KR20020062652A - 고지혈증의 치료 또는 예방제의 시험방법 - Google Patents

고지혈증의 치료 또는 예방제의 시험방법 Download PDF

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후루까와히데히꼬
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후지와라도시히꼬
안도요스께
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Abstract

본 발명은 고지혈증의 치료 또는 예방제를 시험하기 위한 신규한 방법 및 이 방법에 사용되는 핵산 프로브, 프라이머 및 항체를 제공하는 것이다.
구체적으로는 서열목록의 서열번호 1 또는 2 로 표시되는 포유동물의 혈액중의 중성 지방 농도의 조절에 관여하는 유전자의 발현을 지표로 하여 피검물질의 고지혈증의 치료 또는 예방제로서의 효과를 시험하는 방법, 이 방법에 사용되는 핵산 프로브, 프라이머 및 항체를 제공한다.
본 발명의 방법을 이용하여 고지혈증의 치료 또는 예방제의 후보물질의 탐색이 가능하다.

Description

고지혈증의 치료 또는 예방제의 시험방법 {METHOD OF TESTING REMEDY OR PREVENTIVE FOR HYPERLIPEMIA}
최근, 식생활 변화에 수반하여 지방 및 콜레스테롤의 과잉섭취로 인한 고지혈증 환자가 현격히 증가하고 있다. 고지혈증은 혈청지질, 즉 콜레스테롤, 중성 지방 (트리글리세리드, TG), 인지질, 유리지방산 등의 혈청농도가 높아지는 질환이며, 동맥경화증의 중요한 위험인자이다. 또한 고혈압증, 협심증 및 심근경색 등과 같은 관동맥경화증, 뇌경색 등의 합병증을 초래할 가능성이 높다,
지금까지 항고지혈증 작용을 나타내는 수많은 화합물이 보고되고 있지만, 그 대부분은 화학적 수법으로 합성된 것으로, 그 성질상 연속적으로 사용함에 따른 각종 부작용을 피할 수 없는 것이 현재의 실정이다.
한편, 현재 시판중인 프라바스타틴나트륨은 미생물 대사 산물 유래의 강력한 고지혈증 치료제 중 하나이며 그 작용은 콜레스테롤 생합성계의 율속효소인 HMG-CoA 환원효소의 저해제이다. 이 같이, 생체내에 존재하는 고지혈증에 관련된 단백질 또는 그것을 코드하는 유전자를 동정할 수 있다면, 그 기능을 직접 저해하거나, 또는 그 발현을 제어하는 등의 방법에 의해 부작용이 없는 (또는 적은), 보다 효과적인 고지혈증 치료제를 개발할 수 있을 것으로 생각되지만, 그 같은 고지혈증의 발증에 밀접하게 관계하는 유전자는 알려져 있지 않다.
한편, 본 발명의 방법에서 사용되는 핵산 프로브와 동일한 서열이 Genbank 데이터베이스상에「안지오포이에틴 관련 단백질 3 (angiopoietin-related protein 3) 을 코드하는 뉴클레오티드 서열로서 개시되어 있고, 또한 국제 특허출원공개공보 WO99/55869 호에는 동일한 뉴클레오티드 서열이「zalpha 5」를 코드하는 것으로 개시되어 있으나, 이들 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자와 고지혈증의 관련에 대해서는 전혀 알려져 있지 않다. 따라서,「안지오포이에틴 관련 단백질 3」내지「zalpha 5」를 코드하는 뉴클레오티드 서열의 일부가 고지혈증의 치료 또는 예방제를 시험하기 위해 유용하다는 것도 알려져 있지 않다.
즉, 본 발명의 목적은 고지혈증의 치료 또는 예방제를 시험하기 위한 신규한 방법 및 이 방법에 사용되는 핵산 프로브, 프라이머 또는 항체를 제공하는 데 있다.
[발명의 개시]
본 발명자들은 고지혈증의 치료 또는 예방제의 표적유전자를 탐색할 목적으로, 선천적 저지혈증 마우스의 유전자를 고지혈증 마우스의 유전자와 비교함으로써, 고지혈증의 원인유전자의 염색체상의 위치를 좁혀 나간 결과, 고지혈증 마우스에서 고발현하는 유전자를 특정하는데 성공하였다. 이 유전자 유래의 cDNA 는 호모로지 검색 결과, Genbank 데이터베이스에「안지오포이에틴 관련 단백질 3」을코드하는 뉴클레오티드 서열로서 개시되어 있으나, 본 발명자들은 이 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자를 저지혈증 마우스에 강제발현시키면 혈중의 중성 지방 농도가 상승하는 것을 발견하고, 이 유전자가 지금까지 보고되지 않은 신규한 기능을 가짐을 확인하였다. 따라서, 이 뉴클레오티드 서열 또는 그 일부를 프로브 또는 프라이머로 사용한 유전자 발현의 검출계를 이용하는, 고지혈증의 치료 또는 예방제의 신규 시험방법을 구축하는데 성공하였다. 또한, 이 뉴클레오티드 서열이 코드하는 폴리펩티드에 특이적인 항체를 조제하고, 이 항체를 사용하여 이 폴리펩티드의 생산량을 검출하는 실험계를 이용하는 고지혈증의 치료 또는 예방제의 신규 시험방법을 구축하였다. 그리고, 이 뉴클레오티드 서열을 시험동물에게 도입한 모델동물을 작성하고, 이 모델동물을 이용한 고지혈증의 치료 또는 예방제의 신규 시험방법을 구축하는데 성공하여 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은 첫째, 하기 공정 :
1) 배양세포를 피검물질의 존재하 또는 비존재하에 배양한다 ;
2) 상기 1) 에서 얻어진 배양세포에 있어서의 하기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열 (단, 서열 중의 t 는 u 로 대체하여 읽음) 을 갖는 mRNA 의 발현량을 검출한다 :
a) 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47 내지 1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
b) 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
c) 형질전환 대장균 E. coli pBK/m55-1 SANK 72199 (FERM BP-6940) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열 ;
d) 형질전환 대장균 E. coli pTrip/h55-1 SANK 72299 (FERM BP-6941) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열 ;
e) 상기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 혈중의 중성 지방 농도를 상승시키는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열 ; 및
3) 상기 공정 2) 의 결과, 피검물질 비존재하에서 배양한 세포와, 피검물질 존재하에서 배양한 세포 사이에서, 검출된 mRNA 의 발현량을 비교한다 ;
을 포함하는 물질의 고지혈증의 치료 또는 예방제로서의 효과를 시험하는 방법에 관한 것이다. 상기 배양세포는 간 유래 (초대 배양 간세포 등) 인 것이 바람직하고, 또한, 영장류 또는 설치류 동물 유래인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 인간, 마우스, 래트 또는 햄스터 유래의 세포이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, mRNA 의 발현량을 검출하는 방법으로는 노던 블롯, 도트 블롯 또는 슬롯 블롯, RT-PCR, 리보뉴클레아제 보호 어세이, 런온 어세이, DNA 칩 해석, DNA 마이크로 어레이 해석, 또는 정량 PCR 법 등이 바람직하지만, 본 발명은 이것들에 한정되지 않는다.
둘째, 본 발명은 상기 방법에서 사용될 수 있는 핵산 프로브, 즉 상기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열 (단, 서열 중의 t 는 u 로 대체하여 읽음) 을 포함하는 mRNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다 (단, 하기 a) 내지 d) 에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 제외함). 또한, 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47 내지 1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 일방 또는 양방의 말단이 1 뉴클레오티드 또는 2 뉴클레오티드 이상 결실된, 적어도 15 뉴클레오티드로 이루어지는 DNA, 또는 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 일방 또는 양방의 말단이 1 뉴클레오티드 또는 2 뉴클레오티드 이상 결실된, 적어도 15 뉴클레오티드로 이루어지는 DNA 도 상기 방법에 있어서의 핵산 프로브로서 바람직하게 사용될 수 있다.
셋째, 본 발명은 하기 공정 :
1) 배양세포를 피검물질의 존재하 또는 비존재하에서 배양한다 ;
2) 상기 1) 에서 얻어진 배양세포 상등액에 있어서의 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 코드되는 아미노산 서열 또는 그 일부로 이루어지는 폴리펩티드의 생산량을 이 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 검출한다 ; 및
3) 상기 공정 2) 의 결과, 피검물질 비존재하에서 배양한 세포와, 피검물질 존재하에서 배양한 세포 사이에서, 검출된 mRNA 의 양을 비교한다 ;
를 포함하는, 물질의 고지혈증의 치료 또는 예방제로서의 효과를 시험하는 방법, 및 상기 공정 2) 에서 사용되는 항체에 관한 것이다. 이 방법에서, 상기a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 코드되는 아미노산 서열 또는 그 일부로 이루어지는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체는 서열목록의 서열번호 2 의 아미노산 번호 17-455 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부, 동 19-455 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부 또는 서열번호 4 의 아미노산 번호 17-460 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부를 특이적으로 인식하는 것이 바람직하고, 또한 서열목록의 서열번호 9 의 아미노산 번호 1 내지 13 으로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 10 의 아미노산 번호 1 내지 14 로 표시되는 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 공정 2) 에 있어서 항체를 사용하여 검출하는 방법으로는 웨스턴 블롯, 도트 블롯 또는 슬롯 블롯, 고상효소 면역정량법 (ELISA 법) 또는 방사성 동위원소 면역정량법 (RIA 법) 이 바람직하지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
넷째, 본 발명은 상기 항체를 함유하는 것으로 이루어지는 고지혈증의 치료 또는 예방제를 시험하기 위한 키트에 관한 것이다.
다섯째, 본 발명은 하기 공정 :
1) 유전자 조작에 의해 얻어지고, 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 외래유전자가 이 유전자를 고발현할 수 있도록 도입되어 있는 비인간동물에게 피검물질을 투여한다 ; 및
2) 1) 의 동물의 혈중 중성 지방 농도를 측정한다 ;
를 포함하는 물질의 고지혈증의 치료 또는 예방제로서의 효과를 시험하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에서 상기 공정 1) 의 비인간동물은 마우스인 것이 바람직하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 공정 1) 에 기재된 비인간동물로의 외래유전자의 도입방법으로는 이 유전자가 삽입된 아데노 바이러스 벡터를 포함하는 아데노 바이러스의 이 동물에게 감염시키는 방법이 바람직하지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
여섯째, 본 발명은 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중의 연속한 15 내지 30 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열로 이루어지는 DNA 또는 RNA, 및 이 DNA 또는 RNA 를 유효성분으로 함유하는 고지혈증 치료제에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 서열목록의 서열번호 1 이나 서열번호 3 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는, 포유동물의 혈액중의 중성 지방 농도의 조절에 관여하는 유전자의 발현을 지표로 하여 피검물질의 고지혈증의 치료 또는 예방제로서의 효과를 시험하는 방법, 이 방법에 사용되는 핵산 프로브, 프라이머 및 항체, 그리고 서열목록의 서열번호 3 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 의 안티센스 핵산분자를 제공하는 것이다.
본 발명에서 「스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는」이란 시판중인 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (클론텍사 제조) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는 그것과 동등한 조건에서 하이브리다이즈하는 것을 말한다.
본 발명의 방법은 구체적으로 예컨대 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47 내지 1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자, 또는 그것들이 코드하는 폴리펩티드와 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현을 당해 핵산 (mRNA) 또는 당해 폴리펩티드의 특이적 검출에 의해 측정하고, 이 유전자의 발현량을 저하시키는 피검물질을 고지혈증의 치료 또는 예방제의 후보물질로서 선택하는 것이다. 이하, 핵산을 검출하는 태양과 폴리펩티드를 검출하는 태양으로 나눠서 설명한다.
(A) 핵산의 검출
1) 프로브
핵산을 검출하는 태양 중, 핵산 하이브리다이제이션을 이용하는 방법에서 사용되는 프로브는 DNA 또는 RNA 로서, 그 뉴클레오티드 서열은 하기 a) 내지 e) :
a) 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47 내지 1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
b) 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
c) 형질전환 대장균 E. coli pBK/m55-1 SANK 72199 (FERM BP-6940) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 단편이 갖는 뉴클레오티드 서열 ;
d) 형질전환 대장균 E. coli pTrip/h55-1 SANK 72299 (FERM BP-6941) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 단편이 갖는 뉴클레오티드 서열 ;
e) 상기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 혈중의 중성 지방 농도를 상승시키는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열 ;
중 어느 하나 (단, 서열 중의 t 는 u 로 대체하여 읽음) 를 갖는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 뉴클레오티드 서열이면 되고, 예컨대 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 이 안티센스 서열 중에 연속한 적어도 15 뉴클레오티드로 이루어지는 부분서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이 안티센스 서열의 개변체 등, 대략 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리리보뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈함으로써 이 폴리리보뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 것은 모두 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 그들 중, 상기 a) 에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 예컨대 마우스 간 유래의 cDNA 라이브러리로부터 서열목록의 서열번호 1 에 나타내는 뉴클레오티드 서열정보에 기초하여 주지의 방법, 예컨대 플라크 하이브리다이제이션법, 콜로니 하이브리다이제이션법 또는 PCR 법 등에 의해 클로닝한 cDNA 클론을 주지의 방법으로 직접 표지하거나, 또는 이 cDNA 클론을 주형으로 한 폴리멜라제 반응에 의한 복제 또는 전사반응에 있어서 표지함으로써, 표지 프로브로서 얻을 수 있다. 또한, 상기 b) 에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 예컨대 인간 간 유래의 cDNA 라이브러리로부터 서열목록의 서열번호 3 에 나타내는 뉴클레오티드 서열정보에 기초하여 동일한 조작을 함으로써 클로닝한 cDNA 클론으로부터 표지 프로브를 얻을 수 있다. 한편, 상기 c) 또는 d) 에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 일본국 이바라끼껭 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 방 3 고의 공업기술원 생명공학기술연구소에 평성 11 년 (1999 년) 11 월 19 일자로 국제 기탁되어 수탁번호 FERM BP-6940 또는 FERM BP-6941 이 붙여져 있는 형질전환 대장균 E. coli pBK/m55-1 SANK 72199 주 또는 E. coli pTrip/h55-1 SANK 72299 주가 보유하는 재조합 파지미드로부터 얻을 수 있다.
또한, 상기 e) 에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 예컨대 상기와 같이 하여 얻어지는 상기 a) 내지 d) 에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 프로브로 하여 임의의 포유동물 (바람직하게는 간) 유래의 cDNA 라이브러리에 대해 플라크 하이브리다이제이션법이나 콜로니 하이브리다이제이션법에 의한 클로닝을 행하여 단리한 cDNA 클론으로부터 얻을 수 있다.
나아가 또한 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열 중의 연속한 적어도 15 뉴클레오티드로 이루어지는 부분서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 수십 뉴클레오티드 정도의 것이라면 화학합성에 의해 얻을 수 있다. 또한 혹은 상기와 같이 하여 얻어지는 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 cDNA 클론 중의 임의의 부분서열을 예컨대 PCR 등에 의해 서브클로닝한 다음 상기와 동일한 수법으로 안티센스 서열을 갖는 프로브로서 조제할 수 있다.
예컨대, 서열목록의 서열번호 1 에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열 중의 연속한 수십 뉴클레오티드로 이루어지는 부분서열에 있어서, 수뉴클레오티드가 부가, 결실 및/또는 부가되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드일지라도 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 폴리리보뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 한, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 그 같은 폴리뉴클레오티드는 화학합성법이나 폴리멜라제 연쇄반응 (이하「PCR」이라고 함) 등의 효소반응을 이용한 본 발명이 속하는 기술분야에 있어서의 주지의 변이도입법을 이용하여 제작할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 사용되는 프로브는 단일한 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것에 한정되지 않는다. 즉 본 발명의 방법은 예컨대 상기 요건을 만족하는 여러 종류의 뉴클레오티드 서열의 혼합물을 프로브로서 사용하거나 또는 그들 여러 종류의 뉴클레오티드 서열을 각각 개별적으로 사용한 다중검출을 행해도 된다.
2) RT-PCR 용 프라이머
본 발명에서 핵산을 검출하는 또 하나의 태양은 먼저 mRNA 를 주형으로 하는 역전사 효소반응을 행한 후, PCR 을 실시하여 특이적으로 DNA 단편을 증폭하는 이른바 RT-PCR 을 행하는 방법이다. 이 방법에서 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 증폭시키기 위해서는 목적으로 하는 mRNA 의 특정의 부분서열에 상보적인 안티센스 프라이머와, 이 안티센스 프라이머로부터 역전사 효소에 의해 생성되는 cDNA 서열 중의 특정의 부분서열에 상보적인 센스 프라이머가 사용된다.
역전사 효소반응 및 PCR 의 양방에 사용되는 안티센스 프라이머는 실질적으로 상기 a) 내지 e) 에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열 중의 연속한 적어도 18 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 23 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
한편, PCR 에서 사용되는 센스 프라이머의 서열은 상기 a) 내지 e) 에 기재된 뉴클레오티드 서열에 있어서, 상기 안티센스 프라이머의 보상쇄에 해당하는 서열 중의 가장 5'말단측의 위치보다 더욱 5' 말단측 영역에 존재하는 서열 중의 연속한 적어도 18 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 21 뉴클레오티드의 임의의 부분서열로 이루어진다. 단, 센스 프라이머와 안티센스 프라이머에 서로 상보적인 서열이 존재하면 프라이머 끼리가 어닐링함으로써 비특이적인 서열이 증폭되어 특이적인 유전자 검출의 방해가 될 우려가 있으므로, 그 같은 조합을 피한 프라이머의 설계를 하는 것이 바람직하다.
이들 안티센스 프라이머 및 센스 프라이머에는 모두 상기에서 규정한 그들 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 상기 a) 내지 e) 기재의 뉴클레오티드 서열과는 관계없는 뉴클레오티드 서열이 링커로서 부가될 수 있다. 단, 특이적인 유전자 검출의 방해가 되지 않도록 이 링커는 반응중에 반응액내의 핵산과 비특이적 어닐링을 일으키지 않는 것이 바람직하다.
3) 유전자 발현을 검출하는 세포 또는 동물
다음에, 본 발명의 방법에 사용되는 배양세포는 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자를 발현하는 포유동물세포이면 된다.바람직하게는 포유동물 간 유래의 배양세포 (바람직하게는 초대 배양 간세포) 이지만, 예컨대 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자를 그 프로모터 영역과 함께 도입한 세포 등, 인위적으로 형질전환된 세포 (예컨대 CHO 세포) 도 사용할 수 있다. 포유동물종으로는 인간, 마우스, 래트 또는 햄스터가 바람직하고, 인간 또는 마우스가 보다 바람직하고, 더욱 바람직한 세포로는 고지혈증 마우스인 KK 마우스 (닛뽕크레아사로부터 입수가능) 의 초대 배양 간세포를 들 수 있지만 이것들에 한정되는 것은 아니다. 또한 배양세포를 사용하는 것보다 바람직하다고 판단되는 경우에는 포유동물 개체에 피검물질을 투여하고, 그 후 이 동물 개체로부터 적출된 그 장기 또는 조직세포에 있어서의 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현을 검출하는 방법도 채용할 수 있다. 그 때, 유전자 발현의 검출대상이 되는 장기 또는 조직은 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자를 발현하는 것이라면 되지만, 바람직하게는 간이다. 이 실시태양의 바람직한 포유동물종은 인간, 마우스, 래트 또는 햄스터이고, 인간 또는 마우스가 보다 바람직하다. 예컨대 마우스로는 상기 KK 마우스가 바람직하게 사용될 수 있지만 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 사용되는 배양세포는 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자를 발현가능한 조건 (단, 피검물질을 첨가하지 않는 경우) 이라면 어떠한 조건으로 배양해도 된다. 예컨대 이 배양세포에 대해 확립된 배양조건이 알려져 있는데, 이 조건하에서 이 세포가 상기 a) 내지 e)중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자를 발현하는 경우에는 이 조건으로 배양해도 된다.
