JP3497501B1 - 高脂血症等疾患の治療または予防剤の試験方法 - Google Patents

Abstract

【要約】 【課題】 高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択さ
れる一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤を試
験するための新規な方法を提供する。 【解決手段】 培養細胞を被験物質の存在下または非存
在下で培養し、「アンジオポエチン関連タンパク質３ま
たは４」遺伝子のｍＲＮＡ発現量またはプロモーター活
性を検出し、被験物質非存在下で培養した細胞よりも、
被験物質存在下で培養した細胞において、検出されたｍ
ＲＮＡの発現量またはプロモーター活性が少なくなるよ
うな被験物質を選択する方法。ＬＰＬおよび／またはＨ
ＴＧＬの活性を調節する物質の試験方法であって、ＬＰ
Ｌおよび／またはＨＴＧＬとその基質とを反応させる系
に、被験物質と共に、「アンジオポエチン関連タンパク
質３または４」を共存させ、次いで、該タンパク質によ
るＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性阻害を、被検物
質が抑制するか否かを調べることを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】 本発明は、高脂血症、動脈
硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の
疾患の治療または予防剤を試験するための新規な方法に
関する。

【０００２】また、本発明は、高脂血症、動脈硬化およ
び高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治
療または予防剤の探索または試験に有用な新規ポリペプ
チドおよび該ポリペプチドを用いた新規試験方法に関す
る。

【０００３】また、本発明は、脂質低下剤、特に高脂血
症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二
つ以上の疾患の治療または予防剤として有用な、リパー
ゼ活性を調節する物質を試験するための新規方法に関す
る。

【０００４】また、本発明は、高脂血症、動脈硬化およ
び高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治
療または予防剤の試験に有用な、プロモーター活性を有
する新規ＤＮＡに関する。

【０００５】

【従来の技術】 心臓血管疾患は、いまだ世界のほとん
どの先進諸国における死亡の主原因である。アテローム
性動脈硬化症は、急性冠症候群（不安定狭心症、急性心
筋梗塞、虚血性突然死）、脳血栓および脳梗塞の主な病
因である。米国では、毎年、アテローム性動脈硬化症に
よって引き起こされる心筋梗塞により55万人が死亡して
いると推定される。１９９１年の統計では、日本での死
亡原因の第一位がアテローム性動脈硬化症による心臓血
管疾患である。疫学研究により、アテローム性動脈硬化
症は、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧症、喫
煙などの多くの危険因子によって生じることが判明して
いる。

【０００６】血清脂質濃度の異常増加を高脂質血症（hy
perlipidemia）または高脂血症（hyperlipemia）と呼
ぶ。血清脂質にはコレステロール（コレステロールエス
テル、遊離コレステロール）、リン脂質（レシチン、ス
フィンゴミエリン等）、トリグリセリド(中性脂肪)、遊
離脂肪酸、その他のステロール類などがあるが、とくに
臨床的に問題となるのは、血中の中性脂肪およびコレス
テロールの増加である（COMMON DISEASE SERIES Ｎo.１
９高脂血症 中村治雄編集 １９９１年１０月１０日発行
南江堂、Austin et al., Circulation 101, 2777-2782
(2000)）。高コレステロール血症と虚血性心疾患発症と
の関係については、その因果関係は明確にされており、
虚血性心疾患に対する独立した危険因子としての位置が
確立され、その予防や治療が積極的に行なわれている。
また、近年になって血清コレステロール値ほど疫学的に
明確ではないが、高トリグリセリド血症が動脈硬化に関
連した諸疾患の危険因子として再認識されてきている
（Rubins et al., N Engl J Med 341, 410-418 (199
9)）。従って、血中脂質値の適切なコントロールは、虚
血性心疾患、脳梗塞などに代表される動脈硬化に関連し
た諸疾患の予防または治療に極めて重要である（Brewer
et al., Am J Cardiol. 83, 3F-12F (1999)）。中性脂
肪を低下せしめる薬剤としては、フィブリン酸系化合
物、例えば、クロフィブレート、フェノフィブレート、
ベザフィブレート、ゲムフィブロジルなどが医薬として
供されており、血漿中の中性脂肪、およびコレステロー
ルレベルを低下させ、コレステロールレベルの上昇した
個体における虚血性心疾患の予防に有用であることが知
られている（Havel, R. J. and Kane, J. P. (1973) 13
Ann.Rev. Pharmac. 287-308、Circulation 102, 21-27
(2000)、Frick, M. H. et al. (1987) N. Engl. J. Me
d. 317, 1237-1245）。

【０００７】一方、血中コレステロール値を低下させる
薬剤としては、コレスチラミン、コレスチポール等の胆
汁酸を捕捉してその吸収を阻害するもの（例えば、米国
特許第4027009号）、メリナミド（フランス特許第14765
69号）等のアシルコエンザイムＡコレステロールアシル
移転酵素（ＡＣＡＴ）を阻害してコレステロールの腸管
吸収を抑制するもの等の他、コレステロールの生合成を
抑制する薬剤が注目されている。コレステロール生合成
抑制薬剤として、特に３−ヒドロキシ−３−メチルグル
タリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素を阻
害するロバスタチン（米国特許第4231938号）、シンバ
スタチン（米国特許第4444784号）、プラバスタチン
（米国特許第4346227号）等が医薬として供されてい
る。

【０００８】より安全で、かつより効果的な中性脂肪低
下作用を示す脂質低下剤を得ることは、高脂血症の予防
または治療あるいは動脈硬化の治療または予防に有用
な、従って医薬としてより有用な薬剤を提供することに
なる。

【０００９】他方、糖尿病は多くの原因因子に由来する
疾患過程であり、血漿グルコースレベルの上昇もしくは
高血糖症を特徴とする。制御されない高血糖症は、ネフ
ロパシー、ニューロパシー、網膜症、高血圧症、卒中お
よび心疾患を含めた細小血管および大血管疾患に関する
危険性の増大に起因して早期死亡率（premature mortal
ity）の上昇に関連する。従って、グルコース恒常性の
制御は高血糖症、ひいては糖尿病の治療法として決定的
に重要である。

【００１０】本発明の方法において用いられる遺伝子の
うち配列表配列番号１に記載のｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎ
ｂａｎｋデータベース上に「アンジオポエチン関連タン
パク質３（angiopoietin-related protein 3）」をコー
ドするヌクレオチド配列として開示されており、また国
際特許出願公開ＷＯ９９／５５８６９号公報には同じヌ
クレオチド配列が「ｚａｌｐｈａ５」をコードするもの
として開示されているが、これらのヌクレオチド配列を
有する遺伝子と高脂血症、動脈硬化および高血糖との関
連については知られておらず、またその転写制御に関す
るＤＮＡ配列も知られていない。従って、「アンジオポ
エチン関連タンパク質３」乃至「ｚａｌｐｈａ５」をコ
ードするヌクレオチド配列の一部またはそれらのプロモ
ーターが、高脂血症、動脈硬化および高血糖の治療また
は予防剤を試験するために有用であることも知られてい
ない。

【００１１】「アンジオポエチン関連タンパク質」には
６つのファミリーが知られている（「アンジオポエチン
関連タンパク質１、２、３、４、５および６」）。「ア
ンジオポエチン関連タンパク質１、２、３、４、５およ
び６」はアンジオポエチンと同様に、アミノ末端側のコ
イル構造、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン様ド
メインを特徴とする分泌タンパク質である（図７）。例
えば、「アンジオポエチン関連タンパク質３」では、４
６０アミノ酸のうち、アミノ末端から１６番目のアミノ
酸までがシグナルペプチドで、１７番目から２０７番目
のアミノ酸までがヘリックス領域でこの中にコイル構造
が含まれ、２０８番目から２４１番目のアミノ酸までが
リンカー領域で、２４２番目から４６０番目のアミノ酸
までが、フィブリノーゲン結合領域であるとされてい
る。

【００１２】「アンジオポエチン関連タンパク質１」お
よび「アンジオポエチン関連タンパク質２」はアンジオ
ポエチンの相同性を基にしたＰＣＲによりヒト心臓より
同定された（Kim,I., et al. (1999) FEBS Lett.443: 3
53-356； Kim, I., et al (1999) J. Biol. Chem. 27
4: 26523-26528）。「アンジオポエチン関連タンパク質
１」と「アンジオポエチン関連タンパク質２」との間で
は５９％の相同性を示す。アンジオポエチン１に対する
「アンジオポエチン関連タンパク質１及び２」の相同性
は２６−２９％である。アンジオポエチン２に対する
「アンジオポエチン関連タンパク質１及び２」の相同性
は３４％である。

【００１３】「アンジオポエチン関連タンパク質１」は
幅広い臓器で発現が認められているが、アンジオポエチ
ン様の内皮細胞刺激活性は示さない。一方、「アンジオ
ポエチン関連タンパク質２」については心臓、小腸、脾
臓および胃での発現が認められ、血管内皮細胞に対する
刺激活性を示したものの、アンジオポエチン１あるいは
アンジオポエチン２の受容体である「ＴＩＥ２」への結
合は認められなかった。

【００１４】一方、「アンジオポエチン関連タンパク質
３」については、ＥＳＴを用いたホモロジ−検索により
見出され、肝臓と腎臓においてのみ発現していること示
されている（Conklin, D., et al. (1999) Genomics 6
2, 477-482）。「アンジオポエチン関連タンパク質３」
については、Ｃ末端側領域の機能について報告されてい
る（Conklin, D., et al. (1999) Genomics 62, 477-48
2）が、Ｎ末端側領域がいかなる機能を有するかについ
ては知られていなかった。さらに、Ｃ末端側領域を欠い
たＮ末端領域のみの欠損体が機能を有することは全く知
られていない。また、「アンジオポエチン関連タンパク
質３」のパートナー因子については知られておらず、ア
ンジオポエチン関連タンパク質３およびそのパートナー
因子を用いて、血中中性脂肪濃度を調節する薬剤をイン
・ビトロで試験する方法も知られていない。

【００１５】「アンジオポエチン関連タンパク質４」は
ＰＰＡＲγ制御下で脂質代謝あるいはグルコースホメオ
スターシスに関与するタンパク質（Yoon, J. C., et a
l. (2000) Molec. Cell. Biol 20, 5343-5349）、ＰＰ
ＡＲα標的遺伝子で絶食により誘導される脂質因子(Ker
sten, S., et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 28488-
28493)、および内皮細胞にアポトーシスを誘発する肝臓
由来の新規「アンジオポエチン関連タンパク質」（Kim,
I., et al. (2000) Biochem. J. 346, 603-610）とし
て同定されている。「アンジオポエチン関連タンパク質
４」は白色脂肪細胞および胎盤での発現が報告されてい
るがアンジオポエチン様の活性の有無については報告さ
れていない。また、「アンジオポエチン関連タンパク質
４」の発現制御に関わる特定のＤＮＡ領域（プロモータ
ー／エンハンサー領域）は同定されておらず、該遺伝子
のプロモーターが、高脂血症、動脈硬化や高血糖の治療
または予防剤を試験するために有用であることも知られ
ていなかった。

【００１６】「アンジオポエチン関連タンパク質５」は
遺伝子が登録されているだけであり、機能は不明であ
る。

【００１７】「アンジオポエチン関連タンパク質６」は
角膜特異的に発現する遺伝子cornea-derived transcrip
t 6 (CDT6)として同定された（Peek, R., et al. (199
8) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 1782-1788）。
「アンジオポエチン関連タンパク質６」はマウス移植癌
モデルで腫瘍増殖阻止を示した（Peek, R., et al. (20
01) J. Biol. Chem. epub ahead of print）。

【００１８】このようにアンジオポエチンが有する血管
内皮増殖因子様活性とは異なった機能を「アンジオポエ
チン関連タンパク質」は担っている可能性が考えられ
る。

【００１９】「アンジオポエチン関連タンパク質」ファ
ミリーに共通するカルボキシル末端側のフィブリノーゲ
ン様ドメインについては、「ＴＩＥレセプター」との結
合に関与する領域であるとの報告はなく、また、「アン
ジオポエチン関連タンパク質」ファミリーに共通するア
ミノ末端側のコイル構造がどのような機能を有するかは
不明である。

【００２０】さらに、「アンジオポエチン関連タンパク
質」ファミリーのカルボキシル末端側のフィブリノーゲ
ン様領域を欠いたアミノ末端領域のみの欠損体が機能を
有することは全く知られていなかった。

【００２１】

【発明が解決しようとする課題】 本発明の目的は、高
脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまた
は二つ以上の疾患の治療または予防剤を試験するための
新規な方法を提供することにある。

【００２２】また、本発明の目的は、高脂血症、動脈硬
化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾
患の治療または予防剤の探索または試験に有用な新規ポ
リペプチドおよび該ポリペプチドを用いた新規試験方法
を提供することにある。

【００２３】また、本発明の目的は、リパーゼ活性を調
節する物質、特に、高脂血症および／または動脈効果の
予防または治療剤として有用な、ＬＰＬおよび／または
ＨＴＧＬ活性を上昇させることによって血中脂質濃度を
低下せしめる物質を試験するための新規方法を提供する
ことにある。

【００２４】また、本発明の目的は、「アンジオポエチ
ン関連タンパク質３」遺伝子および「アンジオポエチン
関連タンパク質４」遺伝子の転写制御に関わるプロモー
ター領域を特定し、該プロモーターの活性を調節する化
合物のスクリーニング方法を提供することにある。より
具体的には、高脂血症、動脈硬化もしくは高血糖の治療
または予防剤を試験するための新規な方法および該方法
において用いられるＤＮＡが提供される。

【００２５】

【課題を解決するための手段】本発明は、 （１） 下記の工程を含む、被験物質の、高脂血症、動
脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上
の疾患の治療または予防効果を試験する方法： １）哺乳動物由来培養細胞を被験物質の存在下または非
存在下で培養する； ２）上記１）で得られた培養細胞における、下記のａ）
乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（た
だし、配列中のｔはｕに読み替える）を有するｍＲＮＡ
の発現量を検出する： ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１
４１１に示されるヌクレオチド配列； ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１
４５７に示されるヌクレオチド配列； ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＢＫ／ｍ５５−１
ＳＡＮＫ ７２１９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４０）
が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有する
ヌクレオチド配列； ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５
−１ ＳＡＮＫ ７２２９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４
１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有
するヌクレオチド配列； ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオ
チド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチド
とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の
中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列；および ３）上記工程２）の結果、被験物質非存在下で培養した
細胞と、被験物質存在下で培養した細胞との間で、検出
されたｍＲＮＡの発現量を比較する。

【００２６】（２） 哺乳動物由来培養細胞が肝臓由来
であることを特徴とする、（１）に記載の方法。

【００２７】（３） 哺乳動物由来培養細胞が霊長類ま
たは齧歯類動物由来であることを特徴とする、（１）ま
たは（２）に記載の方法。

【００２８】（４） 哺乳動物由来培養細胞がヒトまた
はマウス由来であることを特徴とする、（１）乃至
（３）のいずれか一つに記載の方法。

【００２９】（５） （１）乃至（４）のいずれか一つ
に記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手
段がノーザンブロット、ドットブロットまたはスロット
ブロットであることを特徴とする方法。

【００３０】（６） （１）乃至（４）のいずれか一つ
に記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手
段がＲＴ−ＰＣＲであることを特徴とする方法。

【００３１】（７） （１）乃至（４）のいずれか一つ
に記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手
段がリボヌクレアーゼ保護アッセイであることを特徴と
する方法。

【００３２】（８） （１）乃至（４）のいずれか一つ
に記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手
段がランオン・アッセイであることを特徴とする方法。

【００３３】（９） （１）乃至（４）のいずれか一つ
に記載の方法において、ｍＲＮＡの発現量を検出する手
段が動物組織または細胞由来の相補的ＤＮＡ群または該
ＤＮＡの部分配列で作製された遺伝子チップを用いるも
のであることを特徴とする方法。

【００３４】（１０） 下記の工程を含む、被験物質
の、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一
つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を試験す
る方法： １）培養細胞を被験物質の存在下または非存在下で培養
する； ２）上記１）で得られた培養細胞上清における、下記の
ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列
にコードされるアミノ酸配列またはその一部からなるポ
リペプチドの産生量を、該ポリペプチドと特異的に結合
する抗体を用いて検出する： ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１
４１１に示されるヌクレオチド配列； ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１
４５７に示されるヌクレオチド配列； ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＢＫ／ｍ５５−１
ＳＡＮＫ ７２１９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４０）
が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有する
ヌクレオチド配列； ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５
−１ ＳＡＮＫ ７２２９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４
１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有
するヌクレオチド配列； ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオ
チド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチド
とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の
中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列；および ３）上記工程２）の結果、被験物質非存在下で培養した
細胞と、被験物質存在下で培養した細胞との間で、検出
されたポリペプチドの量を比較する。

【００３５】（１１） （１０）に記載の方法におい
て、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド
配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部からな
るポリペプチドと特異的に結合する抗体が、配列表の配
列番号２のアミノ酸番号１７−４５５に示されるアミノ
酸配列からなるポリペプチドもしくはその一部、同１９
−４５５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
もしくはその一部、または配列番号４のアミノ酸番号１
７−４６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドもしくはその一部と特異的に結合するものであること
を特徴とする方法。

【００３６】（１２） （１０）または（１１）に記載
の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載の
ヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列またはそ
の一部からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体
が、配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から１３に示
されるアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸番号
１から１４に示されるアミノ酸配列を特異的に認識する
ものであることを特徴とする方法。

【００３７】（１３） （１０）乃至（１２）のいずれ
か一つに記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか
一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸
配列またはその一部からなるポリペプチドの産生量を該
ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて検出する
操作が、ウエスタンブロット、ドットブロットまたはス
ロットブロットであることを特徴とする方法。

【００３８】（１４） （１０）乃至（１２）のいずれ
か一つに記載の方法において、ａ）乃至ｅ）のいずれか
一つに記載のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸
配列またはその一部からなるポリペプチドの産生量を該
ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて検出する
操作が、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）または放
射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）であることを特徴
とする方法。

【００３９】（１５） （１４）記載のＥＬＩＳＡ法に
おいてプレートに固相化する抗体としてマウスハイブリ
ドーマ４５Ｂ１の産生するモノクローナル抗体Ｍａｂ４
５Ｂ１を使用することを特徴とする方法。なお、ハイブ
リドーマ４５Ｂ１は、独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターに２００２年３月１３日付で、寄
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９６３として寄託されてい
る。

【００４０】（１６） 下記のｉ）および／またはｉ
ｉ）記載の抗体を含むことを特徴とする、高脂血症、動
脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上
の疾患の治療または予防剤を試験するためのキット：
ｉ）下記のａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレ
オチド配列にコードされるアミノ酸配列またはその一部
からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体： ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１
４１１に示されるヌクレオチド配列； ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１
４５７に示されるヌクレオチド配列； ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＢＫ／ｍ５５−１
ＳＡＮＫ ７２１９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４０）
が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有する
ヌクレオチド配列； ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５
−１ ＳＡＮＫ ７２２９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４
１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡが有
するヌクレオチド配列； ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオ
チド配列のアンチセンス配列からなるポリヌクレオチド
とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の
中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列； ｉｉ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から１３に
示されるアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸番
号１から１４に示されるアミノ酸配列と特異的に結合す
ることを特徴とする抗体。

【００４１】（１７） 配列表の配列番号３のヌクレオ
チド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列
中の連続した１５乃至３０ヌクレオチドからなるヌクレ
オチド配列のアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列
を有するＤＮＡまたはＲＮＡを有効成分として含有する
高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つま
たは二つ以上の疾患の遺伝子治療のための組成物。

【００４２】（１８） 配列表の配列番号１２に示され
るアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列
であって、アミノ酸番号１７のアミノ酸をアミノ末端と
し、アミノ酸番号１４７乃至２０７のいずれか１つのア
ミノ酸をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなる
ポリペプチド。

【００４３】（１９） 配列表の配列番号１２のアミノ
酸番号１７乃至２０７に示されるアミノ酸配列からなる
ことを特徴とする、（１８）記載のポリペプチド。

【００４４】（２０）配列表の配列番号１２のアミノ酸
番号１７乃至１９５に示されるアミノ酸配列からなるこ
とを特徴とする、（１８）記載のポリペプチド。

【００４５】（２１） 配列表の配列番号１２のアミノ
酸番号１７乃至１４７に示されるアミノ酸配列からなる
ことを特徴とする、（１８）記載のポリペプチド。

【００４６】（２２） 配列表の配列番号１６に示され
るアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列
であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ
酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列か
らなるポリペプチド。

【００４７】（２３） 配列表の配列番号１６に示され
るアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列
であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ
酸番号１４４乃至１８３のいずれか一つをカルボキシル
末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。

【００４８】（２４）配列表の配列番号１８のアミノ酸
配列に含まれる連続した1つのアミノ酸配列であって、
アミノ酸番号２２をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０
２乃至２７６のいずれか１つをカルボキシル末端とする
アミノ酸配列からなるポリペプチド。

【００４９】（２５） 配列表の配列番号２０のアミノ
酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であっ
て、アミノ酸番号２３をアミノ末端とし、アミノ酸番号
２０６乃至２７５のいずれか１つをカルボキシル末端と
するアミノ酸配列からなるポリペプチド。

【００５０】（２６） 配列表の配列番号２２のアミノ
酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であっ
て、アミノ酸番号２１をアミノ末端とし、アミノ酸番号
１８５乃至２５８のいずれか１つをカルボキシル末端と
するアミノ酸配列からなるポリペプチド。

【００５１】（２７） 配列表の配列番号２４に示され
るアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列
であって、アミノ酸番号２７をアミノ末端とし、アミノ
酸番号１２２乃至１２９のいずれか１つをカルボキシル
末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。

【００５２】（２８） 配列表の配列番号１６のアミノ
酸番号２６をアミノ末端とし、４０６をカルボキシル末
端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。

【００５３】（２９） 配列表の配列番号１８のアミノ
酸番号２２をアミノ末端とし、４９１をカルボキシル末
端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。

【００５４】（３０） 配列表の配列番号２０のアミノ
酸番号２３をアミノ末端とし、４９３をカルボキシル末
端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。

【００５５】（３１） 配列表の配列番号２２のアミノ
酸番号２１をアミノ末端とし、４７０をカルボキシル末
端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。

【００５６】（３２） 配列表の配列番号２４のアミノ
酸番号２７をアミノ末端とし、３４６をカルボキシル末
端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド。

【００５７】（３３） 配列表の配列番号２６に示され
るアミノ酸配列からなるポリペプチド。

【００５８】（３４）（１８）乃至（３３）記載のアミ
ノ酸配列の一つもしくは数個の部位において、一つ若し
くは数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、付加もしくは置
換されている、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇さ
せる活性を有するポリペプチドの同効物。

【００５９】（３５） （１８）乃至（３４）のいずれ
か１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【００６０】（３６） 配列表の配列番号１１に示され
るヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であ
って、ヌクレオチド番号１８のヌクレオチドを５'末端
とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６３８のいずれか１
つのヌクレオチドを３'末端とするヌクレオチド配列か
らなるＤＮＡ。

【００６１】（３７） 配列表の配列番号１１に示され
るヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であ
って、ヌクレオチド番号１８のヌクレオチドを５'末端
とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６０２のいずれか１
つのヌクレオチドを３'末端とするヌクレオチド配列か
らなるＤＮＡ。

【００６２】（３８） 配列表の配列番号１５に示され
るヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であ
って、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５'末
端とし、ヌクレオチド番号６０１を３'末端とするヌク
レオチド配列からなるＤＮＡ。

【００６３】（３９） 配列表の配列番号１５に示され
るヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であ
って、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５'末
端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３'末端とするヌ
クレオチド配列からなるＤＮＡ。

【００６４】（４０） 配列表の配列番号１７に示され
るヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であ
って、ヌクレオチド番号４３４のヌクレオチドを５'末
端とし、ヌクレオチド番号１０３９乃至１２６１のいず
れか１つのヌクレオチドを３'末端とするヌクレオチド
配列からなるＤＮＡ。

【００６５】（４１） 配列表の配列番号１７に示され
るヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であ
って、ヌクレオチド番号４３４のヌクレオチドを５'末
端とし、ヌクレオチド番号１９０９を３'末端とするヌ
クレオチド配列からなるＤＮＡ。

【００６６】（４２） 配列表の配列番号１９に示され
るヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であ
って、ヌクレオチド番号２２のヌクレオチドを５'末端
とし、ヌクレオチド番号６３９乃至８４６のいずれか１
つのヌクレオチドを３'末端とするヌクレオチド配列か
らなるＤＮＡ。

【００６７】（４３） 配列表の配列番号１９に示され
るヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であ
って、ヌクレオチド番号２２のヌクレオチドを５'末端
とし、ヌクレオチド番号１５０３を３'末端とするヌク
レオチド配列からなるＤＮＡ。

【００６８】（４４） 配列表の配列番号２１に示され
るヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であ
って、ヌクレオチド番号２４２のヌクレオチドを５'末
端とし、ヌクレオチド番号７９６乃至１０１５のいずれ
か１つのヌクレオチドを３'末端とするヌクレオチド配
列からなるＤＮＡ。

【００６９】（４５） 配列表の配列番号２１に示され
るヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であ
って、ヌクレオチド番号２４２のヌクレオチドを５'末
端とし、ヌクレオチド番号１６５４を３'末端とするヌ
クレオチド配列からなるＤＮＡ。

【００７０】（４６） 配列表の配列番号２３に示され
るヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であ
って、ヌクレオチド番号８６のヌクレオチドを５'末端
とし、ヌクレオチド番号３７３乃至３９４のいずれか１
つのヌクレオチドを３'末端とするヌクレオチド配列か
らなるＤＮＡ。

【００７１】（４７） 配列表の配列番号２３に示され
るヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であ
って、ヌクレオチド番号８６のヌクレオチドを５'末端
とし、ヌクレオチド番号１０４８を３'末端とするヌク
レオチド配列からなるＤＮＡ。

【００７２】（４８） 配列表の配列番号２５のヌクレ
オチド番号１８乃至６６２に示されるヌクレオチド配列
からなるＤＮＡ。

【００７３】（４９） （３５）乃至（４８）のいずれ
か１つに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。

【００７４】（５０） アデノウイルスベクターである
ことを特徴とする、（４９）記載の組換えベクター。

【００７５】（５１） （４９）または（５０）記載の
組換えベクターで形質転換された宿主細胞。

【００７６】（５２） （５１）記載の宿主細胞を培養
し、次いで、該培養物から、哺乳動物の血中の中性脂肪
濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドを回収する
ことを特徴とする、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上
昇させる活性を有するポリペプチドの製造方法。

【００７７】（５３） 下記の工程を含む、高脂血症、
動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以
上の疾患の治療または予防剤の試験方法： １） 非ヒト哺乳動物に、（１８）乃至（３４）に記載
のポリペプチドから選択される１種又は２種以上のポリ
ペプチド、および被験物質を投与する；および ２） 上記１）の動物の血中の中性脂肪濃度を測定す
る。

【００７８】（５４） 下記の工程を含む、高脂血症、
動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以
上の疾患の治療または予防剤の試験方法： １） 非ヒト哺乳動物に、（５０）記載の組換えアデノ
ウイルスベクターを保持するアデノウイルスを感染させ
る； ２） 上記工程１）の動物に被験物質を投与する；およ
び ３） 上記工程２）の動物の血中の中性脂肪濃度を測定
する。

【００７９】（５５） 高脂血症、動脈硬化および高血
糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療また
は予防剤の試験方法であって、リポタンパク質リパーゼ
（以下「ＬＰＬ」という）および／または肝性トリアシ
ルグリセロールリパーゼ（以下「ＨＴＧＬ」という）と
その基質とを反応させる系に、被験物質と共に、配列表
の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示される
アミノ酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル
末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプチド、または
（１８）乃至（３４）記載のポリペプチドを共存させ、
次いで、該ポリペプチドによるＬＰＬおよび／またはＨ
ＴＧＬ活性の阻害作用に対する、被験物質の抑制効果を
調べることを特徴とする方法。

【００８０】（５６） 下記の工程を含む、ＬＰＬ活性
を調節する物質の試験方法： １） 下記の［１］−ａ乃至［３］記載の材料と、被験
物質とを共存させた混合物を調製する：［１］ −ａ ＬＰＬを含む材料；［２］ −ａ ＬＰＬの基質を含む材料；［３］ 配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４
６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そ
のカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプ
チド、または（１８）乃至（３４）記載のポリペプチ
ド； ２） 上記１）の［１］−ａ乃至［３］の材料のみから
なる混合物を、１）とは別個に調製する； ３） 上記１）および２）の混合物において、基質から
遊離された脂肪酸の量をそれぞれ測定し、その測定値を
比較する。

【００８１】（５７） ＬＰＬを含む材料が、哺乳動物
由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とす
る、（５６）記載の方法。

【００８２】（５８） ＬＰＬを含む材料が、げっ歯類
または霊長類動物由来の培養脂肪細胞の培養上清である
ことを特徴とする、（５６）または（５７）に記載の方
法。

【００８３】（５９） ＬＰＬの基質を含む材料が、グ
リセロール・トリオレイン酸であることを特徴とする、
（５６）乃至（５８）のいずれか１つに記載の方法。

【００８４】（６０）下記の工程を含む、ＬＰＬおよび
／またはＨＴＧＬの活性を調節する物質の試験方法： １） 下記の［１］−ｂ乃至［３］記載の材料と、被験
物質とを共存させた混合物を調製する：［１］ −ｂ ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材
料；［２］ −ｂ ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含
む材料；［３］ 配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４
６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ま
たはそのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポ
リペプチドまたは（１８）乃至（３４）記載のポリペプ
チド； ２） 上記１）の［１］−ｂ乃至［３］の材料のみから
なる混合物を、１）とは別個に調製する； ３） 上記１）および２）の混合物において、基質から
遊離された脂肪酸の量を測定し、その測定値を比較す
る。

【００８５】（６１） ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ
を含む材料が、ヘパリンを静注投与した哺乳動物由来の
血漿であることを特徴とする、（６０）記載の方法。

【００８６】（６２） ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ
の基質を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸で
あることを特徴とする、（６０）または（６１）記載の
方法。

【００８７】（６３） ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ
を含む材料が、哺乳動物由来の培養脂肪細胞の培養上清
であるか、またはヘパリンを静注投与した哺乳動物由来
の血漿であることを特徴とする、（５９）記載の方法。

【００８８】（６４） ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ
を含む材料が、げっ歯類または霊長類動物由来の培養脂
肪細胞の培養上清であることを特徴とする、（５９）ま
たは（６３）記載の方法。

【００８９】（６５） ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ
の基質を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸で
あることを特徴とする、（５９）、（６３）または（６
４）のいずれか１つに記載の方法。

【００９０】（６６） 下記の１）乃至３）のいずれか
一つで表されるＤＮＡ： １）配列表の配列番号２７に示されるヌクレオチド配列
において、ヌクレオチド番号１で示されるヌクレオチド
を５'末端とし、ヌクレオチド番号５１０乃至５２６の
いずれか一つで示されるヌクレオチドを３'末端とする
ヌクレオチド配列からなるＤＮＡ； ２）上記１）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、哺乳動物肝臓由来の細胞中におい
てプロモーター活性を有するＤＮＡ； ３）上記１）記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド
配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、哺乳動物
肝臓由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤ
ＮＡ。

【００９１】（６７） 配列表の配列番号２７のヌクレ
オチド番号１から５１０で示されるヌクレオチド配列を
含むＤＮＡ。

【００９２】（６８） 配列表の配列番号２７のヌクレ
オチド番号１から５１０で示されるヌクレオチド配列か
らなるＤＮＡ。

【００９３】（６９） 配列表の配列番号２７のヌクレ
オチド番号１から５２６で示されるヌクレオチド配列か
らなるＤＮＡ。

【００９４】（７０） 下記の１）乃至３）のいずれか
一つで表されるＤＮＡ： １）配列表の配列番号２８に示されるヌクレオチド配列
において、ヌクレオチド番号１で示されるヌクレオチド
を５'末端とし、ヌクレオチド番号１８８乃至２６０の
いずれか一つで示されるヌクレオチドを３'末端とする
ヌクレオチド配列からなるＤＮＡ； ２）上記１）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、哺乳動物由来の細胞中において
プロモーター活性を有するＤＮＡ； ３）上記１）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチ
ド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、哺乳動
物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮ
Ａ。

【００９５】（７１） 配列表の配列番号２８のヌクレ
オチド番号１から１８８で示されるヌクレオチド配列を
含み、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性
を有するＤＮＡ。

【００９６】（７２） 配列表の配列番号２８のヌクレ
オチド番号１から１８８で示されるヌクレオチド配列か
らなるＤＮＡ。

【００９７】（７３） （６６）乃至（７２）のいずれ
か１つに記載のＤＮＡを含む発現ベクター。

【００９８】（７４） 外来遺伝子の上流側に外来遺伝
子配列と同じ転写の方向で（６６）乃至（７２）のいず
れか１つに記載のＤＮＡが連結されており、哺乳動物細
胞中で外来遺伝子を発現させ得る発現ベクター。

【００９９】（７５） 外来遺伝子配列がルシフェラー
ゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質
からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝
子配列であることを特徴とする、（７４）記載の発現ベ
クター。

【０１００】（７６） 外来遺伝子配列がルシフェラー
ゼをコードする遺伝子配列であることを特徴とする、
（７４）記載の発現ベクター。

【０１０１】（７７） 組換えプラスミドｐＧＬ８−３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６２７）。

【０１０２】（７８） 発現ベクターｐＧＬ１１−４。

【０１０３】（７９） （７３）乃至（７８）のいずれ
か１つに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細
胞。

【０１０４】（８０） 下記の工程ｉ）からｉｉｉ）を
含む、被験物質の、高脂血症、動脈硬化および高血糖か
ら選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予
防効果を試験する方法： ｉ）（７３）乃至（７８）のいずれか一つに記載の発現
ベクターで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在
下、または非被存在下で培養する工程； ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、（７３）乃至（７
８）のいずれか一つに記載の発現ベクター中の、外来遺
伝子にコードされているタンパク質の産生量を検出また
は測定する工程； ｉｉｉ）上記ｉｉ）の結果、被験物質の存在下で培養し
た細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間での検
出または測定結果を比較する工程。

【０１０５】（８１） 下記の工程ｉ）およびｉｉ）を
含む、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される
一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有す
るタンパク質をコードするｃＤＮＡを同定する方法： ｉ）［１］（７３）乃至（７８）のいずれか一つに記載
の発現ベクターで形質転換された宿主細胞（以下「細胞
Ａ」という）、［２］細胞Ａを被験ｃＤＮＡが哺乳動物
用発現ベクターに組み込まれた組換えプラスミドで形質
転換することにより該被験ｃＤＮＡを一過性または安定
的に発現する細胞（以下「細胞Ｂ」という）および
［３］細胞Ａを別の組換えプラスミドで形質転換してい
るが、該被験ｃＤＮＡは発現しない細胞（以下「細胞
Ｃ」という）の［１］乃至［３］の細胞からなる群から
選択される細胞を個別に培養する工程； ｉｉ）上記ｉ）の細胞Ａ、細胞Ｂおよび細胞Ｃにおけ
る、（７３）乃至（７８）のいずれか一つに記載の発現
ベクター中の、外来遺伝子にコードされているタンパク
質の発現量を測定し比較する工程。

【０１０６】（８２） 「アンジオポエチン関連タンパ
ク質３」遺伝子プロモーター活性を調節するタンパク質
を検出する方法であって、（６６）乃至（６９）のいず
れか一つに記載のＤＮＡに該タンパク質を含む試料を接
触させ、次いで、該ＤＮＡに結合した該タンパク質を検
出することを特徴とする方法。

【０１０７】（８３） 下記の工程ｉ）およびｉｉ）を
含む、「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子プ
ロモーター活性を調節する活性を有する物質を試験する
方法： ｉ）（６６）乃至（６９）のいずれか一つに記載のＤＮ
Ａを放射標識したものに、マウス細胞の核抽出液および
被験物質を加えたもの、ならびにマウス細胞の核抽出液
のみを加えたものをそれぞれ調製する； ｉｉ）上記ｉ）の各混合物試料を電気泳動し、マウス細
胞の核抽出液のみを加えた試料で見出されるバンドと被
験物質を加えた試料で見出されるバンドの間で移動度を
比較する。

【０１０８】（８４） 配列表の配列番号２７のヌクレ
オチド番号１から５２６で示されるヌクレオチド配列中
の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなるＤＮ
Ａ、そのアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列から
なる核酸またはそれらの誘導体。

【０１０９】（８５） 「アンジオポエチン関連タンパ
ク質４」遺伝子プロモーター活性を調節するタンパク質
を分離する方法であって、（７０）乃至（７２）のいず
れか一つに記載のＤＮＡに該タンパク質を含む試料を接
触させ、次いで、該ＤＮＡに結合した該タンパク質を単
離することを特徴とする方法。

【０１１０】（８６） 下記の工程ｉ）およびｉｉ）を
含む、「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子プ
ロモーター活性を調節する活性を有する物質を試験する
方法： ｉ）（７０）乃至（７２）のいずれか一つに記載のＤＮ
Ａを放射標識したものに、マウス細胞の核抽出液および
被験物質を加えたもの、ならびにマウス細胞の核抽出液
のみを加えたものをそれぞれ調製する； ｉｉ）上記ｉ）の各混合物試料を電気泳動し、マウス細
胞の核抽出液のみを加えた試料で見出されるバンドと被
験物質を加えた試料で見出されるバンドの間で移動度を
比較する。

【０１１１】（８７） 配列表の配列番号２８のヌクレ
オチド番号１から２６０で示されるヌクレオチド配列中
の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなるＤＮ
Ａ、そのアンチセンス配列を含むヌクレオチド配列から
なり、（７０）乃至（７２）のいずれか一つに記載のＤ
ＮＡが有するプロモーター活性を促進または阻害する核
酸またはそれらの誘導体。に関する。

【０１１２】すなわち、本発明は、配列表の配列番号
１、３、１１、１５、１７、１９、２１、２３および２
５に示される、哺乳動物の血液中の中性脂肪濃度の調節
に関与する遺伝子の発現を指標として、被験物質の高脂
血症、動脈硬化および高血糖の治療または予防剤として
の効果を試験する方法、該方法において用いられる核酸
プローブ、プライマーおよび抗体を提供するものであ
る。

【０１１３】本発明者らは、高脂血症の治療または予防
剤の標的遺伝子を探索する目的で、先天的低脂血症マウ
スの遺伝子を高脂血症マウスの遺伝子と比較することに
より、高脂血症の原因遺伝子の染色体上の位置を絞り込
んだ結果、高脂血症マウスで高発現する遺伝子を特定す
ることに成功した。この遺伝子由来のｃＤＮＡは、ホモ
ロジー検索の結果、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに「ア
ンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレ
オチド配列として開示されていたが、本発明者らは、該
ヌクレオチド配列を有する遺伝子を低脂血症マウスに強
制発現させ、あるいは動物細胞で発現させたヒト型組換
えタンパク質を投与することで、血中の中性脂肪の濃度
が上昇することを見出し、該遺伝子がこれまで報告され
ていない新規な機能を有することを確かめた。

【０１１４】さらに、先天的に「アンジオポエチン関連
タンパク質３」遺伝子を正常に発現しないコンジェニッ
クマウスと動脈硬化を発症するアポリポプロテインＥ欠
損マウスとを掛け合わせることで得られたマウスにおい
ては、動脈硬化の進展が抑制されることが確かめられ
た。そこで、該ヌクレオチド配列またはその一部をプロ
ーブもしくはプライマーとして用いた遺伝子発現の検出
系を利用する、動脈硬化治療または予防剤の新規試験方
法を構築することに成功した。また、該ヌクレオチド配
列がコードするポリペプチドに特異的な抗体を調製し、
該抗体を用いて該ポリペプチドの産生量を検出する実験
系を利用する動脈硬化症の治療または予防剤の新規試験
方法を構築することに成功した。

【０１１５】さらに、先天的に「アンジオポエチン関連
タンパク質３」遺伝子を正常に発現しないコンジェニッ
クマウスと動脈硬化を発症するアポリポプロテインＥ欠
損マウスまたはレプチン変異遺伝子を有するマウスを掛
け合わせることで得られたマウスにおいては、高血糖状
態が改善されることを確かめた。そこで、該ヌクレオチ
ド配列またはその一部をプローブもしくはプライマーと
して用いた遺伝子発現の検出系を利用することにより、
高血糖の治療または予防剤の新規試験方法を構築できる
ことを見出した。また、該ヌクレオチド配列がコードす
るポリペプチドに特異的な抗体を調製し、該抗体を用い
て該ポリペプチドの産生量を検出する実験系を利用する
高血糖の治療または予防剤の新規試験方法を構築するこ
とに成功した。

【０１１６】また、本発明者らは、「アンジオポエチン
関連タンパク質」が共通して持っているアミノ末端側の
コイル構造に着目し、「アンジオポエチン関連タンパク
質」、「アンジオポエチン関連タンパク質」のカルボキ
シル末端側フィブリノーゲン様領域を欠いたアミノ末端
領域のみの欠損体ポリペプチドが、哺乳動物において血
中の中性脂肪濃度を上昇させる機能を有することを見出
した。更に、本発明者らは、「アンジオポエチン関連タ
ンパク質」を血中に投与すると、カルボキシル末端側の
フィブリノーゲン様領域が切断され、アミノ末端側のヘ
リックス領域を有するポリペプチドが生成し、このペプ
チドが血中脂肪濃度上昇に関与していることも見出し
た。さらに、本発明者らは、「アンジオポエチン関連タ
ンパク質」または「アンジオポエチン関連タンパク質」
のカルボキシル末端側フィブリノーゲン様領域を欠いた
アミノ末端領域のみの欠損体ポリペプチドを用いて、イ
ン・ビボおよびイン・ビトロにおいて高脂血症、動脈硬
化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾
患の治療または予防剤を試験する方法を確立した。

【０１１７】「アンジオポエチン関連タンパク質」にお
けるヘリックス領域、リンカー領域、フィブリノーゲン
様領域は例えば、三次元結晶構造解析で決めることがで
きるが、コンピュータープログラムを用いて予測するこ
ともできる。このようなプログラムとしては、ＧＣＧ
Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒ．１０．２（ＣＯＩＬ ＳＣＡ
Ｎ）（Lupas, et al., Science 252:1162-1164.1991.）
が知られている。ヘリックス領域にはコイル構造が存在
する。

【０１１８】上記、コンピュータープログラムあるい
は、実験結果によると、「アンジオポエチン関連タンパ
ク質１」では、配列表の配列番号１８のアミノ酸番号１
乃至２１までがシグナルペプチド、２２乃至２０２まで
がコイル構造が含まれているヘリックス領域、２７７乃
至４９１までがフィブリノーゲン様領域であり、「アン
ジオポエチン関連タンパク質２」では、配列表の配列番
号２０のアミノ酸番号１乃至２２までがシグナルペプチ
ド、２３乃至２０６までがコイル構造が含まれているヘ
リックス領域、２７６乃至４９３までがフィブリノーゲ
ン様領域であり、「アンジオポエチン関連タンパク質
３」では、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至１
６までがシグナルペプチド、１７乃至２０７までがコイ
ル構造が含まれているヘリックス領域、２４２乃至４６
０までがフィブリノーゲン様領域であり、「アンジオポ
エチン関連タンパク質４」では、配列表の配列番号１６
のアミノ酸番号１乃至２５までがシグナルペプチド、２
６乃至１４４までがコイル構造が含まれているヘリック
ス領域、１８４乃至４０６までがフィブリノーゲン様領
域であるり、「アンジオポエチン関連タンパク質５」で
は、配列表の配列番号２２のアミノ酸番号１乃至２０ま
でがシグナルペプチド、２１乃至１８５までがコイル構
造が含まれているヘリックス領域、 ２５９乃至４７０
までがフィブリノーゲン様領域であり、「アンジオポエ
チン関連タンパク質６」では、配列表の配列番号２４の
アミノ酸番号１乃至２６までがシグナルペプチド、２７
乃至１２２までがコイル構造が含まれているヘリックス
領域、１３０乃至３４６までがフィブリノーゲン様領域
である。

【０１１９】また、本発明者らは、イン・ビボでの血中
中性脂肪濃度上昇作用を担う「アンジオポエチン関連タ
ンパク質３」のパートナー因子について探索を行った結
果、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬのリパーゼ活性がア
ンジオポエチン関連タンパク質３により阻害されること
を見出した。そして、アンジオポエチン関連タンパク質
３の血中中性脂肪濃度上昇作用を調節する物質をイン・
ビトロで試験するための方法として、このＬＰＬおよび
／またはＨＴＧＬのリパーゼ活性阻害作用を利用する方
法を開発し、本発明を完成させた。

【０１２０】アンジオポエチン関連タンパク質３はＬＰ
Ｌ活性を阻害することから、該タンパク質とＬＰＬとの
相互作用を抑制することにより実質的にＬＰＬ活性を上
昇させる物質を見出せば、新しい作用機序を有する、高
脂血症または動脈硬化の治療または予防に有用な薬剤を
提供することになる。

【０１２１】また、本発明者らは、マウスゲノムにおけ
る「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の転写
開始点と予測される部位（配列表の配列番号２７のヌク
レオチド番号４１９）を「１」として、その５'末端側
上流４１８ヌクレオチドの部位から、３'末端側下流１
０８ヌクレオチド（以下、「−４１８乃至＋１０８」の
ように表記する。配列表の配列番号２７のヌクレオチド
番号１乃至５２６）のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
にルシフェラーゼをコードするＤＮＡを連結したレポー
ター遺伝子をヒトＨｅｐＧ２細胞に導入し、ルシフェラ
ーゼの産生量を測定することにより、「アンジオポエチ
ン関連タンパク質３」遺伝子の「−４１８乃至＋１０
８」領域がプロモーター活性を有することを見出した。
また本発明者らは、ルシフェラーゼ遺伝子に連結するマ
ウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の
５'末端側領域を「＋９３乃至＋１０８」（配列表の配
列番号２７のヌクレオチド番号５１１乃至５２６）に短
縮すると、プロモーター活性が失われることも見いだし
た。本発明者らは、さらに、上記プロモーター活性を有
するＤＮＡを用いることにより、該プロモーター活性を
調節する化合物をスクリーニングできることを見出し
た。

【０１２２】また、本発明者らは、マウスゲノムにおけ
る「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の転写
開始点と予測される部位（配列表の配列番号２８のヌク
レオチド番号９１）を「１」として、その５'末端側上
流９０ヌクレオチドの部位から、３'末端側下流１６９
ヌクレオチド（以下、「−９０乃至＋１７０」のように
表記する。配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１
乃至２６０に相当）のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
にルシフェラーゼをコードするＤＮＡを連結したレポー
ター遺伝子をサル腎細胞ＣＯＳ１に導入し、ルシフェラ
ーゼの産生量を測定することにより、「アンジオポエチ
ン関連タンパク質４」遺伝子の「−９０乃至＋１７０」
領域がプロモーター活性を有することを見出した。また
本発明者らは、ルシフェラーゼ遺伝子に連結するマウス
「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の５'末
端側領域を「＋９９乃至＋１７０」（配列表の配列番号
２８のヌクレオチド番号１８９乃至２６０に相当）に短
縮すると、プロモーター活性が失われることも見出し
た。本発明者らは、さらに、上記プロモーター活性を有
するＤＮＡを用いることにより、該プロモーター活性を
調節する化合物をスクリーニングできることを見出し
た。

【０１２３】本発明のＤＮＡは、哺乳動物肝臓由来の細
胞においてプロモーター活性を有する限り、マウス「ア
ンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の５'末端側
上流域のいかなるヌクレオチド配列を含んでいてもよ
い。好適には、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番
号１乃至５２６に示されるヌクレオチド配列からなるＤ
ＮＡを挙げることができるが、本発明はこれに限定され
ない。

【０１２４】一方、マウス「アンジオポエチン関連タン
パク質３」遺伝子の５'末端側＋９３乃至＋１０８に相
当するヌクレオチド配列（配列表の配列番号２７のヌク
レオチド番号５１１乃至５２６）からなるＤＮＡは、実
質的にプロモーター活性を有さない。したがって、マウ
ス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝子の５'
末端側上流域の−４１８位から＋９２位に相当するヌク
レオチド配列（配列表の配列番号２７のヌクレオチド番
号１乃至５１０）に、プロモーター活性に必須の領域が
含まれると考えられるので、本発明のプロモーターＤＮ
Ａは、好ましくは配列表の配列番号２７のヌクレオチド
番号１乃至５１０で示されるヌクレオチド配列の少なく
とも一部を含む。

【０１２５】また、本発明のＤＮＡは、哺乳動物由来の
細胞においてプロモーター活性を有する限り、マウス
「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝子の５'末
端側上流域のいかなるヌクレオチド配列を含んでいても
よい。好適には、配列表の配列番号２８のヌクレオチド
番号１乃至２６０に示されるヌクレオチド配列からなる
ＤＮＡを挙げることができるが、本発明はこれに限定さ
れない。

【０１２６】一方、マウス「アンジオポエチン関連タン
パク質４」遺伝子の５'末端側＋９９乃至＋１７０に相
当するヌクレオチド配列（配列表の配列番号２８のヌク
レオチド番号１８９乃至２６０に相当）からなるＤＮＡ
は、実質的にプロモーター活性を有さない。したがっ
て、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝
子の５'末端側上流域の−９０位から＋９８位に相当す
るヌクレオチド配列（配列表の配列番号２８のヌクレオ
チド番号１乃至１８８に相当）に、プロモーター活性に
必須の領域が含まれると考えられるので、本発明のプロ
モーターＤＮＡは、より好適には配列表の配列番号２８
のヌクレオチド番号１乃至１８８で示されるヌクレオチ
ド配列を少なくとも一部に含む。

【０１２７】本発明において、「ストリンジェントな条
件でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼ
ーション溶液ExpressHyb Hybridization Solution（ク
ロンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズするこ
と、またはそれと同等の条件でハイブリダイズすること
をいう。

【０１２８】

【発明の実施の形態】Ｉ． 遺伝子の発現を指標とする
方法 本発明の一つの方法は、具体的には例えば、配列表の配
列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に示され
るヌクレオチド配列、配列表の配列番号３のヌクレオチ
ド番号７８から１４５７に示されるヌクレオチド配列、
配列表の配列番号１５のヌクレオチド番号１７３から１
３９０に示されるヌクレオチド配列、配列表の配列番号
１７のヌクレオチド番号４３４から１９０９に示される
ヌクレオチド配列、配列表の配列番号１９のヌクレオチ
ド番号２２から１５００に示されるヌクレオチド配列、
配列表の配列番号２１のヌクレオチド番号２４２から１
６５２に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列
番号２３のヌクレオチド番号８から１０４５に示される
ヌクレオチド配列を有する遺伝子、またはそれらがコー
ドするポリペプチドと同じく血中資質濃度を上昇させる
活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現
を、当該核酸（ｍＲＮＡ）または当該ポリペプチドの特
異的検出によって測定し、該遺伝子の発現量を低下させ
るような被験物質を高脂血症、動脈硬化および高血糖か
ら選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予
防剤の候補物質として選択するものである。以下、核酸
の検出を行う態様とポリペプチドの検出を行う態様とに
分けて説明する。

【０１２９】（Ａ）核酸の検出 １）プローブ 核酸の検出を行う態様のうち、核酸ハイブリダイゼーシ
ョンを利用する方法において用いられるプローブは、Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡであって、そのヌクレオチド配列は、
下記ａ）乃至ｅ）： ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１
４１１に示されるヌクレオチド配列； ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８から１
４５７に示されるヌクレオチド配列； ｃ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＢＫ／ｍ５５−１
ＳＡＮＫ ７２１９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４０）
が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡ断片が有
するヌクレオチド配列； ｄ）形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５
−１ ＳＡＮＫ ７２２９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４
１）が保持するファージミド中に挿入されたＤＮＡ断片
が有するヌクレオチド配列； ｅ）上記ａ）乃至ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオ
チド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチド
とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、血中の
中性脂肪濃度を上昇させる活性を有するポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列； のいずれか一つ（ただし、配列中のtはuに読み替える）
のヌクレオチド配列であればよく、例えば、上記ａ）乃
至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のアン
チセンス配列を有するポリヌクレオチド、該アンチセン
ス配列中の連続した少なくとも１５ヌクレオチドからな
る部分配列を有するポリヌクレオチド、または該アンチ
センス配列の改変体等、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一
つに記載のヌクレオチド配列を有するポリリボヌクレオ
チドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするこ
とにより該ポリリボヌクレオチドを特異的に検出するこ
とが可能なものは全て本発明の方法に用いられ得る。そ
れらのうち、上記ａ）記載のヌクレオチド配列のアンチ
センス配列を有するポリヌクレオチドは、例えばマウス
肝臓由来のｃＤＮＡライブラリーから配列表の配列番号
１に示すヌクレオチド配列情報に基づいて、周知の方
法、例えばプラークハイブリダイゼーション法、コロニ
ーハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法等によりク
ローニングしたｃＤＮＡクローンを、周知の方法で直接
標識するか、または該ｃＤＮＡクローンを鋳型としたポ
リメラーゼ反応による複製または転写反応において標識
することにより、標識プローブとして得ることができ
る。また、上記ｂ）記載のヌクレオチド配列のアンチセ
ンス配列を有するポリヌクレオチドは、例えばヒト肝臓
由来のｃＤＮＡライブラリーから配列表の配列番号３に
示すヌクレオチド配列情報に基づいて、同様の操作を行
うことによりクローニングしたｃＤＮＡクローンから標
識プローブを得ることができる。一方、上記ｃ）または
ｄ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列を有す
るポリヌクレオチドは、工業技術院生命工学工業技術研
究所（現 独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物
寄託センター）に平成１１年１１月１９日付で国際寄託
され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４０またはＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６９４１が付されている形質転換大腸菌株
Ｅ．ｃｏｌｉｐＢＫ／ｍ５５−１ ＳＡＮＫ ７２１９
９株またはＥ．ｃｏｌｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１ Ｓ
ＡＮＫ ７２２９９株が保持する組換えファージミドか
ら得ることができる。

【０１３０】さらに、上記ｅ）記載のヌクレオチド配列
のアンチセンス配列を有するポリヌクレオチドは、例え
ば上記のようにして得られる上記ａ）乃至ｄ）記載のヌ
クレオチド配列のアンチセンス配列を有するポリヌクレ
オチドをプローブとして、任意の哺乳動物（好ましくは
肝臓）由来のｃＤＮＡライブラリーについてプラークハ
イブリダイゼーション法やコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法によるクローニングを行って単離したｃＤＮＡク
ローンから得ることができる。

【０１３１】さらにまた、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか
一つに記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列中の
連続した少なくとも１５ヌクレオチドからなる部分配列
を有するポリヌクレオチドは、数十ヌクレオチド程度の
ものであれば化学合成によって得ることが可能である。
またあるいは、上記のようにして得られる上記ａ）乃至
ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する
ｃＤＮＡクローン中の任意の部分配列を、例えばＰＣＲ
等によってサブクローニングしてから、上記と同様の手
法でアンチセンス配列を有するプローブとして調製する
こともできる。

【０１３２】例えば、配列表の配列番号１記載のヌクレ
オチド配列のアンチセンス配列中の連続した数十ヌクレ
オチドからなる部分配列において、数ヌクレオチドが付
加、欠失および／または付加されたようなヌクレオチド
配列からなるポリヌクレオチドであっても、上記ａ）乃
至ｅ）のいずれか一つに記載のポリリボヌクレオチドと
ストリンジェントな条件でハイブリダイズする限り、本
発明の方法に用いられ得る。そのようなポリヌクレオチ
ドは、化学合成法や、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「Ｐ
ＣＲ」という）等の酵素反応を利用した本発明の属する
技術分野における周知の変異導入法を用いて作製するこ
とが可能である。

【０１３３】また、本発明の方法において用いられるプ
ローブは単一のヌクレオチド配列からなるものに限定さ
れない。すなわち本発明の方法においては、例えば上記
の要件を満足する複数種類のヌクレオチド配列の混合物
をプローブとして用いるか、またははそれら複数種類の
ヌクレオチド配列をそれぞれ個別に用いた多重検出を行
ってもよい。

【０１３４】２）ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー 本発明における、核酸の検出を行うもう一つの態様は、
まずｍＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素反応を行ってか
ら、ＰＣＲを実施して特異的にＤＮＡ断片を増幅する、
いわゆるＲＴ−ＰＣＲを行う方法である。この方法にお
いて、目的のヌクレオチド配列を特異的に増幅するため
には、目的のｍＲＮＡの特定の部分配列に相補的なアン
チセンスプライマーと、該アンチセンスプライマーから
逆転写酵素により生成されるｃＤＮＡの配列中の特定の
部分配列に相補的なセンスプライマーが用いられる。

【０１３５】逆転写酵素反応およびＰＣＲの両方に用い
られるアンチセンスプライマーは、実質的に上記ａ）乃
至ｅ）記載のヌクレオチド配列のアンチセンス配列中
の、連続した少なくとも１８ヌクレオチド、好ましくは
少なくとも２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列からな
る。

【０１３６】一方、ＰＣＲにおいて用いられるセンスプ
ライマーの配列は、上記ａ）乃至ｅ）記載のヌクレオチ
ド配列において、上記アンチセンスプライマーの相補鎖
にあたる配列中の最も５'末端側の位置よりもさらに５'
末端側領域に存在する配列中の連続した少なくとも１８
ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２１ヌクレオチド
の任意の部分配列からなる。ただし、センスプライマー
とアンチセンスプライマーに互いに相補的な配列が存在
すると、プライマー同士がアニーリングすることにより
非特異的な配列が増幅され、特異的な遺伝子検出の妨げ
となるおそれがあるので、そのような組み合わせを避け
たプライマーの設計を行うことが好ましい。

【０１３７】これらアンチセンスプライマーおよびセン
スプライマーには、いずれも上記で規定したそれらヌク
レオチド配列の５'末端に、上記ａ）乃至ｅ）記載のヌ
クレオチド配列とは無関係のヌクレオチド配列がリンカ
ーとして付加されていてもよい。ただし、特異的な遺伝
子検出の妨げとならないよう、該リンカーは反応中に反
応液内の核酸と非特異的アニーリングを起こさないよう
なものであることが好ましい。

【０１３８】３）遺伝子発現を検出する細胞または動物 次に、本発明の方法において用いられる培養細胞は、上
記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配
列を有する遺伝子を発現する哺乳動物細胞であればよ
い。好ましくは哺乳動物肝臓由来の培養細胞（好ましく
は、初代培養肝細胞）であるが、例えば上記ａ）乃至
ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する
遺伝子をそのプロモーター領域とともに導入した細胞な
ど、人為的に形質転換された細胞（例えば、ＣＨＯ細
胞）も使用することが可能である。哺乳動物種として
は、ヒト、マウス、ラットまたはハムスターが好まし
く、ヒトまたはマウスがより好ましく、さらに、好まし
い細胞としては高脂血症マウスであるＫＫマウス（日本
クレア社より入手可能）の初代培養肝細胞を挙げること
ができるが、これらに限定されない。また、培養細胞を
用いるよりも好適と判断される場合には、哺乳動物個体
に被験物質を投与して、その後該動物個体から摘出され
たその臓器または組織細胞における上記ａ）乃至ｅ）の
いずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子
の発現を検出する方法も採用し得る。その際、遺伝子発
現の検出対象となる臓器または組織は、上記ａ）乃至
ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する
遺伝子を発現するものであればよいが、好ましくは肝臓
である。この実施態様における好ましい哺乳動物種はヒ
ト、マウス、ラットまたはハムスターが好ましく、ヒト
またはマウスがより好ましい。例えばマウスとしては前
記ＫＫマウスが好ましく用いられるが、本発明はこれに
限定されない。

【０１３９】本発明の方法において用いられる培養細胞
は、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオ
チド配列を有する遺伝子を発現可能な条件（ただし被験
物質を添加しない場合）であれば、いかなる条件で培養
してもよい。例えば、該培養細胞について確立された培
養条件が知られており、該条件下において該細胞が上記
ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列
を有する遺伝子を発現する場合は、該条件で培養してよ
い。

【０１４０】４）被験物質の添加 上記細胞の培養中、被験物質を培養培地に添加し一定期
間培養する。被験物質としては、化合物、微生物の代謝
産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体または
それらの混合物等が挙げられる。また、上記ａ）乃至
ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する
遺伝子の発現を抑制するように設計された核酸またはそ
の誘導体（アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、Ｒ
ＮＡｉ等を含む）を、被験物質として使用することも可
能である。被験物質の投与量や濃度は適宜設定するか、
または例えば希釈系列を作成するなどして複数種の投与
量を設定してもよい。被験物質存在下で培養する期間も
適宜設定してよいが、好ましくは３０分乃至２４時間で
ある。哺乳動物個体に被験物質を投与する場合は、被験
物質の物性等により経口投与、静脈注射、腹腔内注射、
経皮投与、皮下注射等の投与形態を使い分ける。

