (o número total de nucleótidos da sequência de ácido nucleico PRO-ADN) = 4 a dividir por 12 = 33,3%

Define-se "percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" relativamente às sequências de polipéptido PRO320 aqui identificadas, como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos numa sequência PRO320 após alinhamento das sequências e introdução de hiatos, caso necessário, para atingir a máxima percentagem de identidade de sequência e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. 0 alinhamento com objectivos de determinar a percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser obtido de vários modos que se encontram abrangidos pela perícia na especialidade, por exemplo, utilizando programas de computador disponíveis ao público tais como os programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na especialidade podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências em comparação. Para os presentes objectivos, contudo, os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos obtêm-se tal como descrito abaixo utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2, em que o código-fonte completo para o programa ALIGN-2 é proporcionado na Tabela 1. 0 programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 tem como autor Genentech, Inc. e o código-fonte apresentado na Tabela 1 foi apresentado com documentação para o utilizador no gabinete de direitos de autor dos E.U.A. ("U.S. Copyright Office"), Washington D.C., 20559, onde se encontra registado com o número de registo U.S. Copyright Registration, TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível 24

ΕΡ 1 484 338 /PT ao público através de Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código-fonte proporcionado na Tabela 1. 0 programa ALIGN-2 deve ser compilado para utilização num sistema operativo UNIX, de preferência UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

Para os presentes objectivos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma determinada sequência de aminoácidos A relativamente a, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B (que pode ser alternativamente denominada como uma determinada sequência de aminoácidos A que apresenta ou inclui uma certa % de identidade de sequência de aminoácidos relativamente a, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B), calcula-se como se segue:

100 vezes a fracção X/Y em que X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento efectuado por esse programa de A e B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Considerar-se-á que nos casos em que o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A relativamente a B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácidos de B relativamente a A. Como exemplos de cálculos de % de identidade de sequência de aminoácidos, as Tabelas 2A-2B demonstram como calcular a % de identidade de sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos designada "Proteína de Comparação" relativamente à sequência de aminoácidos designada "PRO".

Salvo especificado em contrário, todos os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos aqui utilizados são obtidos e descritos como descrito acima utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. Contudo, a % de identidade de sequência de aminoácidos pode também ser determinada utilizando o programa de comparação de sequências 25

ΕΡ 1 484 338 /PT NCBI-BLAST2 (Altschui et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). O programa de comparação de sequências NCBI-BLAST2 pode ser obtido em http://www.ncbi.nlm.nih.gov. NCSI-BLAST2 utiliza vários parâmetros de busca, em que todos esses parâmetros de busca estão estabelecidos em valores por defeito incluindo, por exemplo, "unmask = yes", "strand = all", "expected occurrences = 10", "minimum low complexity length = 15/5", "multi-_pass e-_value = 0.01", "constant for multi-_pass = 25", "dropoff for final gapped alignment = 25" e "scoring matrix = BLOSUM62".

Nas situações em que se utiliza NCBI-BLAST2 para comparações de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma determinada sequência de aminoácidos A relativamente a, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B (que pode ser alternativamente denominada como uma determinada sequência de aminoácidos A que apresenta ou inclui uma certa % de identidade de sequência de aminoácidos relativamente a, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B), calcula-se como se segue:

100 vezes a fracção X/Y em que X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências NCBI-BLAST2 no alinhamento efectuado por esse programa de A e B e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Considerar-se-á que nos casos em que o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A relativamente a B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácidos de B relativamente a A.

Adicionalmente, a % de identidade de sequência de aminoácidos pode também ser determinada utilizando o programa de computador wu-BLAST-2 (Altschul et al., Methods ín Enzymology, 266:460-480 (1996)). A maioria dos parâmetros de busca de WU-BLAST-2 são estabelecidos em valores por defeito. Os parâmetros não estabelecidos em valores por defeito, ou seja, os parâmetros ajustáveis, são colocados nos seguintes 26

ΕΡ 1 484 338 /PT valores: "overlap span = 1", "overlap fraction = 0.125", "word threshold (T) =11", e "scoring matrix = BLOSUM62". Para os presentes objectivos, o valor da % de identidade de sequência de aminoácidos é determinado pela divisão de (a) o número de residuos de aminoácidos com correspondência idêntica entre a sequência de aminoácidos do polipéptido PRO de interesse apresentando a sequência derivada do polipéptido PRO nativo e a sequência de aminoácidos de interesse de comparação (ou seja, a sequência contra a qual se está a comparar o polipéptido PRO de interesse que pode ser um polipéptido PRO variante) tal como determinado por WU-BLAST-2, por (b) o número total de resíduos de aminoácidos do polipéptido PRO de interesse. Por exemplo, na expressão "um polipéptido incluindo uma sequência de aminoácidos A que apresenta ou apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos relativamente à sequência de aminoácidos B", a sequência de aminoácidos A é a sequência de aminoácidos de comparação de interesse e a sequência de aminoácidos B é a sequência de aminoácidos do polipéptido PRO de interesse. "Isolado", quando utilizado para descrever os vários polipéptidos aqui divulgados, significa um polipéptido que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. De preferência, o polipéptido isolado está livre de associação com todos os componentes com os quais está normalmente associado. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interferirão tipicamente com as utilizações de diagnóstico e terapêuticas do polipéptido e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, o polipéptido será purificado (1) até um grau suficiente para se obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interna através da utilização de um sequenciador de copo rotativo ou (2) até à homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras utilizando azul de Coomassie ou, de preferência, coloração com prata. O polipéptido isolado inclui um polipéptido in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do PRO320 não estará presente. 27

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Vulgarmente, contudo, o polipéptido isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação. 0 termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-PRO320 (incluindo anticorpos agonistas), composições de anticorpo anti-PRO320 com especificidade poli-epitópica, anticorpos de cadeia simples anti-PRO320 e fragmentos de anticorpos anti-PRO320 (ver abaixo). 0 termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui se utiliza refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, ou seja, os anticorpos individuais constituindo a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores. 0 termo "marcado com epítopo", quando aqui utilizado, refere-se a um polipéptido quimérico compreendendo um polipéptido PRO320 fundido com um "polipéptido marcador". 0 polipéptido marcador possui resíduos suficientes para proporcionar um epítopo contra o qual pode ser produzido um anticorpo, contudo é suficientemente curto de modo a não interferir com a actividade do polipéptido com o qual se funde. 0 polipéptido marcador é também de preferência quase único de modo a que o anticorpo não reaja substancialmente de forma cruzada com outros epítopos. Os polipéptidos marcadores adequados possuem geralmente pelo menos seis resíduos de aminoácidos e normalmente entre cerca de 8 e 50 resíduos de aminoácidos (de preferência, entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácidos).

Tal como aqui se utiliza, o termo "imunoadesina" designa moléculas semelhantes a anticorpos que combinam a especificidade de ligação a uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efectoras dos domínios constantes das imunoglobulinas. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é diferente do local de reconhecimento e ligação ao antigénio de um anticorpo (ou seja, é "heteróloga") e uma sequência do domínio constante das imunoglobulinas. A parte adesina de uma molécula de imunoadesina é tipicamente uma sequência de aminoácidos 28

ΕΡ 1 484 338 /PT contígua compreendendo pelo menos o local de ligação de um receptor ou de um ligando. A sequência do domínio constante das imunoglobulinas na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos IgG-14, lgG-2, IgG-3 ou lgG-4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM. "Activo" ou "actividade" para os presentes fins refere-se a uma ou mais formas de PRO320 que mantenham uma actividade biológica e/ou imunológica do PRO320 nativo ou de ocorrência natural, em que a actividade "biológica" se refere a uma função biológica (inibidora ou estimuladora) causada por um PRO320 nativo ou de ocorrência natural diferente da capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigénico possuído por um PRO320 nativo ou de ocorrência natural, e uma actividade "imunológica" se refere à capacidade para induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigénico possuído por um PRO320 nativo ou de ocorrência natural. "Actividade biológica" no contexto de um anticorpo ou de outro agonista que possa ser identificado através dos ensaios de pesquisa aqui divulgados (p. ex., um pequeno péptido de molécula orgânica ou inorgânica, etc.) é utilizada para referir a capacidade e tais moléculas para invocar um ou mais dos efeitos aqui listados em ligação com a definição de uma "quantidade terapeuticamente eficaz". Numa concretização específica, "actividade biológica" é a capacidade para inibir o crescimento ou a proliferação de células neoplásicas. Uma actividade biológica preferida é a inibição, incluindo o abrandamento ou a paragem completa, do crescimento de uma célula tumoral (p. ex., de cancro) alvo. Outra actividade biológica preferida é a actividade citotóxica resultante da morte da célula tumoral (p. ex., de cancro) alvo. Ainda outra actividade biológica preferida é a indução de apoptose de uma célula tumoral (p. ex., de cancro) alvo. A frase "actividade imunológica" significa reactividade cruzada imunológica com pelo menos um epítopo de um polipéptido PRO320. 29

ΕΡ 1 484 338 /PT "Reactividade cruzada imunológica" tal como aqui se utiliza significa que o polipéptido candidato é capaz de inibir competitivamente a actividade biológica qualitativa de um polipéptido PRO320 possuindo esta actividade com anti-soro policlonal criado contra o polipéptido PRO320 activo conhecido. Tais anti-soros são preparados de modo convencional através da injecção de cabras ou coelhos, por exemplo, subcutaneamente com o análogo activo conhecido em adjuvante completo de Freund, seguido de injecção intraperitoneal ou subcutânea de reforço em adjuvante incompleto de Freund. A reactividade cruzada imunológica é de preferência "especifica", o que significa que a afinidade de ligação da molécula imunologicamente reactiva de modo cruzado (p. ex., anticorpo) identificada, para o correspondente polipéptido PRO320, é significativamente superior (de preferência pelo menos cerca de 2 vezes, sendo preferível pelo menos cerca de 4 vezes, sendo ainda preferível pelo menos cerca de 6 vezes e ainda de preferência pelo menos cerca de 8 vezes superior) à afinidade de ligação dessa molécula a qualquer outro polipéptido nativo conhecido. "Tumor", tal como aqui se utiliza, refere-se a todo o crescimento e proliferação de células neoplásicas, malignas ou benignas, e a todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.

Os termos "cancro" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem mas não se limitam a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cancros incluem cancro da mama, cancro da próstata, cancro do cólon, cancro de células escamosas, cancro das células pequenas do pulmão, cancro das células não pequenas do pulmão, cancro do ovário, cancro cervical, cancro gastrointestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro colorrectal, carcinoma do endométrio, carcinoma das glândulas salivares, cancro do rim, cancro da vulva, cancro da tiróide, carcinoma hepático, e vários tipos de cancro da cabeça e do pescoço. 30

ΕΡ 1 484 338 /PT "Tratamento" é uma intervenção efectuada com a intenção de prevenir o desenvolvimento ou de alterar a patologia de um distúrbio. Assim, "tratamento" refere-se tanto ao tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas. Os necessitados de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio bem como aqueles a quem se pretende prevenir o distúrbio. No tratamento de tumor (p. ex., cancro), um agente terapêutico pode diminuir directamente a patologia das células tumorais ou tornar as células tumorais mais susceptiveis a tratamento através de outros agentes terapêuticos, p. ex., radiação e/ou quimioterapia. A "patologia" do cancro inclui todos os fenómenos que comprometem o bem-estar do paciente. Isto inclui, sem limitação, crescimento celular anormal ou descontrolado, metástases, interferência com o funcionamento normal de células vizinhas, libertação de citocinas ou outros produtos de secreção a niveis anormais, supressão ou agravamento da resposta inflamatória imunológica, etc.

Uma "quantidade eficaz" de um polipéptido aqui divulgado ou de um seu agonista, em referência à inibição do crescimento de células neoplásicas, é uma quantidade capaz de inibir, até certo ponto, o crescimento de células alvo. O termo inclui uma quantidade capaz de provocar um efeito inibidor do crescimento, citostático e/ou citotóxico e/ou apoptose das células alvo. Uma "quantidade eficaz" de um polipéptido PRO320 ou de um seu agonista para fins de inibição do crescimento de células neoplásicas pode ser determinada empiricamente e de um modo rotineiro.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" em referência ao tratamento de tumor, refere-se a uma quantidade capaz de provocar um ou mais dos seguintes efeitos: (1) inibição, até certo ponto, do crescimento do tumor, incluindo abrandamento e paragem completa do crescimento; (2) redução no número de células tumorais; (3) redução do tamanho do tumor; (4) inibição (ou seja, redução, abrandamento ou paragem completa) da infiltração de células tumorais em órgãos periféricos; (5) inibição (ou seja, redução, abrandamento ou paragem completa) de metástase; (6) aumento da resposta imunitária antitumoral, que pode, mas que não tem de resultar 31

ΕΡ 1 484 338 /PT na regressão ou rejeição do tumor; e/ou (7) alívio, até certo ponto, de um ou mais dos sintomas associados ao distúrbio. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um polipéptido PRO320 ou de um seu agonista para fins de tratamento de tumor pode ser determinada empiricamente e de um modo rotineiro.

Uma "quantidade inibidora do crescimento" de um polipéptido PRO320 ou de um seu agonista é uma quantidade capaz de inibir o crescimento de uma célula, especialmente um tumor, p. ex., uma célula de cancro, in vitro ou in vivo. Uma "quantidade inibidora do crescimento" de um polipéptido PRO320 ou de um seu agonista para fins de inibição do crescimento de células neoplásicas pode ser determinada empiricamente e de um modo rotineiro.

Uma "quantidade citotóxica" de um polipéptido PRO320 ou de um seu agonista é uma quantidade capaz de causar a destruição de uma célula, especialmente de um tumor, p. ex., célula de cancro, in vitro ou in vivo. Uma "quantidade citotóxica" de um polipéptido PRO320 ou de um seu agonista para fins de inibição do crescimento de células neoplásicas pode ser determinada empiricamente e de um modo rotineiro. 0 termo "agente citotóxico" tal como aqui se utiliza refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa a destruição de células. Pretende-se que o termo inclua isótopos radioactivos (p. ex., I131, I125, Y90 e Re126), agentes quimioterapêuticos e toxinas tais como toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de um tumor, p. ex., cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem adriamicina, doxorrubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, citosina-arabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, bussulfano, citoxina, taxóides, p. ex., paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e doxetaxel (Taxotere, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Rnace), toxotero, metotrexato, cisplatina, melfalano, vinblastina, bleomicina, etoposido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorrelbina, carboplatina, teniposido, daunomicina, 32 ΕΡ 1 484 338 /PT carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (ver, Patente U.S. N.° 4675187), melfalano e outras mostardas de azoto aparentadas. Também incluídos nesta definição estão agentes hormonais que actuam regulando ou inibindo a acção hormonal em tumores tais como o tamoxifeno e a onapristona.

Um "agente inibidor do crescimento" quando aqui utilizado refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento uma célula, especialmente de um tumor, p. ex., uma célula de cancro, in vitro ou in vivo. Assim, o agente inibidor do crescimento é um que reduz significativamente a percentagem de células alvo em fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (num local diferente da fase S), tais como agentes que induzem a paragem em G1 e a paragem na fase M. 0 bloqueadores da fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vinblastina), o taxol e inibidores da topo II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido e bleomicina. Os agentes que param G1 conseguem também passar a parar na fase S, por exemplo, agentes alquilantes do ADN tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo e ara-C. Mais informações podem ser encontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo I, intitulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente a pág. 13. 0 termo "citocina" é uma forma genérica para proteínas libertadas por uma população celular que actuam sobre outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citocinas são as linfocinas, monocinas e as tradicionais hormonas polipeptídicas. Incluídas entre as citocinas estão a hormona do crescimento tal como a hormona do crescimento humana; hormona do crescimento humana N-metionilo e hormona do crescimento bovina; hormona paratiroideia; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormonas glicoproteicas tais como a hormona estimuladora do folículo (FSH), hormona estimuladora da tiróide (TSH) e hormona luteinizante (LH); factor de crescimento hepático; factor de crescimento de fibroblastos; prolactina; lactogénio 33

ΕΡ 1 484 338 /PT placentário; factor de necrose tumoral-α e -β; substância inibidora de muleriano; péptido associado à gonadotrofina de ratinho; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoeietina (TPO); factores de crescimento dos nervos tais como NGF-β; factor de crescimento de plaquetas; factores de crescimento transformantes (TGF) tais como TGF-a e TGF-β; factor de crescimento semelhante a insulina-I e -II; eritropoietina (EPO); factores osteoindutores; interferões tais como o interferão-α, -β e -γ, factores estimuladores de colónias (CSF) tais como o CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulócitos e macrófagos (GM-CSF); e CSF de granulócitos (G-CSF); interleucinas (IL) tais como IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; um factor de necrose tumoral tal como TNF-α ou TNF-β e outros factores polipeptídicos incluindo LIF e o ligando kit (KL). Tal como aqui se utiliza, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente activos das citocinas de sequência nativa. 0 termo "pró-fármaco" tal como aqui se utiliza neste pedido refere-se a uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente activa que é menos citotóxica para as células tumorais em comparação com o fármaco original e é capaz de ser enzimaticamente activada ou convertida na forma original mais activa. Ver, p. ex., Wilman, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy", Bíochemícal Society Transactions 14:375-382, 615th Meeting Belfast (1986) e Stella et al.,

Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, "Directed Drug Delivery", Borchardt et al., (ed.), págs. 247- 267, Humana Press (1985). Os pró-fármacos do presente invento incluem, mas não se limitam a pró-fármacos contendo fosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos glicosilados ou pró-fármacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituídos, pró-fármacos de 5-fluorocitosina e outros de 5-fluorouridina que podem ser derivados numa forma de pró-fármaco para utilizar neste invento incluem, mas não se limitam àqueles agentes quimioterapêuticos descritos acima. 0 termo "agonista" inclui especificamente anticorpos ou fragmentos de anticorpo agonistas, fragmentos ou variantes de sequências de aminoácidos de polipéptidos PRO320 nativos, 34

ΕΡ 1 484 338 /PT péptidos, pequenas moléculas orgânicas, etc. Os métodos para identificação de agonistas de um polipéptido PRO320 podem compreender o contacto de uma célula tumoral com uma molécula agonista candidata e a medição da inibição do crescimento das células tumorais. A administração "crónica" refere-se à administração do agente ou agentes de um modo continuo em oposição a um modo agudo, de forma a manter o efeito terapêutico (actividade) inicial durante um período prolongado de tempo. Administração "intermitente" é o tratamento que não consecutivamente feito sem interrupção, em vez disso é de natureza cíclica. "Mamífero" para os fins do tratamento refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de quinta, e animais de zoológico, desporto ou de estimação, tais como cães, gatos, gado, cavalos, ovelhas, porcos, cabras, coelhos, etc. De preferência, o mamífero é um ser humano. A administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos inclui a administração simultânea (concorrente) e consecutiva por qualquer ordem. "Transportadores" tal como aqui se utiliza inclui transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que não sejam tóxicos para a célula ou mamífero a expor a estes nas dosagens e concentrações empregues. Frequentemente o transportador fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa de pH tamponado. Exemplos de transportadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; álcoois de açúcar de tais como manitol ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; e/ou tensioactivos 35

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~ I / I I TM nao íonicos tais como Tween , polietilenoglicol (PEG), e PLURONICS™. "Anticorpos nativos" e "imunoglobulinas nativas" são habitualmente glicoproteinas heterotetraméricas com cerca de 150 000 dalton, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve encontra-se ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfureto covalente, sendo que o número de ligações dissulfureto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada cadeia pesada e leve apresenta igualmente pontes de dissulfureto regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada apresenta numa das extremidades um domínio variável (VH) seguido por vários domínios constantes. Cada cadeia leve apresenta um domínio variável (VL) numa das extremidades e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Pensa-se que determinados resíduos de aminoácidos formam uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. A expressão "variável" refere-se ao facto de certas porções dos domínios variáveis apresentarem grandes diferenças de sequência entre anticorpos e serem utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo em particular relativamente ao seu antigénio específico. Contudo, a variabilidade não se encontra uniformemente distribuída ao longo dos domínios variáveis dos anticorpos. Encontra-se concentrada em três segmentos denominados regiões determinantes de complementaridade (CDR) ou regiões hipervariáveis tanto nos domínios variáveis da cadeia leve como da cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis denominam-se regiões estruturais (FR). Cada um dos domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas inclui quatro regiões FR, que adoptam de um modo geral uma configuração em folha β, ligadas por três CDR que formam ansas que ligam a estrutura em folha β e nalguns casos fazem parte dessa estrutura. As CDR em cada cadeia mantêm-se juntas e muito próximas pelas regiões FR e juntamente com as CDR da outra cadeia contribuem para a formação do local de 36 ΕΡ 1 484 338 /PT ligação ao antigénio dos anticorpos (consultar Kabat et al., Publ. NIH N° 91-3242, Vol. I, páginas 647-669 (1991)). Os domínios constantes não estão directamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antigénio mas apresentam diferentes funções efectoras, tais como participação do anticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpo. A expressão "região hipervariável" quando aqui utilizada refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antigénio. A região hipervariável inclui resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (ou seja, resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Maryland [1991]) e/ou os resíduos de uma "ansa hipervariável" (ou seja, resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Clothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 [1987]). Resíduos "estruturais" ou "FR" são os resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável tal como aqui definido. "Fragmentos de anticorpo" incluem uma porção de um anticorpo intacto, de preferência a região de ligação ao antigénio ou região variável do anticorpo intacto. Constituem exemplos de fragmentos de anticorpo, entre outros, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 [1995]); moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos de ligação ao antigénio idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada um com um único local de ligação ao antigénio, e um fragmento "Fc" residual, uma designação que reflecte a capacidade para cristalizar facilmente. O tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab')2 que 37

ΕΡ 1 484 338 /PT apresenta dois locais de combinação com o antigénio e é ainda capaz de se ligar de forma cruzada com o antigénio. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento e ligação ao antigénio completo. Esta região consiste num dímero de um domínio variável da cadeia pesada e outro da cadeia leve em forte associação não covalente. É nesta configuração que as três CDR de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação ao antigénio à superfície do dímero VH-VL. Conjuntamente, as seis CDR conferem ao anticorpo especificidade de ligação ao antigénio. Contudo, mesmo apenas um domínio variável (ou metade de um Fv incluindo apenas três CDR específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e se ligar ao antigénio apesar de o fazer com uma afinidade reduzida relativamente ao local de ligação de comprimento completo. 0 fragmento Fab contém também o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab diferem de fragmentos Fab' por adição de alguns resíduos no terminal carboxilo do domínio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de charneira do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui utilizada para Fab' em que o(s) resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes apresentam um grupo tiol livre. Produziram-se originalmente fragmentos de anticorpo F(ab')2 como pares de fragmentos Fab' que apresentam cisteínas de charneira entre si. São igualmente conhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos nitidamente diferentes denominados capa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias destas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, igGl, lgG2, lgG3, lgG4, IgA e IgA2. 38

ΕΡ 1 484 338 /PT A expressão "anticorpo monoclonal" tal como aqui utilizada refere-se a um anticorpo obtido de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, ou seja, os anticorpos individuais que fazem parte da população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, contrariamente às preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por serem sintetizados pela cultura de hibridoma, não contaminada por outras imunoglobulinas. 0 adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogénea de anticorpos e não deve ser entendido como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a utilizar de acordo com o presente invento podem ser produzidos pelo método do hibridoma, descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256:495 [1975], ou podem ser produzidos por métodos de ADN recombinante (consultar, por exemplo, , patente U.S. n .° 4 816 567). Os "anticorpos monoclonais " podem também ser isolados de bibliotecas fágicas de anticorpos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Naturej_ 352:624-628 [1991] e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.