4) 피검물질의 첨가
상기 세포의 배양중, 피검물질을 배양배지에 첨가하여 일정기간 배양한다. 피검물질로는 화합물, 미생물의 대사 산물, 식물이나 동물 조직의 추출물, 그것들의 유도체 또는 그것들의 혼합물 등을 들 수 있다. 피검물질의 투여량이나 농도는 적절히 설정하거나, 또는 예컨대 희석계열을 작성하는 등의 방법으로 여러 종류의 투여량을 설정해도 된다. 피검물질 존재하에서 배양하는 기간도 적절히 설정해도 되지만, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다. 포유동물 개체에 피검물질을 투여하는 경우에는 피검물질의 물성 등에 따라 경구투여, 정맥주사, 복강내주사, 경피투여, 피하주사 등의 형태로 나누어 사용한다.
5) 시료의 조제
상기와 같은 방법으로 배양한 세포로부터 RNA 를 추출할 때에는, 배양종료후, 즉시 세포를 RNA 추출용 용매 (예컨대 페놀 등 리보뉴클레아제를 불활성화하는 작용을 갖는 성분을 함유하는 것) 로 직접 용해하는 것이 바람직하다. 또는 세포를 파괴하지 않도록 스크레이퍼로 신중하게 긁어내거나, 또는 트립신 등의 단백질 분해효소를 사용하여 조심스럽게 배양기재에서 분리시키는 등의 방법으로 세포를 회수한 후, 신속하게 RNA 추출공정으로 이행한다.
RNA 의 추출방법으로는 티오시안산 구아니딘ㆍ염화세슘 초원심법, 티오시안산 구아니딘ㆍ핫 페놀법, 구아니딘 염산법, 산성 티오시안산 구아니딘ㆍ페놀ㆍ클로로포름법 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159) 등을 채용할 수 있지만, 산성 티오시안산 구아니딘ㆍ페놀ㆍ클로로포름법이 바람직하다.
얻어진 RNA 로부터 더욱 mRNA 를 정제하는 방법은 이하에 설명하는 바와 같다. 즉, 진핵세포의 세포질에 존재하는 mRNA 의 대부분은 그 3' 말단에 폴리(A)서열을 갖는 것이 알려져 있으므로, 이 특징을 이용하여 예컨대 비오틴화된 올리고(dT)프로브에 mRNA 를 흡착시키고, 또한 스트렙토아비딘을 고정화한 상자성입자에 비오틴/스트렙토아비딘 사이의 결합을 이용하여 mRNA 를 포착하여 세정조작한 후, mRNA 를 용출함으로써 mRNA 를 정제할 수 있다. 또한, 올리고(dT)셀룰로스 칼럼에 mRNA 를 흡착시키고, 이어서 이것을 용출시켜 정제하는 방법도 채용할 수 있다. 또한 자당 밀도 구배 원심법 등에 의해 mRNA 를 더욱 분획할 수도 있다. 단, 본 발명의 방법을 위해서는 이들 mRNA 의 정제공정이 필수는 아니며, 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현의 검출이 가능하다면 모든 RNA 를 그 후의 공정에 사용할 수도 있다.
6) 시료의 고상화
핵산 하이브리다이제이션에 의해 검출하는 경우, 상기와 같이 하여 얻어진 RNA 시료중의 유전자를 특이적으로 검출하기 위해, 이 RNA 시료를 아가로스 전기영동을 거쳐 하이브리다이제이션 실험용 멤브레인 (이하, 간단히「멤브레인」이라고 함) 에 전사하거나 (노던 블롯법), 또는 직접 멤브레인에 시료를 스며들게 하는, 이른바 도트 블롯법 또는 슬롯 블롯법에 의해 멤브레인에 고상화시킨다. 이 멤브레인으로는 니트로셀룰로스멤브레인 (예컨대 하이본드-C 퓨어 (아머샴 파마시아사 제조) 등), 포지티브 챠지ㆍ나일론 멤브레인 (예컨대, 하이본드-N＋아머샴 파마시아사 제조) 등) 또는 친수성 나일론 멤브레인 (예컨대 하이본드-N/NX (아머샴 파마시아사 제조) 등) 등을 사용할 수 있다.
노던 블롯용 아가로스 전기영동방법으로는 아가로스 포름 아미드겔 전기영동법, 시료를 글리옥살과 디메틸술폭시드로 처리하고, 변성시킨 후, 인산 완충액으로 제작한 아가로스겔로 영동시키는 방법 및 아가로스겔 메틸 수은전기영동법 (이상 Maniatis, T. et al. (1982) in “Molecular Cloning A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory, NY.) 등을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
전기영동후의 겔에서 멤브레인으로 RNA 를 옮기는, 이른바 블롯팅 방법으로는 캐필러리 트랜스퍼법 (Maniatis, T. et al. (1982) in “Molecular Cloning A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory, NY.), 버큠법, 전기영동법 (Maniatis, T. et al. (1989) in “Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd ed”Cold Spring Harbor Laboratory, NY.) 등을 들 수 있다. 도트 블롯법이나 슬롯 블롯법을 위한 기재도 시판되고 있다 (예컨대 바이오 도트 (바이오래드사 제조) 등).
블롯팅 종료후, 멤브레인에 옮겨진 RNA 를 멤브레인에 고정하는 조작을 한다 (이 조작은 멤브레인의 재질에 따라 다르며, 제품에 따라서는 고정조작이 필요없는 경우도 있다).
7) 프로브의 표지
핵산 하이브리다이제이션에 의한 검출을 행함에 있어서, 상기와 같이 하여 고상화시킨 RNA 시료중의 특정 mRNA 를 검출하기 위한 프로브의 표지방법과 검출방법에 대해 이하에 기술한다 :
i) 방사성 동위원소 표지
DNA 단편 또는 그것을 보유하는 벡터 등을 재료 내지 주형으로 하여 닉 트랜스레이션법 (예컨대 닉 트랜스레이션 키트 (아머샴 파마시아사 제조) 등을 사용), 랜덤 프라임법 (예컨대 멀티 프라임 DNA 라벨링 시스템 (아머샴 파마시아사 제조) 등을 사용), 말단표지법 (예컨대 메가 라벨 (타카라슈조 (주) 사 제조), 3'-말단 라벨링 키트 (아머샴 파마시아사 제조) 등을 사용) 로 표지 DNA 프로브를 조제하거나, 또는 주형이 되는 DNA 를 서브 클로닝한 벡터 중의 SP6 프로모터나 T7 프로모터를 이용한 인 비트로 전사법에 의해 표지 RNA 프로브를 조제한다. 이들 프로브의 검출은 X선 필름 또는 이미징 플레이트를 사용한 오토라디오그래피에 의해 수행할 수 있고, 또한 X선 필름의 경우에는 덴시토메트리 (예컨대 GS-700 이미징 덴시토미터 (바이오래드사 제조) 를 사용) 를 이미징 플레이트의 경우에는 BAS2000II (후지필름 제조) 시스템을 각각 이용한 정량도 가능하다.
ii) 효소표지
DNA 또는 RNA 단편을 직접 효소표지한다. 표지에 사용되는 효소는 예컨대 알칼리포스파타제 (AlkPhos Direct system for chemiluminescence (아머샴 파마시아사 제조) 등을 사용), 서양고추냉이퍼옥시다제 (Horseradish Peroxidase) (ECL 다이렉트 뉴클레익 애시드 라벨링 앤드 디텍션 시스템 (아머샴 파마시아사 제조)등을 사용) 을 들 수 있다. 프로브의 검출은 표지한 효소의 촉매반응이 검출가능해지는 기질, 예컨대 이 촉매반응에 의해 발색물질을 생성하거나 발광하는 기질을 포함하는 효소반응 완충액에 멤브레인을 담금으로써 수행한다. 발색기질을 사용한 경우에는 육안에 의해 검출할 수 있고, 발광기질을 사용한 경우에는 방사성 동위원소 표지의 경우와 동일하게 X선 필름 또는 이미징 플레이트를 사용한 오토라디오그래피 또는 인스턴트 카메라를 사용한 사진촬영에 의해 검출할 수 있다. 또한, 발광기질을 사용한 경우에는 덴시토메트리 또는 BAS2000II 시스템을 이용한 정량도 가능하다.
iii) 기타 분자에 의한 표지
플루오레세인 표지 : DNA 단편에 닉 트랜스레이션법, 랜덤 프라임법, 또는 3'말단표지법 (아머샴 파마시아사에서 시판되고 있는 ECL 3'-올리고 라벨링 시스템 등) 으로 표지한다. 또는 SP6, T7 프로모터에 의한 인 비트로 전사에 의해 RNA 에 표지한다 ;
비오틴 표지 : DNA 의 5' 말단을 표지 (아머샴 파마시아사에서 시판되고 있는 올리고 뉴클레오티드 비오틴 라벨링 키트 등 사용) 하거나, DNA 단편에 닉 트랜스레이션법, 랜덤 프라임법 등으로 표지한다 ;
디곡시게닌 수식 dUTP 표지 : DNA 단편에 닉 트랜스레이션법, 랜덤 프라임법 등으로 표지한다.
이들 표지분자의 검출은 어느 경우에나 표지된 분자에 특이적으로 결합하는 분자를 방사성 동위원소나 효소로 표지한 것을 프로브에 결합시키는 조작을 포함한다. 특이적으로 결합하는 분자란 예컨대 플루오레세인이나 디곡시게닌의 경우에는 항플루오레세인 항체나 항디곡시게닌 항체이고, 비오틴의 경우에는 아비딘 또는 스트렙토아비딘이다. 이들을 프로브에 결합시킨 이후에는 그 표지된 방사성 동위원소나 효소에 의해 상기 i) 또는 ii) 에 기재된 것과 동일한 방법에 따라 검출할 수 있다.
8) 하이브리다이제이션
하이브리다이제이션은 본 발명이 속하는 기술분야에 있어서 주지의 방법으로 행할 수 있다. 본 발명의 하이브리다이제이션 용액 또는 세정액의 조성과, 하이브리다이제이션 온도 또는 세정온도의 관계에 대해서는 예컨대 문헌 (바이오 실험 일러스트레이티드 4, p148, 슈쥰사 간행) 의 기재에 따를 수 있지만, 바람직한 조건은 다음과 같다 :
하이브리다이제이션 용액 : ExpressHyb Hybridization Solution (클론테크사 제조) ;
프로브의 최종농도 (방사표지 프로브의 경우) : 1 내지 2 ×106cpm/㎖ (바람직하게는 2 ×106cpm/㎖) ;
하이브리다이제이션 온도 및 시간 : 68 ℃, 1 내지 24 시간.
멤브레인의 세정조건 :
i) 0.1 내지 5 ×SSC (가장 바람직하게는 2 ×SSC), 0.05 내지 0.1 % SDS (가장 바람직하게는 0.05 %) 도데실 황산나트륨 (이하「SDS」라고 함) 중, 실온 내지 42 ℃ (가장 바람직하게는 실온) 에서 20 내지 60 분간 (가장 바람직하게는 20 분간) 진탕하는 조작을 세정액을 교환하여 2 내지 6 회 (가장 바람직하게는 3 회) 실시한다 ;
ii) 상기 i) 다음, 0.1 ×SSC, 0.1 % SDS 중, 50 내지 65 ℃ 에서 20 내지 60 분간 진탕하는 조작을 세정액을 교환하여 2 내지 6 회 실시한다. 또는, 0.2 내지 0.5 ×SSC, 0.1 % SDS 중, 62 내지 65 ℃ 에서 20 내지 60 분간 진탕하는 조작을 세정액을 교환하여 2 내지 6 회 실시한다. 가장 바람직하게는 0.1 ×SSC, 0.1 % SDS 중, 50 ℃ 에서 20 분간 진탕하는 조작을 세정액을 교환하여 3 회 실시한다.
세정종료후, 상기 7) 에 기재한 바와 같이, 프로브의 표지법에 따른 검출ㆍ정량을 행한다. 또한, 세포 당 발현량이 안정되어 있는 것이 알려져 있는 유전자 (예컨대 23 kDa 고염기성 단백질, α-튜블린, 글리세린알데히드-3-데히드로게나제, 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스페라제, 포스포리파제 A2, 리보조말 단백질 S9, 유비키틴 등의 유전자 발현을 검출하기 위한 프로브가 시판되고 있다) 의 각 시료에 있어서의 발현량을 각 시료간의 RNA 양의 차이 등에 기인하는 편차를 보정할 목적으로 동시에 측정해 놓고, 이 안정적 발현유전자의 발현량을 기준으로 한 검출대상 유전자 발현량의 상대값을, 피검물질을 투여한 세포군과 투여하지 않은 세포군 사이에서 비교함으로써 보다 정밀한 평가를 할 수 있다.
그 결과, 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현량을 저하시키는 피검물질은 고지혈증의 치료 또는 예방제가 될 수있다.
9) RT-PCR 반응
RT-PCR 에 의해 핵산의 검출을 하는 태양에 있어서의 각 반응의 조건은 이하에 기재하는 바와 같다. 그리고, RT-PCR 에 의한 검출을 위한 시료는 통상 폴리(A)＋RNA 로 까지 정제되어 있을 필요는 없다.
i) 역전사 효소반응
반응액 조성의 예 (전체량 20 ㎕) :
전체 RNA 적당 ;
염화마그네슘 2.5 내지 5 mM (바람직하게는 5 mM) ;
1 ×RNA PCR 완충액 (10 mM 트리스 염산 (25 ℃ 에서의 pH 8.3 내지 9.0 (바람직하게는 8.3)), 50 mM 염화칼륨) ;
dNTPs 0.5 내지 1 mM (바람직하게는 1 mM) ;
안티센스 프라이머 1 μM (안티센스 프라이머의 대용으로서, 시판중인 랜덤 프라이머 또는 올리고 (dT) 프라이머 (12-20 뉴클레오티드) 를 2.5 μM 첨가할 수도 있다) ;
역전사 효소 0.25 내지 1 단위/㎕ (바람직하게는 0.25 단위/㎕) ; 멸균수로 20 ㎕ 로 조정한다.
반응온도조건 :
30 ℃ 에서 10 분간 보온 (랜덤 프라이머 사용시에만) 한 후, 42 내지 60 ℃(바람직하게는 42 ℃) 에서 15 내지 30 분간 (바람직하게는 30 분간) 보온하고, 추가로 99 ℃ 에서 5 분간 가열하여 효소를 실활시킨 다음, 4 내지 5 ℃ (바람직하게는 5 ℃) 에서 5 분간 냉각한다.
ii) PCR
반응액 조성의 예 :
염화마그네슘 2 내지 2.5 mM (바람직하게는 2.5 mM) ;
1 ×PCR 완충액 (10 mM 트리스 염산 (25 ℃ 에서의 pH 8.3 내지 9.0 (바람직하게는 8.3)), 50 mM 염화칼륨 ;
dNTPs 0.2 내지 0.25 mM (바람직하게는 0.25 mM) ;
안티센스 프라이머 및 센스 프라이머 0.2 내지 0.5 μM (바람직하게는 0.2 μM) ;
Taq 폴리메라제 1 내지 2.5 단위 (바람직하게는 2.5 단위) ;
멸균수를 첨가하여 전량을 80 ㎕ 로 조정하고, 그 전량을 역전사반응을 종료한 반응액 전량에 첨가한 다음 PCR 을 개시한다.
반응온도조건 : 우선 94 ℃ 에서 2 분간 가열한 후, 90 내지 95 ℃ (바람직하게는 94 ℃) 에서 30 초간, 40 내지 60 ℃ (바람직하게는 프라이머의 특성으로부터 산출되는 해리온도 (Tm) 에서 그 보다 20 도 낮은 온도까지의 범위내에서 30 초간, 70 내지 75 ℃ (바람직하게는 72 ℃) 에서 1.5 분간의 온도 사이클을 28 내지 50 사이클 (바람직하게는 28 사이클) 반복한 다음 4 ℃ 로 냉각한다.
PCR 종료후, 반응액을 전기연동하고, 목적으로 하는 크기의 밴드가 증폭되고있는지의 여부를 검출한다. 정량적 검출을 행하기 위해서는 미리 단계희석한 cDNA 클론을 표준 주형 DNA 로 하여 동 조건에서 PCR 을 실시하고, 정량적 검출이 가능한 온도 사이클수를 설정해 놓거나, 또는 예컨대 5 사이클 마다 일부 반응액을 샘플링하여 각각 전기영동한다. 또한 예컨대 PCR 반응시에 방사표지 dCPT 를 사용함으로써, 밴드 중에 도입된 방사능의 양을 지표로 정량할 수도 있다.
피검물질 존재하에서 배양한 세포 유래의 시료와, 피검물질 비존재하에 배양한 세포 유래의 시료 사이에서 검출결과를 비교하고, 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현량을 저하시킨 피검물질은 고지혈증의 치료 또는 예방제가 될 수 있다.
10) 기타 방법
상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현량을 측정하는 다른 방법으로는 이하에 기재하는 것을 들 수 있다.
i) 리보뉴클레아제 보호 어세이 (RNase protection assay) : RNA 시료 중의 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 mRNA (단 서열 중의 t 는 u 로 대체하여 읽음) 에만 표지 프로브를 하이브리다이즈시키고, 이본쇄 폴리뉴클레오티드를 형성시켜 둔 다음, 시료에 리보뉴클레아제를 첨가하여 인큐베이션하면 프로브가 하이브리다이즈한 mRNA 는 이본쇄를 형성하고 있음으로써 리보뉴클레아제에 의한 소화를 피하고, 그 이외의 RNA 는 소화되므로, 이 이본쇄 폴리뉴클레오티드만 남는다 (검출되는 mRNA 보다 프로브가 짧으면 프로브의 사슬길이에 상당하는 이본쇄 폴리뉴클레오티드가 남는다). 이 이본쇄 폴리뉴클레오티드를정량함으로써, 목적으로 하는 유전자의 발현량을 측정한다. 구체적으로는 예컨대 이하에 기재하는 방법에 따른다.
이본쇄를 형성하지 않고 남은 표지 프로브를 이본쇄 폴리뉴클레오티드와 확실히 분리하여 정량을 용이하게 하기 위해, 남은 표지 프로브는 리보뉴클레아제에 소화되는 것이 바람직하지만, 리보뉴클레아제로서 일본쇄 DNA 도 소화할 수 있는 것을 사용하면 표지 프로브는 DNA 라도 RNA 라도 좋다. 표지 프로브의 조제방법은 상기 1) 및 7) 의 기재에 준하지만, 이 방법에 사용되는 프로브의 길이는 50 내지 500 뉴클레오티드 정도가 바람직하다. 또한, 이본쇄 DNA 를 직접 표지하여 열변성만 시킨 프로브 등, 상보쇄가 혼재하는 프로브는 본 방법에 바람직하지 않다.
RNA 프로브는 예컨대 하기 방법에 따라 조제된다. 우선 주형 DNA 를 박테리오파지의 프로모터 (T7, SP6, P3 프로모터 등) 를 갖는 플라스미드 벡터 (예컨대 pGEM-T (프로메가사 제조) 등) 에 삽입한다. 이어서, 이 재조합 플라스미드 벡터를 제한효소로 삽입단편의 바로 하류에서 1 군데만 절단되도록 소화한다. 얻어진 직쇄 DNA 를 주형으로 하여 방사능 표지된 리보뉴클레오티드 존재하에서 인 비트로 전사반응을 실시한다. 이 반응에는 벡터 중의 프로모터에 맞춰 T7, SP6, 또는 T3 폴리멜라제 등의 효소를 사용한다. 이상의 조작은 예컨대 리보프로브 시스템 T7, 동일 SP6 또는 동일 T3 (모두 프로메가사 제조) 을 사용하여 실시할 수 있다.
RNA 시료를 조제할 때까지의 공정은 상기 3) 내지 5) 에 기재된 바와 같다.조제된 모든 RNA 시료 10 내지 20 ㎍ 상당분과, 5 ×105cpm 상당의 과잉량의 표지 프로브를 사용하여 리보뉴클레아제 보호 어세이를 수행한다. 이 조작은 시판중인 키트 (HybSpeed RPA Kit, 암비온사 제조) 를 사용하여 수행할 수 있다. 얻어진 리보뉴클레아제 소화후의 시료를 8M 요소를 포함하는 4 내지 12 % 폴리아크릴아미드겔 전기영동한 후, 겔을 건조시키고, X선 필름으로 오토라디오그래피를 수행한다. 이상의 조작에 의해 리보뉴클레아제 소화를 피한 이본쇄 폴리뉴클레오티드의 밴드를 검출할 수 있고, 또한 그 정량은 상기 7) 의 i) 에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 또한, 노던 블롯 해석의 경우와 마찬가지로 각 시료 사이의 RNA 의 양의 차이 등에 기인하는 편차를 보정할 목적으로 β-액틴 유전자의 발현량을 동시에 측정해 두면 보다 정밀한 평가를 할 수 있다.