【０１４１】５）試料の調製 上記のようにして培養した細胞からＲＮＡを抽出するに
際しては、培養終了後直ちに細胞をＲＮＡ抽出用の溶媒
（例えばフェノール等リボヌクレアーゼを不活性化する
作用を有する成分を含むもの）で直接溶解するのが好ま
しい。または、細胞を破壊しないように、スクレーパー
で慎重に掻きとるか、もしくはトリプシン等のタンパク
質タンパク質分解酵素を用いて穏やかに培養基材から分
離させるなどの方法により、細胞を回収した後、速やか
にＲＮＡ抽出工程に移行する。

【０１４２】ＲＮＡの抽出方法としては、チオシアン酸
グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グア
ニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性
チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法
（Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Bio
chem., 162, 156-159）などを採用しうるが、酸性チオ
シアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好
適である。

【０１４３】得られたＲＮＡからさらにｍＲＮＡを精製
する方法は以下に説明する通りである。すなわち、真核
細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３'末
端にポリ（Ａ）配列を持つことが知られているので、こ
の特徴を利用して例えばビオチン化したオリゴ（ｄＴ）
プローブにｍＲＮＡを吸着させ、さらにストレプトアビ
ジンを固定化した常磁性粒子に、ビオチン／ストレプト
アビジン間の結合を利用してｍＲＮＡを捕捉し洗浄操作
の後、ｍＲＮＡを溶出することにより、ｍＲＮＡを精製
することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカ
ラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出して精製
する方法も採用し得る。さらにショ糖密度勾配遠心法な
どにより、ｍＲＮＡをさらに分画することもできる。た
だし、本発明の方法のためには、これらｍＲＮＡの精製
工程は必須ではなく、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つ
に記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現の検出
が可能である限りにおいて、全ＲＮＡをその後の工程に
用いることもできる。

【０１４４】６）試料の固相化 核酸ハイブリダイゼーションによる検出を行う場合、上
記のようにして得られたＲＮＡ試料中の遺伝子を特異的
に検出するため、該ＲＮＡ試料をアガロース電気泳動を
経てハイブリダイゼーション実験用メンブレン（以下単
に「メンブレン」という）に転写する（ノーザンブロッ
ト法）か、または直接メンブレンに試料を染み込ませ
る、いわゆるドットブロット法やスロットブロット法に
より、メンブレンに固相化する。このメンブレンとして
は、ニトロセルロースメンブレン（例えば、ハイボンド
−Ｃピュア（アマシャム・ファルマシア社製）等）、ポ
ジティブチャージ・ナイロンメンブレン（例えば、ハイ
ボンド−Ｎ＋アマシャム・ファルマシア社製）等）また
は親水性ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−Ｎ
／ＮＸ（アマシャム・ファルマシア社製）等）等が用い
られる。

【０１４５】ノーザンブロット用のアガロース電気泳動
方法としては、アガロースホルムアミドゲル電気泳動
法、試料をグリオキサールとジメチルスルホキシドで処
理し、変性させた後、リン酸緩衝液で作製したアガロー
スゲルで泳動させる方法およびアガロースゲルメチル水
銀電気泳動法（以上Maniatis, T. et al. (1982) in "M
olecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring
Harbor Laboratory, NY.）等を挙げることができるが、
これらに限定されない。

【０１４６】電気泳動後のゲルからメンブレンにＲＮＡ
を移す、いわゆるブロッティング方法としては、キャピ
ラリートランスファー法（Maniatis, T. et al. (1982)
in"Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Sp
ring Harbor Laboratory, NY.）、バキューム法、電気
泳動法（Maniatis, T. et al. (1989) in "MolecularCl
oning A Laboratory Manual、２nd ed" Cold Spring Ha
rbor Laboratory, NY.）等を挙げることができる。ドッ
トブロット法やスロットブロット法のための器材も市販
されている（例えば、バイオドット（バイオラッド社
製）等）。

【０１４７】ブロッティング終了後、メンブレンに移し
取られたＲＮＡをメンブレンに固定する操作を行う（こ
の操作はメンブレンの材質によって異なり、製品によっ
ては固定操作不要の場合もある）。

【０１４８】７）プローブの標識 核酸ハイブリダイゼーションによる検出を行うにあた
り、上記のようにして固相化させたＲＮＡ試料中の特定
のｍＲＮＡを検出するためのプローブの標識方法と検出
方法について以下に述べる： ｉ）放射性同位元素標識 ＤＮＡ断片またはそれを保持するベクター等を材料乃至
鋳型として、ニックトランスレーション法（例えば、ニ
ックトランスレーションキット（アマシャム・ファルマ
シア社製）等を使用）、ランダムプライム法（例えば、
マルチプライムＤＮＡラベリングシステム（アマシャム
・ファルマシア社製）等を使用）、末端標識法（例え
ば、メガラベル（宝酒造（株）社製）、３'−末端ラベ
リングキット（アマシャム・ファルマシア社製）等を使
用）で標識ＤＮＡプローブを調製するか、あるいは鋳型
となるＤＮＡをサブクローニングしたベクター中のＳＰ
６プロモーターやＴ７プロモーターを利用したイン・ビ
トロ転写法により標識ＲＮＡプローブを調製する。これ
らプローブの検出はＸ線フィルムまたはイメージングプ
レートを用いたオートラジオグラフィーにより行うこと
ができ、さらにＸ線フィルムの場合はデンシトメトリー
（例えば、ＧＳ−７００イメージイングデンシトメータ
ー（バイオラッド社製）を使用）を、イメージングプレ
ートの場合はＢＡＳ２０００ＩＩ（富士フィルム製）シ
ステムをそれぞれ用いた定量も可能である。

【０１４９】ｉｉ）酵素標識 ＤＮＡあるいはＲＮＡ断片を直接酵素標識する。標識に
用いられる酵素は例えば、アルカリホスファターゼ（Al
kPhos Direct system for chemiluminescence（アマシ
ャム・ファルマシア社製）等を使用）、西洋ワサビペル
オキシダーゼ（Horseradish Peroxidase）（ＥＣＬダイ
レクト・ヌクレイック・アッシド・ラベリング・アンド
・ディテクション・システム（アマシャム・ファルマシ
ア社製）等を使用）を挙げることができる。プローブの
検出は、標識した酵素の触媒反応が検出可能になるよう
な基質、例えば該触媒反応により発色物質を生成した
り、発光するような基質を含む酵素反応緩衝液にメンブ
レンを浸すことにより行う。発色基質を用いた場合は目
視により検出することができ、発光基質を用いた場合は
放射性同位元素標識の場合と同様にＸ線フィルムまたは
イメージングプレートを用いたオートラジオグラフィー
やインスタントカメラを用いた写真撮影により検出する
ことができる。さらに、発光基質を用いた場合は、デン
シトメトリーやＢＡＳ２０００ＩＩシステムを利用した
定量も可能である。

【０１５０】ｉｉｉ）その他分子による標識 フルオレセイン標識： ＤＮＡ断片にニックトランスレ
ーション法、ランダムプライム法、または３'末端標識
法（アマシャム・ファルマシア社より市販されているＥ
ＣＬ ３'−オリゴラベリングシステムなど）で標識す
る。あるいはＳＰ６、Ｔ７プロモーターによるイン・ビ
トロ転写によりＲＮＡに標識する；ビオチン標識： Ｄ
ＮＡの５'末端を標識（アマシャム・ファルマシア社よ
り市販されているオリゴヌクレオチド・ビオチン・ラベ
リングキットなど使用）するか、またはＤＮＡ断片にニ
ックトランスレーション法、ランダムプライム法などで
標識する。

【０１５１】ジゴキシゲニン修飾ｄＵＴＰ標識： ＤＮ
Ａ断片にニックトランスレーション法、ランダムプライ
ム法などで標識する。

【０１５２】これら標識分子の検出は、いずれの場合
も、標識された分子に特異的に結合する分子を放射性同
位元素や酵素で標識したものをプローブに結合させる操
作を含む。特異的に結合する分子とは、例えばフルオレ
セインやジゴキシゲニンの場合は抗フルオレセイン抗体
や抗ジゴキシゲニン抗体であり、ビオチンの場合はアビ
ジンまたはストレプトアビジンである。これらをプロー
ブに結合させた以降は、その標識された放射性同位元素
や酵素により上記ｉ）またはｉｉ）記載と同様の方法に
したがって検出を行うことができる。

【０１５３】８）ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションは、本発明が属する技術分野に
おいて周知の方法で行われ得る。本発明におけるハイブ
リダイゼーション溶液または洗浄液の組成と、ハイブリ
ダイゼーション温度または洗浄温度の関係については、
例えば文献（バイオ実験イラストレイテッド４、ｐ１４
８、秀潤社刊）の記載に従うことができるが、好ましい
条件は以下の通りである：ハイブリダイゼーション溶
液： ExpressHyb Hybridization Solution（クロンテ
ック社製）； プローブの終濃度（放射標識プローブの場合）： １乃
至２×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌ（好ましくは、２×１０⁶ｃｐ
ｍ／ｍｌ）； ハイブリダイゼーション温度および時間： ６８℃、１
乃至２４時間。

【０１５４】メンブレンの洗浄条件： ｉ） ０．１乃至５×ＳＳＣ（最も好ましくは２×ＳＳ
Ｃ）、０．０５乃至０．１％ ＳＤＳ（最も好ましくは
０．０５％）ドデシル硫酸ナトリウム（以下「ＳＤＳ」
という）中、室温乃至４２℃（最も好ましくは室温）で
２０乃至６０分間（最も好ましくは２０分間）振盪する
操作を、洗浄液を交換して２乃至６回（最も好適には３
回）行う； ｉｉ） 上記ｉ）の後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ Ｓ
ＤＳ中、５０乃至６５℃で、２０乃至６０分間振盪する
操作を、洗浄液を交換して２乃至６回行う。または、
０．２乃至０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、６２
乃至６５℃で、２０乃至６０分間振盪する操作を、洗浄
液を交換して２乃至６回行う。最も好適には、０．１×
ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、５０℃で、２０分間振盪
する操作を、洗浄液を交換して３回行う。

【０１５５】洗浄終了後、上記７）に記載したように、
プローブの標識法に合わせた検出・定量を行う。また、
細胞あたりの発現量が安定していることが知られている
遺伝子（例えば、２３ｋＤａ高塩基性タンパク質、α−
チューブリン、グリセルアルデヒド−３−デヒドロゲナ
ーゼ、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ、ホスホリパーゼＡ２、リボゾーマルタ
ンパク質Ｓ９、ユビキチン等の遺伝子発現を検出するた
めのプローブが市販されている）の各試料における発現
量を、各試料間のＲＮＡ量の差等に起因するばらつきを
補正する目的で同時に測定しておき、この安定的発現遺
伝子の発現量を基準とした、検出対象遺伝子発現量の相
対値を、被験物質を投与した細胞群と投与しなかった細
胞群との間で比較することにより、より精密な評価を行
うことができる。

【０１５６】その結果、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一
つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量を
低下させる被験物質は、高脂血症、動脈硬化および高血
糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療また
は予防剤となり得る。

【０１５７】９）ＲＴ−ＰＣＲ反応 ＲＴ−ＰＣＲによって核酸の検出を行う態様における、
各反応の条件は以下に記載する通りである。なお、ＲＴ
−ＰＣＲによる検出のための試料は、通常ポリ（Ａ）⁺
ＲＮＡにまで精製されている必要はない。

【０１５８】ｉ）逆転写酵素反応 反応液組成の例（全量２０μｌ）： 全ＲＮＡ 適宜； 塩化マグネシウム ２．５乃至５ｍＭ（好ましくは５ｍ
Ｍ）； １×ＲＮＡ ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ トリス−塩酸
（２５℃におけるｐＨ８．３乃至９．０（好ましくは
８．３））、５０ｍＭ 塩化カリウム）； ｄＮＴＰｓ ０．５乃至１ｍＭ（好ましくは１ｍＭ）； アンチセンスプライマー １μＭ （アンチセンスプラ
イマーの代用として、市販のランダムプライマーやオリ
ゴ（ｄＴ）プライマー（１２−２０ヌクレオチド）を
２．５μＭ添加することもできる）； 逆転写酵素 ０．２５乃至１単位／μｌ（好ましくは
０．２５単位／μｌ）； 滅菌水で２０μｌに調整する。

【０１５９】反応温度条件： ３０℃で１０分間保温（ランダムプライマー使用時の
み）した後、４２乃至６０℃（好ましくは４２℃）で１
５乃至３０分間（好ましくは３０分間）保温し、さらに
９９℃で５分間加熱して酵素を失活させてから、４乃至
５℃（好ましくは５℃）で５分間冷却する。

【０１６０】ｉｉ）ＰＣＲ 反応液組成の例： 塩化マグネシウム ２乃至２．５ｍＭ（好ましくは２．
５ｍＭ）； １×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ トリス−塩酸（２５℃に
おけるｐＨ８．３乃至９．０（好ましくは８．３））、
５０ｍＭ 塩化カリウム； ｄＮＴＰｓ ０．２乃至０．２５ｍＭ（好ましくは０．
２５ｍＭ）； アンチセンスプライマーおよびセンスプライマー ０．
２乃至０．５μＭ（好ましくは０．２μＭ）； Ｔａｑポリメラーゼ １乃至２．５単位（好ましくは
２．５単位）； 滅菌水を加えて全量を８０μｌに調整し、その全量を、
逆転写反応を終了した反応液全量に加えてからＰＣＲを
開始する。

【０１６１】反応温度条件： まず９４℃で２分間加熱
した後、９０乃至９５℃（好ましくは９４℃）で３０秒
間、４０乃至６０℃（好ましくは、プライマーの特性か
ら算出される解離温度（Ｔｍ）からそれより２０度低い
温度までの範囲内で３０秒間、７０乃至７５℃（好まし
くは７２℃）で１．５分間の温度サイクルを２８乃至５
０サイクル（好ましくは２８サイクル）繰り返してか
ら、４℃に冷却する。

【０１６２】ＰＣＲ終了後、反応液を電気泳動し、目的
の大きさのバンドが増幅されているか否かを検出する。
定量的検出を行うためには、予め段階希釈したｃＤＮＡ
クローンを標準の鋳型ＤＮＡとして同条件でＰＣＲを実
施し、定量的検出が可能な温度サイクル数を定めておく
か、または、例えば５サイクルごとに一部反応液をサン
プリングしてそれぞれ電気泳動を行う。また例えばＰＣ
Ｒ反応時に放射標識ｄＣＴＰを用いることにより、バン
ド中に取り込まれた放射能の量を指標に定量を行うこと
もできる。

【０１６３】被験物質存在下で培養した細胞由来の試料
と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料との間
で検出結果を比較し、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つ
に記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の発現量を低
下させた被験物質は高脂血症、動脈硬化および高血糖か
ら選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予
防剤となり得る。

【０１６４】１０）その他の方法 上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド
配列を有する遺伝子の発現量を測定する他の方法として
は、以下に記載するものを挙げることができる。

【０１６５】ｉ）リボヌクレアーゼ保護アッセイ（RNas
e protection assay）： ＲＮＡ試料中の、上記ａ）乃
至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有す
るｍＲＮＡ（ただし配列中のtはuに読み替える）のみに
標識プローブをハイブリダイズさせ、二本鎖ポリヌクレ
オチドを形成させておいてから、試料にリボヌクレアー
ゼを添加してインキュベーションすると、プローブがハ
イブリダイズしたｍＲＮＡは二本鎖を形成していること
によってリボヌクレアーゼによる消化を免れ、それ以外
のＲＮＡは消化されるので、該二本鎖ポリヌクレオチド
のみが残る（検出されるｍＲＮＡよりプローブが短けれ
ば、プローブの鎖長に相当する二本鎖ポリヌクレオチド
が残る）。この二本鎖ポリヌクレオチドを定量すること
により、目的の遺伝子の発現量を測定する。具体的に
は、例えば以下に記載する方法に従う。

【０１６６】二本鎖を形成せずに余った標識プローブを
二本鎖ポリヌクレオチドと確実に分離して定量を容易に
するために、余った標識プローブはリボヌクレアーゼに
消化されることが好ましいが、リボヌクレアーゼとして
一本鎖ＤＮＡも消化できるようなものを使用すれば、標
識プローブはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。標識プローブ
の調製方法は上記１）および７）の記載に準ずるが、こ
の方法において用いられるプローブの長さは５０乃至５
００ヌクレオチド程度が好ましい。

【０１６７】ＲＮＡプローブは、例えば下記の方法に従
って調製される。まず鋳型ＤＮＡをバクテリオファージ
のプロモーター（Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３プロモーター等）
を有するプラスミドベクター（例えばｐＧＥＭ−Ｔ（プ
ロメガ社製）など）に挿入する。次にこの組換えプラス
ミドベクターを、制限酵素で、挿入断片のすぐ下流で一
ヶ所だけ切断されるように消化する。得られた直鎖ＤＮ
Ａを鋳型として、放射能標識されたリボヌクレオチド存
在下で、イン・ビトロ転写反応を行う。この反応には、
ベクター中のプロモーターに合わせてＴ７、ＳＰ６、ま
たはＴ３ポリメラーゼ等の酵素を用いる。以上の操作は
例えばリボプローブシステム−Ｔ７、同−ＳＰ６または
同−Ｔ３（いずれもプロメガ社製）を用いて行うことが
できる。

【０１６８】ＲＮＡ試料を調製するまでの工程は上記
３）乃至５）記載の通りである。調製された全ＲＮＡ試
料１０乃至２０μｇ相当分と、５×１０⁵ｃｐｍ相当の
過剰量の標識プローブとを用いてリボヌクレアーゼ保護
アッセイを行う。この操作は市販のキット（HybSpeed R
PA Kit、アンビオン社製）を用いて行うことができる。
得られたリボヌクレアーゼ消化後の試料を、８Ｍ 尿素
を含む４乃至１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動
した後、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムでオートラジオ
グラフィーを行う。以上の操作により、リボヌクレアー
ゼ消化を免れた二本鎖ポリヌクレオチドのバンドを検出
することができ、またその定量は上記７）のｉ）記載の
方法に従って実施することができる。さらに、ノーザン
ブロット解析の場合と同様、各試料間のＲＮＡ量の差等
に起因するばらつきを補正する目的で、β−アクチン遺
伝子の発現量を同時に測定しておけば、より精密な評価
を行うことができる。

【０１６９】このようにして、被験物質存在下で培養し
た細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞
由来の試料との間で検出結果を比較し、上記ａ）乃至
ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する
遺伝子の発現量を低下させた被験物質は高脂血症、動脈
硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の
疾患の治療または予防剤となり得る。

【０１７０】ｉｉ）ランオン・アッセイ（Run-on assa
y、Greenberg, M. E. and Ziff, E.B. (1984) Nature 3
11, 433-438,およびGroudine, M. et al. (1981) Mol.
CellBiol. 1, 281-288参照）： 本方法は、細胞から核
を単離して目的の遺伝子の転写活性を測定する方法であ
り、これまでに述べたような細胞内のｍＲＮＡを検出す
る方法ではないが、本発明においては「遺伝子の発現量
を検出する方法」に包含される。単離された細胞核を用
いて、試験管内で転写反応を行わせると、核を単離する
前に既に転写が開始されｍＲＮＡ鎖が生成されている途
中のものが伸長していく反応のみが進行する。この反応
時に放射標識したリボヌクレオチドを添加して、伸長し
ていくｍＲＮＡを標識しておき、その中に含まれる、非
標識プローブにハイブリダイズするｍＲＮＡを検出する
ことにより、核を単離した時点における目的の遺伝子の
転写活性を測定することができる。被験物質の影響が最
も顕著に現れる時間のデータを判定に用いるため、培養
細胞に被験物質を添加してから核を単離するまでの時間
について、例えば添加３０分後、１時間後、２時間後、
４時間後、８時間後および２４時間後の細胞から核を単
離してそれぞれアッセイを行うなどの方法をとることが
できる。なお具体的操作方法は、プローブを上記１）の
記載に準じて標識しないものを調製する他は、上記参照
文献の記載に準ずる。このようにして、被験物質存在下
で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養
した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、上記
ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列
を有する遺伝子の転写活性を低下させた被験物質は高脂
血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは
二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。

【０１７１】ｉｉｉ）ＤＮＡチップ解析、ＤＮＡマイク
ロアレイ解析 ［１］プローブ取得用試料の調製 まず、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被
験物質非存在下で培養した細胞由来の試料のｍＲＮＡを
抽出精製する。ＲＮＡ試料を調製するまでの工程は上記
３）乃至５）記載の通りである。

【０１７２】［２］プローブの標識 ＤＮＡチップ解析またはＤＮＡマイクロアレイ解析用の
プローブを作製するための出発材料としては、精製して
いない全ＲＮＡを用いることもできるが、上記５）に記
載された方法で精製されたポリ（Ａ）⁺ＲＮＡであるこ
とがより好ましい。

【０１７３】核酸ハイブリダイゼーションによる検出を
行うにあたり、プローブの標識方法と検出方法について
以下に述べる。

【０１７４】アフィメトリクス社製ＤＮＡチップを用い
る解析のためのプローブ： アフィメトリクス社製ＤＮ
Ａチップに添付されたプロトコールに従い、ビオチン標
識したｃＲＮＡプローブを用いる。

【０１７５】ＤＮＡマイクロアレイを用いる解析用のた
めのプローブ： 逆転写酵素反応でポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ
からｃＤＮＡを作製する際に、蛍光色素（例えばＣｙ
３、Ｃｙ５など）で標識されたｄ−ＵＴＰなどを加えて
おくことによりｃＤＮＡを蛍光標識する。このとき、被
験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非
存在下で培養した細胞由来の試料をそれぞれ異なる色素
で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時には
両者を混合して用いることができる。 メンブレンフィ
ルターを用いる解析のためのプローブ： 逆転写酵素反
応でポリ（Ａ）⁺ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、
放射性同位元素（例えば³²Ｐ、³³Ｐ）で標識されたｄ−
ＣＴＰなどを加えておくことによりプローブを標識す
る。

【０１７６】［３］固相化試料 上記工程［２］で得られた標識プローブとハイブリダイ
ズさせるための固相化試料としては、以下のようなもの
を挙げることができる。

【０１７７】データベース上のＥＳＴ（expressed sequ
ence tag）配列またはｍＲＮＡ配列をもとに合成したア
ンチセンスオリゴヌクレオチドが固相化された遺伝子チ
ップ（アフィメトリクス社製）（Lipshutz, R. J. et a
l. (1999) Nature genet. 21, suppliment、20-24）：
上記ＥＳＴ配列またはｍＲＮＡ配列は、プローブの調製
に用いた細胞と同種の動物由来のものであることが最も
好ましいが、それに限定されない。ただし、前述ａ）乃
至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有す
る遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース上に「アンジオ
ポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド
配列として公開されている遺伝子、またはそれらのいず
れか一つの部分配列を含む配列が固相化されているもの
を用いる。

【０１７８】プローブ調製に用いた細胞と同種乃至近縁
の動物の臓器組織（好ましくは肝臓）、もしくは該臓器
組織から単離または株化された細胞から得られたｍＲＮ
Ａより作製されたｃＤＮＡ乃至ＲＴ−ＰＣＲ産物が固相
化されたＤＮＡマイクロアレイまたはメンブレンフィル
ター：これらｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物は、例え
ばｍＲＮＡの材料とした動物のＥＳＴデータベース等の
配列情報をもとに作製されたプライマーで逆転写酵素反
応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたもの
である。試料調製のための材料としては、前述ａ）乃至
ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する
遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース上に「アンジオポ
エチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオチド配
列として公開されている遺伝子を発現している細胞（好
ましくは肝臓由来）を用いる。このｃＤＮＡやＲＴ−Ｐ
ＣＲ産物としては、予め発現量の異なるｍＲＮＡを、サ
ブトラクション法（Diatchenko,L. et al. (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 6025-6030）、ディフ
ァレンシャルディスプレイ法（Kato, K. (1995) Nuclei
c Acids Res. 23, 3685-3690）等を利用して選択しなが
ら作製されたものも含む。また、ＤＮＡマイクロアレイ
やフィルターは、検出対象となる遺伝子、すなわちＧｅ
ｎｂａｎｋデータベース上に「アンジオポエチン関連タ
ンパク質３」をコードするヌクレオチド配列として公開
されている遺伝子を含む市販品を利用してもよいし、ス
ポッターを用いて前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記
載のヌクレオチド配列を有する遺伝子を固相化したＤＮ
Ａマイクロアレイまたはフィルターを作製することもで
きる（例えば、宝酒造（株）社製、ＧＭＳ４１７アレイ
ヤー等）。

【０１７９】この固相化試料に、上記［２］で調製され
たプローブを用いて、同じ条件で別個に、あるいは混合
して同時にハイブリダイズさせる（Brown, P. O. et a
l. (1999) Nature genet. 21, suppliment、33-37）。

【０１８０】［４］解析 アフィメトリクス社製ＤＮＡチップを用いる解析の場
合： アフィメトリクス社製ＤＮＡチップに添付のプロ
トコールに従って、ハイブリダイゼーションおよび解析
を行う。

【０１８１】ＤＮＡマイクロアレイを用いる解析の場
合： 例えば、宝酒造（株）社の市販ＤＮＡマイクロア
レイを用いる場合、同社のプロトコールに従いハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄を行って、蛍光シグナル検出
機（例えばＧＭＳ４１８アレイスキャナー（宝酒造
（株）社製）等）で蛍光シグナルを検出後、解析を行
う。

【０１８２】フィルターを用いる解析の場合： ハイブ
リダイゼーションは、本発明が属する技術分野において
周知の方法で行われ得る。例えば、ハイブリダイゼーシ
ョンおよび洗浄を行った後、解析装置（例えば、アトラ
スイメージ（クロンテック社製））を用いて解析を行
う。

【０１８３】上記いずれの場合も、同一ロットの固相化
試料に被験物質存在下で培養した細胞由来の試料由来の
プローブと、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試
料由来のプローブをそれぞれハイブリダイズさせる。こ
のとき、使用するプローブ以外のハイブリダイゼーショ
ンの条件は同じとする。上記［２］に記載したように、
それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識した場合
は、一つの固相化試料に両プローブの混合物をハイブリ
ダイズさせることもできる（Brown, P. O. et al. (199
9) Nature genet. 21, suppliment、33-37）。

【０１８４】解析の結果、被験物質存在下で培養した細
胞由来の試料由来のプローブと、被験物質非存在下で培
養した細胞由来の試料由来のプローブとの間で、固相化
試料の標的遺伝子、すなわち前述ａ）乃至ｅ）のいずれ
か一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子または
「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌ
クレオチド配列を有する遺伝子にハイブリダイズしたプ
ローブ量を測定する。その結果、標的遺伝子にハイブリ
ダイズしたプローブ量を比較して、被験物質存在下で培
養した細胞由来の試料由来のプローブの方が被験物質非
存在下で培養した細胞由来の試料由来のプローブよりも
少なかった場合、該被験物質は、前述ａ）乃至ｅ）のい
ずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の
発現を抑制する物質であるので、高脂血症、動脈硬化お
よび高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の
治療または予防剤となり得る。

【０１８５】ｉｖ）その他 上記以外に、被験物質存在下で培養した細胞由来の試料
で、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料に比べ
て前述ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチ
ド配列を有する遺伝子の発現量を低下させる被験物質の
特定を検出する方法として、以下の方法を挙げることが
できる。

【０１８６】すなわち、単一の反応において、ＰＣＲを
ハイブリダイゼーションプロービング（以下「プロービ
ング」という）と組み合わせた「Taqman」として知られ
る技術（Holland, P. M. et al. (1991) Proc．Natl．A
cad．Sci．USA 88, 7276-7280）や、単一の反応におい
てＰＣＲをプロービングと組み合わせた方法（Higuchie
t al. Biotechnology，10, 413-417（1992））を利用す
ることもできる。後者の方法では、紫外線で励起される
ことにより蛍光を発する核酸検出試薬である臭化エチジ
ウムをＰＣＲ反応液に添加する。２本鎖ＤＮＡの存在下
で臭化エチジウムの蛍光は増加するので、励起光を照射
したときに検出される蛍光の増加は２本鎖ＰＣＲ産物の
蓄積に相関し得る。

【０１８７】さらに、ＰＣＲによる増幅とプロービング
とを組み合わせた別の方法として、欧州特許出願公開第
０６０１８８９号公報記載の方法を利用することもでき
る。さらに、ライトサイクラーシステム（ロシュ・ダイ
アグノスティクス社製、日本特許公開２０００−３１２
６００号公報参照）を用いてｍＲＮＡ量を定量すること
も可能である。

【０１８８】（Ｂ）ポリペプチドの検出 次に、本発明の方法の別の実施態様としては、上記した
遺伝子発現を検出する実施態様において検出対象となっ
た遺伝子がコードするポリペプチドを検出する方法があ
る。この実施態様においては、試料中のポリペプチドを
９６穴プレートのウェル内底面やメンブレン等に固相化
しておいてから、標的のポリペプチドを特異的に認識す
る抗体を用いた検出が行われる。このうち、９６穴プレ
ートを用いるのは一般に固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳ
Ａ法）や放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）と呼ば
れる方法である。一方、メンブレンに固相化する方法と
しては、試料のポリアクリルアミド電気泳動を経てメン
ブレンにポリペプチドを転写する方法（ウエスタンブロ
ット法）か、または直接メンブレンに試料またはその希
釈液を染み込ませる、いわゆるドットブロット法やスロ
ットブロット法が挙げられる。

【０１８９】１）試料の調製 上記のようなポリペプチドを検出する実施態様において
用いられる培養細胞の種類に関する条件は、上記した遺
伝子発現を検出する実施態様の場合と同様である。ま
た、哺乳動物個体に被験物質を投与して、その後該動物
個体から採取された血清等を試料として用いる方法も採
用し得る。この場合の好ましい哺乳動物種はヒト、マウ
ス、ラットまたはハムスターが好ましく、ヒトまたはマ
ウスがより好ましい。例えばマウスとしては高脂血症マ
ウスであるＫＫマウスが好ましく用いられるが、本発明
はこれに限定されない。培養細胞の培養条件、被験物質
の投与方法についても、遺伝子発現を検出する実施態様
の場合と同様である。また、高脂血症の治療または予防
剤としての活性を調べようとする被験物質としては、化
合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、そ
れらの誘導体またはそれらの混合物等を挙げることがで
きる。

【０１９０】本実施態様のための試料を調製するための
材料としては、被験物質存在下または非存在下で培養し
た細胞培養の培養上清または細胞質画分が用いられ得る
が、培養上清が好適である。培養上清は、培養終了後回
収し、必要によりフィルターろ過滅菌処理を経て、ＥＬ
ＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料の調
製工程に供される。

【０１９１】ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料としては、例え
ば回収した培養上清をそのまま使用するか、緩衝液で適
宜希釈したものを用いる。

【０１９２】ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料
の調製方法は以下の通りである。まず、例えば培養上清
をトリクロロ酢酸処理してタンパク質タンパク質を沈殿
させ、遠心分離により沈殿を得る。この沈殿を氷冷した
アセトンで洗浄し、風乾後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプ
ル緩衝液（バイオラッド社製等）に溶解する。

【０１９３】ドット／スロットブロットの場合は、例え
ば回収した培養上清そのもの、または緩衝液で適宜希釈
したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、
直接メンブレンへ吸着させる。

【０１９４】２）試料の固相化 上記のようにして得られた試料中のポリペプチドを特異
的に検出するため、該試料を固相化する。ウエスタンブ
ロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法
に用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメ
ンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメ
ンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・
ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例え
ば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド
社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶ
ＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等が
挙げられる。

【０１９５】電気泳動後のゲルからメンブレンにポリペ
プチドを移す、いわゆるブロッティング方法としては、
ウエット式ブロッティング法（CURRENT PROTOCOLS IN I
MMUNOLOGY volume2 ed by J. E. Coligan, A. M. Kruis
beek, D. H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strobe
r）、セミドライ式ブロッティング法（上記CURRENT PRO
TOCOLS IN IMMUNOLOGY volume2 参照）等を挙げること
ができる。ドットブロット法やスロットブロット法のた
めの器材も市販されている（例えば、バイオドット（バ
イオラッド）等）。

【０１９６】一方、ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法で検出・定
量を行うためには、専用の９６穴プレート（例えば、イ
ムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料
またはその希釈液（例えば０．０５％ アジ化ナトリウ
ムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」とい
う）で希釈したもの）を入れて４℃乃至室温で一晩、ま
たは３７℃で１乃至３時間静置することにより、ウェル
内底面にポリペプチドを吸着させて固相化する。

【０１９７】３）抗体 本実施態様に用いられる抗体は、上記（Ａ）のａ）から
ｅ）記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子が動物細胞で
発現することにより産生されるポリペプチド、好ましく
は、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４５５
（より好ましくは同１９−４５５）に示されるアミノ酸
配列からなるポリペプチドまたはその一部、もしくは配
列番号４のアミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ
酸配列からなるポリペプチドまたはその一部を特異的に
認識するものである。このような抗体として好適なもの
は例えば、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−４
５５（より好ましくは、同１９−４５５）に示されるア
ミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号４のア
ミノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列からな
るポリペプチドのいずれにも結合するが、他のいかなる
マウスまたはヒト由来のタンパク質とも結合しないよう
な抗体を挙げることができる。

【０１９８】本実施態様のための抗体は、常法を用いて
（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質１、p.389-
397、1992）、抗原となるタンパク質タンパク質、ある
いはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチ
ドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精
製することによって得ることができる。また、公知の方
法（例えば、Kohler and Milstein, Nature 256, 495-4
97, 1975、Kennet, R.ed., Monoclonal Antibody p.365
-367, 1980, Prenum Press, N.Y.）に従って、本発明の
タンパク質タンパク質に対する抗体を産生する抗体産生
細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブ
リドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもで
きる。

【０１９９】一般的に、モノクローナル抗体の製造にあ
たっては、下記のような作業工程を経る。すなわち、
(ａ)抗原として使用する生体高分子を精製、(ｂ)マウス
への抗原の注射による免疫、および血液を採取しアッセ
イして脾臓摘出の時期を決定することにより成る抗体産
生細胞の調製、(ｃ)骨髄腫細胞(ミエローマ)の調製、
(ｄ)脾臓摘出、および脾細胞とミエローマの場合、(ｅ)
目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
(ｆ)単一細胞クローンへの分割( クローニング)、(ｇ)
場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造する
ためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを
移植したマウスの飼育、(ｈ)このようにして製造された
モノクローナル抗体の生理活性、あるいは標識試薬とし
ての特性の検定等の作業工程を経る。

【０２００】本発明のモノクローナル抗体も上記工程に
そって製造することが可能であるが、これに制限され
ず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞、ミエローマ、他
の哺乳動物の抗体産生細胞、ミエローマが使用できるこ
とは言うまでもない。

【０２０１】(ａ) 抗原の精製 抗原としては、請求項１０乃至１２に記載のポリペプチ
ドであればいかなるものでもよいが、本発明のＤＮＡを
大腸菌に導入し発現させ、精製することによって得られ
る融合タンパク質、本発明のＤＮＡでＣＯＳ−１細胞ま
たはＣＨＯ細胞をトランスフェクトして得られる無血清
培養上清から精製されたタンパク質などが抗原として有
効である。

【０２０２】(ｂ) 抗体産生細胞の調製 本発明のＤＮＡをＣＨＯ細胞にトランスフェクトして得
られる無血清培養上清から精製されたタンパク質とフロ
インドの完全、または不完全アジュバント、またはカリ
ミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験
動物に免疫する。実験動物としては、ＢＡＬＢ／ｃマウ
スを使用することが望ましく、これは多用されるマウス
由来のミエローマがすべてＢＡＬＢ／ｃマウスを起源に
しており、しかもその性質が比較的詳しく研究されてお
り、さらに抗体産生細胞とミエローマがともにＢＡＬＢ
／ｃマウス由来であれば、得られるハイブリドーマがＢ
ＡＬＢ／ｃマウス腹腔内で増殖できるため、複雑な手順
なしに腹水よりモノクローナル抗体が得られるという利
点があるためである。しかし、本発明がこれに制限され
ないことは上記の通りである。

【０２０３】免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹
腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射いずれで
もよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。

【０２０４】免疫は、一回または適当な間隔で、好まし
くは１週間から５週間間隔で複数回繰返し行ってもよ
い。免疫した動物の血清中の該抗原に対する抗体価を測
定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供
給原として用いれば、その後の操作の効果を上げること
ができる。融合には最終免疫後３乃至５日後の動物由来
の抗体産生細胞を用いることが好ましい。

【０２０５】ここで用いる抗体価の測定法としては、放
射性同位元素免疫定量法(ＲＩＡ法)、固相酵素免疫定量
法(ＥＬＩＳＡ法)、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法な
ど種々の公知技術があげられるが、感度、迅速性、正確
性、および自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法、
およびＥＬＩＳＡ法が好ましい。

【０２０６】本発明による抗体価の測定は、例えばＥＬ
ＩＳＡ法によれば、以下のような手順により行うことが
できる。すなわち、抗原を固相に吸着させ、さらに抗原
が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク
質、例えば牛血清アルブミン(ＢＳＡ)により覆い、該表
面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料(例えば
マウス血清) に接触させ、上記抗原に試料中の抗体を結
合させ、さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗
体に対する抗体を加え、マウス抗体に結合させ、洗浄後
該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色などを測定
することにより、抗体価算出を行うことができる。

【０２０７】(ｃ) 骨髄腫細胞の調製工程 骨髄細胞としては、一般的にはマウスから得られた株化
細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス(ＢＡＬＢ／
ｃ由来)骨髄腫細胞株Ｐ３−ｘ６３ Ａｇ８−Ｕ１(Ｐ３
−Ｕ１)（Current Topics in Microbiology and Immuno
logy,81,1-7(1978)）、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４．１
(ＮＳ−１)（European J.Immunology,6,511-519(1976)
）、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４(ＳＰ−２)（Nature,276,26
9-270(1978)）、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３(６５
３)（J.Immunology,123,1548-1550(1979)）、Ｐ３−ｘ
６３−Ａｇ８(ｘ６３)（Nature,256,495-497(1975)）な
どを用いることが好ましい。

【０２０８】これらの細胞株は、適当な培地、例えば8-
アザグアニン培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミ
ン(１．５ｍＭ)、２−メルカプトエタノール(５×１０
^-5Ｍ)、ゲンタマイシン(１０μｇ／ｍｌ) 、および牛胎
児血清(ＦＣＳ １０％)を加えた培地に8-アザグアニン
を加えた培地）、Ｉｓｃｏｖｅ´ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ Ｍｅｄｉｕｍ(ＩＭＤＭ)、また
はＤｕｌｂｅｃｃ´ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ
Ｍｅｄｉｕｍ(ＤＭＥＭ)で継代培養するが、細胞融合の
３乃至４日前にＴＩＬ培地（ＴＩＬ Ｍｅｄｉａ Ｉ(免
疫生物研究所)５００ｍｌに、５ｍｌ ＰＥＮＩＣＩＬ
ＬＩＮ−ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮ
（シグマ社）、および牛胎児血清(ＦＣＳ １０％)を加
えた培地）で継代培養し、融合当日２×１０⁷以上の細
胞数を確保する。

【０２０９】(ｄ) 細胞融合 抗体産生細胞は、形質細胞、およびその前駆細胞である
リンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得ても
よく、一般には脾、リンパ節、末梢血、またはこれらの
適宜の組み合わせから得ることができるが、脾臓細胞が
最も一般に用いられる。

【０２１０】最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウ
スから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出
し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞
と工程（ｃ）で得られた骨髄腫細胞を融合させる手段と
して現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比
較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを
用いる方法である。この方法は以下の手順よりなる。

【０２１１】脾細胞と骨髄腫細胞を培地、またはリン酸
緩衝液(ＰＢＳ)でよく洗浄し、脾細胞と骨髄腫細胞の比
が５乃至１０：１程度になるように混合し、遠心分離に
かける。上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした
後、撹拌しながらポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分
子量１０００乃至４０００）と培地との混液を加え数分
後に遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞をTI
L培地で懸濁して培養用プレート上の穴に分注する。各
穴において細胞の増殖が確認されたら、ＨＡＴ培地(Ｔ
ＩＬ培地に、ヒポキサンチン１０^-6乃至１０^-3Ｍ、アミ
ノプテリン１０^-8乃至１０^-7Ｍ、チミジン１０^-6乃至１
０^-4Ｍを加えた培地)に置き換える。

【０２１２】（ｅ） ハイブリドーマ群の選択 培養用プレートは、ＣＯ2インキュベーター中、３５乃
至４０℃で培養する。以後、１乃至３日ごとに培地の半
量相当のＨＡＴ培地を加え、ＣＯ2インキュベーター
中、３５乃至４０℃で１０乃至１４日間培養する。

【０２１３】上記ミエローマ細胞は、８−アザグアニン
耐性株であり、該ミエローマ細胞、およびミエローマ細
胞どうしのハイブリドーマは、ＨＡＴ培地中では生存で
きない。しかしながら、抗体産生細胞どうし、あるい
は、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマ
は生存することができ、さらに抗体産生細胞どうしのハ
イブリドーマには寿命があるため、ＨＡＴ培地での培養
によってハイブリドーマの選択が可能となる。

【０２１４】コロニー状に生育してきたハイブリドーマ
の認められる穴について、HT培地（ＨＡＴ培地からアミ
ノプテリンを除いた培地）への変換を行う。以後、培養
上清の一部をとり、例えば、ELISA 法により抗体価を測
定する。以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用いた
が、その他のものもハイブリドーマの選択に応じて使用
することができ、その場合当然使用する培地組成も変化
する。

【０２１５】(ｆ) クローニング 上記抗体価の測定により特異的抗体を産生することが判
明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニ
ングを行う。このクローニング法としては、限界希釈に
より１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように
希釈してまきこむ方法、軟寒天培地中にまきこみコロニ
ーをとる軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって
１個の細胞を取りだしまきこむ方法、セルソーターによ
って１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙
げられるが、限界希釈法が簡単でありよく用いられる。

【０２１６】抗体価の認められた穴について、例えば限
界希釈法によりクローニングを２乃至４回繰返し、安定
して抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。

【０２１７】（ｇ） ハイブリドーマ培養によるモノク
ローナル抗体の調製 クローニングを完了したハイブリドーマは、ＨＴ培地よ
り通常の培地に換えて培養される。大量培養は、大型培
養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われ
る。この大量培養における上清に、ゲルろ過などを行い
ＩｇＧ画分を集め精製することにより本発明のモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス
（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕ
マウスの腹腔内でも増殖させることが可能である。

【０２１８】また簡便な方法としては、モノクローナル
抗体精製キット（例えば、ファルマシア社のＭＡｂＴｒ
ａｐ ＧＩＩ）を利用することもできる。

【０２１９】（ｈ） モノクローナル抗体の同定 かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ、
サブクラスの決定は以下のように行う。同定法としては
オクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩ
ＳＡ法、またはＲＩＡ法がある。オクテルロニー法は、
簡単ではあるがモノクローナル抗体の濃度が低い場合に
は濃縮しなければならない。ELISA 法、またはRIA 法を
用いれば、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応さ
せ、さらに第二次抗体として各種ＩｇＧサブクラスに対
応する抗体を用いることが可能である。また、さらに簡
便な方法としてアイソタイピング用のキット( 例えば、
アマシャム社製、マウスモノクローナル抗体アイソタイ
ピングキット) を利用することもできる。

【０２２０】さらに、タンパク質の定量は、フォーリン
ロウリー法、および２８０ｎｍでの吸光度（１．４(Ｏ
Ｄ２８０)＝イムのグロブリン１ｍｇ／ｍｌ） より算出
することができる。

【０２２１】なお、本発明のモノクローナル抗体を高濃
度、かつ安定的に産生するハイブリドーマクローンは、
４５Ｂ１と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターに２００２年３月１３日付で、寄
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９６３として寄託されてい
る。

【０２２２】かくして得られたモノクローナル抗体は、
本発明のタンパク質に対して高い特異性を持っており、
さらに上記ハイブリドーマの培養によって均一に得られ
るため、本発明のタンパク質の単離、精製に用いること
ができる。例えば、抗原抗体反応を利用した免疫沈降法
により、該モノクローナル抗体で本発明のタンパク質の
単離、精製が可能である。すなわち、本発明のタンパク
質を含む溶液中に該モノクローナル抗体を添加し、室温
で保存した後、これにプロテインＧセファロース（ファ
ルマシア社製）を混入し、さらに室温で保存する。遠心
操作で沈殿を取得し、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳ等で数回洗浄して、再び遠心して得られた沈殿物
は、該タンパク質、該モノクローナル抗体、およびプロ
テインＧセファロースの複合体である。この沈殿物を適
当な緩衝液に懸濁後、熱処理することにより該複合体を
各成分に解離させてから、遠心を行い上清を回収する。
この上清から、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ
過）等により、該タンパク質を容易に単離、精製するこ
とが可能である。

【０２２３】また、該モノクローナル抗体は、該タンパ
ク質の単離、精製用のアフィニティークロマトグラフィ
ー法におけるリガンドとしても用いることができる。ア
フィニティークロマトグラフィー法は、混合物から担体
に特異的に結合する物質のみを単離精製する場合、極め
て効果的な方法であり、混合物のゲルろ過と比較して、
必要な精製過程を大幅に減少することができる。このア
フィニティークロマトグラフィーにおいて有用な固定化
モノクローナル抗体の作成は、各種酵素の固定化方法に
準じて行うことができ、例えば、CNBr活性化担体を使用
する方法が一般に利用でき、またこのような担体として
はクロマトグラフィーに一般的に使用されている各種材
料、例えばセルロース、アガロース、架橋デキストラ
ン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラス、あるいはこれ
らの担体にスペーサーを導入したもの、特にセファロー
ス４Ｂ（ファルマシア社製）、アフィゲル１０（バイオ
ラッド社製）などが好ましい例として挙げられる。この
固定化モノクローナル抗体を用いて実際に該タンパク質
を精製するには、これらをカラムに充填した後、これに
該タンパク質を含む溶液を通塔する。この操作で該タン
パク質がカラムに吸着する。溶媒、例えば、グリシン−
塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）、塩化ナトリウム溶液、プロ
ピオン溶液、ジオキサン、エチレングリコール、カオト
ロピック塩、塩酸グアニジン、または尿素などで溶出す
ることにより、吸着した該タンパク質が高純度で溶出す
る。

【０２２４】なお、本発明のモノクローナル抗体は、マ
ウス由来のものに限られず、本発明のタンパク質と結合
性を有する限り、いかなる哺乳動物由来の抗体でも構わ
ない。また、本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリ
ドーマが産生するものに限られず、遺伝子工学の手法に
よって作成されたものでもよい。例えば、キメラ抗体、
ヒト化抗体なども、本発明のタンパク質と結合性を有す
る限り、本発明のモノクローナル抗体の範疇に含まれ
る。そのような抗体は、例えば、Man Sung Co らの方法
（Man Sung Co, et al. (1992) J. Immunol. 148, 1149
-1154）などに準じて作成することができる。

【０２２５】本実施態様に用いられる抗体を作製するた
めの抗原としては、配列表の配列番号２のアミノ酸番号
１７−４５５（好ましくは、同１９−４５５）に示され
るアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なく
とも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプ
チド、もしくは配列番号４のアミノ酸番号１７−４６０
に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそ
の少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなる
ポリペプチド、もしくは配列番号１６のアミノ酸番号２
６−４０６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配
列からなるポリペプチド、もしくは配列番号１８のアミ
ノ酸番号２２−４９１に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分
アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号
２０のアミノ酸番号２３−４９３に示されるアミノ酸配
列からなるポリペプチドまたはその少なくとも６個の連
続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、もしく
は配列番号２２のアミノ酸番号２１−４７０に示される
アミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその少なくと
も６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチ
ド、もしくは配列番号２４のアミノ酸番号２７−３４６
に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそ
の少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなる
ポリペプチド、あるいはそれらポリペプチドに任意のア
ミノ酸配列や担体が付加された形の誘導体を挙げること
ができるが、好ましくは配列表の配列番号９のアミノ酸
番号１−１４からなるポリペプチドのＣ末端または配列
番号１０のアミノ酸番号１−１４に示されるアミノ酸配
列からなるポリペプチドのＮ末端に、キーホールリンペ
ットヘモシアニンを担体として結合させたものである。

【０２２６】配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７−
４５５（好ましくは、同１９−４５５）に示されるアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号４のアミ
ノ酸番号１７−４６０に示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドは、例えば、配列表の配列番号１のヌクレ
オチド番号４７−１４１１に示されるヌクレオチド配列
または配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１
４５７に示されるヌクレオチド配列にコードされるポリ
ペプチドを遺伝子操作により宿主細胞に産生させること
によって得ることができる。具体的には、上記ヌクレオ
チド配列を有するＤＮＡを適当なベクターＤＮＡに組み
込むことにより、他の原核生物、または真核生物の宿主
細胞を形質転換させることができる。さらにこれらのベ
クターに適当なプロモーター、および形質発現に関わる
配列を導入することにより、それぞれの宿主において遺
伝子を発現させることが可能である。

【０２２７】原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌
（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）
などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内
で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプ
リコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラ
スミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベ
クターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の
選択性を付与することができる配列を有するものが好ま
しい。

【０２２８】例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよ
く用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２や
ｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定さ
れず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用
できる。

【０２２９】プロモーターとしては、大腸菌において
は、トリプトファン（trp）プロモーター、ラクトース
（lac）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（t
ac）プロモーター、リポプロテイン（lpp）プロモータ
ー、ポリペプチド鎖伸張因子Tu（tufB）プロモーター等
が挙げられ、どのプロモーターも目的のポリペプチドの
産生に使用することができる。

【０２３０】枯草菌としては、例えば２０７−２５株が
好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ohmura,
K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93）などが用い
られるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα
−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮ
Ａ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可
能となる。

【０２３１】真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆
虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、
例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1
981) Cell 23, 175-182、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５
０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細
胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素
欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220）等がよく用いら
れているが、これらに限定されない。

【０２３２】脊椎動物細胞の発現プロモーターとして
は、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロ
モーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部
位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さ
らにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現
ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを
有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani, S. et al. (198
1) Mol. Cell. Biol. 1,854-864）等が挙げられるが、
これに限定されない。

【０２３３】宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合
を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製
起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であ
り、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、お
よびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることが
できる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusso
n, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308)、リ
ン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and
van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）、
および電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982)
EMBO J. 1, 841-845）などによりＣＯＳ細胞に取り込ま
せることができ、かくして所望の形質転換細胞を得るこ
とができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる
場合には、発現ベクターとともに、抗生物質Ｇ４１８耐
性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベ
クター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook, J. et al.
(1989) : "Molecular Cloning A Laboratory Manual" C
old Spring Harbor Laboratory, NY）やｐＳＶ２−ｎｅ
ｏ（Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Ap
pl. Genet. 1, 327-341）などをコ・トランスフェクト
し、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目
的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得る
ことができる。

【０２３４】昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera frugiperdaの卵巣細胞
由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やTrichopl
usia niの卵細胞由来High Five細胞（Wickham, T. J. e
t al, (1992) Biotechnol. Prog. I: 391-396）などが
宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストラン
スファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイ
ルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパク質タンパク
質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３
がよく用いられる（Kidd, I. M. and V.C. Emery (199
3) The use of baculoviruses as expression vectors.
Applied Biochemistry and Biotechnology 42, 137-15
9)。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性
タンパク質タンパク質のプロモーターを利用したベクタ
ーも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表
面タンパク質タンパク質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を
目的タンパク質タンパク質のＮ末端側に繋げることによ
り、組換えタンパク質タンパク質を分泌タンパク質とし
て発現させることも可能である（Zhe-mei Wang, et al.
(1998) Biol. Chem., 379, 167-174)。

【０２３５】真核微生物を宿主細胞とした発現系として
は、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカ
ロミセス属酵母、例えばパン酵母Saccharomyces cerevi
siaeや石油酵母Pichia pastorisが好ましい。該酵母な
どの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アル
コール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen,J.
L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 301
8-3025）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター
（Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 80, 1-5）などを好ましく利用できる。また、
分泌型タンパク質として発現させる場合には、分泌シグ
ナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは
既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え
体として発現することも可能である。例えば、トリプシ
ン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼ
を石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαフ
ァクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２
プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることによ
り、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知
られている（Andrew, L. Niles,et al. (1998) Biotech
nol.Appl. Biochem.28, 125-131)。

【０２３６】上記のようにして得られる形質転換体は、
常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、
または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培
養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じ
て慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記
ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッ
コ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの
培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加
したものを使用できる。

【０２３７】上記培養により、形質転換体の細胞内また
は細胞外に産生される組換えタンパク質は、該タンパク
質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知
の分離操作法により分離・精製することができる。該方
法としては、具体的には例えば、通常の蛋白沈殿剤によ
る処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲ
ル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体
クロマトグラフィー、透析法、これらの組み合わせなど
を例示できる。また、発現させる組換えタンパク質に６
残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケル
アフィニティーカラムで効率的に精製することができ
る。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、
高純度で本発明のポリペプチドを大量に製造できる。

【０２３８】上記のようにして得られる抗体は、ＲＩＡ
法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法な
どの各種免疫学的測定法や免疫組織染色などに用いるこ
とができる。

【０２３９】４）検出 上記３）記載の方法で得られる抗体は、それを直接標識
するか、または該抗体を一次抗体とし、該抗体を特異的
に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識す
る）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。

【０２４０】標識の種類として好ましいものは酵素（ア
ルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダー
ゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさら
に酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わ
る）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体
（または標識ストレプトアビジン）を使用する方法のた
めの、予め標識された抗体（またはストレプトアビジ
ン）は種々のものが市販されている。ＲＩＡの場合はＩ
¹²⁵等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定
は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。

【０２４１】これら標識された酵素の活性を検出するこ
とにより、抗原であるポリペプチドの量が測定される。
アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダ
ーゼの場合、それら酵素の触媒により発色する基質や発
光する基質が市販されている。

【０２４２】発色する基質を用いた場合、ウエスタンブ
ロット法やドット／スロットブロット法においては目視
で検出できる。ＥＬＩＳＡ法においては、好ましくは市
販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光
度（測定波長は基質により異なる）を測定することによ
り定量する。また好ましくは上記３）において抗体作製
のために使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準
抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行って、標
準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成する
ことにより、他の試料中の抗原濃度を定量することが可
能である。

【０２４３】一方、発光する基質を使用した場合は、ウ
エスタンブロット法やドット／スロットブロット法にお
いてはＸ線フィルムまたはイメージングプレートを用い
たオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用
いた写真撮影により検出することができ、デンシトメト
リーやＢＡＳ２０００ＩＩシステムを利用した定量も可
能である。また、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合
は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラ
ッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。

【０２４４】５）測定操作 ｉ）ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロッ
トブロットの場合まず、抗体の非特異的吸着を阻止する
ため、予めメンブレンをそのような非特異的吸着を阻害
する物質（スキムミルク、ウシ血清アルブミン、ゼラチ
ン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時
間浸しておく操作（ブロッキング）を行う。ブロッキン
グ溶液の組成は、例えば５％ スキムミルク、０．０５
乃至０．１％ ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が
用いられる。スキムミルクの代わりに、１乃至１０％の
ウシ血清アルブミン、０．５乃至３％のゼラチンまたは
１％のポリビニルピロリドン等を用いてもよい。ブロッ
キングの時間は、４℃で１６乃至２４時間、または室温
で１乃至３時間である。

【０２４５】次に、メンブレンを０．０５乃至０．１％
ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄
液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去
した後、上記３）記載の方法で作製された抗体を洗浄液
で適宜希釈した溶液中に一定時間浸して、抗体をメンブ
レン上の抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率
は、例えば上記３）記載の組換え抗原を段階希釈したも
のを試料とした予備のウエスタンブロッティング実験を
行って決定することができる。この抗体反応操作は、好
ましくは室温で１時間行う。抗体反応操作終了後、メン
ブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識
されたものである場合は、直ちに検出操作を行うことが
できる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二
次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のもの
を使用する場合は洗浄液で２０００乃至２００００倍に
希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載
されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄
除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で１乃至
３時間浸し、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせ
た検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずメンブレン
を洗浄液中で１５分間振盪してから、洗浄液を新しいも
のに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して
５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗
浄液を交換して洗浄してもよい。

【０２４６】ｉｉ）ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ まず、上記２）の方法で試料を固相化させたプレートの
ウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、
ウエスタンブロットの場合と同様、予めブロッキングを
行っておく。ブロッキングの条件については、ウエスタ
ンブロットの項に記載した通りである。

【０２４７】次に、ウェル内を０．０５乃至０．１％
ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄
液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去
した後、上記３）記載の方法で作製された抗体を洗浄液
で適宜希釈した溶液を分注して一定時間インキュベーシ
ョンし、抗体を抗原に結合させる。このときの抗体の希
釈倍率は、例えば上記３）記載の組換え抗原を段階希釈
したものを試料とした予備のＥＬＩＳＡ実験を行って決
定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは
室温で１時間程度行う。抗体反応操作終了後、ウェル内
を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識された
ものである場合は、直ちに検出操作を行うことができ
る。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗
体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使
用する場合は洗浄液で２０００乃至２００００倍に希釈
して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載され
ている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去
した後のウェルに二次抗体溶液を分注して室温で１乃至
３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄してから、
標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例え
ばまずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してか
ら、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、
再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。
必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。

【０２４８】また本発明において、いわゆるサンドイッ
チ法のＥＬＩＳＡは例えば以下に記載する方法により実
施することができる。まず、配列表の配列番号２のアミ
ノ酸番号１７−４５５（好ましくは、同１９−４５５）
に示されるアミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸番
号１７−４６０に示されるアミノ酸配列のいずれか一つ
において、親水性に富む領域を２箇所選んで、それぞれ
の領域中のアミノ酸６残基以上からなる部分ペプチドを
合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取
得する。このうち一方の抗体を上記４）記載のように標
識しておく。標識しなかった方の抗体は、上記２）記載
の方法に準じて９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内
底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル
内に入れて常温で１時間インキュベーションする。ウェ
ル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分
注してインキュベーションする。再びウェル内を洗浄
後、標識方法に合わせた検出操作を行う。

【０２４９】６） 評価 以上に記載した方法で、被験物質存在下で培養した細胞
由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の
試料との間で検出結果を比較し、その結果上記３）記載
の方法で作製された抗体が特異的に結合するポリペプチ
ドの産生量を低下させた被験物質は、高脂血症、動脈硬
化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾
患の治療または予防剤となり得る。また、上記３）記載
の方法で作製された抗体、およびその他上記の一連の方
法に用いられる試薬をまとめることにより、高脂血症、
動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以
上の疾患の治療または予防剤を試験するためのキットが
提供される。

【０２５０】本発明の方法において検出の対象となるポ
リペプチドは、上記の抗体作製用の抗原を得る方法の記
載に従って得られる他、配列表の配列番号１のヌクレオ
チド番号４７−１４１１に示されるヌクレオチド配列ま
たは配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４
５７に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡを組み
込んだアデノウイルスベクターを利用して動物細胞に産
生させることもできる。そのような組換えアデノウイル
スベクターを構築する方法として、市販のキット（例え
ば、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・
キット、宝酒造（株）社製）を用いる方法を例示でき
る。本発明の方法において検出対象となる遺伝子が哺乳
動物の血中中性脂肪濃度と密接に相関していることは、
例えば上記のようにして得られる組換えアデノウイルス
ベクターを有する組換えアデノウイルスを哺乳動物、例
えばマウスに感染させて、該組換えアデノウイルスベク
ターが保持する遺伝子を発現させると血中中性脂肪濃度
の上昇が観察されること、上記のようにして得られる組
換えタンパク質をマウスに投与すると血中中性脂肪濃度
の上昇が観察されること、および先天性低脂血症マウス
において配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７−
１４１１に示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子の
発現量が高脂血症マウスよりも少ないことから証拠付け
られる。

【０２５１】また、遺伝子操作によって得られる、上記
ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列
を含む外来遺伝子が、該遺伝子を高発現することができ
るように導入されている非ヒト動物を用いた高脂血症、
動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以
上の疾患の治療または予防剤の試験方法も本発明に包含
される。この方法で用いられる動物は、例えば、上記組
換えアデノウイルスを感染させたＫＫ／Ｓｎｋマウス
や、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７−１４
１１に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番
号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示されるヌク
レオチド配列を有するＤＮＡをマウスに導入したトラン
スジェニックマウス等であるが、これらに限定されな
い。