Os presentes anticorpos monoclonais incluem especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma determinada classe ou subclasse de anticorpo, enquanto que a(s) cadeia(s) restante(s) são idênticas ou homólogas às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que apresentem a actividade biológica pretendida (Patente 39

ΕΡ 1 484 338 /PT U.S. n.° 4 816 567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 [1984]).

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, de murídeo) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio de anticorpos) que contêm uma sequência minima derivada de imunoglobulina não humana. Na sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais se substituíram resíduos de uma CDR do receptor por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato ou coelho apresentando a especificidade, afinidade e capacidade pretendidas. Nalguns casos, substituem-se resíduos FR de Fv da imunoglobulina humana pelos correspondentes resíduos não humanos. Além disso, os anticorpos humanizados podem incluir resíduos que não existem nem no anticorpo receptor nem nas sequências de CDR ou estruturais importadas. Estas modificações são efectuadas para refinar e maximizar adicionalmente o desempenho do anticorpo. De um modo geral, o anticorpo humanizado incluirá substancialmente todos e pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado incluirá optimamente também pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para pormenores adicionais consultar Jones et al., Nature, 321:322-323 (1986); Reichmann et al., NatureI_ 332:323-329 [1988]; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992) . 0 anticorpo humanizado inclui um anticorpo PRIMATIZED™ em que a região de ligação ao antigénio do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido por imunização de macacos Macaque com o antigénio de interesse.

Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia simples" ou "sFv" incluem os domínios VH e VL de anticorpo em que esses domínios estão presentes numa única cadeia polipeptídica. De preferência, o polipéptido Fv inclui adicionalmente um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite 40 ΕΡ 1 484 338 /PT que sFv forme a estrutura pretendida para ligação ao antigénio. Para uma revisão de sFv consultar Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg e Moore ed., Springer-Verlag, New York, p. 269-315 (1994). A expressão "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antigénio em que os fragmentos incluem um domínio variável da cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (vH-vL) . Utilizando um ligante que é demasiado curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçam-se os domínios a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e a criar dois locais de ligação ao antigénio. Descrevem-se diacorpos em maior detalhe em, por exemplo, EP 404097; WO 93/11161; e Hollinger et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) .

Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interferiram com utilizações do anticorpo em diagnóstico ou terapêutica e podem incluir enzimas, hormonas e outro solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo tal como determinado pelo método de Lowry e com maior preferência até mais de 99% em peso, (2) até um grau suficiente para se obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna por utilização de um sequenciador de copo rotativo, ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE em condições redutoras ou não redutoras utilizando coloração com azul de Coomassie ou, de preferência, coloração com prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ no interior de células recombinantes dado que não estará presente pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo. Habitualmente, contudo, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação. A expressão "marcador" quando aqui utilizada refere-se a um composto ou composição detectável que está directa ou indirectamente conjugado com o anticorpo de modo a gerar um 41

ΕΡ 1 484 338 /PT anticorpo "marcado". 0 marcador pode ser detectável por si próprio (por exemplo, marcadores radioisotópicos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição substrato que é detectável. 0 marcador pode também ser uma entidade não detectável tal como uma toxina. "Fase sólida" significa uma matriz não aquosa à qual o anticorpo do presente invento pode aderir. Constituem exemplos de fases sólidas aqui abrangidas, entre outras, as formadas parcial ou inteiramente por vidro (por exemplo, vidro de porosidade controlada), polissacáridos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, poliestireno, poli(álcool vinílico) e silicones. Em certas concretizações, dependendo do contexto, a fase sólida pode incluir o poço de uma placa de ensaio; noutras é uma coluna de purificação (por exemplo, uma coluna de cromatografia de afinidade). Esta expressão inclui também uma fase sólida descontínua de partículas discretas, tal como as descritas na Patente U.S. N° 4275149.

Um "lipossoma" é uma vesicula pequena composta por diferentes tipos de lípidos, fosfolípidos e/ou tensioactivos que é útil para entregar um fármaco (tal como um polipéptido PRO320 ou um seu anticorpo) a um mamífero. Os componentes do lipossoma são habitualmente dispostos numa formação em bicamada semelhante ao arranjo de lípidos das membranas biológicas.

Uma "molécula pequena" é aqui definida como possuindo um peso molecular inferior a cerca de 500 Dalton. II. Composições e métodos do invento A. Polipéptidos PRQ320 de comprimento completo O presente invento proporciona sequências de nucleótidos pela primeira vez identificadas e isoladas, que codificam polipéptidos que se referem no presente pedido como PRO320. Nomeadamente, identificaram-se e isolaram-se ADNc que codificam polipéptidos PRO320 conforme descrito em mais detalhe nos Exemplos abaixo. 42

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Tal como divulgado nos exemplos abaixo, os clones de ADNc que codificam o polipéptido PRO320 foram depositados na ATCC. As sequências nucleotidicas reais dos clones podem ser facilmente determinadas pelo perito na especialidade por sequenciação dos clones depositados utilizando métodos rotineiros na especialidade. As sequências de aminoácidos previstas podem ser determinadas a partir das sequências nucleotidicas utilizando práticas correntes. Para o polipéptido PRO320 e o ácido nucleico que o codifica aqui descritos, os requerentes identificaram o que se pensa ser os quadros de leitura mais facilmente identificáveis a partir da informação de sequência então disponível. B. Variantes de PRO320

Além dos polipéptidos PRO320 de sequência nativa de comprimento completo aqui descritos, considera-se que se podem preparar variantes de PRO320. As variantes de PRO320 podem ser preparadas por introdução das alterações apropriadas de nucleótidos no adn de PRO320 e/ou por síntese do polipéptido PRO320 pretendido. Os peritos na especialidade avaliarão quais as alterações de aminoácidos que podem alterar processos pós-tradução do polipéptido PRO320, tais como a mudança do número ou posição de locais de glicosilação ou a alteração das características de ancoragem à membrana.

Podem efectuar-se variações no PRO320 de sequência nativa de comprimento completo ou em vários domínios do PRO320 aqui descrito, por exemplo, utilizando qualquer das técnicas e orientações para mutações conservativas e não conservativas apresentadas, por exemplo, na Patente U.S. N° 5364934. As variações podem ser uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais codões que codificam o PRO320 que resultem numa alteração da sequência de aminoácidos do PRO320 comparativamente com a sequência de PRO320 nativa. Opcionalmente a variação é por substituição de pelo menos um aminoácido por qualquer outro aminoácido em um ou mais dos domínios do PRO320. Podem encontrar-se orientações relativas à determinação de qual o resíduo de aminoácido que pode ser inserido, substituído ou eliminado sem afectar de modo adverso a actividade pretendida por comparação da sequência do PRO320 com a de moléculas proteicas homólogas conhecidas e 43

ΕΡ 1 484 338 /PT minimização do número de alterações na sequência de aminoácidos efectuadas em regiões de homologia elevada. As substituições de aminoácidos podem ser o resultado de substituir um aminoácido por outro aminoácido apresentando propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes, tais como a substituição de uma leucina por uma serina, ou seja, substituições de aminoácidos conservativas. As inserções ou deleções podem opcionalmente ser efectuadas na gama entre cerca de 1 a 5 aminoácidos. As variações permitidas podem ser determinadas fazendo sistematicamente inserções, deleções ou substituições de aminoácidos na sequência e ensaiando as variantes resultantes quanto à actividade apresentada pela sequência nativa madura ou de comprimento completo.

Proporcionam-se aqui fragmentos de polipéptido PRO320. Tais fragmentos podem ser truncados no terminal N ou no terminal C ou podem apresentar falta de resíduos internos, por exemplo, quando comparados com uma proteína nativa de comprimento completo. Certos fragmentos apresentam falta de resíduos de aminoácidos que não são essenciais para a actividade biológica pretendida do polipéptido PRO320.

Os fragmentos de PRO320 podem ser preparados por qualquer uma de várias técnicas convencionais. Os fragmentos peptídicos pretendidos podem ser sintetizados quimicamente. Uma abordagem alternativa envolve a geração de fragmentos de PRO320 por digestão enzimática, por exemplo, por tratamento da proteína com uma enzima que se sabe que cliva proteínas em locais definidos por determinados resíduos de aminoácidos ou por digestão do ADN com enzimas de restrição adequadas e isolamento do fragmento pretendido. Ainda outra técnica adequada envolve o isolamento e a amplificação de um fragmento de ADN que codifica um fragmento polipeptídico pretendido através de reacção em cadeia com polimerase (PCR). Nos iniciadores 5' e 3' da PCR utilizam-se oligonucleótidos que definem as extremidades pretendidas do fragmento de ADN. De preferência, os fragmentos de polipéptido PRO320 partilham pelo menos uma actividade biológica e/ou imunológica com o polipéptido PRO320 nativo apresentado na Figura 2 (SEQ ID NO:2). 44

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Em concretizações particulares, apresentam-se substituições conservativas de interesse na Tabela 3 sob o titulo de substituições preferidas. Se tais substituições resultarem numa alteração da actividade biológica, então introduzem-se alterações mais substanciais, denominadas exemplos de substituições na Tabela 3 ou tal como adicionalmente descrito abaixo em referência a classes de aminoácidos, e pesquisam-se os produtos.

Tabela 3

Resíduo Original Exemplos de substituições Substituições preferidas Ala (A) vai; leu; ile vai Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his; lys; arg gin Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gin (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gin; lys; arg arg Ile (I) leu; vai; met; ala; phe; norleucina leu Leu (L) norleucina; ile; vai; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; vai; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Vai (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu 45

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Obtêm-se modificações substanciais na função ou na identidade imunológica do polipéptido PRO320 por selecção de substituições que diferem significativamente relativamente ao seu efeito de manter (a) a estrutura do esqueleto do polipéptido na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou em hélice, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural dividem-se em grupos com base em propriedades comuns das cadeias laterais: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

As substituições não conservativas implicarão trocar um membro de uma destas classes por outro de outra classe. Tais resíduos substituídos podem também ser introduzidos nos locais de substituição conservativa ou, com maior preferência, nos locais restantes (não conservados).

As variações podem ser efectuadas utilizando métodos conhecidos na especialidade tais como mutagénese mediada por oligonucleótidos (dirigida ao local), varrimento de alanina e mutagénese por PCR. Pode efectuar-se mutagénese dirigida ao local [Cárter et al., Nucl. Acids Res. 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487 (1987)], mutagénese com cassete [Wells et al., Gene 34:315 (1995)], mutagénese com selecção por restrição [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415 (1986)] ou outras técnicas conhecidas sobre o ADN clonado para produzir o ADN variante de PRO320.

Pode também utilizar-se varrimento de análise de aminoácidos para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma sequência não contígua. Entre os aminoácidos preferidos para varrimento incluem-se os aminoácidos neutros e relativamente pequenos. Tais aminoácidos incluem alanina, glicina, serina e cisteína. A alanina é tipicamente um 46

ΕΡ 1 484 338 /PT aminoácido preferido para varrimento neste grupo porque elimina a cadeia lateral para além do carbono beta e é menos provável que altere a conformação da cadeia principal da variante [Cunningham e Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]. A alanina é também tipicamente preferida porque é o aminoácido mais comum. Além disso, encontra-se frequentemente tanto em posições enterradas como expostas [Creighton, "The Proteins" (W.H. Freeman & Co., New York); Chothia, J. Mol. Biol. 150:1 (1976)]. Se a substituição por alanina não proporcionar quantidades adequadas de variante, pode utilizar-se um aminoácido isotérico. C. Modificações de PRQ320

As modificações covalentes de PRO320 estão incluídas no âmbito do presente invento. Um tipo de modificação covalente inclui fazer reagir resíduos de aminoácidos alvo de um polipéptido PRO320 com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou com os residuos do terminal N ou C do PRO320. A derivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para ligação cruzada de PRO320 com uma matriz ou superfície de suporte insolúvel em água para utilização no método para purificar anticorpos anti-PRO320 e vice-versa. Constituem agentes de ligação cruzada habitualmente utilizados, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres dissuccinimidilo tais como 3,3'-ditiobis(succinimidil-propionato), maleimidas bifuncionais tais como bis-N-maleimido-1,8-octano e agentes tais como me til-3- [ (p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Outras modificações incluem desamidação de resíduos glutaminilo e asparaginilo nos resíduos glutamilo e aspartilo correspondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos serilo ou treonilo, metilação de grupos α-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, "Proteins: Structure and Molecular Properties", W.H. Freeman & Co., San Francisco, p. 79-86 (1983)], acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxilo C-terminal. 47

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Constitui outro tipo de modificação covalente do polipéptido PRO320 abrangida pelo âmbito do presente invento, alterar o padrão de glicosilação nativo do polipéptido. Pretende-se que "alterar o padrão de glicosilação nativo" para os presentes objectivos, signifique eliminar uma ou mais porções hidrato de carbono presentes na sequência de PRO320 nativa (quer por remoção do local de glicosilação subjacente quer por deleção da glicosilação por meios químicos e/ou enzimáticos) e/ou adicionar um ou mais locais de glicosilação que não se encontrem presentes na sequência de PRO320 nativa. Adicionalmente, a expressão inclui mudanças qualitativas na glicosilação das proteínas nativas, envolvendo uma alteração da natureza e das proporções das diferentes porções hidrato de carbono presentes. A adição de locais de glicosilação ao polipéptido PRO320 pode obter-se por alteração da sequência de aminoácidos. A alteração pode ser efectuada, por exemplo, pela adição, ou substituição, de um mais resíduos de serina ou treonina à sequência de PRO320 nativa (para locais de glicosilação ligados em 0). A sequência de aminoácidos de PRO320 pode ser opcionalmente alterada através de mudanças ao nível do ADN, nomeadamente por mutação do ADN que codifica o polipéptido PRO320 em bases pré-seleccionadas de modo a que sejam gerados codões que se traduzirão nos aminoácidos pretendidos.

Outro meio de aumentar o número de porções hidrato de carbono no polipéptido PRO320 é por acoplamento químico ou enzimático de glicósidos ao polipéptido. Tais métodos são descritos na especialidade, por exemplo, em WO 87/05330 publicada a 11 de Setembro de 1987 e em Aplin e Wriston, CRC Crit Rev. Biochem., p. 259-306 (1981). A remoção de porções hidrato de carbono presentes no polipéptido PRO320 pode ser obtida química ou enzimaticamente ou por substituição por mutação de codões que codificam resíduos de aminoácidos que servem como alvos para a glicosilação. São conhecidas na especialidade técnicas de desglicosilação química e descrevem-se, por exemplo, em Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) e em Edge et al., Anal. Biochem. 118:131 (1981). A clivagem enzimática de porções hidrato de carbono em polipéptidos pode 48

ΕΡ 1 484 338 /PT ser obtida por utilização de várias endoglicosidases e exoglicosidases tal como descritas por Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350 (1987).

Outro tipo de modificação covalente de PRO320 inclui ligar o polipéptido PRO320 a um de entre vários polímeros não proteináceos, por exemplo, polietilenoglicol (PEG), polipropilenoglicol ou polioxialquilenos do modo estabelecido nas Patentes U.S. Nos 4 640 835; 4 496 689; 4 301 144; 4 610 411; 4 791 192 ou 4 179 337. O polipéptido PRO320 do presente invento pode também ser modificado de modo a formar uma molécula quimérica incluindo PRO320 fundido com outro polipéptido ou sequência de aminoácidos heteróloga.

Numa concretização, uma tal molécula quimérica inclui uma fusão do polipéptido PRO320 com um polipéptido marcador que proporciona um epítopo ao qual se pode ligar selectivamente um anticorpo anti-marcador. O marcador epitópico é geralmente colocado no terminal amino ou carboxilo do polipéptido PRO320. A presença de tais formas do polipéptido PRO320 marcadas com o epítopo pode ser detectada utilizando um anticorpo contra o polipéptido marcador. Igualmente, a dotação com o marcador epitópico permite que o polipéptido PRO320 seja facilmente purificado por purificação de afinidade utilizando um anticorpo anti-marcador ou outro tipo de matriz de afinidade que se ligue ao marcador epitópico. São bem conhecidos na especialidade vários polipéptidos marcadores e seus respectivos anticorpos. Constituem exemplos, marcadores de poli-histidina (poli-His) ou poli-histidina-glicina (poli-His-gly); o polipéptido marcador HA da gripe e o seu anticorpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)]; o marcador c-myc e os seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 [Evan et al.,

Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616 (1985)]; e o marcador da glicoproteína D (gD) do vírus Herpes Simplex e o seu anticorpo [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)]. Outros marcadores polipeptídicos incluem o péptido Flag [Hopp et al., BloTechnology 6:1204-1210 (1988)]; o péptido epitópico KT3 [Martin et al., Science 255:192-194 (1992)]; um péptido epitópico de α-tubulina [Skinner et al., 49

ΕΡ 1 484 338 /PT J. Biol. Chem. 266:15163-15166 (1991)]; e o marcador peptídico da proteína 10 do gene T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6393-6397 (1990)].

Numa concretização alternativa, a molécula quimérica pode incluir uma fusão do polipéptido PRO320 com uma imunoglobulina ou com uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente de uma molécula quimérica (também referida como uma "imunoadesina"), tal fusão poderia ser com a região Fc de uma molécula de IgG. As fusões de Ig incluem preferivelmente a substituição de uma forma solúvel (domínio transmembranar eliminado ou inactivado) de um polipéptido PRO320 no lugar de pelo menos uma região variável no interior de uma molécula de Ig. Numa concretização especialmente preferida, a fusão de imunoglobulina inclui as regiões de charneira, CH2 e CH3 ou as regiões de charneira, CHI, CH2 e CH3, de uma molécula de IgGl. Para a produção de fusões de imunoglobulina consultar igualmente a Patente US N° 5 428 130 emitida a 27 de Junho de 1995. D. Preparação de PRQ320 A descrição abaixo refere-se principalmente à produção de PRO320 por células em cultura transformadas ou transfectadas com um vector contendo ácido nucleico de PRO320. Considera-se obviamente que se podem utilizar métodos alternativos, que são bem conhecidos na especialidade, para preparar PRO320.

Por exemplo, a sequência do polipéptido PRO320, ou suas porções, podem ser produzidas por síntese peptídica directa utilizando técnicas de fase sólida [consultar, por exemplo, Stewart et al., "Solid-Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, Califórnia (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)]. Pode efectuar-se síntese proteica in vitro utilizando técnicas manuais ou por meios automáticos. A síntese automática pode ser obtida, por exemplo, utilizando um Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems (Foster City, Califórnia) utilizando as instruções do fabricante. Várias porções do polipéptido PRO320 podem ser sintetizadas quimicamente separadamente e combinadas 50

ΕΡ 1 484 338 /PT utilizando métodos químicos ou enzimáticos para produzir o polipéptido PRO320 de comprimento completo. 1. Isolamento de ADN que codifica PRQ320

Pode obter-se ADN que codifica PRO320 a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido que se pensa possuir o ARNm de PRO320 e expressá-lo a um nível detectável. Consequentemente, pode obter-se convenientemente ADN de PRO320 humano a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido humano, tal como descrito nos Exemplos. Pode também obter-se o gene que codifica PRO320 a partir de uma biblioteca genómica ou por procedimentos de síntese conhecidos (e.g., síntese automática de ácidos nucleicos).