이 같이 하여 피검물질 존재하에서 배양한 세포 유래의 시료와, 피검물질 비존재하에서 배양한 세포 유래의 시료 사이에서 검출결과를 비교하여 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현량을 저하시킨 피검물질은 고지혈증의 치료 또는 예방제가 될 수 있다.
ii) 런온 어세이 (Run-on assay, Greenberg, M. E. and Ziff, E. B. (1984) Nature 311, 433-438, 및 Groudine, M. et al. (1981) Mol. Cell Biol. 1, 281-288 참조) : 본 방법은 세포에서 핵을 단리하여 목적으로 하는 유전자의 전사활성을 측정하는 방법으로, 지금까지 기술한 세포내의 mRNA 를 검출하는 방법은 아니지만, 본 발명에서는「유전자의 발현량을 검출하는 방법」에 포함된다. 단리된 세포핵을 사용하여 시험관내에서 전사반응시키면 핵을 단리하기 전에 이미 전사가 개시되어 mRNA 사슬이 생성되고 있는 도중의 것이 신장되어 가는 반응만 진행된다. 이 반응시에 방사표지한 리보뉴클레오티드를 첨가하여 신장되어 가는 mRNA 를 표지해 두고, 그 안에 포함되는 비표지 프로브에 하이브리다이즈하는 mRNA 를 검출함으로써, 핵을 단리한 시점에 있어서의 목적으로 하는 유전자의 전사활성을 측정할 수 있다. 피검물질의 영향이 가장 현저히 나타나는 시간의 데이터를 판정에 사용하기 위해, 배양세포에 피검물질을 첨가한 다음 핵을 단리할 때까지의 시간에 대해 예컨대 첨가 30 분후, 1 시간 후, 2 시간후, 4 시간후, 8 시간후 및 24 시간후의 세포로부터 핵을 단리하여 각각 어세이하는 등의 방법을 택할 수 있다. 그리고 구체적인 조작방법은 프로브를 상기 1) 에 기재된 것에 준하여 표지하지 않는 것을 조제하는 것 이외에는 상기 참조문헌에 기재된 것에 준한다. 이 같이 하여 피검물질 존재하에서 배양한 세포 유래의 시료와, 피검물질 비존재하에서 배양한 세포 유래의 시료 사이에서 검출결과를 비교하고, 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 전사활성을 저하시킨 피검물질은 고지혈증의 치료 또는 예방제가 될 수 있다.
iii) DNA 칩 해석, DNA 마이크로 어레이 해석
[1] 프로브 취득용 시료의 조제
우선, 피검물질 존재하에서 배양한 세포 유래의 시료와, 피검물질 비존재하에서 배양한 세포 유래의 시료의 mRNA 를 추출정제한다. RNA 시료를 조제할 때까지의 공정은 상기 3) 내지 5) 에 기재된 바와 같다.
[2] 프로브의 표지
DNA 칩 해석 또는 DNA 마이크로 어레이 해석용 프로브를 제작하기 위한 출발재료로는 정제하지 않은 모든 RNA 를 사용할 수도 있지만, 상기 5) 에 기재된 방법으로 정제된 폴리(A)＋RNA 인 것이 보다 바람직하다.
핵산 하이브리다이제이션에 의한 검출을 행함에 있어서, 프로브의 표지방법과 검출방법에 대해 이하에 기술한다.
어피메트릭스사 제조 DNA 칩을 사용하는 해석을 위한 프로브 : 어피메트릭스사 제조 DNA 칩에 첨부된 프로토콜에 따라, 비오틴 표지한 cRNA 프로브를 사용한다.
DNA 마이크로 어레이를 사용하는 해석용을 위한 프로브 : 역전사 효소반응에서 폴리(A)＋RNA 로부터 cDNA 를 제작할 때에, 형광색소 (예컨대 Cy3, Cy5 등) 로 표시된 d-UTP 등을 첨가해 둠으로써 cDNA 를 형광 표지한다. 이 때, 피검물질 존재하에서 배양한 세포 유래의 시료와, 피검물질 비존재하에서 배양한 세포 유래의 시료를 각각 다른 색소로 표지해 두면, 나중의 하이브리다이제이션시에는 양자를 혼합하여 사용할 수 있다.
멤브레인 필터를 사용하는 해석을 위한 프로브 : 역전사 효소반응에서 폴리(A)＋RNA 로부터 cDNA 를 제작할 때에, 방사성 동위원소 (예컨대32P,33P) 로 표지된 d-CTP 등을 첨가해 둠으로써 프로브를 표지한다.
[3] 고상화 시료
상기 공정 [2] 에서 얻어진 표지 프로브와 하이브리다이즈시키기 위한 고상화 시료로는 다음과 같은 것을 들 수 있다.
데이터베이스상의 EST (expressed sequence tag) 서열 또는 mRNA 서열을 바탕으로 합성한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 고상화된 유전자 칩 (어피메트릭사 제조) (Lipshutz, R. J. et al. (1999) Nature genet. 21, suppliment, 20-24) :
상기 EST 서열 또는 mRNA 서열은 프로브의 조제에 사용한 세포와 동종의 동물 유래인 것이 가장 바람직하지만, 이에 한정되지 않고 예컨대 근연종의 동물 유래의 것도 사용할 수 있다. 단, 전술한 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자, Genbank 데이터베이스상에「안지오포이에틴 관련 단백질 3」을 코드하는 뉴클레오티드 서열로서 공개되어 있는 유전자, 또는 그것들 중 어느 하나의 부분서열을 포함하는 서열이 고상화되어 있는 것을 사용한다.
프로브 조제에 사용한 세포와 동종 내지 근연의 동물의 장기조직 (바람직하게는 간), 또는 이 장기조직에서 단리 또는 주화된 세포로부터 얻어진 mRNA 로 제작된 cDNA 내지 RT-PCR 산물이 고상화된 DNA 마이크로 어레이 또는 멤브레인 필터 :
이들 cDNA 또는 RT-PCR 산물은 예컨대 mRNA 의 재료로 한 동물의 EST 데이터베이스 등의 서열정보를 바탕으로 제작된 프라이머로 역전사 효소반응이나 PCR 을 실시함으로써 클론화된 것이다. 시료 조제를 위한 재료로는 전술한 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자, Genbank 데이터베이스상에「안지오포이에틴 관련 단백질 3」을 코드하는 뉴클레오티드 서열로서 공개되어있는 유전자를 발현하고 있는 세포 (바람직하게는 간 유래) 를 사용한다. 이 cDNA 나 RT-PCR 산물로는 미리 발현량이 다른 mRNA 를 서브트랙션법 (Diatchenko, L. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93, 6025-6030), 디퍼렌셜 디스플레이법 (Kato. K. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 3685-3690) 등을 이용하여 선택하면서 제작된 것도 포함한다. 또한, DNA 마이크로 어레이 또는 필터는 검출대상이 되는 유전자, 즉 Genbank 데이터베이스상에「안지오포이에틴 관련 단백질 3」을 코드하는 뉴클레오티드 서열로서 공개되어 있는 유전자를 함유하는 시판품을 이용해도 되고, 스포터를 사용하여 전술한 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자를 고상화한 DNA 마이크로 어레이 또는 필터를 제작할 수도 있다 (예컨대 타카라슈조 (주) 사 제조 GMS 417 어레이어 등).
상기 고상화 시료에 상기 [2] 에서 조제된 프로브를 사용하여 동일한 조건에서 개별적으로 또는 혼합하여 동시에 하이브리다이즈시킨다 (Brown, P. O. et al. (1999) Nature genet, 21, suppliment 33-37).
[4] 해석
어피메트릭스사 제조 DAN 칩을 사용하는 해석의 경우 : 어피메트릭스사 제조 DNA 칩에 첨부된 프로토콜에 따라 하이브리다이제이션 및 해석을 행한다.
DNA 마이크로 어레이를 사용하는 해석의 경우 : 예컨대 타카라슈조 (주) 사에서 시판되고 있는 DNA 마이크로 어레이를 사용하는 경우, 동사의 프로토콜에 따라 하이브리다이제이션 및 세정을 행하여 형광 시그널 검출기 (예컨대 GMS 418 어레이 스캐너 (타카라슈조 (주) 사 제조) 등) 로 형광 시그널을 검출한 후, 해석을행한다.
필터를 사용하는 해석의 경우 : 하이브리다이제이션은 본 발명이 속하는 기술분야에 있어서 주지의 방법으로 행할 수 있다. 예컨대 하이브리다이제이션 및 세정을 한 후, 해석장치 (예컨대 아틀라스 이미지 (클론테크사 제조)) 를 사용하여 해석한다.
상기 어느 경우에나 동일한 로트의 고상화 시료에 피검물질 존재하에서 배양한 세포 유래의 시료 유래의 프로브와, 피검물질 비존재하에서 배양한 세포 유래의 시료 유래의 프로브를 각각 하이브리다이즈시킨다. 이 때, 사용하는 프로브 이외의 하이브리다이제이션의 조건은 동일하게 한다. 상기 [2] 에 기재된 바와 같이 각각의 프로브를 다른 형광색소로 표지한 경우에는 하나의 고상화 시료에 양 프로브의 혼합물을 하이브리다이즈시킬 수도 있다 (Brown, P. O. et al. (1999) Nature genet. 21, suppliment, 33-37).
해석 결과, 피검물질 존재하에서 배양한 세포 유래의 시료 유래의 프로브와, 피검물질 비존재하에서 배양한 세포 유래의 프로브 사이에서, 고상화 시료의 표적유전자, 즉 전술한 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 또는 안지오포이에틴 관련 단백질 3 을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자에 하이브리다이즈한 프로브의 양을 측정한다. 그 결과, 표적유전자에 하이브리다이즈한 프로브의 양을 비교하여 피검물질 존재하에서 배양한 세포 유래의 시료 유래의 프로브가 피검물질 비존재하에 배양한 세포 유래의 시료 유래의 프로브보다 적은 경우, 이 피검물질은 전술한 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현을 억제하는 물질이므로, 고지혈증의 치료 또는 예방제가 될 수 있다.
iv) 기타
상기 이외에, 피검물질 존재하에서 배양한 세포 유래의 시료에서, 피검물질 비존재하에서 배양한 세포 유래의 시료에 비해 전술한 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현량을 저하시키는 피검물질의 특정을 검출하는 방법으로서, 이하의 방법을 들 수 있다.
즉, 단일 반응에 있어서, PCR 을 하이브리다이제이션 프로빙 (이하「프로빙」이라고 함) 과 조합한「Taqman」 으로 알려진 기술 (Holland, P. M. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7276-7280) 이나, 단일 반응에 있어서 PCR 을 프로빙과 조합하는 방법 (Higuchi et al. Biotechnology, 10, 413-417 (1992)) 을 이용할 수도 있다. 후자의 방법은 자외선으로 여기됨으로써 형광을 발하는 핵산 검출시약인 브롬화 에티듐을 PCR 반응액에 첨가한다. 이본쇄 DNA 의 존재하에서 브롬화 에티듐의 형광은 증가하므로, 여기광을 조사하였을 때에 검출되는 형광의 증가는 이본쇄 PCR 산물의 축적에 상관할 수 있다.
또한, PCR 에 의한 증폭과 프로빙을 조합시킨 다른 방법으로서, 유럽 특허출원공개공보 제0601889호에 기재된 방법을 이용할 수도 있다. 또한, 라이트 사이클러 시스템 (로슈 다이아구노스틱스사 제조, 일본 특허공개공보 2000-312600호 참조) 을 사용하여 mRNA 의 양을 정량할 수도 있다.
(B) 폴리펩티드의 검출
이어서, 본 발명의 방법의 다른 실시태양으로는 상기한 유전자 발현을 검출하는 실시태양에서 검출대상이 된 유전자가 코드하는 폴리펩티드를 검출하는 방법이 있다. 이 실시태양에서는 시료중의 폴리페티드를 96-웰 플레이트의 웰내 바닥면 또는 멤브레인 등에 고상화시켜 둔 다음, 표적의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 검출이 행해진다. 이 중, 96-웰 플레이트를 사용하는 것은 일반적으로 고상효소 면역정량법 (ELISA 법) 이나 방사성 동위원소 면역정량법 (RIA 법) 으로 불리는 방법이다. 한편, 멤브레인에 고상화하는 방법으로는 시료의 폴리아크릴아미드 전기영동을 거쳐 멤브레인에 폴리펩티드를 전사하는 방법 (웨스턴 블롯법) 이나, 또는 직접 멤브레인에 시료 또는 그 희석액을 스며들게 하는 이른바 도트 블롯법이나 슬롯 블롯법을 들 수 있다.
1) 시료의 조제
상기와 같은 폴리펩티드를 검출하는 실시태양에서 사용되는 배양세포의 종류에 관한 조건은 상기한 유전자 발현을 검출하는 실시태양의 경우와 동일하다. 또한, 포유동물 개체에 피검물질을 투여하고, 그 후 이 동물 개체로부터 채취된 혈청 등을 시료로 사용하는 방법도 채용할 수 있다. 그 경우의 바람직한 포유동물종은 인간, 마우스, 래트 또는 햄스터가 바람직하고, 인간 또는 마우스가 보다 바람직하다. 예컨대 마우스로는 고지혈증 마우스인 KK 마우스가 바람직하게 사용되지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다. 배양세포의 배양조건, 피검물질의 투여방법에 대해서도 유전자 발현을 검출하는 실시태양의 경우와 동일하다. 또한, 고지혈증의 치료 또는 예방제로서의 활성을 조사하고자 하는 피검물질로는화합물, 미생물의 대사 산물, 식물이나 동물 조직의 추출물, 이들 유도체 또는 그들의 혼합물 등을 들 수 있다.
본 실시태양을 위한 시료를 조제하기 위한 재료로는 피검물질 존재하 또는 비존재하에서 배양한 세포배양의 배양 상등액 또는 세포질 획분을 사용할 수 있는데 배양 상등액이 바람직하다. 배양 상등액은 배양종료후 회수하고, 필요에 따라 필터 여과멸균처리를 거쳐 ELISA/RIA용 시료나 웨스턴 블롯용 시료의 조제공정에 이용된다.
ELISA/RIA용 시료로는 예컨대 회수한 배양 상등액을 그대로 사용하거나, 완충액으로 적절히 희석한 것을 사용한다.
웨스턴 블롯용 (전기영동용) 시료의 조제방법은 다음과 같다. 우선, 예컨대 배양 상등액을 트리클로로아세트산 처리하여 단백질을 침전시키고, 원심분리에 의해 침전을 얻는다. 이 침전을 빙랭한 아세톤으로 세정하고, 자연건조후, SDS-폴리아크릴아미드 전기영동용 2-메르캅토에탄올을 함유하는 샘플 완충액 (바이오래드사 제조) 에 용해한다.
도트/슬롯 블롯의 경우에는 예컨대 회수한 배양 상등액 자체, 또는 완충액으로 적절히 희석한 것을 블롯팅 장치를 사용하는 등의 방법으로 직접 멤브레인에 흡착시킨다.
2) 시료의 고상화
상기와 같이 하여 얻어진 시료 중의 폴리펩티드를 특이적으로 검출하기 위해 이 시료를 고상화한다. 웨스턴 블롯법, 도트 블롯법 또는 슬롯 블롯법에 사용되는 멤브레인으로는 니트로셀룰로스 멤브레인 (예컨대 바이오래드사 제조 등), 나일론 멤브레인 (예컨대 하이본드-ECL (아머샴 파마시아사 제조) 등), 코튼 멤브레인 (예컨대 블롯 앱소벤트 필터 (바이오래드사 제조) 등) 또는 폴리비닐리덴 디플루오리드 (PVDF) 멤브레인 (예컨대 바이오래드사 제조 등) 등을 들 수 있다.
전기영동후의 겔로부터 멤브레인으로 폴리펩티드를 옮기는, 이른바 블롯팅 방법으로는 웨트식 블로팅법 (CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume2 ed by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober), 세미 드라이식 블롯팅법 (상기 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume2 참조) 등을 들 수 있다. 도트 블롯법이나 슬롯 블롯법을 위한 기재도 시판되고 있다 (예컨대 바이오 도트 (바이오래드) 등).
한편, ELISA 법/RIA 법으로 검출ㆍ정량하기 위해서는 전용의 96-웰 플레이트 (예컨대 이무노 플레이트 막시 소프 (눈크사 제조) 등) 에 시료 또는 그 희석액 (예컨대 0.05 % 아지화 나트륨을 함유하는 인산 완충 생리식염수 (이하「PBS」라고 함) 로 희석한 것) 을 넣고 4 ℃ 내지 실온에서 하룻밤, 또는 37 ℃ 에서 1 내지 3 시간 정치함으로써, 웰내 바닥면에 폴리펩티드를 흡착시켜 고상화한다.
3) 항체
본 실시태양에 사용되는 항체는 상기 (A) 의 a) 내지 e) 에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자가 동물세포에서 발현함으로써 생산되는 폴리펩티드, 바람직하게는 서열목록의 서열번호 2 의 아미노산 번호 17-455 (보다 바람직하게는 동 19-455) 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부 또는서열번호 4 의 아미노산 번호 17-460 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부를 특이적으로 인식하는 것이다. 이 같은 항체로서 바람직한 것은 예컨대 서열목록의 서열번호 2 의 아미노산 번호 17-455 (보다 바람직하게는 동 19-455) 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 및 서열번호 4 의 아미노산 번호 17-460 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 어느 것에나 결합하지만, 다른 어떠한 마우스 또는 인간 유래의 단백질과도 결합하지 않는 항체를 들 수 있다.
본 실시태양을 위한 항체는 상법을 이용하여 (예컨대 신생 화학 실험 강좌 1, 단백질 1, p.389-397, 1992), 항원이 되는 단백질, 또는 그 아미노산 서열로부터 선택되는 임의의 폴리펩티드를 동물에게 면역하고, 생체내에 생산되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 또한 공지의 방법 (예컨대 Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody p.365-367, 1980, Prenum Press, N.Y.) 에 따라 본 발명의 단백질에 대한 항체를 생산하는 항체생산세포와 미에로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하고 모노크로날 항체를 얻을 수도 있다.
본 실시태양에 사용되는 항체를 제작하기 위한 항원으로는 서열목록의 서열번호 2 의 아미노산 번호 17-455 (바람직하게는 동 19-455) 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 6개 이상의 연속한 부분아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 서열번호 4 의 아미노산 번호 17-460 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 6개 이상의 연속한 부분아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 그들 폴리펩티드에 임의의 아미노산 서열이나 담체가 부착된 형태의 유도체를 들 수 있지만, 바람직하게는 서열목록의 서열번호 9 의 아미노산 번호 1-14 로 이루어지는 폴리펩티드의 C 말단 또는 서열번호 10 의 아미노산 번호 1-14 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 N 말단에 키홀 림페트 헤모시아닌을 담체로서 결합시킨 것이다.
서열목록의 서열번호 2 의 아미노산 번호 17-455 (바람직하게는 동 19-455) 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 서열번호 4 의 아미노산 번호 17-460 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 예컨대 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47-1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78-1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 코드되는 폴리펩티드를 유전자 조작에 의해 숙주세포에 생산시킴으로써 얻을 수 있다. 구체적으로는 상기 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 적당한 벡터 DNA 에 삽입함으로써, 다른 원핵생물, 또는 진핵생물의 숙주세포를 형질전환시킬 수 있다. 또한 이들 벡터에 적당한 프로모터, 및 형질발현에 관한 서열을 도입함으로써, 각각의 숙주에 있어서 유전자를 발현시킬 수 있다.
원핵세포의 숙주로는 예컨대 대장균 (Escherichia coli) 이나 길초균 (Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 목적으로 하는 유전자를 이들 숙주세포내에서 형질전환시키기 위해서는 숙주와 적합할 수 있는 종 유래의 레플리콘 즉 복제 기점과, 조절 서열을 포함하고 있는 플라스미드 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 또한 벡터로는 형질전환세포에 표현형질 (표현형) 의 선택성을 부여할수 있는 서열을 갖는 것이 바람직하다.