【０２５２】トランスジェニック動物は、動物から受精
卵を取得し、遺伝子導入の後、偽妊娠動物に移植し発生
させることにより得ることができ、その手順について
は、既に確立されている方法に従うことができる［発生
工学実験マニュアル（野村達次監修、勝木元也 編、19
87年刊）、マウス胚の操作マニュアル（"Manipulating
the Mouse Embryo, A Laboratory Manual" B. Hogan,
F. Costantini and E.Lacy著、山内一也、豊田裕、森庸
厚、岩倉洋一郎 訳、1989年刊）、特公平５−４８０９
３号公報等参照］。具体的には、例えばマウスの場合、
まず雌マウス（血中中性脂肪濃度が通常より低いマウス
であることが好ましく、例えばＫＫ／Ｓｎｋマウスが好
ましいがそれに限定されない）に排卵誘起剤を投与後、
同系統の雄と交配し、翌日雌マウスの卵管より前核受精
卵を採取する。次いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微小
ガラス管を用いて受精卵の前核に注入する。なお、導入
する遺伝子を動物細胞内で発現させるための、プロモー
ターやエンハンサー等の調節遺伝子としては、導入され
た動物の細胞内で機能するものであればいずれも使用す
ることができる。ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮
親雌マウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、約２
０日後に自然分娩または帝王切開により出生させる。こ
のようにして得られた動物が導入した遺伝子を保持して
いることを確認する方法としては、該動物の尾等からＤ
ＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型として導入遺伝子に特異
的なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣ
Ｒを行う方法、該ＤＮＡを数種の制限酵素で消化後ゲル
電気泳動し、ゲル中のＤＮＡをニトロセルロース膜やナ
イロン膜等にブロッティングしたものについて導入遺伝
子の全部または一部を標識したものをプローブとしたサ
ザンブロット解析を行う方法等を挙げることができる。
また、導入された遺伝子が実際に動物体内で発現してい
るか否かは、末梢血中の中性脂肪濃度を測定することに
より確認することができる。導入された遺伝子が実際に
動物体内で発現している場合は、遺伝子を導入しない動
物よりも血中中性脂肪濃度が高くなる。

【０２５３】そのようにして得られた遺伝子導入動物に
被験物質を投与して、血中中性脂肪濃度を低下させる物
質を選択する（好ましくは、遺伝子導入しない動物にも
被験物質を投与して結果を比較し、遺伝子導入した動物
で顕著に血中中性脂肪濃度を低下させる物質を選択す
る）。この方法では、導入された遺伝子の発現を抑制ま
たは阻害する物質のみならず、該遺伝子にコードされる
ポリペプチド自体の機能や、該ポリペプチドと相互作用
して該ポリペプチドの機能発現に寄与する因子（例え
ば、レセプター）等、該ポリペプチドの作用による血中
中性脂肪濃度の上昇に関わる生体反応のいずれかを阻害
する物質を見出すことができる。そのような物質も高脂
血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは
二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。

【０２５４】本発明はまた、本発明の方法において検出
対象とするポリペプチド（以下、単に「検出対象ポリペ
プチド」という）に特異的に結合する、抗体以外のポリ
ペプチド、すなわち検出対象ポリペプチドのレセプター
に関する。該レセプターが細胞膜に存在するタンパク質
である場合は、該レセプターは例えば以下に記載する方
法に従ってクローニングすることができる。まず、配列
表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１に
示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号３の
ヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレオ
チド配列からなるＤＮＡを哺乳動物細胞で発現可能な組
換えベクターを構築し、ＣＯＳ−１に導入してその培養
上清を回収し、検出対象ポリペプチドの組換えポリペプ
チドを精製する。得られた組換えポリペプチドはフルオ
レセイン・イソチオシアネート（以下「ＦＩＴＣ」とい
う）で標識しておく。次に、種々の哺乳動物組織由来の
培養細胞に標識組換えポリペプチドを添加して、標識組
換えポリペプチドが細胞膜上に特異的に結合する細胞、
すなわちレセプターを発現する細胞を同定する。同定さ
れた細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを哺乳動物細胞で
発現可能なベクター中に組み込み、レセプターを発現し
ない細胞（好ましくはＣＯＳ−１またはＣＨＯ細胞、よ
り好ましくはＣＨＯ細胞）で発現させる。このｃＤＮＡ
ライブラリーを発現させた細胞に上記のＦＩＴＣ標識し
た組換えポリペプチドを添加し、一定時間培養後、細胞
を回収して、セルソーターでＦＩＴＣ標識された組換え
ポリペプチドが結合した細胞を選別する。得られた細胞
から導入されたｃＤＮＡをＰＣＲ等によりクローニング
する。必要に応じ、以上の操作を繰り返して、最終的に
ＦＩＴＣ標識組換えポリペプチドに特異的に結合するレ
セプターをコードするｃＤＮＡをクローニングする。ま
たレセプター自体は、このようにしてクローン化された
細胞から回収することができる。

【０２５５】このようにして、検出対象ポリペプチドの
レセプターをコードするｃＤＮＡが得られれば、そのｃ
ＤＮＡライブラリーの材料となった細胞を利用して、さ
らに検出対象ポリペプチドと該レセプターとの相互作用
を阻害する物質や、該レセプターに結合することによっ
て検出対象ポリペプチドと同様の機能を発揮する物質、
あるいは検出対象ポリペプチドと該レセプターとの相互
作用によって開始されるシグナル伝達を阻害する物質の
スクリーニングに利用することができる。具体的には、
例えばマウスゲノムＤＮＡを制限酵素消化等により適宜
断片化して、それらの一端に緑色蛍光タンパク質（gree
n-fluorescent protein：レポーターアッセイ用のベク
ターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販
されている）をコードするＤＮＡが連結されたベクター
を、上記ｃＤＮＡライブラリーの材料となった細胞に導
入する。この細胞の培養中に、検出対象ポリペプチドの
組換えポリペプチド（標識しないもの）を添加して、緑
色蛍光タンパク質を産生する細胞をセルソーターで選別
する。選別された細胞は該組換えポリペプチドの存在下
で緑色蛍光タンパク質を産生する。この細胞を９６穴培
養プレートに１ウェルあたりの細胞数がほぼ同じになる
ように培養し、被験物質のみを添加するか、あるいは該
組換えポリペプチドと被験物質を同時添加して一定時間
培養した後、蛍光プレートリーダー等を用いて緑色蛍光
タンパク質の産生量を測定する。被験物質単独で培養し
たときに緑色蛍光タンパク質の産生を引き起こす場合、
該物質は検出対象ポリペプチドのアゴニストと考えられ
る。一方、該組換えポリペプチドと被験物質を同時添加
したウェルにおける緑色蛍光タンパク質の産生量が、該
組換えポリペプチド単独添加のウェルよりも少ない場
合、被験物質は検出対象ポリペプチドのアンタゴニスト
または該ポリペプチドのシグナル伝達阻害剤であり、高
脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまた
は二つ以上の疾患の治療または予防剤として有用である
と考えられる。

【０２５６】このようにして得られたアンタゴニストが
タンパク質またはペプチドである場合、該タンパク質ま
たはペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポ
リヌクレオチドは、高脂血症、動脈硬化および高血糖か
ら選択される一つまたは二つ以上の疾患の遺伝子治療に
用いることができる。そのようなポリヌクレオチドは、
例えば同定されたアンタゴニストタンパク質またはポリ
ペプチドのアミノ酸配列を解析し、該アミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド
プローブを合成して種々のｃＤＮＡライブラリーやゲノ
ムライブラリーのスクリーニングを行うことにより取得
できる。また、アンタゴニスト活性を有するぺプチド
が、ランダムに合成された人工ペプチドライブラリー由
来である場合は、該ペプチドのアミノ酸配列をコードす
るヌクレオチド配列からなるＤＮＡを化学合成する。遺
伝子治療においては、そのようにして得られたアンタゴ
ニストをコードするポリヌクレオチドを、例えばウイル
スベクターに組み込んで、該組換えウイルスベクターを
有するウイルス（無毒化されたもの）を患者に感染させ
る。患者体内ではアンタゴニストが産生され、配列表の
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの
機能を阻害するので、高脂血症、動脈硬化および高血糖
から選択される一つまたは二つ以上の疾患の進展を抑制
することができる。

【０２５７】遺伝子治療剤を細胞内に導入する方法とし
ては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あ
るいは非ウイルス性の遺伝子導入方法（日経サイエン
ス,1994年4月号,20-45頁、実験医学増刊,12(15)(199
4)、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」,羊土社（1
996））のいずれの方法も適用することができる。

【０２５８】ウイルスベクターによる遺伝子導入方法と
しては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデ
ノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイル
ス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイ
ルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ＴＲ
４あるいは変異ＴＲ４をコードするＤＮＡを組み込んで
導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイル
ス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニア
ウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性
の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉
内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム
法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、
リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙
げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好まし
い。

【０２５９】また遺伝子治療剤を実際に医薬として作用
させるには、ＤＮＡを直接体内に導入するインビボ（in
vivo）法およびヒトからある種の細胞を取り出し体外
でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すエク
スビボ（ex vivo）法がある（日経サイエンス,1994年4
月号,20-45頁、月刊薬事,36(1),23-48（1994）、実験医
学増刊, 12 (15)(1994)）。

【０２６０】例えば、該遺伝子治療剤がインビボ法によ
り投与される場合は、疾患、症状等に応じ、静脈、動
脈、皮下、皮内、筋肉内等、適当な投与経路により投与
される。またインビボ法により投与する場合は、該遺伝
子治療剤は一般的には注射剤等とされるが、必要に応じ
て慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは
膜融合リポソーム（センダイウイルス−リポソーム等）
の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍
結剤等のリポソーム製剤とすることができる。

【０２６１】配列表の配列番号３のヌクレオチド番号７
８−１４５７に示されるヌクレオチド配列の部分配列に
相補的なヌクレオチド配列は、いわゆるアンチセンス治
療に用いることができる。アンチセンス分子は、配列表
の配列番号３のヌクレオチド番号７８−１４５７に示さ
れるヌクレオチド配列の一部に相補的な、通常１５乃至
３０ｍｅｒからなるＤＮＡ、もしくはそのホスホロチオ
エート、メチルホスホネートまたはモルフォリノ誘導体
などの安定なＤＮＡ誘導体、２'−Ｏ−アルキルＲＮＡ
などの安定なＲＮＡ誘導体として用いられ得る。そのよ
うなアンチセンス分子を、微量注入、リポソームカプセ
ル化により、あるいはアンチセンス配列を有するベクタ
ーを利用して発現させるなど、本発明の技術分野におい
て周知の方法で、細胞に導入することができる。このよ
うなアンチセンス療法は、配列表の配列番号３のヌクレ
オチド番号７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列
がコードするタンパク質の活性を減少させることが有効
な病気、特に、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選
択される一つまたは二つ以上の疾患の治療に有用であ
る。

【０２６２】上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含
む医薬として有用な組成物は、医薬として許容できる担
体の混合などの公知の方法によって製造され得る。この
ような担体と製造方法の例は、Applied Antisense Olig
onucleotide Technology(1998 Wiley-Liss, Inc.)に記
載されている。そして、配列番号３のヌクレオチド番号
７８−１４５７に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝
子の発現やその遺伝子産物の活性に異常の認められる高
脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまた
は二つ以上の疾患の治療に十分な量を各人に投与され
る。その有効量は、各人の状態、体重、性別、および年
齢などの種々の因子や、皮下、局所、経口、および筋肉
内といった投与方法の違いによって変化し得る。例え
ば、静脈注射する場合には、０．０２乃至０．２ｍｇ／
ｋｇ／時間で２時間、また、皮下投与の場合には、１乃
至２００ｍｇ／ｍ²／日のように変化し得る。

【０２６３】ＩＩ． ポリペプチドを用いた試験方法 本発明のポリペプチドは、例えば、(a)配列表の配列番
号１１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した
1つの配列であって、ヌクレオチド番号１８を５'末端と
し、ヌクレオチド番号４５８乃至６３８のいずれか１つ
を３'末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、(b)配
列表の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に含ま
れる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号１
８を５'末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６０２
のいずれか１つを３'末端とするヌクレオチド配列を含
むＤＮＡ、(c)配列表の配列番号１５に示されるヌクレ
オチド配列に含まれる連続した1つの配列であってヌク
レオチド番号１７３を５'末端とし、ヌクレオチド番号
６０１を３'末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮ
Ａ、(d)配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド
配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオ
チド番号１７３を５'末端とし、ヌクレオチド番号１３
９３を３'末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、
(e)配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列
に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド
番号４３４を５'末端とし、ヌクレオチド番号１０３９
乃至１２６１のいずれか１つを３'末端とするヌクレオ
チド配列を含むＤＮＡ、(f)配列表の配列番号１７に示
されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列
であって、ヌクレオチド番号４３４を５'末端とし、ヌ
クレオチド番号１９０９を３'末端とするヌクレオチド
配列を含むＤＮＡ、(g)配列表の配列番号１９に示され
るヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であ
って、ヌクレオチド番号２２を５'末端とし、ヌクレオ
チド番号６３９乃至８４６のいずれか１つを３'末端と
するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、(h)配列表の配列
番号１９に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続し
た１つの配列であって、ヌクレオチド番号２２を５'末
端とし、ヌクレオチド番号１５０３を３'末端とするヌ
クレオチド配列を含むＤＮＡ、(i)配列表の配列番号２
１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した1つ
の配列であって、ヌクレオチド番号２４２を５'末端と
しヌクレオチド番号７９６乃至１０１５のいずれか１つ
を３'末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、(j)配
列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含ま
れる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２
４２を５'末端とし、ヌクレオチド番号１６５４を３'末
端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、(k)配列表の
配列番号２３に示されるヌクレオチド配列に含まれる連
続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号８６を
５'末端とし、ヌクレオチド番号３７３乃至３９４のい
ずれか１つを３'末端とするヌクレオチド配列を含むＤ
ＮＡ、(l)配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチ
ド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレ
オチド番号８６を５'末端とし、ヌクレオチド番号１０
４８を３'末端とするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、
の(a)乃至(l)のいずれかを取得し、次いで該ＤＮＡにコ
ードされるポリペプチドを通常の遺伝子組換えの手法を
用いて宿主細胞に生産させることにより得ることができ
る。

【０２６４】なお、配列表の、配列番号１１に示される
ヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわ
ち配列表の配列番号１２のアミノ酸配列において、アミ
ノ酸番号１−１６に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細
胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去される(Con
klin, D. et al. (1999) Genomics 62, 477-482)ので、
上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である
場合は、配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７をア
ミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。同様
に、配列表の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列
にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番
号１６のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−２５
に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシ
グナルペプチドとして除去されるので、上記生産方法に
おいて、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表
の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端とする
ポリペプチドを得ることができる。同様に、配列表の配
列番号１７に示されるヌクレオチド配列にコードされる
アミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号１８のアミノ
酸配列において、アミノ酸番号１−２１に示されるアミ
ノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチド
として除去されるので、上記生産方法において、宿主が
哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号１８
のアミノ酸番号２２をアミノ末端とするポリペプチドを
得ることができる。同様に、配列表の配列番号１９に示
されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、
すなわち配列表の配列番号２０のアミノ酸配列におい
て、アミノ酸番号１−２２に示されるアミノ酸配列は哺
乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去さ
れるので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞
由来である場合は、配列表の配列番号２０のアミノ酸番
号２３をアミノ末端とするポリペプチドを得ることがで
きる。同様に、配列表の配列番号２１に示されるヌクレ
オチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列
表の配列番号２２のアミノ酸配列において、アミノ酸番
号１−２０に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では
翻訳後にシグナルペプチドとして除去されるので、上記
生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合
は、配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１をアミノ
末端とするポリペプチドを得ることができる。同様に、
配列表の配列番号２３に示されるヌクレオチド配列にコ
ードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号２
４のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−２６に示
されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナ
ルペプチドとして除去されるので、上記生産方法におい
て、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配
列番号２４のアミノ酸番号２７をアミノ末端とするポリ
ペプチドを得ることができる。

【０２６５】また、原核細胞のような、哺乳動物のタン
パク質のシグナルペプチドを切断する機能を有さない宿
主を用いて本発明のポリペプチドを生産する方法として
は、例えば、(a)配列表の配列番号１２に示されるアミ
ノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、ア
ミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７
乃至２０７またはアミノ酸番号１４７乃至１９５のいず
れか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、(b)
配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列中の連続
した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６を
アミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末
端とするアミノ酸配列、(c)配列表の配列番号１６に示
されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸
配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、ア
ミノ酸番号１４４乃至１８３のいずれか一つをカルボキ
シル末端とするアミノ酸配列、(d)配列表の配列番号１
８のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、
アミノ酸番号２２をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０
２乃至２７６のいずれか１つをカルボキシル末端とする
アミノ酸配列、(e)配列表の配列番号２０のアミノ酸配
列中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２
３をアミノ末端とし、アミノ酸番号２０６乃至２７５の
いずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(f)配列表の配列番号２２のアミノ酸配列中の連続した
アミノ酸配列であって、アミノ酸番号２１をアミノ末端
とし、アミノ酸番号１８５乃至２５８のいずれか１つを
カルボキシル末端とするアミノ酸配列、(g)配列表の配
列番号２４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した
１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２７をアミ
ノ末端とし、アミノ酸番号１２２乃至１２９のいずれか
１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、(h)配列
表の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端と
し、４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(i)配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をアミノ
末端とし、４９１をカルボキシル末端とするアミノ酸配
列、(j)配列表の配列番号２０のアミノ酸番号２３をア
ミノ末端とし、４９３をカルボキシル末端とするアミノ
酸配列、(k)配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１
をアミノ末端とし、４７０をカルボキシル末端とするア
ミノ酸配列、(l)配列表の配列番号２４のアミノ酸番号
２７をアミノ末端とし、３４６をカルボキシル末端とす
るアミノ酸配列、の(a)乃至(l)のいずれかのアミノ酸配
列のアミノ末端側に、該アミノ酸配列を切断しないプロ
テアーゼによって特異的に切断されるアミノ酸配列が連
結し、さらにそのアミノ末端側に特定の化合物と特異的
な親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列が連結して
いる、アミノ酸配列からなる融合タンパク質を大腸菌に
生産させ、次いで該融合タンパク質を、特定の化合物と
の親和性を利用して精製した後に、前記プロテアーゼに
よって、アミノ末端側の上記特定の化合物との親和性を
有するタンパク質のアミノ酸配列を除去する方法を挙げ
ることができる。このような特定の化合物との親和性を
利用した精製例としては、例えば、グルタチオン・Ｓ−
トランスフェラーゼ（以下「ＧＳＴ」という）のアミノ
酸配列が連結している融合タンパク質を大腸菌に生産さ
せ、次いで該融合タンパク質をグルタチオンとＧＳＴと
の親和性を利用して精製した後、プロテアーゼによって
ＧＳＴ配列を除去する方法を挙げることができる。ただ
し、本明細書中の実施例で示されているように、本発明
のポリペプチドは、ＧＳＴ配列を除去しない融合タンパ
ク質の状態であっても、その機能を損なわない。

【０２６６】また、「アンジオポエチン関連タンパク
質」のアミノ末端側(シグナルペプチド内)に、精製を容
易にするためのヒスチジンタグが挿入され、かつ、カル
ボキシル末端側のフィブリノーゲン結合領域を欠失して
いるポリペプチドも血中中性脂肪濃度上昇機能を失わ
ず、例えば、配列表の配列番号２４に示されるような、
「アンジオポエチン関連タンパク質３」のアミノ末端側
（シグナルペプチド内）に、精製を容易にするためのヒ
スチジンタグが挿入され、かつカルボキシル末端側の２
５３残基を欠失しているポリペプチドもまた、その機能
を保持している。

【０２６７】すなわち、本発明は、(a)配列表の配列番
号１２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミ
ノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端と
し、アミノ酸番号１４７乃至２０７のいずれか１つをカ
ルボキシル末端とするアミノ酸配列、(b)配列表の配列
番号１２のアミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ
酸番号１４７乃至１９５のいずれか１つをカルボキシル
末端とするアミノ酸配列、(c)配列表の配列番号１６に
示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列
であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ
酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(d)配列表の配列番号１８のアミノ酸配列中の連続した1
つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２２をアミノ
末端とし、アミノ酸番号２０２乃至２７６のいずれか１
つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、(e)配列表
の配列番号２０のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配
列であって、アミノ酸番号２３をアミノ末端とし、アミ
ノ酸番号２０６乃至２７５のいずれか１つをカルボキシ
ル末端とするアミノ酸配列、(f)配列表の配列番号２２
のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であって、ア
ミノ酸番号２１をアミノ末端とし、アミノ酸番号１８５
乃至２５８のいずれか１つをカルボキシル末端とするア
ミノ酸配列、(g)配列表の配列番号２４のアミノ酸配列
中の連続したアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２７
をアミノ末端とし、アミノ酸番号１２２乃至１２９のい
ずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(h)配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６をアミノ
末端とし、４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配
列、(i)配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をア
ミノ末端とし、４９１をカルボキシル末端とするアミノ
酸配列、(j)配列表の配列番号２０のアミノ酸番号２３
をアミノ末端とし、４９３をカルボキシル末端とするア
ミノ酸配列、(k)配列表の配列番号２２のアミノ酸番号
２１をアミノ末端とし、４７０をカルボキシル末端とす
るアミノ酸配列、(l)配列表の配列番号２４のアミノ酸
番号２７をアミノ末端とし、３４６をカルボキシル末端
とするアミノ酸配列、の(a)乃至(l)のいずれかと、任意
のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなり、か
つ哺乳動物において血中中性脂肪濃度を上昇させる活性
を有するポリペプチドも包含するものである。なお、こ
の場合、連結されるアミノ酸配列として、各ヒト・「ア
ンジオポエチン関連タンパク質」のアミノ酸配列由来の
連続した１８残基以上のアミノ酸配列は含まれない。

【０２６８】「アンジオポエチン関連タンパク質」のｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列情報は国立遺伝学研究所のデ
ータベース（ＧｅｎｅＢａｎｋ）から得ることができ
る。「アンジオポエチン関連タンパク質１」はアクセッ
ション番号ＸＭ＿００１７２０、「アンジオポエチン関
連タンパク質２」はアクセッション番号ＮＭ＿０１２０
９８、「アンジオポエチン関連タンパク質３」はアクッ
セッション番号ＡＦ１５２５６２、「アンジオポエチン
関連タンパク質４」はアクセッション番号ＡＦ２０２６
３６、「アンジオポエチン関連タンパク質５」はアクセ
ッション番号ＮＭ＿０３１９１７、「アンジオポエチン
関連タンパク質６」はアクセッション番号Ｙ１６１３２
で登録されている。

【０２６９】配列表の配列番号１１のヌクレオチド番号
１８を５'末端とし、ヌクレオチド番号４５８乃至６３
８のいずれか１つを３'末端とするヌクレオチドは、例
えばヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからクローニングし
たヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコー
ドするｃＤＮＡ、または独立行政法人産業技術総合研究
所・特許生物寄託センターに国際寄託されている組換え
大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１ ＳＡＮ
Ｋ ７２２９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４１）が保持す
る組換えファージミドを鋳型とし、所望のヌクレオチド
配列からなるＤＮＡが増幅されるように設計したオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応
（以下「ＰＣＲ」という）を行うことにより得ることが
できる。あるいは、組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＴ
ｒｉｐ／ｈ５５−１ ＳＡＮＫ７２２９９（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６９４１）が保持する組換えファージミドｐＴｒ
ｉｐ／ｈ５５−１に挿入されているｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列中の所望の位置に、該ｃＤＮＡのオープンリー
ディングフレームと同一のリーディングフレーム上で終
止コドンとなるヌクレオチド配列が挿入されるような部
位特異的人工突然変異を施すことにより得ることもでき
る。 (a)配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列
に含まれる連続した１つの配列であってヌクレオチド番
号４３４を５'末端とし、ヌクレオチド番号１０３９乃
至１２６１のいずれか１つを３'末端とするヌクレオチ
ド配列からなるヌクレオチド、(b)配列表の配列番号１
７に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つ
の配列であって、ヌクレオチド番号４３４のヌクレオチ
ドを５'末端とし、ヌクレオチド番号１９０９を３'末端
とするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド、(c)配
列表の配列番号１９に示されるヌクレオチド番号２２を
５'末端としヌクレオチド番号６３９乃至８４６のいず
れか１つを３'末端とするヌクレオチド配列からなるヌ
クレオチド、(d)配列表の配列番号１９に示されるヌク
レオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、
ヌクレオチド番号２２のヌクレオチドを５'末端とし、
ヌクレオチド番号１５０３を３'末端とするヌクレオチ
ド配列からなるヌクレオチド、(e)配列表の配列番号２
１のヌクレオチド番号２４２を５'末端としヌクレオチ
ド番号７９６乃至１０１５のいずれか１つを３'末端と
するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド、(f)配列表
の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に含まれる
連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２４２
のヌクレオチドを５'末端とし、ヌクレオチド番号１６
５４を３'末端とするヌクレオチド配列からなるヌクレ
オチド、(g)配列表の配列番号２３に示されるヌクレオ
チド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌク
レオチド番号８６のヌクレオチドを５'末端とし、ヌク
レオチド番号３７３乃至３９４のいずれか１つのヌクレ
オチドを３'末端とするヌクレオチド配列からなるヌク
レオチド、(h)配列表の配列番号２３に示されるヌクレ
オチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌ
クレオチド番号８６のヌクレオチドを５'末端とし、ヌ
クレオチド番号１０４８を３'末端とするヌクレオチド
配列からなるヌクレオチド、の(a)乃至(h)はいずれも、
ヒトの適当な臓器由来のｃＤＮＡライブラリーからクロ
ーニングしたヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質
１、２、４、５、６」をコードするｃＤＮＡ、または、
市販のｃＤＮＡクローン（例えばＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ
Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより購入できる）を鋳型とし、所
望のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが増幅されるよう
に設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣ
Ｒを行なうことにより得ることができる。

【０２７０】しかしながら、本発明のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡはこれらに限定されず、例えば上記した
遺伝子組換えの手法において用いられる宿主のコドン使
用頻度を考慮して適宜改変されたものや、また例えば人
工合成ＤＮＡを連結して得られたものでも、宿主細胞に
おいて、(a)配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸
配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ
酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃至
２０７またはアミノ酸番号１４７乃至１９５のいずれか
１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポ
リペプチド、(b)配列表の配列番号１６に示されるアミ
ノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、ア
ミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３
をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペ
プチド、(c)配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸
配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、
アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４
４乃至１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とする
アミノ酸配列からなるポリペプチド、(d)配列表の配列
番号１８のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配列であ
って、アミノ酸番号２２をアミノ末端とし、アミノ酸番
号２０２乃至２７６のいずれか１つをカルボキシル末端
とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、(e)配列表
の配列番号２０のアミノ酸配列中の連続したアミノ酸配
列であって、アミノ酸番号２３をアミノ末端とし、アミ
ノ酸番号２０６乃至２７５のいずれか１つをカルボキシ
ル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチド、(f)
配列表の配列番号２２のアミノ酸配列中の連続したアミ
ノ酸配列であって、アミノ酸番号２１をアミノ末端と
し、アミノ酸番号１８５乃至２５８のいずれか１つをカ
ルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド、(g)配列表の配列番号２４に示されるアミノ酸配列
に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミ
ノ酸番号２７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１２２乃
至１２９のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミ
ノ酸配列からなるポリペプチド、(h)配列表の配列番号
１６のアミノ酸番号２６をアミノ末端とし、４０６をカ
ルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド、(i)配列表の配列番号１８のアミノ酸番号２２をア
ミノ末端とし、４９１をカルボキシル末端とするアミノ
酸配列からなるポリペプチド、(j)配列表の配列番号２
０のアミノ酸番号２３をアミノ末端とし、４９３をカル
ボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド、(k)配列表の配列番号２２のアミノ酸番号２１をア
ミノ末端とし、４７０をカルボキシル末端とするアミノ
酸配列からなるポリペプチド、(l)配列表の配列番号２
４のアミノ酸番号２７をアミノ末端とし、３４６をカル
ボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド、の(a)乃至(l)いずれかのポリペプチドを産生するこ
とが可能であるようなヌクレオチド配列を有するもので
あれば本発明に包含される。

【０２７１】そのような、本発明のポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、適当なベク
ターＤＮＡに組み込んで得られた組換えベクターは、原
核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換すること
ができる。さらにこれらのベクターに適当なプロモータ
ー、および形質発現に関わる配列を導入することによ
り、それぞれの宿主において導入した遺伝子を発現する
ことが可能である。

【０２７２】原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌
（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）
などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内
で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプ
リコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラ
スミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベ
クターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の
選択性を付与することができる配列を有するものが好ま
しい。

【０２７３】例えば、大腸菌としてはＫ１２株やＪＭ１
０９株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般に
ｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、
これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクター
がいずれも使用できる。

【０２７４】大腸菌内で他の生物由来のタンパク質を発
現させる場合には、生物種間におけるコドンの使用頻度
の違いにより、翻訳効率が制限されることがあり、これ
は大腸菌の細胞内のｔＲＮＡ量に偏りがあり、何種類か
のｔＲＮＡが枯渇してしまうことが原因と考えられる。
このような場合、大腸菌内で比較的量の少ないｔＲＮＡ
の量を多く発現するようにした株を用いる発現がうまく
いくことがある。このような大腸菌としては例えば、大
腸菌のＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ （ＤＥ３）−Ｒ
ＩＬを挙げることができる。本株は大腸菌内では比較的
少量のｔＲＮＡ遺伝子（アルギニン・イソロイシン・ロ
イシン）のコピー数を増した菌株である。

【０２７５】プロモーターとしては、大腸菌において
は、トリプトファン（trp）プロモーター、ラクトース
（lac）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（t
ac）プロモーター、リポプロテイン（lpp）プロモータ
ー、ポリペプチド鎖伸張因子Tu（tufB）プロモーター等
が挙げられ、どのプロモーターも目的のポリペプチドの
産生に使用することができる。

【０２７６】枯草菌としては、例えば２０７−２５株が
好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ohmura,
K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93）などが用い
られるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα
−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮ
Ａ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可
能となる。

【０２７７】真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆
虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、
例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1
981) Cell 23, 175-182、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５
０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細
胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素
欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220）等がよく用いら
れているが、これらに限定されない。

【０２７８】脊椎動物細胞の発現プロモーターとして
は、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロ
モーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部
位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さ
らにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現
ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを
有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani, S. et al. (198
1) Mol. Cell. Biol. 1,854-864）等が挙げられるが、
これに限定されない。

【０２７９】宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合
を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製
起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であ
り、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、お
よびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることが
できる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusso
n, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308)、リ
ン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and
van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）、
および電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982)
EMBO J. 1, 841-845）などによりＣＯＳ細胞に取り込ま
せることができ、かくして所望の形質転換細胞を得るこ
とができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる
場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性
マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベク
ター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook, J. et al. (1
989) : "Molecular CloningA Laboratory Manual" Cold
Spring Harbor Laboratory, NY）やｐＳＶ２−ｎｅｏ
（Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. App
l. Genet. 1, 327-341）などをコ・トランスフェクト
し、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目
的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得る
ことができる。

【０２８０】昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera frugiperdaの卵巣細胞
由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やTrichopl
usia niの卵細胞由来High Five細胞（Wickham, T. J. e
t al, (1992) Biotechnol. Prog. I: 391-396）などが
宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストラン
スファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイ
ルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパク質のプロモ
ーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用い
られる（Kidd, I. M. and V.C. Emery (1993) The use
of baculoviruses as expression vectors. Applied Bi
ochemistry and Biotechnology 42, 137-159)。この他
にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性タンパク質
のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さら
に、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面タンパク質ＧＰ６７
の分泌シグナル配列を目的タンパク質のアミノ末端側に
繋げることにより、組換えタンパク質を分泌タンパク質
として発現させることも可能である（Zhe-mei Wang, et
al. (1998) Biol. Chem., 379, 167-174)。

【０２８１】真核微生物を宿主細胞とした発現系として
は、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカ
ロミセス属酵母、例えばパン酵母Saccharomyces cerevi
siaeや石油酵母Pichia pastorisが好ましい。該酵母な
どの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アル
コール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen,J.
L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 301
8-3025）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター
（Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 80, 1-5）などを好ましく利用できる。また、
分泌型タンパク質として発現させる場合には、分泌シグ
ナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは
既知のプロテアーゼの切断部位をアミノ末端側に持つ組
換え体として発現することも可能である。例えば、トリ
プシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプタ
ーゼを石油酵母で発現させた系では、アミノ末端側に酵
母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つ
ＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させるこ
とにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されるこ
とが知られている（Andrew, L. Niles,et al. (1998) B
iotechnol.Appl.Biochem. 28, 125-131)。

【０２８２】上記のようにして得られる形質転換体は、
常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、
または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培
養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じ
て慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記
ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッ
コ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの
培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加
したものを使用できる。

【０２８３】上記培養により、形質転換体の細胞内また
は細胞外に産生される組換えタンパク質は、該タンパク
質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知
の分離操作法により分離・精製することができる。該方
法としては、具体的には例えば、通常の蛋白沈殿剤によ
る処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲ
ル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体
クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例
示できる。また、発現させる組換えタンパク質に６残基
からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフ
ィニティーカラムで効率的に精製することができる。上
記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度
で本発明のポリペプチドを大量に製造できる。

【０２８４】本発明のポリペプチドは、上記の方法に従
って得られる他、該ポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を有するＤＮＡを組み込んだアデノウイルスベ
クターを利用して動物細胞に産生させることもできる。
そのような組換えアデノウイルスベクターを構築する方
法として、市販のキット（例えば、アデノウイルス・エ
クスプレッション・ベクター・キット、宝酒造（株）社
製）を用いる方法を例示できる。本発明のポリペプチド
が哺乳動物の血中中性脂肪濃度と密接に相関しているこ
とは、例えば上記のようにして得られる組換えアデノウ
イルスベクターを有する組換えアデノウイルスを哺乳動
物、例えばマウスに感染させて、該組換えアデノウイル
スベクターが保持する遺伝子を発現させると、血中中性
脂肪（トリグリセリド）濃度の上昇が観察されることか
ら証拠付けられる。

【０２８５】「アンジオポエチン関連タンパク質」をマ
ウス血中に投与すると、カルボキシル末端のペプチドが
除去されたペプチドが生成する。例えば、「アンジオポ
エチン関連タンパク質３」を血中に投与するとアミノ酸
の配列番号５２のアミノ酸番号２２１と２２２の間で切
断されたポリペプチドと、アミノ酸番号２２４と２２５
の間で切断されたペプチドの２種類のポリペプチドが取
得できる。即ち、血中脂質濃度の上昇には、「アンジオ
ポエチン関連タンパク質」を投与してもよいし、「アン
ジオポエチン関連タンパク質」のうちヘリックス領域の
みを含むように改変した変異体ポリペプチドを投与して
もよい。

【０２８６】前記方法によって得られる本発明のポリペ
プチドは、例えば以下に記載するような高脂血症、動脈
硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の
疾患の治療または予防剤の試験方法に用いることができ
る。

【０２８７】まず、この方法で用いられる非ヒト動物
は、例えば、「アンジオポエチン関連タンパク質」（例
えば、「アンジオポエチン関連タンパク質３」および／
または「アンジオポエチン関連タンパク質４」）を正常
に産生しない突然変異遺伝子を有するＫＫ／Ｓｎｋマウ
スや、「アンジオポエチン関連タンパク質」（例えば、
「アンジオポエチン関連タンパク質３」および／または
「アンジオポエチン関連タンパク質４」）遺伝子を発現
しないように遺伝子操作されたノックアウトマウスが好
適であるが、これらに限定されない。

【０２８８】投与するポリペプチドとしては、［１］
「アンジオポエチン関連タンパク質３」を正常に産生し
ない突然変異遺伝子を有するＫＫ／Ｓｎｋマウスに対し
ては、例えば、配列表の配列番号１２に示されるアミノ
酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミ
ノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７乃
至２０７のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを用いたり、［２］「ア
ンジオポエチン関連タンパク質４」を正常に産生しない
突然変異遺伝子を有するＫＫ／Ｓｎｋマウスに対しては
例えば、配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列
中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番
号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３乃至１８
３のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配
列を有するポリペプチドを用いることができるが、血中
中性脂肪濃度の上昇が確認できる限りにおいてこれらに
制限されない。本発明のポリペプチドは単独で用いても
２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【０２８９】本発明のポリペプチドの上記動物への投与
方法としては、血管への投与、経口投与等が挙げられる
が、血中中性脂肪濃度の上昇が確認できる限り、投与方
法に制限はない。本発明のポリペプチドの上記動物への
投与量は血中脂肪濃度の上昇が確認できる限りにおいて
制限されないが、例えば、マウスの尾静脈に投与する場
合には、マウス体重１ｇ当たり、０．０１μｇ乃至１０
ｍｇの範囲で投与することができる。

【０２９０】上記動物に本発明のポリペプチドを投与す
ると、血中中性脂肪（トリグリセリド）濃度の上昇が観
察される。

【０２９１】この実験系においては、本発明のポリペプ
チドと被験物質を試験動物に投与して、血中中性脂肪濃
度が低下する物質を選択する。より好ましくは、［１］
本発明のポリペプチドのみを投与した動物、［２］被験
物質のみを投与した動物および、［３］両者を投与した
動物の間で結果を比較し、［２］の動物において血中中
性脂肪濃度に影響を及ぼさず、かつ［３］の動物におい
て［１］の動物と比較して顕著に血中中性脂肪濃度を低
下させる物質を、本発明のポリペプチドの機能を特異的
に抑制する物質として選択する。この方法では、本発明
のポリペプチド自体の機能や、該ポリペプチドと相互作
用して該ポリペプチドの機能発現に寄与する因子（例え
ば、レセプター）等、該ポリペプチドの作用による血中
中性脂肪濃度の上昇に関わる生体反応のいずれかを阻害
する物質を見出すことができる。そのような物質は高脂
血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは
二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得る。

【０２９２】一方、本発明のポリペプチドはイン・ビト
ロでＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの活性を阻害する効
果を有するので、以下に記載するようなＬＰＬおよび／
またはＨＴＧＬ活性を調節する物質の試験方法に用いる
ことができる。

【０２９３】この試験方法は、ＬＰＬおよび／またはＨ
ＴＧＬの活性測定方法において、ＬＰＬおよび／または
ＨＴＧＬ反応時に、本発明のポリペプチドと、ＬＰＬお
よび／またはＨＴＧＬの活性を調節する作用を調べよう
とする物質（以下「被験物質」という）とを共存させる
ことにより実施することができる。より具体的には、以
下に記載する［１］−ａ乃至［３］または［１］−ｂ乃
至［３］の材料を共存させてＬＰＬ活性を調べる系にお
いて、さらに被験物質を加えたときの、ＬＰＬ活性の変
化を調べる。

【０２９４】［１］−ａ ＬＰＬを含む材料 ＬＰＬを含む材料としては、ＬＰＬを産生している、哺
乳動物脂肪細胞由来または脂肪細胞の前駆細胞由来の細
胞株の培養上清を用いることができる。細胞株が未分化
である場合は、脂肪細胞に分化させてから材料を調製す
ることが好ましい。ＬＰＬを産生している細胞株として
は例えば、マウス細胞株３Ｔ３−Ｌ１（大日本製薬
（株）社より購入可能）、同３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ、同Ｏ
ｂ１７等を挙げることができる。あるいは、ラット白色
前駆脂肪細胞（初代培養細胞）を脂肪細胞に分化させた
細胞も好適に用いることができるが、本発明はこれらに
限定されない。

【０２９５】また、ＬＰＬを含む材料として、精製ＬＰ
Ｌや組換えＬＰＬ（Methods Enzymol. (1996) 263, 319
-26参照）を使用することもできる。例えば、牛乳由来
のＬＰＬ（シグマ社より市販されている）を本発明の方
法に使用することが可能である。

【０２９６】［１］−ｂ ＬＰＬおよびＨＴＧＬを含む
材料 ＬＰＬおよびＨＴＧＬを含む材料としては、体重１ｋｇ
あたり１０乃至１００単位のヘパリンを静注して１０分
乃至１５分経過後の哺乳動物から採取した末梢血由来の
血漿が好適である。

【０２９７】［２］または［２］−ｂ ＬＰＬおよび／
またはＨＴＧＬの基質を含む材料 次に、ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含む材料
は、これらリパーゼの触媒により脂肪酸を遊離すること
が知られている物質を含み、かつこれらリパーゼの活性
を阻害したり不活性化する成分が含まれていないもので
あればよいが、例えばグリセロール・トリ［９，１０
（ｎ）−³Ｈ］オレイン酸のようにＬＰＬの触媒により
遊離される脂肪酸が放射性同位元素で標識してある化合
物や、同様に特定の励起波長下で蛍光を発する物質で標
識された化合物が特に好適である。また、遊離脂肪酸の
量を生化学的な方法で測定する場合には、標識されてい
ない基質（例えばグリセロール・トリオレイン酸）も用
いられ得る。

【０２９８】［３］本発明のポリペプチド 本発明のポリペプチドとしては、配列表の配列番号４の
アミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列か
らなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２
５３残基を欠くポリペプチド、または請求項１８乃至３
４記載のポリペプチドを用いることができるが、これら
に限定されない。

【０２９９】本発明の方法における被験物質は、特に限
定されず、微生物の培養液や動植物の組織からの抽出
物、培養細胞の培養液からの抽出物、人工的に合成され
た無機または有機化合物、組換えタンパク質、抗体また
はその断片、もしくはそれらの中の複数種類の物質を混
合した組成物などがいずれも用いられ得る。

【０３００】その他、反応液には、必要に応じ、ｐＨ調
整のための緩衝液や、アルブミンなどのタンパク質成分
が添加され得る。

【０３０１】これらの材料を混合し、以下に記載する条
件でＬＰＬ反応を行う： 温度条件： ２７乃至３７℃、好適には３７℃； 反応液のｐＨ： ８．０乃至８．５、好適には８．０； 反応液中の塩化ナトリウム濃度： ０．１乃至０．１５
Ｍ、好適には０．１５Ｍ； 反応時間： １５乃至１２０分、好適には１２０分。

【０３０２】なお、ヘパリン投与した哺乳動物由来の血
漿のように、ＬＰＬとＨＴＧＬの両方を含む材料を用い
る場合は、上記条件でＬＰＬとＨＴＧＬとを合わせたリ
パーゼ活性が測定できる。ＨＴＧＬ活性のみを測定する
場合には、他の条件は変えずに塩化ナトリウム濃度を１
Ｍにすることにより、ＬＰＬが不活性化された条件でリ
パーゼ反応を進行させる。ＬＰＬ活性は総リパーゼ活性
からＨＴＧＬ活性を差し引いた値となる。

【０３０３】反応終了後、反応液に有機溶媒を添加、混
合してから遊離脂肪酸を含む層と未反応の基質を含む層
とを分離させ、前者に集まった遊離脂肪酸の量を測定す
る。

【０３０４】また、標識されていない基質を用いた場合
の試験方法の例を以下に示す（Clin.Chem. 30,748(198
4)）。

【０３０５】基質溶液０．５ｍｌ（７．５μｍｏｌ グ
リセロール・トリオレイン酸、２２．５ｍｇ アラビア
ゴム、１００μｍｏｌ トリス−塩酸（ｐＨ８．２）、
５０μｍｏｌ 塩化ナトリウム、２５ｍｇ アルブミ
ン、１４０μｌ ヒト血漿）を３７℃で８０分間インキ
ュベートした後、脂肪細胞培養上清を加え、また同時に
本発明のポリペプチドと被験物質を添加して、２８℃で
６０分間反応させる。次に反応液に２．５ｍｌのイソプ
ロパノール：ヘプタン：硫酸（２．５ｍｏｌ／Ｌ）＝４
０：１０：２（ｖ／ｖ）を加え、１０分間混合し、室温
で４０分放置後、有機層を１ｍｌ採取し、窒素乾固す
る。得られたものを５％ トリトン Ｘ−１００溶液に
て溶解し、市販の脂肪酸測定キット（例えばＮＥＦＡ−
テストワコー（和光純薬（株）社製））等を利用して脂
肪酸量を測定する。

【０３０６】上記方法により試験を行った結果、本発明
のポリペプチドによるＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの
活性阻害を抑制し、結果的にＬＰＬおよび／またはＨＴ
ＧＬ活性を上昇させた被験物質は、血中の中性脂肪濃度
を低下させる、新しい高脂血症、動脈硬化および高血糖
から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または
予防剤の候補として選択される。

【０３０７】ＩＩＩ．プロモーターＤＮＡを用いた試験
方法 本発明のＤＮＡは、マウスゲノムより作成した遺伝子ラ
イブラリーから、例えば、マウス「アンジオポエチン関
連タンパク質３」 ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（Conk
lin, D. et al.Genomics 62, 477-482 (1999)）または
マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」 ｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列(Kersten, S., etal. (2000) J.
Biol. Chem. 275, 28488-28493；Yoon, J. C., et al.
(2000)Mol. Cell. Biol. 20, 5343-5349）の５'末端側
をプローブとして利用したスクリーニングにより単離す
ることができる。または、この配列の情報に基いて、マ
ウスゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応
（以下「ＰＣＲ」という）により、ライブラリーのスク
リーニングの工程を経ずに直接本発明のＤＮＡを増幅す
ることもできる。

【０３０８】なお、本発明のＤＮＡが挿入されている組
換えプラスミドｐＧＬ８−３は、2001（平成13）年６月
７日付で独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄
託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
７６２７が付されている。したがって、本発明のＤＮＡ
は、当該プラスミドから取得することもできる。

【０３０９】なお、本発明の属する技術分野における通
常の知識を有する者であれば、天然型のプロモーターＤ
ＮＡのヌクレオチド配列の一部を他のヌクレオチドへの
置換やヌクレオチドの欠失、付加などの改変により、天
然型のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性を
有するＤＮＡを調製することが可能である。このように
天然型のヌクレオチド配列においてヌクレオチドが置
換、欠失、もしくは付加したヌクレオチド配列を有し、
天然型のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性
を有するＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。ヌク
レオチド配列の改変は、例えば、制限酵素あるいはＤＮ
Ａエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異
誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ
法によるプロモーター配列の改変、合成変異ＤＮＡの直
接導入などの方法により行うことができる。これらのう
ち好適なものは、配列表の配列番号２７のヌクレオチド
番号１から５１０で示されるヌクレオチド配列または配
列表の配列番号２のヌクレオチド番号１から２６０で示
されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡであり、より好適
には配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５
２６で示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番
号２８のヌクレオチド番号１から１８８で示されるヌク
レオチド配列からなるＤＮＡである。

【０３１０】また、本発明のＤＮＡとしては、配列表の
配列番号２７のヌクレオチド番号１からヌクレオチド番
号５２６で示されるヌクレオチド配列または配列番号２
８のヌクレオチド番号１から２６０で示されるヌクレオ
チド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。
このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、プロモータ
ー活性を有するものであればよい。このようなＤＮＡ
は、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１から５
２６で示されるヌクレオチド配列または配列番号２８の
ヌクレオチド番号１から２６０で示されるヌクレオチド
配列と、通常、７０％以上、好ましくは８０％以上、よ
り好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列の同一性を
有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見され
る変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種
生物由来の相同遺伝子等が含まれる。

【０３１１】本発明において、ストリンジェントな条件
下でのハイブリダイゼーションは、通常のストリンジェ
ントな条件（ローストリンジェントな条件）では、ハイ
ブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ 塩化
ナトリウム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）または
これと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、
３７−４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳ
Ｃまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予
備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃
度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。また、
より高いストリンジェンシーを有する条件（ハイストリ
ンジェントな条件）では、前記において、洗浄を０．１
×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で行うこと
により実施できる。

【０３１２】このようにして得られた本発明のＤＮＡが
プロモーター活性を有するか否かは、下記に説明するよ
うに、その下流にルシフェラーゼ等のマーカー遺伝子を
連結したもの（以下「レポーター遺伝子」という）で哺
乳動物細胞を形質転換し、この形質転換細胞におけるマ
ーカー遺伝子の発現が検出されるか否かを調べることに
よって確認することができる。

【０３１３】本発明で用いられる発現ベクターは外来遺
伝子の上流側に外来遺伝子配列と同じ転写の方向で本発
明のＤＮＡが連結されており、哺乳動物細胞中で外来遺
伝子を発現させ得るものである。かかる発現ベクター
は、外来遺伝子の上流に本発明のＤＮＡが連結されてい
るため、本発明のＤＮＡ中におけるプロモーターの制御
下に外来遺伝子を発現することができる。本発明の発現
ベクターは、哺乳動物細胞に導入することにより複製さ
れ得る形態であればよく、例えば、適当なレプリコンを
有する環状または直線状のいずれであってもよい。

【０３１４】ウイルスベクターによる遺伝子導入方法と
しては例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデ
ノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイル
ス、ポックスウイルス、ポリオウイルス等のＤＮＡウイ
ルス、またはＲＮＡウイルスにｃＤＮＡを組み込んで導
入する方法が挙げられる。なかでも、レトロウイルス、
アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイ
ルスを用いた方法が好ましい。

【０３１５】非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、
発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワ
クチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイ
クロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレク
トロポレーション法等が挙げられ、なかでも、ＤＮＡワ
クチン法、リポソーム法が好ましい。

【０３１６】該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル
（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman, H. and Magn
usson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-130
8)、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F.
L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-4
57）、および電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al.
(1982) EMBO J. 1, 841-845）およびリポフェクション
法（Lopata et al. (1984)Nucl. Acids Res. 12, 5707-
5717, Sussman and Milman (1984) Mol. Cell. Biol.
4, 1641-1643）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませること
ができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができ
る。ただし、培養細胞株がいわゆる浮遊細胞である場合
は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用
いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる
細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件
を用いる。

【０３１７】また、動物から受精卵を取得し、遺伝子導
入の後、偽妊娠動物に移植し、発生させることにより得
たトランスジェニック動物を用いることもでき、その手
順は公知の方法［発生工学実験マニュアル（野村達次
監修、勝木元也 編、1987年刊）、特開平５−４８０９
３号等参照］に従えばよい。具体的には、例えば、マウ
スの場合にはまずメスマウスに排卵誘起剤を投与後、同
系統のオスと交配し、翌日メスマウスの卵管より前核受
精卵を採取する。次いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微
小ガラス管を用いて受精卵の前核に注入する。なお、導
入する遺伝子を動物細胞内で発現させるために本発明の
ＤＮＡをプロモーターとして有し、エンハンサー等の調
節遺伝子は、導入された動物の細胞内で機能するもので
あれば特に限定されない。ＤＮＡを注入した受精卵は、
偽妊娠仮親メスマウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移
植し、役２０日後に自然分娩または帝王切開により出生
させる。

【０３１８】こうして得られた動物が、導入遺伝子を保
持していることを確認する方法としては、例えば：前記
動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡをこれに特異
的なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いてＰＣ
Ｒ増幅する方法、該ＤＮＡを制限酵素で消化後、ゲル電
気泳動し、ゲル中のＤＮＡをナイロン膜等にブロッティ
ングした後、標識した導入遺伝子の全部または一部をプ
ローブとしてサザンブロット解析を行なう方法等を挙げ
ることができる。

【０３１９】外来遺伝子としては、対象疾患を治療する
ためのタンパク質をコードする遺伝子、マーカー遺伝子
などが挙げられる。

【０３２０】以下、本発明のＤＮＡの使用方法について
述べる。

【０３２１】１）誘導型発現ベクターとしての利用 本発明のＤＮＡが、ある特異的な刺激によりプロモータ
ー活性を表すことが判明した場合、所望の遺伝子の上流
に本発明のＤＮＡを挿入したベクターなどを作製して体
細胞に導入し、該刺激を付加することにより、該所望の
遺伝子を誘導的に発現させることができる。

【０３２２】２）ＤＮＡによる拮抗阻害を利用したＤＮ
Ａのプロモーター活性調節 本発明は、上記プロモーターＤＮＡの配列の少なくとも
一部を含むＤＮＡ（その誘導体を含む。以下「部分配
列」という）に関する。このような部分配列を用いるこ
とにより、該部分配列自体がプロモーター活性を有する
か否かを問わず、上記プロモーターＤＮＡとこれに結合
しうるタンパク質（例えば、転写因子）との結合を拮抗
阻害する方法を実施することが可能である。例えば、該
部分配列が、本発明のＤＮＡ配列上においてそのプロモ
ーター活性を阻害するタンパク質の結合部位に相当する
場合には、この方法によりプロモーター活性を促進する
ことができ、逆にプロモーター活性を促進するタンパク
質（転写因子を含む）の結合部位に相当する場合には、
プロモーター活性を阻害することができる。このような
拮抗阻害に用いる部分配列ＤＮＡは、通常少なくとも６
ヌクレオチド、好ましくは１０ヌクレオチド以上の鎖長
を有する。また、拮抗阻害に用いるために選択される部
分配列の種類としては、例えば、プロモーター上の転写
因子の結合コンセンサス部位を含む配列が挙げられる。
また、そうした部分配列ＤＮＡの誘導体としては、いく
つかの部分配列を連結したものや、それをアデノウイル
スベクター等に組み込んで動物細胞への遺伝子導入を可
能にしたもの、また、ＤＮＡの３'末端もしくは５'末端
にビオチンを連結したもの等が用いられ得る。

【０３２３】下記実施例において明らかなように、「ア
ンジオポエチン関連タンパク質３」および「アンジオポ
エチン関連タンパク質４」は、低脂血症マウスで強制発
現させると血中の中性脂肪濃度が上昇する。「アンジオ
ポエチン関連タンパク質３」が正常に産生されない変異
遺伝子の影響により、顕著な血中脂質濃度の低下、動脈
硬化の進展抑制および高血糖の改善が観察され、「アン
ジオポエチン関連タンパク質４」についても同様の現象
が観察されると考えられるので、本発明のＤＮＡが有す
るプロモーター活性を抑制する機能を有する部分配列ま
たはその誘導体は高脂血症、動脈硬化および高血糖から
選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防
のための医薬組成物の有効成分として有用である。

【０３２４】３）プロモーター活性を調節するタンパク
質のスクリーニング 本発明のＤＮＡのプロモーター活性の調節には、上記の
ような部分配列等を用いた拮抗阻害の他に、本発明のＤ
ＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質を利用す
る方法を用いることもできる。本発明のＤＮＡは、その
プロモーター活性を調節するタンパク質のスクリーニン
グに利用することが可能である。したがって、本発明
は、下記に示すような、該ＤＮＡのプロモーター活性を
調節するタンパク質のスクリーニング方法に関する。そ
のようなタンパク質としては、直接本発明のＤＮＡに結
合してそのプロモーター活性を促進あるいは阻害するタ
ンパク質の他に、細胞膜受容体や細胞内タンパク質に作
用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を促
進あるいは阻害するタンパク質が含まれる。

【０３２５】３−１）プロモーターＤＮＡに結合するタ
ンパク質のスクリーニング この方法は、本発明のＤＮＡに被験タンパク質試料を接
触させ、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質を選択す
る工程を含む。このような方法としては、例えば、本発
明のプロモーターＤＮＡを用いた、これに結合するタン
パク質のアフィニティー精製が挙げられる。具体的な方
法の一例を示せば、本発明のプロモーターＤＮＡをビオ
チン化し、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズに
結合させてＤＮＡアフィニティービーズを作製する。次
いで、これを細胞の核抽出液とインキュベートして本発
明のＤＮＡと特異的に結合する核抽出液中のタンパク質
を精製し、この構造を決定する。これにより、直接本発
明のＤＮＡと結合するタンパク質、およびＤＮＡ結合活
性は持たないがサブユニットとして該タンパク質と複合
体を形成し本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が精製
できる（GabrielsenO.S et al., Nucleic acid Researc
h 17, 6253-6267 (1989)、Savoysky E et al., Oncogen
e 9, 1839-1846 (1994)）。

【０３２６】３−２）プロモーター活性を指標にしたタ
ンパク質のスクリーニング この方法は、本発明のＤＮＡの下流に連結されたマーカ
ー遺伝子［下記５−２）において詳述する］を保持する
細胞に被験ＤＮＡを導入し、マーカー遺伝子の発現を調
節する発現産物を選択する工程を含む。このような方法
には、例えば、酵母や動物細胞を用いたone-hybrid法が
含まれる。具体的には、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝
子を挿入したレポーター遺伝子を細胞に安定に導入し、
次いでこれに遺伝子ライブラリーを導入して、レポータ
ー遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなクロ
ーンを選択し、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質を
選択する。この方法により、直接本発明のＤＮＡと結合
するタンパク質の他に、細胞内の内在性タンパク質に作
用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調
節するタンパク質を得ることができる。なお、酵母のon
e-hybrid法（Li J.J. and Herskowitz I., Science 26
2, 1870-1873 (1993)、Wang M.M.and Reed R.R., Natur
e 364, 121-126 (1993)）などで、「Matchmaker system
（クロンテック社）」等がキットとして発売されてい
る。

【０３２７】さらに他の一つの態様は、本発明のＤＮＡ
の下流に連結されたマーカー遺伝子を保持する細胞に被
験試料を接触させ、マーカー遺伝子の発現を調節するタ
ンパク質を選択する工程を含む。具体的な方法の一例と
しては、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子が挿入された
レポーター遺伝子を安定に導入した細胞と、被験試料
（例えば、遺伝子ライブラリーを導入した細胞の培養上
清）とをインキュベートして、マーカー遺伝子の発現促
進あるいは発現阻害を示すようなタンパク質を選択す
る。この方法では、細胞膜受容体などを介して間接的に
本発明のＤＮＡのプロモーター活性に影響を与えるタン
パク質が得られる。

【０３２８】４）プロモーター活性を調節するタンパク
質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング方法 本発明のＤＮＡを用いて、そのプロモーター活性を調節
するタンパク質をコードするＤＮＡを直接単離すること
も可能である。本発明は、また、本発明のＤＮＡのプロ
モーター活性を調節するタンパク質をコードするｃＤＮ
Ａのスクリーニング方法に関する。このスクリーニング
方法の一つの態様は、本発明のＤＮＡに被験ＤＮＡの発
現産物を接触させ、本発明のＤＮＡに結合するタンパク
質をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。このよ
うな方法には、例えば、サウスウエスタン法が含まれ
る。具体的には、遺伝子ライブラリーを導入した大腸菌
で各タンパク質を発現させ、これらをフィルター膜に転
写した後、本発明のＤＮＡをプローブとして直接ブロッ
トし、該ＤＮＡプローブと結合するタンパク質を発現す
るクローンを選択して、これをコードする遺伝子を単離
する。この方法により本発明のＤＮＡに結合する活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子を得ることができ
る（実験医学別冊 バイオマニュアルシリーズ「転写因
子研究法」（株）羊土社刊、１７７−１８８頁参照）。

【０３２９】他の一つの態様は、本発明のＤＮＡの下流
に連結されたマーカー遺伝子を保持する細胞に被験ｃＤ
ＮＡを導入し、マーカー遺伝子の発現を調節する発現産
物をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。このよ
うな方法には、例えば、上記した酵母や動物細胞を用い
たone-hybrid法が含まれる。

【０３３０】すなわち、本発明のＤＮＡをとマーカー遺
伝子を挿入したレポーター遺伝子を哺乳動物由来の培養
細胞に安定に導入した細胞（以下「細胞Ａ」という）
に、さらに該細胞に哺乳動物細胞用発現ベクターに被験
ｃＤＮＡが挿入された組換えプラスミドを導入した細胞
（以下「細胞Ｂ」という）を培養する。比較対照として
は、細胞Ａをそのまま培養するか、あるいは、細胞Ａに
被験ｃＤＮＡを含まない哺乳動物細胞用発現ベクター
や、被験ｃＤＮＡを含んでいてもそれが発現しない組換
えプラスミドを導入した細胞（以下「細胞Ｃ」という）
を培養する。細胞Ｂと、細胞Ａまたは細胞Ｃとの間で、
マーカー遺伝子の発現量を比較し、マーカー遺伝子の発
現を促進するかまたは阻害するようなｃＤＮＡクローン
を選択する。この方法では、本発明のＤＮＡと直接結合
するタンパク質をコードするｃＤＮＡだけでなく、細胞
内の内在性タンパク質に作用して間接的に本発明のＤＮ
Ａのプロモーター活性を調節するタンパク質をコードす
るｃＤＮＡも得ることができる。

【０３３１】さらに他の一つの態様は、本発明のＤＮＡ
の下流に連結されたマーカー遺伝子を保持する細胞に被
験ｃＤＮＡの発現産物を接触させ、マーカー遺伝子の発
現を調節する発現産物をコードするｃＤＮＡを選択する
工程を含む。具体的な方法の一例を示せば、本発明のＤ
ＮＡとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を安
定にに導入した細胞と、被験ｃＤＮＡの発現産物（例え
ば、ｃＤＮＡライブラリーを導入した細胞の培養上清）
とをインキュベートして、マーカー遺伝子の発現促進あ
るいは発現阻害を示すようなタンパク質あるいはそれを
コードするｃＤＮＡを単離する。この方法により細胞膜
受容体などを介して間接的に本発明のＤＮＡのプロモー
ター活性に作用するタンパク質をコードするｃＤＮＡを
得ることができる。

【０３３２】５）プロモーター活性を調節する化合物の
スクリーニング 本発明のＤＮＡを用いて、そのプロモーター活性を調節
する化合物のスクリーニングを行うことも可能である。
すなわち本発明は、下記に示すような、該ＤＮＡのプロ
モーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法に
関する。