As bibliotecas podem ser pesquisadas com sondas (tais como anticorpos contra o PRO320 ou oligonucleótidos com pelo menos cerca de 20-80 bases) concebidas para identificar o gene de interesse ou a proteína por ele codificada. A pesquisa da biblioteca de ADNc ou genómica com a sonda seleccionada pode ser efectuada utilizando procedimentos padrão, tal como os descritos em Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . A utilização da metodologia de PCR é um modo alternativo de isolar o gene que codifica PRO320 [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., "PCR Primer: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) ] .

Os Exemplos abaixo descrevem técnicas para pesquisa de uma biblioteca de ADNc. As sequências oligonucleotídicas seleccionadas como sondas devem apresentar comprimento suficiente e devem ser suficientemente inequívocas de modo a minimizar falsos positivos. O oligonucleótido é de preferência marcado de modo a poder ser detectado após hibridação com ADN da biblioteca que está a ser pesquisada. São bem conhecidos na especialidade métodos de marcação e incluem a utilização de marcadores radioactivos tais como ATP marcado com P, biotinilaçao ou marcaçao enzimatica. Proporcionam-se as condições de hibridação, incluindo rigor moderado e rigor elevado, em Sambrook et al., supra. 51

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As sequências identificadas em tais métodos de pesquisa de bibliotecas podem ser comparadas e alinhadas com outras sequências conhecidas depositadas e disponíveis em bases de dados públicas tais como GenBank ou outras bases de dados de sequências privadas. Pode determinar-se a identidade de sequência (ao nivel de aminoácidos ou de nucleótidos) no interior de regiões definidas da molécula ou ao longo da sequência de comprimento completo, utilizando métodos conhecidos na especialidade e tal como aqui descrito.

Podem obter-se ácidos nucleicos apresentando sequências de codificação de proteínas por pesquisa de bibliotecas de ADNc ou genómicas seleccionadas utilizando a sequência de aminoácidos deduzida aqui divulgada pela primeira vez e, se necessário, utilizando procedimentos convencionais de extensão de iniciadores tal como descrito em Sambrook et al.r supra, para detectar precursores e intermediários de processamento de ARNm que podem não ter sido submetidos a transcrição inversa para ADNc. 2. Selecção e transformação de células hospedeiras

Transfectam-se ou transformam-se células hospedeiras com os vectores de expressão ou clonagem aqui descritos para produção de PRO320 e cultiva-se em meio de nutrientes convencional modificado tal como apropriado para induzir promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências pretendidas. As condições de cultura tais como meio, temperatura, pH e semelhantes podem ser seleccionadas pelo perito na especialidade sem experiências desnecessárias. De um modo geral, podem encontrar-se princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas de células em "Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach", M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et al., supra.

Os métodos de transfecção de células eucarióticas e transformação de células procarióticas são conhecidos das pessoas competentes na matéria, por exemplo, CaCl2, CaP04, mediada por lipossomas e electroporação. Dependendo da célula hospedeira utilizada, efectua-se transformação utilizando técnicas padrão apropriadas a tais células. Utiliza-se 52

ΕΡ 1 484 338 /PT geralmente o tratamento com cálcio que utiliza cloreto de cálcio, tal como descrito em Sambrook et al., supra, ou electroporação para procariotas. Utiliza-se infecção com Agrobacterium tumefacíens para transformação de certas células vegetais, tal como descrito por Shaw et al.r Gene 23:315 (1983) e WO 89/05859 publicada a 29 de Junho de 1989. Para células de mamífero sem tais paredes celulares, pode utilizar-se o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology 52:456-457 (1978).

Descreveram-se aspectos gerais de transfecções para sistemas hospedeiros de células de mamífero na Patente U.S. N° 4399216. As transformações para levedura são tipicamente efectuadas de acordo com o método de Van Solingen et ai., J. Bact. 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76:3829 (1979). Contudo, podem também utilizar-se outros métodos para introduzir ADN em células, tais como por micro-injecção nuclear, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas ou policatiões, por exemplo, polibreno, poliornitina. Para várias técnicas para transformar células de mamífero, consultar, Keown et al., Methods in Enzymology 185:527-537 (1990) e Mansour et al.,

Nature 336:348-352 (1988).

Constituem células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos vectores aqui referidos, células de procariotas, levedura ou eucariotas superiores. Constituem procariotas adequados, mas não se limitam a, eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tal como E. coli. Diferentes estirpes de E. coli encontram-se disponíveis ao público, tal como E. coli Kl2 estirpe MM294 (ATCC 31 446); E. coli X1776 (ATCC 31 537); E. coli estirpe W3110 (ATCC 27 325) e K5 772 (ATCC 53 635). Constituem outras células hospedeiras procarióticas adequadas, Enterobacteriaceae tais como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, assim como bacilos tais como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P divulgado em DD 266 710 publicado a 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa e Streptomyces. Estes exemplos são ilustrativos e não limitativos. A estirpe W3110 constitui um 53

ΕΡ 1 484 338 /PT hospedeiro ou hospedeiro parental particularmente preferido porque é uma estirpe hospedeira comum para fermentações de produtos de ADN recombinante. De preferência, a célula hospedeira excreta quantidades minimas de enzimas proteoliticas. Por exemplo, a estirpe W3110 pode ser modificada para efectuar uma mutação genética nos genes que codificam proteínas endógenas ao hospedeiro, incluindo os exemplos de tais hospedeiros, E. coli W3110 estirpe 1A2, que apresenta o genótipo completo tonA; E. coli W3110 estirpe 9E4, que apresenta o genótipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 estirpe 27C7 (ATCC 55 244), que apresenta o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP onepT kanr; E. coli W3110 estirpe 37D6, que apresenta o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; E. coli W3110 estirpe 40B4, que é uma estirpe 37D6 com uma mutação de deleção degP sem resistência a canamicina; e uma estirpe E. coli apresentando protease periplasmática mutante divulgada na Patente U.S. N° 4946783 emitida a 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, são adequados métodos in vitro de clonagem, por exemplo, PCR ou outras reacções de polimerização de ácidos nucleicos.

Além de procariotas, constituem hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vectores que codificam PRO320, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras. Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo hospedeiro eucariota inferior habitualmente utilizado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Nature 290:140 [1981]; EP 139383 publicada a 2 de Maio de 1985); hospedeiros de Kluyveromyces (Patente U.S. N° 4943529; Fleer et al.r Bio/Technology 9:968-975 (1991)) tal como, por exemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 [1983]). K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906; Vanden Berg et al., Bio/Technology 8:135 (1990)), K. thermotolerans e K. marxianus; yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28:265-278 [1988]); Candida·, Trichoderma reesia (EP 244234);

Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (EP 394538 publicada a 31 de Outubro de 1990); e 54 ΕΡ 1 484 338 /PT fungos filamentosos tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillíum, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada a 10 de Janeiro de 1991), e hospedeiros de Aspergillus tais como A. nidulans (Ballance et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289 [1983]; Tilburn et ai., Gene 26:205-221 [1983] ; Yelton et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:1470-1474 (1984)) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J. 4:475-479 [1985]). São aqui adequadas leveduras metilotróficas e incluem, mas não se limitam a, leveduras capazes de crescer em metanol seleccionadas dos géneros que consistem de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsís e Rhodotorula. Pode encontrar-se uma listagem de espécies especificas que constituem exemplos desta classe de leveduras em C. Anthony, "The Biochemistry of Methylotrophs", 269 (1982) .

Derivam-se células hospedeiras adequadas para a expressão de PRO320 glicosilado a partir de organismos pluricelulares. Constituem exemplos de células de invertebrados, células de insectos tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, assim como células vegetais. Constituem exemplos de linhas celulares de mamifero hospedeiras, células de ovário de hamster chinês (CHO) e células COS. Constituem exemplos mais específicos, a linha CVl de rim de macaco transformada com SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO), Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1990)); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); e tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51) . Considera-se que a selecção da célula hospedeira apropriada se encontra abrangida pela perícia na especialidade. 3. Selecção e utilização de um vector replicável O ácido nucleico (por exemplo, ADNc ou ADN genómico) que codifica PRO320 pode ser inserido num vector replicável para clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. Encontram-se disponíveis ao público vários vectores. O vector 55

ΕΡ 1 484 338 /PT pode, por exemplo, estar sob a forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula virai ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vector através de vários procedimentos. De um modo geral, insere-se o ADN em local(ais) apropriado(s) de uma endonuclease de restrição utilizando técnicas conhecidas na especialidade. Os componentes do vector incluem geralmente, mas não se limitam a, uma ou mais sequências de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento estimulador, um

promotor e uma sequência de terminação da transcrição. A construção de vectores adequados contendo um ou mais desses componentes utiliza técnicas de ligação padrão que são conhecidas do perito na especialidade. 0 PRO320 pode ser produzido de modo recombinante não apenas directamente mas também como um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo, que pode ser uma sequência de sinal ou outro polipéptido apresentando um local de clivagem específico no terminal N da proteína madura ou do polipéptido. De um modo geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vector ou pode ser uma parte do ADN que codifica PRO320 que é inserido no vector. A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal procariótica seleccionada, por exemplo, do grupo de comandos da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina II estável ao calor. Para secreção de levedura a sequência de sinal pode ser, por exemplo, o comando da invertase de levedura, o comando do factor alfa (incluindo os comandos do factor α de Saccharomyces e Kluyveromyces, o último descrito na Patente U.S. N° 5010182) ou o comando da fosfatase ácida, o comando da glucoamilase de C. albicans (EP 362179 publicada a 4 de Abril de 1990) ou a sequência de sinal descrita em WO 90/13646 publicada a 15 de Novembro de 1990. Para a expressão em células de mamífero, podem utilizar-se sequências de sinal de mamífero para dirigir a secreção da proteína, tais como sequências de sinal de polipéptidos excretados da mesma espécie ou de espécies relacionadas assim como comandos de secreção virais.

Ambos os vectores de expressão e clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vector se replique em uma ou mais células hospedeiras seleccionadas. 56

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Tais sequências são bem conhecidas para várias bactérias, leveduras e virus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é adequada para levedura e diferentes origens de replicação virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero.

Os vectores de expressão e clonagem conterão tipicamente um gene de selecção também denominado marcador seleccionável. Os genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, e.g., o gene que codifica D-alanina-racemase para bacilos.

Constituem exemplos de marcadores de selecção adequados para células de mamífero, os que permitem a identificação de células competentes para absorver os ácidos nucleicos que codificam PRO320 tal como DHFR ou timidina-quinase. Constitui uma célula hospedeira apropriada quando se utiliza DHFR de tipo selvagem a linha celular CHO deficiente em actividade de DHFR, preparada e propagada tal como descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980). Constitui um gene de selecção adequado para utilização em levedura, o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980)]. O gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura que não apresenta a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N° 44076 ou PEP4-1 [Jones, Genetlcs 85:12 (1977)].

Os vectores de expressão e clonagem contêm habitualmente um promotor operativamente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica PRO320 para dirigir a síntese de ARNm. São bem conhecidos promotores reconhecidos por várias potenciais células hospedeiras. Constituem promotores adequados para utilização com hospedeiros procarióticos, os sistemas de promotores da β-lactamase e da lactose [Chang et 57

ΕΡ 1 484 338 /PT al., Nature 275:615(1978); Goeddel et al.r Nature 281:544 (1979)], da fosfatase alcalina, um sistema de promotor do triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980); EP 36776] e promotores híbridos tais como o promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:21-25 (1983)]. Os promotores para utilização em sistemas bacterianos conterão também uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operativamente ao ADN que codifica PRO320.

Constituem exemplos de sequências de promotor adequadas para utilização com hospedeiros de levedura, os promotores para a 3-fosfoglicerato-quinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); Holland,

Biochemistry 17:4900 (1978)], tal como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato- isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglicose-isomerase e glucoquinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores indutíveis apresentando a vantagem adicional da transcrição ser controlada pelas condições de crescimento, são as regiões de promotor para a álcool-desidrogenase 2, o isocitocromo C, a fosfatase ácida, enzimas de degradação associadas ao metabolismo do azoto, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Descrevem-se adicionalmente vectores e promotores adequados para utilização em expressão em levedura na EP 73657. A transcrição de PRO320 a partir de vectores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir de genomas de vírus tais como o vírus do polioma, vírus da varíola aviária (UK 2211504 publicada a 5 de Julho de 1989), adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus de hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por exemplo, o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, e de promotores de choque térmico, desde 58

ΕΡ 1 484 338 /PT que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras. A transcrição de um ADN que codifica o PRO320 por eucariotas superiores pode ser aumentada pela inserção no vector de uma sequência estimuladora. Os estimuladores são elementos de ADN que actuam em eis habitualmente com cerca de 10 a 300 pb, que actuam num promotor para aumentar a sua transcrição. São actualmente conhecidas muitas sequências de estimuladores de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina) . Tipicamente, contudo, utilizar-se-á um estimulador de um vírus de célula eucariótica. Constituem exemplos, o estimulador de SV40 do lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o estimulador do promotor precoce de citomegalovírus, o estimulador de polioma do lado tardio da origem de replicação e estimuladores de adenovírus. O estimulador pode sofrer splicing no vector numa posição 5' ou 3' relativamente à sequência de codificação de ‘—PRO320, mas localiza-se de preferência num local a 5' do promotor.

Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (células de levedura, fungos, insecto, vegetais, animais, humanas ou nucleadas de outros organismos pluricelulares) conterão igualmente sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do ARNm. Tais sequências estão habitualmente disponíveis a partir das regiões 5' e ocasionalmente 3' não traduzidas de ADN ou ADNc eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm que codifica PRO320.

Descrevem-se ainda outros métodos, vectores e células hospedeiras adequados para adaptação à síntese de PRO320 em cultura de células de vertebrado recombinantes em Gething et al., Nature 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281:40— 46 (1979); EP 117060; e EP 117058. 59

ΕΡ 1 484 338 /PT 4. Detecção de amplificação/expressão qénica A amplificação e/ou expressão génica pode ser medida numa amostra directamente, por exemplo, por "Southern blotting" convencional, "Northern blotting" para quantificar a transcrição de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:5201-5205 (1980)], "dot-blotting" (análise de ADN), ou hibridação in situ, utilizando uma sonda adequadamente marcada com base nas sequências aqui proporcionadas. Alternativamente, podem utilizar-se anticorpos que podem reconhecer dúplices específicos, incluindo dúplices de ADN, dúplices de ARN e dúplices híbridos ADN-ARN ou dúplices ADN-proteína. Os anticorpos podem por sua vez ser marcados e o ensaio pode ser efectuado no local em que o dúplex se encontra ligado a uma superfície, de modo a que após formação de um dúplex na superfície se possa detectar a presença de um anticorpo ligado ao dúplex.

Alternativamente, a expressão génica pode ser medida por métodos imunológicos, tal como coloração imuno-histoquímica de células ou secções de tecido e ensaio de cultura de células ou fluidos corporais para quantificar directamente a expressão de produto génico. Os anticorpos úteis para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio de fluidos de amostra podem ser quer monoclonais quer policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipéptido PRO320 de sequência nativa ou contra um péptido sintético baseado nas sequências de ADN aqui proporcionadas ou contra uma sequência exógena fundida com o ADN de PRO320 e codificando para um epítopo de anticorpo específico. 5. Purificação do polipéptido

Podem recuperar-se formas de PRO320 do meio de cultura ou de lisados das células hospedeiras. Se estiverem ligadas à membrana podem ser libertadas da membrana utilizando uma solução de detergente adequada (por exemplo, Triton-X 100) ou por clivagem enzimática. As células utilizadas para expressão de PRO320 podem ser rompidas por diferentes meios físicos ou químicos tais como ciclos de congelamento-descongelamento, 60

ΕΡ 1 484 338 /PT tratamento com ultra-sons, ruptura mecânica ou agentes de lise de células.

Pode pretender-se purificar PRO320 de proteínas ou polipéptidos de células recombinantes. Os seguintes procedimentos constituem exemplos de procedimentos de purificação adequados: por fraccionamento numa coluna de permuta iónica; precipitação com etanol; HPLC em fase inversa; cromatografia em sílica ou numa resina de permuta catiónica tal como DEAE; cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amónio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A-Sepharose para remover contaminantes tais como IgG; e colunas quelantes de metais para ligar formas marcadas com epítopo de PRO320. Podem utilizar-se diferentes métodos de purificação de proteínas e tais métodos são conhecidos na especialidade e descritos por exemplo em Deutscher, "Methods in Enzymology", 182 (1990); Scopes, "Protein Purification:

Principies and Practice", Springer-Verlag, New York (1982) . 0(s) passo(s) de purificação seleccionado(s) dependerão, por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e do PRO320 específico produzido. E. Anticorpos

Alguns candidatos a fármacos para utilização nas composições e métodos do presente invento são anticorpos e fragmentos de anticorpo que imitam a actividade biológica de um polipéptido PRO320. 1. Anticorpos policlonais São conhecidos dos peritos na especialidade métodos de preparação de anticorpos policlonais. Os anticorpos policlonais podem ser criados num mamífero, por exemplo, por uma ou mais injecções de um agente de imunização e, caso pretendido, um adjuvante. Tipicamente, o agente de imunização e/ou adjuvante será injectado no mamífero por injecções subcutâneas ou intraperitoneais múltiplas. O agente de imunização pode incluir o polipéptido PRO320 ou uma sua proteína de fusão. Pode ser útil conjugar o agente de 61

ΕΡ 1 484 338 /PT imunização com uma proteína que se sabe que é imunoqénica no mamífero a imunizar. Constituem exemplos de tais proteínas imunogénicas, mas não se limitam a, hemocianina da lapa Fissurella, albumina de soro, tiroglobulina bovina e inibidor de tripsina de soja. Constituem exemplos de adjuvantes que podem ser utilizados, adjuvante completo de Freund e adjuvante MPL-TDM (monofosforil-Lípido A, dicorinomicolato de trealose sintético). 0 protocolo de imunização pode ser seleccionado por um perito na especialidade sem experiências desnecessárias. 2. Anticorpos monoclonais

Os anticorpos podem, alternativamente, ser anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando métodos de hibridoma, tais como os descritos por Kohler e Milstein, Nature 256:495 (1975). Num método de hibridoma imuniza-se tipicamente um ratinho, hamster ou outro animal hospedeiro adequado com um agente de imunização para desencadear linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao agente de imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. 0 agente de imunização incluirá tipicamente o polipéptido PRO320, ou uma sua proteína de fusão. Em geral, utilizam-se linfócitos de sangue periférico ("PBL") caso se pretendam células de origem humana, ou utilizam-se células de baço ou células de nódulos linfáticos caso se pretendam fontes de mamífero não humano. Os linfócitos são então fundidos com uma linha celular imortalizada utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma [Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", Academic Press, (1986) p. 59-103]. As linhas celulares imortalizadas são usualmente células de mamífero transformadas, nomeadamente células de mieloma de origem de roedor, bovina e humana. Usualmente, utilizam-se linhas celulares de rato ou ratinho. As células de hibridoma podem ser cultivadas num meio de cultura adequado que contém de preferência uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células imortalizadas não fundidas. Por exemplo, se as células parentais não contiverem a enzima 62

ΕΡ 1 484 338 /PT hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"), substâncias que evitam o crescimento de células deficientes em HGPRT.

As linhas células imortalizadas preferidas são as que se fundem eficazmente, suportam expressão estável em niveis elevados de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo seleccionadas e são sensíveis a um meio, tal como meio HAT. Constituem linhas celulares imortalizadas mais preferidas as linhas de mieloma de murideo, que podem ser obtidas, por exemplo, de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia e de American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Foram também descritas linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma de ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos [Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., "Monoclonal

Antibodies Production Techniques and Applications", Mareei

Dekker, Inc ., New York, (1987) p. 51-63]. 0 meio de cultura no qual se cultivam as células de hibridoma pode então ser ensaiado para a presença de anticorpos monoclonais dirigidos contra PRO320. De preferência, determina-se a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou um ensaio de imunossorção com enzima ligada (ELISA). Tais técnicas e ensaios são conhecidos na especialidade. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise de Scatchard de Munson e Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980).

Após terem sido identificadas as células de hibridoma pretendidas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e cultivados por métodos padrão [Coding, supra]. Constituem meios de cultura adequados para este objectivo, por exemplo, meio de Eagle modificado por Dulbecco e meio RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como ascites num mamífero. 63

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Os anticorpos monoclonais excretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados do meio de cultura ou fluido de ascites por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia em hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

Os anticorpos monoclonais podem também ser preparados por métodos de ADN recombinante, tais como os descritos na Patente U.S. N° 4816567. 0 ADN que codifica os anticorpos monoclonais do presente invento pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, por utilização de sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos de murídeo). As células de hibridoma do presente invento servem como fonte preferida de tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outra forma não produzem proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. 0 ADN pode também ser modificado, por exemplo, por substituição da sequência de codificação para domínios constantes das cadeias pesada e leve humana em vez das sequências homólogas de murídeo [Patente U.S. N° 4816567; Morrison et al., supra] ou por ligação covalente à sequência de codificação de imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação para um péptido não imunoglobulina. Tal péptido não imunoglobulina pode ser substituído pelos domínios constantes de um anticorpo do presente invento ou pode ser substituído pelos domínios variáveis de um local de combinação de antigénio de um anticorpo do presente invento para criar um anticorpo bivalente quimérico.

Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes. São bem conhecidos na especialidade métodos para preparar anticorpos monovalentes. Por exemplo, um método envolve a expressão recombinante da cadeia leve e cadeia pesada modificada de imunoglobulina. A cadeia pesada é, em geral, truncada em qualquer ponto na região Fc de modo a evitar ligação cruzada 64

ΕΡ 1 484 338 /PT da cadeia pesada. Alternativamente, substituem-se os resíduos de cisteina relevantes por outro resíduo de aminoácido ou são eliminados para evitar ligação cruzada. São também adequados métodos in vitro para preparar anticorpos monovalentes. Pode efectuar-se digestão de anticorpos para produzir os seus fragmentos, nomeadamente fragmentos Fab, utilizando técnicas de rotina conhecidas na especialidade. 3. Anticorpos humanos e humanizados

Os anticorpos do presente invento podem adicionalmente incluir anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, de murideo) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio de anticorpos) que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos pelos resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato ou coelho apresentando a especificidade, afinidade e capacidade pretendidas. Em alguns casos, substituem-se resíduos estruturais de Fv da imunoglobulina humana pelos resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados podem também incluir resíduos que não se encontrem no anticorpo receptor, nem nas sequências CDR ou estruturais importadas. Em geral, o anticorpo humanizado incluirá substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de uma imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado incluirá também optimamente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]. 65

ΕΡ 1 484 338 /PT São bem conhecidos na especialidade métodos para humanizar anticorpos não humanos. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente denominados resíduos de "importação", que são tipicamente obtidos de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente efectuada seguindo o método de Winter e colaboradores [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhocyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), por substituição de CDR ou sequências de CDR de roedor pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Assim, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. N° 4 816 56 7), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor.

Os anticorpos humanos podem também ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na especialidade, incluindo bibliotecas de apresentação de fagos [Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)]. As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, p. 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)]. De igual modo, podem ser preparados anticorpos humanos pela introdução de locais de imunoglobulina humana em animais transgénicos, por exemplo, ratinhos nos quais os genes de imunoglobulina endógenos foram parcial ou completamente inactivados. Após provocação, observa-se produção de anticorpo humano, que é muito semelhante ao observado em humanos em todos os sentidos, incluindo rearranjo de genes, montagem e repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 5 545 807; 5 545 806; 5 569 825; 5 625 126; 5 633 425; 5 661 016 e nas seguintes publicações científicas: Marks et al., Bio/Technology 10:79-783 (1992); Lonberg et 66

ΕΡ 1 484 338 /PT al., Nature 368:56-859 (1994); Morrison, Nature 368:12-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:45-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:26 (1996); Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:5-93 (1995). 4. Anticorpos biespecíficos

Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, de preferência humanos ou humanizados, que apresentam especificidades de ligação para pelo menos dois antigénios diferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é para o PRO320 e a outra é para qualquer outro antigénio e de preferência para uma proteína ou receptor ou subunidade de receptor da superfície celular. São conhecidos na especialidade métodos para preparar anticorpos biespecíficos. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas têm especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature 305:537-539 [1983]). Dada a distribuição aleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpo diferentes, das quais só uma tem a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta é usualmente conseguida por passos de cromatografia de afinidade. Revelam-se procedimentos semelhantes em WO 93/08829, publicado a 13 de Maio de 1993 e em Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).

Os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação pretendidas (locais de combinação anticorpo-antigénio) podem ser fundidos a sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão é, de preferência, com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo pelo menos parte das regiões de charneira, CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para a ligação da cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os ADN que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, caso se pretenda, a cadeia leve de imunoglobulina, são 67

ΕΡ 1 484 338 /PT inseridos em vectores de expressão separados e são co-transfectados para um organismo hospedeiro adequado. Para mais detalhes sobre geração de anticorpos biespecíficos consultar, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986) .

De acordo com outra abordagem descrita em WO 96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser modificada para maximizar a percentagem de heterodimeros que se recuperam da cultura de células recombinantes. A interface preferida inclui pelo menos uma parte da região CH3 de um dominio constante de anticorpo. Neste método, substituem-se uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenas da interface da primeira molécula de anticorpo por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano) . Criam-se "cavidades" de compensação de tamanho idêntico ou semelhante à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) na interface da segunda molécula de anticorpo por substituição de cadeias laterais de aminoácidos grandes por cadeias mais pequenas (por exemplo, alanina ou treonina). Tal proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero relativamente a outros produtos secundários indesejáveis, tais como homodímeros.

Podem preparar-se anticorpos biespecíficos na forma de anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2). Foram descritas na literatura técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo. Por exemplo, podem preparar-se anticorpos biespecíficos utilizando ligação química. Brennan et al., Science 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que se clivam proteoliticamente anticorpos intactos para gerar fragmentos F(ab')2- Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação ditiol, arsenieto de sódio, para estabilizar ditióis vizinhos e evitar a formação de dissulfureto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido no Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos 68

ΕΡ 1 484 338 /PT produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas.

Os fragmentos Fab' podem ser recuperados directamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecificos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de anticorpo biespecifico F(ab') completamente humanizada. Cada fragmento Fab' foi excretado separadamente de E. coli e sujeito a acoplamento químico direccionado in vitro para formar o anticorpo biespecifico. 0 anticorpo biespecifico assim formado foi capaz de se ligar a células que sobre-expressam o receptor ErbB2 e a células T humanas normais, bem como desencadear a actividade litica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humanos.

Foram também descritas várias técnicas para preparar e isolar fragmentos de anticorpo biespecificos directamente de cultura de células recombinantes. Por exemplo, produziram-se anticorpos biespecificos utilizando fechos de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992).

Ligaram-se os péptidos de fechos de leucina das proteínas Fos e Jun a porções Fab' de dois anticorpos diferentes através de fusão génica. Reduziram-se os homodímeros de anticorpo na região de charneira para formar monómeros e seguidamente re-oxidaram-se para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticorpo biespecificos. Os fragmentos incluem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) através de um ligante que é demasiado curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Assim, os domínios VH e vL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando assim dois locais de ligação ao antigénio. Foi também relatada outra estratégia para preparar fragmentos de anticorpo biespecificos por utilização de dímeros de Fv de cadeia simples (sFv). Consultar, Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). 69

ΕΡ 1 484 338 /PT

Estão contemplados anticorpos com mais de duas valências. Por exemplo, podem preparar-se anticorpos triespecíficos. Tun et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

Podem ligar-se exemplos de anticorpos biespecificos a dois epitopos diferentes num determinado polipéptido PRO320. Alternativamente, pode combinar-se um braço anti-polipéptido PRO320 com um braço que se liga a uma molécula desencadeadora num leucócito, tal como uma molécula de receptor de células T (por exemplo, CD2, CD3, CD28 ou B7) ou receptores Fc para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CDJ6) de modo a focar os mecanismos de defesa celular para a célula que expressa o polipéptido PRO320 particular. Os anticorpos biespecificos podem ser também utilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expressem um polipéptido PRO320 particular. Estes anticorpos possuem um braço de ligação a PRO320 e um braço que liga um agente citotóxico ou um quelante de radionuclidos, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA ou TETA. Outro anticorpo biespecifico de interesse liga o polipéptido PRO320 e liga adicionalmente o factor tecidular (TF). 7. Anticorpos heteroconjugados

Os anticorpos heteroconjugados estão também no âmbito do presente invento. Os anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos ligados covalentemente. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos para direccionar células do sistema imunitário para células indesejáveis [Patente U.S. N° 4676980] e para tratamento de infecção por VIH [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089] . Considera-se que os anticorpos podem ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos em quimica de sintese de proteínas, incluindo os que envolvem agentes de ligação cruzada. Por exemplo, podem construir-se imunotoxinas utilizando uma reacção de permuta de dissulfureto ou por formação de uma ligação tioéter. Constituem exemplos de reagentes adequados para este objectivo, iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e os divulgados, por exemplo, na Patente U.S. N° 4 676 980. 70 ΕΡ 1 484 338 /PT 6. Manipulação da função efectora

Pode ser desejável modificar o anticorpo do presente invento relativamente à função efectora, de modo a aumentar, e.g. a eficácia do anticorpo no tratamento de cancro. Por exemplo, pode(m) introduzir-se resíduo(s) de cisteína na região Fc, permitindo assim a formação de ligações dissulfureto intercadeias nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter uma capacidade de internalização melhorada e/ou maior morte celular mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Consultar, Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Podem também preparar-se anticorpos homodiméricos com actividade antitumoral aumentada utilizando agentes de ligação cruzada heterobifuncionais, tal como descrito em Wolff et al., Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, pode conceber-se um anticorpo que tenha regiões Fc duplas e possa portanto apresentar maiores capacidades de lise de complemento e ADCC. Consultar, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). 7. imunoconjugados O presente invento refere-se também a imunoconjugados incluindo um anticorpo conjugado com um agente citotóxico, tal como um agente quimioterapêutico, toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente activa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou seus fragmentos) ou um isótopo radioactivo (ou seja, um radioconjugado).

Foram descritos acima agentes quimioterapêuticos úteis na geração de tais imunoconjugados. As toxinas enzimaticamente activas e seus fragmentos que podem ser utilizadas incluem a cadeia A da difteria, fragmentos activos não ligantes da toxina da difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sancina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e 71

ΕΡ 1 484 338 /PT os tricotecenos. Encontram-se disponíveis vários radionuclidos para a produção de anticorpos radioconjugados. Constituem exemplos, 112Bi, 131I, 131In, 90Y e 130Re.

Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico são preparados utilizando vários agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, tais como N-succinimidil-3-(1-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (tal como suberato de dissuccinimidilo), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos bis-azido (tal como bis(p- azidobenzoíl)hexanodiamina), derivados bis-diazónio (tal como bis-(p-diazónio-benzoíl)etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno) compostos de flúor bis-activos (tal como 1, 5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, pode ser preparada uma imunotoxina de ricina tal como descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987).

Constitui um exemplo de agente quelante para a conjugação de radionucleótidos ao anticorpo, o ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono-14. Consultar WO94/11026.

Noutra concretização, o anticorpo pode ser conjugado com um "receptor" (tal como estreptavidina) para utilização em pré-direccionamento de tumores em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao doente, seguido de remoção do conjugado não ligado da circulação utilizando um agente de depuração e seguidamente administração de um "ligando" (por exemplo, avidina) que está conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleótido). 8. Imunolipossornas

Os anticorpos aqui revelados podem também ser formulados como imunolipossomas. Lipossomas contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na especialidade, tal como descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4030 (1980); e Patentes U.S. Nos 4485045 e 4544545. Divulgam-se lipossomas com tempo de circulação aumentado na Patente U.S. N° 5013556. 72

ΕΡ 1 484 338 /PT

Podem gerar-se lipossomas particularmente úteis pelo método de evaporação de fase inversa com uma composição de lipido incluindo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE).

Extrudem-se os lipossomas através de filtros de tamanho de poro definido para obter lipossomas com o diâmetro pretendido. Podem conjugar-se aos lipossomas fragmentos Fab' do anticorpo do presente invento tal como descrito em Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) através de uma reacção de permuta de dissulfureto. 0 lipossoma contém opcionalmente no seu interior um agente quimioterapêutico (tal como doxorrubicina). Consultar, Gabizon et al., J. National Câncer Inst. 81(19):1484 (1989). F. Identificação de proteínas capazes de inibir o crescimento ou a proliferação de células neoplásicas

As proteínas divulgadas no presente pedido foram ensaiadas num painel de 60 linhas celulares de tumores actualmente utilizadas na pesquisa de investigação de descoberta de fármacos in vitro orientada para a doença do National Câncer Institute (NCI). O objectivo desta pesquisa é identificar moléculas que tenham actividade citotóxica e/ou citostática contra diferentes tipos de tumores. O NCI pesquisa mais de 10000 novas moléculas por ano (Monks et al., J. Natl. Câncer Inst. 83:757-766 (1991); Boyd, Câncer. Princ. Pract. Oncol. Update 3(10):1-12 (1989)). As linhas celulares tumorais empregues neste estudo foram descritas em Monks et al., supra. As linhas celulares cujo crescimento foi significativamente inibido pelas proteínas do presente pedido estão especificadas nos Exemplos.

Os resultados mostraram que as proteínas testadas mostram actividades citostáticas e, nalguns casos e concentrações, citotóxicas numa variedade de linhas celulares de cancro e portanto são candidatos úteis para terapia de tumores.

Outros ensaios baseados em células e modelos animais para tumores (p. ex., cancros) podem também ser utilizados para verificar as descobertas da pesquisa de cancro do NCI e para melhor compreender a relação entre a proteína aqui 73

ΕΡ 1 484 338 /PT identificada e o desenvolvimento e a patogénese do crescimento de células neoplásicas. Por exemplo, podem ser utilizadas culturas primárias derivadas de tumores de animais transgénicos (tal como descrito abaixo) nos ensaios baseados em células daqui, embora sejam preferidas linhas celulares estáveis. As técnicas para derivar linhas celulares continuas a partir de animais transgénicos são bem conhecidas na especialidade (ver, p. ex., Small et al., Mol. Cell Biol. 5:642-648, 1985). G. Modelos animais

Uma variedade de modelos animais bem conhecidos pode ser utilizada para melhor se compreender o papel das moléculas aqui identificadas no desenvolvimento e na patogénese de tumores, e testar a eficácia de agentes terapêuticos candidatos, incluindo anticorpos e outros agonistas dos polipéptidos nativos, incluindo pequenas moléculas agonistas. A natureza in vivo de tais modelos torna-os particularmente preditivos das respostas em pacientes humanos. Os modelos animais de tumores e cancros (p. ex., cancro da mama, cancro do cólon, cancro da próstata, cancro do pulmão, etc.) incluem tanto animais não recombinantes como recombinantes (transgénicos). Os modelos de animais não recombinantes incluem, por exemplo, roedores, p. ex., modelos de murídeo. Tais modelos podem ser gerados através da introdução de células tumorais em ratinhos singénicos utilizando técnicas padrão, p. ex., injecção subcutânea, injecção na veia da cauda, implantação no baço, implantação intraperitoneal, implantação sob a cápsula renal ou implantação ortopina, p. ex., células de cancro do cólon implantadas em tecido do cólon (ver, p. ex., publicação PCT N° WO 97/33551, publicado a 18 de Setembro de 1997) .

Provavelmente a espécie mais frequentemente utilizada em estudos oncológicos são ratinhos imunodeficientes e, em particular, ratinhos nus. A observação de que os ratinhos nus com hipo/aplasia podem actuar com sucesso como hospedeiros para xenoenxertos de tumores humanos conduziu à sua utilização disseminada para este fim. 0 gene nu recessivo autossómico foi introduzido num grande número de estirpes congénicas distintas de ratinhos nus, incluindo, por exemplo, 74

ΕΡ 1 484 338 /PT ASW, A/He, AKR, BALB/c, BlO.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, Ι/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII e SJL. Adicionalmente, uma grande variedade de outros animais com defeitos imunológicos herdados diferentes dos ratinhos nus foi criada e utilizada como receptores de xenoenxertos tumorais. Para mais detalhes ver, p. ex., "The Nude Mouse in Oncology Research", E. Boven e B. Winograd, eds., CRC Press, Inc., 1991.

As células introduzidas em tais animais podem ser derivadas de linhas celulares de tumores/cancros conhecidas, tais como, qualquer uma das linhas celulares tumorais listadas acima, e, por exemplo, a linha celular B104-1-1 (linha celular NIH-3T3 estável transfectada com o proto-oncogene new); células NIH-3T3 transfectadas com ras; Caco-2 (ATCC HTB-37); uma linha celular de adenocarcinoma do cólon humano de grau II moderadamente bem diferenciada, HT-29 (ATCC HTB-38) ou de tumores e cancros. As amostras de células tumorais ou de cancro podem ser obtidas de pacientes sujeitos a cirurgia, utilizando condições padrão, envolvendo congelação e armazenamento em azoto liquido (Karmali et al., Br. J. Câncer 48:689-696, 1983).

As células tumorais podem ser introduzidas em animais, tais como ratinhos nus, através de uma variedade de procedimentos. 0 espaço subcutâneo (s.c.) em ratinhos é muito adequado para a implantação de tumores. Os tumores podem ser transplantados s.c. como blocos sólidos, como biópsias de agulhas através da utilização uma agulha de punção ou como suspensões celulares. Para a implantação de blocos sólidos ou por agulha de punção, fragmentos de tecido tumoral de tamanho adequado são introduzidos no espaço s.c. As suspensões celulares são preparadas de fresco a partir de tumores primários ou de linhas celulares tumorais estáveis e injectadas subcutaneamente. As células tumorais podem também ser injectadas como implantes subdérmicos. Nesta localização, o inoculo é depositado entre a parte inferior do tecido conjuntivo dérmico e o tecido s.c.. Boven e Winograd (1991), supra. Os modelos animais de cancro da mama podem ser gerados, por exemplo, através de implantação de células de neuroblastoma de rato (das quais foi inicialmente isolado o oncogene new), ou de células NIH-3T3 transformadas com new em 75

ΕΡ 1 484 338 /PT ratinhos nus, essencialmente tal como descrito por Drebin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:9129-9133 (1986).

De modo semelhante, modelos animais de cancro do cólon podem ser gerados através da passagem de células de cancro do cólon em animais, p. ex., ratinhos nus, conduzindo ao aparecimento de tumores nestes animais. Um modelo de transplante ortotópico de cancro do cólon humano em ratinhos nus foi descrito, por exemplo, por Wang et al., Câncer

Research 54:4726-4728, 1994 e Too et al., Câncer Research 55:681-684, 1995. Este modelo baseia-se no designado "METAMOUSE" vendido por AntiCancer, Inc., (San Diego, Califórnia).

Os tumores que surgem em animais podem ser removidos e cultivados in vitro. As células das culturas in vitro podem então ser passadas para animais. Tais tumores podem servir como alvos para mais testes ou pesquisa de fármacos. Alternativamente, os tumores resultantes da passagem podem ser isolados e o arn das células pré-passadas e das células isoladas após um ou mais ciclos de passagem analisado quanto à expressão diferencial de genes de interesse. Tais técnicas de passagem podem ser efectuadas com qualquer tumor ou linhas celulares de cancro conhecidos.

Por exemplo, Meth A, CMS4, CMSS, CMS21 e WEHI-164 são fibrossarcomas quimicamente induzidos de ratinhos fêmeas balb/c (DeLeo et al., J. Exp. Med. 146:720, 1977), que proporcionam um sistema modelo altamente controlável para estudar as actividades antitumorais de vários agentes (Palladino et al., J. Immunol. 138:4023-4032, 1987).

Resumidamente, as células tumorais são propagadas in vitro em cultura celular. Antes da injecção nos animais, as linhas celulares são lavadas e suspensas em tampão, a uma densidade celular de cerca de ΙΟχΙΟ6 a ΙΟχΙΟ7 células/ml. Os animais são então infectados subcutaneamente com 10 a 100 μΐ da suspensão celular, esperando-se uma a três semanas para que apareça um tumor.

Adicionalmente, o carcinoma do pulmão de Lewis (3LL) de ratinho, que é um dos tumores experimentais mais minuciosamente estudado, pode ser utilizado como modelo de 76

ΕΡ 1 484 338 /PT tumor de investigação. A eficácia neste modelo de tumor foi correlacionada com efeitos benéficos no tratamento de pacientes humanos diagnosticados com carcinoma de células pequenas do pulmão (SCCL). Este tumor pode ser introduzido em ratinhos normais após injecção de fragmentos de tumor de um ratinho afectado ou de células mantidas em cultura (Zupi et al., Br. J. Câncer 41, supl. 4:309, 1980), e as evidências indicam que os tumores podem ser iniciados a partir da injecção de apenas uma única célula e que uma proporção muito elevada de células tumorais infectadas sobrevive. Para mais informação acerca deste modelo de tumor ver, Zacharski, Haemostasis 16:300-320, 1986).

Um modo de avaliar a eficácia de um composto de teste num tumor implantado num modelo animal é medir o tamanho do tumor antes e após o tratamento. Tradicionalmente, o tamanho dos tumores implantados tem sido medido com uma pinça graduada em duas ou três dimensões. A medição limitada a duas dimensões não reflecte exactamente o tamanho do tumor, portanto é habitualmente convertida no volume correspondente através da utilização de uma fórmula matemática. Contudo, a medição do tamanho do tumor é muito imprecisa. Os efeitos terapêuticos de um candidato a fármaco podem ser melhor descritos como atraso do crescimento induzido pelo tratamento e atraso do crescimento especifico. Outra variável importante na descrição do crescimento do tumor é o tempo de duplicação do volume do tumor. Programas de computador para o cálculo e descrição do crescimento tumoral estão também disponíveis, tais como o programa relatado por Rygaard e Spang-Thomsen, "Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animais", Wu e Sheng eds., Basel, 1989, 301. Observa-se, contudo, que as respostas inflamatória e de necrose que se seguem ao tratamento podem de facto resultar num aumento do tamanho do tumor, pelo menos inicialmente. Portanto, estas alterações necessitam ser cuidadosamente monitorizadas, através de uma combinação de um método morfométrico e de análise de citometria de fluxo.