예컨대 대장균으로는 K12주 등이 주로 사용되고, 벡터로는 일반적으로 pBR322 또는 pUC계 플라스미드가 사용되지만 이에 한정되지 않고 공지의 각종 균주, 및 벡터를 모두 사용할 수 있다.
프로모터로는 대장균에서는 트립토판(trp)프로모터, 락토스(lac)프로모터, 트립토판 락토스(tac)프로모터, 리포프로틴(lpp)프로모터, 폴리펩티드쇄 신장인자 Tu(tufB)프로모터 등을 들 수 있고, 어느 프로모터나 목적으로 하는 폴리펩티드의 생산에 사용할 수 있다.
길초균으로는 예컨대 207-25주가 바람직하고, 벡터로는 pTUB228 (Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93) 등을 사용할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 길초균의 α-아미라제의 시그널 펩티드 서열을 코드하는 DNA 서열을 연결함으로써, 균체 밖에서의 분비 발현도 가능해진다.
진핵세포의 숙주세포로는 척추동물, 곤충, 효모 등의 세포가 포함되고, 척추동물세포로는 예컨대 원숭이 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182, ATCC CRL-1650) 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디히드로 엽산 환원효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220) 등이 주로 사용되고 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
척추동물세포의 발현 프로모터로는 통상 발현하고자 하는 유전자의 상류에 위치하는 프로모터, RNA 의 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사종결서열등을 갖는 것을 사용할 수 있고, 또한 이것은 필요에 따라 복제 기점을 가져도 된다. 이 발현 벡터의 예로는 SV40 의 초기 프로모터를 갖는 pSV2dhfr (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Celi. Biol. 1, 854-864) 등을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
숙주세포로서 COS 세포를 사용하는 경우를 예로 들면 발현 벡터로는 SV40 복제 기점을 갖고, COS 세포에 있어서 자립증식이 가능하고, 또한 전사 프로모터, 전사 종결 시그널, 및 RNA 스플라이스 부위를 구비한 것을 사용할 수 있다. 이 발현 벡터는 디에틸아미노에틸 (DEAE)-덱스트란법 (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308), 인산칼슘-DNA 공침전법 (Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457), 및 전기 펄스 천공법 (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845) 등에 의해 COS 세포에 도입할 수 있고, 이렇게 하여 원하는 형질전환세포를 얻을 수 있다. 또한, 숙주세포로서 CHO 세포를 사용하는 경우에는 발현벡터와 함께 항생물질 G418 내성 마커로서 기능하는 neo 유전자를 발현할 수 있는 벡터, 예컨대 pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989) : “Molecular Cloning A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory, NY) 또는 pSV2-neo (Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341) 등을 코 트랜스펙트하고, G418 내성의 콜로니를 선택함으로써, 목적으로 하는 폴리펩티드를 안정되게 생산하는 형질전환세포를 얻을 수 있다.
곤충세포를 숙주세포로 사용하는 경우에는 인시류 밤나방과의 Spodopterafrugiperda 의 난소 세포 유래 주화 세포 (Sf-9 또는 Sf-21) 또는 Trichoplusia ni 의 난세포 유래 High Five 세포 (Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog. I : 391-396) 등이 숙주세포로서 주로 사용되고, 바큐로 바이러스 트랜스퍼 벡터로는 오토 그래파 핵다각체 바이러스 (AcNPV) 의 폴리헤드린 단백질의 프로모터를 이용한 pVL1392/1393 이 주로 사용된다 (Kidd, I. M. and V.C. Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and Biotechnology 42, 137-159). 이 밖에도 바큐로 바이러스의 P10 또는 동 염기성 단백질의 프로모터를 이용한 벡터도 사용할 수 있다. 또한, AcNPV 의 엔벨로프 표면단백질 GP67 의 분비 시그널 서열을 목적단백질의 N 말단측에 연결함으로써 재조합 단백질을 분비단백질로서 발현시킬 수도 있다 (Zhe-mei Wang, et al. (1998) Biol. Chem., 379, 167-174).
진핵미생물을 숙주세포로 한 발현계로는 효모가 일반적으로 잘 알려져 있는데, 그 중에서도 사카로미세스속 효모, 예컨대 빵 효모 Saccharomyces cerevisiae 또는 석유효모 Pichia pastoris 가 바람직하다. 이 효모 등의 진핵미생물의 발현벡터로는 예컨대 알코올 탈수소효소 유전자의 프로모터 (Bennetzen, J. L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025) 또는 산성 포스파타제 유전자의 프로모터 (Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1-5) 등을 바람직하게 이용할 수 있다. 또한, 분비형 단백질로서 발현시키는 경우에는 분비 시그널 서열과 숙주세포가 갖는 내재성 프로테아제 또는 기지의 프로테아제의 절단부위를 N 말단측에 갖는 재조합체로서 발현할 수도 있다. 예컨대 트립신형 세린 프로테아제의 인간 마스트 세포 트립타제를 석유효모로 발현시킨 계에서는 N 말단측에 효모의 α팩터의 분비 시그널 서열과 석유효모가 갖는 KEX2 프로테아제의 절단부위를 연결하여 발현시킴으로써, 활성형 트립타제가 배지중에 분비되는 것이 알려져 있다 (Andrew, L. Niles, et al. (1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 28, 125-131).
상기와 같이 하여 얻어진 형질전환체는 상법에 따라 배양할 수 있고, 이 배양에 의해 세포내, 또는 세포 밖에 목적으로 하는 폴리펩티드가 생산된다. 이 배양에 사용되는 배지로는 채용한 숙주세포에 따라 관용되는 각종의 것을 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 상기 COS 세포라면 RPMI 1640 배지나 둘베코 개변 이글 배지 (이하「DMEM」이라고 함) 등의 배지에, 필요에 따라 소 태아 혈청 등의 혈청성분을 첨가한 것을 사용할 수 있다.
상기 배양에 의해 형질전환체의 세포내 또는 세포 밖에 생산되는 재조합 단백질은 이 단백질의 물리적 성질이나 화학적 성질 등을 이용한 각종 공지의 분리조작법으로 분리ㆍ정제할 수 있다. 이 방법으로서 구체적으로는 예컨대 통상의 단백 침전제에 의한 처리, 한외여과, 분자 체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등의 각종 액체 크로마토그래피, 투석법, 이들의 조합 등을 예시할 수 있다. 또한, 발현시키는 재조합 단백질에 6잔기로 이루어지는 히스티딘을 연결함으로써 니켈 어피니티 칼럼으로 효율적으로 정제할 수 있다. 상기 방법을 조합함으로써 용이하게 고수율, 고순도로 본 발명의 폴리펩티드를 대량으로 제조할 수 있다.
상기와 같이 하여 얻어진 항체는 RIA법, ELISA법, 형광항체법, 수신 혈구 응집반응법 등의 각종 면역학적 측정법이나 면역조직염색 등에 이용할 수 있다.
4) 검출
상기 3) 에 기재된 방법으로 얻어지는 항체는 그것을 직접 표지하거나, 또는 이 항체를 1차 항체로 하고, 이 항체를 특이적으로 인식하는 (항체를 제작한 동물 유래의 항체를 인식한다) 표지 2차 항체와 협동으로 검출에 이용된다.
표지의 종류로서 바람직한 것은 효소 (알칼리 포스파타제 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제) 또는 비오틴 (단 2차 항체의 비오틴에 추가로 효소 표지 스트렙토 아비딘을 결합시키는 조작이 가해진다) 이지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 표지 2차 항체 (또는 표지 스트렙토 아비딘) 를 사용하는 방법을 위한, 미리 표지된 항체 (또는 스트렙토 아비딘) 는 각종의 것이 시판되고 있다. RIA 의 경우에는 I125등의 방사성 동위원소로 표지된 항체를 사용하고, 측정은 액체 신틸레이션 카운터 등을 이용하여 실시한다.
이들 표지된 효소의 활성을 검출함으로써, 항원인 폴리펩티드의 양이 측정된다. 알칼리 포스파타제 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제의 경우, 그들 효소의 촉매에 의해 발색하는 기질이나 발광하는 기질이 시판되고 있다.
발색하는 기질을 사용한 경우, 웨스턴 블롯법이나 도트/슬롯 블롯법에서는 육안으로 검출할 수 있다. ELISA 법에서는 바람직하게는 시판중인 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 흡광도 (측정파장은 기질에 따라 다르다) 를 측정함으로써 정량한다. 또한 바람직하게는 상기 3) 에서 항체 제작을 위해 사용한 항원의 희석계열을 조제하고, 이것을 표준항원시료로서 다른 시료와 동시에 검출조작을 하여 표준항원농도와 측정값을 플롯한 표준곡선을 작성함으로써, 다른 시료중의 항원농도를 정량할 수 있다.
한편, 발광하는 기질을 사용한 경우에는 웨스턴 블롯법이나 도트/슬롯 블롯법에서는 X선 필름 또는 이미징 플레이트를 사용한 오토라디오그래피나, 인스턴트 카메라를 사용한 사진촬영에 의해 검출할 수 있고, 덴시토메트리 또는 BAS2000II 시스템을 이용한 정량도 가능하다. 또한 ELISA 법에서 발광기질을 사용하는 경우에는 발광 마이크로 플레이트 리더 (예컨대 바이오래드사 제조 등) 를 사용하여 효소활성을 측정한다.
5) 측정조작
i) 웨스턴 블롯, 도트 블롯 또는 슬롯 블롯의 경우
먼저, 항체의 비특이적 흡착을 저지하기 위해, 미리 멤브레인을 그 같은 비특이적 흡착을 저해하는 물질 (스킴밀크, 소 혈청 알부민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등) 을 함유하는 완충액 중에 일정시간 담궈 두는 조작 (블로킹) 을 한다. 블로킹 용액의 조성은 예컨대 5 % 스킴밀크, 0.05 내지 0.1 % 트윈 20 을 함유하는 인산 완충 생리식염수 (PBS) 또는 트리스 완충 생리식염수 (TBS) 가 사용된다. 스킴밀크 대신에 1 내지 10 % 의 소 혈청 알부민, 0.5 내지 3 % 의 젤라틴 또는 1 % 의 폴리비닐피롤리돈 등을 사용해도 된다. 블로킹 시간은 4 ℃ 에서 16 내지24 시간, 또는 실온에서 1 내지 3 시간이다.
이어서, 멤브레인을 0.05 내지 0.1 % 트윈 20 을 함유하는 PBS 또는 TBS (이하「세정액」이라고 함) 로 세정하여 여분의 브로킹 용액을 제거한 후, 상기 3) 에 기재된 방법으로 제작된 항체를 세정액으로 적절히 희석한 용액중에 일정시간 담그고 항체를 멤브레인 위의 항원에 결합시킨다. 이 때의 항체의 희석배율은 예컨대 상기 3) 에 기재된 재조합 항원을 단계희석한 것을 시료로 한 예비 웨스턴 블롯팅 실험을 수행하여 결정할 수 있다. 이 항체반응조작은 바람직하게는 실온에서 1 시간 수행한다. 항체반응조작종료후, 멤브레인을 세정액으로 세정한다. 여기서, 사용한 항체가 표지된 것인 경우에는 즉시 검출조작을 할 수 있다. 미표지 항체를 사용한 경우에는 계속하여 2차 항체반응을 수행한다. 표지 2차 항체는 예컨대 시판중인 것을 사용하는 경우에는 세정액으로 2000 내지 20000 배로 희석하여 사용한다 (첨부된 지시서에 바람직한 희석배율이 기재된 경우에는 그 기재에 따른다). 1차 항체를 세정제거한 후의 멤브레인을 2차 항체 용액에 실온에서 1 내지 3 시간 담그고 세정액으로 세정한 다음, 표지방법에 따른 검출조작을 한다. 세정조작은 예컨대 먼저 멤브레인을 세정액중에서 15 분간 진탕한 다음, 세정액을 새로운 것으로 교환하여 5 분간 진탕한 후, 다시 세정액을 교환하여 5 분간 진탕함으로써 수행한다. 필요하다면 다시 세정액을 교환하여 세정해도 된다.
ii) ELISA/RIA
먼저, 상기 2) 의 방법으로 시료를 고상화시킨 플레이트의 웰내 바닥면으로의 항체의 비특이적 흡착을 저지하기 위해 웨스턴 블롯의 경우와 마찬가지로, 미리 블로킹을 해 둔다. 블로킹의 조건은 웨스턴 블롯의 항에 기재한 바와 같다.
이어서, 웰내를 0.05 내지 0.1 % 트윈 20 을 함유하는 PBS 또는 TBS (이하「세정액」이라고 함) 로 세정하여 여분의 브로킹 용액을 제거한 후, 상기 3) 에 기재된 방법으로 제작된 항체를 세정액으로 적절히 희석한 용액을 분주하여 일정시간 인큐베이션하고, 항체를 항원에 결합시킨다. 이 때의 항체의 희석배율은 예컨대 상기 3) 에 기재된 재조합 항원을 단계희석한 것을 시료로 한 예비 ELISA 실험을 수행하여 결정할 수 있다. 이 항체반응조작은 바람직하게는 실온에서 1 시간 정도 수행한다. 항체반응조작 종료후, 웰내를 세정액으로 세정한다. 여기서, 사용한 항체가 표지된 것인 경우에는 즉시 검출조작을 수행할 수 있다. 미표지 항체를 사용한 경우에는 계속하여 2차 항체반응을 수행한다. 표지 2차 항체는 예컨대 시판중인 것을 사용하는 경우에는 세정액으로 2000 내지 20000 배로 희석하여 사용한다 (첨부된 지시서에 바람직한 희석배율이 기재된 경우에는 그 기재에 따른다). 1차 항체를 세정제거한 후의 웰에 2차 항체 용액을 분주하여 실온에서 1 내지 3 시간 인큐베이션하고, 세정액으로 세정한 다음, 표지방법에 따른 검출조작을 수행한다. 세정조작은 예컨대 먼저 웰내에 세정액을 분주하여 5 분간 진탕한 다음, 세정액을 새로운 것으로 교환하여 5 분간 진탕한 후, 다시 세정액을 교환하여 5 분간 진탕함으로써 수행한다. 필요하다면 다시 세정액을 교환하여 세정해도 된다.
또한, 본 발명에서 이른바 샌드위치법의 ELISA 는 예컨대 이하에 기재하는방법에 의해 실시할 수 있다. 먼저, 서열목록의 서열번호 2 의 아미노산 번호 17-455 (바람직하게는 동 19-455) 로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 4 의 아미노산 번호 17-460 으로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나에 있어서, 친수성이 풍부한 영역을 2군데 선택하여 각각의 영역중의 아미노산 6 잔기 이상으로 이루어지는 부분펩티드를 합성하고, 이 부분펩티드를 항원으로 한 2종류의 항체를 취득한다. 이 중 일방의 항체를 상기 4) 에 기재된 바와 같이 표지하여 둔다. 표지하지 않은 쪽의 항체는 상기 2) 에 기재된 방법에 준하여 96-웰 ELISA 용 플레이트의 웰내 바닥면에 고상화시킨다. 블로킹 후, 시료액을 웰내에 넣어 상온에서 1 시간 인큐베이션한다. 웰내를 세정후, 표지한 쪽의 항체 희석액을 각 웰에 분주하여 인큐베이션한다. 다시 웰내를 세정후, 표지방법에 따른 검출조작을 수행한다.
6) 평가
이상에 기재한 방법으로, 피검물질 존재하에서 배양한 세포 유래의 시료와, 피검물질 비존재하에서 배양한 세포 유래의 시료 사이에서 검출결과를 비교하고, 그 결과 상기 3) 에 기재된 방법으로 제작된 항체가 특이적으로 결합하는 폴리펩티드의 생산량을 저하시킨 피검물질은 고지혈증의 치료 또는 예방제가 될 수 있다. 또한, 상기 3) 에 기재된 방법으로 제작된 항체, 및 기타 상기 일련의 방법에 사용되는 시약을 모음으로써, 고지혈증의 치료 또는 예방제를 시험하기 위한 키트가 제공된다.
본 발명의 방법에 있어서 검출의 대상이 되는 폴리펩티드는 상기 항체 제작용 항원을 얻는 방법의 기재에 따라 얻어지는 것 이외에, 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47-1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78-1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 삽입한 아데노 바이러스 벡터를 이용하여 동물세포에 생산시킬 수도 있다. 그 같은 재조합 아데노 바이러스 벡터를 구축하는 방법으로서 시판중인 키트 (예컨대 아데노 바이러스 익스프레션 벡터 키트, 타카라슈조 (주) 사 제조) 를 사용하는 방법을 예시할 수 있다. 본 발명의 방법에서 검출대상이 되는 유전자가 포유동물의 혈중 중성 지방농도와 밀접한 상관관계에 있음은, 예컨대 상기와 같이 하여 얻어지는 재조합 아데노 바이러스 벡터를 갖는 재조합 아데노 바이러스를 포유동물, 예컨대 마우스에 감염시켜 이 재조합 아데노 바이러스 벡터가 보유하는 유전자를 발현시키면 혈중 중성 지방농도의 상승이 관찰되는 점, 및 선천성 저지혈증 마우스에 있어서 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47-1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현량이 고지혈증 마우스보다 적은 점에서 알 수 있다.
또한, 유전자 조작으로 얻어지는 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 외래유전자가 이 유전자를 고발현할 수 있도록 도입되어 있는 비인간 동물을 이용한 고지혈증의 치료 또는 예방제의 시험방법도 본 발명에 포함된다. 이 방법에서 이용되는 동물은 예컨대 상기 재조합 아데노 바이러스를 감염시킨 KK/San 마우스나, 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47-1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드번호 78-1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 마우스에 도입한 트랜스제닉 마우스 등이지만 이에 한정되는 것은 아니다.
트랜스제닉 동물은 동물로부터 수정란을 취득하고, 유전자 도입후, 위임신(僞姙娠)동물에게 이식하여 발생시킴으로써 얻을 수 있다. 그 수순으로는 이미 확립되어 있는 방법에 따를 수 있다 [발생공학실험 매뉴얼 (노무라 타츠지 감수, 카쯔기 모토야 편, 1987 년 간행), 마우스 배아의 조작 매뉴얼 (“Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual”B. Hogan, F. Costantini and E. Lacy 저술, 야마우찌 카즈야, 토요타 히로시, 모리 쯔네아쯔, 이와쿠라 요오이찌로 번역, 1989 년 간행), 일본 특허공고공보 평5-48093호 참조]. 구체적으로는 예컨대 마우스의 경우, 먼저 암컷 마우스 (혈중 중성 지방농도가 일반적인 것보다 낮은 것이 바람직하고, 예컨대 KK/San 마우스가 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다) 에 배란유도제를 투여한 후, 동 계통의 수컷과 교배시키고 다음 날 암컷 마우스의 난관으로부터 전핵수정란을 채취한다. 이어서 도입되는 DNA 단편 용액을 미소 유리관을 사용하여 수정란의 전핵에 주입한다. 그리고, 도입하는 유전자를 동물세포내에서 발현시키기 위한 프로모터나 인헨서 등의 조절유전자로는 도입된 동물의 세포내에서 기능하는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. DNA 를 주입한 수정란은 위임신 예비 어미 암컷 마우스 (Slc : ICR 등) 의 난관에 이식하고, 약 20 일후에 자연분만 또는 제왕절개에 의해 출생시킨다. 이 같이 하여 얻어진 동물이 도입한 유전자를 보유하고 있음을 확인하는 방법으로는 이 동물의 꼬리 등으로부터 DNA 를 추출하고, 이 DNA 를 주형으로 하여 도입유전자에 특이적인 센스 및 안티센스 프라이머를 사용한 PCR 을 수행하는 방법, 이 DNA 를 여러 종의 제한효소로 소화후 겔전기영동하고, 겔 중의 DNA 를 니트로셀룰로스 막이나 나일론 막 등에 블롯팅한 것에 대해 도입유전자의 전부 또는 일부를 표지한 것을 프로브로 한 서던 블롯 해석을 수행하는 방법 등을 들 수 있다. 또한, 도입된 유전자가 실제로 동물체내에서 발현하고 있는지의 여부는 말초혈중의 중성 지방농도를 측정함으로써 확인할 수 있다. 도입된 유전자가 실제로 동물 체내에서 발현하고 있는 경우에는 유전자를 도입하지 않은 동물보다 혈중 중성 지방농도가 높아진다.