【０３３３】５−１）プロモーターとタンパク質との結
合を指標としたスクリーニング この方法は、被験化合物の存在下で本発明のＤＮＡと被
験試料とを接触させ、本発明のＤＮＡと被験試料中のタ
ンパク質との結合を促進または阻害する化合物を選択す
る工程を含む。具体的には例えば、細胞の核抽出液を、
本発明のＤＮＡを放射性同位元素等により標識したプロ
ーブと結合させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り、核抽出液中のタンパク質と本発明のＤＮＡとの複合
体のバンドをゲルシフト法により検出する（実験医学別
冊 バイオマニュアルシリーズ「転写因子研究法」
（株）羊土社刊、１０７−１１２頁参照）。ＤＮＡプロ
ーブ添加の際、被験化合物も添加し、核抽出液中のタン
パク質と本発明のＤＮＡとの複合体のバンドの形成を促
進あるいは阻害する化合物を選択する。この方法では、
直接本発明のＤＮＡに作用する化合物および本発明のＤ
ＮＡに結合するタンパク質に作用する化合物が得られ
る。例えば、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が生
体内で本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害するよ
うな場合、このタンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を
阻害するような化合物は、本発明のＤＮＡのプロモータ
ー活性を促進できると考えられる。なお、本発明のＤＮ
Ａに結合するタンパク質が既に単離されていれば、細胞
の核抽出液に代えて、該タンパク質の組み換えタンパク
質を利用することも可能である。

【０３３４】５−２）プロモーター活性を指標としたス
クリーニング この方法は、本発明のＤＮＡの３'末端側に連結された
マーカー遺伝子を保持する細胞に被験化合物を接触さ
せ、マーカー遺伝子の発現を調節する化合物を選択する
工程を含む。この方法では、直接、間接的に本発明のＤ
ＮＡのプロモーター活性を調節する化合物が得られる。

【０３３５】この方法において、本発明のＤＮＡの３'
末端側に連結されるマーカー遺伝子にコードされるマー
カータンパク質は、宿主である上記細胞が本発明の方法
の一連の過程において産生し得る他のいかなるタンパク
質とも区別可能なもの（好ましくは、形質転換前の上記
細胞が該マーカータンパク質と同一または類似のタンパ
ク質をコードする遺伝子を持たないようなもの）であれ
ばよい。例えば、マーカータンパク質が該細胞に対して
毒性を有するようなものや、該細胞が感受性を有する抗
生物質の耐性を付与するものであるような場合でも、マ
ーカー遺伝子の発現の有無は細胞の生存率で判定するこ
とが可能である。しかしながら、本発明で用いられるマ
ーカー遺伝子としてより好ましいものは、発現量を特異
的かつ定量的に検出することができる（例えば該マーカ
ー遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的抗体
が取得されているような）構造遺伝子である。さらに好
ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定
量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコー
ドする遺伝子である。そのようなものとして、以下に挙
げるようなタンパク質をコードする遺伝子を例示するこ
とができるが、本発明はそれらに限定されない：クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ： クロラ
ムフェニコールにアセチル基を付加する。いわゆるＣＡ
Ｔアッセイ等で検出可能。プロモーターを組み込むだけ
でレポーターアッセイ用のベクターを調製できるベクタ
ーとしてｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社
製）が市販されている；ホタルルシフェラーゼ： ルシ
フェリンを代謝した際に生じる生物発光を測定すること
により定量する。同じくレポーターアッセイ用のベクタ
ーとしてｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社
製）が市販されている；β−ガラクトシダーゼ： 呈色
反応、蛍光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質が
ある。レポーターアッセイ用のベクターとしてｐβｇａ
ｌ−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）が市販されている；分
泌型アルカリホスファターゼ： 呈色反応、生物発光ま
たは化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポー
ターアッセイ用のベクターとしてｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓ
ｉｃ（クロンテック社製）が市販されている；緑色蛍光
タンパク質（green-fluorescent protein）： 酵素で
はないが、自らが蛍光を発するので直接定量できる。同
じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ
−１（クロンテック社製）が市販されている。

【０３３６】培養細胞株に発現プラスミドを導入する方
法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Luthman, H.
and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 12
95-1308)、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graha
m, F. L. and van der Eb, A.J. (1973) Virology 52,
456-457）、電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al.(19
82) EMBO J. 1, 841-845）、リポフェクション法（Lopa
ta et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717, S
ussman and Milman (1984) Mol. Cell. Biol.4, 1641-1
643）等を挙げることができるが、これらに限定され
ず、本発明の属する技術分野において汎用される他の方
法も採用することができる。ただし、培養細胞株がいわ
ゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ
共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの
方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたト
ランスフェクション条件を用いる。

【０３３７】このようにして本発明のＤＮＡの３'末端
側にマーカー遺伝子が連結された発現ベクターをトラン
スフェクションした細胞を培養すると、マーカー遺伝子
の転写が促進される。マーカー遺伝子の発現が可能な条
件下で培養するにあたって、培地中に任意の被験物質を
添加した条件および添加しない条件を設定して培養後、
マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質の添加によ
りマーカー遺伝子の発現量に変化が生じるか否かを検定
する。「マーカー遺伝子の発現が可能な条件」は、細胞
が生存して、タンパク質の生産が可能な条件であればよ
いが、好ましくは、使用される細胞株に適合した培地
（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）を使用
し、４乃至６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む
空気存在下、３６乃至３８℃（最も好適には３７℃）で
２乃至３日間（最も好適には２日間）培養する。

【０３３８】このような系において、本発明のＤＮＡの
３'末端側にマーカー遺伝子が連結された発現ベクター
を導入した際のレポーター遺伝子の発現誘導を抑制する
ような被験物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖か
ら選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予
防剤として有用な候補物質として選択される。

【０３３９】なお、本発明のＤＮＡのプロモーター活性
を調節するタンパク質が既に得られている場合には、被
験化合物の存在下で該タンパク質（またはその誘導体）
と本発明のＤＮＡとを接触させ、該タンパク質（または
その誘導体）と本発明のＤＮＡとの結合を促進または阻
害する化合物を選択して、本発明のＤＮＡのプロモータ
ー活性を調節する化合物をスクリーニングすることが可
能である。具体的には、例えば、グルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼを融合した本発明のＤＮＡに結合するタ
ンパク質（ＤＮＡ結合ドメインのみでもよい）を精製し
て、抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体で覆っ
たマイクロプレートに結合させた後、ビチオン化した本
発明のＤＮＡをこのタンパク質と接触させ、該タンパク
質と本発明ＤＮＡとの結合をストレプトアビジン化アル
カリホスファターゼで検出する。本発明のＤＮＡ添加の
際、被験化合物も添加し、該タンパク質と本発明のＤＮ
Ａとの結合を促進あるいは阻害する化合物を選択する。
この方法では、直接本発明のＤＮＡに作用する化合物お
よび本発明のに結合するタンパク質に作用する化合物が
得られる。例えば、本発明のＤＮＡに結合するタンパク
質が生体内で本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害
する場合、このタンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を
阻害するような化合物は本発明のＤＮＡのプロモーター
活性を促進できると考えられる。

【０３４０】なお、下記参考例において明らかなよう
に、「アンジオポエチン関連タンパク質３」および「ア
ンジオポエチン関連タンパク質４」は、低脂血症マウス
で強制発現させると血中の中性脂肪濃度が上昇する。
「アンジオポエチン関連タンパク質３」が正常に産生さ
れない変異遺伝子の影響により、顕著な血中脂質濃度の
低下、動脈硬化の進展抑制および高血糖の改善が観察さ
れ、「アンジオポエチン関連タンパク質４」についても
同様の現象が観察されると考えられるので、本発明のＤ
ＮＡが有するプロモーター活性を抑制する機能を有する
部分配列またはその誘導体は高脂血症、動脈硬化および
高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療
または予防剤となり得る。

【０３４１】

【実施例】 以下、実施例をもって本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各
操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニン
グ（MolecularCloning）」［Sambrook, J.,Fritsch, E.
F.およびManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Labora
tory Pressより1989年に発刊］に記載の方法により行う
か、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販
品の指示書に従って使用した。

【０３４２】参考例１． ｃＤＮＡのクローニング マウス肝臓を材料として、下記の方法に従って配列表の
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するｃＤＮ
Ａを取得した。

【０３４３】ａ）マウス肝臓からのｍＲＮＡの抽出 ９週齢のＫＫマウス（雄、浜松医科大学付属動物実験施
設より入手）２匹より解剖して肝臓を摘出後、速やかに
液体窒素中に入れて急速凍結させた。この重量を測定
し、３．１ｇを乳鉢上で液体窒素存在下で粉砕した。
５．５Ｍ グアニジンチオシアネート（以下ＧＴ）緩衝
液（５．５Ｍ グアニジンチオシアネート、２５ｍＭ
クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％ サルコ
シル、０．２Ｍ β−メルカプトエタノール）（３０ｍ
ｌ）を加え、乳棒で破砕し、新たにＧＴ緩衝液（１０ｍ
ｌ）を加え、乳棒で破砕後、溶解液を回収した。また、
ＧＴ緩衝液（２０ｍｌ）で乳鉢を洗浄しこの溶液も回収
した。３６ｍｌの回収液を３０００ｒｐｍ、１０℃で１
０分間遠心後、上清を新しいチューブに移し、各々１８
ゲージの注射針で２０回吸引排出を繰り返した。次にセ
シウム・トリフルオロ酢酸（ＣｓＴＦＡ）を用いた密度
勾配遠心による全ＲＮＡの分離を行った。ＣｓＴＦＡ原
液（１９ｍｌ）をリボヌクレアーゼ不含再蒸留水（１
８．９２４ｍｌ）で希釈し、この希釈液（６．１８ｍ
ｌ）を６本の１３ＰＡ（ベックマン製）チューブに入
れ、先に回収したサンプル（１チューブあたり５．２ｍ
ｌ）を重層した。このものをスイングローター（日立工
機（株）社製Ｐ４０ＳＴ）を用い超遠心機（日立ＳＣＰ
７０Ｈ型）で３００００ｒｐｍ（約１２５０００ｇ）、
２０℃で２０．５時間遠心した後、上清を除去して得ら
れたペレットをｍＲＮＡ精製キット（アマシャム・ファ
ルマシア社製クイックプレップｍＲＮＡ精製キット）添
付の抽出緩衝液 ３．３ｍｌに懸濁した。ｍＲＮＡの精
製は該精製キットを添付プロトコールに従って用いるこ
とにより行った。このようにして得られた５μｇのｍＲ
ＮＡを鋳型とし、ｃＤＮＡライブラリー作製キット（ス
トラタジーン社製ＺＡＰエクスプレス・ｃＤＮＡ・ギガ
パックＩＩＩゴールド・クローニングキット）をその添
付プロトコールに従って用いることにより、λファージ
ｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【０３４４】ｂ）ｃＤＮＡライブラリーの１次スクリー
ニング 上記ａ）記載の方法で得られたλファージｃＤＮＡライ
ブラリーを感染させた大腸菌を、直径９ｃｍの培養シャ
ーレに作製した寒天培地プレート（ＮＺＹ培地：０．５
％ 塩化ナトリウム、０．２％ 硫酸マグネシウム７水
和物、０．５％イーストエキストラクト、１％ カゼイ
ン加水分解物、１．５％ 寒天）に、プレート１枚あた
り１．８×１０⁵個のプラークが形成されるように分散
させ、３７℃で８時間培養した。このプラーク形成され
た寒天培地の１４ヶ所について、２５０μｌ用の広径ピ
ペットチップ（ＲＡＩＮＩＮ社製）の底部を用いて寒天
培地をプラークごと抜き取り、それら寒天培地片をそれ
ぞれ１００μｌのＳＭ緩衝液（０．１Ｍ 塩化ナトリウ
ム、８ｍＭ 硫酸マグネシウム、５０ｍＭ トリス−塩
酸（ｐＨ７．５）、０．０１％ ゼラチン）の入ったプ
ラスチック遠心管に入れ、ボルテックスミキサーを用い
て激しく混濁させてから４℃で１乃至２時間放置した
後、１２０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収
し、ファージ懸濁液とした。

【０３４５】一方、ＰＣＲに用いるプライマーとして、
下記のヌクレオチド配列：プライマー１：5'- gactgatc
aa atatgttgag ctt -3'（配列表の配列番号５）；およ
びプライマー２：5'- tgcatccaga gtggatccag a -3'
（配列表の配列番号６）を有するオリゴヌクレオチド
を、自動ＤＮＡ合成機（モデル３９４：（株）パーキン
エルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業部
製）を用い、ホスホアミダイト法（Matteucci, M. D.,
and Caruthers, M. H. (1981) J. Am. Chem.Soc. 103,
3185-3191）に従って合成した。

【０３４６】上記のようにして得られたファージ懸濁液
５μｌを、２．５μｌの１０×ＰＣＲ用緩衝液（宝酒造
（株）社製のＴａｑポリメラーゼに添付）、４μｌのｄ
ＮＴＰ混液（各２．５ｍＭ、宝酒造（株）社製のＴａｑ
ポリメラーゼに添付）、各１μｌの各７．５μＭに調整
した上記プライマー１および２、０．２５μｌのＴａｑ
ポリメラーゼ（宝酒造（株）社製）、１１．２５μｌの
滅菌水と混和し、まず９４℃で５分加熱した後、引き続
き９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の
温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で７分間
保温してから、４℃に保存した。反応物は４％のアガロ
ースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ ３：１アガロース（ＦＭＣ
バイオプロダクツ社製）で調製した）で電気泳動して、
特異的断片の増幅を解析した。このようにして１４のフ
ァージ懸濁液をスクリーニングした結果、目的のｃＤＮ
Ａの断片が特異的に増幅される二つの陽性サンプルを得
た。

【０３４７】ｃ）２次スクリーニング マウスゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）１００ｎｇを
鋳型にして上記ｂ）に記載した条件でＰＣＲを行い、ア
ガロース電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片を回収
した。このＤＮＡ断片を鋳型として、マルチプライムＤ
ＮＡラベリングシステム（アマシャム・ファルマシア
社）を用いて³²Ｐで標識されたＤＮＡ断片を生成する反
応を行った後、反応液をニックカラム（アマシャム・フ
ァルマシア社製）に注入した。このカラムに４００μｌ
のＴＥ（１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）を流して１回洗浄し、さらに４００μｌ
のＴＥを流して溶出液を回収した。この溶出画分全量を
以下の２次スクリーニングに標識プローブとして用い
た。

【０３４８】一方、上記ｂ）で陽性と判定されたファー
ジ懸濁液をＳＭ緩衝液で１００倍希釈し、そのうち２μ
ｌ分のファージを感染させた大腸菌を、直径９ｃｍの培
養シャーレに作製した寒天培地プレートに分散させ、３
７℃で８時間培養した。このプラーク形成された寒天培
地上に、シャーレ内径に合わせた円形のナイロンメンブ
レン（アマシャム・ファルマシア社製、ハイボンドＮ
＋）をのせて、４℃にて５分間放置することによりプラ
ークを移しとった。１８Ｇの注射針を用いてメンブレン
の３ヶ所を寒天培地まで貫通することにより位置合わせ
用の目印をつけた後、メンブレンを剥がしてアルカリ溶
液（１．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリ
ウム）に２分間、次いで中和溶液（１．５Ｍ 塩化ナト
リウム、０．５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８．０））に５
分間、さらに２×ＳＳＣ、０．２Ｍ トリス−塩酸（ｐ
Ｈ７．５）を含む溶液に３０秒間浸した後、室温で完全
に風乾させた。

【０３４９】このメンブレンを２０ｍｌのハイブリダイ
ゼーション溶液（ExpressHyb Hybridization Solutio
n、クロンテック社製）中で６８℃、１時間インキュベ
ーション（プレハイブリダイゼーション）した後、標識
プローブを含む８ｍｌのハイブリダイゼーション溶液に
交換して６８℃、６時間インキュベーションした。次い
で、このメンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳ
を含む溶液で、室温下、１５分間緩やかに振盪しながら
洗浄する操作を３回繰り返した後、さらに０．１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ ＳＤＳを含む溶液で５０℃、３０分間洗
浄する操作を３回繰り返した。

【０３５０】洗浄後のメンブレンについてオートラジオ
グラフィーを行い、陽性と認められた位置の元のプラー
クを寒天培地から回収して、そのファージ懸濁液につい
て上記ｂ）に記載した条件でＰＣＲを実施した結果、陽
性プラーク試料１０個中６個においてＤＮＡ断片の特異
的増幅が認められた。

【０３５１】このうちもっとも強く増幅が認められた試
料のファージ懸濁液について、ＺＡＰエクスプレス・ｃ
ＤＮＡ・ギガパックＩＩＩゴールド・クローニングキッ
ト（ストラタジーン社製）に添付されたヘルパーファー
ジおよび宿主菌を用いて、該キットに添付のプロトコー
ルに従ってインビボ切り出し（In Vivo Excision）を行
い、寒天培地上にファージミドを含む大腸菌コロニーを
形成させた。これらのコロニーを単離してそれぞれファ
ージミドを抽出し、上記ｂ）に記載の方法でＰＣＲを実
施した結果、ＤＮＡ断片の特異的増幅がみられたコロニ
ーを選択、培養し、１．６ｋｂｐのｃＤＮＡインサート
を有するファージミド＃５５−１を保持する形質転換大
腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＢＫ／ｍ５５−１ ＳＡＮＫ ７
２１９９を単離した。

【０３５２】得られたファージミド＃５５−１に挿入さ
れているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列を解析した結
果、配列表の配列番号１に示される配列であることが判
明した（ただし配列表の配列番号１のヌクレオチド番号
１−８はベクター由来のアダプター配列である）。この
配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにマウス・「アンジ
オポエチン関連タンパク質３」として登録されている配
列（登録番号：ＡＦ１６２２２４）と同一であった。な
お、このファージミド＃５５−１を保持する形質転換大
腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＢＫ／ｍ５５−１ ＳＡＮＫ ７
２１９９は、１９９９（平成１１）年１１月１９日付で
工業技術院生命工学工業技術研究所（現・独立行政法人
産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に国際寄
託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４０が付され
た。

【０３５３】実施例１． ノーザンブロット解析 ａ）マウス臓器からの全ＲＮＡの抽出 参考例１で得られたｃＤＮＡの発現している組織を調べ
る目的でノーザンブロット解析を実施した。まず、ＫＫ
マウス（高脂血症マウス）およびＫＫ／Ｓｎｋマウス
（低脂血症変異マウス。白木ら、第７回糖尿病動物研究
会（１９９３年））の精巣（testis）、脾臓（splee
n）、腎臓（kidney）、小腸（small intestine）、肝臓
（liver）および脳（brain）から全ＲＮＡの抽出を行っ
た。１８週齢のＫＫマウスおよびＫＫ／Ｓｎｋマウスを
解剖してそれぞれ各臓器を摘出後、速やかに液体窒素内
に入れ急凍した後−８０℃に保存した。臓器０．５ｇに
対し約１５ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（ギブコ・ビーアー
ルエル社製）を加え、超高速ホモジナイザーポリトロン
（キネマティカ社製）を用いて氷上でホモジナイズを行
った（目盛６で２分間）。これを室温で５分間静置した
後、３ｍｌのクロロホルムを加え、手で１５秒間激しく
転倒混和した。再び室温で３分間静置してから、１２０
００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。遠心後、上層
を回収し、０．８容量のリボヌクレアーゼ不含イソプロ
ピルアルコールを加えて混和した。これを室温で１０分
間静置後、１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し
た後、上清を除去してリボヌクレアーゼ不含７０％エタ
ノールを加えた。これを１２０００×ｇ、４℃で１０分
間遠心分離し、上清を除去して、沈殿を乾燥させてか
ら、−８０℃に保存した。

【０３５４】ｂ）全ＲＮＡの電気泳動およびブロッティ
ング 回収した各臓器の全ＲＮＡをリボヌクレアーゼ不含再蒸
留水で４μｇ／μｌに調整した後、このＲＮＡ液５μｌ
とＲＮＡ試料緩衝液（１．１５×ＭＯＰＳ緩衝液（１×
ＭＯＰＳ緩衝液は２０ｍＭ ＭＯＰＳ、５ｍＭ 酢酸ナ
トリウム、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（以下「Ｅ
ＤＴＡ」という）を含む）、２．４Ｍホルムアルデヒ
ド、５７％ ホルムアミド、７％ グリセロール、１８
μｇ／ｍｌ ブロモフェノールブルー、１８μｇ／ｍｌ
キシレンシアノール、０．１８ｍＭ ＥＤＴＡ）１６
μｌを混合し、６５℃で１０分間保温した後、氷上で５
分間放置した。この試料液全量を、１．１７％ホルマリ
ンを含む電気泳動用アガロースゲル（１×ＭＯＰＳ緩衝
液、１．１７％ アガロース（高強度、分析用、バイオ
ラッド社製）、０．６６Ｍ ホルムアルデヒド）の一つ
のウェルへ注入し電気泳動した。電気泳動は、５００ｎ
ｇ／ｍｌ 臭化エチジウムの入った１×ＭＯＰＳ緩衝液
の入ったサブマリン電気泳動槽中、５０Ｖで約１時間通
電した後、さらに１００Ｖで約１．５時間通電すること
により行った。電気泳動終了後、アガロースゲル中のＲ
ＮＡをキャピラリートランスファー法（Maniatis, T. e
t al.(1982) in "Molecular Cloning A Laboratory Man
ual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY）に従ってナ
イロンメンブレン（ハイボンドＮ＋、アマシャム・ファ
ルマシア社製）に一晩かけて転写した（転写用溶液は２
０×ＳＳＣを使用した）。このメンブレンを２×ＳＳＣ
で５分間洗浄し、風乾させ、クロスリンク用紫外線照射
装置（スペクトロリンカーＸＬ−１０００、トミー精工
（株）社製）で紫外線を照射（１２００Ｊ／ｃｍ²）し
てＲＮＡを固定した。

【０３５５】ｃ）プローブの調製 参考例１のｂ）で合成したプライマーを用い、サーマル
サイクラー（ジーンアンプＰＣＲシステム９６００、
（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシ
ステムズ事業部製）を使用して以下の条件でＰＣＲを行
った。まずプライマー（終濃度各０．５μＭ）とツイー
ン２０（シグマ社製、終濃度０．１％）に滅菌水を加え
て７．５μｌとした後、２×ＰＣＲソルーション・プレ
ミックスＴａｑ（宝酒造（株）社製：０．０５単位／μ
ｌ Ｔａｑポリメラーゼ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２
０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１００ｍＭ 塩
化カリウム、３ｍＭ 塩化マグネシウムを含む）を７．
５μｌ添加した。さらにマウスゲノムＤＮＡ（クロンテ
ック社製）を１μｌ（１００ｎｇ相当）加え、反応液を
調製した。この反応液を、まず９４℃で３分間加熱した
後、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で４５秒の
温度サイクルを３５回繰り返してから、４℃で保温し
た。

【０３５６】このＰＣＲ後の反応液１μｌをとり、ＴＡ
クローニングキット（デュアルプロモーターバージョン
Ａ、インビトロジェン社製）を添付のプロトコールに従
って用いて、増幅されたＤＮＡ断片をプラスミドベクタ
ーにクローニングした。この組換えプラスミドベクター
でコンピテント大腸菌を形質転換し、５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結
果アンピシリン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニ
ーを選択して、４ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含む液体ＬＢ培地で３７℃で一晩培養した。このうち
３．５ｍｌの培養液からプラスミド自動抽出装置（ＰＩ
−５０、クラボウ社製）を使用してプラスミドＤＮＡを
回収した。得られたプラスミドＤＮＡについてヌクレオ
チド配列解析を行い、目的のＰＣＲ産物が挿入されてい
たプラスミドを以下の操作に用いた。

【０３５７】選択されたプラスミドＤＮＡ ８μｇを、
制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、フェノール／クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿を滅
菌水１０μｌに溶解した。この溶液に色素液（０．２５
％ ブロモフェノールブルー、０．２５％ キシレンシ
アノール、１５％ フィコール（タイプ４００））を２
μｌ加えて、全量をポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度８％、１００Ｖ、室温、３時間）した。電気
泳動後のゲルを臭化エチジウムで染色した後、紫外線照
射下で目的のＤＮＡに相当するバンド（約２００ｂｐ、
配列表の配列番号２９）部分のゲル片を剃刀刃で切り取
り、微量遠心チューブに移して粉砕した。このものに３
００μｌの溶出緩衝液（０．５Ｍ 酢酸アンモニウム、
１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％ ＳＤＳ）
を加え、３７℃で一晩保温した後、フェノール／クロロ
ホルム抽出を２回、エタノール沈殿を１回行って、沈殿
を滅菌水２０μｌに溶解した。

【０３５８】得られたＤＮＡ溶液５μｌについて、参考
例１のｃ）記載の方法で、³²Ｐで標識されたプローブ
（４００μｌ）を調製した。

【０３５９】ｄ）ハイブリダイゼーション 上記ｂ）で作製したメンブレンを２０ｍｌのハイブリダ
イゼーション溶液（ExpressHyb Hybridization Solutio
n、クロンテック社製）中に入れて６８℃で１時間イン
キュベーション（プレハイブリダイゼーション）した
後、³²Ｐ標識プローブを含む２０ｍｌのハイブリダイゼ
ーション溶液中で、６８℃で一晩インキュベーションし
た。その後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤ
Ｓを含む溶液中、室温で２０分間、３回洗浄し、さらに
０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む溶液中、５０
℃で２０分間、３回洗浄してから、オートラジオグラフ
ィーを行った。

【０３６０】その結果、検出した遺伝子の発現は肝臓の
みでみられ、またその発現量はＫＫマウス（高脂血症マ
ウス）よりもＫＫ／Ｓｎｋマウス（低脂血症マウス）で
著しく低下していることが明らかとなった（図１）。

【０３６１】上記実験系において、例えば被験物質存在
下または非存在下で培養したＫＫマウス初代培養肝細胞
からＲＮＡ試料を調製し、以下同様の操作を行うことに
より、被験物質の高脂血症、動脈硬化および高血糖から
選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防
剤としての効果を調べることができる。この実験におい
て検出される遺伝子の発現量を低下させるような被験物
質は高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一
つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得
る。多検体処理を行う場合には、電気泳動を省略してド
ットブロットやスロットブロットを行うこともできる。

【０３６２】参考例２．ヒトｃＤＮＡのクローニング １）プローブの調製 配列表の配列番号１に示されるマウスｃＤＮＡに対応す
るヒトｃＤＮＡを取得するため、下記のヌクレオチド配
列：5'- tcctctagtt atttcctcca g -3'（配列表の配列
番号７）；および5'- tggtttgcca gcgatagatc -3'（配
列表の配列番号８）を有するオリゴヌクレオチドプライ
マーを合成した。

【０３６３】次に、ヒトゲノムＤＮＡ（ベーリンガーマ
ンハイム社製、２００ｍｇ／ｍｌ）１μｌ、Ｔａｑポリ
メラーゼ（ｒＴａｑ、宝酒造（株）社製、５単位／μ
ｌ）１μｌ、１０×ＰＣＲ用緩衝液（宝酒造（株）社
製）１０μｌ、ｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）１６μ
ｌ、２０μＭのプライマー各２μｌ、および滅菌水６８
μｌを混合した。この反応液を、９４℃で５分間加熱し
た後、引き続き９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２
℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７
２℃で１０分間保温してから、４℃に保存した。この反
応液を２％ アガロースゲルにて電気泳動した後、増幅
されたＤＮＡバンド部分のゲルを切り出して精製した。
このようにして得られたＤＮＡをＤＮＡ標識キット（Bc
aBestラベリングキット、宝酒造（株）社製）を用いて
³²Ｐで標識したものを下記２）においてプローブとして
用いた。

【０３６４】２）ｃＤＮＡライブラリーの１次スクリー
ニング 市販のヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリー（Human Live
r 5'-STRETCH cDNA Library、クロンテック社製）のう
ち、１×１０⁶プラークのＤＮＡをナイロンメンブレン
に固定した。すなわち、ｃＤＮＡライブラリーを感染さ
せた大腸菌を直径９ｃｍの培養シャーレに作製した寒天
培地プレート２０枚に、１枚あたり５×１０⁴個のプラ
ークが形成されるように分散させ、３７℃で８時間培養
した。このプラーク形成された寒天培地上に、シャーレ
内径に合わせた円形のナイロンメンブレン（アマシャム
・ファルマシア社製、ハイボンドＮ＋）をのせて、４℃
にて５分間放置することによりプラークを移しとった。
１８Ｇの注射針を用いてメンブレンの３ヶ所を寒天培地
まで貫通することにより位置合わせ用の目印をつけた
後、メンブレンを剥がしてアルカリ溶液（１．５Ｍ 塩
化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に２分間、
次いで中和溶液（１．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５Ｍ
トリス−塩酸（ｐＨ８．０））に５分間、さらに２×
ＳＳＣ、０．２Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）を含む
溶液に３０秒間浸した後、室温で完全に風乾させた。次
いで、クロスリンク用紫外線照射装置（スペクトロリン
カーＸＬ−１０００、トミー精工（株）社製）で紫外線
を照射（１２００Ｊ／ｃｍ²）してＤＮＡを固定した。

【０３６５】このようにして調製されたメンブレンを、
上記１）で得られた標識プローブを含むハイブリダイゼ
ーション溶液（ExpressHyb solution、クロンテック社
製）中で６５℃で一晩インキュベーションした。その
後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳを含
む溶液で１５分ずつ３回、室温で洗浄してから、さらに
０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む溶液で３０分
ずつ３回、５０℃で洗浄した後、オートラジオグラフィ
ーを行った。

【０３６６】その結果判明した陽性のシグナルの位置に
あったプラークを、上記寒天培地プレートから培地ごと
採取し、それぞれ１００μｌのＳＭ緩衝液（０．１Ｍ
塩化ナトリウム、８ｍＭ 硫酸マグネシウム、５０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％ ゼラチ
ン）中に入れてよく懸濁してから４℃で２時間放置した
後、１２０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収し
た。

【０３６７】このようにして得られた１次陽性ファージ
液を再び大腸菌に感染させたものを、直径９ｃｍの培養
用シャーレに作製した寒天培地上に、シャーレ１枚あた
り５００個のプラークが形成されるように培養し、上記
の手法を繰り返すことにより２次スクリーニングを行っ
た。得られた２次陽性クローンファージを大腸菌株ＢＭ
２５．８（クロンテック社製）に感染させたものを寒天
培地上で３７℃で培養して、ファージミドを含む大腸菌
コロニーを形成させた。コロニーを単離し、液体培地で
少量培養してファージミドを抽出し、制限酵素消化によ
る挿入断片の解析を行った結果、１．６ｋｂｐの挿入断
片を有する、クローン＃ｈ５−１を有する大腸菌Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１ ＳＡＮＫ ７２２９
９を単離した。このクローンの挿入断片のヌクレオチド
配列を解析した結果、ＧｅｎＢａｎｋにヒト・「アンジ
オポエチン関連タンパク質３」として登録されているの
ｃＤＮＡ配列（登録番号：AF152562）と一致した（配列
表の配列番号３。ただし、配列表の配列番号３のヌクレ
オチド番号１−１４はベクター由来のアダプター配列で
ある）。なお、このファージミド＃ｈ５−１を保持する
形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１
ＳＡＮＫ ７２２９９は、１９９９年１１月１９日付
で工業技術院生命工学工業技術研究所（現・独立行政法
人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に国際
寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４１が付され
た。

【０３６８】実施例２． ポリクローナル抗体の作製 配列表の配列番号１および配列番号３に示されるヌクレ
オチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列
表の配列番号２および配列表の配列番号４に示されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをいずれも認識する抗
体を作製する目的で、抗原として、それらマウスおよび
ヒトのポリペプチドの間で保存されている領域から選ば
れた２種類のアミノ酸配列：Glu-Pro-Lys-Ser-Arg-Phe-
Ala-Met-Leu-Asp-Asp-Val-Lys-Cys（５５−１−Ｎ１、
配列表の配列番号９）；およびCys-Gly-Glu-Asn-Asn-Le
u-Asn-Gly-Lys-Tyr-Asn-Lys-Pro-Arg（５５−１−Ｃ
１、配列表の配列番号１０）を有するペプチドを化学合
成法で合成した（使用機器：パーキンエルマージャパン
社製モデル４３３）。ただし、５５−１−Ｎ１のアミノ
酸配列は、後に担体としてキーホールリンペットヘモシ
アニン（以下「ＫＬＨ」という）を結合させるため、本
来のアミノ酸配列のＣ末端にシステイン残基が付加され
たものである。一方、５５−１−Ｃ１でＫＬＨが結合さ
れるＮ末端のシステインは本来のアミノ酸配列由来のも
のである。

【０３６９】次に、合成ペプチド５５−１−Ｎ１ １
１．１ｍｇおよびＫＬＨ ２１．５ｍｇ、または５５−
１−Ｃ１ １０．２ｍｇとＫＬＨ ２１．２ｍｇを、そ
れぞれＮ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシニ
ミド（ＥＭＣＳ、同仁化学研究所（株）社製）試薬を用
いて縮合させた（縮合反応溶媒として８Ｍ 尿素および
０．９％ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）を用い、室温で１５時間保温し
た）。この反応液を８Ｍ尿素溶液中に入れた後、流水に
対して透析し、さらに純水に対して透析を行ってから凍
結乾燥し、ＫＬＨが結合したペプチド抗原を得た。これ
らのペプチド抗原約１０ｍｇに１ｍｌの生理食塩水を加
え、超音波発振機（ソニケーター）、ボルテックスミキ
サー、ガラス棒等を用いて細かい懸濁液にした。その
後、生理的食塩水で全量を各７．５ｍｌとし、さらに１
ｍｌずつバイアルに小分けして凍結保存した。

【０３７０】免疫の際には、上記バイアル１本分の抗原
溶液を融解し、同量のアジュバンドと混合してそれぞれ
ウサギ２羽の背中に皮下、または皮内に注射した。アジ
ュバンドはフロインド完全アジュバンドを用いて行い、
２回目以降の免疫ではフロイントの不完全アジュバンド
を用いた。免疫は２週間おきに４回行い、２回目の免疫
以降、試験採血を行い血清中の抗体価を固層法による酵
素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で調べた。９６穴のＥＬＩ
ＳＡ用プレート（住友ベークライト（株）社製、９６穴
Ｈタイプ）におのおのの抗原ペプチドをコーティング
し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗
体を二次抗体として使用した。４回目の免疫から１３日
後に全採血を行った。

【０３７１】採血後、抗体をアフィニティーカラムを用
いて精製した。すなわち、Ｎ−（６−マレイミドカプロ
イロキシ）スクシニミド（ＥＭＣＳ、同仁化学研究所
（株）社製）とアミノアルキルアガロース（バイオラッ
ド社製、アフィゲル１０２）とを反応させて活性化した
担体ＥＭＣ−アガロース（約５ｍｌ）にペプチド（５５
−１−Ｎ１：７．８２ｍｇ、５５−１−Ｃ１：８．０７
ｍｇ）を結合させた。未反応のＥＭＣ基は０．１Ｍ 塩
酸メルカプトエチルアミン（５ｍＭ ＥＤＴＡを含む）
で処理することにより不活化させた。抗血清８５ｍｌを
ＰＢＳ（０．０２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、
０．９％ 塩化ナトリウム含有）で２倍希釈し、硫安沈
殿（終濃度４０％）法により沈殿物を得、この沈殿物を
ＰＢＳに溶解し、脱塩後ＰＢＳで透析し、この透析内液
を粗ＩｇＧ画分とした。アフィニティーカラムへは３回
に分けてクロマト操作をした。すなわち、アフィニティ
ーカラムへ粗ＩｇＧ画分１／３量をチャージし、素通り
画分をカラムに再注入する操作を３回繰り返した。素通
り部分および洗液を合わせた４０ｍｌを非吸着フラクシ
ョンとして集めた。非特異的にカラムに結合したものを
除去するために、１Ｍ塩化ナトリウム含有ＰＢＳで十分
洗浄した後、４Ｍ 塩化マグネシウム溶液、３．５Ｍ
チオシアン酸カリウム溶液および０．１Ｍ グリシン−
塩酸緩衝液（ｐＨ２．３）を順次カラムに流して、カラ
ム担体上に結合しているペプチドに特異的に結合してい
た抗体をアフィニティー精製抗体として溶出した。４Ｍ
塩化マグネシウム溶液および３．５Ｍ チオシアン酸
カリウム溶液の溶出液中に目的の抗体が含まれていたの
で、それぞれの溶出液をＰＢＳに対して透析したもの
を、以下の操作で抗体として使用した。

【０３７２】実施例３． ＣＯＳ−１細胞での発現およ
びウエスタンブロット解析 参考例２で得られた＃ｈ５−１ファージミドＤＮＡを制
限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、８％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行って、実施例１のｃ）に記載
した方法で、ｃＤＮＡを含む約１．６ｋｂの断片を単
離、精製した。一方、高発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ（Ha
ra, T. et al.(1992) EMBO.J. 11, 1875-、横田崇、新
井賢一編集、バイオマニュアルシリーズ３、遺伝子クロ
ーニング実験法、羊土社、p18-20）を同様にＥｃｏＲＩ
とＸｂａＩで消化し、末端を脱リン酸化した後、上記ｃ
ＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン
２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡ
で大腸菌を形質転換し、得られた形質転換株についてそ
れが保有するプラスミドＤＮＡの制限酵素による解析を
行い、１．６ｋｂのＤＮＡ断片を有する株を選択してｐ
ＭＥｈ５５−１と命名した。

【０３７３】次に、ｐＭＥｈ５５−１を保有する形質転
換大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００
ｍｌの液体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養した。この
培養液から、プラスミド精製キット（ウィザード・ピュ
アフェクション・プラスミドＤＮＡ精製システム、プロ
メガ社製）を用いてｐＭＥｈ５５−１ ＤＮＡを回収
し、塩化セシウム法で精製した。

【０３７４】このようにして得られたプラスミドｐＭＥ
ｈ５５−１でＣＯＳ−１細胞をトランスフェクションし
た。ＣＯＳ−１細胞へのトランスフェクションは（株）
島津製作所製の遺伝子導入装置ＧＴＥ−１を用いて電機
穿孔法により行った。すなわち、まずＣＯＳ−１細胞を
セミコンフルエントになるまで増殖させたフラスコよ
り、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により細胞を回収し、Ｐ
ＢＳ（−）緩衝液（宝酒造（株）社製）で洗浄した。次
にその細胞をＰＢＳ（−）緩衝液で６×１０⁷細胞／ｍ
ｌに懸濁した。上記方法にて回収したプラスミドＤＮＡ
（ｐＭＥｈ５５−１）をＰＢＳ（−）緩衝液で２００μ
ｇ／ｍｌに調製した。細胞懸濁液とＤＮＡ溶液を２０μ
ｌずつ混合し、これを電極間隔２ｍｍのチャンバーに入
れ、６００Ｖ−３０μｓｅｃのパルスを１秒間隔で２回
与えた。そのチャンバーを４℃で５分間冷却した後、中
の細胞−ＤＮＡ混合液を１０％ ウシ胎児血清を含むＤ
ＭＥＭ １０ｍｌに加え、シャーレに移して３７℃、５
％ ＣＯ2下で一晩培養した。その後、培養上清を除
き、無血清培地（ＤＭＥＭ）で細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ
１０ｍｌを加えて３日間培養した。

【０３７５】このようにして得られた細胞培養物より培
養上清を回収した。ｃＤＮＡを含まないネガティブコン
トロールプラスミドｐＭＥ１８ＳまたはｐＭＥｈ５５−
１でトランスフェクトして得たＣＯＳ−１細胞の無血清
培養上清０．３ｍｌをそれぞれトリクロロ酢酸（以下
「ＴＣＡ」という）処理してタンパク質を沈殿させ、遠
心分離により沈殿を得た。この沈殿を氷冷したアセトン
で洗浄し、風乾後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用の２−メルカプトエタノール
を含むサンプル緩衝液（バイオラッド社製）に溶解し、
４−２０％ ポリアクリルアミド密度勾配ゲル（マルチ
ゲル４／２０、第一化学薬品（株）社製）を用いて、還
元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。

【０３７６】電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルから
バンドを転写緩衝液（１９２ｍＭグリシン、２０％ メ
タノール、２５ｍＭ トリス）中でゲルメンブレン転写
装置（マリソル社製、ＮＰ７５１３）を用いて４℃、９
０分、２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレン
（バイオラッド社製）に転写した。

【０３７７】転写後のニトロセルロースメンブレンにつ
いて、実施例２で得られた抗体（以下「５５−１−Ｎ１
抗体」または「５５−１−Ｃ１抗体」という）を用いた
ウエスタンブロット解析を行った。すなわち、まずニト
ロセルロースメンブレンを０．０５％のツイーン２０を
含むＰＢＳ（以下「０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢ
Ｓ」という）で洗浄した（室温で１５分間を１回、次い
で５分間を２回）後、プラスチックバッグ（商品名ハイ
ブリバック、コスモバイオ（株）社製）に入れ、５％
スキムミルク（雪印乳業（株）社製）を含む０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳを２０ｍｌ加え、室温で１時
間振とうした。１時間後、メンブレンを取り出し、０．
０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ中で、１５分間×１
回、次いで５分間×２回洗浄した。洗浄後、メンブレン
を新しいプラスチックバッグに移し、５５−１−Ｎ１抗
体または５５−１−Ｃ１抗体（１００倍希釈）、１％
ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という。シグマ社
製）を含む０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳを２０
ｍｌ添加して室温で１時間振とうした。１時間後、メン
ブレンを取り出し０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ
溶液で１５分間×１回、５分間×２回洗浄した。その
後、メンブレンを新しいプラスチックバッグに移し、西
洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ア
マシャム・ファルマシア社製）を１％ ＢＳＡを含む
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２０００倍に希
釈した溶液２０ｍｌを入れ、を室温で１時間振とうし
た。１時間後、メンブレンを取り出し、０．０５％ Ｔ
ｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１５分間×１回、次いで５分間
×４回洗浄した。洗浄後、メンブレンをラップフィルム
上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液
（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて、５５−１
−Ｎ１抗体または５５−１−Ｃ１抗体が結合するバンド
の検出を行った（メンブレンをラップフィルム上に置
き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液に１分間
浸した後、１時間室温で放置してバックグラウンドを減
衰させてから、Ｘ線フィルムを感光させた（３秒
間））。その結果、両方の抗体により、ｐＭＥｈ５５−
１プラスミドＤＮＡを導入して得られたＣＯＳ−１培養
上清中に特異的なバンドが検出された（図２）。

【０３７８】同様の実験は、参考例１で得られたマウス
ｃＤＮＡを発現させたＣＯＳ−１細胞培養上清について
も実施できる。すなわち、参考例１で得られたファージ
ミド＃５５−１ ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａ
Ｉで消化して得られる、約１．６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片
をｐＭＥ１８Ｓに組み込んで得られたクローン（ｐＭＥ
５５−１）を構築し、上記と同様の方法でＣＯＳ−１細
胞に導入し、培養上清を回収する。この培養上清から調
製した試料について、５５−１−Ｎ１抗体および５５−
１−Ｃ１抗体を用いたウエスタンブロット解析を行う
と、いずれの抗体で検出した場合もｐＭＥ５５−１プラ
スミドＤＮＡを導入して得られたＣＯＳ−１培養上清中
に特異的なバンドが検出される。

【０３７９】上記実験系において、例えば被験物質存在
下または非存在下で培養したＫＫマウス初代培養肝細胞
の培養上清から試料を調製し、以下同様の操作を行うこ
とにより、被験物質の高脂血症、動脈硬化および高血糖
から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または
予防剤としての効果を調べることができる。この実験に
おいて検出される抗原量を低下させるような被験物質
は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一
つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となり得
る。多検体処理を行う場合には、電気泳動を省略してド
ットブロットやスロットブロットを行うこともできる。

【０３８０】実施例４． 組換えアデノウイルスの作製
および培養細胞における発現 参考例１で得られたマウス由来のｃＤＮＡを強制発現さ
せるため組換えアデノウイルスは、市販のキット（アデ
ノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット、
宝酒造（株）社製）を用いて作製した。すなわち、参考
例１で得られたファージミドクローン＃５５−１を、制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた約
１．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をを平滑化したものを挿
入ＤＮＡ断片として以下の操作に用いた。

【０３８１】また、サイトメガロウイルスエンハンサー
とニワトリβ−アクチンプロモーターにより発現される
ように設計されているコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ
（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キ
ットに添付）の制限酵素ＳｗａＩ認識部位にインサート
ＤＮＡ断片を挿入したコスミドｐＡｘＣＡ／ｍＡＰ５を
作製した。ｐＡｘＣＡ／ｍＡＰ５ ＤＮＡおよび末端タ
ンパク質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノ
ウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに添
付）をリン酸カルシウムトランスフェクションシステム
（ライフテック社製）を用いて２９３細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５７３）にコ・トランスフェクションして、組
換えアデノウイルスＡｄ／ｍＡＰ−５を単離し、さらに
２９３細胞中で増幅させた。また、コントロールコスミ
ドｐＡｘＣＡｉＬａｃＺから切り出したＬａｃＺ遺伝子
が組み込まれた組換えアデノウイルスベクターを有する
アデノウイルスＡｄ／ＬａｃＺを同様に作製し２９３細
胞で増幅させた。増幅させたウイルスの２９３細胞から
の回収は、まずウイルス感染２９３細胞に３０秒×４回
の超音波処理（ブランソン社製Ｂ−１２００を使用）を
行い、次いで塩化セシウム密度勾配遠心による精製を２
回繰り返すことによって行った。得られたウイルス液
を、１０％ グリセロールを添加したＰＢＳに対して４
℃で透析した後、使用するまで−７０℃以下で凍結保存
した。

【０３８２】このようにして得られた組換えアデノウイ
ルスを、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２）に約５ｍ．
ｏ．ｉ．（multiplicity of infection：多重感染度）
で感染させ、無血清培地（ダルベッコ修正イーグル培地
（ＤＭＥＭ））で３乃至４日培養した後の培養上清を回
収した。この上清１ｍｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフ
チューブに入れ、１００μｌのトリクロロ酢酸を添加し
て室温で３分放置した後、卓上遠心機にて１５０００ｒ
ｐｍで５分間遠心した。上清を除去し、氷冷したアセト
ンを０．５ｍｌ加えて良く攪拌し、再度卓上遠心機にて
１５０００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を除去し、再
び氷冷したアセトンを０．５ｍｌ加えて良く攪拌し、卓
上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分間遠心して、上清
を除いた後、沈殿物を真空乾燥させた。この沈殿物を１
０μｌの蒸留水に溶解させ、２−メルカプトエタノール
を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（バイオラッド社
製）と混合した後、９９℃で５分間加熱して、電気泳動
用試料を調製した。試料を中でゲル濃度４−２０％のポ
リアクリルアミド密度勾配ゲルにて電気泳動した（電気
泳動用緩衝液：２５ｍＭ トリス、１９２ｍＭ グリシ
ン、０．１％ ＳＤＳ）後、転写緩衝液中で４℃、１時
間、２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレンに
転写した。転写したメンブレンは０．５％ スキムミル
クを添加したＰＢＳ液で４℃で一晩ブロッキングし、洗
浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗
浄した。次いで、メンブレンを、５５−１−Ｎ１抗体の
精製前の抗血清と５５−１−Ｃ１抗体の精製前の抗血清
を混合したものを５％ ウシ胎児血清を含む０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１００００倍希釈した反応
液中に入れて室温で１時間インキュベーションした後、
洗浄液で３回洗浄した。さらに、メンブレンを西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
（バイオラッド社製）を５％ ウシ胎児血清を含む０．
０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１００００倍希釈し
た反応液中で室温で１時間インキュベーションした後、
洗浄液で５回洗浄した。このメンブレンをラップフィル
ム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出溶液
に１分間浸した後、１時間室温で放置してバックグラウ
ンドを減衰させてから、Ｘ線フィルムを感光させた（３
秒間）。その結果、組換えアデノウイルスＡｄ／ｍＡＰ
−５を感染させたＨｅＬａ細胞培養上清由来のサンプル
のレーン中に特異的なバンドが検出された（図３）。

【０３８３】一方、ファージミドクローン＃ｈ５−１が
保持するｃＤＮＡがアデノウイルスベクターに組み込ま
れたものを有する組換えアデノウイルス（Ａｄ／ｈＡＰ
５）を調製して同様の実験を行い、ＨｅＬａ細胞に発現
させた培養上清のウエスタンブロット解析を行った結
果、同様に特異的なバンドが検出された（図３）。

【０３８４】実施例５． 組換えアデノウイルスを用い
たインビボでの発現 上記のようにして精製された組換えアデノウイルスＡｄ
／ｍＡＰ−５またはＡｄ／ＬａｃＺを、１０％グリセロ
ールを含むＰＢＳで２×１０¹⁰ｐｆｕ（plaqueforming
unit）／ｍｌに希釈し、それぞれ３匹（Ａｄ／ｍＡＰ−
５）または２匹（Ａｄ／ＬａｃＺ）の１３−１４週齢の
雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに１００μｌ（２×１０⁹ｐｆ
ｕ）ずつ尾静脈注射により接種した。接種１日後に各マ
ウスの眼底よりヘマトクリット管で採血して、卓上遠心
機で５２００ｒｐｍで１５分遠心して血漿を分離し、中
性脂肪測定用キット（トリグリセリドＥ−テストワコ
ー、和光製薬（株）社製）を用いて中性脂肪濃度を測定
した。Ａｄ／ＬａｃＺ接種マウス群では血中の中性脂肪
濃度に有意な差が認められなかったのに対し、Ａｄ／ｍ
ＡＰ−５接種マウス群と他の２群の間には血中の中性脂
肪濃度に有意な差が認められた（図４）。

【０３８５】一方、ファージミドクローン＃ｈ５−１が
保持するｃＤＮＡがアデノウイルスベクターに組み込ま
れたものを有する組換えアデノウイルス（Ａｄ／ｈＡＰ
５）で同様の実験を行い、雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに発現
させた結果、血中の中性脂肪濃度の有意な上昇がみら
れ、ヒト型分子がマウス体内でも機能することが判明し
た（図４）。

【０３８６】また、これら血中の中性脂肪濃度に有意差
が認められたアデノウイルス感染マウス群の肝臓から全
ＲＮＡを回収し、実施例１記載の方法でノーザンブロッ
ト解析を行ったところ、導入した遺伝子が実際に高発現
していることが確認された（図５）。アデノウイルス感
染ＫＫ／Ｓｎｋマウス群で検出されるバンドは、遺伝子
操作を行っていないＫＫマウスで検出されるバンドより
も大きいが、これは組換えアデノウイルスベクター中で
有効な転写開始点またはポリ（Ａ）付加シグナルが本来
の遺伝子上のものとは異なることに起因すると考えられ
る。いずれにせよ、組換えアデノウイルスベクターに組
み込まれたｃＤＮＡ中の最初の翻訳開始コドンのすぐ
５'末端側には、該翻訳開始コドンと同一読み枠上に終
始コドンが存在するため、このｍＲＮＡの大きさの違い
は翻訳されるアミノ酸配列には影響しない。

【０３８７】実施例６． 組換えタンパク質の精製およ
びＮ末端アミノ酸配列の決定 以下に記載する方法に従って、実施例３で作成された、
配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有す
るヒトｃＤＮＡが挿入された発現ベクターｐＭＥｈ５５
−１で動物細胞を形質転換し、該形質転換細胞の培養上
清中に分泌される組換えタンパク質を精製して、そのＮ
末端アミノ酸配列を決定した。

【０３８８】（１）形質転換体の取得および培養上清の
調製 １０％ＦＣＳ（ギブコ・ビーアールエル社製）、１０単
位／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌ ストレプト
マイシン（ギブコ・ビーアールエル社製）を含むαＭＥ
Ｍ（ギブコ・ビーアールエル社製）培地でジヒドロ葉酸
還元酵素欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９
６）を増殖させた後、トランスフェクション試薬（Ｆｕ
ＧＥＮＥ６：ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を使
用し、ｐＭＥｈ５５−１プラスミドを１μｇ／１０⁶細
胞の割合でトランスフェクトした。具体的には、細胞は
２００枚の細胞培養用シャーレ（１５０ｍｍφ、コーニ
ング社製）に１．５×１０⁷細胞／シャーレで培養し、
トランスフェクションにはシャーレ１枚あたり１５μｇ
のｐＭＥｈ５５−１プラスミドを使用した。トランスフ
ェクション操作後の細胞を上記のＦＣＳを含む培地中で
２４時間培養後、培地を無血清αＭＥＭ培地（３０ｍｌ
／シャーレ）に交換してから、さらに３日間培養し、無
血清培養上清６リットルを回収した。

【０３８９】（２）組換えタンパク質の精製 １） カラム（ストリームラインＣ−１００：アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテク社製）に充填したセファ
デックスＧ２５（アマシャム・ファルマシア・バイオテ
ク社製）１．６リットル分のゲルに、上記（１）で得ら
れた培養上清を６００ｍｌ注入した（流速：２０ｍｌ／
分）。次いで、溶離緩衝液（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７．５）、０．０１％ アジ化ナトリウム（シグマ社
製）、０．０５％ プロテアーゼインヒビター混合液
（シグマ社製）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ
社製）。以下「Ａ液」という）を流速５０ｍｌ／分でカ
ラムに流し、初めの１５００ｍｌ分の溶出液を回収し
た。この操作を１０回実施して、上記（１）で得られた
６リットルの培養上清の脱塩および低分子除去を行っ
た。

【０３９０】２） 次に、上記１）で得られた溶出液を
ＦＰＬＣ装置（バイオパイロットシステム、アマシャム
・ファルマシア・バイオテク社製）を用い、以下に記載
する条件によりイオン交換クロマトグラフィーを行って
分画した。 カラム： Ｑセファロース・ファストフロー（アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテク社製）１００ｍｌをＸＫ
５０／１００カラム（アマシャム・ファルマシア・バイ
オテク社製）に充填した。 溶離緩衝液組成： ［Ａ液］ 上記参照 ［Ｂ液］２０ｍＭ トリス−塩酸、１Ｍ 塩化ナトリウ
ム（ｐＨ７．５）、０．０１％ アジ化ナトリウム、
０．０５％ プロテアーゼインヒビター混合液、０．０
５％ Ｔｗｅｅｎ２０ 流速： １０ｍｌ／分 分画： 各１０ｍｌ／チューブ 温度： ４℃ 溶出条件： １００％ Ａ液から１００％ Ｂ液への直
線濃度勾配（６０分間）塩化ナトリウム濃度 ０．３乃
至０．４Ｍで溶出された画分を回収した。

【０３９１】３） さらに、上記２）のイオン交換クロ
マトグラフィーで回収された画分について、ＦＰＬＣ装
置を用いて、以下に記載する条件の群特異的アフィニテ
ィークロマトグラフィーを実施した。 カラム： アフィゲル ブルー（バイオラッド社製）１
０ｍｌをＸＫ１６／４０カラム（アマシャム・ファルマ
シア・バイオテク社製）に充填した。溶離緩衝液組成： ［Ｃ液］２０ｍＭ トリス−塩酸、０．５Ｍ 塩化ナト
リウム（ｐＨ７．５）、０．０１％ アジ化ナトリウ
ム、０．０５％ プロテアーゼインヒビター混合液、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ［Ｄ液］２０ｍＭ トリス−塩酸、１Ｍ 塩化ナトリウ
ム（ｐＨ７．５）、０．０１％ アジ化ナトリウム、
０．０５％ プロテアーゼインヒビター混合液、０．０
５％ Ｔｗｅｅｎ２０ 流速： １．５ｍｌ／分 温度： ４℃ 上記２）で回収された画分をカラムに通した後、Ｃ液を
６０ｍｌ流して洗浄してから、Ｄ液を１００ｍｌ流し
て、Ｄ液による溶出液を回収した。

【０３９２】４） 上記３）で得られた溶出液に等量
（１００ｍｌ）のＡ液を加えた。このものについて、Ｆ
ＰＬＣ装置を用いて、以下に記載する条件の群特異的ア
フィニティークロマトグラフィーを実施した。 カラム： レンチル・レクチン・セファロース４Ｂ（ア
マシャム・ファルマシア・バイオテク社製）１０ｍｌを
ＸＫ１６／４０カラムに充填した。溶離緩衝液組成： ［Ｃ液］ 上記参照 ［Ｆ液］２０ｍＭ トリス−塩酸、０．５Ｍ 塩化ナト
リウム、０．３Ｍ メチルマンノピラノシド（ｐＨ７．
５）、０．０１％ アジ化ナトリウム、０．０５％ プ
ロテアーゼインヒビター混合液、０．０５％ Ｔｗｅｅ
ｎ２０ 流速： １ｍｌ／分 温度： ４℃ サンプルをカラムに通した後、Ｃ液を５０ｍｌ流して洗
浄してから、Ｆ液を５０ｍｌ流して、Ｆ液による溶出液
を回収した。

【０３９３】この溶出液を透析チューブ（排除限界分子
量１０ＫＤａ：ギブコ・ビーアールエル社製）に移し、
０．０１％ アジ化ナトリウムおよび０．１％ プロテ
アーゼインヒビター混合液を含むダルベッコＰＢＳ
（−）（日水製薬（株）社製）２リットルに対して、４
℃で一晩透析した。その後、透析チューブ内の溶液を回
収して、そのうち４ｍｌに、４ｍｇ／ｍｌ デオキシコ
ール酸ナトリウムを含むＴＣＡを１／１０容量（０．４
ｍｌ）加え、得られた沈殿を回収し、続いてアセトンを
加えて得られた沈殿を回収し、５０μｌの滅菌超純水に
溶解した。

【０３９４】（３）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 上記（２）で精製された試料にＰＮＧａｓｅＦ（ニュー
イングランド・バイオラブ社製）を加え、Ｎ結合型糖鎖
を切断した。具体的には、まず５０μｌの試料に６μｌ
の１０×変性バッファー（ＰＮＧａｓｅＦ試薬に添付）
を添加して攪拌し、１０分間煮沸水浴中で加熱した。こ
れを室温に戻した後、６μｌの１０％ノニデットＰ−４
０および６μｌの１０×Ｇ７バッファー（以上ＰＮＧａ
ｓｅＦ試薬に添付）を順に加えて攪拌した。このものに
ＰＮＧａｓｅＦを３μｌ添加し、攪拌してから３７℃の
水浴で２時間以上保温した。

【０３９５】このＮ結合型糖鎖切断反応後の反応液につ
いて、４乃至２０％濃度勾配アクリルアミドゲル（マル
チゲル４／２０、第一化学薬品（株）社製）およびミニ
スラブ式電気泳動装置（日本エイドー（株）社製）を用
いた還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。電気泳
動後、ゲルメンブラン転写装置（マリソル社製）を用
い、ゲル内で分離されたタンパク質を０．２μｍ孔径の
ポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（バイオ
ラッド社製）に転写した（２ｍＡ／ｃｍ²、４℃で２時
間）。転写後の膜を１００％ メタノール（和光純薬
（株）社製）で１０秒間濡らした後、超純水で２分間洗
浄してから、クーマシー染色液（バイオラッド社製）で
５分間染色し、さらに膜をメタノールに浸して２分間脱
色した結果、約５０ＫＤａに相当するバンドがみられ
た。このバンド部分の膜を切り出し、プロテインシーク
エンサー（ＰＰＳＱ−１０：島津製作所（株）社製）に
てＮ末端配列の解析を実施した。

【０３９６】その結果、上記約５０ＫＤａのバンドのＮ
末端アミノ酸配列はSer-Arg-Ile-Asp-Gln-Asp-Asn-Ser-
Ser-Phe-Asp （配列表の配列番号４のアミノ酸番号１
７から２７）であった。このことから、配列表の配列番
号３のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌ
クレオチド配列にコードされるタンパク質は、哺乳動物
細胞では、Ｎ末端の１６個のペプチド（配列表の配列番
号４のアミノ酸番号１から１６）が切り落とされて、そ
の直後に続くセリン残基（配列表の配列番号４のアミノ
酸番号１７）をＮ末端とする成熟体として分泌されるこ
とが明らかとなった。

【０３９７】参考例３． 組換えタンパク質の精製およ
びマウスへの投与 実施例６において精製した組換えタンパク質３００μｇ
を１５週令のＫＫ／Ｓｎｋマウス雄４匹に尾静脈投与し
た。対照として、別の個体４匹にはＰＢＳ（ギブコ・ビ
ーアールエル社製）を投与した（０．５ｍｌ／マウ
ス）。投与１、３、６、２４時間後、それぞれのマウス
から７５μｌヘパリン処理済みキャピラリー採血管（フ
ナコシ社製）で眼底採血し、５２００ｒｐｍ、４℃で１
５分間遠心した（トミー精工（株）社製ＴＨ−１ロータ
ー使用）後、血漿を分離し回収した。同様に、精製タン
パク質投与前に眼底採血により血漿を分離し、投与前値
のサンプルとして回収した。血中の中性脂肪濃度測定
は、トリグリグリセライドＥテストワコー（和光純薬
（株）社製）を使用した。すなわち、回収した血漿を２
μｌずつ９６穴プレート（コーニング社製）に加え、こ
れに発色試薬２００μｌを添加して攪拌後、１０分間室
温で静置した。操作終了後、マイクロプレートリーダー
で主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度を測定
し、主波長の測定値から副波長の測定値を差し引いた値
から中性脂肪濃度を算出した。