Modelos animais recombinantes (transgénicos) podem ser concebidos através da introdução da porção de codificação dos genes aqui identificados no genoma de animais de interesse, utilizando técnicas padrão para produção de animais 77

ΕΡ 1 484 338 /PT transgénicos. Os animais que podem servir como alvo para a manipulação transgénica incluem, sem limitação, ratinhos, ratos, coelhos, cobaias, ovelhas, cabras, porcos e primatas não humanos, p. ex., babuínos, chimpanzés e macacos. As técnicas conhecidas na especialidade para introduzir um transgene em tais animais incluem a micro-injecção no pró-núcleo (Hoppe e Wanger, Patente U.S. N.° 4 873 191); transferência de genes para as linhas germinais mediada por retrovírus (p. ex., Van der Putten et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:6148-615 1985); direccionamento de genes para células estaminais embrionárias (Thompson et ai., Cell 56:313-321, 1989); electroporação de embriões (Lo, Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814, 1983); transferência de genes mediada por esperma (Lavitrano et ai., Cell 57:717-73, 1989). Para revisão, ver, por exemplo, Patente U.S. N° 4736866.

Para os fins do presente invento, os animais transgénicos incluem aqueles que possuem o transgene apenas em parte das suas células ("animais em mosaico") . O transgene pode ser integrado como um único transgene ou em concatâmeros, p. ex., em série cabeça-com-cabeça ou cabeça-com-cauda. A introdução selectiva de um transgene num determinado tipo celular é também possível seguindo, por exemplo, a técnica de Lasko et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6232-6236, 1992). A expressão do transgene em animais transgénicos pode ser monitorizada através de técnicas padrão. Por exemplo, pode ser utilizada a análise de "Southern blot" ou amplificação por PCR para verificar a integração do transgene. O nível de expressão de ARNm pode então ser analisado utilizando técnicas tais como hibridação in situ, análise de " Northern blot", PCR ou imunocitoquímica. Os animais são ainda examinados quanto a sinais de desenvolvimento de tumores ou cancro. A eficácia dos anticorpos que se ligam especificamente aos polipéptidos aqui identificados e a outros candidatos a fármacos, pode ser também testada no tratamento de tumores animais espontâneos. Um alvo adequado para tais estudos é o carcinoma de células escamosas oral felino (SCC). O SCC oral felino é um tumor maligno, altamente invasivo, que é a 78

ΕΡ 1 484 338 /PT malignidade oral mais vulgar nos gatos, contribuindo para mais de 60% dos tumores orais relatados nesta espécie. Raramente metastiza para locais distantes, embora esta baixa incidência de metástases possa ser meramente um reflexo dos curtos tempos de sobrevivência para os gatos com este tumor. Estes tumores não são normalmente passíveis de cirurgia, primeiramente devido à anatomia da cavidade oral felina. Actualmente, não existe tratamento eficaz para este tumor. Antes de entrar para o estudo, cada gato é sujeito a um exame clínico completo, biopsia e é pesquisado através de tomografia computadorizada (TC). Os gatos diagnosticados com tumores de células escamosas orais sublinguais são excluídos do estudo. A língua pode ficar paralisada em resultado de tal tumor e mesmo que o tratamento mate o tumor, os animais podem não ser capazes de se alimentar por si próprios. Cada gato é tratado repetidamente, durante um período mais longo de tempo. Serão tiradas fotografias aos tumores diariamente durante o período de tratamento e em cada reavaliação subsequente. Após o tratamento, cada gato é sujeito a outra pesquisa de TC. As pesquisas de TC e os radiogramas torácicos são avaliados de 8 em 8 semanas a partir daí. Os dados são avaliados quanto a diferenças na sobrevivência, resposta e toxicidade em comparação com grupos de controlo. A resposta positiva pode requerer provas de regressão do tumor, de preferência com melhoria da qualidade de vida e/ou maior esperança de vida.

Adicionalmente, podem também ser testados outros tumores animais espontâneos, tais como fibrossarcoma, adenocarcinoma, linfoma, condroma, leiomiossarcoma de cães, gatos e babuínos. Destes, o adenocarcinoma mamário em cães e gatos é o modelo preferido uma vez que o seu surgimento e comportamento são muito semelhantes aos dos humanos. Contudo, a utilização deste modelo está limitada pela rara ocorrência deste tipo de tumor nos animais. H. Ensaios de pesquisa de candidatos a fármacos

Os ensaios de pesquisa de candidatos a fármacos são desenhados para identificar compostos que se ligam ou complexam de modo competitivo com o receptor ou receptores dos polipéptidos aqui identificados, ou que de outro modo 79

ΕΡ 1 484 338 /PT sinalizam através de tal receptor ou receptores. Tais ensaios de pesquisa incluirão ensaios passíveis de pesquisa de elevado rendimento de bibliotecas químicas, tornando-os particularmente adequados para identificação de candidatos a fármacos de moléculas pequenas. As moléculas pequenas contempladas incluem compostos orgânicos ou inorgânicos sintéticos, incluindo péptidos, de preferência péptidos solúveis, fusões (poli)péptido-imunoglobulina, e, em particular, anticorpos incluindo, sem limitação, anticorpos policlonais e monoclonais e fragmentos de anticorpo, anticorpos de cadeia simples, anticorpos anti-idiotipicos e versões quiméricas ou humanizadas de tais anticorpos ou fragmentos, bem como anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo. Os ensaios podem ser efectuados numa variedade de formatos, incluindo ensaios de ligação proteína-proteína, ensaios de pesquisa bioquímicos, imunoensaios e ensaios baseados em células, que estão bem caracterizados na especialidade.

Em ensaios de ligação, a interacção é a ligação e o complexo formado pode ser isolado ou detectado na mistura reaccional. Numa concretização particular, um receptor de um polipéptido codificado pelo gene aqui identificado ou candidato a fármaco é imobilizado numa fase sólida, p. ex., numa placa de microtítulo, através de ligações covalentes ou não covalentes. A ligação não covalente é geralmente alcançada através do revestimento da superfície sólida com uma solução do polipéptido e secagem. Alternativamente, pode ser utilizando um anticorpo imobilizado, p. ex., um anticorpo monoclonal, específico para o polipéptido a imobilizar para o ancorar a uma superfície sólida. 0 ensaio é efectuado através da adição do componente não imobilizado, que pode ser marcado através de um marcador detectável, ao componente imobilizado, p. ex., a superfície revestida contendo o componente ancorado. Quando a reacção está completa, os componentes que não reagiram são removidos, p. ex., através de lavagem, e os complexos ancorados na superfície sólida são detectados. Quando o componente originalmente não imobilizado possui um marcador detectável, a detecção do marcador imobilizado na superfície indica que ocorreu complexação. Quando o componente originalmente não imobilizado não possui um marcador, a complexação pode ser detectada, por exemplo, 80

ΕΡ 1 484 338 /PT através da utilização de um anticorpo marcado que se ligue especificamente ao complexo imobilizado.

Se o composto candidato interagir mas não se ligar a um receptor particular, a sua interacção com esse polipéptido pode ser ensaiada através de métodos bem conhecidos para detecção de interacções proteína-proteína. Tais ensaios incluem abordagens tradicionais, tais como ligação cruzada, co-imunoprecipitação e co-purificação através de colunas de gradiente ou cromatográficas. Adicionalmente, as interacções proteína-proteína podem ser monitorizadas através da utilização de um sistema genético baseado em levedura descrito por Fields e colaboradores (Fields e Song, Nature (London) 340:245-246, 1989; Chien et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 88:9578-9582, 1991) tal como divulgado por Chevray e Nathans {Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5789-5793, 1991).

Muitos activadores da transcrição, tais como GAL4 de levedura, consistem em dois domínios modulares discretos, um que actua como domínio de ligação ao ADN, enquanto que o outro funciona como domínio de activação da transcrição. O sistema de expressão de levedura descrito nas publicações antecedentes (geralmente referido como o "sistema de dois híbridos") tira vantagem desta propriedade, e emprega duas proteínas híbridas, uma na qual a proteína alvo é fundida com o domínio de ligação ao ADN de GAL4 e a outra na qual as proteínas activadoras candidatas são fundidas com o dominio de activação. A expressão de um gene repórter GALl-lacZ sob controlo de um promotor activado por GAL4 depende da reconstituição da actividade de GAL4 através da interacção proteína-proteína. As colónias contendo polipéptidos que interagem são detectadas com um substrato cromogénico para a β-galactosidase. Um estojo completo (MATCHMAKER ) para identificação de interacções proteína-proteína entre duas proteínas específicas utilizando a técnicas de dois híbridos está comercialmente disponível em Clontech. Este sistema pode também ser estendido para mapear domínios proteicos envolvidos em interacções proteicas específicas bem como para indicar resíduos de aminoácidos que sejam cruciais para estas interacções. 81

ΕΡ 1 484 338 /PT I. Composições farmacêuticas

Podem administrar-se os polipéptidos do presente invento, anticorpos agonistas que se ligam especificamente a proteínas aqui identificadas, bem como outras moléculas identificadas pelos ensaios de pesquisa aqui divulgados, para o tratamento de tumores, incluindo cancros, sob a forma de composições farmacêuticas.

Quando se utilizam fragmentos de anticorpo, é preferido o fragmento de inibição mais pequeno que liga especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo. Por exemplo, com base nas sequências de região variável de um anticorpo, podem conceber-se moléculas de péptido que mantenham a capacidade de se ligar à sequência proteica alvo. Tais péptidos podem sintetizar-se quimicamente e/ou produzir-se por tecnologia de ADN recombinante (consultar, por exemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:7889-7893, 1993). A formulação aqui pode também conter mais de um composto activo, conforme necessário para a indicação particular a tratar, de preferência aqueles com actividades complementares que não se afectem adversamente uns aos outros. Alternativamente, ou adicionalmente, a composição pode compreender um agente que aumente a sua função, tal como, por exemplo, um agente citotóxico, uma citocina, um agente quimioterapêutico ou agente inibidor do crescimento. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido.

Preparam-se formulações terapêuticas dos polipéptidos aqui identificados, ou seus agonistas, para armazenamento por mistura do ingrediente activo com o grau de pureza pretendido com transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais ("Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a edição, Osol, A. ed. [1980]), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto 82

ΕΡ 1 484 338 /PT de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos tais como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensioactivos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). A formulação aqui pode também conter mais do que um composto activo conforme necessário para a indicação particular a tratar, de preferência os que apresentam actividades complementares que não apresentam efeitos adversos entre si. Alternativa ou adicionalmente, a composição pode incluir um agente citotóxico, uma citocina ou um agente inibidor do crescimento. Tais moléculas encontram-se adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o objectivo pretendido.

Os ingredientes activos podem também ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a edição, Osol, A. ed. (1980).

As formulações a utilizar em administração in vivo têm que ser estéreis. Tal pode ser facilmente conseguido por filtração através de membranas de esterilização por filtração antes ou após liofilização e reconstituição. 83

ΕΡ 1 484 338 /PT

As composições terapêuticas aqui são geralmente colocadas num recipiente possuindo uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa possuindo uma tampa perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica.

Podem preparar-se preparações de libertação sustentada. Constituem exemplos adequados de preparações de libertação sustentada matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o anticorpo, em que as matrizes se encontram sob a forma de artigos com forma, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Constituem exemplos de matrizes de libertação sustentada, poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2-hidroxietilmetacrilato) ou poli(álcool vinílico)), polilactidos (Pat. U.S. N° 3773919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de γ-etilo, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis, como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto que os polímeros como etileno- acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico permitem a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante um longo período de tempo podem desnaturar ou

agregar-se como resultado de exposição a humidade a 37°C, resultando em perda de actividade biológica e possíveis alterações de imunogenicidade. Podem ser concebidas estratégias racionais para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, quando se verifica que o mecanismo de agregação é a formação de ligações S-S intermoleculares através de permuta de tiodissulfureto, pode conseguir-se estabilização por modificação de resíduos sulfidrilo, liofilização a partir de soluções ácidas, controlo do teor de humidade, utilizando aditivos adequados e desenvolvendo composições de matrizes poliméricas específicas. 84

ΕΡ 1 484 338 /PT J. Métodos de tratamento

Considera-se que os polipéptidos do presente invento e seus agonistas, incluindo anticorpos, péptidos e agonistas de moléculas pequenas, podem ser utilizados para tratar vários tumores, e.g. cancros. Constituem exemplos de condições e doenças a tratar, tumores benignos ou malignos (por exemplo, carcinomas renais, do fígado, do rim, da bexiga, da mama, gástricos, dos ovários, colorrectais, da próstata, pancreáticos, do pulmão, da vulva, da tiróide, hepáticos; sarcomas; glioblastomas; e vários tumores da cabeça e do pescoço); leucemias e malignidades linfóides; outros distúrbios, tais como distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos e outros distúrbios glandulares, macrofágicos, epiteliais, do estroma e blastocélicos; e distúrbios inflamatórios, angiogénicos e imunológicos. Os agentes antitumorais do presente invento (incluindo os polipéptidos aqui divulgados e agonistas que imitam a sua actividade, por exemplo, anticorpos, péptidos e moléculas orgânicas pequenas) são administrados a um mamífero, de preferência um ser humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa na forma de bolus ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo, ou por via intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, intra-ocular, intra-arterial, intralesional, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica ou por inalação.

Podem combinar-se outros regimes terapêuticos com a administração dos agentes anticancerosos do presente invento. Por exemplo, o doente a tratar com tais agentes anticancerosos pode também receber terapia de radiação. Alternativa ou adicionalmente, pode administrar-se ao doente um agente quimioterapêutico. A preparação e calendário de dosagem para tais agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante ou como determinado empiricamente pelo profissional de saúde. A preparação e calendário de dosagem para tal quimioterapia são também descritos em "Chemotherapy Service" Ed., M.C. Perry, Williams e Wilkins, Baltimore, Maryland (1992). 0 agente quimioterapêutico pode preceder ou seguir-se à administração do agente antitumoral do presente invento, ou pode ser 85

ΕΡ 1 484 338 /PT administrado simultaneamente com ele. Os agentes anticancerosos do presente invento podem ser combinados com um composto anti-estrogénio tal como tamoxifeno ou um composto anti-progesterona tal como onapristona (consultar, EP 616812) em dosagens conhecidas para tais moléculas.

Pode ser desejável administrar também anticorpos contra antigénios associados a tumores, tais como anticorpos que ligam a ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 ou factor endotelial vascular (VEGF). Alternativa ou adicionalmente, podem ser co-administrados ao doente dois ou mais anticorpos que se ligam ao mesmo ou a dois ou mais antigénios diferentes associados ao cancro. Por vezes, pode ser benéfico administrar também uma ou mais citocinas ao doente. Numa concretização preferida, os agentes anticancerosos aqui são co- administrados com um agente inibidor do crescimento. Por exemplo, o agente inibidor do crescimento pode ser administrado primeiro, seguido pela administração de um agente anticanceroso do presente invento. Contudo, consideram-se também a administração simultânea ou a administração do agente anticanceroso do presente invento primeiro. As dosagens adequadas para o agente inibidor do crescimento são as utilizadas actualmente e podem ser diminuídas devido à acção combinada (sinergia) do agente inibidor do crescimento e do presente anticorpo.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem adequada de um agente antitumoral, dependerá do tipo de doença a tratar, tal como definido acima, da gravidade e evolução da doença, se o agente é administrado com objectivos preventivos ou terapêuticos, da terapia prévia, da história clinica do doente e da resposta ao agente, e do critério do médico assistente. 0 agente é administrado adequadamente ao doente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. As experiências com animais proporcionam orientação fiável para a determinação de doses eficazes para terapia humana. A extrapolação inter-espécies de doses eficazes pode ser realizada seguindo os princípios assentes por Mordenti. J.E Chappell. W. The use of interspecies scaling in toxicokinetics em "Toxicokinetics and New Drug Development",

Yacobi et ai., eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42 96. 86

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Por exemplo, dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1-20 mg/kg) de um agente antitumoral é uma dosagem inicial candidata para administração ao doente, quer, por exemplo, numa administração, quer em mais administrações separadas ou por infusão continua. Uma dosagem diária típica pode estar na gama de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores supramencionados. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra a supressão pretendida dos sintomas da doença. Contudo, podem ser úteis outros regimes de dosagem. A progressão desta terapia é facilmente monitorizada por técnicas e ensaios convencionais. É proporcionada na literatura orientação quanto a dosagens e métodos de administração particulares; veja-se por exemplo, as Pat. U.S. Nos 4657760; 5206344; ou 5225212. Antecipa-se que diferentes formulações serão eficazes para diferentes compostos de tratamento e diferentes distúrbios, que a administração que tem como alvo um órgão ou tecido, por exemplo, pode necessitar de ser entregue de uma maneira diferente da que tem como alvo outro órgão ou tecido. K. Artigos de fabrico

Noutra concretização do presente invento, proporciona-se um artigo de fabrico contendo materiais úteis para o diagnóstico ou tratamento dos distúrbios descritos acima. O artigo de fabrico inclui um recipiente e um marcador. Constituem recipientes adequados, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser feitos de vários materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para o diagnóstico ou tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma tampa perfurável com uma agulha de injecção hipodérmica). O agente activo na composição é um agente antitumoral do presente invento. O marcador no recipiente, ou associado a este, indica que a composição é utilizada para diagnóstico ou tratamento da condição seleccionada. O artigo de fabrico pode incluir adicionalmente um segundo recipiente contendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina 87

ΕΡ 1 484 338 /PT tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e folhetos inclusos com instruções para utilização.

Os seguintes exemplos apresentam-se com fins meramente ilustrativos e não pretendem de modo algum limitar o âmbito do presente invento.

Todas as referências a patentes e literatura citadas no presente fascículo são aqui incorporadas por referências na sua totalidade.

EXEMPLOS

Os reagentes comercialmente disponíveis referidos nos exemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante, salvo indicação em contrário. A fonte das células identificadas nos seguintes exemplos e ao longo do fascículo pelos números de acesso ATCC é a American Type Culture Collection, Manassas, VA. EXEMPLO 1

Pesquisa de homoloqia de domínio extracelular para identificar novos polipéptidos e ADNc que os codificam

As sequências do domínio extracelular (ECD) (incluindo a sequência de sinal de secreção, caso exista) de cerca de 950 proteínas segregadas conhecidas da base de dados pública Swiss-Prot foram utilizadas para pesquisar bases de dados de EST. As bases de dados de est incluíram bases de dados públicas (por exemplo, Dayhoff, GenBank) e bases de dados registadas (por exemplo LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Paio Alto, Califórnia) . A pesquisa foi efectuada utilizando o programa de computador BLAST ou BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)) como uma comparação das sequências proteicas de ECD com uma tradução em 6 quadros das sequências de EST. As comparações com uma pontuação BLAST de 70 (ou em alguns casos 90) ou superior que não codificavam proteínas conhecidas foram agrupadas e montadas em sequências 88

ΕΡ 1 484 338 /PT de ADN de consenso com o programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington).

Utilizando esta pesquisa de homologia de domínio extracelular, as sequências de ADN de consenso foram montadas relativamente às outras sequências de EST identificadas utilizando phrap. Além disso, as sequências de ADN de consenso obtidas foram frequentemente (mas nem sempre) estendidas utilizando ciclos repetidos de BLAST ou BLAST-2 e phrap para estender a sequência de consenso o mais possível utilizando as fontes de sequências de EST discutidas acima.

Com base nas sequências de consenso obtidas como descrito acima, sintetizaram-se então oligonucleótidos e utilizaram-se para identificar por PCR uma biblioteca de ADNc que continha a sequência de interesse e para utilização como sondas para isolar um clone da sequência de codificação de comprimento completo de um polipéptido PRO. Os iniciadores de PCR directo e inverso têm, em geral, 20 a 30 nucleótidos e são frequentemente concebidos para dar um produto de PCR de cerca de 100-1000 pb de comprimento. As sequências das sondas têm tipicamente 40-55 pb de comprimento. Em alguns casos, sintetizam-se oligonucleótidos adicionais quando a sequência de consenso é maior do que cerca de 1-1,5 kpb. De modo a pesquisar várias bibliotecas para um clone de comprimento completo, pesquisou-se o ADN das bibliotecas por amplificação por PCR, tal como em Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", com o par de iniciadores de PCR. Utilizou-se então uma biblioteca positiva para isolar clones que codificam o gene de interesse, utilizando o oligonucleótido sonda e um dos pares de iniciadores.