이 같이 하여 얻어진 유전자 도입동물에게 피검물질을 투여하여 혈중 중성 지방농도를 저하시키는 물질을 선택한다 (바람직하게는 유전자를 도입하지 않은 동물에게도 피검물질을 투여하여 결과를 비교하고, 유전자를 도입한 동물에게서 현저하게 혈중 중성 지방농도를 저하시키는 물질을 선택한다). 이 방법에서는 도입된 유전자의 발현을 억제 또는 저해하는 물질 뿐아니라, 이 유전자에 코드되는 폴리펩티드 자체의 기능이나, 이 폴리펩티드와 상호작용하여 이 폴리펩티드의 기능발현에 기여하는 인자 (예컨대 리셉터) 등, 이 폴리펩티드의 작용에 의한 혈중 중성 지방농도의 상승에 관련되는 생체반응 중 어느 하나를 저해하는 물질을 찾아 낼 수 있다. 이 같은 물질도 고지혈증의 치료 또는 예방제가 될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 있어서 검출대상으로 하는 폴리펩티드 (이하, 단지「검출대상 폴리펩티드」라고 함) 에 특이적으로 결합하는, 항체 이외의 폴리펩티드, 즉 검출대상 폴리펩티드의 리셉터에 관한 것이다. 이 리셉터가 세포막에 존재하는 단백질인 경우에는 이 리셉터는 예컨대 이하에 기재하는 방법에따라 클로닝할 수 있다. 먼저, 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47 내지 1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 DNA 를 포유동물세포에서 발현 가능한 재조합 벡터를 구축하고, COS-1 에 도입하여 그 배양 상등액을 회수하고, 검출대상 폴리펩티드의 재조합 폴리펩티드를 정제한다. 얻어진 재조합 폴리펩티드는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (이하「FITC」라고 함) 로 표지해 둔다. 이어서, 각종 포유동물 조직 유래의 배양세포에 표지 재조합 폴리펩티드를 첨가하여 표지 재조합 폴리펩티드가 세포막상에 특이적으로 결합하는 세포, 즉 리셉터를 발현하는 세포를 동정한다. 동정된 세포 유래의 cDNA 라이브러리를 포유동물세포에서 발현가능한 벡터 중에 삽입하고, 리셉터를 발현하지 않는 세포 (바람직하게는 COS-1 또는 CHO 세포, 보다 바람직하게는 CHO 세포) 에서 발현시킨다. 이 cDNA 라이브러리를 발현시킨 세포에 상기 FITC 표지한 재조합 폴리펩티드를 첨가하고, 일정시간 배양후, 세포를 회수하여 셀소터로 FITC 표지된 재조합 폴리펩티드가 결합한 세포를 선별한다. 얻어진 세포로부터 도입된 cDNA 를 PCR 등에 의해 클로닝한다. 필요에 따라 이상의 조작을 반복하여 최종적으로 FITC 표지 재조합 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 리셉터를 코드하는 cDNA 를 클로닝한다. 또한 리셉터 자체는 이 같이 하여 클론화된 세포로부터 회수할 수 있다.
이 같이 하여 검출대상 폴리펩티드의 리셉터를 코드하는 cDNA 가 얻어지면 그 cDNA 라이브러리의 재료가 된 세포를 이용하여, 추가로 검출대상 폴리펩티드와이 리셉터의 상호작용을 저해하는 물질이나, 이 리셉터에 결합함으로써 검출대상 폴리펩티드와 동일한 기능을 발휘하는 물질, 또는 검출대상 폴리펩티드와 이 리셉터의 상호작용에 의해 개시되는 시그널 전달을 저해하는 물질의 스크리닝에 이용할 수 있다. 구체적으로는 예컨대 마우스 게놈 DNA 를 제한효소 소화에 의해 적절히 단편화하여 그들의 일단에 녹색형광 단백질 (green-fluorescent protein : 리포터 어세이용 벡터로서 pEGFP-1 (크론텍사 제조) 이 시판되고 있다) 을 코드하는 DNA 가 연결된 벡터를 상기 cDNA 라이브러리의 재료가 된 세포에 도입한다. 이 세포 배양중에 검출대상 폴리펩티드의 재조합 폴리펩티드 (표지하지 않는 것) 를 첨가하여 녹색형광 단백질을 생산하는 세포를 셀소터로 선별한다. 선별된 세포는 이 재조합 폴리펩티드의 존재하에서 녹색형광 단백질을 생산한다. 이 세포를 96-웰 배양 플레이트에 1웰 당 세포수가 대략 같아지도록 배양하고, 피검물질만 첨가하거나, 또는 이 재조합 폴리펩티드와 피검물질을 동시첨가하여 일정시간 배양한 후, 형광 플레이트 리더 등을 사용하여 녹색형광 단백질의 생산량을 측정한다. 피검물질 단독으로 배양하였을 때에 녹색형광 단백질의 생산을 일으키는 경우, 이 물질은 검출대상 폴리펩티드의 아고니스트라고 생각할 수 있다. 한편, 이 재조합 폴리펩티드와 피검물질을 동시첨가한 웰에 있어서의 녹색형광 단백질의 생산량이 이 재조합 폴리펩티드 단독첨가의 웰보다 적은 경우, 이 물질은 검출대상 폴리펩티드의 안타고니스트 또는 이 폴리펩티드의 시그널 전달저해제이고, 고지혈증의 치료 또는 예방제로서 유용한 것으로 생각할 수 있다.
이 같이 하여 얻어진 안타고니스트가 단백질 또는 펩티드인 경우, 이 단백질또는 펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 고지혈증의 유전자 치료에 사용할 수 있다. 그 같은 폴리뉴클레오티드는 예컨대 동정된 안타고니스트 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 해석하고, 이 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성한 각종 cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝을 수행함으로써 취득할 수 있다. 또한, 안타고니스트 활성을 갖는 펩티드가 랜덤하게 합성된 인공 펩티드 라이브러리 유래인 경우에는 이 펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 DNA 를 화학합성한다. 유전자 치료에 있어서는 이 같이 하여 얻어진 안타고니스트를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 예컨대 바이러스 벡터에 삽입하여 이 재조합 바이러스 벡터를 갖는 바이러스 (무독화된 것) 를 환자에게 감염시킨다. 환자 체내에서는 안타고니스트가 생산되고, 서열목록의 서열번호 4 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 기능을 저해하므로 혈중의 중성 지방 농도를 저감시킬 수 있다.
유전자 치료제를 세포내에 도입하는 방법으로는 바이러스 벡터를 이용한 유전자 도입방법, 또는 비바이러스성 유전자 도입방법 (닛께이 사이언스, 1994 년 4 월호, 20-45 페이지, 실험의학증간, 12(15)(1994), 실험의학 별책「유전자 치료의 기초기술」, 요도사 (1996)) 중 어느 방법이나 적용할 수 있다.
바이러스 벡터에 의한 유전자 도입방법으로는 예컨대 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 폴리오 바이러스, 신드비스 바이러스 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에, TR4 또는 변이 TR4 를 코드하는 DNA 를 삽입하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 이 중, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아 바이러스를 사용한 방법이 특히 바람직하다. 비바이러스성 유전자 도입방법으로는 발현 플라스미드를 직접 근육내에 투여하는 방법 (DNA 왁틴법), 리포솜법, 리포펙틴법, 마이크로인젝션법, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있고, 특히 DNA 왁틴법, 리포솜법이 바람직하다.
또한 유전자 치료제를 실제로 의약으로 작용시키기 위해서는 DNA 를 직접 체내에 도입하는 인 비보 (in vivo) 법 및 인간으로부터 어떤 종류의 세포를 꺼내어 체외에서 DNA 를 이 세포에 도입하고, 그 세포를 체내에 되돌리는 엑스 비보 (ex vivo) 법이 있다 (닛께이 사이언스, 1994 년 4 월호, 20-45 페이지, 월간 야꾸지, 36(1), 23-48(1994), 실험의학 증간, 12(15)(1994)).
예컨대 이 유전자 치료제가 인 비보법에 의해 투여되는 경우에는 질환, 증상 등에 따라, 정맥, 동맥, 피하, 피내, 근육내 등 적당한 투여경로를 통해 투여된다. 또한 인 비보법에 의해 투여하는 경우에는 이 유전자 치료제는 일반적으로는 주사제 등으로 되지만, 필요에 따라 관용의 담체를 첨가해도 된다. 또한, 리포솜 또는 막융합 리포솜 (센다이 바이러스-리포솜 등) 의 형태로 한 경우에는 현탁제, 동결제, 원심분리 농축 동결제 등의 리포솜 제제로 할 수 있다.
서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78-1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 부분서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열은 이른바 안티센서 치료에 사용할 수 있다. 안티센스 분자는 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호78-1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적인, 통상 15 내지 30 mer 로 이루어지는 DNA, 또는 그 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 또는 모르폴리노 유도체 등의 안정된 DNA 유도체, 2'-O-알킬 RNA 등의 안정된 RNA 유도체로서 사용될 수 있다. 그 같은 안티센스 분자를 미량 주입, 리포솜 캡슐화에 의해, 또는 안티센스 서열을 갖는 벡터를 이용하여 발현시키는 등, 본 발명의 기술분야에 있어서 주지의 방법으로 세포에 도입할 수 있다. 이 같은 안티센스 요법은 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78-1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열이 코드하는 단백질의 활성을 검소시키는 것이 유용한 질병, 특히 고지혈증의 치료에 유용하다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 의약으로서 유용한 조성물은 의약으로서 허용될 수 있는 담체의 혼합 등과 같은 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 이 같은 담체와 제조방법의 예는 레민톤의 Pharmaceutical Sciences 에 기재되어 있다. 그리고, 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78-1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 유전자의 발현이나 그 유전자 산물의 활성에 이상이 관찰되는 고지혈증의 치료에 충분한 양을 각 사람에게 투여한다. 그 유효량은 각 사람의 상태, 체중, 성별, 및 연령 등의 각종 인자나, 피하, 국소, 경구, 및 근육내 등의 투여방법의 차이에 따라 변화될 수 있다. 예컨대 정맥주사하는 경우에는 0.02 내지 0.2 ㎎/㎏/시간으로 2 시간, 또한 피하투여의 경우에는 1 내지 200 ㎎/㎡/일과 같이 변화될 수 있다.
본 발명은 고지혈증의 치료 또는 예방제의 신규 시험방법, 이 방법에서 사용되는 핵산 프로브, 프라이머 및 항체에 관한 것이다.
도 1 은 KK 마우스 장기 유래의 시료에 대한 노던 블롯 해석의 결과를 나타내는 도면이다. 레인 우측의 숫자 (28S 및 18S) 는 마커 RNA 의 침강계수를 나타낸다.
도 2 는 유전자 도입의 COS-1 세포 배양 상등액을 시료로 한 웨스턴 블롯 해석의 결과를 나타내는 도면이다. 레인 좌측의 숫자는 분자량 마커의 분자량 (단위 : KDa) 을 나타낸다.
도 3 은 유전자 도입 Hela 세포 배양 상등액을 시료로 한 웨스턴 블롯 해석의 결과를 나타내는 도면이다. 레인 우측의 숫자는 분자량 마커의 분자량 (단위 : KDa) 을 나타낸다.
도 4 는 재조합 아데노 바이러스를 감염시킨 KK/San 마우스의 말초혈중의 중성 지방농도 측정결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는 KK 마우스 및 재조합 아데노 바이러스를 감염시킨 KK/San 마우스의 간 유래의 시료에 대한 노던 블롯 해석의 결과를 나타내는 도면이다. 레인 좌측의 숫자는 마커 RNA 의 침강계수를 나타낸다.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하겠지만, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다. 그리고, 하기 실시예에서 유전자조작에 관한 각 조작은 특별한 명시가 없는 한,「모레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」[Sambrook, J., Fritsch, E.F. 및 Maniatis, T. 저술, Cold Spring Harbor Laboratory Press 에서 1989 년 발간] 에 기재된 방법에 따라 수행하거나,또는 시판중인 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 사용하였다.
참고예 1. cDNA 의 클로닝
마우스 간을 재료로 하여 다음과 같은 방법에 따라 서열목록의 서열번호 1 로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 cDNA 를 취득한다.
a) 마우스 간으로부터의 mRNA 의 추출
생후 9주 된 KK 마우스 (수컷, 하마마쯔 의과대학 부속 동물실험시설에서 입수) 2 마리를 해부하여 간을 적출후, 신속하게 액체질소 중에 넣어 급속동결시킨다. 이 중량을 측정하여 3.1 g 을 유발상에서 액체질소 존재하에 분쇄한다. 5.5 M 구아니딘티오시아네이트 (이하 GT) 완충액 (5.5 M 구아니딘티오시아네이트, 25 mM 시트르산나트륨 (pH 7.0), 0.5 % 살코실, 0.2 M β-메르캅토에탄올) (30 ㎖) 을 첨가하여 유봉으로 파쇄하고, 새로 GT 완충액 (10 ㎖) 을 첨가하여 유봉으로 파쇄후, 용해액을 회수한다. 또한, GT 완충액 (20 ㎖) 으로 유발을 세정하고 이 용액도 회수한다. 36 ㎖ 의 회수액을 3000 rpm, 10 ℃ 에서 10 분간 원심후, 상등액을 새로운 튜브에 옮기고, 각각 18 게이지의 주사침으로 20 회 흡입배출을 반복한다. 이어서 세슘ㆍ트리플루오로아세트산 (CsTFA) 을 사용한 밀도구배원심에 의해 모든 RNA 를 분리한다. CsTFA 원액 (19 ㎖) 을 리보뉴클레아제 비함유 재증류수 (18.924 ㎖) 로 희석하고, 이 희석액 (6.18 ㎖) 을 6개의 13PA (베크만 제조) 튜브에 넣고, 앞서 회수한 샘플 (1 튜브 당 5.2 ㎖) 을 중층한다. 이것을 스윙 로터 (히타치고오키 (주) 사 제조 P40ST) 를 사용하여 초원심기 (히타치SCP70H 형) 로 30000 rpm (약 125000 g), 20 ℃ 에서 20.5 시간 원심한 후, 상등액을 제거하여 얻어진 펠릿을 mRNA 정제 키트 (아머샴 파마시아사 제조 퀵 프렙 mRNA 정제키트) 가 첨부된 추출완충액 3.3 ㎖ 에 현탁한다. mRNA 의 정제는 이 정제키트를 첨부 프로토콜에 따라 사용함으로써 수행한다. 이 같이 하여 얻어진 5 ㎍ 의 mRNA 를 주형으로 하고, cDNA 라이브러리 제작 키트 (스트라타진사 제조 ZAP 익스프레스 cDNA 기가팩 III 골드 클로닝 키트) 를 그 첨부 프로토콜에 따라 사용함으로써 λ파지 cDNA 라이브러리를 제작한다.
b) cDNA 라이브러리의 1차 스크리닝
상기 a) 에 기재된 방법으로 얻어진 λ파지 cDNA 라이브러리를 감염시킨 대장균을 직경 9 ㎝ 의 배양 샬레에 만들어 놓은 한천배지 플레이트 (NZY 배지 : 0.5 % 염화나트륨, 0.2 % 황산마그네슘 7 수화물, 0.5 % 이스트 익스트락트, 1 % 카세인 가수분해물, 1.5 % 한천) 에 플레이트 1장 당 1.8 × 105개의 프라크가 형성되도록 분산시켜 37 ℃ 에서 8 시간 배양한다. 이 프라크가 형성된 한천배지의 14 개소에 대해 250 ㎕ 용 넓은 직경의 피펫칩 (RAININ 사 제조) 의 바닥부를 사용하여 한천배지를 프라크 채로 발취하고, 그들 한천배지편을 각각 100 ㎕ 의 SM 완충액 (0.1M 염화나트륨, 8 mM 황산마그네슘, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.5), 0.01 % 젤라틴) 이 들어 있는 플라스틱 원심관에 넣고, 볼텍스 믹서를 사용하여 격렬하게 혼탁시킨 다음 4 ℃ 에서 1 내지 2 시간 방치한 후, 12000 ×g 으로 5 분간 원심분리하여 상등액을 회수하고 파지 현탁액으로 하였다.
한편, PCR 에 사용하는 프라이머로서 하기 뉴클레오티드 서열 : 프라이머 1 : 5'-gactgatcaa atatgttgag ctt-3' (서열목록의 서열번호 5) ; 및 프라이머 2 : 5'-tgcatccaga gtggatccag a-3' (서열목록의 서열번호 6) 를 갖는 올리고뉴클레오티드를 자동 DNA 합성기 (모델 394 : (주) 퍼킨엘머 저팬 어프라이드 바이오시스템즈 사업부 제조) 를 사용하여 포스포아미다이트법 (Matteucci, M.D., and Caruthers, M.H. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191) 에 따라 합성하였다.
상기와 같이 하여 얻어진 파지 현탁액 5 ㎕ 를 2.5 ㎕ 의 10 ×PCR용 완충액 (타카라슈조 (주) 사 제조의 Taq 폴리멜라제에 첨부), 4 ㎕ 의 dNTP 혼합액 (각 2.5 mM, 타카라슈조 (주) 사 제조의 Taq 폴리멜라제에 첨부), 각 1 ㎕ 의 각 7.5 μM 로 조정한 상기 프라이머 1 및 2, 0.25 ㎕ 의 Taq 폴리멜라제 (타카라슈조 (주) 사 제조), 11.25 ㎕ 의 멸균수와 혼화하고, 먼저 94 ℃ 에서 5 분간 가열한 후, 계속하여 94 ℃ 에서 30 초, 55 ℃ 에서 30 초, 72 ℃ 에서 30 초의 온도사이클을 30 회 반복하고, 마지막으로 72 ℃ 에서 7 분간 보온한 다음 4 ℃ 로 보존한다. 반응물은 4 % 의 아가로스겔 (NuSieve 3 : 1 아가로스 (FMC 바이오 프로덕츠사 제조) 로 조제한다) 로 전기영동하여 특이적 단편의 증폭을 해석한다. 이 같이 하여 14 의 파지 현탁액을 스크리닝한 결과, 목적으로 하는 cDNA 단편이 특이적으로 증폭되는 2개의 양성 샘플을 얻었다.
c) 2차 스크리닝
마우스 게놈 DNA (클론테크사 제조) 100 ng 를 주형으로 하여 상기 b) 에 기재된 조건으로 PCR 을 수행하고, 아가로스 전기영동을 수행하여 증폭된 DNA 단편을회수한다. 이 DNA 단편을 주형으로 하여 멀티프라임 DNA 라벨링 시스템 (아머샴 파마시아사 제조) 을 이용하여32P 로 표지된 DNA 단편을 생성하는 반응을 수행한 후, 반응액을 닉 칼럼 (아머샴 파마시아사 제조) 에 주입한다. 이 칼럼에 400 ㎕ 의 TE (10 mM 트리스염산 (pH 7.5), 1 mM EDTA) 를 흐르게 하여 1회 세정하고, 추가로 400 ㎕ 의 TE 를 흐르게 하여 용출액을 회수한다. 이 용출 획분 전량을 이하의 2차 스크리닝에 표지 프로브로서 사용한다.
한편, 상기 b) 에서 양성으로 판정된 파지 현탁액을 SM 완충액으로 100 배 희석하고, 그 중 2 ㎕ 분의 파지를 감염시킨 대장균을 직경 9 ㎝ 의 배양 샬레에 만들어 놓은 한천배지 플레이트에 분산시켜 37 ℃ 에서 8 시간 배양한다. 이 프라크 형성된 한천배지 위에 샬레 내경에 맞춘 원형의 나일론 멤브레인 (아머샴 파마시아사 제조, 하이본드 N＋) 을 얹고 4 ℃ 에서 5 분간 방치함으로써 프라크를 옮겨놓는다. 18 G 의 주사바늘을 사용하여 멤브레인의 3군데를 한천배지까지 관통함으로써 위치정렬용 안표를 한 후, 멤브레인을 벗겨 알칼리 용액 (1.5M 염화나트륨, 0.5M 수산화나트륨) 에 2 분간, 이어서 중화용액 (1.5M 염화나트륨, 0.5M 트리스염산 (pH 8.0)) 에 5 분간, 다시 2 ×SSC, 0.2M 트리스 염산 (pH 7.5) 을 함유하는 용액에 30 초 동안 담근 후, 실온에서 완전히 자연건조시킨다.