【０３９８】その結果を表１に示した。組換えタンパク
質の投与により、血中の中性脂肪濃度が上昇することが
示された。

【０３９９】

【表１】 （単位：ｍｇ／ｄｌ） ――――――――――――――――――――――――――― ＰＢＳ 組換えタンパク質 ――――――――――――――――――――――――――― 投与前 ３４．４ ３３．８ 投与１時間後 ３０．５ １４２．８ ３時間後 ３５．１ ９９．９ ６時間後 ３２．４ ４４．３ ２４時間後 ２８．６ ３５．１ ――――――――――――――――――――――――――― 参考例４． ベザフィブレート投与による影響 １１週齢の雄Zucker fattyラット（日本チャールズリバ
ーより購入）２匹に７日間、高脂血症治療剤ベザフィブ
レート（シグマ社製）をＦ２粉末飼料（船橋農場社製）
に０．３％の濃度で混ぜて投与した。対照群のラット
（２匹）にはＦ２粉末飼料のみを与えた。両方の条件の
ラットからそれぞれ血液サンプルを回収した後、肝臓を
摘出し、直ちに液体窒素内に入れ急凍した後、−８０℃
に保存した。得られた肝臓組織０．１ｇに対し５ｍｌの
ＴＲＩｚｏｌ試薬（ギブコ・ビーアールエル社製）を加
え、超高速ホモジナイザー（ポリトロン、キネマティカ
社製）を用いて氷上でホモジナイズを行った（目盛１０
で２分間）。これを室温で５分間静置した後、１ｍｌの
クロロホルムを加え、１５秒間激しく転倒混和した。再
び室温で１０分間静置してから、１２０００×ｇ、室温
で１０分間遠心分離した。遠心後、上層を回収し、２．
５ｍｌのリボヌクレアーゼ不含イソプロピルアルコール
を加えて混和した。これを室温で１０分間静置後、１２
０００×ｇ、室温で１０分間遠心分離した後、上清を除
去してリボヌクレアーゼ不含７０％エタノールを加え
た。これを１２０００×ｇ、室温で５分間遠心分離し、
上清を除去して、沈殿を乾燥させてから、−８０℃に保
存した。得られたペレットをリボヌクレアーゼを含まな
い純水に溶解したものを全ＲＮＡ溶液とした。

【０４００】一本鎖ｃＤＮＡの合成は以下の手順で行っ
た。得られた全ＲＮＡ１μｇにリボヌクレアーゼを含ま
ない純水を加え全量を６μｌとし、１０×ＤＮＡａｓｅ
反応緩衝液（ギブコ・ビーアールエル社製ＤＮａｓｅ
Ｉに添付）を１μｌ、ＤＮａｓｅＩ（Ａｍｐグレード、
ギブコ・ビーアールエル社製）を１μｌ加え、室温で１
５分間保温した後、２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ＤＮａｓｅＩ
に添付）を１μｌ加え、６５℃で１０分間保温した。こ
の溶液に、一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（SuperScript fi
rst-strand synthesis system for RT-PCR、ギブコ・ビ
ーアールエル社製）添付のランダムヘキサマープライマ
ーを１μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘを１μｌ加
え、６５℃、５分間保温した後、急激に４℃まで冷却し
熱変性を行った。引き続き、ｃＤＮＡ合成キット添付の
１０×逆転写反応緩衝液を２μｌ、２５ｍＭ 塩化マグ
ネシウムを４μｌ、０．１Ｍ ジチオスレイトール溶液
を２μｌ、リボヌクレアーゼインヒビターを１μｌ加
え、２５℃で２分間保温し、その後、添付の逆転写酵素
を１μｌ 添加した。このサンプルを２５℃で１０分保
温後、４２℃で５０分保温した。さらに７０℃で１５分
間保温した後、急激に４℃まで冷却し熱変性を行った。
添付のリボヌクレアーゼＨを１μｌ加え、３７℃で２０
分間保温してＲＮＡを分解し、−２０℃にて保存した。
反応終了後、すべてのサンプルに２９μｌのリボヌクレ
アーゼを含まない純水を加え、さらにリボヌクレアーゼ
を含まない純水で５倍希釈したものを下記の定量に用い
た。検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液は、対照サンプル
の１例の定量用溶液よりリボヌクレアーゼを含まない純
水にて５倍ずつの希釈系列を作成することにより調製し
た。

【０４０１】一方、TaqMan ＰＣＲに用いるプライマー
として、下記の配列：5'- caaagcttga aagtctactg gagg
-3' （配列表の配列番号３０）;および5'- ggttctgaa
c caagctggtc a -3' （配列表の配列番号３１）を有す
るオリゴヌクレオチドを合成した（アマシャム・ファル
マシア社に発注）。

【０４０２】さらに、TaqMan ＰＣＲに用いるプローブ
として、下記の配列：5'- aagatggcgc tccaacacag agtc
ag -3' （配列表の配列番号３２）を有し、その５'末
端にレポーター色素Ｆａｍ、３'末端にレポーター消光
体のＴａｍｕｒａを結合したオリゴヌクレオチドを合成
した（ＴａｑＭａｎ フルオレセント・プローブ、アプ
ライドバイオシステムズジャパン社製）。また「アンジ
オポエチン関連タンパク質３」の発現量の標準化をはか
る目的で、ラット１８ｓリボゾームＲＮＡの定量を行う
こととし、ＴａｑＭａｎ リボソーマルＲＮＡコントロ
ール・リージェント、アプライドバイオシステムズジャ
パン社製）を用いた。

【０４０３】これらの材料を用いて、ＴａｑＭａｎ Ｐ
ＣＲ法による、ラット「アンジオポエチン関連タンパク
質３」遺伝子の発現量の定量を行った。ＰＣＲ反応は９
６穴反応プレート（マイクロアンプ・オプチカル・９６
ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシ
ステムズジャパン社製）中で行った。反応溶液の組成は
１ウェル中、上記方法で得られた一本鎖ｃＤＮＡ溶液５
μｌ、ＴａｑＭａｎＰＣＲ用プライマー（５０ｐｍｏｌ
／μｌ）を正方向側、逆方向側ともに０．２μｌ（最終
濃度２００ｎＭ）、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ用プローブ
（６．６μＭ）０．７５μｌ（最終濃度１００ｎＭ）、
ＰＣＲ増幅用混合液（ＴａｑＭａｎ ユニバーサル・Ｐ
ＣＲマスター・ミックス、アプライドバイオシステムズ
ジャパン社製）２５μｌ、超純水１８．８５μｌとし
た。この際、検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液は原液濃
度を便宜的に「６２５」とし、以降５倍希釈を繰り返し
て濃度「６２５」、「１２５」、「２５」、「５」およ
び「１」の溶液について同様に反応液を調製した。ＰＣ
Ｒ反応はＴａｑＭａｎ ＰＣＲ専用サーマルサイクラー
・検出器（ＡＢＩ７７００、アプライドバイオシステム
ズジャパン社製）を用いて行った。反応は、５０℃で２
分間、９５℃で１０分間保温の後、９５℃で１５秒間、
６０℃で１分間の反応を４０回繰り返し、１サイクルご
とにレポーター色素の発光量を測定した。各サイクルご
とのレポーター色素の発光量から１８Ｓリボゾーム、
「アンジオポエチン関連タンパク質３」の増幅曲線を作
成した。検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液の希釈系列の
増幅曲線から横軸に濃度、縦軸にサイクル数をとった検
量線を作成し、各発現定量用サンプルについてはその対
数増幅期において任意に設定した一定の発光量を超えた
サイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を
算出した。「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝
子の発現量は同一サンプルにおける１８Ｓリボゾームの
発現量の値で補正を行った。

【０４０４】その結果、ラット「アンジオポエチン関連
タンパク質３」遺伝子の発現量は、ベザフィブレート投
与群において、コントロール群に比べ７３％低下してい
ることが示された。なお、この時用いられたベザフィブ
レート投与群のラットの血中中性脂肪濃度は、コントロ
ール群に比べて５０％減少していた。

【０４０５】参考例５． 動脈硬化および血糖値への影
響低脂血症マウスＫＫ／Ｓｎｋは配列表の配列番号２に
示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードす
る遺伝子の変異型（以下「低脂血症変異遺伝子」とい
う）をホモで有し、該ポリペプチドの産生量が先天的に
低い。以下に記載する方法に従って動脈硬化モデルマウ
スまたは高血糖モデルマウスにおける低脂血症変異遺伝
子の影響を検討した。

【０４０６】１） コンジェニックマウスの作出 ａ）交配様式 ＫＫ／Ｓｎｋマウスの雌をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの雄
（浜松医科大学附属動物実験施設より入手）と交雑し
て、戻し交雑第１世代（Ｎ１世代）を作出した。次い
で、Ｎ１雌をＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄に再度交雑してＮ２世
代を得た。このＮ２個体の尾からゲノムＤＮＡを抽出
し、後述ｃ）記載の方法でＰＣＲを行い、低脂血症変異
遺伝子をヘテロで持つ個体を選抜した。選抜した雌をさ
らにＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄と交雑して、Ｎ３世代を作出し
た。その後、同様の方法でＮ１０世代まで連続して選抜
交雑を実施した。次いで、Ｎ１０世代のヘテロの雌雄を
交雑し、得られた産児から採取したゲノムについて後述
ｃ）記載の方法でＰＣＲを実施して、低脂血症変異遺伝
子をホモで持つ雌雄を選抜した。その後、兄妹交配によ
り継代し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景の低脂血症変異コンジ
ェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−低脂血症）系統を
得た。いずれの動物も温度２３±１℃、湿度５５±１０
％、１４時間照明の動物室内で飼育し、ＣＭＦ固形飼料
（オリエンタル酵母工業（株）製）と７ｐｐｍクロール
水を自由摂取させた。

【０４０７】ｂ）ゲノムＤＮＡの抽出方法 上記ａ）で選抜に用いたマウス（４週齢）より採取した
尾（１．５ｃｍ）を８４０μｌの溶解液（７２０μｌの
１×ＳＳＣ、８０μｌの１０％ ＳＤＳ、４０μｌの１
０ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫを含む）に浸漬し、５
０℃で保温しながら一晩振盪した。次いで、１ｍｇ／ｍ
ｌ リボヌクレアーゼＡを２０μｌ加えて、５０℃で１
時間保温した。その後、フェノール・クロロホルム抽出
を２回、エタノール沈殿操作を１回行い、沈殿を１０ｍ
Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡを
含む緩衝液１５０μｌに溶解した。その後、分光光度計
（Ｕ−３０００、（株）日立製作所製）で２６０ｎｍ波
長における吸光度を測定し、滅菌水を加えて濃度を２５
ｎｇ／μｌに調整してゲノムＤＮＡ試料とした。

【０４０８】ｃ）遺伝子型の判定 ２種類のマイクロサテライトマーカー検出用プライマー
セット（Ｄ４Ｍｉｔ１５およびＤ４Ｍｉｔ２１９、リサ
ーチジェネティクス社製）を用い、サーマルサイクラー
（ＰＴＣ−１００、エムジェーリサーチ社製）を使用し
て以下の条件でＰＣＲを行った。１．５μｌの１０×Ｐ
ＣＲバッファー［１００ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．
３）、１５ｍＭ 塩化マグネシウム、５００ｍＭ 塩化
カリウムを含む。ロシュ・ダイアグノティクス社製］、
２．４μｌの各１．２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（宝酒造
（株）社製）、各０．４５μｌの６．７μＭ プライマ
ー、０．３５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ
・ダイアグノティクス社製）に滅菌水を加えて１１μｌ
とした後、上記ｂ）で調製したゲノムＤＮＡを４μｌ加
え、反応液を調製した。この反応液を、まず９４℃で３
分間加熱した後、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２
℃で４５秒の温度サイクルを３５回繰り返し、さらに７
２℃で３分保持してから、４℃で保温した。

【０４０９】このＰＣＲ後の反応液に色素液（０．１５
％ ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール）を
２μｌ加え、そのうちの５μｌを４％のアガロースゲル
（ＮｕＳｉｅｖｅ ３：１アガロース（ＦＭＣバイオプ
ロダクツ社製）で調製した）で１５０Ｖ、室温で１．５
時間乃至２時間、電気泳動した。電気泳動後のゲルを臭
化エチジウムで染色した後、紫外線照射下で目的のＤＮ
Ａに相当するバンドを確認した。プライマーセットＤ４
Ｍｉｔ１５で約２８０ｂｐと約３００ｂｐの２種類の断
片が増幅され、かつＤ４Ｍｉｔ２１９で約１１０ｂｐと
約１２０ｂｐの２種類の断片が増幅されたゲノムを有す
る個体を「低脂血症変異遺伝子へテロ」、Ｄ４Ｍｉｔ１
５で約３００ｂｐの断片のみが増幅され、かつＤ４Ｍｉ
ｔ２１９で約１２０ｂｐの断片のみが増幅されたゲノム
を有する個体を「低脂血症変異遺伝子ホモ」とした。

【０４１０】２）低脂血症変異遺伝子ホモ／ＡｐｏＥホ
モ欠損個体の作出 ａ）選抜様式 上記１）のａ）で得られたＣ５７ＢＬ／６Ｊ−低脂血症
マウスとアポリポタンパク質Ｅ（以下「ＡｐｏＥ」とい
う）ホモ欠損マウス（Zhang, S.H., et al. (1992) Sci
ence 258, 468-471、東京大学医学部器官病態内科学教
室より入手）との交雑から交雑第１世代（Ｆ１世代）を
作出した。次いで、Ｆ１世代の雌雄を交雑してＦ２世代
を得た。Ｆ２世代のうち、ＡｐｏＥをホモで欠損し、低
脂血症変異遺伝子をホモで持つ個体（以下「ＡｐｏＥ
ＫＯ−低脂血症マウス」という）と低脂血症変異遺伝子
を持たないＡｐｏＥホモ欠損個体（以下「ＡｐｏＥ Ｋ
Ｏマウス」という）を下記の方法で遺伝子型を判定する
ことにより選抜した。なお、いずれの動物も上記１）の
ａ）記載の方法で飼育した。

【０４１１】ｂ）遺伝子型の判定方法 上記１）のｂ）記載の方法でマウス尾よりゲノムＤＮＡ
を抽出した。低脂血症変異遺伝子を選抜するために、変
異型アレルと野生型アレルにおいてサイズ多型を検出す
るオリゴヌクレオチドプライマー：5'- ggctaaatag taa
aaccctg gcg -3' （配列表の配列番号３３）；および
5'- gtgcttgctg tctttccagt ctt -3' （配列表の配列
番号３４）を合成した。このプライマーセットを用いて
ＰＣＲを実施すると、低脂血症変異遺伝子では約２４０
ｂｐの断片が増幅され、一方変異のない正常遺伝子で
は、約２３０ｂｐの断片が増幅される。

【０４１２】また、ＡｐｏＥ欠損を検出するために、欠
損型アレル（ネオマイシン耐性遺伝子）を特異的に増幅
するための、下記の配列からなるオリゴヌクレオチドプ
ライマー：5'- aggatctcgt cgtgacccat ggcga -3'
（配列表の配列番号３５）；および5'- gagcggcgat acc
gtaaagc acgagg -3' （配列表の配列番号３６）（Gaw,
A., et al. (1995) Lab. Anim. 29, 447-449参照）を
それぞれ合成した。このプライマーセットを用いてＰＣ
Ｒを実施すると、鋳型となる遺伝子にＡｐｏＥ欠損変異
がある場合のみ２００ｂｐの断片が増幅される。

【０４１３】さらに、ＡｐｏＥ欠損のない野生型アレル
を特異的に増幅するための、下記の配列からなるオリゴ
ヌクレオチドプライマー：5'- tcccaagtca cacaagaact
gac -3' （配列表の配列番号３７）；および5'- catcc
agaag gctaaagaag gca -3' （配列表の配列番号３８）
をそれぞれ合成した。このプライマーセットを用いてＰ
ＣＲを実施すると、鋳型となる遺伝子にＡｐｏＥ欠損変
異がない場合のみ１７４ｂｐの断片が増幅される。

【０４１４】上記の３セットのプライマーを用いて、上
記１）のｃ）に記載した通り、ＰＣＲと電気泳動を実施
し、増幅された断片を調べた。その結果、約２４０ｂｐ
および２００ｂｐの断片が検出された個体を「ＡｐｏＥ
ＫＯ−低脂血症マウス」とし、約２３０ｂｐおよび２
００ｂｐの断片が検出された個体を「ＡｐｏＥ ＫＯマ
ウス」として選抜した。

【０４１５】３）低脂血症変異遺伝子ホモ／レプチン変
異遺伝子ホモ個体の作出 ａ）選抜様式 上記１）のａ）で得られたＣ５７ＢＬ／６Ｊ−低脂血症
マウスとレプチン変異遺伝子（Ｌｅｐ^ob）をヘテロで持
つＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｅｐ^obマウス（Coleman, D. L.
and Hummel, K. P. (1973) Diabetologia 9 :287-293.
浜松医科大学附属動物実験施設より入手）との交雑か
ら交雑第１世代（Ｆ１世代）を作出した。次いで、Ｆ１
世代の雌雄を交雑してＦ２世代を得た。Ｆ２世代のう
ち、レプチン変異遺伝子と低脂血症変異遺伝子をともに
ホモで持つ個体（以下「ｏｂ−低脂血症マウス」とい
う）と低脂血症変異遺伝子を持たないレプチン変異ホモ
個体（以下「ｏｂマウス」という）を下記の方法で遺伝
子型を判定することにより選抜した。なお、いずれの動
物も上記１）のａ）記載の方法で飼育した。

【０４１６】ｂ）遺伝子型の判定方法 上記１）のｂ）記載の方法でマウス尾よりゲノムＤＮＡ
を抽出した。レプチン変異を検出するために、変異型ア
レルを特異的に増幅するための、下記の配列からなるオ
リゴヌクレオチドプライマー：5'- tgacctggag aatctct
-3' （配列表の配列番号３９）；および5'- catccagg
ct ctctggc -3' （配列表の配列番号４０）；（Namae,
M. et al. (1998) Lab. Anim. Sci. 48, 103-104参
照）をそれぞれ合成した。このプライマーセットを用い
てＰＣＲを実施すると、鋳型となる遺伝子に変異型アレ
ルがある場合のみ約１００ｂｐの断片が増幅される。

【０４１７】さらに、レプチン変異のない野生型アレル
をを特異的に増幅するための、下記の配列からなるオリ
ゴヌクレオチドプライマー：5'- tgacctggag aatctcc -
3' （配列表の配列番号４１）；および5'- catccaggct
ctctggc -3' （前出、配列表の配列番号４０）をそれ
ぞれ合成した。このプライマーセットを用いてＰＣＲを
実施すると、鋳型となる遺伝子にレプチン変異のない場
合のみ約１００ｂｐの断片が増幅される。

【０４１８】上記の２セットのプライマーおよび上記
２）のｂ）に記載した低脂血症変異遺伝子を選抜するた
めの１セットのプライマーを用いて、上記１）のｃ）に
記載した通り、ＰＣＲと電気泳動を実施し、増幅された
断片を調べた。その結果、約１００ｂｐ（レプチン変異
型）および約２４０ｂｐの断片が検出された個体を「ｏ
ｂ−低脂血症マウス」とし、約１００ｂｐ（レプチン変
異型）および約２３０ｂｐの断片が検出された個体を
「ｏｂマウス」として選抜した。

【０４１９】４）血清脂質と動脈硬化病変面積の測定 ＡｐｏＥ ＫＯマウス（雄３匹、２２−２３週齢）およ
びＡｐｏＥ ＫＯ−低脂血症マウス（雄３匹、１９−２
３週齢）を、いずれも１７時間絶食させた後にエーテル
麻酔下で腹大静脈より採血した。次いで血液を３０分放
置した後、２０００×ｇ、室温で１０分間遠心分離を行
い、血清を回収した。血清中の中性脂肪濃度については
トリグリセリドE−テストワコー（和光純薬工業（株）
社製）を、血清コレステロール濃度についてはコレステ
ロールＣ−テストワコー（和光純薬工業（株）社製）を
それぞれ用いて測定した。

【０４２０】また、エーテル麻酔下で、各マウスの胸部
を切開し、左心室より１単位／ｍｌのへパリンを含む生
理食塩液で洗浄した。心臓より大動脈弓部までを取り出
し、心臓と大動脈弁部の分岐点が現れるまで脂肪を除去
した。脂肪除去後、大動脈直上で切断し、４％中性ホル
マリン溶液中で２４時間乃至７日間浸漬固定した。固定
後、常法にしたがってパラフィンブロックを作製した。
このパラフィンブロックを大動脈弓部側からミクロトー
ムで薄切して、切片に初めて弁が現れてから、５μｍの
厚さで連続５枚の切片を採取し、その次の５枚を捨て
た。これを１単位として、この方法で全長５００μｍま
で薄切した。得られた切片には、ElasticaMasson染色を
施した。

【０４２１】ＣＣＤカメラ（ＨＣ−２０００、富士写真
フィルム（株）社製）を搭載した光学顕微鏡（ＢＸ−５
０、オリンパス光学工業（株）社製）下において、Elas
ticaMasson染色を施した大動脈弁部横断像をテレビモニ
ター上に映し出し、画像解析プログラム（ＱＷｉｎ、ラ
イカ社製）を用いて病変の境界をトレースし、病変面積
を計測した。各個体とも厚さ５０μｍの間隔で合計１０
枚の切片について病変面積を計測し、その総和を算出し
た。

【０４２２】その結果を表２に示した。

【０４２３】

【表２】 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ＡｐｏＥ ＫＯ ＡｐｏＥ ＫＯ−低脂血症 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 中性脂肪濃度（mg/dl） 611.7±223.8 178.7±47.4総コレステロール（mg/dl） 1227.3±245.7 610.7±163.2 動脈硬化病変面積の 総和（×１０⁵μｍ²） 10.81±5.48 2.55±1.07 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 以上の結果から、配列表の配列番号２に示されるアミノ
酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の変異
は、血清脂質の低下とともに動脈硬化病変の進展を抑制
することが示された。５）血糖値の測定 ＡｐｏＥ ＫＯ（雄９匹、２４週齢）、ＡｐｏＥ ＫＯ
−低脂血症マウス（雄１０匹、２４週齢）、ｏｂマウス
（雄１２匹、１７−１８週齢）、およびｏｂ−低脂血症
マウス（雄１４匹、１７−１９週齢）を、いずれも１７
時間絶食させた後にエーテル麻酔下で腹大静脈より採血
した。次いで血液を３０分放置した後、２０００Ｇ、室
温で１０分間遠心分離を行い、血清を回収した。血糖値
はグルコースＢ−テストワコー（和光純薬工業（株）社
製）を用いて測定した。

【０４２４】ＡｐｏＥ ＫＯおよびＡｐｏＥ ＫＯ−低
脂血症マウスの結果を表３に、ｏｂマウスおよびｏｂ−
低脂血症マウスの結果を表４に示した。

【０４２５】

【表３】 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ＡｐｏＥ ＫＯ ＡｐｏＥ ＫＯ−低脂血症 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 血糖値（mg/dl） 276.8±69.3 121.4±30.0** ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ** P<0.001

【０４２６】

【表４】 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ｏｂ ｏｂ−低脂血症 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 血糖値（mg/dl） 407.2±195.1 260.1±146.6* ――――――――――――――――――――――――――――――――――― * P<0.05 以上の結果から、配列表の配列番号２に示されるアミノ
酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の変異
は、ＡｐｏＥ欠損あるいはレプチン変異による高血糖を
有意に低下させることが示された。

【０４２７】実施例７ モノクローナル抗体の調製 （a） 抗原蛋白質の調製 １）生産ＣＨＯ細胞株の作製 ｐＳＲαプロモーター下流（ｐＭＥ１８Ｓプラスミド）
にヒトアンジオポエチン関連蛋白質３ ｃＤＮＡが位置
する発現ベクターを作製した。この発現ベクターとｐＳ
Ｖ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ）を１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃ
ｏＢＲＬ社製）−ＭＥＭα（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）−
１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン-１０μｇ／ｍｌスト
レプトマイシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）培地でジヒド
ロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）に共導入
し、核酸除去培地において定常株を取得した。次に、本
定常株をメトトレキセート０．０８μＭ濃度で生育可能
な耐性株を取得し、遺伝子重複による発現量の増加が確
認された株を取得した。以後、１．２８、３０、６０μ
Ｍのメトトレキセート入り核酸除去ＭＥＭα培地で生育
可能な株を取得していき、最終的にコンフルエントな無
血清培養の細胞培養用フラスコ上で、５乃至１０ｍｇ／
ｌ／３日の生産能を有するアンジオポエチン関連蛋白質
３生産ＣＨＯ細胞株を取得した。このように作製したア
ンジオポエチン関連蛋白質３生産ＣＨＯ細胞株をコンフ
ルエントまで培養後、無血清ＭＥＭα（ＧｉｂｃｏＢＲ
Ｌ社製）培地に交換し、３日間培養して無血清培養上清
を得た。２）脱塩、小分子除去 本サンプルをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（アマシャム・
ファルマシア・バイオテク社製）１.６リットルのゲル
に対して６００ｍｌの割合で２０ｍｌ／ｍｉｎで１０回
に分けて、脱塩、小分子を除去した。本サンプルをＦＰ
ＬＣ（Ｂｉｏｐｉｌｏｔ ｓｙｔｅｍ、アマシャム・フ
ァルマシア・バイオテク社製）を用いたイオン交換クロ
マトグラフィーで分画した。３）分画ＳｔｅｐＩ カラム：Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ
（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）をＸＫ
５０（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に
１００ｍｌ充填した。溶離緩衝液： Ａ）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）−０.０
１％ ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％ Ｐｒ
ｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ
（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％ Ｔｗｅｅｎ２０
（ＳＩＧＭＡ社製） Ｂ）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１Ｍ ＮａＣｌ（ｐ
Ｈ７.５）−０.０１％ ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−
０.００５％ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％
Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製） 流速：１０ｍｌ／ｍｉｎ フラクション溶液：１０ml／ｔｕｂｅ 温度：４℃ 溶出条件：溶離液A ⇒ 溶離液B（直線濃度勾配、６０
分間） 得られたフラクションについて、各々０.３乃至０．４
５Ｍ ＮａＣｌ濃度で溶出されてくる画分を回収した
後、一つの溶液にまとめた。まとめた溶液をサンプルと
して、以下の条件で、ＦＰＬＣ（アマシャム・ファルマ
シア・バイオテク社製）を用いて、群特異的アフィニテ
ィークロマトグラフィーを以下の条件で実施した。 ４）分画ＳｔｅｐＩＩ カラム：Ａｆｆｉ Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ（ＢｉｏＲａｄ）
をＫＸ１６（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社
製）に１０ｍｌ充填した。 溶離緩衝液： Ｃ）２０ mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ ＮａＣｌ
（ｐＨ７．５）−０.０１％ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）
−０.００５％ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５
％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製） Ｄ）２０ mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１Ｍ ＮａＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）−０.０１％ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−
０.００５％ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％
Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製） 流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ 温度：４℃ サンプルをアプライ後、Ｃ）液を６０ｍｌを流す。 溶出条件：Ｄ）液を１００ｍｌ流し、一つの溶液として
回収した。回収した溶液を等量（１００ｍｌ）のＡ）液
と混濁し、作製した２００ｍｌの溶液をサンプルとして
以下の条件で、ＦＰＬＣ（アマシャム・ファルマシア・
バイオテク社製）を用いた群特異的アフィニティークロ
マトグラフィーを以下の条件で実施した。 ５）分画ＳｔｅｐＩＩＩ カラム：Ｌｅｎｔｉｌ ｌｅｃｔｉｎ ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ^TM（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）
をＫＸ１６（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社
製）に１０ｍｌ充填した。 溶離緩衝液： Ｃ）２０ mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ ＮａＣｌ
（ｐＨ７．５）−０.０１％ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）
−０.００５％ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５
％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）） Ｆ）２０ mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ ＮａＣｌ
−０．３M Ｍｅｔｈｙｌｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ（ｐＨ７．５）−０．０１％ ＮａＮ3（ＳＩＧＭ
Ａ社製）−０．００５％ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．
００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）） 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ 温度：４℃ サンプルをアプライ後、Ｃ）液を５０ｍｌ流す。 溶出条件：Ｆ）液を５０ｍｌ流し、一つの溶液として回
収した。 ６）透析 回収した液をＤｉａｌｙｓｉｓ ｔｕｂｉｎｇ−１−７
／８ ｉｎ Ｄｕａｍｅｔｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社
製）に移し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ＰＢＳ（−）（日
水製薬社製）、０．０１％ ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社
製）−０．１％ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液２リット
ルで一晩、４℃で透析した。 ７）サンプルの確認 透析後、回収したサンプルの濃度は、ＤＣ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社）、ｗｅ
ｓｔｅｒｎ解析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定し、「アンジ
オポエチン関連タンパク質３」の蛋白質量を測定した。
エンドトキシン濃度はエンドトキシン測定キット（生化
学工業）により測定し、２０ｍｇ／ｍｇ以下である事を
確認した。このようにして精製した蛋白質を抗原として
用いた。

【０４２８】（ｂ） 免疫マウス脾細胞の調製 ８週令のＢＡＬＢ／ｃ雄マウス３匹にアジュバントとし
てフロインド完全アジュバント（ディフコ社）０．５ｍ
ｌを(ａ)で精製した０．５ｍｌ(１００μｇ相当)のアン
ジオポエチン関連タンパク質３に加え、連結針のついた
注射筒内でエマルジョンを形成させた後、皮下注射して
免疫した。２回目以降の免疫ではアジュバントとしてフ
ロインド不完全アジュバント（ディフコ社）を用いた。
免疫は、約２週間おきに４回行い、２回目の免疫以降、
免疫する直前に眼底静脈叢より採血し、血清中の抗「ア
ンジオポエチン関連タンパク質３」抗体価を以下に述べ
る固相法による酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ法)で調べ
た。

【０４２９】（固相酵素免疫法）９６ウェルのＥＬＩＳ
Ａ用プレート(マキシソープ；ヌンク社）の各ウェルに
５０ｎｇの精製「アンジオポエチン関連タンパク質３」
を分注し、４℃で一晩放置して抗原をプレートウェル底
面にコートさせた。プレートを０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗ
ｅｅｎ２０を含むＰＢＳで3回洗浄した後、ＰＢＳで１
０μｇ／ｍｌに調製したＢＳＡを１００μｌ／ウェルで
添加し、室温で1時間放置した。さらに０．１％（ｖ／
ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄して、これ
に第一抗体として段階希釈した試料（マウス血清）を３
０乃至１００μｌ／ウェル分注し、室温で１時間放置し
た。その後、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳで３回洗浄し、第二抗体としてペルオキシダーゼ
標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（バイオラッド社)の３０００
倍希釈液を１００μｌ／ウェル分注し、室温で１乃至２
時間放置する。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含
むＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢパーオキシダーゼ基質液
（バイオラッド社；ＴＭＢパーオキシダーゼキット）を
１００μｌ／ウェルずつ添加し、室温で３０分間保温し
た後、１Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェルずつ分注し、ペル
オキシダーゼ反応を停止させてから、マイクロプレート
リーダー（バイオラッド社）で４５０ｎｍの吸収を測定
し、抗体価を算出した。

【０４３０】(ｃ) マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−
Ａｇ８．６５３(６５３)をＴＩＬ培地で培養し、２×１
０⁷以上の細胞を得た。

【０４３１】（ｄ） ハイブリドーマの作製 ＤＭＥＭ（日水製薬社製）でよく洗浄した免疫マウス脾
細胞１．４×１０⁸個とマウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３
−Ａｇ８．６５３(６５３) １．５×１０⁷個を混合
し、８００ｒｐｍで６分間遠心分離にかけた。沈澱とし
て得られた脾細胞、およびＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５
３(６５３)を混合した細胞群をよくほぐした後、あらか
じめＤＭＥＭで５０％に調製したポリエチレングリコー
ル４０００(ＰＥＧ４０００)溶液を２ｍｌ／分となるよ
うに一滴ずつ撹拌しながら１分間添加した。次にＤＭＥ
Ｍを２ｍｌ／分で１分間、同様にして添加し、この操作
をもう一度繰り返した。さらに１６ｍｌのＤＭＥＭを３
分間で添加して、８００ｒｐｍで６分間遠心分離した。
遠心分離後上清を捨て、３５ｍｌのＴＩＬ培地で懸濁し
た。

【０４３２】（ｅ） ハイブリドーマ群の選別 懸濁液を９６ウェルプレート（コースター社）に１００
μｌ／ウェルずつ分注し、７．５％のＣＯ2インキュベ
ーター中、３７℃で培養した。７日後、５０μｌ／ウェ
ルでＨＡＴ培地を添加した。さらに４日後、同様にして
同量のＨＡＴ培地を添加した。その３日後、コロニー状
に生育してきた融合細胞のみられるウェルについて培養
上清の一部を採取し、抗「アンジオポエチン関連タンパ
ク質３」抗体価を上記（ｂ）と同様の固相酵素免疫測定
法により測定し、それと同時にＨＴ培地へ置き換えた。

【０４３３】（ｆ） クローニング 抗体価の認められたウェルについては、限界希釈法によ
りクローニングを３回繰返し、安定して抗体価の認めら
れたクローンを抗「アンジオポエチン関連タンパク質
３」モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選
択した。ここで得られたハイブリドーマクローンの１つ
は、４５Ｂ１と命名され、独立行政法人産業技術総合研
究所特許生物寄託センターに２００２年３月１３日付
で、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９６３として寄託され
ている。

【０４３４】（ｇ） モノクローナル抗体の精製 抗「アンジオポエチン関連タンパク質３」モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマ４５Ｂ１株の培養上清を回収
して、０．２２μｍのフィルター(ミリポア社)にて濾過
滅菌した後、ＭＡｂＴｒａｐ ＧＩＩ（ファルマシア
社）を用いて抗体を精製した。以上の工程を経て抗「ア
ンジオポエチン関連タンパク質３」モノクローナル抗体
ＭＡｂ４５Ｂ１を得た。

【０４３５】（ｈ） モノクローナル抗体の抗原特異性 上記（ａ）の１）で作製した「アンジオポエチン関連タ
ンパク質３」生産ＣＨＯ細胞株の無血清培養上清とＣＨ
Ｏ細胞の無血清培養上清とをそれぞれ吸着抗原として用
いたＥＬＩＳＡにより、Ｍａｂ４５Ｂ１が「アンジオポ
エチン関連タンパク質３」に特異的であることを確認し
た。すなわち、「アンジオポエチン関連タンパク質３」
生産ＣＨＯ細胞株の無血清培養上清とＣＨＯ細胞の無血
清培養上清とをそれぞれ１００μｌずつ９６ウェルのＥ
ＬＩＳＡ用プレート（マキシソープ；ヌンク社製）の各
ウェルに分注し、４℃で一晩保温して抗体をプレートウ
ェル底面に吸着させた。各ウェルをＰＢＳで３回洗浄し
た後、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを２００μｌ
／ウェルずつ添加し、４℃で一晩保温した。その後、
０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
（以下「ＰＢＳＴ」という）で各ウェルを２回洗浄し、
これに、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで段階希釈
した抗体産生ハイブリドーマ４５Ｂ１培養上清を１００
μｌ／ウェルずつ分注し、室温で１時間反応させた。そ
の後、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳで各ウェルを５回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを
含むＰＢＳで５０００分の１に希釈したＨＲＰ標識化抗
マウスＩｇＧ抗体（アマシャムバイオサイエンス）を１
００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１時間反応させ
た。さらに０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含
むＰＢＳで各ウェルを５回洗浄し、ＡＢＴＳパーオキシ
ダーゼ基質液（ロッシュ・ダイアグノスティクス）を１
００μｌ／ウェルずつ添加し、室温で３０分間保温した
後、４１５ｎｍの吸収を測定した。「アンジオポエチン
関連タンパク質３」生産ＣＨＯ細胞株の無血清培養上清
を吸着させたウェルでは高い吸光度が見られ抗体の希釈
に従って吸光度が減少したのに対し、ＣＨＯ細胞の無血
清培養上清を吸着させたウェルでは抗体の希釈によらず
低い吸光度しか見られなかった。

【０４３６】（ｉ） モノクローナル抗体の分類 マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(ア
マシャム社)を用いて解析した結果、この抗体は、Ｉｇ
Ｇ１サブクラスの抗体であると同定された。

【０４３７】実施例８．ＭＡｂ４５Ｂ１を用いた「アン
ジオポエチン関連タンパク質３」定量系 （ａ） ウサギ抗「アンジオポエチン関連タンパク質
３」ポリクローナル抗体の作製 アジュバントとしてフロインド完全アジュバント（ディ
フコ社）０．５ｍｌを実施例７の（ａ）で精製した０．
５ｍｌ(１００μｇ相当)の「アンジオポエチン関連タン
パク質３」に加え、連結針のついた注射筒内でエマルジ
ョンを形成させた後、雄ウサギの皮下に接種した。２回
目以降の免疫ではアジュバントとしてフロインド不完全
アジュバント（ディフコ社）を用いた。免疫は、約２週
間おきに８回行った。接種後、経時的に部分採血し、抗
体価の上昇を調べた。８回目の免疫後７日後に麻酔下で
全採血し、５３．５ｍｌの免疫血清を得た。該血清２０
ｍｌを、ＭＡｂＴｒａｐ ＧIIキットを用いて精製し、
１１５ｍｌの１．６４ｍｇ／ｍｌ ＩｇＧが得られた。

【０４３８】以上の工程を経て、ウサギ抗「アンジオポ
エチン関連タンパク質３」ポリクローナル抗体（以下
「No.1抗体」という）を得た。

【０４３９】（ｂ） ＨＲＰ標識Ｆａｂ´化ポリクロー
ナル抗体の作成 １）Ｆ（ａｂ´)2の調製 ３０ｍｌの１．６４ｍｇ／ｍｌ Ｎｏ．１抗体を０．１
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５ ０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含む）で透析したし、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０
（アミコン社）を用いて濃縮した。０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ４．５ ０．１Ｍ ＮａＣｌを含む）
で濃度を６ｍｇ／ｍｌに合わせた。0.1M酢酸ナトリウム
緩衝液（pH4.5、0.1M NaClを含む）にて10mg／mlに溶解
したブタ胃・ペプシン（シグマ社）２０μｌ(０．２ｍ
ｇ)を０．５ｍｌの６ｍｇ／ｍｌＮｏ．１抗体に添加
し、３７℃で６時間反応させた。反応液を０．１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、Ｕｌ
ｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４（インビトロジェン社）カ
ラム（１．５ｃｍ×４５ｃｍ）−０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）、流速０．３５ｍｌ／ｍｉ
ｎ、１画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。Ｎ
ｏ．１抗体Ｆ（ａｂ´)2F画分を280nmの吸光度により確
認し、CENTRICON-30（アミコン社）を用いて濃縮した。
これらの操作を繰り返し、最終的に11.2mlの2.5mg/ml N
o.1 F(ab')2抗体が得られた。

【０４４０】２）Fab'の調製 １１．２ｍｌの２．５ｍｇ／ｍｌ Ｎｏ．１ Ｆ(ａｂ
´)２抗体を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．
０)で透析し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０(アミコン社)
を用いて濃縮した。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
(ｐＨ６．０)で濃度を５ｍｇ／ｍｌに合わせた。０．４
５ｍｌの５ｍｇ／ｍｌ Ｎｏ．１ Ｆ(ａｂ´)２抗体に
０．１Ｍ ２−ｍｅｒｃａｐｏｔｅｔｈｙｌａｍｉｎ
ｅ、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液(ｐＨ６．０)５０μｌを加え、３７℃、９０分
間反応させた。反応液をＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ４
４(インビトロジェン社）カラム(１．５×４５ｃｍ)−
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０，５ｍＭ
ＥＤＴＡを含む)、流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分
０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。Ｎｏ．１ Ｆａ
ｂ´抗体の存在を２８０ｎｍの吸光度により確認した
後、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０(アミコン社)を用いて濃
縮した。これらの操作を繰り返し、最終的に１１．４ｍ
ｌの１．４ｍｇ／ｍｌ Ｎｏ．１Ｆａｂ´抗体が得られ
た。

【０４４１】３）マレイミドペルオキシダーゼの調製 西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ(シグマ社)３６．８ｍｇ
を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．０)にて
６．６６ｍｇ／ｍｌに溶解した。Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈ
ｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅにてＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ
ｙｌ−４−(Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ) ｃ
ｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−１ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ
(シグマ社)を溶解して濃度を７０ｍＭに合わせた。３０
０μｌの６．６６ｍｇ／ｍｌ西洋ワサビ・ペルオキシダ
ーゼに３０μｌの７０ｍＭ Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ
ｙｌ−４−(Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ) ｃ
ｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−１ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ
を加え、３０℃、３０分間反応させた。反応液から沈殿
を遠心除去した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５のカラ
ム(１×３０ｃｍ)−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
(ｐＨ６．０)，流速０．４乃至０．６ｍｌ／ｍｉｎ，１
画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。ペルオキシ
ダーゼを含む画分を４０３ｎｍの吸光度により確認し、
ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮
した。これらの操作を繰り返し、最終的に5.2mlの6.5mg
／mlマレイミドペルオキシダーゼが得られた。

【０４４２】４）マレイミド化ペルオキシダーゼとＦａ
ｂ´の反応 ０．７１ｍｌの１．４ｍｇ／ｍｌのＮｏ．１ Ｆａｂ´
抗体に０．２８ｍｌの６．５ｍｇ／ｍｌマレイミド化ペ
ルオキシダーゼを添加し、４℃、２０時間反応させた。
反応後、５０ｍＭ Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ
を１０μｌ添加した。Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ４４(イ
ンビトロジェン社)カラム(１．５×４５乃至１００ｃ
ｍ)−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．５)、
流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分１．０ｍｌでゲル濾
過した。各画分の２８０ｎｍ及び４０３ｎｍにおける吸
光度を測定し、さらに各画分のペルオキシダーゼ活性を
測定した。各画分に０．２％(ｗ／ｖ) ｔｈｉｍｅｒｏ
ｓａｌ(シグマ社)を終濃度０．００２％になるように、
１０％(ｗ／ｖ)ウシ血清アルブミンを終濃度０．１％に
なるように添加した後、４℃で保存した。ペルオキシダ
ーゼ標識Ｆａｂ´の濃度はペルオキシダーゼ活性あるい
は４０３ｎｍの吸光度から計算し、１０μｇ／ｍｌ以上
の濃度で保存した。これらの操作を繰り返し、最終的に
８．６ｍｌの０．７８ｍｇ／ｍｌのＨＲＰ標識化Ｎｏ．
１ Ｆａｂ´抗体を得、以下の実験に用いた。

【０４４３】(ｃ)「アンジオポエチン関連タンパク質
３」定量系の作製 実施例７の（ｇ）で培養上清より得られた精製ＭＡｂ４
５Ｂ１を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で２μｇ／
ｍｌに希釈し、これを１００μｌずつ９６ウェルのＥＬ
ＩＳＡ用プレート(マキシソープ；ヌンク社製)の各ウェ
ルに分注し、４℃で一晩保温して抗体をプレートのウェ
ル底面に吸着させた。各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した
後、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを２００μ
ｌ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩保温した。０．０５
％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下「Ｐ
ＢＳＴ」という）で各ウェルを２回洗浄し、これに、１
％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗ
ｅｅｎ２０を含むＰＢＳで段階希釈した試料（精製「ア
ンジオポエチン関連タンパク質３」あるいはヒト血漿）
を１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩保温し
た。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓで各ウェルを７回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよ
び０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
で０．５μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ標識化Ｎｏ．１
Ｆａｂ´抗体を１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃
で３０分間反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅ
ｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを９回洗浄し、ＴＭＢ
パーオキシダーゼ基質液（バイオラッド社 ＴＭＢパー
オキシダーゼキット）を１００μｌ／ウェルずつ添加
し、室温で３０分間保温した後、１Ｎ硫酸を１００μｌ
／ウェルずつ分注し、ペルオキシダーゼ反応を停止させ
てから、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社
製）で４５０ｎｍの吸収を測定した。その結果、精製
「アンジオポエチン関連タンパク質３」濃度と測定結果
が正比例したことから、このＥＬＩＳＡ系により「アン
ジオポエチン関連タンパク質３」を直線性良く定量可能
であることが判明した（図６参照）。ヒト血漿を試料と
した場合も該ＥＬＩＳＡ系により検出可能であった。

【０４４４】実施例９． アデノウイルスベクターを用
いた組換えポリペプチドの産生 （１）ＤＮＡの調製 １）コザック配列の挿入 参考例２記載の、高脂血症の治療または予防剤を試験す
るための方法において、遺伝子発現量を検出するために
クローニングされたｃＤＮＡに、コザックのコンセンサ
ス配列が付加されたｃＤＮＡクローンを得るため、下記
のヌクレオチド配列：5'- gccaccatggtcacaattaagctcct
tctttttattg -3'（配列表の配列番号４２）および、制
限酵素ＸｈｏＩの特異的認識配列が付加された下記のヌ
クレオチド配列：5'- tctagagcctcgttcattcaaagctttctg
aatctg -3'（配列表の配列番号４３）からなるオリゴヌ
クレオチドプライマーを合成した。ここで、配列番号４
２に示されるプライマーの一部は配列表の配列番号５３
に示される「アンジオポエチン関連タンパク質３」のｃ
ＤＮＡのヌクレオチド番号２５乃至５５であり、配列番
号４３に示されるプライマーの一部は配列表の配列番号
５３のヌクレオチド番号１３８５乃至１４１５のアンチ
センスに該当する。

【０４４５】次に、参考例２記載の方法で得られた組換
えファージミドｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１に挿入されてい
るヒトｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに「アン
ジオポエチン関連タンパク質３」をコードするヌクレオ
チド配列として開示されているもの）約０．４μｇ／ｍ
ｌを鋳型とし、上記プライマー（それぞれ０．４ｍ
Ｍ）、Ｔｂｒ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザ
イム社製）、１×ＰＣＲ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラー
ゼに添付の１０×緩衝液を１０分の１量）、２ｍＭの塩
化マグネシウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰ
ＣＲを行った。ＰＣＲは上記サンプルを９４℃で３分間
加熱した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２
℃で１分の温度サイクル３０回、最後に６８℃で２分間
保温の条件で行なった。

【０４４６】ＰＣＲの結果得られた増幅断片（約１．４
ｋｂｐ）を、ＴＡクローニングキット（インビトロジェ
ン社製）に添付されたプラスミドベクターｐＣＲ２．１
へ挿入し、挿入断片を含むプラスミドクローン（ｐＣＲ
／ＫｈＡＰ５）を単離した。ＤＮＡシークエンサー（Ａ
ＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００、アプライドバイオシステ
ムズ社製）で挿入断片の配列を解析して、ＰＣＲの際に
該挿入断片内に変異が生じていないことを確認した。

【０４４７】次に、ｐＣＲ／ＫｈＡＰ５を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して、生成した断片のう
ち、ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコ
ードするｃＤＮＡを含む断片を、予め制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＸｂａＩで消化した哺乳動物細胞発現ベクター
ｐＭＥ１８Ｓに挿入することにより、組換えプラスミド
ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を得た。

【０４４８】２）部分欠失変異体の作製 ａ）カルボキシル末端側領域を欠失した変異体 上記１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／Ｋ
ｈＡＰ５を制限酵素ＳｐｅＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポ
リメラーゼで切断末端を平滑端化した後に、ＤＮＡリガ
ーゼ反応を行って再び両端を連結することにより、ヒト
・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナルペ
プチドを含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０７番
目のアミノ酸残基（セリン）をコードするコドン（at
c）の後に終止コドン（tag）が挿入された組換えプラス
ミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５ＣＣを構築した。この組
換えプラスミド中の挿入断片のヌクレオチド配列は配列
表の配列番号１１に示す通りである。

【０４４９】ｂ）アミノ末端側領域を欠失した変異体 上記１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／Ｋ
ｈＡＰ５を制限酵素ＢｃｌＩおよびＳｐｅＩで消化し、
ヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナ
ルペプチドを含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０
７番目のアミノ酸残基（セリン）までをコードするｃＤ
ＮＡ配列のみを含む断片を除いた後、Ｔ４ ＤＮＡポリ
メラーゼ切断末端を平滑端化し、ＤＮＡリガーゼ反応を
行って再び両端を連結した。この操作により、ｐＭＥ１
８Ｓ／ＫｈＡＰ５の中の、ヒト・「アンジオポエチン関
連タンパク質３」のシグナルペプチドを含むアミノ酸配
列中の２１乃至２０６番目のアミノ酸をコードするヌク
レオチド配列がプロリンをコードするコドン（cct）で
置換された組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５
ＦＬＤを構築した。この組換えプラスミド中の挿入断
片のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１３に示す通
りである。

【０４５０】（２）組換えアデノウイルスの調製 上記（１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／
ＫｈＡＰ５ ＣＣとｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５ ＦＬＤ
中に存在する「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺
伝子の一部領域欠失変異体をコードする遺伝子が、組込
まれた組換えアデノウイルスは、アデノウイルス発現ベ
クターキット（宝酒造（株）社製）を用いて以下に記載
する方法に従って作製した。

【０４５１】まず、上記で（１）で得られた組換えプラ
スミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５ＣＣおよびｐＭＥ１８
Ｓ／ＫｈＡＰ５ ＦＬＤを、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＸｂａＩで消化して、得られたそれぞれ約１．
４ｋｂおよび約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、切断
末端を平滑化した。次に、サイトメガロウイルスエンハ
ンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターにより挿入
遺伝子が発現されるように設計されているコスミドベク
ターｐＡｘＣＡｗｔのＳｗａＩ切断部位にこれらの断片
をそれぞれ挿入し、組換えコスミドｐＡｘＣＡ／ＫｈＡ
Ｐ５ ＣＣおよびｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５ ＦＬＤを調
製した。

【０４５２】これらの組換えコスミドＤＮＡと末端タン
パク質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウ
イルス発現ベクターキットに添付）をリン酸カルシウム
トランスフェクションシステム（ライフテック社製）を
用いて２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）にコ・ト
ランスフェクションして、組換えアデノウイルスＡｄ／
ＫｈＡＰ５ ＣＣ、Ａｄ／ＫｈＡＰ５ ＦＬＤを単離
し、さらに２９３細胞内で増幅させた。増幅させたウイ
ルスの２９３細胞からの回収は、まずウイルス感染２９
３細胞に３０秒×４回の超音波処理（ブランソン社製Ｂ
−１２００を使用）を行うか、または凍結融解を３回繰
り返し、次いで塩化セシウム密度勾配遠心による精製を
２回繰り返すことによって行った。得られたウイルス液
を、１０％ グリセロールを添加したＰＢＳに対して４
℃で透析した後、使用するまで−７０℃以下で凍結保存
した。

【０４５３】（３）組換えアデノウイルスによる目的タ
ンパク質の発現の確認 上記（２）記載の方法で得られた組換えアデノウイルス
をＨｅＬａ細胞に感染させて、目的タンパク質の発現を
確認した。

【０４５４】まず、上記（２）記載の方法で得られた組
換えアデノウイルスをそれぞれＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２）に約５ｍ．ｏ．ｉ．（multiplicity of in
fection：多重感染度）で感染させ、無血清培地（ダル
ベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ））で３乃至４日培
養した後の培養上清を回収した。培養上清１ｍｌを１．
５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに入れ、１００μｌ
のトリクロロ酢酸溶液（１ｇ／ｍｌ トリクロロ酢酸、
４ｍｇ／ｍｌ デオキシコール酸）を添加して室温で３
分間放置後、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで５分遠
心した。上清を除いて、氷冷したアセトンを０．５ｍｌ
加えて攪拌し、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分
遠心した。上清を除いて、沈殿に再度氷冷したアセトン
を０．５ｍｌ加えて攪拌し、卓上遠心機にて１５０００
ｒｐｍで２分遠心して、上清を除き、沈殿物を真空乾燥
した。この沈殿物をそれぞれ１０μｌの蒸留水に溶解さ
せ、２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ
試料緩衝液（バイオラッド社製）と混合した後、９９℃
で５分間加熱して、電気泳動用試料を調製した。これら
試料をゲル濃度４−２０％のポリアクリルアミド密度勾
配ゲルにて電気泳動した（電気泳動用緩衝液：２５ｍＭ
トリス、１９２ｍＭ グリシン、０．１％ＳＤＳ）
後、転写緩衝液（２５ｍＭ トリス、１９２ｍＭ グリ
シン、２０％メタノール）中で４℃、１時間、２００ｍ
Ａの条件でニトロセルロースメンブレンに転写した。

【０４５５】転写したメンブレンは０．５％ スキムミ
ルクを添加したＰＢＳ液中に浸して４℃で一晩ブロッキ
ングし、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢ
Ｓ）で３回洗浄した。次いで、メンブレンを、約２７０
ｎｇ／ｍｌの５５−１−Ｎ１抗体または約１μｇ／ｍｌ
の５５−１−Ｃ１抗体および５％ ウシ胎児血清を含む
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ液中に入れて室温
で１時間インキュベーションした後、洗浄液で３回洗浄
した。なお、これら抗体はいずれも実施例２記載の方法
で取得された。５５−１−Ｎ１抗体はヒト「アンジオポ
エチン関連タンパク質３」のアミノ末端側に特異的に結
合する抗体であり、５５−１−Ｃ１抗体は同じくカルボ
キシル末端側に特異的に結合する抗体である。

【０４５６】さらに、メンブレンを西洋ワサビペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（バイオラ
ッド社製）を５％ ウシ胎児血清を含む０．０５％ Ｔ
ｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２０００倍希釈した反応液中で
室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で５回
洗浄した。このメンブレンをラップフィルム上に置き、
発光試薬溶液（ＥＣＬウエスタン検出試薬。アマシャム
・ファルマシア・バイオテク社製）に１分間浸した後、
１時間室温で放置してバックグラウンドを減衰させてか
ら、Ｘ線フィルムを感光させた（１０秒間）。このＸ線
フィルムを現像した結果、組換えアデノウイルスを感染
させたＨｅＬａ細胞において、それぞれ目的のポリペプ
チドが産生されていることが確かめられた。

【０４５７】（４）組換えアデノウイルスを接種したＫ
Ｋ／Ｓｎｋマウスの血中中性脂肪濃度の測定 上記で精製した組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５
ＣＣおよびＡｄ／ＫｈＡＰ５ ＦＬＤを１０％ グリ
セロール添加ＰＢＳで２．０×１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌおよ
び１．０×１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌに希釈し、それぞれ３匹
の１９週齢の雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに３００μｌずつ尾
静脈注射により接種した。また、陰性対照として、１０
％ グリセロール添加ＰＢＳを３００μｌずつ３匹の１
９週齢の雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに尾静脈注射により接種
した。

【０４５８】接種１日後に、各マウスの眼底よりヘマト
クリット管で採血し、卓上遠心機で５２００ｒｐｍで１
５分間遠心して血漿を分離し、キット（トリグリセリド
Ｅ−テストワコー。和光製薬（株）社製）を用いて中性
脂肪濃度を測定した。

【０４５９】その結果、Ａｄ／ ＫｈＡＰ５ ＦＬＤ接
種マウス群と１０％ グリセロール添加ＰＢＳ接種マウ
ス群では、血中の中性脂肪濃度に有意な差が認められな
かった（いずれも５０ｍｇ／ｄＬ以下）のに対し、Ａｄ
／ＫｈＡＰ５ ＣＣ接種マウス群では血中の中性脂肪濃
度の顕著な上昇が認められた（３０００ｍｇ／ｄＬ以
上）。

【０４６０】本実施例の方法において、例えばＡｄ／Ｋ
ｈＡＰ５ ＣＣを接種したマウスに、被験物質を投与
し、血中中性脂肪濃度の変動を調べることにより、高脂
血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは
二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験を行うことが
できる。

【０４６１】実施例１０． 融合タンパク質の活性評価 （１）融合タンパク質発現形質転換大腸菌の作製 配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７乃至２０７、
同アミノ酸番号１７乃至１９５、または同アミノ酸番号
１７乃至１４７に示されるアミノ酸配列からなるポリペ
プチドのアミノ末端にグルタチオン・Ｓ・トランスフェ
ラーゼ（以下「ＧＳＴ」という）が連結している融合タ
ンパク質（以下、順番にそれぞれ「ＧＳＴ−ＣＣ」、
「ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ」および「ＧＳＴ−Ｃ１」とい
う。）を以下に記載する方法に従って調製した。

【０４６２】まず、ＰＣＲ用プライマーとして、下記の
ヌクレオチド配列：5'- cggaattccctccagaattgatcaag -
3'（ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌおよびＧＳＴ−
Ｃ１共用のセンスプライマー。配列表の配列番号４
４）；5'- ccgctcgagactagtccttctgagctg -3'（ＧＳＴ
−ＣＣ用アンチセンスプライマー。配列表の配列番号４
５）；および5'- ccgctcgagttgactatgctgttggtt -3'
（ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ用アンチセンスプライマー。配列
表の配列番号４６）；および5'- ccgctcgaggttagttagtt
gctcttc -3'（ＧＳＴ−Ｃ１用アンチセンスプライマ
ー。配列表の配列番号４７）を合成した。

【０４６３】次に、実施例３記載のｃＤＮＡ（ｐＭＥｈ
５５−１）を鋳型とし、センスプライマーおよびアンチ
センスプライマー（それぞれ０．２μＭ）、Ｔｂｒ Ｅ
ＸＴＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｔｂｒ
ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１
０倍希釈）、２ｍＭの塩化マグネシウムおよび各０．４
ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ
は、上記サンプルを９４℃で３分間加熱した後に、９４
℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の温度サイ
クル３０回、最後に７２℃で５分間の条件で行なった。

【０４６４】ＰＣＲではそれぞれについて、約５８０ｂ
ｐ（ＧＳＴ−ＣＣ用アンチセンスプライマー使用）、約
５４０ｂｐ（ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ用アンチセンスプライ
マー使用）および約４００ｂｐ（ＧＳＴ−Ｃ１用アンチ
センスプライマー使用）のＤＮＡ断片が増幅した。増幅
したＤＮＡ断片を回収し、それぞれについて、ＥｃｏＲ
ＩおよびＸｈｏＩで消化した。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏ
Ｉで消化してからウシ小腸アルカリホスファターゼ（宝
酒造（株）社製）を用いて切断末端の脱リン酸化処理を
行ったプラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ＧＳＴ
をコードする遺伝子を含む。アマシャム・ファルマシア
・バイオテク社製）に、このＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ
で消化した、ＤＮＡ断片をそれぞれ挿入し、３種の挿入
断片を含む３種のプラスミドクローンを単離した。ＧＳ
Ｔ−ＣＣ用アンチセンスプライマーで増幅した断片を有
するプラスミドクローンをｐＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−Ｃ
Ｃｄｅｌ用アンチセンスプライマーを使用して増幅した
断片を有するプラスミドクローンをｐＧＳＴ―ＣＣｄｅ
ｌ、ＧＳＴ−Ｃ１用アンチセンス用プライマーを使用し
て増幅した断片を有するプラスミドクローンをｐＧＳＴ
−Ｃ１と命名した。

【０４６５】プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧ
ＳＴ−ＣＣｄｅｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１または、挿入断片を
含まずＧＳＴのみを発現させるためのコントロールベク
ターｐＧＥＸ−４Ｔ−２のそれぞれで大腸菌ＪＭ１０９
株を形質転換した。形質転換は大腸菌ＪＭ１０９のコン
ピテントセルにプラスミドを添加し、氷上で３０分間静
置した後、４２℃で３０秒間保温し、再び氷上で２分間
静置してから、３７℃で１時間振盪培養をすることによ
って行なった。形質転換後の培養液をアンピシリン添加
ＬＢ寒天プレート上に撒き、出現した組換え体のコロニ
ーをピックアップして液体培養し、ＩＰＴＧ誘導による
組換えタンパク質の発現を確認した。

【０４６６】（２）融合タンパク質の調製 １）形質転換大腸菌の培養 プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄ
ｅｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１及びコントロールベクターｐＧＥ
Ｘ−４Ｔ−２を保持する形質転換大腸菌をそれぞれ、ア
ンピシリン入りのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１８時間
振とう培養した。培養液の一部を新しい培地に添加し、
さらに３７℃にて振とう培養を行なった。６００ｎｍで
の吸光度が０．５−０．７に達した時に、最終濃度１ｍ
Ｍとなるようにイソプロピル・チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）を添加しさらに４時間振とう培養を継続し
た。