As bibliotecas de ADNc utilizadas para isolar os clones de ADNc foram construídas por métodos padrão utilizando reagentes comercialmente disponíveis, tais como os de Invitrogen, San Diego, CA. O ADNc foi iniciado com oligodT contendo um local NotI, ligado com adaptadores tratados com hemiquinase cegos a SalI, clivado com NotI, determinou-se o tamanho por electroforese em gel e clonou-se numa orientação definida para um vector de clonagem adequado (tal como pRKB ou pRKD; pRK5B é um precursor de pRK5D que não contém o local 89

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SfíI; consultar, Holmes et al., Science 253:1278-1280 (1991)) nos locais Xhol e NotI únicos. EXEMPLO 2

Isolamento de clones de ADNc codificando PRO320 humano

Foi montada uma sequência de ADN de consenso relativamente a outras sequências de EST utilizando phrap tal como descrito no Exemplo 1 acima. Esta sequência de consenso é aqui designada como DNA28739. Com base na sequência de consenso DNA28739, foram sintetizados oligonucleótidos para: 1) identificar através de PCR uma biblioteca de ADNc que continha a sequência de interesse, e 2) utilizar como sondas para isolar um clone da sequência de codificação de comprimento completo para PRO320.

Um par de iniciadores de PCR (directo e inverso) foi sintetizado: iniciador de PCR directo: 5'-CCTCAGTGGCCACATGCTCATG-3' (SEQ ID NO:3) iniciador de PCR inverso: 5'-GGCTGCACGTATGGCTATCCATAG-3' (SEQ ID NO:4)

Adicionalmente, foi construída uma sonda de hibridação oligonucleotídica sintética a partir da sequência de consenso DNA28739 que tinha a seguinte sequência nucleotídica: sonda de hibridação: 5'-GATAAACTGTCAGTACAGCTGTGAAGACACAGAAGAAGGGCCACAGTGCC-3' (SEQ ID NO:5)

Para pesquisar várias bibliotecas para obter uma fonte de um clone de comprimento completo, o ADN das bibliotecas foi pesquisado através de amplificação por PCR com o par de iniciadores de PCR identificado acima. Uma biblioteca positiva foi então utilizada para isolar os clones codificando o gene de PRO320 utilizando o oligonucleótido sonda e um dos iniciadores de PCR. O ARN para construção das 90

ΕΡ 1 484 338 /PT bibliotecas de ADNc foi isolado a partir de tecido pulmonar fetal humano (LIB025). A sequenciação de ADN dos clones isolados tal como descrito acima deu a sequência de ADN de comprimento completo para DNA32284-1307 (Figura 1, SEQ ID NO:l); e a sequência proteica derivada para PRO320. A sequência de codificação de DNA32284-1307 está incluída na Figura 1 (SEQ ID NO:l). O clone DNA32284-1307 contém um único enquadramento de leitura aberto com um local de início da tradução aparente nas posições dos nucleótidos 135-137 e um codão de terminação aparente nas posições dos nucleótidos 1149-1151. O precursor do polipéptido previsto tem 338 aminoácidos de comprimento. A análise da sequência de comprimento completo de PRO320 mostrada na Figura 2 (SEQ ID NO:2) evidencia a presença de uma variedade de domínios polipeptidicos importantes, em que as localizações dadas para esses domínios polipeptidicos importantes são aproximadamente tal como descrito acima. A análise do polipéptido PRO320 de comprimento completo mostrado na Figura 2 evidencia a presença do seguinte: um péptido de sinal de cerca de 1 a cerca de 21 aminoácidos; um local de amidação de cerca do aminoácido 330 a cerca do aminoácido 334; locais de hidroxilação de ácido aspártico e asparagina de cerca do aminoácido 109 a cerca do aminoácido 121, de cerca do aminoácido 191 a cerca do aminoácido 203 e de cerca do aminoácido 236 a cerca do aminoácido 248; uma assinatura de padrão de cisteínas de domínio semelhante a EGF de cerca do aminoácido 80 a cerca do aminoácido 91; domínios semelhantes a EGF de ligação ao cálcio de cerca do aminoácido 103 a cerca do aminoácido 125, de cerca do aminoácido 230 a cerca do aminoácido 252 e de cerca do aminoácido 185 a cerca do aminoácido 207. O clone DNA32284-1307 foi depositado na ATCC a 11 de Março de 1998 e foi-lhe atribuído do n.° de depósito ATCC 209670. A proteína PRO320 de comprimento completo mostrada na Figura 2 tem um peso molecular estimado de cerca de 37143 daltons e um pi de cerca de 8,92. 91

ΕΡ 1 484 338 /PT EXEMPLO 3

Utilização de PRQ320 como sonda de hibridação O seguinte método descreve a utilização de uma sequência nucleotidica codificando PRO320 como sonda de hibridação. 0 ADN compreendendo a sequência de codificação da PRO320 de comprimento completo ou madura (tal como mostrada na Figura 1, SEQ ID N0:1) ou um seu fragmento, é empregue como sonda para pesquisar ADN homólogos (tais como aqueles que codificam as variantes de ocorrência natural de PRO320) em bibliotecas de ADNc de tecido humano ou biblioteca genómicas de tecido humano. A hibridação e lavagem dos filtros contendo um dos ADN da biblioteca são efectuadas sob as seguintes condições de elevado rigor. A hibridação da sonda radiomarcada derivada do gene codificando um polipéptido PRO320 aos filtros é efectuada numa solução de formamida a 50%, SSC 5χ, SDS a 0,1%, pirofosfato de sódio a 0,1%, fosfato de sódio 50 mM, pH 6,8, solução de Denhardt 2x e sulfato de dextrano a 10% a 42°C durante 20 horas. A lavagem dos filtros é efectuada numa solução aquosa de SSC 0,lx e SDS a 0,1% a 42°C.

Os ADN possuindo uma identidade de sequência desejada com o ADN codificando a sequência nativa de comprimento completo podem ser identificados utilizando técnicas conhecidas na especialidade. EXEMPLO 4

Expressão de PRQ320 em E, coli

Este exemplo ilustra a preparação de uma forma não glicosilada de PRO320 através de expressão recombinante em E. coli. A sequência de ADN codificando PRO320 é inicialmente amplificada, utilizando iniciadores de PCR seleccionados. Os iniciadores devem conter locais de enzimas de restrição que correspondam aos locais de enzimas de restrição no vector de 92

ΕΡ 1 484 338 /PT expressão seleccionado. Pode ser empregue uma variedade de vectores de expressão. Um exemplo de um vector adequado é pBR322 (derivado de E. coli, ver Bolívar et al., Gene 2:95, 1977), que contém genes para resistência a ampicilina e tetraciclina. 0 vector é digerido com enzima de restrição e desfosforilado. As sequências amplificadas por PCR são então ligadas no vector. 0 vector incluirá de preferência sequências que codificam para um gene de resistência a antibióticos, um promotor trp, um comando poli-His (incluindo os primeiros seis codões STH, a sequência poli-His e o local de clivagem pela enteroquinase), a região de codificação de PRO320, o terminador da transcrição de lambda e um gene argU. A mistura de ligação é então utilizada para transformar uma estirpe de E. coli seleccionada utilizando os métodos descritos em Sambrook et al., supra. Os transformantes são identificados pela sua capacidade para crescerem em placas de LB e as colónias resistentes ao antibiótico são então seleccionadas. 0 ADN plasmídico pode ser isolado e confirmado através de análise de restrição e sequenciação do ADN.

Os clones seleccionados podem ser criados de um dia para o outro em meio de cultura líquido tal como caldo LB suplementado com antibióticos. A cultura de um dia para o outro pode subsequentemente ser utilizada para inocular uma cultura em maior escala. As células são então criadas até uma densidade óptica desejada, período durante o qual o promotor de expressão é ligado.

Após cultura das células durante várias horas mais, as células podem ser colhidas por centrifugação. 0 sedimento celular obtido por centrifugação pode ser solubilizado utilizando vários agentes conhecidos na especialidade e a proteína PRO320 solubilizada pode então ser purificada utilizando uma coluna quelante de metais sob condições que permitam uma ligação forte da proteína. PRO320 pode ser expressa em E. coli numa forma marcada com poli-His, utilizando o seguinte procedimento. 0 ADN, codificando PRO320, é inicialmente amplificado, utilizando iniciadores de PCR seleccionados. Os iniciadores conterão locais de enzimas de restrição que correspondem aos locais de 93

ΕΡ 1 484 338 /PT enzimas de restrição no vector de expressão seleccionado e outras sequências úteis proporcionando um início da tradução eficiente e de confiança, uma rápida purificação numa coluna quelante de metais e a remoção proteolítica com enteroquinase. As sequências amplificadas por PCR e marcadas com poli-His são então ligadas num vector de expressão, que é utilizado para transformar um hospedeiro de E. coli baseado na estirpe 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq)). Os transformantes são primeiro criados em LB contendo 50 mg/ml de carbenicilina a 30°C com agitação até ser alcançada uma D060o de 3-5. As culturas são então diluidas 50-100 vezes em meios CRAP (preparados através da mistura de 3,57 g de (NH4)2S04, 0,71 g de citrato de sódio-2H20, 1, 07 g de KC1, 5,36 g de extracto de levedura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF em 500 ml de água, bem como MPOS 110 mM, pH 7,3, glicose a 0,55% (p/v) e MgS04 7 mM) e criadas durante aproximadamente 20-30 horas a 30°C com agitação. As amostras são removidas para verificar a expressão através de análise de SDS-PAGE e a cultura bruta é centrifugada para sedimentar as células. Os sedimentos celulares são congelados até à purificação e redobragem. A pasta de E. coli de fermentações de 0,5 a 11 (sedimentos de 6-10 g) é ressuspensa em 10 volumes (p/v) em tampão de guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH 8. São adicionados sulfito de sódio sólido e tetrationato de sódio para fazer concentrações finais de 0,1 M e 0,02 M, respectivamente, e a solução é agitada de um dia para o outro a 4°C. Este passo resulta numa proteína desnaturada com todos os resíduos de cisteína bloqueados através de sulfitolização. A solução é centrifugada a 40000 rpm numa ultracentrifuga Beckman durante 30 min. O sobrenadante é diluido com 3-5 volumes de tampão da coluna quelante de metais (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) e filtrado através de filtros de 0,22 micrómetros para clarificar. O extracto clarificado é carregado numa coluna de quelato de metais Qiagen Ni2+-NTA de 5 ml equilibrada no tampão da coluna quelante de metais. A coluna é lavada com tampão adicional contendo imidazole 50 mM (Calbiochem, qualidade Utrol), pH 7,4. A proteína é eluída com tampão contendo imidazole 250 mM. As fracções contendo a proteína desejada são reunidas e armazenadas a 4°C. A concentração proteica é estimada através da sua absorvância a 280 nm 94

ΕΡ 1 484 338 /PT utilizando o coeficiente de extinção calculado com base na sua sequência de aminoácidos.

As proteínas são redobradas através de diluição da amostra lentamente para tampão de redobragem preparado de fresco consistindo em: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, ureia 2,5 M, cisteina 5 mM, glicina 20 mM e EDTA 1 mM. Os volumes de redobragem são escolhidos de modo a que a concentração proteica final esteja entre 50 e 100 microgramas/ml. A solução de redobragem é agitada suavemente a 4°C durante 12-36 horas. A reacção de redobragem é extinta através da adição de TFA até uma concentração final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de mais purificação da proteína, a solução é filtrada através de um filtro de 0,22 micrómetros e é adicionado acetonitrilo até uma concentração final de 2-10%. A proteína redobrada é cromatografada numa coluna de fase inversa Pores Ri/H utilizando um tampão móvel de TFA a 0,1% com eluição com um gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%. As alíquotas de fracções com uma absorvância de Ai8o são analisadas em géis de SDS-poliacrilamida e as fracções contendo proteína redobrada homogénea são reunidas. Geralmente, as espécies correctamente redobradas da maioria das proteínas são eluídas nas menores concentrações de acetonitrilo uma vez que essas espécies são a mais compactas com os seus interiores hidrófobos são escudados da interacção com a resina de fase inversa. As espécies agregadas são habitualmente eluídas a concentrações mais elevadas de acetonitrilo. Para além da resolução das formas mal dobradas das proteínas da forma desejada, o passo de fase inversa remove também a endotoxina das amostras.

As fracções contendo o polipéptido PRO320 dobrado desejado são reunidas e o acetonitrilo é removido utilizando uma corrente suave de azoto dirigida à solução. As proteína são formuladas em HEPES 20 mM, pH 6,8 com cloreto de sódio 0,14 M e manitol a 4% através de diálise ou através de filtração em gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas no tampão de formulação e filtradas para esterilização. 95

ΕΡ 1 484 338 /PT

Em WO 00/37638, os polipéptidos foram expressos com sucesso em E. coli numa forma marcada com poli-His através do procedimento de cima. EXEMPLO 5

Expressão de PRQ320 em células de mamífero

Este exemplo ilustra a preparação de uma forma potencialmente glicosilada de PRO320 através de expressão recombinante em células de mamífero. O vector, pRK5 (ver EP 307247, publicada a 5 de Março de 1989), é empregue como vector de expressão. Opcionalmente, o ADN de PRO320 é ligado em pRK5 com enzimas de restrição seleccionadas para permitir a inserção do ADN de PRO320 utilizando métodos de ligação tais como descritos em Sambrook et al., supra. O vector resultante é designado pTK5-PRO320.

Numa concretização, as células hospedeiras seleccionadas podem ser células 293. As células 293 humanas (ATCC CCL 1573) são criadas até à confluência em placas de cultura de tecidos em meio tal como DMEM suplementado com soro fetal bovino e, opcionalmente, componentes nutrientes e/ou antibióticos. Cerca de 10 pg de ADN de pRK5-PRO320 são misturados com cerca de 1 pg de ADN codificando o gene de ARN de VA (Thimmappaya et al., Cell 31:543, 1982) e dissolvidos em 500 pl de Tris-HC1 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl2 0,227 Μ. A esta mistura são adicionados, às gotas, 500 pl de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPCg 1,5 mM e deixa-se formar um precipitado durante 10 minutos a 25°C. O precipitado é suspenso e adicionado às células 293 e deixado assentar durante cerca de quatro horas a 37°C. O meio de cultura é aspirado e são adicionados 2 ml de glicerol a 20% em PBS durante 30 segundos. As células 293 são então lavadas com meio isento de soro, é adicionado meio fresco e as células são incubadas durante cerca de 5 dias.

Aproximadamente 24 horas após as transfecções, o meio de cultura é removido e substituído por meio de cultura (sozinho) ou meio de cultura contendo 200 pCi/ml de 35S-cisteína e 200 pCi/ml de 35S-metionina. Após uma incubação de 12 horas, o meio condicionado é recolhido, concentrado num 96

ΕΡ 1 484 338 /PT filtro de centrifugação e carregado num gel de SDS a 15%. 0 gel processado pode ser seco e exposto a película durante um periodo de tempo seleccionado para revelar a presença do polipéptido PRO320. As culturas contendo células transfectadas podem ser sujeitas a mais incubação (em meio isento de soro) e o meio é testado em bioensaios seleccionados.

Numa técnica alternativa, PRO320 pode ser introduzido transientemente em células 293 utilizando o método de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 12:7575, 1981, as células 293 são criadas até à densidade máxima num balão de rotação e são adicionados 700 pg de ADN de pRK5-PRO320. As células são primeiro concentradas a partir do balão de rotação por centrifugação e lavadas com PBS. O precipitado de ADN-dextrano é incubado no sedimento celular durante quatro horas. As células são tratadas com glicerol a 20% durante 90 segundos, lavadas com meio de cultura de tecidos e reintroduzidas no balão de rotação contendo meio de cultura de tecidos, 5 pg/ml de insulina bovina e 0,1 pg/ml de transferrina bovina. Após cerca de quatro dias, os meios condicionados são centrifugados e filtrados para remover as células e os restos celulares. A amostra contendo PRO320 expresso pode então ser concentrada e purificada através de qualquer método seleccionado, tal como diálise e/ou cromatografia de coluna.

Noutra concretização, pode ser expresso em células CHO. O pRK5-PRO320 pode ser transfectado para células CHO utilizando reagentes conhecidos tais como CaPO ou DEAE-dextrano. Tal como descrito acima, as culturas celulares podem ser incubadas e o meio substituído por meio de cultura (sozinho) ou meio contendo um radiomarcador tal como "S-metionina". Após a determinação da presença de um polipéptido PRO320, o meio de cultura pode ser substituído por meio isento de soro. De preferência, as culturas são incubadas durante cerca de 6 dias e depois o meio condicionado é colhido. O meio contendo o polipéptido PRO320 expresso pode então ser concentrado e purificado através de qualquer método seleccionado. 97

ΕΡ 1 484 338 /PT Ο PRO320 marcado com epítopo pode também ser expresso em células hospedeiras CHO. 0 PRO320 pode ser subclonado a partir do vector pRK5. A inserção do subclone pode ser sujeita a PCR para se fundir de modo enquadrado com um marcador de epítopo seleccionado tal como um marcador poli-His num vector de expressão de Baculovírus. A inserção de PRO320 marcado com poli-His pode ser subclonada num vector conduzido por SV40 contendo um marcador de selecção tal como DHFR para selecção de clones estáveis. Finalmente, as células CHO podem ser transfectadas (tal como descrito acima) com o vector conduzido por SV40. A marcação pode ser efectuada, tal como descrito acima, para verificar a expressão. 0 meio de cultura contendo o PRO320 marcado com poli-His expresso pode então ser concentrado e purificado através de qualquer método seleccionado, tal como cromatografia de afinidade de Ni2+-quelato. PRO320 pode também ser expresso em células CHO e/ou COS através de um procedimento de expressão transiente ou em células CHO através de outro procedimento de expressão estável. A expressão estável em células CHO é efectuada utilizando o seguinte procedimento. As proteínas são expressas como uma construção de IgG (imunoadesina), na qual as sequências de codificação para as formas solúveis (p. ex., domínios extracelulares) das respectivas proteínas são fundidas com uma sequência da região constante de igGl contendo os domínios de charneira, CH2 e CH2 e/ou como uma forma marcada com poli-His.

Após amplificação por PCR, os respectivos ADN são subclonados num vector de expressão de CHO utilizando técnicas padrão tal como descrito em Ausubel et al., "Current Protocols of Molecular Biology", Unidade 3.16, John Wiley and Sons (1997). Os vectores de expressão de CHO são construídos para terem locais de restrição compatíveis 5' e 3' do ADN de interesse para permitir o vaivém conveniente dos ADNc. 0 vector utilizado na expressão em células CHO é tal como descrito em Lucas et al., Nuc. Acids Res. 24:9 (1774-1779), 1996 e utiliza o promotor/estimulador inicial de SV40 para conduzir a expressão do ADNc de interesse e da di- 98

ΕΡ 1 484 338 /PT hidrofolato-redutase (DHFR). A expressão de DHFR permite a selecção da manutenção estável do plasmídeo após a transfecção.

Doze microgramas do ADN plasmídico desejado são introduzidos em aproximadamente 10 milhões de células CHO utilizando os reagentes de transfecção comercialmente disponíveis Superfect® (Qiagen), Dosper® ou Fugene® (Boehringer Mannheim). As células são criadas tal como descrito em Lucas et al., supra. Aproximadamente 3xl0~7 células são congeladas numa ampola para mais crescimento e produção tal como descrito abaixo.

As ampolas contendo o ADN plasmidico são descongeladas através da colocação num banho-maria e mistura sujeitando a vórtice. O conteúdo é pipetado para um tubo de centrífuga contendo 10 ml de meio e centrifugado a 1000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante é aspirado e as células são ressuspensas em 10 ml de meio selectivo (PS20 filtrado a 0,2 pm com soro fetal bovino diafiltrado a 0,2 pm a 5%). As células são então divididas em alíquotas para um frasco de agitação de 250 ml enchido com 150 ml de meio de crescimento selectivo e incubadas a 37°C. Após mais 2-3 dias, frascos de agitação de 250 ml, 500 ml e 2000 ml são semeados com 3xl03 células/ml. Os meios das células são mudados com meios frescos através de centrifugação e ressuspensão em meio de produção. Embora possa ser empregue qualquer meio de CHO adequado, pode de facto ser utilizado um meio de produção descrito na Patente U.S. N° 5 122 469, publicada a 16 de Junho de 1992. Um frasco de agitação de produção de 3 1 é semeado a 2xl06 células/ml. No dia 0, o número de células e o pH são determinados. No dia 1, o frasco é amostrado e é iniciado o arejamento com ar filtrado. No dia 2, o frasco é amostrado, a temperatura é mudada para 33°C e são tomados 30 ml de glicose a 500 g/1 e 0,6 ml de anti-espuma a 10% (p. ex., emulsão de polidimetilsiloxano a 35%, Dow Corning 365 Medicai Grade Emulsion). Ao longo da produção, o pH é ajustado conforme necessário para se manter em torno de 7,2. Após 10 dias, ou até a viabilidade cair abaixo de 70%, a cultura celular é colhida através de centrifugação e filtração através de um filtro de 0,22 pm. O filtrado é 99

ΕΡ 1 484 338 /PT armazenado a 4°C ou imediatamente carregado em colunas para purificação.

Para as construções marcadas com poli-His, as proteínas são purificadas utilizando uma coluna de Ni2+-NTA (Qiagen) . Antes da purificação, é adicionado imidazole aos meios condicionados a uma concentração de 5 mM. Os meios condicionados são bombeados para uma coluna de Ni2+-NTA de 6 ml equilibrada em Hepes 20 mM, pH 7,4, o tampão contendo NaCl 0,3 M e imidazole 5 mM a um caudal de 4-5 ml/min. a 4°C. Após o carregamento, a coluna é lavada com tampão de equilíbrio adicional e a proteína é eluída com tampão de equilíbrio contendo imidazole 0,25 Μ. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada num tampão de armazenamento contendo Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M e manitol a 4%, pH 6,8, com uma coluna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml e armazenada a -80°C.