이 멤브레인을 20 ㎖ 의 하이브리다이제이션 용액 (ExpressHyb Hybridization Solution, 클론테크사 제조) 중에서 68 ℃, 1 시간 인큐베이션 (프리하이브리다이제이션) 한 후, 표지 프로브를 함유하는 8 ㎖ 의 하이브리다이제이션 용액으로 교환하여 68 ℃, 6 시간 인큐베이션한다. 이어서 이 멤브레인을 2 ×SSC, 0.05 % SDS 를 함유하는 용액에서, 실온하, 15 분간 완만하게 진탕하면서 세정하는 조작을 3회 반복한 후, 다시 0.1 ×SSC, 0.1 % SDS 를 함유하는 용액으로 50 ℃, 30 분 동안 세정하는 조작을 3 회 반복한다.
세정후의 멤브레인에 대해 오토라디오그래피를 수행하고, 양성으로 판명된 위치의 본래의 프라크를 한천배지로부터 회수하여, 그 파지 현탁액에 대해 상기 b) 에 기재한 조건으로 PCR 을 실시한 결과, 양성 프라크 시료 10 개중 6 개에서 DNA 단편의 특이적 증폭이 관찰되었다.
이 중 가장 강하게 증폭이 관찰된 시료의 파지 현탁액에 대해 ZAP 익스프레스 cDNA 기가 팩 III 골드 클로닝 키트 (스트라타진사 제조) 에 첨부된 헬퍼 파지 및 숙주균을 사용하여 이 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 인 비보 절단 (In Vivo Excision) 을 수행하고, 한천배지 위에 파지미드를 포함하는 대장균 콜로니를 형성시킨다. 이들 콜로니를 단리하여 각각 파지미드를 추출하고, 상기 b) 에 기재된 방법으로 PCR 을 실시한 결과, DNA 단편의 특이적 증폭이 관찰된 콜로니를 선택하여 배양하고, 1.6 kbp 의 cDNA 인서트를 갖는 파지미드 #55-1 을 보유하는 형질전환 대장균 E. coli pBK/m 55-1 SANK 72199 를 단리한다.
얻어진 파지미드 #55-1 에 삽입되어 있는 cDNA 의 전체 뉴클레오티드 서열을 (주) 퍼킨엘머 저팬 어프라이드 바이오시스템즈 사업부 제조 ABI 프리즘 377 DNA 시퀀서, 또는 3700 DNA 시퀀서를 사용하여 해석한 결과, 서열목록의 서열번호 1 로 표시되는 서열인 것이 판명되었다 (단 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 1-8 은 벡터 유래의 어댑터 서열이다). 이 서열은 GenBank 데이터베이스에 마우스 안지오포이에틴 관련 단백질 3 으로서 등록되어 있는 서열 (등록번호 : AF162224) 과 동일하였다. 그리고, 이 파지미드 #55-1 을 보유하는 형질전환 대장균 E. coli pBK/m 55-1 SANK 72199 는 1999 (평성 11 년) 년 11 월 19 일자로 일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1 쪼메 1 방 3 고의 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 국제기탁되어 수탁번호 FERM BP-6940 이 붙여졌다.
실시예 1. 노던 블롯 해석
a) 마우스 장기로부터의 모든 RNA 의 추출
참고예 1 에서 얻어진 cDNA 가 발현하고 있는 조직을 조사할 목적으로 노던 블롯 해석을 실시하였다. 먼저, KK 마우스 (고지혈증 마우스) 및 KK/San 마우스 (저지혈증 변이 마우스. 시라키 등, 제 7 회 당뇨병 동물연구회 (1993 년)) 의 정소 (testis), 비장 (spleen), 신장 (kidney), 소장 (small intestine), 간 (liver) 및 뇌 (brain) 로부터 모든 RNA 를 추출한다. 생후 18 주 된 KK 마우스 및 KK/San 마우스를 해부하여 각각의 장기를 적출한 후, 신속하게 액체질소내에 넣고 급속동결시킨 후 －18 ℃ 로 보존한다. 장기 0.5 g 에 대해 약 15 ㎖ 의 TRIzol 시약 (기브코 BRL 사 제조) 을 첨가하고, 초고속 호모지나이저 폴리트론 (키네마티커사 제조) 을 사용하여 빙상에서 호모지나이즈를 수행한다 (눈금 6 에서 2 분간). 이것을 실온에서 5 분간 정치한 후, 3 ㎖ 의 클로로포름을 첨가하고, 손으로 15 초 동안 격렬하게 전도혼화하였다. 다시 실온에서 3 분간 정치한 다음 12000 ×g, 4 ℃ 에서 15 분간 원심분리하였다. 원심후, 상층을 회수하고,0.8 용량의 리보뉴클레아제 비함유 이소프로필 알코올을 첨가하여 혼화하였다. 이것을 실온에서 10 분간 정치후, 12000 ×g, 4 ℃ 에서 10 분간 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 리보뉴클레아제 비함유 70 % 에탄올을 첨가한다. 이것을 12000 ×g, 4 ℃ 에서 10 분간 원심분리하고, 상등액을 제거하여 침전을 건조시킨 다음, －80 ℃ 로 보존한다.
b) 모든 RNA 의 전기영동 및 블롯팅
회수한 각 장기의 모든 RNA 를 리보뉴클레아제 비함유 재증류수로 4 ㎍/㎕ 로 조정한 후, 이 RNA 액 5 ㎕ 와 RNA 시약 완충액 (1.15 ×MOPS 완충액 (1 ×MOPS 완충액은 20 mM MOPS, 5 mM 아세트산나트륨, 1 mM 에틸렌디아민 4아세트산 (이하「EDTA」라고 함) 을 함유), 2.4M 포름알데히드, 57 % 포름아미드, 7 % 글리세롤, 18 ㎍/㎖ 브로모페놀 블루, 18 ㎍/㎖ 자일렌시아놀 0.18 mM EDTA) 16 ㎕ 를 혼합하고, 65 ℃ 에서 10 분간 보온한 후, 얼음위에서 5 분간 방치한다. 이 시료액 전량을 1.17 % 포르말린을 함유하는 전기영동용 아가로스겔 (1 ×MOPS 완충액, 1.17 % 아가로스겔 (고강도, 분석용, 바이오래드사 제조), 0.66M 포름알데히드) 의 하나의 웰에 주입하여 전기영동한다. 전기영동은 500 ng/㎖ 브롬화 에티듐이 들어 있는 1 ×MOPS 완충액이 들어 있는 서브마린 전기영동조 안에서, 50 V 에서 약 1 시간 통전한 후, 다시 100 V 에서 약 1.5 시간 통전함으로써 수행하였다. 전기영동 종류후, 아가로스겔 중의 RNA 를 캐필러리 트랜스퍼법 (Maniatis, T. et al. (1982) in “Molecular Cloning A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory, NY) 에 따라 나일론 멤브레인 (하이본드 N＋, 아머샴파마시아사 제조) 에 하룻밤에 걸쳐 전사하였다 (전사용 용액은 20 ×SSC 를 사용하였다). 이 멤브레인을 2 ×SSC 로 5 분간 세정하고, 자연건조시키고 크로스링크용 자외선 조사장치 (스펙트로링커 XL 1000, 토미 세이꼬 (주) 사 제조) 로 자외선을 조사 (1200 J/㎠) 하여 RNA 를 고정한다.
c) 프로브의 제조
참고예 1 의 b) 에서 합성한 프라이머를 사용하여 서멀 사이클러 (진 앰프 PCR 시스템 9600, (주) 퍼킨엘머 저팬 어프라이드 바이오시스템즈 사업부 제조) 를 사용하여 이하의 조건으로 PCR 을 수행한다. 먼저, 프라이머 (최종농도 0.5 μM) 와 트윈 20 (시그마사 제조, 최종농도 0.1 %) 에 멸균수를 첨가하여 7.5 ㎕ 로 한 후, 2 ×PCR 솔루션 프리믹스 Taq (타카라슈조 (주) 사 제조 : 0.05 단위/㎕ Taq 폴리멜라제, 0.4 mM dNTPs, 20 mM 트리스염산 (pH 8.3), 100 mM 염화칼륨, 3 mM 염화마그네슘을 함유) 을 7.5 ㎕ 첨가한다. 또한 마우스 게놈 DNA (클론테크사 제조) 를 1 ㎕ (100 ng 상당) 첨가하고, 반응액을 조제한다. 이 반응액을 먼저 94 ℃ 에서 3 분간 가열한 후, 94 ℃ 에서 30 초, 55 ℃ 에서 1 분, 72 ℃ 에서 45 초의 온도사이클을 35 회 반복한 다음, 4 ℃ 에서 보온한다.
이 PCR 후의 반응액 1 ㎕ 을 취하고, TA 클로닝 키트 (듀얼 프로모터 버전 A, 인비트로젠사 제조) 를 첨부의 프로토콜에 따라 사용하여 증폭된 DNA 단편을 플라스미드 벡터에 클로닝하였다. 이 재조합 플라스미드 벡터로 형질 전환용 대장균(competent cell)을 형질전환시켜 50 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 LB 한천배지 위에서 배양하였다. 그 결과 암피실린 내성을 나타내며 생육된 대장균 콜로니를 선택하여 4 ㎖ 의 50 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 액체 LB 배지에서 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 이 중, 3.5 ㎖ 의 배양액으로부터 플라스미드 자동추출장치 (PI-50, 크라보사 제조) 를 사용하여 플라스미드 DNA 를 회수한다. 얻어진 플라스미드 DNA 에 대해 뉴클레오티드 서열해석을 수행하여 목적으로 하는 PCR 산물이 삽입되어 있던 플라스미드를 이하의 조작에 사용하였다.
선택된 플라스미드 DNA 8 ㎍ 을 제한효소 EcoRI 로 소화시킨 후, 페놀/클로로포름 추출, 에탄올 침전을 행하고, 얻어진 침전을 멸균수 10 ㎕ 에 용해한다. 이 용액에 색소액 (0.25 % 브로모페놀 블루, 0.25 % 자일렌시아놀, 15 % 피콜 (타입 400)) 을 2 ㎕ 첨가하여 전량을 폴리아크릴아미드겔 전기영동 (겔농도 8 %, 100 V, 실온, 3 시간) 하였다. 전기영동후의 겔을 브롬화 에티듐으로 염색한 후, 자외선 조사하에서 목적으로 하는 DNA 에 상당하는 밴드 (약 200 bp, 서열목록의 서열번호 11) 부분의 겔편을 면도날로 절취하고, 미량 원심 튜브에 옮겨 분쇄하였다. 이것에 300 ㎕ 의 용출완충액 (0.5M 아세트산암모늄, 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.1 % SDS) 을 첨가하여 37 ℃ 에서 하룻밤 보온한 후, 페놀/클로로포름 추출을 2 회, 에탄올 침전을 1 회 수행하고 침전을 멸균수 20 ㎕ 에 용해하였다.
얻어진 DNA 용액 5 ㎕ 에 대해 참고예 1 의 c) 에 기재된 방법으로32P 로 표지된 프로브 (400 ㎕) 를 조제한다.
d) 하이브리다이제이션
상기 b) 에서 작성한 멤브레인을 20 ㎖ 의 하이브리다이제이션 용액(ExpressHyb Hybridization Solution, 클론테크사 제조) 안에 넣어 68 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션 (프리하이브리다이제이션) 한 후,32P 표지 프로브를 함유하는 20 ㎖ 의 하이브리다이제이션 용액 중에서 68 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션한다. 그 후, 멤브레인을 2 ×SSC, 0.05 % SDS 를 함유하는 용액 중, 실온에서 20 분간, 3 회 세정하고, 다시 0.1 ×SSC, 0.1 % SDS 를 함유하는 용액 중, 50 ℃ 에서 20 분간, 3 회 세정한 다음, 오토라디오그래피를 수행한다.
그 결과, 검출한 유전자의 발현은 간에서만 관찰되고, 또한 그 발현량은 KK 마우스 (고지혈증 마우스) 보다 KK/San 마우스 (저지혈증 마우스) 에서 현저히 저하됨을 알 수 있었다 (도 1).
상기 실험계에 있어서, 예컨대 피검물질 존재하 또는 비존재하에서 배양한 KK 마우스 초대 배양 간세포로부터 RNA 시료를 조제하고, 이하 동일한 조작을 함으로써 피검물질의 고지혈증의 치료 또는 예방제로서의 효과를 조사할 수 있다. 이 실험에서 검출되는 유전자의 발현자를 저하시키는 피검물질은 고지혈증의 치료 또는 예방제가 될 수 있다. 다검체 치리를 하는 경우에는 전기영동을 생략하여 도트 블롯이나 슬롯 블롯을 수행할 수도 있다.
참고예 2. 인간 cDNA 의 클로닝
1) 프로브의 조제
서열목록의 서열번호 1 로 표시되는 마우스 cDNA 에 대응하는 인간 cDNA 를 취득하기 위해, 하기의 뉴클레오티드 서열 ;
5'-tcctctagtt atttcctcca g-3' (서열목록의 서열번호 7) ; 및
5'-tggtttgcca gcgatagatc-3' (서열목록의 서열번호 8)
을 갖는 올리고뉴클레오디드 프라이머를 합성하였다.
이어서, 인간 게놈 DNA (베링거 만하임사 제조, 200 ㎎/㎖) 1 ㎕, Taq 폴리멜라제 (rTaq, 타카라슈조 (주) 사 제조 : 5 단위/㎕) 1 ㎕, 10 ×PCR용 완충액 (타카라슈조 (주) 사 제조) 10 ㎕, dNTP 혼합액 (각 2.5 mM) 16 ㎕, 20 μM 의 프라이머 각 2 ㎕, 및 멸균수 68 ㎕ 를 혼합한다. 이 반응액을 94 ℃ 에서 5 분간 가열한 후, 이어서 94 ℃ 에서 30 초, 55 ℃ 에서 30 초, 72 ℃ 에서 30 초의 온도사이클을 30 회 반복하고, 마지막으로 72 ℃ 에서 10 분간 보온한 다음, 4 ℃ 로 보존한다. 이 반응액을 2 % 아가로스겔로 전기영동한 후, 증폭된 DNA 밴드부분의 겔을 절단하여 정제한다. 이 같이 하여 얻어진 DNA 를 DNA 표지 키트 (BcaBest 라벨링 키트, 타카라슈조 (주) 사 제조) 를 사용하여32P 로 표지한 것을 하기 2) 에서 프로브로서 사용한다.
2) cDNA 라이브러리의 1차 스크리닝
시판중인 인간 간 유래 cDNA 라이브러리 (Human Liver 5'-STRETCH cDNA Library, 클론테크사 제조) 중, 1 ×106프라크의 DNA 를 나일론 멤브레인에 고정한다. 즉, cDNA 라이브러리를 감염시킨 대장균을 직경 9 ㎝ 의 배양 샬레에 만들어 놓은 한천배지 플레이트 20 장에, 1 장 당 5 ×104개의 프라크가 형성되도록 분산시켜 37 ℃ 에서 8 시간 배양하였다. 이 프라크가 형성된 한천배지 위에 샬레 내경에 맞춘 원형의 나일론 멤브레인 (아머샴 파마시아사 제조, 하이본드 N＋) 을 얹고, 4 ℃ 에서 5 분간 방치함으로써 프라크를 옮겨놓는다. 18G 의 주사바늘을 사용하여 멤브레인의 3군데를 한천배지까지 관통함으로써 위치정렬용 안표를 한 후, 멤브레인을 벗겨 알칼리 용액 (1.5M 염화나트륨, 0.5M 수산화나트륨) 에 2 분간, 이어서 중화용액 (1.5M 염화나트륨, 0.5M 트리스염산 (pH 8.0)) 에 5 분간, 다시 2 ×SSC, 0.2M 트리스 염산 (pH 7.5) 을 함유하는 용액에 30 초 동안 담근 후, 실온에서 완전히 자연건조시킨다. 이어서, 크로스링크용 자외선 조사장치 (스펙트로링커 XL-1000, 토미 세이꼬 (주) 사 제조) 로 자외선을 조사 (1200 J/㎠) 하여 DNA 를 고정한다.
이 같이 하여 조제된 멤브레인을 상기 1) 에서 얻어진 표지 프로브를 함유하는 하이브리다이제이션 용액 (ExpressHyb solution, 클론테크사 제조) 중에서 65 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션한다. 그 후, 멤브레인을 2 ×SSC, 0.05 % SDS 를 함유하는 용액으로 15 분씩 3 회, 실온에서 세정한 다음, 다시 0.1 ×SSC, 0.1 % SDS 를 함유하는 용액으로 30 분씩 3 회, 50 ℃ 에서 세정한 후, 오토라디오그래피를 수행한다.
그 결과 판명된 양성의 시그널의 위치에 있던 프라크를 상기 한천배지 플레이트로부터 배지 채로 채취하고, 각각 100 ㎕ 의 SM 완충액 (0.1M 염화나트륨, 8 mM 황산마그네슘, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.5), 0.01 % 젤라틴) 중에 넣어 잘 현탁한 다음 4 ℃ 에서 2 시간 방치한 후, 12000 ×g 으로 5 분간 원심분리하여 상등액을 회수한다.
이 같이 하여 얻어진 1차 양성 파지액을 다시 대장균에 감염시킨 것을 직경 9 ㎝ 의 배양용 샬레에 제작한 한천배지 위에, 샬레 1 장 당 500 개의 프라크가 형성되도록 배양하고, 상기 수법을 반복함으로써 2차 스크리닝을 수행한다. 얻어진 2차 양성 클론 파지를 대장균주 BM 25.8 (클론테크사 제조) 에 감염시킨 것을 한천배지 위에서 37 ℃ 에서 배양하여 파지미드를 함유하는 대장균 콜로니를 형성시킨다. 콜로니를 단리하고, 액체배지에서 소량 배양하여 파지미드를 추출하고, 제한효소 소화에 의한 삽입단편을 해석한 결과, 1.6 kbp 의 삽입단편을 갖는 클론 #h5-1 을 갖는 대장균 E.Coli pTrip/h55-1 SANK 72299 를 단리하였다. 이 클론의 삽입단편의 뉴클레오티드 서열을 해석한 결과, GenBank 에 인간 안지오포이에틴 관련 단백질 3 으로 등록되어 있는 cDNA 서열 (등록번호 : AF152562) 과 일치하였다 (서열목록의 서열번호 3. 단, 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 1-14 는 벡터 유래의 어댑터 서열이다). 그리고, 이 파지미드 #h5-1 을 보유하는 형질전환 대장균 E. coli pTrip/h55-1 SANK 72299 는 1999 년 11 월 19 일자로 일본국 이바라끼껭 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 방 3 고의 공업기술원 생명공학기술연구소에 국제 기탁되어 수탁번호 FERM BP-6941 이 붙여졌다.
실시예 2. 폴리클로날 항체의 제작
서열목록의 서열번호 1 및 서열번호 3 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 코드되는 아미노산 서열, 즉 서열목록의 서열번호 2 및 서열목록의 서열번호 4 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 모두 인식하는 항체를 제작할 목적으로 항원으로서 그들 마우스 및 인간의 폴리펩티드 사이에서 보존되어 있는 영역으로부터 선택된 2 종류의 아미노산 서열 :
Glu-Pro-Lys-Ser-Arg-Phe-Ala-Met-Leu-Asp-Asp-Val-Lys-Cys (55-1-N1, 서열목록의 서열번호 9) ; 및
Cys-Gly-Glu-Asn-Asn-Leu-Asn-Gly-Lys-Tyr-Asn-Lys-Pro-Arg (55-1-C1, 서열목록의 서열번호 10)
를 갖는 펩티드를 화학합성법으로 합성하였다 (사용기기 : 퍼킨엘머 저팬사 제조 모델 433). 단, 55-1-N1 의 아미노산 서열은 후에 담체로서 키홀 림페트 헤모시아닌 (이하「KLH」라고 함) 을 결합시키기 위해, 본래의 아미노산 서열의 C 말단에 시스테인 잔기가 부가된 것이다. 한편, 55-1-C1 에서 KLH 가 결합되는 N 말단의 시스테인은 본래의 아미노산 서열 유래의 것이다.