【０４６７】２）ｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する大腸菌
からの細胞破砕液の調製 コントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で形質転換し
た大腸菌の培養液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の
条件で遠心処理して沈殿した菌体を回収した。回収した
菌体を超音波処理用緩衝液（５０ｍＭ トリス−塩酸
（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）で懸濁し、懸濁液を４℃、
６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理した。沈殿
を−８０℃で凍結し、次いで室温にて融解して再度超音
処理用緩衝液に懸濁した。懸濁液を氷浴中で超音波破砕
器（トミー精工（株）社製ＵＤ−２０１）によって、出
力＝５、デューティ＝５０の条件で５分間処理した。超
音波処理後の破砕液に最終濃度１％となるようにトリト
ン Ｘ−１００を添加し混和し、４℃、１００００ｒｐ
ｍ、３０分間の条件で遠心処理し、上清を回収した。上
清はＧＳＴｒａｐカラム（アマシャム・ファルマシア・
バイオテク社製）中に流した。

【０４６８】３）ｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅ
ｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１を保持する大腸菌からの細胞破砕液
の調製 組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅ
ｌ、ｐＧＳＴ−Ｃ１で形質転換した大腸菌の培養液それ
ぞれを、４℃、５０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心
処理し、沈殿した菌体を回収した。沈殿した菌体に対し
て、洗浄用緩衝液（０．５％ トリトン Ｘ−１００、
１ｍＭ ＥＤＴＡ）での懸濁、４℃、５０００ｒｐｍ、
１０分間の条件での遠心処理、の操作を３回繰り返し、
得られた菌体を８Ｍ 尿素溶液に溶解した。この溶液を
室温に１時間放置した後、４℃、１３０００ｒｐｍ、３
０分間の遠心処理を行ない上清を回収した。組換えプラ
スミドｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ、ｐＧＳ
Ｔ−Ｃ１で形質転換した大腸菌の由来の培養液から得ら
れた３種の上清について透析を行なった。透析は、４Ｍ
尿素溶液に対して４℃で１時間、２Ｍ 尿素溶液に対
して４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で
１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で一晩の順で
行なった。透析後、４℃、１２０００ｒｐｍ、３０分間
の条件で遠心し、上清をそれぞれＧＳＴｒａｐカラム中
に流した。

【０４６９】４）融合タンパク質の精製 上記の工程を経てＧＳＴ、ＧＳＴとの融合タンパク質Ｇ
ＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−Ｃ１またはＧＳＴ−ＣＣｄｅｌが
吸着したＧＳＴカラムにＰＢＳを流してカラム内を洗浄
して不純物を除去した。次いで、１０ｍＭ 還元型グル
タチオン溶液を流して、ＧＳＴ、ＧＳＴとの融合タンパ
ク質ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−Ｃ１又はＧＳＴ−ＣＣｄｅ
ｌを溶出させた。溶出液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気
泳動にで分離した後、ゲルをクマシー染色して、タンパ
ク質の存在を確認した。また、溶出液をＰＢＳで４℃、
一晩透析した。ここで、プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−２
を保持する形質転換体から精製されたタンパク質がＧＳ
Ｔであり、以下同様にｐＧＳＴ−ＣＣ、ｐＧＳＴ−Ｃ
１、ｐＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ由来のタンパク質がそれぞ
れ、ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−Ｃ１、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ
である。

【０４７０】（３）血中中性脂肪濃度上昇活性 上記（２）で得られたＧＳＴ、ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−
Ｃ１、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌおよびＧＳＴ−Ｃ１を、ＰＢ
Ｓでタンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌに調整した後に、そ
れぞれ３匹、４匹、２匹および５匹の１９週齢の雄ＫＫ
／Ｓｎｋマウスに３００μｌずつ尾静脈注射により接種
した。採血は摂取前と摂取３０分後に行なった。ヘマト
クリット管で各マウスの眼底より採血して、卓上遠心機
で５２００ｒｐｍ、１５分間遠心して血漿を分離し、接
種前後における血中中性脂肪（トリアシルグリセロー
ル）濃度を測定した。

【０４７１】その結果を図８に示した。図８のグラフ
中、縦軸は、血漿１００ｍｌ中の中性脂肪（トリアシル
グリセロール）量を示している。横軸は各融合タンパク
質を示す。ＧＳＴ接種マウス群（図８の「ＧＳＴ」）で
は接種前後で差が認められなかったのに対し、ＧＳＴ−
Ｃ１接種マウス群（図８の「Ｃ１」）では若干ながら血
中中性脂肪濃度の上昇が認められた。一方、ＧＳＴ−Ｃ
ＣおよびＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ接種マウス群（図８の「Ｃ
Ｃ」および「ＣＣｄｅｌ」）では血中中性脂肪濃度の顕
著な上昇が認められた。

【０４７２】本実施例の方法において、例えばＧＳＴ−
ＣＣあるいはＣＣｄｅｌを接種したマウスに、被験物質
を投与し、血中中性脂肪濃度の変動を調べることによ
り、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一
つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験を行
うことができる。

【０４７３】実施例１１． ＬＰＬ活性測定法 （１）ラット脂肪細胞由来ＬＰＬを用いる方法 １）ＬＰＬ試料の調製 ラット白色脂肪前駆細胞（ホクドー社より購入）を増殖
用培地［１０％ ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」とい
う）、１００単位／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍ
ｌ ストレプトマイシン、１７μＭ パントテン酸、３
３μＭ （＋）−ビオチン、１００μＭ アスコルビン
酸、１μＭ オクタン酸および５０ｎＭトリヨードチロ
ニンを含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥ
Ｍ」という）］の入った細胞培養用フラスコ（培養面積
２５ｃｍ²）中で３７℃で２４時間培養した後、培地を
分化誘導用培地（１０％ ＦＣＳ、１００単位／ｍｌ
ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、
１７μＭ パントテン酸、３３μＭ （＋）−ビオチ
ン、１００μＭ アスコルビン酸、１μＭ オクタン
酸、５０ｎＭ トリヨードチロニン、１０μｇ／ｍｌ
インスリンおよび２．５μＭ デキサメタゾンを含むＤ
ＭＥＭ）に交換し、３７℃でさらに４８時間培養した。
その後、脂肪細胞維持培地（１０％ ＦＣＳ、１００Ｕ
／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマ
イシン、１７μＭ パントテン酸、３３μＭ （＋）−
ビオチン、１００μＭ アスコルビン酸、１μＭオクタ
ン酸、５０ｎＭ トリヨードチロニンおよび１０μｇ／
ｍｌ インスリンを含むＤＭＥＭ）に交換し、２乃至３
日目に１０％ ＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌ インスリンお
よび１０単位／ｍｌ ヘパリンナトリウムを含有するＤ
ＭＥＭ培地を２ｍｌ加え、１時間培養した後、この培養
上清を回収してＬＰＬ活性の測定に用いた。

【０４７４】２）ＬＰＬ活性測定 ＬＰＬ活性の測定法は、文献記載の方法（Nilsson-Ehl
e, P. and Schotz, M.C.(1976) J.Lipid Res. 17, 536-
541）に従った。なお、配列表の配列番号４のアミノ酸
番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなるポ
リペプチド（アンジオポエチン関連タンパク質３。）
は、実施例６記載の方法に従って調製した。

【０４７５】まず、上記１）記載の方法で調製した培養
上清１００μｌを等量の基質溶液［２ｍＭ グリセロー
ル・トリ［９，１０（ｎ）−³Ｈ］オレイン酸（１３１
ＫＢｅｑ／μｍｏｌ、アマシャム社製）、０．１８９μ
ｇ／ｍｌ Ｌ α−ホスファチジルコリン（シグマ社
製）、１４ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（シグマ社
製）、１４０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１５
％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０％（ｖ／ｖ）非働化Ｆ
ＣＳ］と混合し、そこへ精製したアンジオポエチン関連
タンパク質３を加え、３７℃で１２０分間保温した。そ
の後、１．０５ｍｌの０．１Ｍ 炭酸カリウム・ほう酸
緩衝液（ｐＨ１０．５）と３．２５ｍｌのメタノール：
クロロホルム：ヘキサン＝１４１：１２５：１００（ｖ
／ｖ）を加えて反応を停止させ、強く撹拌した後、３０
００×ｇで１５分間遠心分離した。水−メタノール層の
³Ｈカウントを液体シンチレーションカウンターにて測
定した。ＬＰＬ活性の１単位は、１μｍｏｌの脂肪酸を
１分間に生成する活性として定義した。その結果を表５
に示した。

【０４７６】

【表５】 ―――――――――――――――――――――――――――――― ポリペプチド１ ＬＰＬ活性の相対値 （μｇ／ｍｌ） （％） ―――――――――――――――――――――――――――――― ０ 100±13 １ 84±9 ２．５ 64±1 ５ 52±3 １０ 29±3 ―――――――――――――――――――――――――――――― アンジオポエチン関連タンパク質３はＬＰＬの活性を用
量依存的に抑制した。この実験系において、リパーゼ反
応の際に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性
を調節する作用を有するか否かを調べることができる。 （２） マウスヘパリン静注後血漿を用いる方法 Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスにヘパリンナトリウムを尾静脈
投与し（１００単位／ｋｇ）、１０分後に腹大動脈より
採血を行ない、遠心分離によりヘパリン静注後血漿を調
製し、ＬＰＬ活性測定に使用した。ただし、血漿を用い
た場合、上記（１）の２）に記載の条件で測定を行う
と、血漿中に含まれる肝臓由来のＨＴＧＬとＬＰＬとの
両リパーゼ活性が測定される。そこで、それらを分別し
て測定するために、まず、上記（１）の２）に記載の条
件でリパーゼ反応を行ってリパーゼ活性を測定し、得ら
れた結果を「総リパーゼ活性」とした。一方、別に、終
濃度１Ｍとなるように塩化ナトリウムを反応液に加える
ことによりＬＰＬを不活化した条件でリパーゼ反応を行
い、血漿中に残存するＨＴＧＬのリパーゼ活性のみを測
定した。このようにして得られた総リパーゼ活性からＨ
ＴＧＬ活性を差し引いた値をＬＰＬ活性とした。その結
果を表６に示した。

【０４７７】

【表６】 ―――――――――――――――――――――――――――――― ポリペプチド１ ＨＴＧＬ活性 ＬＰＬ活性 の相対値 の相対値 （μｇ／ｍｌ） （％） （％） ―――――――――――――――――――――――――――――― ０ 100±8 100±0 １ 109±13 93±2 ２．５ 94±4 82±5 ５ 80±2 70±5 １０ 64±7 49±5 ―――――――――――――――――――――――――――――― アンジオポエチン関連タンパク質３は、マウスヘパリン
静注後血漿中のＬＰＬおよびＨＴＧＬの両者に対してそ
の活性をイン・ビトロで阻害することが明らかになっ
た。この実験系において、総リパーゼ活性を測定するた
めのリパーゼ反応時に被験物質を添加すれば、該物質が
ＬＰＬまたはＨＴＧＬのいずれかの活性を調節する作用
を有するか否かを調べることができる。同様に、ＨＴＧ
Ｌ活性を測定するためのリパーゼ反応時に被験物質を添
加すれば、該物質がＨＴＧＬの活性を調節する作用を有
するか否かを調べることができる。

【０４７８】実施例１２． 融合タンパク質のＬＰＬ活
性阻害効果 ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌまたはＧＳＴを用い
てアンジオポエチン関連タンパク質３の代わりに用いて
実施例１１の（１）記載の方法でＬＰＬの活性を測定し
た。ＧＳＴ（１０μｇ／ｍｌ）を添加したときのＬＰＬ
活性を１００％とし、ＧＳＴ−ＣＣあるいはＧＳＴ−Ｃ
Ｃｄｅｌを添加したときの相対的ＬＰＬ活性を算出し
た。その結果を表７に示した。

【０４７９】

【表７】 ―――――――――――――――――――――――――――― ＧＳＴ−ＣＣ ＬＰＬ活性の相対値 （μｇ／ｍｌ） （％） ―――――――――――――――――――――――――――― １ ９７±４ ２．５ ９１±２ ５ ８１±４ １０ ６２±１ ―――――――――――――――――――――――――――― ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ ＬＰＬ活性の相対値 （μｇ／ｍｌ） （％） ―――――――――――――――――――――――――――― １ ８８±２ ２．５ ８４±２ ５ ６９±７ １０ ４７±１ ―――――――――――――――――――――――――――― ＧＳＴ−ＣＣおよびＧＳＴ−ＣＣｄｅｌはＬＰＬの活性
を用量依存的に抑制した。この実験系において、リパー
ゼ反応の際に被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬの
活性を調節する作用を有するか否かを調べることができ
る。

【０４８０】実施例１３． ヒスチジンタグが付加され
たポリペプチドの調製とＬＰＬ阻害活性 （１）ヒスチジンタグが付加されたポリペプチドの調製 「アンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナルペプ
チドを含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０番目の
アミノ酸残基（アスパラギン酸）をコードするコドンの
直後にヒスチジンタグが挿入され、かつアミノ末端から
２０８番目以降のアミノ酸配列を欠失したポリペプチド
ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓを、以下に記載する方法に従
って調製した。

【０４８１】１）ヒスチジンタグの挿入 「アンジオポエチン関連タンパク質３」の前駆体のアミ
ノ酸配列のアミノ末端から２０番目（成熟体のアミノ酸
配列の4番目）に相当するアミノ酸（アスパラギン酸）
のカルボキシル末端側に、ヒスチジンタグ（配列表の配
列番号２６のアミノ酸番号２１乃至２８に示されるアミ
ノ酸配列）が挿入されるように、実施例９の（１）の
１）で得られた組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡ
Ｐ５を改変した。

【０４８２】まず、一部が相補的な、下記のヌクレオチ
ド配列からなるオリゴヌクレオチド：5'- gatccgcatcat
caccatcaccat -3'（配列表の配列番号４８）および5'-
gatcatggtgatggtgatgatgcg -3'（配列表の配列番号４
９）を合成し、さらに合成ＤＮＡ末端リン酸化試薬フォ
スファリンク（アプライドバイオシステム社製）を用い
て５'末端をリン酸化した。これらをアニーリングさせ
たものを、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を制限酵素Ｂｃｌ
Ｉで完全に消化して得られた約４．２ｋｂの断片に挿入
した。その結果として、上記のアニーリングさせたオリ
ゴヌクレオチドが３単位連結したＤＮＡが、ＢｃｌＩ切
断部位に挿入されたプラスミドクローンが得られた。次
に、このクローンをＢｃｌＩで消化したものに、ｐＭＥ
１８Ｓ／ＫｈＡＰ５をＢｃｌＩで完全に消化して得られ
る約１８０ｂｐの断片を挿入することにより、プラスミ
ドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓ＋１６を得た。

【０４８３】プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈ
ｉｓ＋１６には、ヒスチジンタグをコードする配列が３
単位含まれており、その中の３'末端側の２単位は、目
的とは逆の方向に連結された余分な配列である。この配
列を省いた断片をＰＣＲにより増幅するために、センス
／アンチセンス兼用プライマーとして、以下のヌクレオ
チド配列：5'-gaattgatcagcatcatcaccatcaccacgatc-3'
（配列表の配列番号５０）からなるオリゴヌクレオチド
プライマーを合成した。次いで、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡ
Ｐ５／Ｈｉｓ＋１６（０．４μｇ／ｍｌ）を鋳型とし、
上記プライマー（０．４ｍＭ）、Ｔｂｒ ＥＸＴ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（フィンザイム社製）、１×ＰＣＲ反応
緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１
０分の１量）、２ｍＭの塩化マグネシウム、各０．４ｍ
ＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ま
ず９４℃で２分加熱した後に、９４℃で３０秒、６０℃
で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り
返し、最後に７２℃で７分間保温するという条件で行な
った。

【０４８４】ＰＣＲの結果得られた増幅断片（２６８ｂ
ｐ）をＢｃｌＩで消化した後、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ
５をＢｃｌＩで完全に切断して得られた約４．２ｋｂの
断片に挿入した。以上の操作により、ｐＭＥ１８Ｓ／Ｋ
ｈＡＰ５に挿入されているｃＤＮＡ配列中に存在する２
ヶ所のＢｃｌＩ切断部位のうち、上流側の切断部位に、
ヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列（配列表
の配列番号２５のヌクレオチド番号７８乃至１０１）が
挿入されたＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ
／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを得た。

【０４８５】２）カルボキシル末端側を欠損した改変体
の作製 上記１）で得られたプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ
５／Ｈｉｓを制限酵素ＳｐｅＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼで切断末端を平滑化した後に、ＤＮＡリガ
ーゼ反応を行って再び両端を連結することにより、「ア
ンジオポエチン関連タンパク質３」のシグナルペプチド
を含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０７番目のア
ミノ酸残基（セリン）をコードするコドン（atc）の後
に終止コドン（tag）が挿入され、またアミノ末端から
２０番目のアミノ酸残基（アスパラギン酸）をコードす
るコドンの直後にヒスチジンタグをコードするヌクレオ
チド配列が挿入されたＤＮＡ（配列表の配列番号２５）
を含む組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５ Ｃ
Ｃ／Ｈｉｓを構築した。

【０４８６】３）ＣＯＳ−１細胞での発現 直径１５０ｍｍ組織培養用シャーレ（コーニング社製）
に、ＣＯＳ−１細胞（０．５×１０⁶細胞）を懸濁した
１０％ ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という。ギブコ
社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭ
ＥＭ」という。ギブコ社製）３０ｍｌを入れて、３７
℃、５％炭酸ガス下で３日間培養した。その後、培地を
除去してから、トランスフェクション試薬（リポフェク
タミン２０００１８０μｌとＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ溶液
（いずれもギブコ社製） ３ｍｌとを混濁したもの）に
３６μｇのｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓを
加えて混ぜたものをＣＯＳ−１細胞に加えることによ
り、トランスフェクションを行った。トランスフェクシ
ョン後、３７℃、５％炭酸ガス下で３日間静置した。以
上の操作をシャーレ１３０枚分のＣＯＳ−１細胞に対し
て実施し、総計約４．４Ｌの培養上清を集めた。この培
養上清を、０．２２μｍセルロースアセテート製ボトル
トップフィルター（コーニング社製）を用いて吸引ろ過
して、ろ液を回収した。

【０４８７】４）発現量、濃度の確認 上記３）で回収されたろ液の一部と、実施例６に記載の
方法で精製された「アンジオポエチン関連タンパク質
３」についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ゲル内のタン
パク質をニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にウ
ェット法で転写した（０．２Ａ、９０分、４℃）。この
ニトロセルロース膜を、５％ スキムミルク（雪印乳業
（株）社製）を含むＰＢＳ−０．０５％ ツイーン２０
溶液（以下「ＰＢＳ−Ｔ」という）に一晩浸してブロッ
キングを行った。次いで、ニトロセルロース膜をＰＢＳ
−Ｔで洗浄した後、ウエスタンブロットを行った。一次
抗体には実施例２記載の５５−Ｎ１抗体を、二次抗体に
は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗ウサギポリ
クローナルＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を使用した。
５５−Ｎ１抗体が特異的に結合したバンドの検出には、
ＥＣＬ試薬（アマシャム社製）を用いた。その結果、上
記３）で得られたろ液中には約１．０乃至１．５ｍｇ／
リットル（全ろ液中に４．４乃至６．６ｍｇ）のＫｈＡ
Ｐ５ ＣＣ／Ｈｉｓが含まれていることが明らかになっ
た。

【０４８８】５）ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓの精製 上記３）で得られたろ液の全量について、限外ろ過装置
（ＴＩＦＦラボスケールおよび３０ＫＤａ孔径の限外ろ
過膜（いずれもミリポア社製））を用いて、４４０ｍｌ
となるまで限外濃縮した。さらに、得られた試料に、限
外ろ過装置中で２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ
塩化ナトリウム、０．１％ アジ化ナトリウムおよび
０．０５％ プロテアーゼインヒビターカクテル（シグ
マ社製）を含む緩衝液（ｐＨ７．４）４リットルを徐々
に加えながら限外ろ過を続行することにより、溶媒が該
緩衝液に置換された試料を得た（液量６００ｍｌ）。

【０４８９】一方、キレーティングカラム（ＨｉＴｒａ
ｐキレーティング ５ｍｌカラム。アマシャム社製）に
０．１Ｍの硫酸ニッケル ５ｍｌを約５ｍｌ／分の流速
で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合させ
た。このカラムに超純水を流して洗浄した後、ＨＰＬＣ
送液システム（アマシャム社製）に装着して、以下に記
載する条件で試料のアフィニティー精製を行った。

【０４９０】溶媒： Ａ液： ２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 塩化
ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．１％ アジ化ナトリウ
ム、０．０５％ プロテアーゼインヒビターカクテル
（シグマ社製） Ｂ液： ２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 塩化
ナトリウム、０．５Ｍイミダゾール（ｐＨ７．４）、
０．１％ アジ化ナトリウム、０．０５％ プロテアー
ゼインヒビターカクテル（シグマ社製） 流速： ５ｍｌ／分 精製手順： 試料６００ｍｌをカラムに流した後、Ａ液
８０％、Ｂ液 ２０％の緩衝液（０．１Ｍ イミダゾ
ール濃度に相当）５０ｍｌを流して非吸着物を洗浄除去
した。その後、Ｂ液 ５０ｍｌをカラムに流し、ヒスチ
ジンタグを有するポリペプチドを溶出させ、溶出液を回
収した。この溶出液にＡ液２００ｍｌを加えて、イミダ
ゾール濃度０．１Ｍの溶液としたものを、第２回のアフ
ィニティー精製用試料とした。

【０４９１】小スケールのキレーティングカラム（Ｈｉ
Ｔｒａｐキレーティング １ｍｌカラム。アマシャム社
製）に０．１Ｍの硫酸ニッケル ５ｍｌを約１ｍｌ／分
の流速で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合
させ、次いで超純水を流して洗浄した後、カラムをＨＰ
ＬＣ送液システムに装着し、試料を流してから、カラム
をＨＰＬＣから取り外した。次いで、２０ｍＭ リン酸
ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ イミ
ダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液を、１ｍｌ／分の流速で
１ｍｌカラムに手動で流して、非吸着物を洗浄除去し
た。その後、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ
塩化ナトリウム、０．３Ｍ イミダゾール、ｐＨ７．４
の緩衝液を同様に１ｍｌ／分の流速で流し、溶出液を１
ｍｌずつ、５分画（計５ｍｌ）回収した。

【０４９２】回収した溶出液をそれぞれ透析チューブ
（ギブコ社製）に入れて、５００ｍＬのＰＢＳ（ギブコ
社製）に対して透析を行った。透析膜外液であるＰＢＳ
は、３回交換した。最後の透析膜外液を一部採取して、
ＬＰＬ活性評価の際の陰性対照試料とした。

【０４９３】回収した試料中のタンパク質濃度を、プロ
テインアッセイ（ＤＣプロテインアッセイキット（バイ
オラッド社製）を使用）やＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で見積も
った結果、計１．８ｍｇのＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓが
得られたことが判明した。そして、下記のＬＰＬ活性評
価には、第２回のアフィニティー精製により得られた第
２および第３の分画をまとめたものを用いた。

【０４９４】（２）ＬＰＬ活性の測定 上記（１）の５）で得られたＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓ
試料を、ＧＳＴ−ＣＣの代わりに用いて、実施例１１の
（１）記載の方法でＬＰＬ活性を測定した。その結果を
表８に示す。

【０４９５】

【表８】 ―――――――――――――――――――――――――――――― ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓ ＬＰＬ活性の相対値 （μｇ／ｍｌ） （％） ―――――――――――――――――――――――――――――― ０ １００±３ １ ２７±５ ２．５ ２１±２ ５ １４±２ １０ １１±１ ―――――――――――――――――――――――――――――― ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓは、ＬＰＬ活性を強く阻害し
た。この実験系において、リパーゼ反応の際に被験物質
を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性を調節する作用を
有するか否かを調べることができる。

【０４９６】（３）血中中性脂肪濃度の低下作用 実施例１０の（３）記載の方法に従って、ＫｈＡＰ５
ＣＣ／ＨｉｓをＫＫ／Ｓｎｋマウスに尾静脈投与した
（１００μｇ／マウス）。投与前と投与後のマウスから
末梢血を採取して中性脂肪濃度を測定した。その結果、
投与前のマウスでは血中中性脂肪濃度が４０．５ｍｇ／
ｄｌであったのに対し、ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓ投与
３０分後では１０６．０ｍｇ／ｄｌに上昇していた。溶
媒のみを投与した対照群の投与３０分後の血中中性脂肪
濃度は４１．３ｍｇ投与群であった。以上の結果より、
ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓは血中中性脂肪濃度を有意に
上昇させることが確かめられた。

【０４９７】実施例１４．ヘパリン結合部位に変異を導
入したアンジオポエチン関連タンパク質３の血漿トリグ
リセリドに対する効果 （１）ヘパリン結合モチーフに変異を導入したアンギオ
ポエチン関連蛋白−３（ＡＲＰ３）のＮ末２０７アミノ
酸部分蛋白の構築 実施例１３の２）記載のプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／Ｋｈ
ＡＰ５ ＣＣ／ＨｉｓをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し
て得られる約１．４ｋｂｐの断片を単離し、宝酒造製の
Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍキット
に添付のプラスミドｐＫＦ１８ｋのＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ
Ｉ切断点に挿入した。変異導入用プライマーＧＴＣＡＴ
ＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＧＧＣＣＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＣ
を用い、キットの説明書に従って変異を導入し、プラス
ミドpＫＦ１８／ＫｈＡＰ５ ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓ
を得た。得られたプラスミドクローンの塩基配列を決定
して、変異導入が行われたことおよび他の部分に変異が
入っていないことを確認した。結果として、配列表の配
列番号１２の６２番目のヒスチジン、６３番目リジン、
６５番目のリジンがそれぞれイソロイシン、アスパラギ
ン、アスパラギンへ置換した蛋白をコードするＤＮＡ配
列が作製された。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩとＸ
ｂａＩで切断して約１．４ｋｂｐの断片を単離し、高発
現ベクターｐＭＥ１８Ｓ（Hara, T. et al.(1992) EMB
O.J. 11, 1875-、横田崇、新井賢一編集、バイオマニュ
アルシリーズ３、遺伝子クローニング実験法、羊土社、
p18-20）のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断点に挿入した（ｐ
ＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ（−ＨＢ））。

【０４９８】（２）ヘパリン結合モチーフに変異を導入
したアンギオポエチン関連蛋白−３（ＡＲＰ３）のＮ末
２０７アミノ酸部分蛋白の活性に関する検討 １）マウス血漿中トリグリセリド濃度上昇活性 Ａ）組換えアデノウイルスの作製 ＡＲＰ３のＮ末２０７アミノ酸部分蛋白（ＡＲＰ３ Ｃ
Ｃ）およびヘパリン結合モチーフに変異を導入したＡＲ
Ｐ３のＮ末２０７アミノ酸部分蛋白（ＡＲＰ３ＣＣ（−
ＨＢ））を強制発現させるため組換えアデノウイルス
は、市販のキット（アデノウイルス・エクスプレッショ
ン・ベクター・キット、宝酒造（株）社製）を用いて作
製した。すなわち、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ／
ＨｉｓあるいはpＫＦ１８／ＫｈＡＰ５ ＣＣ（−Ｈ
Ｂ）／ＨｉｓをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、得
られた約１．４ｋｂのＤＮＡ断片の末端を平滑化したも
のを挿入ＤＮＡ断片として以下の操作に用いた。

【０４９９】また、サイトメガロウイルスエンハンサー
とニワトリβ−アクチンプロモーターにより発現される
ように設計されているコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ
（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キ
ットに添付）の制限酵素ＳｗａＩ認識部位にインサート
ＤＮＡ断片を挿入したコスミドｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５
ＣＣ／ＨｉｓおよびｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ
（−ＨＢ）／Ｈｉｓを作製した。ｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ
５ ＣＣ／Ｈｉｓ ＤＮＡあるいはｐＡｘＣＡ／ＫｈＡ
Ｐ５ ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓ ＤＮＡと末端タンパク
質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウイル
ス・エクスプレッション・ベクター・キットに添付）を
リン酸カルシウムトランスフェクションシステム（ライ
フテック社製）を用いて２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１５７３）にコ・トランスフェクションして、組換えア
デノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ／ＨｉｓおよびＡ
ｄ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓを単離し、さ
らに２９３細胞中で増幅させた。増幅させたウイルスの
２９３細胞からの回収は、まずウイルス感染２９３細胞
に３０秒×４回の超音波処理（ブランソン社製Ｂ−１２
００を使用）を行い、次いで塩化セシウム密度勾配遠心
による精製を２回繰り返すことによって行った。得られ
たウイルス液を、１０％ グリセロールを添加したＰＢ
Ｓに対して４℃で透析した後、使用するまで−７０℃以
下で凍結保存した。

【０５００】Ｂ）組換えアデノウイルスのマウス接種後
の血漿中トリグリセリド濃度 上記のようにして精製された組換えアデノウイルスＡｄ
／ＫｈＡＰ５ ＣＣ／ＨｉｓおよびＡｄ／ＫｈＡＰ５
ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓを、１０％グリセロールを含む
ＰＢＳで２×１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌに希釈し、それぞれ２
匹（Ａｄ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓ）または３匹（Ａ
ｄ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓ）の２０−２
１週齢の雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに２００μｌ（５×１０
⁹ｐｆｕ）ずつ尾静脈注射により接種した。接種前、接
種１、２、４、７、１１、１４日後に各マウスの眼底よ
りヘマトクリット管で採血して、卓上遠心機で５２００
ｒｐｍ１５分遠心して血漿を分離した。接種後1日後の
血漿1μｌを２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−
ＰＡＧＥ試料緩衝液（バイオラッド社製）と混合した
後、９９℃で５分間加熱して、電気泳動用試料を調製し
た。試料を中でゲル濃度４−２０％のポリアクリルアミ
ド密度勾配ゲルにて電気泳動した（電気泳動用緩衝液：
２５ｍＭ トリス、１９２ｍＭ グリシン、０．１％
ＳＤＳ）後、転写緩衝液（２５ｍＭ トリス、１９２ｍ
Ｍ グリシン、２０％メタノール）中で４℃、１時間、
２００ｍＡの条件でニトロセルロースメンブレンに転写
した。転写したメンブレンは０．５％ スキムミルクを
添加したＰＢＳ液で４℃で一晩ブロッキングし、洗浄液
（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄し
た。次いで、メンブレンを、２７０ｎｇ／ｍｌの実施例
２記載の５５−１−Ｎ１抗体および５％ ウシ胎児血清
を含む０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ液中に入れ
て室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で３
回洗浄した。さらに、メンブレンを西洋ワサビペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（アマシャ
ム・バイオサイエンス社製）を５％ ウシ胎児血清を含
む０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２０００倍希釈
した反応液中で室温で１時間インキュベーションした
後、洗浄液で５回洗浄した。このメンブレンをラップフ
ィルム上に置き、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出
溶液に１分間浸した後、Ｘ線フィルムを感光させた。そ
の結果、組換えアデノウイルスＡｄ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ
／Ｈｉｓを感染させたマウス血漿中およびＡｄ／ＫｈＡ
Ｐ５ ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈｉｓを感染させたマウス血漿
中に特異的なバンドが検出された（図９）。

【０５０１】続いて中性脂肪測定用キット（トリグリセ
リドＥ−テストワコー、和光製薬（株）社製）を用いて
中性脂肪濃度を測定した。Ａｄ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈ
ｉｓ接種マウス群では血中の中性脂肪濃度が顕著に上昇
したのに対し、Ａｄ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ（−ＨＢ）／Ｈ
ｉｓ接種マウス群では血漿中の中性脂肪濃度はほとんど
上昇しなかった（図１０）。

【０５０２】２）リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）阻
害活性 Ａ）組換えタンパクの調製 ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ／ＨｉｓあるいはpＫ
Ｆ１８／ＫｈＡＰ５ＣＣ（−ＨＢ）／ＨｉｓをＬｉｐｏ
ｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００試薬（インビトロジェン社
製）を用いて、ＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1981) Cell
23, 175-182、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）に導入
し、血清非添加のダルベッコ改変イーグル培地で4日培
養した後に培養上清を回収した。培養上清をTIFFラボス
ケール（ミリポア社）で30Kのフィルター（ミリポア
社）を用いて、約10分の1量に限外濃縮した。濃縮した
サンプルは、１０倍量の５０ｍＭイミダゾール、０．５
Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッフ
ァーで循環させて、本組成のバッファーに置換した。バ
ッファー置換したサンプルは、予め０．５ｍｌの０．１
Ｍ硫酸ニッケルで処理し、５０ｍＭイミダゾール、０．
５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッ
ファーに置換したＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカ
ラム（アマシャムバイオサイエンス社）に結合させた
後、１００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファーで洗浄し、
３００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウム、
０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファーで溶出した。得
られた溶出サンプルを１，０００倍量のＰＢＳ（―）
（シグマ社）で３回透析したものをそれぞれ組換えタン
パクＡＲＰ３ＣＣ、ＡＲＰ３ ＣＣ（−ＨＢ）とした。

【０５０３】Ｂ）ＬＰＬ阻害活性 上記で得られた組換えタンパク質のＬＰＬ阻害活性を実
施例１１）の（１）の２）記載の方法で検討した。ＡＲ
Ｐ３ ＣＣ（―ＨＢ）のＬＰＬ阻害活性はＡＲＰ３ Ｃ
ＣのＬＰＬ阻害活性に比べて著しく低かった（図１
１）。

【０５０４】以上より、ＡＲＰ３ ＣＣ（―ＨＢ）はＡ
ＲＰ３の機能阻害剤のスクリーニングの際の陰性対照と
して利用できる。

【０５０５】実施例１５．ヒスチジンタグ付加蛋白発現
アデノウイルスベクターを接種したマウスの血漿の調製 （１）組換えアデノウイルスの調製 アデノウイルス発現ベクターキット（宝酒造（株）社
製）を用いて、以下の方法にしたがって、組換えアデノ
ウイルスを作製した。実施例１３の（１）の１）で得ら
れた、組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈ
ｉｓを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し
て、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、切断末端を平
滑化した。次に、サイトメガロウイルスエンハンサーと
ニワトリβ−アクチンプロモーターにより挿入遺伝子が
発現されるように設計されているコスミドベクターｐＡ
ｘＣＡｗｔのＳｗａＩ切断部位にこれらの断片をそれぞ
れ挿入し、組換えコスミドｐＡｘＣＡ／ＫｈＡＰ５／Ｈ
ｉｓを調製した。

【０５０６】この組換えコスミドＤＮＡと末端タンパク
質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウイル
ス発現ベクターキットに添付）をリン酸カルシウムトラ
ンスフェクションシステム（ライフテック社製）を用い
て２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）にコ・トラ
ンスフェクションして、組換えアデノウイルスＡｄ／Ｋ
ｈＡＰ５／Ｈｉｓを単離し、さらに２９３細胞内で増幅
させた。増幅させたウイルスの２９３細胞からの回収
は、まずウイルス感染２９３細胞に３０秒×４回の超音
波処理（ブランソン社製Ｂ−１２００を使用）を行う
か、または凍結融解を３回繰り返し、次いで塩化セシウ
ム密度勾配遠心による精製を２回繰り返すことによって
行った。得られたウイルス液を、１０％ グリセロール
を添加したＰＢＳに対して４℃で透析した後、使用する
まで−７０℃以下で凍結保存した。

【０５０７】（２）組換えアデノウイルスによる目的タ
ンパク質の発現の確認 上記（１）記載の方法で得られた組換えアデノウイルス
をＨｅＬａ細胞に感染させて、目的タンパク質の発現を
確認した。

【０５０８】まず、上記（１）記載の方法で得られた組
換えアデノウイルスをそれぞれＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２）に約５ｍ．ｏ．ｉ．（multiplicity of in
fection：多重感染度）で感染させ、無血清培地（ダル
ベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ））で３乃至４日培
養した後の培養上清を回収した。培養上清１ｍｌを１．
５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに入れ、１００μｌ
のトリクロロ酢酸溶液（１ｇ／ｍｌ トリクロロ酢酸、
４ｍｇ／ｍｌ デオキシコール酸）を添加して室温で３
分間放置後、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで５分遠
心した。上清を除いて、氷冷したアセトンを０．５ｍｌ
加えて攪拌し、卓上遠心機にて１５０００ｒｐｍで２分
遠心した。上清を除いて、沈殿に再度氷冷したアセトン
を０．５ｍｌ加えて攪拌し、卓上遠心機にて１５０００
ｒｐｍで２分遠心して、上清を除き、沈殿物を真空乾燥
した。この沈殿物をそれぞれ１０μｌの蒸留水に溶解さ
せ、２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ
試料緩衝液（バイオラッド社製）と混合した後、９９℃
で５分間加熱して、電気泳動用試料を調製した。これら
試料をゲル濃度４−２０％のポリアクリルアミド密度勾
配ゲルにて電気泳動した（電気泳動用緩衝液：２５ｍＭ
トリス、１９２ｍＭ グリシン、０．１％ＳＤＳ）
後、転写緩衝液（２５ｍＭ トリス、１９２ｍＭ グリ
シン、２０％メタノール）中で４℃、１時間、２００ｍ
Ａの条件でニトロセルロースメンブレンに転写した。

【０５０９】転写したメンブレンは０．５％ スキムミ
ルクを添加したＰＢＳ液中に浸して４℃で一晩ブロッキ
ングし、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢ
Ｓ）で３回洗浄した。次いで、メンブレンを、約２７０
ｎｇ／ｍｌの実施例２記載の５５−１−Ｎ１抗体および
５％ ウシ胎児血清を含む０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
−ＰＢＳ液中に入れて室温で１時間インキュベーション
した後、洗浄液で３回洗浄した。

【０５１０】さらに、メンブレンを西洋ワサビペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（バイオラ
ッド社製）を５％ ウシ胎児血清を含む０．０５％ Ｔ
ｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２０００倍希釈した反応液中で
室温で１時間インキュベーションした後、洗浄液で５回
洗浄した。このメンブレンをラップフィルム上に置き、
発光試薬溶液（ＥＣＬウエスタン検出試薬。アマシャム
・ファルマシア・バイオテク社製）に１分間浸した後、
１時間室温で放置してバックグラウンドを減衰させてか
ら、Ｘ線フィルムを感光させた（１０秒間）。このＸ線
フィルムを現像した結果、組換えアデノウイルスを感染
させたＨｅＬａ細胞において、目的のポリペプチドが産
生されていることが確かめられた。

【０５１１】（３）組換えアデノウイルスを接種したＫ
Ｋ／Ｓｎｋマウス血漿の調製 上記（１）で精製した組換えアデノウイルスＡｄ／Ｋｈ
ＡＰ５／Ｈｉｓを１０％グリセロール添加ＰＢＳで７．
２×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌに希釈し、５匹の１８週齢の雄
ＫＫ／Ｓｎｋマウスに３００μｌずつ尾静脈注射により
接種した。

【０５１２】接種２日後に、各マウスの腹大動脈より６
０μｌの１％ＥＤＴＡを予め入れた注射筒（テルモ社製
の２６ゲージの注射針および１ｍｌのシリンジ）を用い
て採血し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移
し、転倒混和後に、卓上遠心機で５２００ｒｐｍで１５
分間遠心して血漿を分離した。

【０５１３】（４）ＫＫ／Ｓｎｋマウス血漿中目的タン
パク質の精製 得られた血漿を１０ｍＭイミダゾール／ＰＢＳ、４℃で
４日間透析後、ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｈ
Ｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）へ添加し、２０ｍＭイ
ミダゾール／ＰＢＳおよび１００ｍＭイミダゾール／Ｐ
ＢＳ洗浄を行った。溶出は３００ｍＭイミダゾール／Ｐ
ＢＳで行い、各フラクションはゲル濃度４−２０％のポ
リアクリルアミド密度勾配ゲルにて電気泳動（電気泳動
用緩衝液：２５ｍＭ トリス、１９２ｍＭ グリシン、
０．１％ ＳＤＳ）後、ＧｅｌＣｏｄｅ染色（Ｐｉｅｒ
ｃｅ社）を行い目的タンパク質の有無を確認した。

【０５１４】（５）ＫＫ／Ｓｎｋマウス血漿中目的タン
パク質切断点の同定 His-tagアフィニティー精製で得たヒト・「アンジオポ
エチン関連タンパク質３」画分に終濃度10 mM dithioth
reitol (Sigma, St. louis, MO)を加えて還元した後、
終濃度55 mM iodoacetamide (Wako, Osaka, Japan)を加
えアルキル化反応を行った。その後Lysyl Endopeptidas
e (Wako, Osaka, Japan)を加えて37 ℃で一晩消化、ま
たはPNGase F (New England Biolabs, Beverly, MA)で3
7 ℃、2時間糖鎖除去処理を行った後、Sequencing Grad
e Endoproteinase Glu-C (Promega, Madison, WI)を加
えて37 ℃で一晩消化した。消化反応液に0.05 % formic
acid / H2Oを加えLC/ESI MS/MS (liquid chromatograp
hy electrospray ionizationtandem mass spectrometr
y)測定の試料とした。LCには逆相クロマトグラフィー担
体Inertsil ODS-2 (GL Science, Tokyo, Japan)を詰め
た自作のエレクトロスプレーニードルをカラムとして用
い、CapLC System (Waters, Milford, MA)で送液した。
溶出溶媒としてA液：0.05 % formic acid / H2O 、B
液：0.05 % formicacid / acetonitrile を使用し、1時
間で0 %から30 ％ までB液濃度を直線的に上げるグラジ
エント溶出を行った。溶出液は直接Q-Tof2 (Micromass,
Manchester, UK)に導入してESI MS/MS 測定を行った。

【０５１５】得られたMSスペクトルからヒト・「アンジ
オポエチン関連タンパク質３」のペプチドマッピングを
行ったところ、Lysyl Endopeptidaseで消化したサンプ
ルにはヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」に
由来するEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPR（アミノ酸残基198-
221）、EIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPR（198-224）とい
う2本のペプチドが、endoproteinase Glu-Cで消化した
サンプルにはISLSSKPR（214-221）、ISLSSKPRAPR（214-
224）という2本のペプチドが存在した。これらのペプチ
ドのカルボキシル末端はこの2種の酵素の基質認識部位
ではない。従ってヒト・「アンジオポエチン関連タンパ
ク質３」の血中切断部位としてArg221とAla222の間およ
びArg224とThr225の間の2ヶ所を確認した。

【０５１６】実施例１６． 融合アンジオポエチン関連
タンパク質４の活性評価 （１）融合タンパク質の調製 配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６乃至１４３に
示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ末
端にグルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼ（以下「Ｇ
ＳＴ」という）が連結している融合タンパク質（以下、
「ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ」という）を以下に記載する方法
に従って調製した。

【０５１７】まず、ＰＣＲ用プライマーとして、下記の
ヌクレオチド配列：5'- tcccccgggggacccgtgcagtccaag-
3'（ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ用のセンスプライマー。配列表
の配列番号５１）；および5'- ccgctcgagctggctttgcaga
tgctg-3'（ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ用アンチセンスプライマ
ー。配列表の配列番号５２）を合成した。

【０５１８】次に、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ Ｃｏｎｓｏｒ
ｔｉｕｍより購入したｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ（ｃｌｏｎ
ｅ ４１４９０３９）を鋳型とし、センスプライマーお
よびアンチセンスプライマー（それぞれ０．２μＭ）、
Ｔｂｒ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝
液（Ｔｂｒ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０
×緩衝液を１０倍希釈）、２ｍＭの塩化マグネシウムお
よび各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを実施し
た。ＰＣＲは、上記サンプルを９４℃で３分加熱した後
に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒
の温度サイクルを３０回繰り返した後、最後に７２℃で
７分間の条件で行なった。

【０５１９】ＰＣＲで増幅した約３７０ｂｐのＤＮＡ断
片を回収し、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化した。Ｓｍ
ａＩおよびＸｈｏＩで消化してからウシ小腸アルカリホ
スファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて切断末端の
脱リン酸化処理を行ったプラスミドベクターｐＧＥＸ−
４Ｔ−２（ＧＳＴをコードする遺伝子を含む。アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテク社製）にこの断片を挿入
し、挿入断片を含むプラスミドクローンを単離した。こ
のプラスミドクローンをｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎと命名し
た。

【０５２０】組換えプラスミドクローンｐＧＳＴ−ＡＲ
Ｐ４Ｎ、または、挿入断片を含まずＧＳＴのみを発現さ
せるためのコントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で
大腸菌ＪＭ１０９株をそれぞれ形質転換した。形質転換
は大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルにプラスミド
を添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で３０秒
間保温し、再び氷上で２分間静置してから、３７℃で１
時間振盪培養をすることによって行なった。形質転換後
の培養液をアンピシリン添加ＬＢ寒天プレート上に撒
き、出現した組換え体のコロニーをピックアップして液
体培養し、ＩＰＴＧ誘導による組換えタンパク質の発現
を確認した。

【０５２１】（２）融合タンパク質の調製 １）形質転換大腸菌の培養 プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ、コントロー
ルベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する形質転換大腸
菌をそれぞれ、アンピシリン入りのＬＢ培地に植菌し、
３７℃で１８時間振とう培養した。培養液の一部を新し
い培地に添加し、さらに３７℃にて振とう培養を行なっ
た。６００ｎｍでの吸光度が０．５−０．７に達した時
に、最終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル・チオガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加しさらに４時間振
とう培養を継続した。

【０５２２】２）ｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持した大腸菌
からの細胞破砕液の調製 コントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で形質転換し
た大腸菌の培養液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の
条件で遠心処理して沈殿した菌体を回収した。回収した
菌体を超音波処理用緩衝液（５０ｍＭ トリス−塩酸
（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）で懸濁し、懸濁液を４℃、
６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理した。沈殿
を−８０℃で凍結し、次いで室温にて融解して再度超音
処理用緩衝液に懸濁した。懸濁液を氷浴中で超音波破砕
器（トミー精工（株）社製ＵＤ−２０１）によって、出
力＝５、デューティ＝５０の条件で５分間処理した。超
音波処理後の破砕液に最終濃度１％となるようにトリト
ン Ｘ−１００を添加し混和し、４℃、１００００ｒｐ
ｍ、３０分間の条件で遠心処理し、上清を回収した。上
清はＧＳＴｒａｐカラム（アマシャム・ファルマシア・
バイオテク社製）中に流した。

【０５２３】３）ｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを保持する大腸
菌からの細胞破砕液の調製 組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎで形質転換した
大腸菌の培養液それぞれを、４℃、５０００ｒｐｍ、１
５分間の条件で遠心処理し、沈殿した菌体を回収した。
沈殿した菌体に対して、洗浄用緩衝液（０．５％ トリ
トン Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ）での懸濁、４
℃、５０００ｒｐｍ、１０分間の条件での遠心処理、の
操作を３回繰り返し、得られた菌体を８Ｍ 尿素溶液に
溶解した。この溶液を室温に１時間放置した後、４℃、
１３０００ｒｐｍ、３０分間の遠心処理を行ない上清を
回収した。得られた上清を透析した。透析は、４Ｍ 尿
素溶液に対して４℃で１時間、２Ｍ 尿素溶液に対して
４℃で１時間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で１時
間、超音波処理用緩衝液に対して４℃で一晩の順で行な
った。透析後、４℃、１２０００ｒｐｍ、３０分間の条
件で遠心し、ＧＳＴｒａｐカラム中に流した。

【０５２４】４）融合タンパク質の精製 上記の工程を経てＧＳＴ、ＧＳＴとの融合タンパク質
（以下、「ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ」という）が吸着したＧ
ＳＴカラムにＰＢＳを流してカラム内を洗浄して不純物
を除去した。次いで、１０ｍＭ 還元型グルタチオン溶
液を流して、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを溶出させ
た。溶出液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にで分離
した後、ゲルをクマシー染色して、タンパク質の存在を
確認した。また、溶出液をＰＢＳで４℃、一晩透析し
た。

【０５２５】（２）血中中性脂肪濃度上昇活性 上記（１）で精製したＧＳＴおよびＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ
を、ＰＢＳでタンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌに調整し、
それぞれ２匹の１９週齢の雄ＫＫ／Ｓｎｋマウスに約３
００μｌずつ尾静脈注射により接種した。採血は摂取前
と接種３０分後に行なった。ヘマトクリット管で各マウ
スの眼底より採血して、卓上遠心機で５２００ｒｐｍ１
５分遠心して血漿を分離し、接種前後における血中中性
脂肪濃度を測定した。結果を表９に示した。

【０５２６】

【表９】 ―――――――――――――――――――――――――― ＴＧ値（ｍｇ／ｄｌ） ―――――――――――― Ｐｒｅ ３０分後 ―――――――――――――――――――――――――― ＧＳＴ ５１ ４４ ＧＳＴ ３８ ４４ ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ ４１ ２２４ ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ ２３ ２１６ ―――――――――――――――――――――――――― ＧＳＴ接種マウス群では接種前後で差が認められなかっ
たのに対し、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ接種マウス群では有意
に血中中性脂肪濃度の上昇が認められた。

【０５２７】本実施例の方法において、例えばＧＳＴ−
ＡＲＰ４Ｎを接種したマウスに、被験物質を投与し、血
中中性脂肪濃度の変動を調べることにより、高脂血症、
動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは二つ以
上の疾患の治療または予防剤の試験を行うことができ
る。

【０５２８】実施例１７． ＬＰＬ活性阻害効果 （１）ＬＰＬ試料の調製 ラット白色脂肪前駆細胞（ホクドー社より購入）を増殖
用培地［１０％ ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」とい
う）、１００単位／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍ
ｌ ストレプトマイシン、１７μＭ パントテン酸、３
３μＭ （＋）−ビオチン、１００μＭ アスコルビン
酸、１μＭ オクタン酸および５０ｎＭ トリヨードチ
ロニンを含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭ
ＥＭ」という）］の入った細胞培養用フラスコ（培養面
積２５ｃｍ²）中で３７℃で２４時間培養した後、培地
を分化誘導用培地（１０％ ＦＣＳ、１００単位／ｍｌ
ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシ
ン、１７μＭ パントテン酸、３３μＭ （＋）−ビオ
チン、１００μＭ アスコルビン酸、１μＭ オクタン
酸、５０ｎＭ トリヨードチロニン、１０μｇ／ｍｌ
インスリンおよび２．５μＭ デキサメタゾンを含むＤ
ＭＥＭ）に交換し、３７℃でさらに４８時間培養した。
その後、脂肪細胞維持培地（１０％ ＦＣＳ、１００Ｕ
／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマ
イシン、１７μＭ パントテン酸、３３μＭ（＋）−ビ
オチン、１００μＭ アスコルビン酸、１μＭオクタン
酸、５０ｎＭ トリヨードチロニンおよび１０μｇ／ｍ
ｌ インスリンを含むＤＭＥＭ）に交換した。２乃至３
日後に１０％ ＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌ インスリンお
よび１０単位／ｍｌ ヘパリンナトリウムを含有するＤ
ＭＥＭ培地を２ｍｌ加え、１時間培養した後、この培養
上清を回収してＬＰＬ活性の測定に用いた。

【０５２９】（２）ＬＰＬ活性測定 ＬＰＬ活性の測定法は、文献記載の方法（Nilsson-Ehl
e, P. and Schotz, M.C.(1976) J.Lipid Res. 17, 536-
541）に従った。

【０５３０】まず、上記１）記載の方法で調製した培養
上清１００μｌを等量の基質溶液［２ｍＭ グリセロー
ル・トリ［９，１０（ｎ）−³Ｈ］オレイン酸（１３１
ＫＢｅｑ／μｍｏｌ、アマシャム社製）、０．１８９μ
ｇ／ｍｌ Ｌ α−ホスファチジルコリン（シグマ社
製）、１４ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（シグマ社
製）、１４０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１５
％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０％（ｖ／ｖ）非働化Ｆ
ＣＳ］と混合し、そこへ実施例１５で得られたＧＳＴま
たはＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを加え、３７℃で１２０分間保
温した。その後、１．０５ｍｌの０．１Ｍ 炭酸カリウ
ム・ほう酸緩衝液（ｐＨ１０．５）と３．２５ｍｌのメ
タノール：クロロホルム：ヘキサン＝１４１：１２５：
１００（ｖ／ｖ）を加えて反応を停止させ、強く撹拌し
た後、３０００×ｇで１５分間遠心分離した。水−メタ
ノール層の³Ｈカウントを液体シンチレーションカウン
ターにて測定した。ＬＰＬ活性の１単位は、１μｍｏｌ
の脂肪酸を１分間に生成する活性として定義した。さら
に、ＧＳＴ（１０μｇ／ｍｌ）を添加したときのＬＰＬ
活性を１００％とし、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎを添加したと
きの相対的ＬＰＬ活性を算出した。その結果を表１０に
示した。

【０５３１】

【表１０】 ―――――――――――――――――――――――――――――― ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎ ＬＰＬ活性 （μｇ／ｍｌ） （％） ―――――――――――――――――――――――――――――― １ ７４±６ ２．５ ６１±１ ５ ３４±４ １０ １６±２ ―――――――――――――――――――――――――――――― ＧＳＴ−ＡＲＰ４ＮはＬＰＬの活性を用量依存的に抑制
した。この実験系において、リパーゼ反応の際に被験物
質を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性を調節する作用
を有するか否かを調べることができる。

【０５３２】実施例１８．アンジオポエチン関連タンパ
ク質４とグルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼとの融
合タンパク質の活性評価 （１）融合タンパク質発現形質転換大腸菌の作製 配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６乃至４０６に
示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ末
端にグルタチオン・Ｓ・トランスフェラーゼ（以下「Ｇ
ＳＴ」という）が連結している融合タンパク質（以下、
「ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ」という。）を以下に記載
する方法に従って調製した。

【０５３３】まず、ＰＣＲ用プライマーとして、下記の
ヌクレオチド配列：5'- tcccccgggggacccgtgcagtccaag-
3'（ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ用のセンスプライマー。
配列表の配列番号５５）；および5'- ccgctcgagggaggct
gcctctgctgc-3'（ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ用アンチセ
ンスプライマー。配列表の配列番号５６）を合成した。

【０５３４】次に、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ． Ｃｏｎｓｏ
ｒｔｉｕｍより購入のｃＤＮＡ（Ｉ．Ｄ． ４１４９０
３９）１０ｎｇを鋳型とし、センスプライマーおよびア
ンチセンスプライマー（それぞれ０．２μＭ）、Ｔｂｒ
ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｔ
ｂｒ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝
液を１０倍希釈）、２ｍＭの塩化マグネシウムおよび各
０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを実施した。Ｐ
ＣＲは、上記サンプルを９４℃で３分間加熱した後に、
９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒
の温度サイクル３５回、最後に７２℃で５分間の条件で
行なった。

【０５３５】ＰＣＲでは約１１４０ｂｐのＤＮＡ断片が
増幅した。増幅したＤＮＡ断片を回収し、ＳｍａＩおよ
びＸｈｏＩで消化した。ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化
してからウシ小腸アルカリホスファターゼ（宝酒造
（株）社製）を用いて切断末端の脱リン酸化処理を行っ
たプラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ＧＳＴをコ
ードする遺伝子を含む。アマシャム・ファルマシア・バ
イオテク社製）に、このＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化
した、ＤＮＡ断片を挿入し、挿入断片を含むプラスミド
クローンを単離した。このプラスミドクローンをｐＧＳ
Ｔ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌと命名した。

【０５３６】プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆ
ｕｌｌで大腸菌ＥｐｉｃｕｒｉａｎＣｏｌｉ ＢＬ２１
ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ （ＤＥ３）−ＲＩＬ株（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ社製）を、または、挿入断片を含まずＧ
ＳＴのみを発現させるためのコントロールベクターｐＧ
ＥＸ−４Ｔ−２で大腸菌ＪＭ１０９株をそれぞれ形質転
換した。

【０５３７】形質転換は１０倍希釈したＸＬ１０−Ｇｏ
ｌｄ β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ ｍｉｘ
２mｌを大腸菌Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＢＬ２
１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ （ＤＥ３）−ＲＩＬのコンピ
テントセル １００mｌに予め添加し、氷上で２分置きに
攪拌しながら１０分間冷却後にプラスミドを添加し、氷
上で３０分間静置後、４２℃で２０秒間保温し、再び氷
上で２分間静置してから、ＳＯＣ培養液中で３７℃、１
時間振盪培養をすることによって行なった。形質転換後
の培養液をアンピシリンおよびクロラムフェニコール添
加ＬＢ寒天プレート上に撒き、出現した組換え体のコロ
ニーをピックアップして液体培養し、ＩＰＴＧ誘導によ
る組換えタンパク質の発現を確認した。

【０５３８】一方、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換はコン
ピテントセルにプラスミドを添加し、氷上で３０分間静
置した後、４２℃で３０秒間保温し、再び氷上で２分間
静置してから、ＳＯＣ培養液中で３７℃、１時間振盪培
養をすることによって行なった。形質転換後の培養液を
アンピシリン添加ＬＢ寒天プレート上に撒き、出現した
組換え体のコロニーをピックアップして液体培養し、Ｉ
ＰＴＧ誘導による組換えタンパク質の発現を確認した。

【０５３９】（２）融合タンパク質の調製 １）形質転換大腸菌の培養 プラスミドクローンｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌおよび
コントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する形
質転換大腸菌をそれぞれ、アンピシリン／クロラムフェ
ニコールおよびアンピシリン入りのＬＢ培地に植菌し、
３７℃で１８時間振とう培養した。培養液の一部を新し
い培地に添加し、さらに３７℃にて振とう培養を行なっ
た。６００ｎｍでの吸光度が０．５−０．７に達した時
に、最終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル・チオガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加しさらに４時間振
とう培養を継続した。

【０５４０】２）ｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する大腸菌
からの細胞破砕液の調製 コントロールベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２で形質転換し
た大腸菌の培養液を４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の
条件で遠心処理して沈殿した菌体を回収した。回収した
菌体を超音波処理用緩衝液（５０ｍＭ トリス−塩酸
（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）で懸濁し、懸濁液を４℃、
６０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理した。沈殿
を−８０℃で凍結し、次いで室温にて融解して再度超音
処理用緩衝液に懸濁した。懸濁液を氷浴中で超音波破砕
器（トミー精工（株）社製ＵＤ−２０１）によって、出
力＝５、デューティ＝５０の条件で５分間処理した。超
音波処理後の破砕液に最終濃度１％となるようにトリト
ン Ｘ−１００を添加し混和し、４℃、１００００ｒｐ
ｍ、３０分間の条件で遠心処理し、上清を回収した。上
清はＧＳＴｒａｐカラム（アマシャム・ファルマシア・
バイオテク社製）中に流した。

【０５４１】３）ｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを保持す
る大腸菌からの細胞破砕液の調製 組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌで形質転
換した大腸菌の培養液を、４℃、５０００ｒｐｍ、１５
分間の条件で遠心処理し、沈殿した菌体を回収した。沈
殿した菌体に対して、洗浄用緩衝液（０．５％ トリト
ン Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ）での懸濁、４℃、
５０００ｒｐｍ、１０分間の条件での遠心処理、の操作
を３回繰り返し、得られた菌体を８Ｍ 尿素溶液に溶解
した。この溶液を室温に１時間放置した後、４℃、１３
０００ｒｐｍ、３０分間の遠心処理を行ない上清を回収
した。組換えプラスミドｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌで
形質転換した大腸菌由来の培養液から得られた上清につ
いて透析を行なった。透析は、４Ｍ 尿素溶液に対して
４℃で１時間、２Ｍ 尿素溶液に対して４℃で１時間、
超音波処理用緩衝液に対して４℃で１時間、超音波処理
用緩衝液に対して４℃で一晩の順で行なった。透析後、
４℃、１２０００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心し、上
清をＧＳＴｒａｐカラム中に流した。

【０５４２】４）融合タンパク質の精製 上記の工程を経てＧＳＴ又はＧＳＴとの融合タンパク質
ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌが吸着したＧＳＴカラムにＰ
ＢＳを流してカラム内を洗浄して不純物を除去した。次
いで、１０ｍＭ 還元型グルタチオン溶液（ｐＨ８．
０）を流して、ＧＳＴ、ＧＳＴとの融合タンパク質ＧＳ
Ｔ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを溶出させた。溶出液の一部をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて分離した後、ゲルをクマシ
ー染色して、タンパク質の存在を確認した。また、溶出
液をＰＢＳで４℃、一晩透析した。ここで、プラスミド
ｐＧＥＸ−４Ｔ−２を保持する形質転換体から精製され
たタンパク質がＧＳＴであり、ｐＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕ
ｌｌを保持する形質転換体から精製されたタンパク質
が、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌである。

【０５４３】（３）血中中性脂肪濃度上昇活性 上記（２）で得られたＧＳＴおよびＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆ
ｕｌｌを、ＰＢＳでタンパク質濃度約０．５ｍｇ／ｍｌ
に調整した後に、それぞれ２匹の１６週齢の雄ＫＫ／Ｓ
ｎｋマウスに１００μｌずつ尾静脈注射により接種し
た。採血は摂取前と摂取３０分後に行なった。ヘマトク
リット管で各マウスの眼底より採血して、卓上遠心機で
５２００ｒｐｍ、１５分間遠心して血漿を分離し、接種
前後における血中中性脂肪（トリアシルグリセロール）
濃度を測定した。