As construções de imunoadesina (contendo Fc) são purificadas a partir dos meios condicionados como se segue. O meio condicionado é bombeado para uma coluna de proteína A (Pharmacia) de 5 ml que foi equilibrada em tampão fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Após o carregamento, a coluna é lavada extensivamente com tampão de equilíbrio antes da eluição com ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. A proteína eluída é imediatamente neutralizada através da colheita de fracções de 1 ml para tubos contendo 275 μΐ de tampão Tris 1 M, pH 9. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada em tampão de armazenamento tal como descrito acima para as proteínas marcadas com poli-His. A homogeneidade é avaliada através de géis de SDS- poliacrilamida e através de sequenciação dos aminoácidos N-terminais através de degradação de Edman. PRO320 foi estavelmente expresso em células CHO através do método acima descrito. Adicionalmente, os polipéptidos foram expressos em células CHO através do procedimento de expressão transiente em WO 00/37638. 100

ΕΡ 1 484 338 /PT EXEMPLO 6

Expressão de PRQ320 em levedura O seguinte método descreve a expressão recombinante de PRO320 em levedura.

Primeiro, vectores de expressão de levedura são construídos para produção intracelular ou secreção de PRO320 a partir do promotor de ADH2/GAPDH. O adn codificando PRO320 e o promotor são inseridos em locais de enzimas de restrição apropriados no plasmideo seleccionado para dirigir a expressão intracelular de PRO320. Para segregação, o ADN codificando PRO320 pode ser clonado no plasmideo seleccionado, juntamente com o ADN codificando o promotor de ADH2/GAPDH, um péptido de sinal nativo de PRO320 ou outro péptido de sinal de mamifero, ou, por exemplo, uma sequência de sinal/comando de secreção do factor-alfa ou da invertase de levedura e sequências ligantes (se necessário) para expressão de PRO320.

As células de levedura, tais como a estirpe de levedura AB110, podem então ser transformadas com os plasmideos de expressão descritos acima e cultivadas em meios de fermentação seleccionados. Os sobrenadantes das leveduras transformadas podem ser analisados através de precipitação com ácido tricloroacético a 10% e separação através de SDS-PAGE, seguido de coloração dos géis com corante Azul de Coomassie. O PRO320 recombinante pode ser subsequentemente isolado e purificado através da remoção das células de levedura do meio de fermentação através de centrifugação e depois concentração do meio utilizando filtros de cartucho seleccionados. O concentrado contendo PRO320 pode ainda ser purificado utilizando resinas de cromatografia de coluna seleccionadas. 101

ΕΡ 1 484 338 /PT EXEMPLO 7

Expressão de PRQ320 em células de insecto infectadas por Baculovírus O seguinte método descreve a expressão recombinante em células de insecto infectadas por Baculovírus. A sequência de codificação para PRO320 é fundida a montante de um marcador de epítopo contido dentro de um vector de expressão de baculovírus. Tais marcadores de epítopos incluem marcadores poli-His e marcadores de imunoglobulina (tais como regiões Fc de IgG). Pode ser empregue uma variedade de plasmídeos, incluindo plasmídeos derivados de plasmídeos comercialmente disponíveis tais como pVLl393 (Novagen). Resumidamente, a sequência de codificação de PRO320 ou a porção desejada da sequência de codificação de PRO320 (tal como a sequência de codificação do domínio extracelular de uma proteína transmembranar ou a sequência de codificação da proteína madura se a proteína for extracelular) é amplificada através de PCR com iniciadores complementares às regiões 5' e 3'. O iniciador 5' pode incorporar locais de enzimas de restrição flanqueadores (seleccionados). O produto é então digerido com as enzimas de restrição seleccionadas e subclonado no vector de expressão. O baculovírus recombinante é gerado através de co-transfecção do plasmídeo de cima e adn do vírus BaculoGoldTM (Pharmingen) em células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (comercialmente disponível em GIBCO-BRL). Após 4-5 dias de incubação a 28°C, os vírus libertados são colhidos e utilizados para mais amplificações. A infecção virai e a expressão proteica são efectuadas tal como descrito por 0'Reilley et al., "Baculovírus expression vectors: A Laboratory Manual", Oxford: Oxford University Press (1994). O PRO320 marcado com poli-His pode então ser purificado, por exemplo, através de cromatografia de afinidade de Ni2+-quelato como se segue. Os extractos são preparados a partir de células Sf9 infectadas com vírus recombinante tal como descrito por Rupert et al., Nature 362:175-179, 1993. 102

ΕΡ 1 484 338 /PT

Resumidamente, as células Sf9 são lavadas, ressuspensas em tampão de ultra-sons (Hepes 25 mM, pH 7,9; MgCl2 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol a 10%; NP-40 a 0,1%; KC1 0,4 M) e sujeitas a ultra-sons duas vezes durante 20 segundos em gelo. As células sujeitas a ultra-sons são clarificadas através de centrifugação e o sobrenadante é diluído 50 vezes em tampão de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol a 10%, pH 7,8) e filtrado através de um filtro de 0,45 mm. Uma coluna de agarose de Ni2+-NTA (comercialmente disponível em Qiagen) é preparada com um volume de leito de 5 ml, lavada com 25 ml de água e equilibrada com 25 ml de tampão de carga. O extracto celular filtrado é carregado na coluna a 0,5 ml por minuto. A coluna é lavada até à A280 limiar com tampão de carga, ponto ao qual é iniciada a recolha das fracções. A seguir, a coluna é lavada com um tampão de lavagem secundário (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM; glicerol a 10%, pH 6,0), que elui a proteína ligada de modo não específico. Após se alcançar novamente uma A28o limiar, a coluna é revelada com um gradiente de imidazole de 0 a 500 mM no tampão de lavagem secundário. Fracções de 1 ml são colhidas e analisadas através de SDS-page e coloração com prata ou "Western blot" com Ni2+-NTA conjugado com fosfatase alcalina (Qiagen) . As fracções contendo o PRO320 marcado com Hisio eluído são reunidas e dialisadas novamente contra o tampão de carga.

Alternativamente, a purificação do PRO320 marcado com IgG (ou marcado com Fc) pode ser efectuada utilizando técnicas de cromatografia conhecidas, incluindo por exemplo, cromatografia de coluna de Proteína A ou proteína G.

Após a amplificação por PCR, as respectivas sequências de codificação são subclonadas num vector de expressão de baculovírus (pb.PH.igG para fusões de IgG e pb.PH.His.c para proteínas marcadas com poly-His) e o ADN do vector e do baculovírus Baculogold® (Pharmingen) são co-transfectados para 105 células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (GIBCO-BRL). pb.PH.IgG e pb.PH.His são modificações do vector de expressão de baculovírus comercialmente disponível pVLl393 (Pharmingen), com regiões poliligantes modificadas para incluir as sequências marcadoras de His ou Fc. As células são criadas em meio TNM-FH de Hink suplementado com FBS a 10% (Hyclone). As 103

ΕΡ 1 484 338 /PT células são incubadas durante 5 dias a 28°C. O sobrenadante é colhido e subsequentemente utilizado para a primeira amplificação virai através da infecção das células Sf9 em meio TNM-FH de Hink suplementado com FBS a 10% a uma multiplicidade de infecção (MOI) aproximada de 10. As células são incubadas durante 3 dias a 28°C. O sobrenadante é colhido e a expressão das construções no vector de expressão de baculovirus é determinada através da ligação de lotes de 1 ml do sobrenadante a 25 ml de contas de Ni2+-NTA (Qiagen) para proteínas marcadas com histidina ou contas de Proteína A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) para proteínas marcadas com IgG seguido de análise de SDS-PAGE para comparação com uma concentração conhecida da proteína padrão através de coloração de azul de Coomassie. O sobrenadante da primeira amplificação virai é utilizado para infectar uma cultura em agitação (500 ml) de células Sf9 criadas em meio ESF-921 (Expression Systems LLC) a uma MOI aproximada de 0,1. As células são incubadas durante 3 dias a 28°C. O sobrenadante é colhido e filtrado. A ligação de lotes e a análise de SDS-PAGE é repetida, conforme necessário até à expressão da cultura em agitação ser confirmada. O meio condicionado das células transfectadas (0,5 a 31) é colhido através de centrifugação para remover as células e filtrado através de filtros de 0,22 micrómetros. Para as construções marcadas com poli-His, a construção proteica é purificada utilizando uma coluna de Ni2+-NTA (Qiagen). Antes da purificação é adicionado imidazole aos meios condicionados até uma concentração de 5 mM. Os meios condicionados são bombeados para uma coluna de Ni2+-NTA de 6 ml equilibrada em tampão Hepes 20 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,3 M e imidazole 5 mM a um caudal de 4-5 ml/min a 4°C. Após o carregamento, a coluna é lavada com mais tampão de equilíbrio e a proteína é eluída com tampão de equilíbrio contendo imidazole 0,25 Μ. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada num tampão de armazenamento contendo Hepes 10 mM, NaCl 0,14 Me manitol a 4%, pH 6,8, com uma coluna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml e armazenada a -80 °C. 104

ΕΡ 1 484 338 /PT

As construções de imunoadesina (contendo Fc) das proteínas são purificadas a partir dos meios condicionados como se segue. Os meios condicionados são bombeados para uma coluna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que foi equilibrada com tampão fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Após o carregamento, a coluna é lavada extensivamente com tampão de equilíbrio antes da eluição com ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. A proteína eluída é imediatamente neutralizada através da colheita de fracções de 1 ml para tubos contendo 275 ml de tampão Tris 1 M, pH 9. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada em tampão de armazenamento tal como descrito acima para as proteínas marcadas com poli-His. A homogeneidade das proteínas é verificada através de electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PEG) e sequenciação dos aminoácidos N-terminais através de degradação de Edman.

Os polipéptidos foram expressos em células de insecto Sf9 infectadas com baculovírus em WO 00/376638.

Alternativamente, pode ser utilizado um procedimento modificado de baculovírus incorporando células High-5. Neste procedimento, o ADN codificando a sequência desejada é amplificado com sistemas adequados, tais como Pfu (Stratagene), ou fundido a montante (a 5') de um marcador de epítopo contido num vector de expressão de baculovírus. Tais marcadores de epítopo incluem marcadores poli-His e marcadores de imunoglobulina (tais como regiões Fc de igG) . Pode ser empregue uma variedade de plasmídeos, incluindo plasmídeos derivados de plasmídeos comercialmente disponíveis tais como pIEl-1 (Novagen). Os vectores plEl-1 e pIEl-2 são desenhados para expressão constitutiva de proteínas recombinantes a partir do promotor iel de baculovírus em células de insecto estavelmente transformadas (I) . Os plasmídeos diferem apenas na orientação dos locais de clonagem múltipla e contêm todas as sequências de promotores que se sabe serem importantes para a expressão génica mediada por iel em células de insecto não infectadas bem como o elemento estimulador de hr5, pIEl-1 e pIEl-2 incluem o local de início da tradução e podem ser utilizados para produzir proteínas de fusão. Resumidamente, a sequência desejada ou a porção desejada da sequência (tal como a sequência de 105

ΕΡ 1 484 338 /PT codificação do domínio extracelular de uma proteína transmembranar) é amplificada através de PCR com iniciadores complementares às regiões 5' e 3'. O iniciador 5' pode incorporar locais de enzimas de restrição flanqueadores (seleccionados). O produto é então digerido com essas enzimas de restrição seleccionadas e subclonado no vector de expressão. Por exemplo, os derivados de pIEl-1 podem inclui a região Fc da IgG humana (pb.PH.lgG) ou um marcador de 8 histidinas (pb.PH.His) a jusante (a 3') da sequência desejada. De preferência, a construção do vector é sequenciada para confirmação.

As células High-5 são criadas até uma confluência de 50% sob as condições de 27°C, ausência de C02, sem pen/estrep. Para cada placa de 150 mm, são misturados 30 pg de vector baseado em pIE contendo a sequência com 1 ml de meio Ex-Cell (Meios: Ex.Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences # 14401-78P (nota: estes meios são sensíveis à luz) e num tubo separado, 100 μΐ de CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL #10362-010) (sujeito a vórtice para misturar)) são misturados com 1 ml de meio Ex-Cell. As duas soluções são combinadas e deixadas a incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos. 8 ml de meio Ex-Cell são adicionados aos 2 ml de mistura ADN/CellFECTIN e estes são vertidos sobre as células High-5 que foram lavadas uma vez com o meio Ex-Cell. A placa é então incubada no escuro durante 1 hora à temperatura ambiente. A mistura ADN/CellFECTIN é então aspirada e as células são lavadas uma vez com Ex-Cell para remover o excesso de CellFECTIN, 30 ml de meio Ex-Cell fresco são adicionados e as células são incubadas durante 3 dias a 28°C. O sobrenadante é colhido e a expressão da sequência no vector de expressão de baculovírus é determinada através da ligação de lotes de 1 ml do sobrenadante a 25 ml de contas de Ní2+-nta (Qiagen) para proteínas marcadas com histidina ou contas de Proteína A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) para proteínas marcadas com IgG seguido de análise de SDS-PAGE para comparação com uma concentração conhecida da proteína padrão através de coloração com azul de Coomassie. O meio condicionado das células transfectadas (0,5 a 31) é colhido através de centrifugação para remover as células e filtrado através de filtros de 0,22 micrómetros. 106

ΕΡ 1 484 338 /PT

Para as construções marcadas com poli-His, a construção proteica compreendendo a sequência é purificada utilizando uma coluna de Ni2+-NTA (Qiagen). Antes da purificação é adicionado imidazole aos meios condicionados até uma concentração de 5 mM. O meio condicionado é bombeado para uma coluna de Ni2+-NTA de 6 ml equilibrada em tampão Hepes 20 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,3 M e imidazole 5 mM a um caudal de 4-5 ml/min a 48°C. Após o carregamento, a coluna é lavada com mais tampão de equilíbrio e a proteina é eluida com tampão de equilíbrio contendo imidazole 0,25 Μ. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada num tampão de armazenamento contendo Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M e manitol a 4%, pH 6,8, com uma coluna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml e armazenada a -80°C.

As construções de imunoadesina (contendo Fc) das proteínas são purificadas a partir dos meios condicionados como se segue. O meio condicionado é bombeado para uma coluna de Proteína A (Pharmacia) de 5 ml que foi equilibrada em tampão fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Após o carregamento, a coluna é lavada extensivamente com tampão de equilíbrio antes da eluição com ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. A proteína eluida é imediatamente neutralizada através da colheita de fracções de 1 ml para tubos contendo 275 ml de tampão Tris 1 M, pH 9. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada em tampão de armazenamento tal como descrito acima para as proteínas marcadas com poli-His. A homogeneidade da sequência é avaliada através de géis de SDS-poliacrilamida e através de sequenciação dos aminoácidos N-terminais através de degradação de Edman e de outros procedimentos analíticos conforme desejado ou necessário.

Os polipéptidos foram expressos utilizando o procedimento de baculovírus de cima empregando células High-5 em WO/37638. EXEMPLO 8

Preparação de anticorpos que se ligam a PRQ320

Este exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais que se podem ligar especificamente a PRO320. 107

ΕΡ 1 484 338 /PT

As técnicas para produção de anticorpos monoclonais são conhecidas na especialidade e estão descritas, por exemplo, em Goding, supra. Os imunogénios que podem ser empregues incluem PRO320 purificado, proteínas de fusão contendo PRO320 e células que expressem PRO320 recombinante à superfície da célula. A selecção do imunogénio pode ser feita pelo perito na especialidade sem demasiada experimentação.

Ratinhos, tais como Balb/c, são imunizados com o imunogénio de PRO320 emulsionado em adjuvante completo de Freund e injectado subcutaneamente ou intraperitonealmente numa quantidade de 1-100 microgramas. Alternativamente, o imunogénio é emulsionado em adjuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) e injectado nas almofadas das patas traseiras dos animais. Os ratinhos imunizados são então reforçados 10 a 12 dias depois com imunogénio adicional emulsionado no adjuvante seleccionado. A partir dai, durante várias semanas, os ratinhos podem também ser reforçados com injecções de imunização adicionais. Amostras de soro podem ser periodicamente obtidas dos ratinhos através de sangria retro-orbital para testes em ensaios ELISA para detectar anticorpos anti-PRO320.

Após ser detectado um título de anticorpo adequado, os animais "positivos" para os anticorpos podem ser injectados com uma injecção intravenosa final de PRO320. Três a quatro dias depois, os ratinhos são sacrificados e são colhidas células do baço. As células do baço são então fundidas (utilizando polietilenoglicol a 35%) com uma linha celular de mieloma de murídeo seleccionada tal como P3Z63AgU.l, disponível em ATCC, CRL N° 1597. As fusões geram células de hibridoma que podem então ser plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços contendo meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibir a proliferação das células não fundidas, híbridos de mieloma e híbridos de células do baço.

As células de hibridoma serão pesquisadas num ELISA quanto à reactividade contra PRO320. A determinação de células de hibridoma "positivas" que segregam os anticorpos monoclonais desejados contra PRO320 está dentro da perícia na especialidade. 108

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As células de hibridoma positivas podem ser injectadas intraperitonealmente em ratinhos Balb/c singénicos para produzir ascites contendo os anticorpos monoclonais anti-PRO320. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser criadas em balões de cultura de tecidos ou garrafas rolantes. A purificação dos anticorpos monoclonais produzidos nas ascites pode ser alcançada utilizando precipitação com sulfato de amónio, seguido de cromatografia por exclusão em gel. Alternativamente, pode ser empregue cromatografia de afinidade baseada na ligação do anticorpo à proteína A ou à proteína G. EXEMPLO 9

Purificação de polipéptidos PRQ320 utilizando anticorpos específicos

Os polipéptidos PRO320 nativos ou recombinantes podem ser purificados através de uma variedade de técnicas padrão na especialidade de purificação de proteínas. Por exemplo, polipéptido pró-PRO320, polipéptido PRO320 maduro ou polipéptido pré-PRO320 é purificado através de cromatografia de imunoafinidade utilizando anticorpos específicos para o polipéptido PRO320 de interesse. Em geral, uma coluna de imunoafinidade é construída através da ligação covalente do anticorpo anti-polipéptido PRO320 a uma resina cromatográfica activada.

As imunoglobulinas policlonais são preparadas a partir de soros imunes através de precipitação com sulfato de amónio ou através de purificação em Proteína A imobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Do mesmo modo, os anticorpos monoclonais são preparados a partir de fluído de ascites de ratinho através de precipitação com sulfato de amónio ou de cromatografia em Proteína A imobilizada. A imunoglobulina parcialmente purificada é covalentemente ligada a uma resina cromatográfica tal como SEPHAROSE™ activada com CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). O anticorpo é ligado à resina, a resina é blogueada e a resina derivada é lavada de acordo com as instruções do fabricante. 109

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Uma tal coluna de imunoafinidade é utilizada na purificação do polipéptido PRO320 através da preparação de uma fracção a partir de células contendo o polipéptido PRO320 numa forma solúvel. Esta preparação é derivada através de solubilização da célula inteira ou de uma fracção subcelular obtida por centrifugação diferencial através da adição de detergente ou através de outros método bem conhecidos na especialidade. Alternativamente, o polipéptido PRO320 solúvel contendo uma sequência de sinal pode ser segregado numa quantidade útil para o meio no qual as células são criadas.

Uma preparação contendo polipéptido PRO320 solúvel é passada através de uma coluna de imunoafinidade e a coluna é lavada sob condições que permitem a absorção preferencial do polipéptido PRO320 (ou seja, tampões de elevada força iónica na presença de detergente). Depois, a coluna é eluida sob condições que destroem a ligação anticorpo/polipéptido PRO320 (ou seja, um tampão de pH baixo tal como aproximadamente pH 2-3, ou uma elevada concentração de um caotropo tal como ureia ou ião tiocianato) e o polipéptido PRO320 é recolhido. EXEMPLO 10

Pesquisa de fármacos

Este invento é particularmente útil para pesquisar compostos através da utilização de polipéptidos PRO320 ou de um seu fragmento de ligação em qualquer uma de uma variedade de técnicas de pesquisa de fármacos. O polipéptido PRO320 ou fragmento empregue num tal teste pode estar livre em solução, afixado num suporte sólido, preso numa superfície celular ou localizado intracelularmente. Um método de pesquisa de fármacos utiliza células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas que são estavelmente transformadas com ácidos nucleicos recombinantes expressando o polipéptido PRO320 ou o fragmento. Os fármacos são pesquisados contra tais células transformadas em ensaios de ligação competitiva. Tais células, na forma viável ou fixada, podem ser utilizados para ensaios de ligação padrão. Pode medir-se, por exemplo, a formação de complexos entre um polipéptido PRO320 ou um fragmento e o agente a testar. Alternativamente, pode-se examinar a diminuição da formação do complexo entre o 110

ΕΡ 1 484 338 /PT polipéptido PRO320 e a sua célula alvo ou receptores alvo causada pelo agente a testar.