이어서, 합성 펩티드 55-1-N1 11.1 ㎎ 및 KLH 21.5 ㎎, 또는 55-1-C1 10.2 ㎎ 과 KLH 21.2 ㎎ 을 각각 N-(6-말레이미드카프로일옥시)숙시니미드 (EMCS, 도오닝카가꾸켕큐쇼 (주) 사 제조) 시약을 사용하여 축합시킨다 (축합반응용매로서 8M 요소 및 0.9 % 염화나트륨을 함유하는 0.02M 인산 완충액 (pH 7.5) 을 사용하여 실온에서 15 시간 보온한다). 이 반응액을 8M 요소 용액 중에 넣은 후, 흐르는 물에 대해 투석하고, 다시 순수에 대해 투석한 다음 동결건조시켜 KLH 가 결합한 펩티드 항원을 얻는다. 이들 펩티드가 항원 약 10 ㎎ 에 1 ㎖ 의 생리식염수를 첨가하고, 초음파발진기 (소니케이터), 볼텍스 믹서, 유리봉 등을 사용하여 미세한 현탁액으로 하였다. 그 후, 생리적 식염수로 전량을 각 7.5 ㎖ 로 하고, 다시 1 ㎖ 씩 바이알에 작게 나누어 동결보존한다.
면역시에는 상기 바이알 1개분의 항원용액을 융해하고, 동량의 아쥬번트와 혼합하여 각각 토끼 2마리의 등에 피하, 또는 피내에 주사한다. 아쥬번트는 프로인드 완전 아쥬번트를 사용하여 수행하고, 2 회째 이후의 면역에서는 프로인드의 불완전 아쥬번트를 사용하였다. 면역은 2 주 간격으로 4 회 실시하고, 2 회째의 면역 이후, 시험채혈하여 혈청중의 항체가를 고층법에 의한 효소면역측정법 (ELISA) 으로 조사한다. 96-웰 ELISA용 플레이트 (스미토모 베이크라이트 (주) 사 제조, 96-웰 H 타입) 에 각각의 항원펩티드를 코팅하고, 서양고추냉이 퍼옥시다제 표지 항토끼 IgG 항체를 2차 항체로 사용한다. 4 회째 면역으로부터 13 일후에 전체 채혈을 수행한다.
채혈후, 항체를 어피니티 칼럼을 사용하여 정제한다. 즉, N-(6-말레이미드카프로일옥시)숙시니미드 (EMCS, 도오닝카가꾸켕큐쇼 (주) 사 제조) 와 아미노알킬아가로스 (바이오래드사 제조, 어피겔 102) 를 반응시켜 활성화된 담체 EMC-아가로스 (약 5 ㎖) 에 펩티드 (55-1-Ni : 7.82 ㎎, 55-1-C1 : 8.07 ㎎) 를 축합시켰다. 미반응의 EMC 기는 0.1M 염산메르캅토에틸아민 (5 mM EDTA 를 함유) 으로 처리함으로써 불활화시켰다. 항혈청 85 ㎖ 를 PBS (0.02M 인산 완충액 (pH 7.0), 0.9 % 염화나트륨 함유) 으로 2배 희석하고, 황안 침전 (최종농도 40 %) 법에 의해 침전물을 얻고, 이 침전물을 PBS 에 용해시키고, 탈염후 PBS 로 투석하여 이 투석내액을 비정제 IgG 획분으로 하였다. 어피니티 칼럼으로는 3 회에 걸쳐 크로마토 조작하였다. 즉, 어피니티 칼럼에 비정제 IgG 획분 1/3 양을 챠지하고, 원래대로 획분을 칼럼에 재주입하는 조작을 3 회 반복한다. 원래대로의 부분 및 세정액을 합친 40 ㎖ 를 비흡착 프랙션으로서 모은다. 비특이적으로 칼럼에 결합한 것을 제거하기 위해, 1M 염화나트륨 함유 PBS 로 충분히 세정한 후, 4M 염화마그네슘 용액, 3.5M 티오시안산칼륨 용액 및 0.1M 글리신-염산 완충액 (pH 2.3) 을 순차적으로 칼럼에 흐르게 하여 칼럼 담체 위에 결합하고 있는 펩티드에 특이적으로 결합하고 있던 항체를 어피니티 정제 항체로서 용출한다. 4M 염화마그네슘 용액 및 3.5M 티오시안산 칼륨 용액의 용출액중에 목적으로 하는 항체가 함유되어 있었으므로, 각각의 용출액을 PBS 에 대해 투석한 것을 이하의 조작으로 항체로서 사용하였다.
실시예 3. COS-1 세포에서의 발현 및 웨스턴 블롯 해석
참고예 2 에서 얻어진 #h5-1 파지미드 DNA 를 제한효소 EcoRI 와 XbaI 로 소화하고, 8 % 폴리아크릴아미드겔 전기영동을 수행하여 실시예 1 의 c) 에 기재된 방법으로 cDNA 를 함유하는 약 1.6 kb 의 단편을 단리, 정제하였다. 한편, 고발현 벡터 pME18S (Hara, T. et al. (1992) EMBO. J. 11, 1875-, 요꼬타 타카시, 아라이 켕이찌 편집, 바이오 매뉴얼 시리즈 3, 유전자 클로닝 실험법, 요도사, p18-20) 를 동일하게 EcoRI 와 XbaI 에서 소화시키고, 말단을 탈인산화한 후, 상기 cDNA 단편과 DNA 라이게이션 키트 (버젼 2, 타카라슈조 (주) 사 제조) 를 사용하여 연결하였다. 이 DNA 로 대장균을 형질전환하고, 얻어진 형질전환주에 대해 그것이 보유하는 플라스미드 DNA 의 제한효소에 의해 해석하고, 1.6 kb 의 DNA 단편을 갖는 주를 선택하여 pMEh55-1 로 명명하였다.
이어서, pMEh55-1 을 보유하는 형질전환 대장균을 50 ㎍/㎖ 의 암피실린을함유하는 100 ㎖ 의 액체 LB 배지중에서, 37 ℃ 에서 하룻밤 배양한다. 이 배양액으로부터 플라스미드 정제 키트 (위저드 퓨어펙션 플라스미드 DNA 정제 시스템, 프로메가사 제조) 를 사용하여 pMEh55-1 DNA 를 회수하여 염화세슘법으로 정제한다.
이 같이 하여 얻어진 플라스미드 pMEh55-1 에서 COS-1 세포를 트랜스펙션한다. COS-1 세포로의 트랜스펙션은 (주) 시마즈세이사꾸쇼 제조의 유전자 도입장치 GTE-1 을 사용하여 전기천공법으로 수행한다. 즉, 먼저 COS-1 세포를 세미컨플루언트로 될 때까지 증식시킨 플라스크로부터, 트립신 EDTA 처리에 의해 세포를 회수하고, PBS(－) 완충액 (타카라슈조 (주) 사 제조) 으로 세정한다. 이어서 그 세포를 PBS(－) 완충액으로 6 ×107세포/㎖ 에 현탁한다. 상기 방법으로 회수한 플라스미드 DNA (pMEh55-1) 을 PBS(－) 완충액으로 200 ㎍/㎖ 로 조제한다. 세포현탁액과 DNA 용액을 20 ㎕ 씩 혼합하고, 이것을 전극간격 2 ㎜ 의 챔버에 넣고, 600 V-30 μsec 의 펄스를 1 초 간격으로 2 회 부여한다. 그 챔버를 4 ℃ 에서 5 분간 냉각한 후, 안의 세포-DNA 혼합액을 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 10 ㎖ 에 첨가하고, 샬레로 옮겨 37 ℃, 5 % CO2하에서 하룻밤 배양한다. 그 후, 배양 상등액을 제거하고, 무혈청배지 (DMEM) 에서 세포를 세정하고, DMEM 10 ㎖ 를 첨가하여 3 일간 배양한다.
이 같이 하여 얻어진 세포배양물로부터 배양 상등액을 회수한다. cDNA 를 함유하지 않는 네거티브 컨트롤 플라스미드 pME18S 또는 pMEh 55-1 로 트랜스펙트하여 얻은 COS-1 세포의 무혈청 배양 상등액 0.3 ㎖ 를 각각 트리클로로아세트산 (이하「TCA」라고 함) 처리하여 단백질을 침전시키고, 원심분리에 의해 침전을 얻는다. 이 침전을 빙랭한 아세톤으로 세정하고, 자연건조후, SDS-폴리아크릴아미드 전기영동 (SDS-PAGE) 용의 2-메르캅토에탄올을 함유하는 샘플 완충액 (바이오래드사 제조) 에 용해하고, 4-20% 폴리아크릴아미드 밀도 구배 겔 (멀티 겔 4/20, 다이이찌카가꾸야쿠힝 (주) 사 제조) 을 사용하여 환원조건하에서 SDS-PAGE 를 수행한다.
전기영동후, 폴리아크릴아미드겔로부터 밴드를 전사완충액 (192 mM 글리신, 20 % 메탄올, 25 mM 트리스) 중에서 겔 멤브레인 전사장치 (마리솔사 제조, NP7513) 를 사용하여 4 ℃, 90 분, 200 ㎃ 의 조건으로 니트로셀룰로스 멤브레인 (바이오래드사 제조) 에 전사하였다.
전사후의 니트로셀룰로스 멤브레인에 대해 실시예 2 에서 얻어진 항체 (이하「55-1-N1 항체」또는「55-1-C1 항체」라고 함) 를 사용한 웨스턴 블롯 해석을 수행한다. 즉, 먼저 니트로셀룰로스 멤브레인을 0.05 % 의 트윈 20 을 함유하는 PBS (이하「0.05 % Tween 20-PBS」라고 함) 로 세정한 (실온에서 15 분 동안 1 회, 이어서 5 분 동안 2 회) 후, 플라스틱 백 (상품명 하이브리 백, 코스모바이오 (주) 사 제조) 에 넣고, 5 % 스킴밀크 (유키지루시뉴교 (주) 사 제조) 를 함유하는 0.05 % Tween20-PBS 를 20 ㎖ 첨가하고, 실온에서 1 시간 진탕한다. 1 시간후, 멤브레인을 꺼내어 0.05 % Tween20-PBS 중에서 15 분간 ×1 회, 이어서 5 분간 ×2 회 세정한다. 세정후, 멤브레인을 새로운 플라스틱 백에 옮기고, 55-1-N1 항체 또는 55-1-C1 항체 (100 배 희석), 1 % 소 혈청 알부민 (이하「BSA」라고 함. 시그마사 제조) 을 함유하는 0.05 % Tween20-PBS 를 20 ㎖ 첨가하여 실온에서 1 시간 진탕한다. 1 시간 후, 멤브레인을 꺼내어 0.05 % Tween 20-PBS 용액으로 15 분간 ×1 회, 5 분간 × 2 회 세정하였다. 그 후, 멤브레인을 새로운 플라스틱 백에 옮기고, 서양고추냉이 퍼옥시다제 표지 항토끼 IgG 항체 (아머샴 파마시아사 제조) 를 1 % BSA 를 함유하는 0.05 % Tween20-PBS 로 2000 배로 희석한 용액 20 ㎖ 를 넣고, 실온에서1 시간 진탕한다. 1 시간후, 멤브레인을 꺼내어 0.05 % Tween 20-PBS 에서 15 분간 ×1 회, 이어서 5 분간 ×4 회 세정한다. 세정후, 멤브레인을 랩 필름 위에 놓고 ECL 웨스턴 블롯팅 검출용액 (아머샴 파마시아사 제조) 을 사용하여 55-1-N1 항체 또는 55-1-C1 항체가 결합하는 밴드의 검출을 수행한다 (멤브레인을 랩 필름 위에 놓고, ECL 웨스턴 블롯팅 검출용액에 1 분간 담근 후, 1 시간 실온에서 방치하여 백그라운드를 감쇠시킨 다음, X선 필름을 감광시킨다 (3 초간)). 그 결과, 양방의 항체에 의한 pMEh55-1 플라스미드 DNA 를 도입하여 얻어진 COS-1 배양 상등액 중에 특이적인 밴드가 검출되었다 (도 2).
동일한 실험은 참고예 1 에서 얻어진 마우스 cDNA 를 발현시킨 COS-1 세포 배양 상등액에 대해서도 실시할 수 있다. 즉, 참고예 1 에서 얻어진 파지미드 #55-1 DNA 를 제한효소 EcoRI 와 XbaI 로 소화시켜 얻어지는 약 1.6 kb 의 삽입 DNA 단편을 pME18S 에 삽입하여 얻어진 클론 (pME55-1) 을 구축하고, 상기와 같은 방법으로 COS-1 세포에 도입하고, 배양 상등액을 회수한다. 이 배양 상등액으로부터 조제된 시료에 대해 55-1-N1 항체 및 55-1-C1 항체를 사용한 웨스턴 블롯해석을 수행하면, 어떠한 항체로 검출하였을 경우에도 pME55-1 플라스미드 DNA 를 도입하여 얻어진 COS-1 배양 상등액 중에 특이적인 밴드가 검출된다.
상기 실험계에서, 예컨대 피검물질 존재하 또는 비존재하에 배양한 KK 마우스 초대 배양 간세포의 배양 상등액으로부터 시료를 조제하고, 이하 동일한 조작을 수행함으로써, 피검물질의 고지혈증의 치료 또는 예방제로서의 효과를 조사할 수 있다. 이 실험에서 검출되는 항원량을 저하시키는 피검물질은 고지혈증의 치료 또는 예방제가 될 수 있다. 다검체 처리를 실시하는 경우에는 전기영동을 생략하여 도트 블롯이나 슬롯 블록 을 수행할 수도 있다.
실시예 4. 재조합 아데노 바이러스의 제작 및 배양세포에 있어서의 발현
참고예 1 에서 얻어진 마우스 유래의 cDNA 를 강제발현시키기 위해 재조합 아데노 바이러스는 시판중인 키트 (아데노 바이러스 익스프레션 벡터 키트, 타카라슈조 (주) 사 제조) 를 사용하여 제작한다. 즉, 참고예 1 에서 얻어진 파지미드 클론 #55-1 을 제한효소 ExoRI 및 NotI 로 소화시키고, 얻어진 약 1.7 kb 의 DNA 단편의 말단을 평활화한 것을 삽입 DNA 단편으로서 이하의 조작에 사용한다.
먼저, 사이트메가로 바이러스 인헨서와 닭β-액틴프로모터에 의해 발현되도록 설계되어 있는 코스미드 벡터 pAxCAwt (아데노 바이러스 익스프레션 벡터 키트에 첨부) 의 제한효소 SwaI 인식 부위에 인서트 DNA 단편을 삽입한 코스미드 pAxCA/mAP 5 를 제작한다. pAxCA/mAP5 DNA 및 말단 단백질 결합 바이러스 DNA (DNA-TPC, 아데노 바이러스 익스프레션 벡터 키트에 첨부) 를 인산칼슘 트랜스펙션 시스템 (라이프테크사 제조) 을 사용하여 293 세포 (ATCC CRL1573) 에 코 트랜스펙션하여 재조합 아데노 바이러스 Ad/mAP-5 를 단리하고, 다시 293 세포중에서 증폭시켰다. 또한, 컨트롤 코스미드 pAxCAiLacZ 으로부터 절단한 LacZ 유전자가 삽입된 재조합 아데노 바이러스 벡터를 갖는 아데노 바이러스 Ad/LacZ 을 동일하게 제작한 293 세포로 증폭시켰다. 증폭시킨 바이러스의 293 세포로부터의 회수는 먼저 바이러스 감염 293 세포에 30 초 ×4 회의 초음파처리 (브란손사 제조 B-1200 을 사용) 를 수행하고, 이어서 염화세슘 밀도 구배 원심에 의한 정제를 2 회 반복함으로써 수행하였다. 얻어진 바이러스액을, 10 % 글리세롤을 첨가한 PBS 에 대해 4 ℃ 에서 투석한 후, 사용하기까지 －70 ℃ 이하에서 동결보존한다.
이 같이 하여 얻어진 재조합 아데노 바이러스를 HeLa 세포 (ATCCCCL2) 약 5 m.o.i. (multiplicity of infection : 다중감염증) 에서 감염시키고, 무혈청 배지 (둘베코 수정 이글배지 (DMEM)) 에서 3 내지 4 일 배양한 후의 배양 상등액을 회수한다. 이 상등액 1 ㎖ 를 1.5 ㎖ 용량의 에펜돌프 튜브에 넣고, 100 ㎕ 의 트리클로로아세트산을 첨가하여 실온에서 3 분 방치한 후, 탁상원심기에 의해 15000 rpm 으로 5 분간 원심하였다. 상등액을 제거하고, 빙랭한 아세톤을 0.5 ㎖ 첨가하여 잘 교반하고, 다시 탁상원심기에 의해 15000 rpm 으로 2 분간 원심하였다. 상등액을 제거하고, 다시 빙랭한 아세톤을 0.5 ㎖ 첨가하여 잘 교반한 후, 탁상원심기에 의해 15000 rpm 으로 2 분간 원심하고 상등액을 제거한 후, 침전물을 진공건조시킨다. 이 침전물을 10 ㎕ 의 증류수에 용해시키고, 2-메르캅토에탄올을 함유하는 SDS-PAGE 시료 완충액 (바이오래드사 제조) 과 혼합한 후, 99 ℃ 에서 5 분간 가열하여 전기영동용 시료를 조제한다. 시료를 안에서 겔농도 4-20 % 의폴리아크릴아미드 밀도 구배 겔에 의해 전기영동한 (전기영동용 완충액 : 25 mM 트리스, 192 mM 글리신 0.1 % SDS) 후, 전사완충액중에서 4 ℃, 1 시간, 200 mA 의 조건으로 니트로셀룰로스 멤브레인에 전사하였다. 전사된 멤브레인은 0.5 % 스킴밀크를 첨가한 PBS 액으로 4 ℃ 에서 하룻밤 블로킹하고, 세정액 (0.05 % Tween20-PBS) 으로 3 회 세정하였다. 이어서, 멤브레인을 55-1-N1 항체의 정제전의 항혈청과 55-1-C1 항체의 정제전의 항혈청을 혼합한 것을 5 % 소 태아 혈청을 함유하는 0.05 % Tween20-PBS 로 10000 배 희석한 반응액중에 넣어 실온에서 1 시간 인큐베이션한 후, 세정액으로 3 회 세정하였다. 또한, 멤브레인을 서양고추냉이 퍼옥시다제 표지 염소항토끼 IgG (H＋L) (바이오래드사 제조) 을 5 % 소 태아 혈청을 함유하는 0.05 % Tween20-PBS 로 10000 배 희석한 반응액중에서 실온에서 1 시간 인큐베이션한 후, 세정액으로 5 회 세정하였다. 이 멤브레인을 랩 필름 위에 놓고, ECL 웨스턴 블롯팅 검출용액에 1 분간 담근 후, 1 시간 실온에서 방치하여 백그라운드를 감쇠시킨 다음, X선 필름을 감광시켰다 (3 초간). 그 결과, 재조합 아데노 바이러스 Ad/mAP-5 를 감염시킨 HeLa 세포 배양 상등액 유래의 샘플의 레인 중에 특이적인 밴드가 검출되었다 (도 3).
한편, 파지미드 클론 #h5-1 이 보유하는 cDNA 가 아데노 바이러스 벡터에 삽입된 것을 갖는 재조합 아데노 바이러스 (Ad/hAP5) 를 조제하여 동일한 실험을 하고, HeLa 세포에 발현시킨 배양 상등액의 웨스턴블롯 해석을 한 결과, 동일하게 특이적인 밴드가 검출되었다 (도 3).
실시예 5. 재조합 아데노 바이러스를 사용한 인비보에서의 발현
상기와 같이 하여 정제된 재조합 아데노 바이러스 Ad/mAP-5 또는 Ad/LacZ 을 10 % 글리세롤을 함유하는 PBS 에서 2 ×1010pfu (plaque forming unit)/㎖ 로 희석하여 각각 3 마리 (Ad/mAP-5) 또는 2 마리 (Ad/LacZ) 의 생후 13 내지 14 주 된 수컷 KK/San 마우스에 100 ㎕ (2 ×1010pfu) 씩 꼬리 정맥주사에 의해 접종하였다. 접종 1 일후에 각 마우스의 안저로부터 헤마토크리트관으로 채혈하여 탁상원심기로 5200 rpm 으로 15 분 원심하여 혈장을 분리하고, 중성 지방 측정용 키트 (트리글리세리드 E-테스트 와코, 와코세이야꾸 (주) 사 제조) 를 사용하여 중성 지방 농도를 측정하였다. Ad/LacZ 접종 마우스군에서는 혈중의 중성 지방 농도에 유의한 차이가 인정되지 않았는데 비해 Ad/mAP-5 접종 마우스군과 다른 2 군 사이에는 혈중의 중성 지방 농도에 유의한 차이가 인정되었다 (도 4).