【０５４４】その結果を表１１に示した。ＧＳＴ接種マ
ウス群（表１１の「ＧＳＴ」）では接種前後で差が認め
られなかったのに対し、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ接種
マウス群（表１１の「ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ」）で
は顕著な血中中性脂肪濃度の上昇が認められた。

【０５４５】本実施例の方法において、例えばＧＳＴ−
ＡＲＰ４Ｆｕｌｌを接種したマウスに、被験物質を投与
し、血中中性脂肪濃度の変動を調べることにより、高脂
血症、動脈硬化および高血糖から選択される一つまたは
二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験を行うことが
できる。

【０５４６】

【表１１】 ―――――――――――――――――――――――――― ＴＧ値（ｍｇ／ｄｌ） ―――――――――――― Ｐｒｅ ３０分後 ―――――――――――――――――――――――――― ＧＳＴ ３９ ３９ ＧＳＴ ６２ ６７ ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ ４７ ２９１ ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ ３５ ２４９ ―――――――――――――――――――――――――― 実施例１９． ＧＳＴ−ＡＲＰ４ＦｕｌｌのＬＰＬ活性
阻害効果 実施例１１の（１）の１）記載の方法にしたがって調製
した、ラット白色脂肪前駆細胞培養上清１００μｌを等
量の基質溶液（２ｍＭ グリセロール・トリ［９，１０
（ｎ）−³Ｈ］オレイン酸（１３１ＫＢｅｑ／μｍｏ
ｌ、アマシャム社製）、０．１８９μｇ／ｍｌ Ｌ α
−ホスファチジルコリン（シグマ社製）、１４ｍｇ／ｍ
ｌ ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、１４０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１５％（ｖ／ｖ）グリセ
ロール、１０％（ｖ／ｖ）非働化ＦＣＳ）と混合し、そ
こへ実施例１８で得られたＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌま
たはＧＳＴを加え、３７℃で１２０分間保温した。その
後、１．０５ｍｌの０．１Ｍ炭酸カリウム・ほう酸緩衝
液（ｐＨ１０．５）と３．２５ｍｌのメタノール：クロ
ロホルム：ヘキサン＝１４１：１２５：１００（ｖ／
ｖ）を加えて反応を停止させ、強く撹拌した後、３００
０×ｇで１５分間遠心分離した。水−メタノール層の³
Ｈカウントを液体シンチレーションカウンター（ベック
マン社製）にて測定した。ＬＰＬ活性の１単位は、１μ
ｍｏｌの脂肪酸を１分間に生成する活性として定義し
た。さらに、ＧＳＴ（１０μｇ／ｍｌ）を添加したとき
のＬＰＬ活性を１００％とし、ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌ
ｌを添加したときの相対的ＬＰＬ活性を算出した。その
結果を表１２に示した。

【０５４７】

【表１２】 ―――――――――――――――――――――――――――― ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌ ＬＰＬ活性の相対値 （μｇ／ｍｌ） （％） ―――――――――――――――――――――――――――― １ ６７±４ ２．５ ３０±１ ５ １６±２ １０ ５±１ ―――――――――――――――――――――――――――― ＧＳＴ−ＡＲＰ４ＦｕｌｌはＬＰＬの活性を用量依存的
に抑制した。この実験系において、リパーゼ反応の際に
被験物質を添加すれば、該物質がＬＰＬの活性を調節す
る作用を有するか否かを調べることができる。

【０５４８】実施例２０． マウス「アンジオポエチン
関連タンパク質３」遺伝子の解析ａ）ＢＡＣ（Bacteria
l artificial chromosome）ＤＮＡの調製 マウスＢＡＣクローン３５５Ｌ−１（リサーチ・ジェネ
ティクス社より購入）を保持する大腸菌を１２．５μｇ
／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１００ｍｌのＬＢ
培地で、３７℃で一晩培養した後、培養液を４ｍｌずつ
４個のチューブユニットに分注し、ＤＮＡ自動抽出装置
（ＰＩ−５０、クラボウ（株）社製）を用いてＤＮＡを
抽出した。さらにこのサンプルを塩化セシウム法によっ
て精製した。

【０５４９】ｂ） ＤＮＡの断片化 ３０ｎｇ／μｌのＢＡＣ ＤＮＡ ３００μｌを１．５
ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、ソニケーター
（ソニファイアーＩＩ ２５０、ブランソン社製)、お
よびスペシャルマイクロチップ（ブランソン社製）を用
いて、ソニケーターの出力調整を１、デューティー・サ
イクルを「コンスタント」の条件にそれぞれ設定して、
ＤＮＡを３秒間、２回ソニケーションし断片化した。Ｄ
ＮＡの断片化の度合いは、アガロースゲル電気泳動を行
って確認した。

【０５５０】ｃ） ＤＮＡ断片の末端修復 上記で断片化されたＤＮＡに、終濃度５ｍＭの塩化マグ
ネシウム、０．０５ｍＭのｄＮＴＰ（宝酒造（株）社
製）存在下で１０単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝
酒造（株）社製）を加え、２５℃で１５分間保温した。
さらに、５単位のクレノウ断片（宝酒造（株）社製）を
加え、２５℃で１５分間保温して、断片化ＤＮＡの末端
を平滑化した。ＤＮＡを精製後、終濃度２ｍＭのＡＴＰ
（宝酒造（株）社製）、１単位のポリヌクレオチドキナ
ーゼ（宝酒造（株）社製）およびポリヌクレオチドキナ
ーゼ反応緩衝液（ポリヌクレオチドキナーゼに添付、終
濃度：５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍ
Ｍ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ジチオスレイトール）
を加え、３７℃で３０分間保温してＤＮＡ末端をリン酸
化した。反応終了後、ＴＥ飽和フェノール／クロロホル
ムにてポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。

【０５５１】ｄ） ショ糖密度勾配遠心 １０％ショ糖溶液は、１０ｍｌの５０％ショ糖溶液、
０．２５ｍｌの２０×ＳＳＣおよび０．１ｍｌの０．５
Ｍ エチレンジアミン四酢酸（以下「ＥＤＴＡ」とい
う）を混合し、滅菌水で全量５０ｍｌに調整することに
より作製した。３８％ショ糖溶液は、３８ｍｌの５０％
ショ糖溶液、０．２５ｍｌの２０×ＳＳＣおよび０．１
ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを混合して、滅菌水で全量５
０ｍｌに調整することにより作製した。１３ＰＡチュー
ブ（日立工機（株）社製）に３８％ショ糖溶液を５ｍｌ
加え、次いで１０％ショ糖溶液を５ｍｌ静かに加えた
後、グラジエントフォーマー（グラジエント・メイト、
コスモバイオ（株）社製）を用いて速度（SPEED）１
０、時間（TIME）２分３０秒および角度（ANGLE）８°
の条件に設定してショ糖密度勾配を作製した。得られた
ショ糖密度勾配溶液に上記ｃ）で得られたＤＮＡを加
え、１５００００×ｇ、２０℃で１６時間遠心分離し
た。その後、チューブの下部より注射針（１８Ｇ）を用
いて穴を開け、チューブ内液を下層から３００μｌずつ
分画して回収した。０．８％ アガロースゲルにて各画
分の一部を電気泳動し、約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を含
んでいた画分を選択し、エタノール沈殿後に１０μｌの
ＴＥに溶解した。

【０５５２】ｅ） ベクター調製およびライブラリーの
作製 上記で得られたＢＡＣ ＤＮＡ由来の約２．０ｋｂ断片
と０．１μｇのｐＵＣ１９ ＤＮＡ／ＳｍａＩ（ファー
メンタス社製）をＤＮＡライゲーションキット（バージ
ョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。反応液
をエレクトロポレーション用コンピテント大腸菌（エレ
クトロ・マックスＤＨ１０Ｂセル、ギブコ・ビーアール
エル社製）に加え、エレクトロポレーション用キュベッ
ト（ジーンパルサーキュベット ０．１ｃｍ、バイオラ
ッド社製）に移し、エレクトロポレーション装置（ジー
ンパルサーＩＩ、バイオラッド社製）を用いて、電圧
１．８ｋＶ、電気容量２５μＦ、抵抗２００Ωの条件で
エレクトロポレーションした。その後１ｍｌのＳＯＣ培
地（ギブコ・ビーアールエル社製）を加え、３７℃で１
時間振とうし、終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、
終濃度５０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ（ギブコ・ビーアー
ルエル社製）および終濃度２５μｇ／ｍｌのＩＰＴＧ
（ギブコ・ビーアールエル社製）を含むＬＢ固形培地
（１．２％ バクトアガー含有）上に塗り広げ、３７℃
で一晩培養した。

【０５５３】ｆ）ＤＮＡの調製 上記ｅ）の結果、白色を呈したコロニーを選択し、終濃
度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢＧ培地（１
リットル当たり、トリプトン １２ｇ、イーストエキス
トラクト ２４ｇ、リン酸一カリウム ２．３ｇ、リン
酸二カリウム１２．５ｇ、グリセロール ４ｍｌおよび
１Ｍ グルコース ２０ｍｌを含む）１．２ｍｌ／ウェ
ルを入れた培養用マイクロウェルプレート（２．２ｍｌ
ディープ・ウェル・プレート、日本ジェネティクス社
製）に１コロニー／ウェルで植菌した。プレートの上面
を通気性粘着シート（日本ジェネティクス社製）にてシ
ールした後、プレートミキサーを用いて緩やかに撹拌し
ながら、３７℃で１６．５時間培養した。その後、培養
液を６００μｌずつとって、新しい培養用マイクロウェ
ルプレートに分注し、マイクロプレート用遠心機（４Ｋ
１５Ｃ、シグマ社製）を用いて、６０００ｒｐｍ、２０
℃にて５分間遠心した。上清を除き、沈殿した菌体から
ＤＮＡ抽出キット（QIAprep ９６・ターボ・バイオロ
ボット・キット、Ｑｉａｇｅｎ社製）およびＤＮＡ抽出
装置（バイオロボット９６００、Ｑｉａｇｅｎ社製）を
用いてＤＮＡを抽出した。

【０５５４】ｇ）ヌクレオチド配列解析 シークエンシング用プライマーとして、下記のヌクレオ
チド配列：5'- tgtaaaacga cggccagt -3'（-21M13forwa
rd、配列表の配列番号５７）；および5'- caggaaacag c
tatgacc -3'（M13reverse、配列表の配列番号５８）か
らなるオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置にて化学合
成した。

【０５５５】上記ｆ）で得られた各ＤＮＡ １０μｌに
対して、プライマー（-21M13forwardまたはM13revers
e）を３．２ｐｍｏｌ、シークエンシング試薬（ビッグ
ダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンスＦＳレ
ディ・リアクション・キット、アプライドバイオシステ
ムズ社製）を８μｌ加え、滅菌水にて全量を２０μｌと
した。サーマルサイクラー（ジーンアンプ・ＰＣＲシス
テム９７００、アプライドバイオシステムズ社製）にて
サイクルシークエンス反応を実施（９６℃で１０秒、５
０℃で５秒、６０℃で４分を１サイクルとして２５サイ
クル）して、得られたサンプルをＤＮＡシークエンサー
（ＡＢＩ３７００、アプライドバイオシステムズ社製）
に供してヌクレオチド配列を解析した。得られた配列デ
ータは、ＤＮＡシークエンスソフト（Sequencher、Gene
Codes社製）を用いて編集、整列化された。解析の結
果、配列表の配列番号２７に示されるヌクレオチド配列
を含むＤＮＡが目的のプロモーターＤＮＡとして選択さ
れた。マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」を
コードする遺伝子の転写開始点（エクソン１の５'末端
境界部位）はGenBankデータベースに登録されている最
も５'末端側が長いＥＳＴ（Expressed Sequence Tag）
である「ＡＩ１９５５２４」を参照して決定した。すな
わち、ＡＩ１９５５２４のヌクレオチド配列のうち、ベ
クター部分を除いた最初のヌクレオチドを転写開始点と
判断し、その位置を「１」と定義した。このようにし
て、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝
子の転写開始点より５'末端側４１８ｂｐから３'末端側
１３２ｂｐまでの領域に相当するヌクレオチド配列から
なるＤＮＡが同定された。

【０５５６】実施例２１． ルシフェラーゼ発現プラス
ミドベクターの構築 ａ）プラスミドｐＧＬ８−３の構築 実施例２０の結果を基に、マウス「アンジオポエチン関
連タンパク質３」をコードする遺伝子の５'末端側上流
域を特異的に増幅するためのＰＣＲプライマーとして、
下記のヌクレオチド配列：5'- aaggtaccgc tgtttccaga
taaacaaa -3' （プライマー１、配列表の配列番号５
９）；および5'- tcaaatgatg aaaggtctgg atccactctg g
atgc -3' （プライマー２、配列表の配列番号６０）か
らなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ化学合成した。

【０５５７】上記プライマー（終濃度各０．２μＭ）
と、ＬＡ ＰＣＲキット（宝酒造（株）社製）添付の１
０×ＬＡバッファー（Ｍｇ＋）を５μｌ、同じく添付ｄ
ＮＴＰを８μｌ、実施例２０のａ）に記載した方法で精
製したＢＡＣクローン３５５Ｌ−１ ＤＮＡ １μｌお
よび滅菌水を加えて４９．５μｌとし、キット添付のＬ
Ａ Ｔａｑポリメラーゼを０．５μｌ加えて全量を５０
μｌとした。サーマルサイクラー（ジーンアンプＰＣＲ
システム９６００、アプライドバイオシステムズ社製）
を使用してＰＣＲを実施した（温度条件：９４℃で２分
間加熱してから、次に９８℃で２０秒、６８℃で３分の
温度サイクルを３０回繰り返し、４℃に冷却、保存し
た）。

【０５５８】このＰＣＲ後の反応液中のＤＮＡをエタノ
ール沈殿で回収した後、滅菌水８０μｌに溶解した。こ
のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで順次消化し
た。一方、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂａ
ｓｉｃ（プロメガ社製）を同様にＫｐｎＩとＢｇｌＩＩ
で消化し、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社
製）を用いて脱リン酸化した後、上記ＤＮＡ断片とＤＮ
Ａライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）
社製）を用いて連結した。このＤＮＡで大腸菌ＤＨ１０
Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社製）を
形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。

【０５５９】いくつかのコロニーを少量培養して、培養
菌体からプラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンサー
（モデル３７００、（（株）アプライドバイオシステム
ズ事業部製）を用いて挿入断片のヌクレオチド配列を解
析し、配列表の配列番号２７のヌクレオチド番号１乃至
５２６に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿
入されたプラスミドをｐＧＬ８−３と命名した。プラス
ミドｐＧＬ８−３は、２００1（平成１３）年６月７日
付けで独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託
センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７
６２７が付された。このプラスミドを保有する形質転換
大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍ
ｌの液体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養し、この培養
液から、プラスミド抽出精製キット（ウィザード・ピュ
アフェクション・キット、プロメガ社製））を用いてＤ
ＮＡを回収し、精製した。

【０５６０】ｂ）プラスミドｐＧＬ１３−１の構築 下記のヌクレオチド配列：5'- aaggtaccaa ttgcatccag
agtggatcca a -3' （配列表の配列番号６１）；および
5'- ttggatccac tctggatgca attggtacct t -3' （配列
表の配列番号６２）を有するオリゴヌクレオチドを合成
した。

【０５６１】上記オリゴヌクレオチド各５μｇを混合し
てアニーリングさせてから、制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐ
ｎＩで順次消化した。一方、ルシフェラーゼ発現ベクタ
ーｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）を同様にＫｐ
ｎＩとＢｇｌＩＩで消化し、アルカリホスファターゼ
（宝酒造（株）社製）を用いて脱リン酸化した後、上記
ＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン
２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡ
で大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーア
ールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロ
ニーを得た。

【０５６２】いくつかのコロニーの培養菌体からプラス
ミドを抽出してＤＮＡシークエンサー（モデル３７０
０、（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイ
オシステムズ事業部製）を用いてヌクレオチド配列を解
析し、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺
伝子の＋９３乃至＋１０８領域に相当するＤＮＡ（配列
表の配列番号２７のヌクレオチド番号５１１乃至５２
６）が挿入されたプラスミドｐＧＬ１３−１を取得し
た。このプラスミドを保有する形質転換大腸菌を５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの液体ＬＢ培
地中で、３７℃で一晩培養し、この培養液から、プラス
ミド抽出精製キット（プロメガ社製）を用いてＤＮＡを
回収し、精製した。

【０５６３】ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂ
ａｓｉｃ（プロメガ社製）ＤＮＡでも同様にして大腸菌
ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル
社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを培
養し、プラスミド抽出精製キット（プロメガ社製）を用
いてＤＮＡを回収し、精製した。このプラスミドＤＮＡ
をネガティブコントロールとして使用した。

【０５６４】実施例２２． アンジオポエチン関連タン
パク質３遺伝子のプロモーター活性実施例２１で単離し
たＤＮＡのプロモーター活性について評価するため、レ
ポーターアッセイを実施した。すなわち、実施例２１で
構築したホタルルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＧＬ
８−３またはｐＧＬ１３−１）を、ヒト肝臓由来細胞株
ＨｅｐＧ２にトランスフェクションして、ホタルルシフ
ェラーゼ活性の変化を調べた。なお、細胞へのトランス
フェクション効率についての各プラスミド間の実験ロッ
ト差を補正するための内部標準として、ウミシイタケル
シフェラーゼ発現プラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ（プロメガ
社製）を用いた。

【０５６５】まず、ＨｅｐＧ２細胞（大日本製薬（株）
社より購入）を、１０％ウシ胎児血清（モアゲート社
製）、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−
グルタミン、および１ｍＭのピルビン酸を含むＭＥＭ培
地（ギブコ・ビーアールエル社製）中で、３７℃で５％
炭酸ガスのインキュベーター内で培養した。セミコンフ
ルエントになるまで増殖させた大角フラスコ（住友ベー
クライト社製）に、ＰＢＳ（−）（日水製薬（株）社
製）を加えて、セルスクレーパー（住友ベークライト
（株）社製）を用いて細胞を掻きとって回収した。その
細胞を５×１０⁵個／ウェルで６穴培養プレート（コー
ニング社製）に蒔き、一晩培養した。１μｇのｐＧＬ３
−Ｂａｓｉｃ、ｐＧＬ８−３、あるいはｐＧＬ１３−１
ＤＮＡと０．０４ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ ＤＮＡを混
合して、滅菌水で全量を５μｌとしてＤＮＡ溶液とし
た。一方、１００μｌのウシ胎児血清を含まないＭＥＭ
培地（その他の成分は上記と同様）に６μｌのトランス
フェクション試薬（TransIT-LT1、宝酒造（株）社製）
を添加し室温で５分間保温した。この溶液に先に調製し
たＤＮＡサンプルを添加し、室温で５分間保温した。細
胞は血清を含まないＭＥＭ培地（その他の成分は上記と
同じ）２ｍｌで２回洗浄し、２ｍｌの同培地に置き換え
た。ＤＮＡ溶液を３０μｌ／ウェルずつ３ウェルへ添加
して、４時間培養後に２ｍｌ／ウェルの１０％ウシ胎児
血清を含むＭＥＭ培地（その他の成分は上記と同じ）へ
置き換え３７℃で一晩培養した。培養後、培地を除去し
て２００μｌ／ウェルの細胞溶解剤（Passive Lysis Bu
ffer（プロメガ社製））に溶解して、細胞抽出液を調製
した。そして、そのうちの２０μｌを用いて、デュアル
−ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム
（プロメガ社製）を、添付のプロトコールに従って用い
ることにより、ホタルおよびウミシイタケルシフェラー
ゼ活性を測定した（ルミナスＣＴ−９０００Ｄ、ダイア
ヤトロン社製を使用）。実験結果については、内部標準
のウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正したホタルル
シフェラーゼ活性として表した。

【０５６６】その結果、ｐＧＬ８−３を導入したＨｅｐ
Ｇ２細胞では、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃを導入した細胞に
比べて約１９倍のルシフェラーゼ活性が観察されたこと
から、ｐＧＬ８−３に組み込まれた配列表の配列番号２
７に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡにはプロ
モーターとしての活性が存在することが明らかとなっ
た。一方、ｐＧＬ１３−１を導入した細胞では、ルシフ
ェラーゼ活性がｐＧＬ８−３を導入した細胞の１／１０
に低下した。以上の結果より、配列表の配列番号２７の
ヌクレオチド番号１乃至５１０に示されるＤＮＡ、すな
わちマウス「アンジオポエチン関連タンパク質３」遺伝
子の５'末端側上流−４１８乃至＋９２に相当する領域
にプロモーター活性が存在することが明らかとなった。

【０５６７】本実施例の方法において、例えばｐＧＬ８
−３で形質転換したＨｅｐＧ２細胞を被験物質存在下で
培養したときのルシフェラーゼ活性を測定することによ
り、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害する物質
の試験を行うことができる。このプロモーター活性を阻
害する物質は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選
択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤
となりうる。

【０５６８】実施例２３． 「アンジオポエチン関連タ
ンパク質４」プロモーター領域の解析 ａ）マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」プロ
モーター領域の単離マウス「アンジオポエチン関連タン
パク質４」をコードする遺伝子の５'末端側上流域を特
異的に増幅するためのＰＣＲプライマーとして、下記の
ヌクレオチド配列：5'- cggggtaccgagtgggtgctgggaagca
a -3'（プライマー１、配列表の配列番号６３）；およ
び5'- cccaagcttgccttgggtgcagcaacgct -3'（プライマ
ー２、配列表の配列番号６４）からなるオリゴヌクレオ
チドをＤＮＡ合成装置（アマシャム バイオサイエンス
株式会社）にて化学合成した。

【０５６９】マウス１２９Ｓｖ（三共株式会社安全性研
究所で飼育）由来のゲノムＤＮＡ１００ｎｇを鋳型と
し、上記プライマー（それぞれ３００ｎＭ）、ＫＯＤ
ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を１μｌ、１×ＰＣ
Ｒ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝
液＃１を１０分の１量）、１ｍＭの塩化マグネシウム、
各０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび滅菌水を加えて全量を５
０μｌとしＰＣＲを行った。ＰＣＲはサーマルサイクラ
ー（ジーンアンプＰＣＲシステム９７００、アプライド
バイオシステムズ社製）を使用し、上記サンプルを９４
℃で２分間加熱した後に、９４℃で１５秒、６０℃で３
０秒、６８℃で３分の温度サイクル３５回、最後に６８
℃で３分間保温の条件で行なった。得られたＰＣＲ産物
はＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製後、ＫｐｎＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩによる切断を行い、１．０％ １×ＴＡ
Ｅアガロース電気泳動による目的バンドの分離後、ＳＵ
ＰＲＥＣ−０１（宝酒造（株）社製）、エタノール沈殿
によりＤＮＡの回収を行った。

【０５７０】一方、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ
３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）を同様にＫｐｎＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アルカリホスファターゼ
（宝酒造（株）社製）を用いて脱リン酸化した後、上記
ＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン
２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡ
で大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーア
ールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロ
ニーを得た。いくつかのコロニーを少量培養して、培養
菌体からプラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンサー
（モデル３７００、（アプライドバイオシステムズジャ
パン社製）を用いて挿入断片のヌクレオチド配列を解析
し、配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至２
６０に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含む
約２．９ｋｂの断片が挿入されたプラスミドを得た（ｐ
ＧＬ２−４）。このプラスミドを保有する形質転換大腸
菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの
液体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養し、この培養液か
ら、プラスミド抽出精製キット（ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐ
ｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用
いてＤＮＡを回収し、精製した。

【０５７１】ｂ）ルシフェラーゼ発現プラスミドベクタ
ーｐＧＬ１１−４およびｐＧＬ１２−４の構築 マウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」をコード
する遺伝子の５'末端側上流域を特異的に増幅するため
のＰＣＲプライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
5'- cggggtaccacaaagcctgtggcattgca -3'（プライマー
３、配列表の配列番号６５）；および5'- cggggtaccctc
ccccagaactccagctg -3'（プライマー４、配列表の配列
番号６６）からなるオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装
置にて化学合成した。

【０５７２】プラスミドｐＧＬ２−４を鋳型とし、上記
プライマー（それぞれ３００ｎＭ）、ＫＯＤ ＤＮＡポ
リメラーゼ（東洋紡社製）を１μｌ、１×ＰＣＲ反応緩
衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液＃１を
１０分の１量）、１ｍＭの塩化マグネシウム、各０．２
ｍＭのｄＮＴＰｓおよび滅菌水を加えて全量を５０μｌ
としＰＣＲを行った。ＰＣＲはサーマルサイクラー（ジ
ーンアンプＰＣＲシステム９７００、アプライドバイオ
システムズ社製）を使用し、上記サンプルを９４℃で２
分間加熱した後に、９４℃で１５秒、６０℃で１５秒の
温度サイクル３０回、最後に６８℃で３分間保温の条件
で行なった。得られたＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ
ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン
社製）で精製後、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる
切断を行い、１．０％ １×ＴＡＥアガロース電気泳動
による目的バンドの分離後、ＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒
造（株）社製）、エタノール沈殿によりＤＮＡの回収を
行った。

【０５７３】一方、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ
３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）を同様にＫｐｎＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アルカリホスファターゼ
（宝酒造（株）社製）を用いて脱リン酸化した後、上記
ＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン
２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡ
で大腸菌ＤＨ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーア
ールエル社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロ
ニーを得た。いくつかのコロニーを少量培養して、培養
菌体からプラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンサー
（モデル３７００、（アプライドバイオシステムズジャ
パン社製）を用いて挿入断片のヌクレオチド配列を解析
し、配列表の配列番号２８のヌクレオチド番号１乃至２
６０に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入
されたプラスミドをｐＧＬ１１−４と命名し、配列表の
配列番号２８のヌクレオチド番号１８９乃至２６０に示
されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されたプ
ラスミドをｐＧＬ１２−４と命名した。

【０５７４】このプラスミドを保有する形質転換大腸菌
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの液
体ＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養し、この培養液か
ら、プラスミド抽出精製キット（ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐ
ｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用
いてＤＮＡを回収し、精製した。

【０５７５】マウス「アンジオポエチン関連タンパク質
４」をコードする遺伝子の転写開始点（エクソン１の
５'末端境界部位）はGenBankデータベースに登録されて
いる最も５'末端側が長いＥＳＴ（Expressed Sequence
Tag）である「ＡＫ０１４５６４」を参照して決定し
た。すなわち、ＡＫ０１４５６４のヌクレオチド配列の
うち、ベクター部分を除いた最初のヌクレオチドを転写
開始点と判断し、その位置を「１」と定義した。このよ
うにして、マウス「アンジオポエチン関連タンパク質
４」遺伝子の転写開始点より５'末端側９０ｂｐから３'
末端側１７０ｂｐまでの領域に相当するヌクレオチド配
列からなるＤＮＡの単離を行った。

【０５７６】ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｂ
ａｓｉｃ（プロメガ社製）ＤＮＡも同様にして大腸菌Ｄ
Ｈ１０Ｂのコンピテント細胞（ギブコビーアールエル社
製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを培養
し、プラスミド抽出精製キット（ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐ
ｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用
いてＤＮＡを回収し、精製した。このプラスミドＤＮＡ
をネガティブコントロールとして使用した。

【０５７７】実施例２４． アンジオポエチン関連タン
パク質４遺伝子のプロモーター活性実施例２３で単離し
たＤＮＡのプロモーター活性について評価するため、レ
ポーターアッセイを実施した。すなわち、実施例２３で
構築したホタルルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＧＬ
１１−４またはｐＧＬ１２−４）を、サル腎臓由来細胞
株ＣＯＳ１にトランスフェクションして、ホタルルシフ
ェラーゼ活性の変化を調べた。なお、細胞へのトランス
フェクション効率についての各プラスミド間の実験ロッ
ト差を補正するための内部標準として、ウミシイタケル
シフェラーゼ発現プラスミドｐＲＬ−ＴＫ（プロメガ社
製）を用いた。

【０５７８】まず、ＣＯＳ１細胞（アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（American Type Culture
Collection：ＡＴＣＣ）より購入）を、１０％ウシ胎児
血清（ギブコ・ビーアールエル社製）およびペニシリン
／ストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ培地（ギブコ・
ビーアールエル社製、Ｃａｔｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒ１１
９６５−０９２）中で、３７℃で５％炭酸ガスのインキ
ュベーター内で培養した。２４穴培養プレート（コーニ
ング社製）でセミコンフルエント（semi-confluent）に
なるまで増殖させ、０．２μｇのｐＧＬ３−Ｂａｓｉ
ｃ、ｐＧＬ１１−４、あるいはｐＧＬ１２−４ ＤＮＡ
と６ｎｇのｐＲＬ−ＴＫ ＤＮＡを混合して、滅菌水で
全量を５μｌとしてＤＮＡ溶液とした。一方、２０μｌ
のウシ胎児血清を含まないＤ−ＭＥＭ培地（その他の成
分は上記と同様）に１μｌのトランスフェクション試薬
（ＦｕＧＥＮＥ６、ロシュ社製）を添加し軽く攪拌した
後、この溶液に先に調製したＤＮＡサンプルを添加し、
室温で１５分間保温した。ＤＮＡ溶液を３ウエルへ添加
して、３７℃で二晩培養した。培養後、培地を除去し、
２５０μｌ／ウエルの細胞溶解剤（Passive Lysis Buff
er（プロメガ社製））に溶解して、細胞抽出液を調製し
た。そして、そのうちの２０μｌを用いて、デュアル−
ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム（プ
ロメガ社製）を、添付のプロトコールに従って用いるこ
とにより、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活
性を測定した（ルミナスＣＴ−９０００Ｄ、ダイアヤト
ロン社製を使用）。実験結果については、内部標準のウ
ミシイタケルシフェラーゼ活性で補正したホタルルシフ
ェラーゼ活性とし、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃコントロール
を１とした時の相対値で表した。

【０５７９】その結果、ｐＧＬ１１−４を導入したＣＯ
Ｓ１細胞では、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃを導入した細胞に
比べて約３０倍のルシフェラーゼ活性が観察されたこと
から、ｐＧＬ１１−４に組み込まれた配列表の配列番号
２８に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡにはプ
ロモーターとしての活性が存在することが明らかとなっ
た。一方、ｐＧＬ１２−４を導入した細胞では、ｐＧＬ
３−Ｂａｓｉｃを導入した細胞に対して約１．７倍のル
シフェラーゼ活性を示すにとどまった。その結果を表１
３に示した。以上の結果より、配列表の配列番号２８の
ヌクレオチド番号１乃至２６０に示されるＤＮＡ、すな
わちマウス「アンジオポエチン関連タンパク質４」遺伝
子の５'末端側上流−９０乃至＋１７０に相当する領域
にプロモーター活性が存在することが明らかとなった。
なお、表中（Ｍｅａｎ±ＳＤ）はルシフェラーゼ活性の
平均値と標準偏差を意味する。

【０５８０】

【表１３】 ――――――――――――――――――――――――――――――――― ルシフェラーゼ活性（Ｍｅａｎ±ＳＤ） ――――――――――――――――――――――――――――――――― ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ １．０±０．１ ｐＧＬ１１−４ ３０．３±５．３ ｐＧＬ１２−４ １．７±０．２ ――――――――――――――――――――――――――――――――― 本実施例の方法において、例えばｐＧＬ１１−４で形質
転換したＣＯＳ１細胞を被験物質存在下で培養したとき
のルシフェラーゼ活性を測定することにより、本発明の
ＤＮＡのプロモーター活性を阻害する物質の試験を行う
ことができる。このプロモーター活性を阻害する物質
は、高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される一
つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤となりう
る。

【０５８１】

【発明の効果】 以上述べたように、本発明により、配
列表の配列番号１のヌクレオチド番号４７から１４１１
に示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号３
のヌクレオチド番号７８から１４５７に示されるヌクレ
オチド配列からなる遺伝子が、高脂血症、動脈硬化およ
び高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾患に関
与する遺伝的素因の一つであり、従って該遺伝子の発現
量を抑制する物質が高脂血症、動脈硬化および高血糖か
ら選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予
防剤となり得ることが確かめられた。すなわち、本発明
の方法、該方法のうち核酸の検出を行う態様においてプ
ローブまたはプライマーとして使用されるポリヌクレオ
チドおよび同じくポリペプチドの検出を行う態様におい
て使用される抗体は、高脂血症、動脈硬化および高血糖
から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または
予防剤の探索に有用である。また、本発明のポリペプチ
ドが血中中性脂肪濃度を上昇させる活性を有すること、
該活性は融合タンパク質の形状でも保持され得ること、
さらに本発明のポリペプチドがＬＰＬ活性の阻害効果を
有すること、および本発明のポリペプチドを用いること
により高脂血症、動脈硬化および高血糖から選択される
一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防剤の試験を
イン・ビボ、イン・ビトロのいずれにおいても実施でき
ることが示された。

【０５８２】さらに、本発明により、プロモーター活性
を有する新規ＤＮＡが提供された。本発明のＤＮＡは、
「アンジオポエチン関連タンパク質３」または「アンジ
オポエチン関連タンパク質４」の発現量を抑制する物質
を試験するための方法に用いることができるので、新し
い作用機作を有する高脂血症、動脈硬化および高血糖か
ら選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予
防剤の開発に有用である。

【配列表フリーテキスト】配列番号９： ポリクローナ
ル抗体を取得するための抗原として使用された合成オリ
ゴペプチド 配列番号１１： ヒト・「アンジオポエチン関連タンパ
ク質３」のアミノ末端側領域をコードするＤＮＡ 配列番号１２： ヒト・「アンジオポエチン関連タンパ
ク質３」のアミノ末端側領域をコードするポリペプチド
のアミノ酸配列 配列番号１３： ヒト・「アンジオポエチン関連タンパ
ク質３」のカルボキシル末端側領域をコードするペプチ
ドのポリペプチドのＤＮＡ配列 配列番号１４： ヒト・「アンジオポエチン関連タンパ
ク質３」のカルボキシル末端側領域をコードするポリペ
プチドのアミノ酸配列 配列番号２５： ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓをコードす
るＤＮＡ 配列番号２６： ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓのアミノ酸
配列 配列番号４２： コザックのコンセンサス配列が付加さ
れたＰＣＲプライマー 配列番号４３： 制限酵素ＸｈｏＩの特異的配列が付加
されたＰＣＲプライマー 配列番号４４： ＧＳＴ−ＣＣ、ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌ及
びＧＳＴ−Ｃ１の一部をコードするＤＮＡを増幅するた
めのＰＣＲセンスプライマー 配列番号４５： ＧＳＴ−ＣＣの一部をコードするＤＮ
Ａを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー 配列番号４６： ＧＳＴ−ＣＣｄｅｌの一部をコードす
るＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマ
ー 配列番号４７： ＧＳＴ−Ｃ１の一部をコードするＤＮ
Ａを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー 配列番号４８： ヒスチジンタグをコードする配列を挿
入するためのオリゴヌクレオチド 配列番号４９： ヒスチジンタグをコードする配列を挿
入するためのオリゴヌクレオチド 配列番号５０： プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５
／Ｈｉｓの部分断片を増幅するためのセンス／アンチセ
ンスプライマー 配列番号５１： ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎの一部をコードす
るＤＮＡを増幅するためのＰＣＲセンスプライマー 配列番号５２： ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｎの一部をコードす
るＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマ
ー 配列番号５５： ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌの一部をコ
ードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲセンスプライマ
ー 配列番号５６： ＧＳＴ−ＡＲＰ４Ｆｕｌｌの一部をコ
ードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲアンチセンスプ
ライマー 配列番号５７： シークエンシングプライマー -21M13
forward 配列番号５８： シークエンシングプライマー M13rev
erse 配列番号５９： ＰＣＲプライマー１ 配列番号６０： ＰＣＲプライマー２ 配列番号６１： プラスミドｐＧＬ１３−１の挿入断片
を調製するためのオリゴヌクレオチド 配列番号６２： プラスミドｐＧＬ１３−１の挿入断片
を調製するためのオリゴヌクレオチド 配列番号６３： 制限酵素ＫｐｎＩに特異的な配列を付
加したＰＣＲセンスプライマー。 配列番号６４： 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩに特異的な配
列を付加したＰＣＲアンチセンスプライマー。 配列番号６５： 制限酵素ＫｐｎＩに特異的な配列を付
加したＰＣＲセンスプライマー。 配列番号６６： 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩに特異的な配
列を付加したＰＣＲアンチセンスプライマー。