Assim, o presente invento proporciona métodos de pesquisa de fármacos ou de quaisquer outros agentes que possam afectar uma doença ou distúrbio associado ao polipéptido PRO320. Estes métodos compreendem o contacto de um tal agente com um polipéptido PRO320 ou um seu fragmento e o ensaio (i) quanto à presença de um complexo entre o agente e o polipéptido PRO320 ou fragmento, ou (ii) quanto à presença de um complexo entre o polipéptido PRO320 ou fragmento e a célula, através de métodos bem conhecidos na especialidade. Em tais ensaios de ligação competitiva, o polipéptido PRO320 ou fragmento é tipicamente marcado. Após uma incubação adequada, o polipéptido PRO320 livre ou fragmento é separado do presente na forma ligada, e a quantidade de marcador livre ou não complexado é uma medida da capacidade do agente particular para se ligar ao polipéptido PRO320 ou para interferir com o complexo polipéptido PRO320/célula.

Outra técnica para a pesquisa de fármacos proporciona uma pesquisa de elevado rendimento para compostos possuindo uma afinidade de ligação adequada para um polipéptido e está descrita em detalhe em WO 84/03564, publicado a 13 de

Setembro de 1984. Resumidamente, um grande número de pequenos compostos de teste peptidicos diferentes é sintetizado num substrato sólido, tal como alfinetes de plástico ou alguma outra superfície. Aplicado a um polipéptido PRO320, os compostos de teste peptidicos são feitos reagir com o polipéptido PRO320 e lavados. O polipéptido PRO320 ligado é detectado através de métodos bem conhecidos na especialidade. O polipéptido PRO320 purificado pode também ser revestido directamente sobre placas para utilizar nas técnicas de pesquisa acima mencionadas. Adicionalmente, podem ser utilizados anticorpos não neutralizantes para capturar o péptido e imobilizá-lo no suporte sólido.

Este invento contempla também a utilização de ensaios de pesquisa de fármacos competitivos nos quais os anticorpos neutralizantes capazes de se ligar a um polipéptido PRO320 competem especificamente com um composto de teste pela 111 ΕΡ 1 484 338 /PT ligação ao polipéptido PRO320 ou a seus fragmentos. Deste modo, os anticorpos podem ser utilizados para detectar a presença de qualquer péptido que partilhe um ou mais determinantes antigénicos com um polipéptido PRO320. EXEMPLO 11

Desenho Racional de Fármacos 0 objectivo do desenho racional de fármacos é produzir análogos estruturais de um polipéptido biologicamente activo de interesse (ou seja, um polipéptido PRO320) ou de moléculas pequenas com as quais ele interaja ou seja, agonistas, antagonistas ou inibidores. Qualquer um destes exemplos pode ser utilizado para desenhar fármacos que sejam formas mais activas ou estáveis do polipéptido PRO320 ou que aumentem ou interfiram com a função do polipéptido PRO320 in vivo {c.f., Hodgson, Bio/Technology 9:19-21, 1991).

Numa abordagem, a estrutura tridimensional do PRO320 ou de um complexo inibidor do polipéptido PRO320, é determinada através de cristalografia de raios-X, através de modelação por computador ou mais tipicamente, através de uma combinação das duas abordagens. Tanto a forma como as cargas do polipéptido PRO320 têm de ser averiguadas para elucidar a estrutura e determinar o local ou os locais activos da molécula. Menos frequentemente, pode obter-se informação útil em relação à estrutura do polipéptido PRO320 através de modelação baseada na estrutura de proteínas homólogas. Em ambos os casos, a informação estrutural relevante é utilizada para desenhar moléculas semelhantes ao polipéptido PRO320 análogas ou para identificar inibidores eficientes. Exemplos úteis do desenho racional de fármacos podem incluir moléculas que tenham uma actividade ou estabilidade melhoradas tal como mostrado por Braxton e Wells, Biochemistry 31:7796-7801, 1992, ou que actuem como inibidores, agonistas ou antagonistas de péptidos nativos tal como mostrado por Athauda et al., J. Biochem. 113:742-746, 1993. É também possível isolar um anticorpo específico do alvo, seleccionado através de ensaio funcional, tal como descrito acima, e depois resolver a sua estrutura cristalina. 112

ΕΡ 1 484 338 /PT

Esta abordagem, em princípio, produz um "pharmacore" sobre o qual se pode basear o subsequente desenho de fármacos. É possível evitar a cristalografia de proteínas através da criação de anticorpos anti-idiotípicos (anti-id) para um anticorpo funcional farmacologicamente activo. Como uma imagem no espelho de uma imagem no espelho, espera-se que o local de ligação dos anti-id seja um análogo do receptor original. 0 anti-id pode então ser utilizado para identificar e isolar péptidos de bancos de péptidos produzidos quimicamente ou biologicamente. Os péptidos isolados actuariam então como "pharmacore".

Em virtude do presente invento, podem tornar-se disponíveis quantidades suficientes do polipéptido PRO320 para efectuar estudos analíticos tais como cristalografia de raios-X. Adicionalmente, o conhecimento da sequência de aminoácidos do polipéptido PRO320 aqui proporcionado proporcionará orientação aos que empregam técnicas de modelação por computador em vez ou para além da cristalografia de raios-X. EXEMPLO 12

Ensaio antitumoral in vitro A actividade anti-proliferativa dos polipéptidos PRO320 foi determinada no ensaio de identificação de fármacos anticancerosos in vitro de investigação orientada para a doença do National Câncer institute (NCI), utilizando um ensaio de ligação do corante sulfo-rodamina B (SRB) essencialmente tal como descrito por Skehan et al., J. Natl. Câncer Inst. 82:1107-1112, 1990. As 60 linhas celulares tumorais empregues neste estudo ("o painel NCI"), bem como as condições para a sua manutenção e cultura in vitro foram descritas por Monks et al., J. Natl. Câncer Inst. 83:757-766, 1991. O objectivo desta pesquisa é de avaliar inicialmente a actividade citotóxica e/ou citostática dos compostos de teste contra diferentes tipos de tumores (Monks et al., supra-, Boyd, Câncer. Princ. Pract. Oncol. Update 3(10):1-12, 1989). 113

ΕΡ 1 484 338 /PT Células de aproximadamente 60 linhas celulares tumorais humanas foram colhidas com tripsina/EDTA (Gibco), lavadas uma vez, ressuspensas em IMEM e foi determinada a sua viabilidade. As suspensões celulares foram adicionadas através de pipeta (volume de 100 μΐ) para placas de microtitulo de 96 poços. A densidade celular para a incubação de 6 dias foi inferior do que para a incubação de 2 dias para prevenir sobrecrescimento. Foi permitido aos inoculados um período de pré-incubação de 24 horas a 37°C para estabilização. Diluições a duas vezes a concentração de teste pretendida foram adicionadas no tempo zero em alíquotas de 100 μΐ aos poços de placas de microtitulo (diluição 1:2). Os compostos de teste foram avaliados em diluições de cinco semi-log (1000 a 100000 vezes). As incubações ocorreram durante dois dias e seis dias numa atmosfera de C02 a 5% e humidade a 100%.

Após incubação, o meio foi removido e as células foram fixadas em 0,1 ml de ácido tricloroacético a 10% a 40°C. As placas foram lavadas cinco vezes com água desionizada, secas, coradas durante 30 minutos com 0,1 ml de corante sulfo-rodamina B (Sigma) a 0,4% dissolvido em ácido acético a 1%, lavadas quatro vezes com ácido acético a 1% para remover o corante não ligado, secas e o corante foi extraído durante cinco minutos com 0,1 ml de Tris base 10 mM [tris(hidroximetil)aminometano], pH 10,5. A absorvância (DO) da sulfo-rodamina B a 492 nm foi medida utilizando um leitor de placas de microtitulo de 96 poços com uma interface computadorizada.

Uma amostra de teste é considerada positiva se mostrar pelo menos 40% de efeito inibidor do crescimento a uma ou mais concentrações. Os resultados são mostrados na seguinte Tabela 4, onde as abreviaturas do tipo de célula tumoral são como se segue: 114

ΕΡ 1 484 338 /PT NSCL = carcinoma de pulmão de células não pequenas; SNC = sistema nervoso central

Tabela 4

Composto Tipo de Célula Tumoral Designação PRO320 Leucemia CCRF-CEM: RPMl-8226 PRO320 NSCL HOP62; NCI 11322M PRO320 Cólon HCT-116 PRO320 Renal SN12C PRO320 Mama MDA-N PRO320 Ovário OVCAR-3 PRO320 Melanoma MALME-3M Depósito de material:

Os seguintes materiais foram depositados na American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, EUA (ATCC):

Material N° de Dep. ATCC Data de Depósito DNA32284-1307 209670 11 de Março de 1998

Este depósito foi efectuado segundo os termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes e seus Regulamentos (Tratado de Budapeste). Tal assegura a manutenção de uma cultura viável do depósito durante 30 anos a partir da data de depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC segundo os termos do Tratado de Budapeste e sujeito a um acordo entre a Genentech, Inc. e a ATCC, que assegura a disponibilidade permanente e sem restrições da descendência da cultura do depósito ao público após concessão da patente norte-americana pertinente ou após disponíveis ao público quaisquer pedidos de patente norte-americana ou estrangeira, o que ocorrer primeiro, e assegura a disponibilidade da descendência a quem determinado pelo U.S. Commissioner of Patents and Trademarks com esse direito de acordo com 35 U.S.C. §122 e as regras do Commissioner dai 115

ΕΡ 1 484 338 /PT decorrentes (incluindo 37 C.F.R. §1.14 com particular referência a 886 OG 638). 0 cessionário do presente pedido de patente concordou que, caso uma cultura dos materiais depositados morra ou se perca ou seja destruída quando cultivada em condições adequadas, os materiais serão prontamente substituídos após notificação, por outros equivalentes. A disponibilidade do material depositado não deve ser entendida como uma permissão para a prática do presente invento em contravenção dos direitos concedidos pela autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis relativas a patentes. 0 fascículo aqui escrito é considerado suficiente para permitir que um perito na especialidade ponha em prática o presente invento. 0 presente invento não está limitado no seu âmbito pela construção depositada, dado que a concretização depositada se destina unicamente a ilustração de certos aspectos do presente invento e outras construções que sejam funcionalmente equivalentes encontram-se no âmbito do presente invento. 0 depósito de material aqui não constitui uma admissão de que a descrição escrita aqui contida é inadequada para permitir a prática de qualquer aspecto do presente invento, incluindo o seu melhor modo, nem deve ser interpretada como limitante do âmbito das reivindicações às ilustrações específicas que representa. De facto, várias modificações para além das que são aqui mostradas e descritas serão evidentes para os peritos na especialidade a partir da descrição anterior e caem no âmbito das reivindicações anexas.

Listagem de Sequências <110> Genentech, Inc.

<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS NEOPLÁSICAS

<130> P2834RIPCT <140> EP04007617.6 <141> 1999-12-02 <150> EP99960644.5 <151> 1999-12-02 116

ΕΡ 1 484 338 /PT <15Ο> PCT/US99/28565 <151> 1999-12-02 <15Ο> US 60/113, 296 <151> 1998-12-22 <15Ο> PCT/US99/05028 <151> 1999-03-08 <15Ο> US 60/130, 232 <151> 1999-04-21 <15Ο> US 60/131, 445 <151> 1999-04-28 <15Ο> US 60/134, 287 <151> 1999-05-14 <15Ο> US 60/144, 758 <151> 1999-07-20 <15Ο> US 60/145, 698 <151> 1999-07-26 <15Ο> PCT/US99/21090 < 151> 1999-09-15 <150> PCT/US99/21547 < 151> 1999-09-15 <160> 5 <210> 1 <211> 2260

<212> ADN <213> Homo sapiens <2 2 Ο > <221> incerto <222> 2009, 2026, 2033, 2055, 2074, 2078, 2086 <223> base desconhecida <4 0 0> 1 cggacgcgtg ggtgcgagtg gagcggagga cccgagcggc tgaggagaga 50 ggaggcggcg gcttagctgc tacggggtcc ggccggcgec ctcccgaggg íoo gggctcagga ggaggaagga ggacccgtgc gagaatgcct ctgccctgga 150 117

ΕΡ 1 484 338 /PT gccttgcgct cecgctgctg ctctcctggg tggcaggtgg tttcgggaac 200 gcggccagtg caaggcatca cgggctgtta gcatcggcac gtcagcctgg 250 ggtctgtcac tatggaacta aactggcctg ctgctacggc tggagaagaa 300 acagcaaggg agtctgtgaa gctacatgcg aacctggatg caagtttggt 350 gagtgcgtgg gaccaaacaa atgcagatgc tttccaggat açaccgggaa 400 aacctgcagt caagatgtga atgagtgtgg aatgaaaccc cggccatgcc 450 aacacagatg tgtgaataca cacggaagct acaagtgctt ttgcctcagt 500 ggccacatgc tcatgecaga tgctacgtgt gtgaactcta ggacacgtgc 550 eatgataaac tgtcagtaca gctgtgaaga cacagaagaa gggccacagt 600 gcctgtgtcc atcctcagga ctccgcctgg ccccaaatgg aagagactgt 650 ctagatattg atgaatgtgc ctctggtaaa gtcatctgtc cctacaatcg 700 aagatgtgtg aacacatttg gaagctacta ctgcaaatgt cacattggtt 750

tcgaactgca ataeatcagt ggacgatatg actgtataga tataaatgaa SOO tgtactatgg atagccatac gtgcagccac catgccaatt gcttcaatac 850 ccaagggtcc ttcaagtgta aatgcaagca gggatataaa ggcaatggac 900 ttcggtgttc tgctatccct gaaaactctg tgaaggaagt ccccagagca 950 cctggtacca tcaaagacag aatcaagaag ttgcttgctc acaaaaacag 1000 catgaaaaag aaggcaaaaa teaaaaatgt taccccagaa cccaccagga 1050 ctcctacccc taaggtgaac ttgeagccct tcaactatga agagatagtt 1100 tccagaggcg ggaactccca tggaggcaaa aaagggaatg aagagaaacg 1150 aaagaggggc ctgaggacga gaaaagagaa gagaaagccc tgaagaatga 1200 catagaggag cgaagcctgc gaggagatgt gtttttccct aaggtgaatg 1250 aagcaggtga attcggcctg attctggtcc aaaggaaagc gctaacttcc 1300 aaactggaac ataaagattt aaatatctcg gttgactgca gcttcaatca 1350 tgggatctgt gactggaaac aggacagaga agatgatttt gactggaatc 1400 ctgctgatcg agataatgct attggcttct atatggcagt tccggccttg 1450 gcaggtcaca agaaagacat tggccgattg aaacttctcc cacctgacct 1500 gcaaccccaa agcaacttct gtttgccctt tgattaccgg ctggccggag 1550 acaaagtcgg gaaacttcga gtgtttgtga aaaacagtaa caatgccctg 1600 gcatgggaga agaccacgag tgaggatgaa aagtggaaga cagggaaaat 1650 tcagttgtat caaggaactg atgctaccaa aagcatcatt tttgaagcag 1700 aacgtggcaa gggcaaaacc ggcgaaateg cagtggatgg cgtcttgctt 1750 118

ΕΡ 1 484 338 /PT gtttcaggct tatgtccaga tagcctteta tctgtggatg actgaatgtc 1800 aetatettta tatttgactt tgtatgtcag ttccctggtt tttttgatat 1850 tgcatcatag gacctctggc attttagaat tactagctga aaaattgtaa 1900 tgtaccaaca gaaatattat tgtaagatgc ctttcttgta taagatatgc 1950 caatatttgc tttaaatatc atatcactgt atcttctcag tcatttctga 2000 atctttccnc attatattat aaaatntgga aangtcagtt tatctcccct 2050 cctcngtata tctgatttgt atangtangt tgatgngctt ctctctacaa 2100 catttctaga aaatagaaaa aaaagcacag agaaatgttt aactgtttga 21S0 ctettatgat acttcttgga aactatgaca tcaaagaCag acttttgcct 2200 aagtggctta gctgggtctt tcatagccaa acttgtatat ttaattettt 2250 gtaataataa 2260

<210> 2 <211> 338 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Pro Leu Pro Trp Ser Leu Ala Leu Pro Leu Leu Leu Ser Trp 1 5 io 15

Vai Ala Gly Gly Phe Gly Asn Ala Ala ser Ala Arg Mis His Gly 20 25 30

Leu Leu Ala Ser Ala Arg Gin Pro Gly Vai Cys His Tyr Gly Thr 35 40 45

Lys Leu Ala Cys Cys Tyr Gly Trp Arg Arg Asn Ser Lys Gly Vai 50 55 60

Cys Glu Ala Thr Cys Glu Pro Gly Cys Lys Phe Gly Glu Cys Vai

6S 70 7S

Gly Pro Asn Lys Cys Arg Cys Phe Pro Gly Tyr Thr Gly Lys Thr 80 85 90

Cys Ser Gin Αβρ Vai Asn Glu Cys Gly Met Lys Pro Arg pro Cys 95 100 105

Gin His Arg Cys Vai Asn Thr His Gly Ser Tyr Lys Cys Phe Cys 110 115 120

Leu Ser Gly His Met Leu Met Pro Asp Ala Thr Cys Vai Asn Ser 125 130 135

Arg Thr Cys Ala Met lie Asn Cys Gin Tyr Ser Cys Glu Asp Thr 140 145 150

Glu Glu Gly Pro Gin Cys Leu Cys Pro Ser Ser Gly Leu Arg Leu 119

ΕΡ 1 484 338 /PT 1SS 160 165 Ala Pro Asn Gly Arg Asp Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ser 170 175 180 Gly I*ys Vai Ile Cys Pro Tyr Asn Arg Arg Cys Vai Asn Thr Phe 185 190 195 Gly Ser Tyr Tyr Cys Lys Cys His Ile Gly Phe Glu Leu Gin Tyr 200 205 210 lie Ser Gly Arg Tyr Asp Cys Ile Asp Ile Asn Glu Cys Thr Met 21S 220 225 Asp ser His Thr Cys Ser His His Ala Asn cys Phe Asn Thr Gin 230 235 240 Gly Ser Phe Lys Cys Lys Cys Lys Gin Gly Tyr Lys Gly Asn Gly 245 2 50 255 Leu Arg Cys Ser Ala Ile Pro Glu Asn Ser Vai Lys Glu Vai Leu 260 265 270 Arg Ala Pro Gly Thr Ile Lys Asp Arg Ile Lys Lys Leu Leu Ala 27S 280 285 His Lys Asn Ser Met Lys Lys Lys Ala Lys Ile Lys Asn Vai Thr 290 295 300 Pro Glu Pro Thr Arg Thr Pro Thr Pro Lys Vai Asn Leu Gin Pro 30S 310 315 Phe Asn Tyr Glu Glu Ile Vai Ser Arg Gly Gly Asn Ser His Gly 320 325 330 Gly Lys Lys Gly Asn Glu Glu Lys 335 338

<210> 3 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda Oligonucleotídica Sintética <400> 3

cctcagtggc cacatgctca tg 22 <210> 4 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda Oligonucleotídica Sintética <400> 4 24 ggctgcacgt atggctatcc atag 120

ΕΡ 1 484 338 /PT <210> 5 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sonda Oligonucleotídica Sintética <400> 5 gataaactgt cagtacagct gtgaagacac agaagaaggg ccacagtgcc 50

Lisboa,

Claims (15)

1. ΕΡ 1 484 338 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um agente para a preparação de um medicamento para o tratamento de tumor num mamifero, em que o agente é um polipéptido possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos ao longo de todo o comprimento de: (i) a sequência de aminoácidos dos residuos 1 ou X a 338 mostrada na Figura 2 (SEQ ID NO:2), em que X é qualquer residuo de aminoácido de 17 a 26, ou (ii) um fragmento da sequência de aminoácidos mostrada na Figura 6, em que o polipéptido tem pelo menos 10 aminoácidos de comprimento e possui actividade anti-proliferativa in vítro contra células tumorais.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o tumor é um cancro.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o cancro é seleccionado de entre o grupo que consiste em cancro da mama, cancro do ovário, cancro renal, cancro colorrectal, cancro uterino, cancro da próstata, cancro do pulmão, cancro da bexiga, cancro do sistema nervoso central, melanoma e leucemia.
4. 4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações antecedentes, em que o nivel de identidade é de pelo menos 90%.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o nivel de identidade é de pelo menos 95%.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o polipéptido possui a sequência de aminoácidos dos residuos 1 ou x a 338 mostrada na Figura 2 (SEQ ID NO:2), em que X é qualquer residuo de aminoácido de 17 a 26.
7. 7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações antecedentes, em que X é 22. ΕΡ 1 484 338 /PT 2/2
8. 8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5 e 7, em que o polipéptido possui pelo menos 50 aminoácidos de comprimento.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o polipéptido tem pelo menos 100 aminoácidos de comprimento.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o polipéptido tem pelo menos 150 aminoácidos de comprimento.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o polipéptido tem pelo menos 200 aminoácidos de comprimento.
12. 12. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações antecedentes, em que o medicamento compreende adicionalmente um outro agente inibidor do crescimento, agente citotóxico ou agente quimioterapêutico.
13. 13. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações antecedentes, em que o mamífero é um ser humano.
14. 14. Método in vitro para inibição do crescimento de uma célula tumoral, compreendendo o método a exposição da referida célula tumoral a uma quantidade eficaz de um agente tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o tumor é tal como definido na reivindicação 2 ou na reivindicação 3. Lisboa,