한편, 파지미드 클론 #h5-1 이 보유하는 cDNA 가 아데노 바이러스 벡터에 삽입된 것을 갖는 재조합 아데노 바이러스 (Ad/hAP5) 로 동일한 실험을 하여 수컷 KK/San 마우스에 발현시킨 결과, 혈중의 중성 지방 농도의 유의한 상승이 관찰되어 인간형 분자가 마우스 체내에서도 기능함이 판명되었다 (도 4).
또한, 이들 혈중의 중성 지방 농도에 유의한 차이가 인정된 아데노 바이러스 감염 마우스군의 간으로부터 모든 RNA 를 회수하고, 실시예 1 에 기재된 방법으로 노던 블롯 해석을 한 결과, 도입된 유전자가 실제로 고발현하고 있음이 확인되었다 (도 5). 아데노 바이러스 감염 KK/San 마우스군에서 검출되는 밴드는 유전자 조작을 하지 않은 KK 마우스에서 검출되는 밴드보다 크지만, 이는 재조합 아데노바이러스 벡터 중에서 유효한 전사개시점 또는 폴리(A) 부가 시그널이 본래의 유전자상의 것과는 다른 것에 기인하는 것으로 생각된다. 어떻든간에, 재조합 아데노 바이러스 벡터에 삽입된 cDNA 중의 최초의 번역개시 코돈의 바로 5'말단측에는 이 번역개시 코돈과 동일한 읽기 틀 안에 종시코돈이 존재하기 때문에, 이 mRNA 의 크기의 차이는 번역되는 아미노산 서열에 영향을 미치지는 않는다.
실시예 6. 재조합 단백질의 정제 및 N 말단 아미노산 서열의 결정
이하에 기재하는 방법에 따라 실시예 3 에서 작성된 서열목록의 서열번호 3 으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 인간 cDNA 가 삽입된 발현벡터 pMEh55-1 로 동물세포를 형질전환시키고, 이 형질전환세포의 배양 상등액중에 분비되는 재조합 단백질을 정제하여 그 N 말단 아미노산 서열을 결정하였다.
(1) 형질전환체의 취득 및 배양 상등액의 조제
10 % FCS (기브코 BRL 사 제조), 10 단위/㎖ 페니실린 및 10 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (기브코 BRL 사 제조) 을 함유하는 αMEM (기브코 BRL 사 제조) 배지에서 디히드로 엽산 환원효소 결손 CHO 세포 (ATCC CRL-9096) 를 증식시킨 후, 트랜스펙션 시약 (FuGENE6 : 로슈 다이아그노스티크스사 제조) 을 사용하고, pMEh55-1 플라스미드를 1 ㎍/106세포의 비율로 트랜스펙트하였다. 구체적으로는 세포는 200 장의 세포배양용 샬레 (150 ㎜ø, 코닝사 제조) 에 1.5 ×107세포/샬레에서 배양하고, 트랜스펙션에는 샬레 1 장 당 15 ㎍ 의 pMEh55-1 플라스미드를 사용하였다. 트랜스펙션 조작후의 세포를 상기 FCS 를 함유하는 배지중에서 24 시간 배양후, 배지를 무혈청 αMEM 배지 (30 ㎖/샬레) 로 교환한 다음, 다시 3 일간 배양하고, 무혈청 배양 상등액 6 리터를 회수하였다.
(2) 재조합 단백질의 정제
1) 칼럼 (스트림라인 C-100 : 아머샴 파마시아 바이오테크사 제조) 에 충전한 세파덱스 G25 (아머샴 파마시아 바이오테크사 제조) 1.6 리터분의 겔에, 상기 (1) 에서 얻어진 배양 상등액을 600 ㎖ 주입하였다 (유속 : 20 ㎖/분). 이어서, 용리완충액 (20 mM 트리스 염산 (pH7.5), 0.01 % 아지화 나트륨 (시그마사 제조), 0.05 % 프로테아제 인히비터 혼합액 (시그마사 제조), 0.05 % Tween20 (시그마사 제조). 이하「A 액」이라고 함) 을 유속 50 ㎖/분으로 칼럼에 흐르게 하고, 최초의 1500 ㎖ 분의 용출액을 회수하였다. 이 조작을 10 회 실시하여 상기 (1) 에서 얻어진 6 리터의 배양 상등액의 탈염 및 저분자를 제거한다.
2) 이어서, 상기 1) 에서 얻어진 용출액을 FPLC 장치 (바이오 파일럿 시스템, 아머샴 파마시아 바이오테크사 제조) 를 사용하여 이하에 기재하는 조건으로 이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 분획하였다.
칼럼 : Q 세파로스 퍼스트 플로 (아머샴 파마시아 바이오테크사 제조) 100 ㎖ 를 XK50/100 칼럼 (아머샴 파마시아 바이오테크사 제조) 에 충전하였다.
용리완충액 조성 :
[A 액] 상기 참조
[B 액] 20 mM 트리스 염산, 1M 염화나트륨 (pH 7.5), 0.01 % 아지화 나트륨 0.05 % 프로테아제 인히비터 혼합액, 0.05 % Tween20
유속 : 10 ㎖/분
분획 : 각 10 ㎖/튜브
온도 : 4 ℃
용출조건 : 100 % A 액에서 100 % B 액으로의 직선농도 구배 (60 분간) 염화나트륨 농도 0.3 내지 0.4M 으로 용출된 획분을 회수하였다.
3) 또한, 상기 2) 의 이온 교환 크로마토그래피로 회수된 획분에 대해, FPLC 장치를 사용하여 이하에 기재하는 조건의 군특이적 어피니티 크로마토그래피를 실시하였다.
칼럼 : 어피겔 블루 (바이오래드사 제조) 10 ㎖ 를 XK16/40 칼럼 (아머샴 파마시아 바이오테크사 제조) 에 충전하였다.
용리 완충액 조성 :
[C 액] 20 mM 트리스 염산, 0.5M 염화나트륨 (pH 7.5), 0.01 % 아지화 나트륨, 0.05 % 프로테아제 인히비터 혼합액, 0.05 % Tween20
[D 액] 20 mM 트리스 염산, 1M 염화나트륨 (pH 7.5), 0.01 % 아지화 나트륨, 0.05 % 프로테아제 인히비터 혼합액, 0.05 % Tween20
유속 : 1.5 ㎖/분
온도 : 4 ℃
상기 2) 에서 회수된 획분을 칼럼에 통과시킨 후, C 액을 60 ㎖ 흐르게 하여 세정한 다음, D 액을 100 ㎖ 흐르게 하여 D 액에 의한 용출액을 회수한다.
4) 상기 3) 에서 얻어진 용출액에 등량 (100 ㎖) 의 A 액을 첨가한다.이것에 대해 FPLC 장치를 사용하여 이하에 기재하는 조건의 군특이적 어피니티 크로마토그래피를 실시하였다.
칼럼 : 렌틸 렉틴 세파로스 4B (아머샴 파마시아 바이오테크사 제조) 10 ㎖ 를 XK16/40 칼럼에 충전하였다.
용리 완충액 조성 :
[C 액] 상기 참조
[F 액] 20 mM 트리스 염산, 0.5M 염화나트륨, 0.3M 메틸만노피라노시드 (pH 7.5), 0.01 % 아지화 나트륨, 0.05 % 프로테아제 인히비터 혼합액, 0.05 % Tween20
유속 : 1 ㎖/분
온도 : 4 ℃
샘플을 칼럼에 통과시킨 후, C 액을 50 ㎖ 흐르게 하여 세정한 다음, F 액을 50 ㎖ 흐르게 하여 F 액에 의한 용출액을 회수하였다.
이 용출액을 투석튜브 (배제한계 분자량 10 KDa : 기브코 BRL 사 제조) 에 옮기고, 0.01 % 아지화 나트륨 및 0.1 % 프로테아제 인히비터 혼합액을 함유하는 둘베코 PBS(－) (닛스이세이야꾸 (주) 사 제조) 2 리터에 대해, 4 ℃ 에서 하룻밤 투석하였다. 그 후, 투석튜브내의 용액을 회수하여 그 중 4 ㎖ 에 4 ㎎/㎖ 데옥시콜산 나트륨을 함유하는 TCA 를 1/10 용량 (0.4 ㎖) 첨가하고, 얻어진 침전을 회수하고, 계속하여 아세톤을 첨가하여 얻어진 침전을 회수하고, 50 ㎕ 의 멸균 초순수에 용해하였다.
(3) N 말단 아미노산 서열의 결정
상기 (2) 에서 정제된 시료에 PNGaseF (뉴잉글랜드 바이오러브사 제조) 를 첨가하고 N 결합형 당쇄를 절단하였다. 구체적으로는 먼저 50 ㎕ 의 시료에 6 ㎕ 의 10 ×변성 버퍼 (PNGaseF 시약에 첨부) 를 첨가하여 교반하고, 10 분간 끓는 물 수욕중에서 가열하였다. 이것을 실온으로 되돌린 후, 6 ㎕ 의 10 % 노니데트 P-40 및 6 ㎕ 의 10 ×G7 버퍼 (이상 PNGaseF 시약에 첨부) 를 차례로 첨가하여 교반하였다. 이것에 PNGaseF 를 3 ㎕ 첨가하고, 교반한 다음 37 ℃ 의 수욕에서 2 시간 이상 보온하였다.
이 N 결합형 당쇄 절단반응후의 반응액에 대해 4 내지 20 % 농도구배 아크릴아미드겔 (멀티겔 4/20, 다이이찌카가꾸야꾸힝 (주) 사 제조) 및 미니슬라브식 전기영동장치 (닛뽕 에이드 (주) 사 제조) 를 사용하여 환원조건하의 SDS-PAGE 를 실시하였다. 전기영동후, 겔 멤브레인 전사장치 (마리솔사 제조) 를 사용하고, 겔내에서 분리된 단백질을 0.2 ㎛ 구멍직경의 폴리비닐리덴 디플루오리드 (PVDF) 막 (바이오래드사 제조) 에 전사하였다 (2 mA/㎠, 4 ℃ 에서 2 시간). 전사후의 막을 100 % 메탄올 (와코쥰야꾸 (주) 사 제조) 로 10 초간 적신 후, 초순수로 2 분간 세정한 다음, 쿠마시 염색액 (바이오래드사 제조) 으로 5 분간 염색하고, 다시 막을 메탄올에 담구어 2 분간 탈색한 결과, 약 50 KDa 에 상당하는 밴드가 관찰되었다. 이 밴드부분의 막을 절단하여 프로테인 시퀀서 (PPSQ-10 : 시마즈세이사꾸쇼 (주) 사 제조) 에 의해 N 말단서열의 해석을 실시하였다.
그 결과, 상기 약 50 kDa 의 밴드의 N 말단 아미노산 서열은
Ser-Arg-Ile-Asp-Gln-Asp-Asn-Ser-Ser-Phe-Asp (서열목록의 서열번호 4 의아미노산 번호 17 내지 27) 이었다. 이 점에서, 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 코드되는 단백질은 포유동물세포에서는 N 말단의 16 개의 펩티드 (서열목록의 서열번호 4 의 아미노산 번호 1 내지 16) 가 절단되어 그 직후에 이어지는 세린 잔기 (서열목록의 서열번호 4 의 아미노산 번호 17) 를 N 말단으로 하는 성숙체로서 분비됨이 판명되었다.
이상 기술한 바와 같이, 본 발명에 의해 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47 내지 1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 유전자가 혈중의 중성 지방 농도를 상승시키는 유전적 소인(素因) 중 하나이고, 따라서 이 유전자의 발현량을 억제하는 물질이 고지혈증의 치료 또는 예방제가 될 수 있음이 판명되었다. 즉, 본 발명의 방법, 이 방법 중 핵산을 검출하는 태양에 있어서 프로브 또는 프라이머로 사용되는 폴리뉴클레오티드 및 동일하게 폴리펩티드를 검출하는 태양에 사용되는 항체는 고지혈증의 치료 또는 예방제의 탐색에 유용하다.

Claims (27)

  1. 물질의 고지혈증의 치료 또는 예방제로서의 효과를 시험하는 방법으로서, 하기 공정 :
    1) 배양세포를 피검물질의 존재하 또는 비존재하에 배양한다 ;
    2) 상기 1) 에서 얻어진 배양세포에 있어서의 하기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열 (단, 서열 중의 t 는 u 로 대체하여 읽음) 을 갖는 mRNA 의 발현량을 검출한다 :
    a) 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47 내지 1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
    b) 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
    c) 형질전환 대장균 E. coli pBK/m55-1 SANK 72199 (FERM BP-6940) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열 ;
    d) 형질전환 대장균 E. coli pTrip/h55-1 SANK 72299 (FERM BP-6941) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열 ;
    e) 상기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 혈중의 중성 지방 농도를 상승시키는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열 ; 및
    3) 상기 공정 2) 의 결과, 피검물질 비존재하에서 배양한 세포와, 피검물질 존재하에서 배양한 세포 사이에서, 검출된 mRNA 의 발현량을 비교한다 ;
    을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 배양세포가 간 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 배양세포가 영장류 또는 설치류 동물 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 배양세포가 인간 또는 마우스 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 의 발현량을 검출하는 방법이 노던 블롯 (Northern blotting), 도트 블롯 또는 슬롯 블롯인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 의 발현량을 검출하는 방법이 RT-PCR 인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 의 발현량을 검출하는방법이 리보뉴클레아제 보호 어세이인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 의 발현량을 검출하는 방법이 런온 (run-on) 어세이인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 하기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열 (단, 서열 중의 t 는 u 로 대체하여 읽음) 을 포함하는 mRNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 (단, 하기 a) 내지 d) 에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 제외함) :
    a) 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47 내지 1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
    b) 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
    c) 형질전환 대장균 E. coli pBK/m55-1 SANK 72199 (FERM BP-6940) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열 ;
    d) 형질전환 대장균 E. coli pTrip/h55-1 SANK 72299 (FERM BP-6941) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열.
  10. 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47 내지 1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 일방 또는 양방의 말단이 1 뉴클레오티드 또는 2 뉴클레오티드이상 결실된, 적어도 15 뉴클레오티드로 이루어지는 DNA.
  11. 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 일방 또는 양방의 말단이 1 뉴클레오티드 또는 2 뉴클레오티드 이상 결실된, 적어도 15 뉴클레오티드로 이루어지는 DNA.
  12. 물질의 고지혈증의 치료 또는 예방제로서의 효과를 시험하는 방법으로서, 하기 공정 :
    1) 배양세포를 피검물질의 존재하 또는 비존재하에서 배양한다 ;
    2) 상기 1) 에서 얻어진 배양세포 상등액에 있어서의 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 코드되는 아미노산 서열 또는 그 일부로 이루어지는 폴리펩티드의 생산량을 이 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 검출한다 ;
    a) 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47 내지 1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
    b) 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
    c) 형질전환 대장균 E. coli pBK/m55-1 SANK 72199 (FERM BP-6940) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열 ;
    d) 형질전환 대장균 E. coli pTrip/h55-1 SANK 72299 (FERM BP-6941) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열.
    e) 상기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 혈중의 중성 지방 농도를 상승시키는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열 ; 및
    3) 상기 공정 2) 의 결과, 피검물질 비존재하에서 배양한 세포와, 피검물질 존재하에서 배양한 세포 사이에서, 검출된 mRNA 의 발현량을 비교한다 ;
    을 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 코드되는 아미노산 서열 또는 그 일부로 이루어지는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체가, 서열목록의 서열번호 2 의 아미노산 번호 17-455 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부, 동 19-455 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부 또는 서열번호 4 의 아미노산 번호 17-460 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부를 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 코드되는 아미노산 서열 또는 그 일부로 이루어지는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체가, 서열목록의 서열번호 9 의 아미노산 번호 1 내지 13으로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 10 의 아미노산 번호 1 내지 14 로 표시되는 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 코드되는 아미노산 서열 또는 그 일부로 이루어지는 폴리펩티드의 생산량을 이 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 검출하는 조작이, 웨스턴 블롯, 도트 블롯 또는 슬롯 블롯인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 코드되는 아미노산 서열 또는 그 일부로 이루어지는 폴리펩티드의 생산량을 이 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 검출하는 조작이, 고상효소 면역정량법 (ELISA 법) 또는 방사성 동위원소 면역정량법 (RIA 법) 인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 하기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 코드되는 아미노산 서열 또는 그 일부로 이루어지는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체 :
    a) 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47 내지 1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
    b) 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는뉴클레오티드 서열 ;
    c) 형질전환 대장균 E. coli pBK/m55-1 SANK 72199 (FERM BP-6940) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열 ;
    d) 형질전환 대장균 E. coli pTrip/h55-1 SANK 72299 (FERM BP-6941) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열 ;
    e) 상기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 혈중의 중성 지방 농도를 상승시키는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열.
  18. 제 17 항에 기재된 항체로서, 서열목록의 서열번호 9 의 아미노산 번호 1 내지 13 으로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 10 의 아미노산 번호 1 내지 14 로 표시되는 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 항체.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 기재된 항체를 함유하는 것으로 이루어지는 고지혈증의 치료 또는 예방제를 시험하기 위한 키트.
  20. 물질의 고지혈증의 치료 또는 예방제로서의 효과를 시험하는 방법으로서, 하기 공정 :
    1) 유전자 조작에 의해 얻어지고, 하기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 기재된뉴클레오티드 서열 ;
    a) 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47 내지 1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
    b) 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
    c) 형질전환 대장균 E. coli pBK/m55-1 SANK 72199 (FERM BP-6940) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열 ;
    d) 형질전환 대장균 E. coli pTrip/h55-1 SANK 72299 (FERM BP-6941) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열.
    e) 상기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 혈중의 중성 지방 농도를 상승시키는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는 외래유전자가 이 유전자를 고발현할 수 있도록 도입되어 있는 비인간동물에게 피검물질을 투여한다 ; 및
    2) 1) 의 동물의 혈중 중성 지방 농도를 측정한다 ;
    를 포함하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 1) 의 비인간동물이 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서, 1) 에 기재된 비인간동물로의 외래유전자의 도입이 이 유전자가 삽입된 아데노 바이러스 벡터를 포함하는 아데노 바이러스의 이 동물로의 감염에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
  23. 하기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열 (단, 서열 중의 t 는 u 로 대체하여 읽음) 을 포함하는 mRNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의, 고지혈증의 치료 또는 예방제의 시험에 사용하는 프로브의 제조를 위한 사용 :
    a) 서열목록의 서열번호 1 의 뉴클레오티드 번호 47 내지 1411 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
    b) 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 ;
    c) 형질전환 대장균 E. coli pBK/m55-1 SANK 72199 (FERM BP-6940) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열 ;
    d) 형질전환 대장균 E. coli pTrip/h55-1 SANK 72299 (FERM BP-6941) 가 보유하는 파지미드 중에 삽입된 DNA 가 갖는 뉴클레오티드 서열.
  24. 서열목록의 서열번호 2 의 아미노산 번호 17-455 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부, 동 19-455 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부 또는 서열번호 4 의 아미노산 번호 17-460 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부의, 고지혈증의 치료 또는 예방제의 시험에 사용하는 항체의 제조를 위한 사용.
  25. 서열목록의 서열번호 2 의 아미노산 번호 17-455 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부, 동 19-455 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부 또는 서열번호 4 의 아미노산 번호 17-460 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 일부를 특이적으로 인식하기 위한 항체의, 고지혈증의 치료 또는 예방제의 시험 키트의 제조를 위한 사용.
  26. 서열목록의 서열번호 3 의 뉴클레오티드 번호 78 내지 1457 로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중의 연속한 15 내지 30 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열의 안티센스 서열로 이루어지는 DNA 또는 RNA.
  27. 제 26 항에 기재된 DNA 또는 RNA 를 유효성분으로 함유하는 고지혈증 치료제.
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