【０５８３】

【配列表】SEQUENCE LISTING<110> Sankyo Company, Li
mited <120> Methods of testing therapeutic or preventive
agents for hyperlipidemia. <130> 2002036SM <140> <141> <150>JP2001/173758 <151>2001-6-8 <150>JP2001/178548 <151>2001-6-13 <150>JP2001/213334 <151>2001-7-13 <150>JP2001/300715 <151>2001-9-28 <150>JP2001/300716 <151>2001-9-28 <150>JP2001/357037 <151>2001-11-22 <150>JP2001/384103 <151>2001-12-18 <150>JP2002/103583 <151>2001-4-5 <160> 66 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1604 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (47)..(1411) <400> 1 ggcacgaggt tccaaattgc ttaaaattga ataattgaga caaaaa atg cac aca 55 Met His Thr 1 att aaa tta ttc ctt ttt gtt gtt cct tta gta att gca tcc aga gtg 103 Ile Lys Leu Phe Leu Phe Val Val Pro Leu Val Ile Ala Ser Arg Val 5 10 15 gat cca gac ctt tca tca ttt gat tct gca cct tca gag cca aaa tca 151 Asp Pro Asp Leu Ser Ser Phe Asp Ser Ala Pro Ser Glu Pro Lys Ser 20 25 30 35 aga ttt gct atg ttg gat gat gtc aaa att tta gcg aat ggc ctc ctg 199 Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn Gly Leu Leu 40 45 50 cag ctg ggt cat gga ctt aaa gat ttt gtc cat aag act aag gga caa 247 Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr Lys Gly Gln 55 60 65 att aac gac ata ttt cag aag ctc aac ata ttt gat cag tct ttt tat 295 Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln Ser Phe Tyr 70 75 80 gac cta tca ctt cga acc aat gaa atc aaa gaa gag gaa aag gag cta 343 Asp Leu Ser Leu Arg Thr Asn Glu Ile Lys Glu Glu Glu Lys Glu Leu 85 90 95 aga aga act aca tct aca cta caa gtt aaa aac gag gag gtg aag aac 391 Arg Arg Thr Thr Ser Thr Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu Val Lys Asn 100 105 110 115 atg tca gta gaa ctg aac tca aag ctt gag agt ctg ctg gaa gag aag 439 Met Ser Val Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu Glu Glu Lys 120 125 130 aca gcc ctt caa cac aag gtc agg gct ttg gag gag cag cta acc aac 487 Thr Ala Leu Gln His Lys Val Arg Ala Leu Glu Glu Gln Leu Thr Asn 135 140 145 tta att cta agc cca gct ggg gct cag gag cac cca gaa gta aca tca 535 Leu Ile Leu Ser Pro Ala Gly Ala Gln Glu His Pro Glu Val Thr Ser 150 155 160 ctc aaa agt ttt gta gaa cag caa gac aac agc ata aga gaa ctc ctc 583 Leu Lys Ser Phe Val Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ile Arg Glu Leu Leu 165 170 175 cag agt gtg gaa gaa cag tat aaa caa tta agt caa cag cac atg cag 631 Gln Ser Val Glu Glu Gln Tyr Lys Gln Leu Ser Gln Gln His Met Gln 180 185 190 195 ata aaa gaa ata gaa aag cag ctc aga aag act ggt att caa gaa ccc 679 Ile Lys Glu Ile Glu Lys Gln Leu Arg Lys Thr Gly Ile Gln Glu Pro 200 205 210 tca gaa aat tct ctt tct tct aaa tca aga gca cca aga act act ccc 727 Ser Glu Asn Ser Leu Ser Ser Lys Ser Arg Ala Pro Arg Thr Thr Pro 215 220 225 cct ctt caa ctg aac gaa aca gaa aat aca gaa caa gat gac ctt cct 775 Pro Leu Gln Leu Asn Glu Thr Glu Asn Thr Glu Gln Asp Asp Leu Pro 230 235 240 gcc gac tgc tct gcc gtt tat aac aga ggc gaa cat aca agt ggc gtg 823 Ala Asp Cys Ser Ala Val Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Val 245 250 255 tac act att aaa cca aga aac tcc caa ggg ttt aat gtc tac tgt gat 871 Tyr Thr Ile Lys Pro Arg Asn Ser Gln Gly Phe Asn Val Tyr Cys Asp 260 265 270 275 acc caa tca ggc agt cca tgg aca tta att caa cac cgg aaa gat ggc 919 Thr Gln Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Lys Asp Gly 280 285 290 tca cag gac ttc aac gaa aca tgg gaa aac tac gaa aag ggc ttt ggg 967 Ser Gln Asp Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Glu Lys Gly Phe Gly 295 300 305 agg ctc gat gga gaa ttt tgg ttg ggc cta gag aag atc tat gct ata 1015 Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ala Ile 310 315 320 gtc caa cag tct aac tac att tta cga ctc gag cta caa gac tgg aaa 1063 Val Gln Gln Ser Asn Tyr Ile Leu Arg Leu Glu Leu Gln Asp Trp Lys 325 330 335 gac agc aag cac tac gtt gaa tac tcc ttt cac ctg ggc agt cac gaa 1111 Asp Ser Lys His Tyr Val Glu Tyr Ser Phe His Leu Gly Ser His Glu 340 345 350 355 acc aac tac acg cta cat gtg gct gag att gct ggc aat atc cct ggg 1159 Thr Asn Tyr Thr Leu His Val Ala Glu Ile Ala Gly Asn Ile Pro Gly 360 365 370 gcc ctc cca gag cac aca gac ctg atg ttt tct aca tgg aat cac aga 1207 Ala Leu Pro Glu His Thr Asp Leu Met Phe Ser Thr Trp Asn His Arg 375 380 385 gca aag gga cag ctc tac tgt cca gaa agt tac tca ggt ggc tgg tgg 1255 Ala Lys Gly Gln Leu Tyr Cys Pro Glu Ser Tyr Ser Gly Gly Trp Trp 390 395 400 tgg aat gac ata tgt gga gaa aac aac cta aat gga aaa tac aac aaa 1303 Trp Asn Asp Ile Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys 405 410 415 ccc aga acc aaa tcc aga cca gag aga aga aga ggg atc tac tgg aga 1351 Pro Arg Thr Lys Ser Arg Pro Glu Arg Arg Arg Gly Ile Tyr Trp Arg 420 425 430 435 cct cag agc aga aag ctc tat gct atc aaa tca tcc aaa atg atg ctc 1399 Pro Gln Ser Arg Lys Leu Tyr Ala Ile Lys Ser Ser Lys Met Met Leu 440 445 450 cag ccc acc acc taagaagctt caactgaact gagacaaaat aaaagatcaa 1451 Gln Pro Thr Thr 455 taaattaaat attaaagtcc tcccgatcac tgtagtaatc tggtattaaa attttaatgg 1511 aaagcttgag aattgaattt caattaggtt taaactcatt gttaagatca gatatcaccg 1571 aatcaacgta aacaaaattt atctttttca atc 1604 <210> 2 <211> 455 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met His Thr Ile Lys Leu Phe Leu Phe Val Val Pro Leu Val Ile Ala 1 5 10 15 Ser Arg Val Asp Pro Asp Leu Ser Ser Phe Asp Ser Ala Pro Ser Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Arg Thr Asn Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Ser Thr Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Val Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Thr Ala Leu Gln His Lys Val Arg Ala Leu Glu Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Asn Leu Ile Leu Ser Pro Ala Gly Ala Gln Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Ser Phe Val Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ile Arg 165 170 175 Glu Leu Leu Gln Ser Val Glu Glu Gln Tyr Lys Gln Leu Ser Gln Gln 180 185 190 His Met Gln Ile Lys Glu Ile Glu Lys Gln Leu Arg Lys Thr Gly Ile 195 200 205 Gln Glu Pro Ser Glu Asn Ser Leu Ser Ser Lys Ser Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Pro Leu Gln Leu Asn Glu Thr Glu Asn Thr Glu Gln Asp 225 230 235 240 Asp Leu Pro Ala Asp Cys Ser Ala Val Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255 Ser Gly Val Tyr Thr Ile Lys Pro Arg Asn Ser Gln Gly Phe Asn Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Thr Gln Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 275 280 285 Lys Asp Gly Ser Gln Asp Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Glu Lys 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Ala Ile Val Gln Gln Ser Asn Tyr Ile Leu Arg Leu Glu Leu Gln 325 330 335 Asp Trp Lys Asp Ser Lys His Tyr Val Glu Tyr Ser Phe His Leu Gly 340 345 350 Ser His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Val Ala Glu Ile Ala Gly Asn 355 360 365 Ile Pro Gly Ala Leu Pro Glu His Thr Asp Leu Met Phe Ser Thr Trp 370 375 380 Asn His Arg Ala Lys Gly Gln Leu Tyr Cys Pro Glu Ser Tyr Ser Gly 385 390 395 400 Gly Trp Trp Trp Asn Asp Ile Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 405 410 415 Tyr Asn Lys Pro Arg Thr Lys Ser Arg Pro Glu Arg Arg Arg Gly Ile 420 425 430 Tyr Trp Arg Pro Gln Ser Arg Lys Leu Tyr Ala Ile Lys Ser Ser Lys 435 440 445 Met Met Leu Gln Pro Thr Thr 450 455 <210> 3 <211> 1716 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (78)..(1457) <400> 3 gcggccgcgt cgacgtctag gtctgcttcc agaagaaaac agttccacgt tgcttgaaat 60 tgaaaatcaa gataaaa atg ttc aca att aag ctc ctt ctt ttt att gtt 110 Met Phe Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe Ile Val 1 5 10 cct cta gtt att tcc tcc aga att gat caa gac aat tca tca ttt gat 158 Pro Leu Val Ile Ser Ser Arg Ile Asp Gln Asp Asn Ser Ser Phe Asp 15 20 25 tct cta tct cca gag cca aaa tca aga ttt gct atg tta gac gat gta 206 Ser Leu Ser Pro Glu Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val 30 35 40 aaa att tta gcc aat ggc ctc ctt cag ttg gga cat ggt ctt aaa gac 254 Lys Ile Leu Ala Asn Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp 45 50 55 ttt gtc cat aag acg aag ggc caa att aat gac ata ttt caa aaa ctc 302 Phe Val His Lys Thr Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu 60 65 70 75 aac ata ttt gat cag tct ttt tat gat cta tcg ctg caa acc agt gaa 350 Asn Ile Phe Asp Gln Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu 80 85 90 atc aaa gaa gaa gaa aag gaa ctg aga aga act aca tat aaa cta caa 398 Ile Lys Glu Glu Glu Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln 95 100 105 gtc aaa aat gaa gag gta aag aat atg tca ctt gaa ctc aac tca aaa 446 Val Lys Asn Glu Glu Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys 110 115 120 ctt gaa agc ctc cta gaa gaa aaa att cta ctt caa caa aaa gtg aaa 494 Leu Glu Ser Leu Leu Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys 125 130 135 tat tta gaa gag caa cta act aac tta att caa aat caa cct gaa act 542 Tyr Leu Glu Glu Gln Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr 140 145 150 155 cca gaa cac cca gaa gta act tca ctt aaa act ttt gta gaa aaa caa 590 Pro Glu His Pro Glu Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gln 160 165 170 gat aat agc atc aaa gac ctt ctc cag acc gtg gaa gac caa tat aaa 638 Asp Asn Ser Ile Lys Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp Gln Tyr Lys 175 180 185 caa tta aac caa cag cat agt caa ata aaa gaa ata gaa aat cag ctc 686 Gln Leu Asn Gln Gln His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu 190 195 200 aga agg act agt att caa gaa ccc aca gaa att tct cta tct tcc aag 734 Arg Arg Thr Ser Ile Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys 205 210 215 cca aga gca cca aga act act ccc ttt ctt cag ttg aat gaa ata aga 782 Pro Arg Ala Pro Arg Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg 220 225 230 235 aat gta aaa cat gat ggc att cct gct gaa tgt acc acc att tat aac 830 Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn 240 245 250 aga ggt gaa cat aca agt ggc atg tat gcc atc aga ccc agc aac tct 878 Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser 255 260 265 caa gtt ttt cat gtc tac tgt gat gtt ata tca ggt agt cca tgg aca 926 Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr 270 275 280 tta att caa cat cga ata gat gga tca caa aac ttc aat gaa acg tgg 974 Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp 285 290 295 gag aac tac aaa tat ggt ttt ggg agg ctt gat gga gaa ttt tgg ttg 1022 Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu 300 305 310 315 ggc cta gag aag ata tac tcc ata gtg aag caa tct aat tat gtt tta 1070 Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu 320 325 330 cga att gag ttg gaa gac tgg aaa gac aac aaa cat tat att gaa tat 1118 Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr 335 340 345 tct ttt tac ttg gga aat cac gaa acc aac tat acg cta cat cta gtt 1166 Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val 350 355 360 gcg att act ggc aat gtc ccc aat gca atc ccg gaa aac aaa gat ttg 1214 Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu 365 370 375 gtg ttt tct act tgg gat cac aaa gca aaa gga cac ttc aac tgt cca 1262 Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro 380 385 390 395 gag ggt tat tca gga ggc tgg tgg tgg cat gat gag tgt gga gaa aac 1310 Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn 400 405 410 aac cta aat ggt aaa tat aac aaa cca aga gca aaa tct aag cca gag 1358 Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu 415 420 425 agg aga aga gga tta tct tgg aag tct caa aat gga agg tta tac tct 1406 Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser 430 435 440 ata aaa tca acc aaa atg ttg atc cat cca aca gat tca gaa agc ttt 1454 Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe 445 450 455 gaa tgaactgagg caaatttaaa aggcaataat ttaaacatta acctcattcc 1507 Glu 460 aagttaatgt ggtctaataa tctggtatta aatccttaag agaaagcttg agaaatagat 1567 tttttttatc ttaaagtcac tgtctattta agattaaaca tacaatcaca taaccttaaa 1627 gaataccgtt tacatttctc aatcaaaatt cttataatac tatttgtttt aaattttgtg 1687 atgtgggaat caattttaga tggtcacaa 1716 <210> 4 <211> 460 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Phe Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe Ile Val Pro Leu Val Ile Ser 1 5 10 15 Ser Arg Ile Asp Gln Asp Asn Ser Ser Phe Asp Ser Leu Ser Pro Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr Pro Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gln Asp Asn Ser Ile Lys 165 170 175 Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp Gln Tyr Lys Gln Leu Asn Gln Gln 180 185 190 His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg Thr Ser Ile 195 200 205 Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 225 230 235 240 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 275 280 285 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 325 330 335 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 340 345 350 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 355 360 365 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 370 375 380 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 385 390 395 400 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 405 410 415 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 420 425 430 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 435 440 445 Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 450 455 460 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 gactgatcaa atatgttgag ctt 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 tgcatccaga gtggatccag a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tcctctagtt atttcctcca g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tggtttgcca gcgatagatc 20 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Syntheti
c oligopeptide which is used as an antigen to obtain polyclonal antibody <400> 9 Glu Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Cys 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 1417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA enco
ding N-terminal domain of human angiopietin related protein 3 <220> <221> CDS <222> (18)..(638) <400> 11 gaattcggct tgccacc atg gtc aca att aag ctc ctt ctt ttt att gtt 50 Met Val Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe Ile Val 1 5 10 cct cta gtt att tcc tcc aga att gat caa gac aat tca tca ttt gat 98 Pro Leu Val Ile Ser Ser Arg Ile Asp Gln Asp Asn Ser Ser Phe Asp 15 20 25 tct cta tct cca gag cca aaa tca aga ttt gct atg tta gac gat gta 146 Ser Leu Ser Pro Glu Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val 30 35 40 aaa att tta gcc aat ggc ctc ctt cag ttg gga cat ggt ctt aaa gac 194 Lys Ile Leu Ala Asn Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp 45 50 55 ttt gtc cat aag acg aag ggc caa att aat gac ata ttt caa aaa ctc 242 Phe Val His Lys Thr Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu 60 65 70 75 aac ata ttt gat cag tct ttt tat gat cta tcg ctg caa acc agt gaa 290 Asn Ile Phe Asp Gln Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu 80 85 90 atc aaa gaa gaa gaa aag gaa ctg aga aga act aca tat aaa cta caa 338 Ile Lys Glu Glu Glu Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln 95 100 105 gtc aaa aat gaa gag gta aag aat atg tca ctt gaa ctc aac tca aaa 386 Val Lys Asn Glu Glu Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys 110 115 120 ctt gaa agc ctc cta gaa gaa aaa att cta ctt caa caa aaa gtg aaa 434 Leu Glu Ser Leu Leu Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys 125 130 135 tat tta gaa gag caa cta act aac tta att caa aat caa cct gaa act 482 Tyr Leu Glu Glu Gln Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr 140 145 150 155 cca gaa cac cca gaa gta act tca ctt aaa act ttt gta gaa aaa caa 530 Pro Glu His Pro Glu Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gln 160 165 170 gat aat agc atc aaa gac ctt ctc cag acc gtg gaa gac caa tat aaa 578 Asp Asn Ser Ile Lys Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp Gln Tyr Lys 175 180 185 caa tta aac caa cag cat agt caa ata aaa gaa ata gaa aat cag ctc 626 Gln Leu Asn Gln Gln His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu 190 195 200 aga agg act agc tagtattcaa gaacccacag aaatttctct atcttccaag 678 Arg Arg Thr Ser 205 ccaagagcac caagaactac tccctttctt cagttgaatg aaataagaaa tgtaaaacat 738 gatggcattc ctgctgaatg taccaccatt tataacagag gtgaacatac aagtggcatg 798 tatgccatca gacccagcaa ctctcaagtt tttcatgtct actgtgatgt tatatcaggt 858 agtccatgga cattaattca acatcgaata gatggatcac aaaacttcaa tgaaacgtgg 918 gagaactaca aatatggttt tgggaggctt gatggagaat tttggttggg cctagagaag 978 atatactcca tagtgaagca atctaattat gttttacgaa ttgagttgga agactggaaa 1038 gacaacaaac attatattga atattctttt tacttgggaa atcacgaaac caactatacg 1098 ctacatctag ttgcgattac tggcaatgtc cccaatgcaa tcccggaaaa caaagatttg 1158 gtgttttcta cttgggatca caaagcaaaa ggacacttca actgtccaga gggttattca 1218 ggaggctggt ggtggcatga tgagtgtgga gaaaacaacc taaatggtaa atataacaaa 1278 ccaagagcaa aatctaagcc agagaggaga agaggattat cttggaagtc tcaaaatgga 1338 aggttatact ctataaaatc aaccaaaatg ttgatccatc caacagattc agaaagcttt 1398 gaatgaacga ggctctaga 1417 <210> 12 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Polypept
ide encodingN-terminal domain of human angiopietin
related protein 3 <400> 12 Met Val Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe Ile Val Pro Leu Val Ile Ser 1 5 10 15 Ser Arg Ile Asp Gln Asp Asn Ser Ser Phe Asp Ser Leu Ser Pro Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr Pro Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gln Asp Asn Ser Ile Lys 165 170 175 Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp Gln Tyr Lys Gln Leu Asn Gln Gln 180 185 190 His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg Thr Ser 195 200 205 <210> 13 <211> 858 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA enco
dingC-terminal domain of human angiopoietin relate
d protein 3 <220> <221> CDS <222> (18)..(842) <400> 13 gaattcggct tgccacc atg gtc aca att aag ctc ctt ctt ttt att gtt 50 Met Val Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe Ile Val 1 5 10 cct cta gtt att tcc tcc aga att gat cct agt att caa gaa ccc aca 98 Pro Leu Val Ile Ser Ser Arg Ile Asp Pro Ser Ile Gln Glu Pro Thr 15 20 25 gaa att tct cta tct tcc aag cca aga gca cca aga act act ccc ttt 146 Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg Thr Thr Pro Phe 30 35 40 ctt cag ttg aat gaa ata aga aat gta aaa cat gat ggc att cct gct 194 Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro Ala 45 50 55 gaa tgt acc acc att tat aac aga ggt gaa cat aca agt ggc atg tat 242 Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met Tyr 60 65 70 75 gcc atc aga ccc agc aac tct caa gtt ttt cat gtc tac tgt gat gtt 290 Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp Val 80 85 90 ata tca ggt agt cca tgg aca tta att caa cat cga ata gat gga tca 338 Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly Ser 95 100 105 caa aac ttc aat gaa acg tgg gag aac tac aaa tat ggt ttt ggg agg 386 Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly Arg 110 115 120 ctt gat gga gaa ttt tgg ttg ggc cta gag aag ata tac tcc ata gtg 434 Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile Val 125 130 135 aag caa tct aat tat gtt tta cga att gag ttg gaa gac tgg aaa gac 482 Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys Asp 140 145 150 155 aac aaa cat tat att gaa tat tct ttt tac ttg gga aat cac gaa acc 530 Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu Thr 160 165 170 aac tat acg cta cat cta gtt gcg att act ggc aat gtc ccc aat gca 578 Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn Ala 175 180 185 atc ccg gaa aac aaa gat ttg gtg ttt tct act tgg gat cac aaa gca 626 Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys Ala 190 195 200 aaa gga cac ttc aac tgt cca gag ggt tat tca gga ggc tgg tgg tgg 674 Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp Trp 205 210 215 cat gat gag tgt gga gaa aac aac cta aat ggt aaa tat aac aaa cca 722 His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Pro 220 225 230 235 aga gca aaa tct aag cca gag agg aga aga gga tta tct tgg aag tct 770 Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser 240 245 250 caa aat gga agg tta tac tct ata aaa tca acc aaa atg ttg atc cat 818 Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His 255 260 265 cca aca gat tca gaa agc ttt gaa tgaacgaggc tctaga 858 Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 270 275 <210> 14 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Polypept
ide encodingC-terminal domain of human angiopoieti
n related protein 3 <400> 14 Met Val Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe Ile Val Pro Leu Val Ile Ser 1 5 10 15 Ser Arg Ile Asp Pro Ser Ile Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser 20 25 30 Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu 35 40 45 Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile 50 55 60 Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser 65 70 75 80 Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu 100 105 110 Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe 115 120 125 Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr 130 135 140 Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile 145 150 155 160 Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His 165 170 175 Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys 180 185 190 Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn 195 200 205 Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly 210 215 220 Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys 225 230 235 240 Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu 245 250 255 Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu 260 265 270 Ser Phe Glu 275 <210> 15 <211> 1943 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (173)..(1393) <400> 15 ggagaagaag ccgagctgag cggatcctca cacgactgtg atccgattct ttccagcggc 60 ttctgcaacc aagcgggtct tacccccggt cctccgcgtc tccagtcctc gcacctggaa 120 ccccaacgtc cccgagagtc cccgaatccc cgctcccagg ctacctaaga gg atg agc 178 Met Ser 1 ggt gct ccg acg gcc ggg gca gcc ctg atg ctc tgc gcc gcc acc gcc 226 Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala Thr Ala 5 10 15 gtg cta ctg agc gct cag ggc gga ccc gtg cag tcc aag tcg ccg cgc 274 Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser Pro Arg 20 25 30 ttt gcg tcc tgg gac gag atg aat gtc ctg gcg cac gga ctc ctg cag 322 Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu Leu Gln 35 40 45 50 ctc ggc cag ggg ctg cgc gaa cac gcg gag cgc acc cgc agt cag ctg 370 Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser Gln Leu 55 60 65 agc gcg ctg gag cgg cgc ctg agc gcg tgc ggg tcc gcc tgt cag gga 418 Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys Gln Gly 70 75 80 acc gag ggg tcc acc gac ctc ccg tta gcc cct gag agc cgg gtg gac 466 Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg Val Asp 85 90 95 cct gag gtc ctt cac agc ctg cag aca caa ctc aag gct cag aac agc 514 Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln Asn Ser 100 105 110 agg atc cag caa ctc ttc cac aag gtg gcc cag cag cag cgg cac ctg 562 Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg His Leu 115 120 125 130 gag aag cag cac ctg cga att cag cat ctg caa agc cag ttt ggc ctc 610 Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe Gly Leu 135 140 145 ctg gac cac aag cac cta gac cat gag gtg gcc aag cct gcc cga aga 658 Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala Arg Arg 150 155 160 aag agg ctg ccc gag atg gcc cag cca gtt gac ccg gct cac aat gtc 706 Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His Asn Val 165 170 175 agc cgc ctg cac cgg ctg ccc agg gat tgc cag gag ctg ttc cag gtt 754 Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe Gln Val 180 185 190 ggg gag agg cag agt gga cta ttt gaa atc cag cct cag ggg tct ccg 802 Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly Ser Pro 195 200 205 210 cca ttt ttg gtg aac tgc aag atg acc tca gat gga ggc tgg aca gta 850 Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp Thr Val 215 220 225 att cag agg cgc cac gat ggc tca gtg gac ttc aac cgg ccc tgg gaa 898 Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro Trp Glu 230 235 240 gcc tac aag gcg ggg ttt ggg gat ccc cac ggc gag ttc tgg ctg ggt 946 Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp Leu Gly 245 250 255 ctg gag aag gtg cat agc atc acg ggg gac cgc aac agc cgc ctg gcc 994 Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg Leu Ala 260 265 270 gtg cag ctg cgg gac tgg gat ggc aac gcc gag ttg ctg cag ttc tcc 1042 Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln Phe Ser 275 280 285 290 gtg cac ctg ggt ggc gag gac acg gcc tat agc ctg cag ctc act gca 1090 Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr Ala 295 300 305 ccc gtg gcc ggc cag ctg ggc gcc acc acc gtc cca ccc agc ggc ctc 1138 Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly Leu 310 315 320 tcc gta ccc ttc tcc act tgg gac cag gat cac gac ctc cgc agg gac 1186 Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Arg Asp 325 330 335 aag aac tgc gcc aag agc ctc tct gga ggc tgg tgg ttt ggc acc tgc 1234 Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr Cys 340 345 350 agc cat tcc aac ctc aac ggc cag tac ttc cgc tcc atc cca cag cag 1282 Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro Gln Gln 355 360 365 370 cgg cag aag ctt aag aag gga atc ttc tgg aag acc tgg cgg ggc cgc 1330 Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg Gly Arg 375 380 385 tac tac ccg ctg cag gcc acc acc atg ttg atc cag ccc atg gca gca 1378 Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met Ala Ala 390 395 400 gag gca gcc tcc tag cgtcctggct gggcctggtc ccaggcccac gaaagacggt 1433 Glu Ala Ala Ser 405 gactcttggc tctgcccgag gatgtggccg ttccctgcct gggcaggggc tccaaggagg 1493 ggccatctgg aaacttgtgg acagagaaga agaccacgac tggagaagcc ccctttctga 1553 gtgcaggggg gctgcatgcg ttgcctcctg agatcgaggc tgcaggatat gctcagactc 1613 tagaggcgtg gaccaagggg catggagctt cactccttgc tggccaggga gttggggact 1673 cagagggacc acttggggcc agccagactg gcctcaatgg cggactcagt cacattgact 1733 gacggggacc agggcttgtg tgggtcgaga gcgccctcat ggtgctggtg ctgttgtgtg 1793 taggtcccct ggggacacaa gcaggcgcca atggtatctg ggcggcgtca cagagttctt 1853 ggaataaaag caacctcaga acacttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1913 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1943 <210> 16 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser 20 25 30 Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu 35 40 45 Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser 50 55 60 Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys 65 70 75 80 Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg 85 90 95 Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln 100 105 110 Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg 115 120 125 His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe 130 135 140 Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala 145 150 155 160 Arg Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His 165 170 175 Asn Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe 180 185 190 Gln Val Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly 195 200 205 Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp 210 215 220 Thr Val Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro 225 230 235 240 Trp Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp 245 250 255 Leu Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg 260 265 270 Leu Ala Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln 275 280 285 Phe Ser Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu 290 295 300 Thr Ala Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser 305 310 315 320 Gly Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg 325 330 335 Arg Asp Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly 340 345 350 Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro 355 360 365 Gln Gln Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg 370 375 380 Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met 385 390 395 400 Ala Ala Glu Ala Ala Ser 405 <210> 17 <211> 2066 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 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Ala Lys Lys Cys Ala Tyr Thr Phe Leu Val Pro Glu Gln Arg Ile 45 50 55 60 aca ggg cca atc tgt gtc aac acc aag ggg caa gat gca agt acc att 661 Thr Gly Pro Ile Cys Val Asn Thr Lys Gly Gln Asp Ala Ser Thr Ile 65 70 75 aaa gac atg atc acc agg atg gac ctt gaa aac ctg aag gat gtg ctc 709 Lys Asp Met Ile Thr Arg Met Asp Leu Glu Asn Leu Lys Asp Val Leu 80 85 90 tcc agg cag aag cgg gag ata gat gtt ctg caa ctg gtg gtg gat gta 757 Ser Arg Gln Lys Arg Glu Ile Asp Val Leu Gln Leu Val Val Asp Val 95 100 105 gat gga aac att gtg aat gag gta aag ctg ctg aga aag gaa agc cgt 805 Asp Gly Asn Ile Val Asn Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg 110 115 120 aac atg aac tct cgt gtt act caa ctc tat atg caa tta tta cat gag 853 Asn Met Asn Ser Arg Val Thr Gln Leu Tyr Met Gln Leu Leu His Glu 125 130 135 140 att atc cgt aag agg gat aat tca ctt gaa ctt tcc caa ctg gaa aac 901 Ile Ile Arg Lys Arg Asp Asn Ser Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn 145 150 155 aaa atc ctc aat gtc acc aca gaa atg ttg aag atg gca aca aga tac 949 Lys Ile Leu Asn Val Thr Thr Glu Met Leu Lys Met Ala Thr Arg Tyr 160 165 170 agg gaa cta gag gtg aaa tac gct tcc ttg act gat ctt gtc aat aac 997 Arg Glu Leu Glu Val Lys Tyr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Val Asn Asn 175 180 185 caa tct gtg atg atc act ttg ttg gaa gaa cag tgc ttg agg ata ttt 1045 Gln Ser Val Met Ile Thr Leu Leu Glu Glu Gln Cys Leu Arg Ile Phe 190 195 200 tcc cga caa gac acc cat gtg tct ccc cca ctt gtc cag gtg gtg cca 1093 Ser Arg Gln Asp Thr His Val Ser Pro Pro Leu Val Gln Val Val Pro 205 210 215 220 caa cat att cct aac agc caa cag tat act cct ggt ctg ctg gga ggt 1141 Gln His Ile Pro Asn Ser Gln Gln Tyr Thr Pro Gly Leu Leu Gly Gly 225 230 235 aac gag att cag agg gat cca ggt tat ccc aga gat tta atg cca cca 1189 Asn Glu Ile Gln Arg Asp Pro Gly Tyr Pro Arg Asp Leu Met Pro Pro 240 245 250 cct gat ctg gca act tct ccc acc aaa agc cct ttc aag ata cca ccg 1237 Pro Asp Leu Ala Thr Ser Pro Thr Lys Ser Pro Phe Lys Ile Pro Pro 255 260 265 gta act ttc atc aat gaa gga cca ttc aaa gac tgt cag caa gca aaa 1285 Val Thr Phe Ile Asn Glu Gly Pro Phe Lys Asp Cys Gln Gln Ala Lys 270 275 280 gaa gct ggg cat tcg gtc agt ggg att tat atg att aaa cct gaa aac 1333 Glu Ala Gly His Ser Val Ser Gly Ile Tyr Met Ile Lys Pro Glu Asn 285 290 295 300 agc aat gga cca atg cag tta tgg tgt gaa aac agt ttg gac cct ggg 1381 Ser Asn Gly Pro Met Gln Leu Trp Cys Glu Asn Ser Leu Asp Pro Gly 305 310 315 ggt tgg act gtt att cag aaa aga aca gac ggc tct gtc aac ttc ttc 1429 Gly Trp Thr Val Ile Gln Lys Arg Thr Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe 320 325 330 aga aat tgg gaa aat tat aag aaa ggg ttt gga aac att gac gga gaa 1477 Arg Asn Trp Glu Asn Tyr Lys Lys Gly Phe Gly Asn Ile Asp Gly Glu 335 340 345 tac tgg ctt gga ctg gaa aat atc tat atg ctt agc aat caa gat aat 1525 Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Asn Ile Tyr Met Leu Ser Asn Gln Asp Asn 350 355 360 tac aag tta ttg att gaa tta gaa gac tgg agt gat aaa aaa gtc tat 1573 Tyr Lys Leu Leu Ile Glu Leu Glu Asp Trp Ser Asp Lys Lys Val Tyr 365 370 375 380 gca gaa tac agc agc ttt cgt ctg gaa cct gaa agt gaa ttc tat aga 1621 Ala Glu Tyr Ser Ser Phe Arg Leu Glu Pro Glu Ser Glu Phe Tyr Arg 385 390 395 ctg cgc ctg gga act tac cag gga aat gca ggg gat tct atg atg tgg 1669 Leu Arg Leu Gly Thr Tyr Gln Gly Asn Ala Gly Asp Ser Met Met Trp 400 405 410 cat aat ggt aaa caa ttc acc aca ctg gac aga gat aaa gat atg tat 1717 His Asn Gly Lys Gln Phe Thr Thr Leu Asp Arg Asp Lys Asp Met Tyr 415 420 425 gca gga aac tgc gcc cac ttt cat aaa gga ggc tgg tgg tac aat gcc 1765 Ala Gly Asn Cys Ala His Phe His Lys Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Ala 430 435 440 tgt gca cat tct aac cta aat gga gta tgg tac aga gga ggc cat tac 1813 Cys Ala His Ser Asn Leu Asn Gly Val Trp Tyr Arg Gly Gly His Tyr 445 450 455 460 aga agc aag cac caa gat gga att ttc tgg gcc gaa tac aga ggc ggg 1861 Arg Ser Lys His Gln Asp Gly Ile Phe Trp Ala Glu Tyr Arg Gly Gly 465 470 475 tca tac tcc tta aga gca gtt cag atg atg atc aag cct att gac tga 1909 Ser Tyr Ser Leu Arg Ala Val Gln Met Met Ile Lys Pro Ile Asp 480 485 490 agagagacac tcgccaattt aaatgacaca gaactttgta cttttcagct cttaaaaatg 1969 taaatgttac atgtatatta cttggcacaa tttatttcta cacagaaagt ttttaaaatg 2029 aattttaccg taactataaa agggaaccta taaatgt 2066 <210> 18 <211> 491 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Lys Thr Phe Thr Trp Thr Leu Gly Val Leu Phe Phe Leu Leu Val 1 5 10 15 Asp Thr Gly His Cys Arg Gly Gly Gln Phe Lys Ile Lys Lys Ile Asn 20 25 30 Gln Arg Arg Tyr Pro Arg Ala Thr Asp Gly Lys Glu Glu Ala Lys Lys 35 40 45 Cys Ala Tyr Thr Phe Leu Val Pro Glu Gln Arg Ile Thr Gly Pro Ile 50 55 60 Cys Val Asn Thr Lys Gly Gln Asp Ala Ser Thr Ile Lys Asp Met Ile 65 70 75 80 Thr Arg Met Asp Leu Glu Asn Leu Lys Asp Val Leu Ser Arg Gln Lys 85 90 95 Arg Glu Ile Asp Val Leu Gln Leu Val Val Asp Val Asp Gly Asn Ile 100 105 110 Val Asn Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Asn Met Asn Ser 115 120 125 Arg Val Thr Gln Leu Tyr Met Gln Leu Leu His Glu Ile Ile Arg Lys 130 135 140 Arg Asp Asn Ser Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn Lys Ile Leu Asn 145 150 155 160 Val Thr Thr Glu Met Leu Lys Met Ala Thr Arg Tyr Arg Glu Leu Glu 165 170 175 Val Lys Tyr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Val Asn Asn Gln Ser Val Met 180 185 190 Ile Thr Leu Leu Glu Glu Gln Cys Leu Arg Ile Phe Ser Arg Gln Asp 195 200 205 Thr His Val Ser Pro Pro Leu Val Gln Val Val Pro Gln His Ile Pro 210 215 220 Asn Ser Gln Gln Tyr Thr Pro Gly Leu Leu Gly Gly Asn Glu Ile Gln 225 230 235 240 Arg Asp Pro Gly Tyr Pro Arg Asp Leu Met Pro Pro Pro Asp Leu Ala 245 250 255 Thr Ser Pro Thr Lys Ser Pro Phe Lys Ile Pro Pro Val Thr Phe Ile 260 265 270 Asn Glu Gly Pro Phe Lys Asp Cys Gln Gln Ala Lys Glu Ala Gly His 275 280 285 Ser Val Ser Gly Ile Tyr Met Ile Lys Pro Glu Asn Ser Asn Gly Pro 290 295 300 Met Gln Leu Trp Cys Glu Asn Ser Leu Asp Pro Gly Gly Trp Thr Val 305 310 315 320 Ile Gln Lys Arg Thr Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Arg Asn Trp Glu 325 330 335 Asn Tyr Lys Lys Gly Phe Gly Asn Ile Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly 340 345 350 Leu Glu Asn Ile Tyr Met Leu Ser Asn Gln Asp Asn Tyr Lys Leu Leu 355 360 365 Ile Glu Leu Glu Asp 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Leu His Glu Ile Ile Arg Lys Arg Asp Asn Ala Leu Glu 140 145 150 ctc tcc cag ctg gag aac agg atc ctg aac cag aca gcc gac atg ctg 531 Leu Ser Gln Leu Glu Asn Arg Ile Leu Asn Gln Thr Ala Asp Met Leu 155 160 165 170 cag ctg gcc agc aag tac aag gac ctg gag cac aag tac cag cac ctg 579 Gln Leu Ala Ser Lys Tyr Lys Asp Leu Glu His Lys Tyr Gln His Leu 175 180 185 gcc aca ctg gcc cac aac caa tca gag atc atc gcg cag ctt gag gag 627 Ala Thr Leu Ala His Asn Gln Ser Glu Ile Ile Ala Gln Leu Glu Glu 190 195 200 cac tgc cag agg gtg ccc tcg gcc agg ccc gtc ccc cag cca ccc ccc 675 His Cys Gln Arg Val Pro Ser Ala Arg Pro Val Pro Gln Pro Pro Pro 205 210 215 gct gcc ccg ccc cgg gtc tac caa cca ccc acc tac aac cgc atc atc 723 Ala Ala Pro Pro Arg Val Tyr Gln Pro Pro Thr Tyr Asn Arg Ile Ile 220 225 230 aac cag atc tct acc aac gag atc cag agt gac cag aac ctg aag gtg 771 Asn Gln Ile Ser Thr Asn Glu Ile Gln Ser Asp Gln Asn Leu Lys Val 235 240 245 250 ctg cca ccc cct ctg ccc act atg ccc act ctc acc agc ctc cca tct 819 Leu Pro Pro Pro Leu Pro Thr Met Pro Thr Leu Thr Ser Leu Pro Ser 255 260 265 tcc acc gac aag ccg tcg ggc cca tgg aga gac tgc ctg cag gcc ctg 867 Ser Thr Asp Lys Pro Ser Gly Pro Trp Arg Asp Cys Leu Gln Ala Leu 270 275 280 gag gat ggc cac gac acc agc tcc atc tac ctg gtg aag ccg gag aac 915 Glu Asp Gly His Asp Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Val Lys Pro Glu Asn 285 290 295 acc aac cgc ctc atg cag gtg tgg tgc gac cag aga cac gac ccc ggg 963 Thr Asn Arg Leu Met Gln Val Trp Cys Asp Gln Arg His Asp Pro Gly 300 305 310 ggc tgg acc gtc atc cag aga cgc ctg gat ggc tct gtt aac ttc ttc 1011 Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Leu Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe 315 320 325 330 agg aac tgg gag acg tac aag caa ggg ttt ggg aac att gat ggc gaa 1059 Arg Asn Trp Glu Thr Tyr Lys Gln Gly Phe Gly Asn Ile Asp Gly Glu 335 340 345 tac tgg ctg ggc ctg gag aac att tac tgg ctg acg aac caa ggc aac 1107 Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Asn Ile Tyr Trp Leu Thr Asn Gln Gly Asn 350 355 360 tac aaa ctc ctg gtg acc atg gag gac tgg tcc ggc 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gtg atg atg atc cga ccg aac ccc aac 1491 Ser Tyr Ser Leu Lys Lys Val Val Met Met Ile Arg Pro Asn Pro Asn 475 480 485 490 acc ttc cac taa gccagctccc cctcc 1518 Thr Phe His <210> 20 <211> 493 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Arg Pro Leu Cys Val Thr Cys Trp Trp Leu Gly Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Met Gly Ala Val Ala Gly Gln Glu Asp Gly Phe Glu Gly Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Ser Pro Arg Glu Phe Ile Tyr Leu Asn Arg Tyr Lys Arg Ala Gly 35 40 45 Glu Ser Gln Asp Lys Cys Thr Tyr Thr Phe Ile Val Pro Gln Gln Arg 50 55 60 Val Thr Gly Ala Ile Cys Val Asn Ser Lys Glu Pro Glu Val Leu Leu 65 70 75 80 Glu Asn Arg Val His Lys Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asn Asn Glu Leu 85 90 95 Leu Lys Gln Lys Arg Gln Ile Glu Thr Leu Gln Gln Leu Val Glu Val 100 105 110 Asp Gly Gly Ile Val Ser Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg 115 120 125 Asn Met Asn Ser Arg Val Thr Gln Leu Tyr Met Gln Leu Leu His Glu 130 135 140 Ile Ile Arg Lys Arg Asp Asn Ala Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn 145 150 155 160 Arg Ile Leu Asn Gln 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ctc ctg ctg ggc 289 Met Gly Lys Pro Trp Leu Arg Ala Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 gcg tcg tgg gcg cgg gcg ggc gcc ccg cgc tgc acc tac acc ttc gtg 337 Ala Ser Trp Ala Arg Ala Gly Ala Pro Arg Cys Thr Tyr Thr Phe Val 20 25 30 ctg ccc ccg cag aag ttc acg ggc gct gtg tgc tgg agc ggc ccc gca 385 Leu Pro Pro Gln Lys Phe Thr Gly Ala Val Cys Trp Ser Gly Pro Ala 35 40 45 tcc acg cgg gcg acg ccc gag gcc gcc aac gcc agc gag ctg gcg gcg 433 Ser Thr Arg Ala Thr Pro Glu Ala Ala Asn Ala Ser Glu Leu Ala Ala 50 55 60 ctg cgc atg cgc gtc ggc cgc cac gag gag ctg tta cgc gag ctg cag 481 Leu Arg Met Arg Val Gly Arg His Glu Glu Leu Leu Arg Glu Leu Gln 65 70 75 80 agg ctg gcg gcg gcc gac ggc gcc gtg gcc ggc aag gtg cgc gcg ctg 529 Arg Leu Ala Ala Ala Asp Gly Ala Val Ala Gly Lys Val Arg Ala Leu 85 90 95 cgc aag gag agc cgc ggc ctg agc gcg cgc ctg ggc cag ttg cgc gcg 577 Arg Lys Glu Ser Arg Gly Leu Ser Ala Arg Leu Gly Gln Leu Arg Ala 100 105 110 cag ctg cag cac gag gcg ggg ccc ggg gcg ggc ccg ggg gcg gat ctg 625 Gln Leu Gln His Glu Ala Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Asp Leu 115 120 125 ggg gcg gag cct gcc gcg gcg ctg gcg ctg ctc ggg gag cgc gtg ctc 673 Gly Ala Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly Glu Arg Val Leu 130 135 140 aac gcg tcc gcc gag gct cag cgc gca gcc gcc cgg ttc cac cag ctg 721 Asn Ala Ser Ala Glu Ala Gln Arg Ala Ala Ala Arg Phe His Gln Leu 145 150 155 160 gac gtc aag ttc cgc gag ctg gcg cag ctc gtc acc cag cag agc agt 769 Asp Val Lys Phe Arg Glu Leu Ala Gln Leu Val Thr Gln Gln Ser Ser 165 170 175 ctc atc gcc cgc ctg gag cgc ctg tgc ccg gga ggc gcg ggc ggg cag 817 Leu Ile Ala Arg Leu Glu Arg Leu Cys Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gln 180 185 190 cag cag gtc ctg ccg cca ccc cca ctg gtg cct gtg gtt ccg gtc cgt 865 Gln Gln Val Leu Pro Pro Pro Pro Leu Val Pro Val Val Pro Val Arg 195 200 205 ctt gtg ggt agc acc agt gac acc agt agg atg ctg gac cca gcc cca 913 Leu Val Gly Ser Thr Ser Asp Thr Ser Arg Met Leu Asp Pro Ala Pro 210 215 220 gag ccc cag aga gac cag acc cag aga cag cag gag ccc atg gct tct 961 Glu Pro Gln Arg Asp Gln Thr Gln Arg Gln Gln Glu Pro Met Ala Ser 225 230 235 240 ccc atg cct gca ggt cac cct gcg gtc ccc acc aag cct gtg ggc ccg 1009 Pro Met Pro Ala Gly His Pro Ala Val Pro Thr Lys Pro Val Gly Pro 245 250 255 tgg cag gat tgt gca gag gcc cgc cag gca ggc cat gaa cag agt gga 1057 Trp Gln Asp Cys Ala Glu Ala Arg Gln Ala Gly His Glu Gln Ser Gly 260 265 270 gtg tat gaa ctg cga gtg ggc cgt cac gta gtg tca gta tgg tgt gag 1105 Val Tyr Glu Leu Arg Val Gly Arg His Val Val Ser Val Trp Cys Glu 275 280 285 cag caa ctg gag ggt gga ggc tgg act gtg atc cag cgg agg caa gat 1153 Gln Gln Leu Glu Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Gln Asp 290 295 300 ggt tca gtc aac ttc ttc act acc tgg cag cac tat aag gcg ggc ttt 1201 Gly Ser Val Asn Phe Phe Thr Thr Trp Gln His Tyr Lys Ala Gly Phe 305 310 315 320 ggg cgg cca gac gga gaa tac tgg ctg ggc ctt gaa ccc gtg tat cag 1249 Gly Arg Pro Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Pro Val Tyr Gln 325 330 335 ctg acc agc cgt ggg gac cat gag ctg ctg gtt ctc ctg gag gac tgg 1297 Leu Thr Ser Arg Gly Asp His Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asp Trp 340 345 350 ggg ggc cgt gga gca cgt gcc cac tat gat ggc ttc tcc ctg gaa ccc 1345 Gly Gly Arg Gly Ala Arg Ala His Tyr Asp Gly Phe Ser Leu Glu Pro 355 360 365 gag agc gac cac tac cgc ctg cgg ctt ggc cag tac cat ggt gat gct 1393 Glu Ser Asp His Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Gln Tyr His Gly Asp Ala 370 375 380 gga gac tct ctt tcc tgg cac aat gac aag ccc ttc agc acc gtg gat 1441 Gly Asp Ser Leu Ser Trp His Asn Asp Lys Pro Phe Ser Thr Val Asp 385 390 395 400 agg gac cga gac tcc tat tct ggt aac tgt gcc ctg tac cag cgg gga 1489 Arg Asp Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Ala Leu Tyr Gln Arg Gly 405 410 415 ggc tgg tgg tac cat gcc tgt gcc cac tcc aac ctc aac ggt gtg tgg 1537 Gly Trp Trp Tyr His Ala Cys Ala His Ser Asn Leu Asn Gly Val Trp 420 425 430 cac cac ggc ggc cac tac cga agc cgc tac cag gat ggt gtc tac tgg 1585 His His Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp Gly Val Tyr Trp 435 440 445 gct gag ttt cgt ggt ggg gca tat tct ctc agg aag gcc gcc atg ctc 1633 Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ala Tyr Ser Leu Arg Lys Ala Ala Met Leu 450 455 460 att cgg ccc ctg aag ctg tga ctctgtgttc ctctgtcccc taggccctag 1684 Ile Arg Pro Leu Lys Leu 465 470 aggacattgg tcagcaggag cccaagttgt tctggccaca cnttntttgt ggntcagtgc 1744 caatgtgtcc cacanaantt cccactgtgg atcttgtnac cctgggcgct gaaaatggga 1804 cccaggaatc ccccccgtca atatnttggc ctcanatggc tccccaaggt cattcatatc 1864 tcggtttgag ctcatatntt ataataacac aaagtagccg cgaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1924 aaaaaaa 1931 <210> 22 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Gly Lys Pro Trp Leu Arg Ala Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Trp Ala Arg Ala Gly Ala Pro Arg Cys Thr Tyr Thr Phe Val 20 25 30 Leu Pro Pro Gln Lys Phe Thr Gly Ala Val Cys Trp Ser Gly Pro Ala 35 40 45 Ser Thr Arg Ala Thr Pro Glu Ala Ala Asn Ala Ser Glu Leu Ala Ala 50 55 60 Leu Arg Met Arg Val Gly Arg His Glu Glu Leu Leu Arg Glu Leu Gln 65 70 75 80 Arg Leu Ala Ala Ala Asp Gly Ala Val Ala Gly Lys Val Arg Ala Leu 85 90 95 Arg Lys Glu Ser Arg Gly Leu Ser Ala Arg Leu Gly Gln Leu Arg Ala 100 105 110 Gln Leu Gln His Glu Ala Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Asp Leu 115 120 125 Gly Ala Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly Glu Arg Val Leu 130 135 140 Asn Ala Ser Ala Glu Ala Gln Arg Ala Ala Ala Arg Phe His Gln Leu 145 150 155 160 Asp Val Lys Phe Arg Glu Leu Ala Gln Leu Val Thr Gln Gln Ser Ser 165 170 175 Leu Ile Ala Arg Leu Glu Arg Leu Cys Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gln 180 185 190 Gln Gln Val Leu Pro Pro Pro Pro Leu Val Pro Val Val Pro Val Arg 195 200 205 Leu Val Gly Ser Thr Ser Asp Thr Ser Arg Met Leu Asp Pro Ala Pro 210 215 220 Glu Pro Gln Arg Asp Gln Thr Gln Arg Gln Gln Glu Pro Met Ala Ser 225 230 235 240 Pro Met Pro Ala Gly His Pro Ala Val Pro Thr Lys Pro Val Gly Pro 245 250 255 Trp Gln Asp Cys Ala Glu Ala Arg Gln Ala Gly His Glu Gln Ser Gly 260 265 270 Val Tyr Glu Leu Arg Val Gly Arg His Val Val Ser Val Trp Cys Glu 275 280 285 Gln Gln Leu Glu Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Gln Asp 290 295 300 Gly Ser Val Asn Phe Phe Thr Thr Trp Gln His Tyr Lys Ala Gly Phe 305 310 315 320 Gly Arg Pro Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Pro Val Tyr Gln 325 330 335 Leu Thr Ser Arg Gly Asp His Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asp Trp 340 345 350 Gly Gly Arg Gly Ala Arg Ala His Tyr Asp Gly Phe Ser Leu Glu Pro 355 360 365 Glu Ser Asp His Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Gln Tyr His Gly Asp Ala 370 375 380 Gly Asp Ser Leu Ser Trp His Asn Asp Lys Pro Phe Ser Thr Val Asp 385 390 395 400 Arg Asp Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Ala Leu Tyr Gln Arg Gly 405 410 415 Gly Trp Trp Tyr His Ala Cys Ala His Ser Asn Leu Asn Gly Val Trp 420 425 430 His His Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp Gly Val Tyr Trp 435 440 445 Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ala Tyr Ser Leu Arg Lys Ala Ala Met Leu 450 455 460 Ile Arg Pro Leu Lys Leu 465 470 <210> 23 <211> 2006 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (8)..(1048) <400> 23 acaaaag atg ctg aaa aag cct ctc tca gct gtg acc tgg ctc tgc att 49 Met Leu Lys Lys Pro Leu Ser Ala Val Thr Trp Leu Cys Ile 1 5 10 ttc atc gtg gcc ttt gtc agc cac cca gcg tgg ctg cag aag ctc tct 97 Phe Ile Val Ala Phe Val Ser His Pro Ala Trp Leu Gln Lys Leu Ser 15 20 25 30 aag cac aag aca cca gca cag cca cag ctc aaa gcg gcc aac tgc tgt 145 Lys His Lys Thr Pro Ala Gln Pro Gln Leu Lys Ala Ala Asn Cys Cys 35 40 45 gag gag gtg aag gag ctc aag gcc caa gtt gcc aac ctt agc agc ctg 193 Glu Glu Val Lys Glu Leu Lys Ala Gln Val Ala Asn Leu Ser Ser Leu 50 55 60 ctg agt gaa ctg aac aag aag cag gag agg gac tgg gtc agc gtg gtc 241 Leu Ser Glu Leu Asn Lys Lys Gln Glu Arg Asp Trp Val Ser Val Val 65 70 75 atg cag gtg atg gag ctg gag agc aac agc aag cgc atg gag tcg cgg 289 Met Gln Val Met Glu Leu Glu Ser Asn Ser Lys Arg Met Glu Ser Arg 80 85 90 ctc aca gat gct gag agc aag tac tcc gag atg aac aac caa att gac 337 Leu Thr Asp Ala Glu Ser Lys Tyr Ser Glu Met Asn Asn Gln Ile Asp 95 100 105 110 atc atg cag ctg cag gca gca cag acg gtc act cag acc tcc gca gat 385 Ile Met Gln Leu Gln Ala Ala Gln Thr Val Thr Gln Thr Ser Ala Asp 115 120 125 gcc atc tac gac tgc tct tcc ctc tac cag aag aac tac cgc atc tct 433 Ala Ile Tyr Asp Cys Ser Ser Leu Tyr Gln Lys Asn Tyr Arg Ile Ser 130 135 140 gga gtg tat aag ctt cct cct gat gac ttc ctg ggc agc cct gaa ctg 481 Gly Val Tyr Lys Leu Pro Pro Asp Asp Phe Leu Gly Ser Pro Glu Leu 145 150 155 gag gtg ttc tgt gac atg gag act tca ggc gga ggc tgg acc atc atc 529 Glu Val Phe Cys Asp Met Glu Thr Ser Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile 160 165 170 cag aga cga aaa agt ggc ctt gtc tcc ttc tac cgg gac tgg aag cag 577 Gln Arg Arg Lys Ser Gly Leu Val Ser Phe Tyr Arg Asp Trp Lys Gln 175 180 185 190 tac aag cag ggc ttt ggc agc atc cgt ggg gac ttc tgg ctg ggg aac 625 Tyr Lys Gln Gly Phe Gly Ser Ile Arg Gly Asp Phe Trp Leu Gly Asn 195 200 205 gaa cac atc cac cgg ctc tcc aga cag cca acc cgg ctg cgt gta gag 673 Glu His Ile His Arg Leu Ser Arg Gln Pro Thr Arg Leu Arg Val Glu 210 215 220 atg gag gac tgg gag ggc aac ctg cgc tac gct gag tat agc cac ttt 721 Met Glu Asp Trp Glu Gly Asn Leu Arg Tyr Ala Glu Tyr Ser His Phe 225 230 235 gtt ttg ggc aat gaa ctc aac agc tat cgc ctc ttc ctg ggg aac tac 769 Val Leu Gly Asn Glu Leu Asn Ser Tyr Arg Leu Phe Leu Gly Asn Tyr 240 245 250 act ggc aat gtg ggg aac gac gcc ctc cag tat cat aac aac aca gcc 817 Thr Gly Asn Val Gly Asn Asp Ala Leu Gln Tyr His Asn Asn Thr Ala 255 260 265 270 ttc agc acc aag gac aag gac aat gac aac tgc ttg gac aag tgt gca 865 Phe Ser Thr Lys Asp Lys Asp Asn Asp Asn Cys Leu Asp Lys Cys Ala 275 280 285 cag ctc cgc aaa ggt ggc tac tgg tac aac tgc tgc aca gac tcc aac 913 Gln Leu Arg Lys Gly Gly Tyr Trp Tyr Asn Cys Cys Thr Asp Ser Asn 290 295 300 ctc aat gga gtg tac tac cgc ctg ggt gag cac aat aag cac ctg gat 961 Leu Asn Gly Val Tyr Tyr Arg Leu Gly Glu His Asn Lys His Leu Asp 305 310 315 ggc atc acc tgg tat ggc tgg cat gga tct acc tac tcc ctc aaa cgg 1009 Gly Ile Thr Trp Tyr Gly Trp His Gly Ser Thr Tyr Ser Leu Lys Arg 320 325 330 gtg gag atg aaa atc cgc cca gaa gac ttc aag cct taa aaggaggctg 1058 Val Glu Met Lys Ile Arg Pro Glu Asp Phe Lys Pro 335 340 345 ccgtggagca cggatacaga aactgagaca cgtggagact ggatgagggc agatgaggac 1118 aggaagagag tgttagaaag ggtaggactg agaaacagcc tataatctcc aaagaaagaa 1178 taagtctcca aggagcacaa aaaaatcata tgtaccaagg atgttacagt aaacaggatg 1238 aactatttaa acccactggg tcctgccaca tccttctcaa ggtggtagac tgagtggggt 1298 ctctctgccc aagatccctg acatagcagt agcttgtctt ttccacatga tttgtctgtg 1358 aaagaaaata attttgagat cgttttatct attttctcta cggcttaggc tatgtgaggg 1418 caaaacacaa atccctttgc taaaaagacc catattattt tgattctcaa aggataggcc 1478 tttgagtgtt agagaaagga gtgaaggagc caggtgggaa atggtatttc tatttttaaa 1538 ctccagtgaa attatcttga gtctacacat tatttttaaa acacaaaaat tgttcggctg 1598 gaactgaccc aggctggact tgcggggagg aaactccagg gcactgcatc tggcgatcag 1658 actctgagca ctgcccctgc tcgccttggt catgtacagc actgaaagga atgaggcacc 1718 agcaggaggt ggacagagtc tctcatggat gccggcacaa aactgcctta aaatattcat 1778 agttaataca ggtatatcta tttttattta ctttgtaaga aacaagctca aggagcttcc 1838 ttttaaattt tgtctgtagg aaatggttga aaactgaagg tagatggtgt tatagttaat 1898 aataaatgct gtaaataagc atctcacttt gtaaaaataa aatattgtgg ttttgtttta 1958 aacattcaac gtttcttttc cttctacaat aaacactttc aaaatgtg 2006 <210> 24 <211> 346 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Leu Lys Lys Pro Leu Ser Ala Val Thr Trp Leu Cys Ile Phe Ile 1 5 10 15 Val Ala Phe Val Ser His Pro Ala Trp Leu Gln Lys Leu Ser Lys His 20 25 30 Lys Thr Pro Ala Gln Pro Gln Leu Lys Ala Ala Asn Cys Cys Glu Glu 35 40 45 Val Lys Glu Leu Lys Ala Gln Val Ala Asn Leu Ser Ser Leu Leu Ser 50 55 60 Glu Leu Asn Lys Lys Gln Glu Arg Asp Trp Val Ser Val Val Met Gln 65 70 75 80 Val Met Glu Leu Glu Ser Asn Ser Lys Arg Met Glu Ser Arg Leu Thr 85 90 95 Asp Ala Glu Ser Lys Tyr Ser Glu Met Asn Asn Gln Ile Asp Ile Met 100 105 110 Gln Leu Gln Ala Ala Gln Thr Val Thr Gln Thr Ser Ala Asp Ala Ile 115 120 125 Tyr Asp Cys Ser Ser Leu Tyr Gln Lys Asn Tyr Arg Ile Ser Gly Val 130 135 140 Tyr Lys Leu Pro Pro Asp Asp Phe Leu Gly Ser Pro Glu Leu Glu Val 145 150 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Sequence: DNA enco
dingKhAP5 CC/His <220> <221> CDS <222> (18)..(662) <400> 25 gaattcggct tgccacc atg gtc aca att aag ctc ctt ctt ttt att gtt 50 Met Val Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe Ile Val 1 5 10 cct cta gtt att tcc tcc aga att gat cag cat cat cac cat cac cac 98 Pro Leu Val Ile Ser Ser Arg Ile Asp Gln His His His His His His 15 20 25 gat caa gac aat tca tca ttt gat tct cta tct cca gag cca aaa tca 146 Asp Gln Asp Asn Ser Ser Phe Asp Ser Leu Ser Pro Glu Pro Lys Ser 30 35 40 aga ttt gct atg tta gac gat gta aaa att tta gcc aat ggc ctc ctt 194 Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn Gly Leu Leu 45 50 55 cag ttg gga cat ggt ctt aaa gac ttt gtc cat aag acg aag ggc caa 242 Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr Lys Gly Gln 60 65 70 75 att aat gac ata ttt caa aaa ctc aac ata ttt gat cag tct ttt tat 290 Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln Ser Phe Tyr 80 85 90 gat cta tcg ctg caa acc agt gaa atc aaa gaa gaa gaa aag gaa ctg 338 Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu Ile Lys Glu Glu Glu Lys Glu Leu 95 100 105 aga aga act aca tat aaa cta caa gtc aaa aat gaa gag gta aag aat 386 Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu Val Lys Asn 110 115 120 atg tca ctt gaa ctc aac tca aaa ctt gaa agc ctc cta gaa gaa aaa 434 Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu Glu Glu Lys 125 130 135 att cta ctt caa caa aaa gtg aaa tat tta gaa gag caa cta act aac 482 Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gln Leu Thr Asn 140 145 150 155 tta att caa aat caa cct gaa act cca gaa cac cca gaa gta act tca 530 Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr Pro Glu His Pro Glu Val Thr Ser 160 165 170 ctt aaa act ttt gta gaa aaa caa gat aat agc atc aaa gac ctt ctc 578 Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gln Asp Asn Ser Ile Lys Asp Leu Leu 175 180 185 cag acc gtg gaa gac caa tat aaa caa tta aac caa cag cat agt caa 626 Gln Thr Val Glu Asp Gln Tyr Lys Gln Leu Asn Gln Gln His Ser Gln 190 195 200 ata aaa gaa ata gaa aat cag ctc aga agg act agc tagtattcaa 672 Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg Thr Ser 205 210 215 gaacccacag aaatttctct atcttccaag ccaagagcac caagaactac tccctttctt 732 cagttgaatg aaataagaaa tgtaaaacat gatggcattc ctgctgaatg taccaccatt 792 tataacagag gtgaacatac aagtggcatg tatgccatca gacccagcaa ctctcaagtt 852 tttcatgtct actgtgatgt tatatcaggt agtccatgga cattaattca acatcgaata 912 gatggatcac aaaacttcaa tgaaacgtgg gagaactaca aatatggttt tgggaggctt 972 gatggagaat tttggttggg cctagagaag atatactcca tagtgaagca atctaattat 1032 gttttacgaa ttgagttgga agactggaaa gacaacaaac attatattga atattctttt 1092 tacttgggaa atcacgaaac caactatacg ctacatctag ttgcgattac tggcaatgtc 1152 cccaatgcaa tcccggaaaa caaagatttg gtgttttcta cttgggatca caaagcaaaa 1212 ggacacttca actgtccaga gggttattca ggaggctggt ggtggcatga tgagtgtgga 1272 gaaaacaacc taaatggtaa atataacaaa ccaagagcaa aatctaagcc agagaggaga 1332 agaggattat cttggaagtc tcaaaatgga aggttatact ctataaaatc aaccaaaatg 1392 ttgatccatc caacagattc agaaagcttt gaatgaacga ggctctaga 1441 <210> 26 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Polypept
ide encodingKhAP5 CC/His <400> 26 Met Val Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe Ile Val Pro Leu Val Ile Ser 1 5 10 15 Ser Arg Ile Asp Gln His His His His His His Asp Gln Asp Asn Ser 20 25 30 Ser Phe Asp Ser Leu Ser Pro Glu Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu 35 40 45 Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly 50 55 60 Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe 65 70 75 80 Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln 85 90 95 Thr Ser Glu Ile Lys Glu Glu Glu Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr 100 105 110 Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu 115 120 125 Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln 130 135 140 Lys Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gln Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln 145 150 155 160 Pro Glu Thr Pro Glu His Pro Glu Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val 165 170 175 Glu Lys Gln Asp Asn Ser Ile Lys Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp 180 185 190 Gln Tyr Lys Gln Leu Asn Gln Gln His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu 195 200 205 Asn Gln Leu Arg Arg Thr Ser 210 215 <210> 27 <211> 526 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 27 gctgtttcca gataaacaaa ctacaaacag ggttacagat gcttaatttt tcctcaagct 60 aaggaaactc acacttaagt ttaatgacaa acttaatcca tcaaaaacta aggtttattt 120 ataaatctct tatagtaaga aaaaatttaa atgatctttt aaaaacaggt aaataccttt 180 atcctgaaag aataattatc aatacagcaa atttaactat tttaacaatt ttgaaaatta 240 cctcctatta gttgctcatt tccttgattt cagttgccat tgatctaact caacatgggg 300 gagggttaca ttcgtgcaag ttagcacagc ttaatggtta actccattct cctgccaacc 360 ttgtgtgtgc atgcagcaaa tagccgtgta tataaagtca agaggtccag gtctccttac 420 aggagggaga agttccaaat tgcttaaaat tgaataattg agacaaaaaa tgcacacaat 480 taaattattc ctttttgttg ttcctttagt aattgcatcc agagtg 526 <210> 28 <211> 260 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 28 acaaagcctg tggcattgca ccctaaaact tggccactcg ctccgccccc gggccccgcc 60 tccaatgctc tccctcccac tcccacaccc gctttataaa gtggggcttt aggtgcaacc 120 gtgaaacgct tatgagctac gggctccaga tcttcttctg caccagagca agtctaagtc 180 tgagccggct cccccagaac tccagctgct gggtcttgaa ctcctgcgtt ccggagtcct 240 agcgttgctg cacccaaggc 260 <210> 29 <211> 199 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 29 ttgcatccag agtggatcca gacctttcat catttgattc tgcaccttca gagccaaaat 60 caagatttgc tatgttggat gatgtcaaaa ttttagcgaa tggcctcctg cagctgggtc 120 atggacttaa agattttgtc cataagacta agggacaaat taacgacata tttcagaagc 180 tcaacatatt tgatcagtc 199 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 30 caaagcttga aagtctactg gagg 24 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 31 ggttctgaac caagctggtc a 21 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 32 aagatggcgc tccaacacag agtcag 26 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 33 ggctaaatag taaaaccctg gcg 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 34 gtgcttgctg tctttccagt ctt 23 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 35 aggatctcgt cgtgacccat ggcga 25 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 36 gagcggcgat accgtaaagc acgagg 26 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 37 tcccaagtca cacaagaact gac 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 38 catccagaag gctaaagaag gca 23 <210> 39 <211> 17 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 39 tgacctggag aatctct 17 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 40 catccaggct ctctggc 17 <210> 41 <211> 17 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 41 tgacctggag aatctcc 17 <210> 42 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR prim
erwith Kozak's consensus sequence <400> 42 gccaccatgg tcacaattaa gctccttctt tttattg 37 <210> 43 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR prim
er with the specific sequence for a restriction endonuclease XhoI <400> 43 tctagagcct cgttcattca aagctttctg aatctg 36 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR sens
e primer to amplify a DNA fragment encoding a part of GST-CC, GST-CCdel or GST-C1 <400> 44 cggaattccc tccagaattg atcaag 26 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR anti
sense primer to amplify a DNA fragment encoding a part of GST-CC <400> 45 ccgctcgaga ctagtccttc tgagctg 27 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR anti
sense primer to amplify a DNA fragment encoding a part of GST-CCdel <400> 46 ccgctcgagt tgactatgct gttggtt 27 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR anti
sense primer to amplyfy a DNA fragment encoding a part of GST-C1 <400> 47 ccgctcgagg ttagttagtt gctcttc 27 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for insertion of a sequence encoding histidine tag <400> 48 gatccgcatc atcaccatca ccat 24 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for insetion of a sequence encoding a hisitidine tag <400> 49 gatcatggtg atggtgatga tgcg 24 <210> 50 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sense/antisense primer to amplify a DNA fragment which is a part of a plasmid pME18S/KhAP5/His <400> 50 gaattgatca gcatcatcac catcaccacg atc 33 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR sens
e primer primer to amplify a DNA fragment encoding a part of GST-ARP4N <400> 51 tcccccgggg gacccgtgca gtccaag 27 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR anti
sense primer to amplify a DNA fragment encoding a part of GST-ARP4N <400> 52 ccgctcgagc tggctttgca gatgctg 27 <210> 53 <211> 1480 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (25)..(1407) <400> 53 ggcacgagga aaatcaagat aaaa atg ttc aca att aag ctc ctt ctt ttt 51 Met Phe Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe 1 5 att gtt cct cta gtt att tcc tcc aga att gat caa gac aat tca tca 99 Ile Val Pro Leu Val Ile Ser Ser Arg Ile Asp Gln Asp Asn Ser Ser 10 15 20 25 ttt gat tct cta tct cca gag cca aaa tca aga ttt gct atg tta gac 147 Phe Asp Ser Leu Ser Pro Glu Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp 30 35 40 gat gta aaa att tta gcc aat ggc ctc ctt cag ttg gga cat ggt ctt 195 Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu 45 50 55 aaa gac ttt gtc cat aag acg aag ggc caa att aat gac ata ttt caa 243 Lys Asp Phe Val His Lys Thr Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln 60 65 70 aaa ctc aac ata ttt gat cag tct ttt tat gat cta tcg ctg caa acc 291 Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr 75 80 85 agt gaa atc aaa gaa gaa gaa aag gaa ctg aga aga act aca tat aaa 339 Ser Glu Ile Lys Glu Glu Glu Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys 90 95 100 105 cta caa gtc aaa aat gaa gag gta aag aat atg tca ctt gaa ctc aac 387 Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn 110 115 120 tca aaa ctt gaa agc ctc cta gaa gaa aaa att cta ctt caa caa aaa 435 Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys 125 130 135 gtg aaa tat tta gaa gag caa cta act aac tta att caa aat caa cct 483 Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gln Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro 140 145 150 gaa act cca gaa cac cca gaa gta act tca ctt aaa act ttt gta gaa 531 Glu Thr Pro Glu His Pro Glu Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu 155 160 165 aaa caa gat aat agc atc aaa gac ctt ctc cag acc gtg gaa gac caa 579 Lys Gln Asp Asn Ser Ile Lys Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp Gln 170 175 180 185 tat aaa caa tta aac caa cag cat agt caa ata aaa gaa ata gaa aat 627 Tyr Lys Gln Leu Asn Gln Gln His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn 190 195 200 cag ctc aga agg act agt att caa gaa ccc aca gaa att tct cta tct 675 Gln Leu Arg Arg Thr Ser Ile Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser 205 210 215 tcc aag cca aga gca cca aga act act ccc ttt ctt cag ttg aat gaa 723 Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu 220 225 230 ata aga aat gta aaa cat gat ggc att cct gct gaa tgt acc acc att 771 Ile Arg Asn Val Lys His Asp Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile 235 240 245 tat aac aga ggt gaa cat aca agt ggc atg tat gcc atc aga ccc agc 819 Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser 250 255 260 265 aac tct caa gtt ttt cat gtc tac tgt gat gtt ata tca ggt agt cca 867 Asn Ser Gln Val Phe His Val Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro 270 275 280 tgg aca tta att caa cat cga ata gat gga tca caa aac ttc aat gaa 915 Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu 285 290 295 acg tgg gag aac tac aaa tat ggt ttt ggg agg ctt gat gga gaa ttt 963 Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe 300 305 310 tgg ttg ggc cta gag aag ata tac tcc ata gtg aag caa tct aat tat 1011 Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr 315 320 325 gtt tta cga att gag ttg gaa gac tgg aaa gac aac aaa cat tat att 1059 Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile 330 335 340 345 gaa tat tct ttt tac ttg gga aat cac gaa acc aac tat acg cta cat 1107 Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His 350 355 360 cta gtt gcg att act ggc aat gtc ccc aat gca atc ccg gaa aac aaa 1155 Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys 365 370 375 gat ttg gtg ttt tct act tgg gat cac aaa gca aaa gga cac ttc aac 1203 Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn 380 385 390 tgt cca gag ggt tat tca gga ggc tgg tgg tgg cat gat gag tgt gga 1251 Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly 395 400 405 gaa aac aac cta aat ggt aaa tat aac aaa cca aga gca aaa tct aag 1299 Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys 410 415 420 425 cca gag agg aga aga gga tta tct tgg aag tct caa aat gga agg tta 1347 Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu 430 435 440 tac tct ata aaa tca acc aaa atg ttg atc cat cca aca gat tca gaa 1395 Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu 445 450 455 agc ttt gaa tga actgaggcaa atttaaaagg caataattta aacattaacc 1447 Ser Phe Glu 460 tcattccaag ttaatgtggt ctaataatct ggt 1480 <210> 54 <211> 460 <212> PRT <213> Homo sapiens<400> 54 Met Phe Thr Ile Lys Leu Leu Leu Phe Ile Val Pro Leu Val Ile Ser 1 5 10 15 Ser Arg Ile Asp Gln Asp Asn Ser Ser Phe Asp Ser Leu Ser Pro Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 35 40 45 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu Ile Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 100 105 110 Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 115 120 125 Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr Pro Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gln Asp Asn Ser Ile Lys 165 170 175 Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp Gln Tyr Lys Gln Leu Asn Gln Gln 180 185 190 His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg Thr Ser Ile 195 200 205 Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 225 230 235 240 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 275 280 285 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 325 330 335 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 340 345 350 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 355 360 365 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 370 375 380 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 385 390 395 400 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 405 410 415 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 420 425 430 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 435 440 445 Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu 450 455 460 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR senc
e primer to amplify a DNA fragment encoding a part of GST-ARP4Full <400> 55 tcccccgggg gacccgtgca gtccaag 27 <210> 56 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR anti
sence primer to amplify a DNA fragment encoding a part of GST-ARP4Full <400> 56 ccgctcgagg gaggctgcct ctgctgc 27 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sequenci
ng primer -21M13forward <400> 57 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sequenci
ng primer M13reverse <400> 58 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 59 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR prim
er 1 <400> 59 aaggtaccgc tgtttccaga taaacaaa 28 <210> 60 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR prim
er 2 <400> 60 tcaaatgatg aaaggtctgg atccactctg gatgc 35 <210> 61 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to prepare a fragment inserted in the plasmid pGL13-1 <400> 61 aaggtaccaa ttgcatccag agtggatcca a 31 <210> 62 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to prepare a fragment inserted in the plasmid pGL13-1 <400> 62 ttggatccac tctggatgca attggtacct t 31 <210> 63 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR sense primer with the specific sequence for a restriction endonuclease KpnI <400> 63 cggggtaccg agtgggtgct gggaagcaa 29 <210> 64 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR antis
ense primer with the specific sequence for a restriction endonuclease HindIII <400> 64 cccaagcttg ccttgggtgc agcaacgct 29 <210> 65 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR sense primer with the specific sequence for a restriction endonuclease KpnI <400> 65 cggggtacca caaagcctgt ggcattgca 29 <210> 66 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR antis
ense primer with the specific sequence for a restriction endonuclease HindIII <400> 66 cggggtaccc tcccccagaa ctccagctg 29

【図面の簡単な説明】

【図１】ＫＫマウス臓器由来の試料についてのノーザン
ブロット解析の結果を表す図。

【図２】 遺伝子導入ＣＯＳ−１細胞培養上清を試料と
したウエスタンブロット解析の結果を表す図。

【図３】 遺伝子導入ＨｅＬａ細胞培養上清を試料とし
たウエスタンブロット解析の結果を表す図。

【図４】 組換えアデノウイルスを感染させたＫＫ／Ｓ
ｎｋマウスの末梢血中の中性脂肪濃度測定結果を表す
図。

【図５】 ＫＫマウスおよび組換えアデノウイルスを感
染させたＫＫ／Ｓｎｋマウスの肝臓由来の試料について
のノーザンブロット解析の結果を表す図。

【図６】精製「アンジオポエチン関連タンパク質３」の
ＥＬＩＳＡによる検量線を表す図。

【図７】 「アンジオポエチン関連タンパク質１乃至
５」の構造。左側がアミノ末端、右側がカルボキシル末
端である。アンジオポエチン関連タンパク質は、アミノ
末端から、シグナルペプチド、ヘリックス領域、フィブ
リノーゲン様領域からなる。

【図８】 融合タンパク質のＫＫ／Ｓｎｋマウスにおけ
る血中中性脂肪濃度に及ぼす影響を示した図。

【図９】 組換えアデノウイルスを感染させたマウスの
血漿を試料としたウエスタンブロット解析の結果を表す
図。

【図１０】 組換えアデノウイルスを感染させたマウス
の末梢血中の中性脂肪濃度測定結果を表す図。

【図１１】 ヘパリン結合部位に変異を導入したアンジ
オポエチン関連タンパク質３の血漿トリグリセリドに対
する効果を表す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/44 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/44 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/92 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/92 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 特願2001−300716(P2001−300716) (32)優先日 平成13年９月28日(2001．9．28) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願2001−357037(P2001−357037) (32)優先日 平成13年11月22日(2001．11．22) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願2001−384103(P2001−384103) (32)優先日 平成13年12月18日(2001．12．18) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願2002−103583(P2002−103583) (32)優先日 平成14年４月５日(2002．4．5) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） 早期審査対象出願 (72)発明者 安雲 浩明 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 清水川 哲也 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 島村 満 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 吉田 健一 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 古川 秀比古 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (56)参考文献 特開2000−300263（ＪＰ，Ａ) 国際公開00／53753（ＷＯ，Ａ２) 国際公開01／42499（ＷＯ，Ａ１) Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，2000， Ｖｏｌ．20， Ｎｏ．14， ｐ．5343− 5349 Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，1999， Ｖｏｌ. 62， Ｎｏ．３， ｐ．477−482 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，1999， Ｖｏｌ．274， Ｎｏ．37, ｐ．26523−26528 Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ Ｉｎｖ，1998， Ｖ ｏｌ．39， Ｎｏ．10， ｐ．1782− 1788 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 15/12 C07K 14/47 G01N 33/15 G01N 33/50 G01N 33/92 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (28)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１２に示されるアミノ
   酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であっ
   て、アミノ酸番号１７のアミノ酸をアミノ末端とし、ア
   ミノ酸番号１４７乃至２０７のいずれか１つのアミノ酸
   をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなるポリペ
   プチド。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１
   ７乃至２０７に示されるアミノ酸配列からなることを特
   徴とする、請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１７
   乃至１９５に示されるアミノ酸配列からなることを特徴
   とする、請求項１記載のポリペプチド。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１
   ７乃至１４７に示されるアミノ酸配列からなることを特
   徴とする、請求項１記載のポリペプチド。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号１６に示されるアミノ
   酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であっ
   て、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号
   １４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列からなる
   ポリペプチド。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号１６に示されるアミノ
   酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であっ
   て、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号
   １４４乃至１８３のいずれか一つをカルボキシル末端と
   するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号２６に示されるアミノ
   酸配列からなるポリペプチド。
8. 【請求項８】請求項１乃至７記載のアミノ酸配列の一つ
   もしくは数個の部位において、一つ若しくは数個のアミ
   ノ酸残基が欠失、挿入、付加もしくは置換されている、
   哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇させる活性を有す
   るポリペプチドの同効物。
9. 【請求項９】 請求項１乃至８のいずれか１つに記載の
   ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 配列表の配列番号１１に示されるヌク
    レオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、
    ヌクレオチド番号１８のヌクレオチドを５'末端とし、
    ヌクレオチド番号４５８乃至６３８のいずれか１つのヌ
    クレオチドを３'末端とするヌクレオチド配列からなる
    ＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 配列表の配列番号１１に示されるヌク
    レオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、
    ヌクレオチド番号１８のヌクレオチドを５'末端とし、
    ヌクレオチド番号４５８乃至６０２のいずれか１つのヌ
    クレオチドを３'末端とするヌクレオチド配列からなる
    ＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 配列表の配列番号１５に示されるヌク
    レオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、
    ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５'末端と
    し、ヌクレオチド番号６０１を３'末端とするヌクレオ
    チド配列からなるＤＮＡ。
13. 【請求項１３】 配列表の配列番号２５のヌクレオチド
    番号１８乃至６６２に示されるヌクレオチド配列からな
    るＤＮＡ。
14. 【請求項１４】 請求項９乃至１３のいずれか１つに記
    載のＤＮＡを含む組換えベクター。
15. 【請求項１５】 請求項１４記載の組換えベクターで形
    質転換された宿主細胞。
16. 【請求項１６】 請求項１５記載の宿主細胞を培養し、
    次いで、該培養物から、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度
    を上昇させる活性を有するポリペプチドを回収すること
    を特徴とする、哺乳動物の血中の中性脂肪濃度を上昇さ
    せる活性を有するポリペプチドの製造方法。
17. 【請求項１７】 下記の工程を含む、高脂血症、動脈硬
    化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾
    患の治療または予防剤の試験方法： １） 非ヒト哺乳動物に、配列表の配列番号４のアミノ
    酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ酸配列からなる
    ポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２５３残
    基を欠くポリペプチド、配列表の配列番号１６のアミノ
    酸番号２６乃至４０６に示されるアミノ酸配列からなる
    ポリペプチド、そのカルボキシル末端の１乃至２６３残
    基を欠くポリペプチド、または請求項１乃至８に記載の
    ポリペプチドから選択される１種又は２種以上のポリペ
    プチド、および被験物質を投与する；および ２） 上記１）の動物の血中の中性脂肪濃度を測定す
    る。
18. 【請求項１８】 下記の工程を含む、高脂血症、動脈硬
    化および高血糖から選択される一つまたは二つ以上の疾
    患の治療または予防剤の試験方法： １） 非ヒト哺乳動物に、配列表の配列番号３のヌクレ
    オチド番号７８乃至１４５７に示されるヌクレオチド配
    列、配列表の配列番号１５のヌクレオチド番号１７３乃
    至１３９３に示されるヌクレオチド配列、または請求項
    ９乃至１３のいずれか一つに記載のＤＮＡを含む組換え
    アデノウイルスベクターを保持するアデノウイルスを感
    染させる； ２） 上記工程１）の動物に被験物質を投与する；およ
    び ３） 上記工程２）の動物の血中の中性脂肪濃度を測定
    する。
19. 【請求項１９】 高脂血症、動脈硬化および高血糖から
    選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防
    剤の試験方法であって、リポタンパク質リパーゼ（以下
    「ＬＰＬ」という）および／または肝性トリアシルグリ
    セロールリパーゼ（以下「ＨＴＧＬ」という）とその基
    質とを反応させる系に、被験物質と共に、配列表の配列
    番号４のアミノ酸番号１７乃至４６０に示されるアミノ
    酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の
    １乃至２５３残基を欠くポリペプチド、配列表の配列番
    号１６のアミノ酸番号２６乃至４０６に示されるアミノ
    酸配列からなるポリペプチド、そのカルボキシル末端の
    １乃至２６３残基を欠くポリペプチド、または請求項１
    乃至８記載のポリペプチドを共存させ、次いで、該ポリ
    ペプチドによるＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬ活性の阻
    害作用に対する、被験物質の抑制効果を調べることを特
    徴とする方法。
20. 【請求項２０】 下記の工程を含む、ＬＰＬ活性を調節
    する物質の試験方法： １） 下記の［１］−ａ乃至［３］記載の材料と、被験
    物質とを共存させた混合物を調製する：［１］ −ａ ＬＰＬを含む材料；［２］ −ａ ＬＰＬの基質を含む材料；［３］ 配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４
    ６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そ
    のカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポリペプ
    チド、配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６乃至４
    ０６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そ
    のカルボキシル末端の１乃至２６３残基を欠くポリペプ
    チド、または請求項１乃至８記載のポリペプチド； ２） 上記１）の［１］−ａ乃至［３］の材料のみから
    なる混合物を、１）とは別個に調製する； ３） 上記１）および２）の混合物において、基質から
    遊離された脂肪酸の量をそれぞれ測定し、その測定値を
    比較する。
21. 【請求項２１】 ＬＰＬを含む材料が、哺乳動物由来の
    培養脂肪細胞の培養上清であることを特徴とする、請求
    項２０記載の方法。
22. 【請求項２２】 ＬＰＬを含む材料が、げっ歯類または
    霊長類動物由来の培養脂肪細胞の培養上清であることを
    特徴とする、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 ＬＰＬの基質を含む材料が、グリセロ
    ール・トリオレイン酸であることを特徴とする、請求項
    ２０乃至２２のいずれか１つに記載の方法。
24. 【請求項２４】下記の工程を含む、ＬＰＬおよび／また
    はＨＴＧＬの活性を調節する物質の試験方法： １） 下記の［１］−ｂ乃至［３］記載の材料と、被験
    物質とを共存させた混合物を調製する：［１］ −ｂ ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む材
    料；［２］ −ｂ ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質を含
    む材料；［３］ 配列表の配列番号４のアミノ酸番号１７乃至４
    ６０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ま
    たはそのカルボキシル末端の１乃至２５３残基を欠くポ
    リペプチド、配列表の配列番号１６のアミノ酸番号２６
    乃至４０６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチ
    ド、そのカルボキシル末端の１乃至２６３残基を欠くポ
    リペプチド、または請求項１乃至８記載のポリペプチ
    ド； ２） 上記１）の［１］−ｂ乃至［３］の材料のみから
    なる混合物を、１）とは別個に調製する； ３） 上記１）および２）の混合物において、基質から
    遊離された脂肪酸の量を測定し、その測定値を比較す
    る。
25. 【請求項２５】 ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む
    材料が、ヘパリンを静注投与した哺乳動物由来の血漿で
    あることを特徴とする、請求項２４記載の方法。
26. 【請求項２６】 ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む
    材料が、哺乳動物由来の培養脂肪細胞の培養上清である
    ことを特徴とする、請求項２４記載の方法。
27. 【請求項２７】 ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬを含む
    材料が、げっ歯類または霊長類動物由来の培養脂肪細胞
    の培養上清であることを特徴とする、請求項２４または
    ２６記載の方法。
28. 【請求項２８】 ＬＰＬおよび／またはＨＴＧＬの基質
    を含む材料が、グリセロール・トリオレイン酸であるこ
    とを特徴とする、請求項２４乃至２７のいずれか１つに
    記載の方法。