CN1542132A - 高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区全抗体基因的重组病毒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区全抗体的重组病毒及其用途。迄今为止，尚未有应用重组病毒携带治疗肿瘤区并含有人恒定区的全抗体的研究报告。本发明通过将编码治疗肿瘤的并同时含有人恒定区的轻链及含有人恒定区的重链的全抗体基因的核苷酸序列插入重组病毒基因组中，从而在肿瘤细胞内高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体，抑制肿瘤的生长及转移。

Description

高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区全抗体基因的重组病毒及其用途

技术领域

本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种能高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的重组病毒及其用途。

背景技术

Kohler和Milstein在1975年创立的单克隆抗体制备技术，为肿瘤的治疗提供一种新的方法——肿瘤的导向治疗法。在肿瘤导向治疗研究初期，人们给予极大的热情和不切合实际的期望，但早期的临床研究的疗效十分不理想。其主要原因为：1.在早期的临床试验中应用的是鼠源性抗体，在人体内会产生针对鼠源性抗体的抗抗体(HAMA)，它会中和治疗性的鼠源性抗体，使其被快速清除，因此鼠源性抗体在人体内半衰期很短，故疗效不确切，同时鼠源性抗体会导致人体过敏反应，从而产生毒副作用；2.抗体的亲和力和特异性不高，多数抗体特别是一些基因工程小分子抗体或人源化抗体自身亲和力较低，特异性不高，从而不能有效靶向肿瘤细胞，因此其临床上抗肿瘤疗效不确切；3.肿瘤自身抗原表达的差异及抗原的调变也是影响抗体治疗成功的因素。近5年来随着现代生物技术的发展，抗体技术两个关键性技术获得突破，1.人鼠嵌合抗体、人源化抗体和人抗体技术及制备技术的成熟，基本上可以克服鼠源性抗体人用产生抗抗体的问题；同时由于在人鼠嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中采用人的Fc片段(可结晶的片段，是指用木瓜酶消化免疫球蛋白所得的片段，其分子量大约为50000)，在人体内的半衰期从鼠源性抗体小于20小时到人源化抗体和人抗体的半衰期为数天、甚至到21天之久；另外在人的Fc片段的改造可进一步提高对肿瘤的杀伤。2.抗体库的建立和筛选以及多价重组抗体制备技术的发展使人们能够直接获得特异性强和亲和力高的单克隆抗体，如SLAM法(SelectedLymphocyte Antibody Method)制备的抗体的亲和力比杂交瘤技术制备的提高1000倍。抗体技术的发展终于使导向治疗研究走出低谷，并在近几年取得了突破性进展，应用抗体治疗肿瘤初显曙光。

但目前对于抗体治疗实体瘤仍存在着两个难题：1.由于实体肿瘤的细胞被致密的基质包裹，抗体难以穿透这一屏障而到达肿瘤细胞；大多数实体肿瘤有淋巴回流障碍，导致间质内压力升高，因而阻止了抗体由血液中进入肿瘤实质：小部分进入肿瘤内部的抗体，首先遇到血管周围的肿瘤细胞而被结合，使得抗体无法到达距离血管较远的肿瘤细胞。2.由于治疗肿瘤的抗体需要量极多，目前的生物工程生产比较困难；同时由于需要量极多，要求其产品纯度极高，因此其产品生产成本及价格均非常昂贵。故目前应用抗体治疗大体积的实体肿瘤的疗效仍不理想，很多研究建议对于实体肿瘤的抗体治疗主要应用于肿瘤的微小残留或微转移灶中，但这种疾病的治疗需要长时间及大规模的多中心临床试验才能评估其疗效，这也使抗体在实体瘤的临床应用及推广产生一定的限制作用。

基因治疗是近年兴起的一种新的治疗恶性肿瘤方法。其基因转染方法分病毒法及非病毒法两种。病毒法通常采用逆转录病毒、重组腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒及痘苗病毒。逆转录病毒在体外具有较高的转染率，但病毒滴度偏低，在体内转染率较低，而且只能感染分裂期的细胞，同时具有整合至染色体，存在癌变的可能性的缺点。非病毒法包括脂质体及基因枪等方法，其转染基因表达时间较短，转染率较低。腺病毒及腺相关病毒是目前肿瘤基因治疗中最常见病毒载体，已广泛地应用于人体基因治疗方案中，腺病毒具有容易生产及纯化的特点，它在体内及体外均能有效转染分裂及静止细胞，无致癌性。腺相关病毒具有转染分裂及静止细胞的能力，能持久的表达。应用重组病毒携带单链抗体或Fab抗体治疗肿瘤已有文献报道。但由于单链抗体或Fab抗体在体内半衰期很短，无抗体介导的细胞毒效应，故疗效不理想。而含人恒定区的全基因抗体包括人鼠嵌合抗体、人源化抗体及人的抗体，由于这三种抗体均同时含有人的轻链恒定区及人的重链恒定区，其半衰期大大延长，可为数天、甚至到21天之久，同时具有明显的抗体介导的细胞毒效应。

但迄今为止，尚未见到应用重组病毒携带治疗肿瘤区并含有人恒定区的全抗体的报告。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种高效低毒的治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体基因的重组病毒。

本发明的目的在于提供了一种用于抑制肿瘤细胞生长的并含有人恒定区的全抗体基因的重组病毒。

本发明的目的在于提供一种的治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体基因的重组病毒。

本发明的目的在于提供一种含有上述重组病毒的药物组合物。

本发明人创造性地提供了用重组病毒携带治疗肿瘤并含人恒定区的全基因抗体对肿瘤进行治疗，即：采用重组病毒携带治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体基因，将该重组病毒转染肿瘤细胞，使肿瘤细胞表达大量治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体，从而抑制肿瘤的生长及转移。本发明携带治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体基因的重组病毒在肿瘤组织中高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体，因此克服了全抗体难以进入实体瘤组织的困难；同时携带治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体基因的重组病毒生产成本低廉，从而解决了治疗全抗体大量生产成本高的难题，因而从疗效及经济上均优于肿瘤的抗体治疗法。

抗体(Ab)是一种对特异抗原的结合特异性的糖蛋白。天然抗体约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链与重链通过一个共价二硫键与相连。每条重链是由一个可变区(VH)和多个恒定区组成。每条轻链是由一个可变区(VL)和一个恒定区组成；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。

抗体的可变区中较为保守的区域称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区(分别是FR1、FR2、FR3和FR4)，在4个框架区中间夹了3个高变区，它们大致上成β-折叠构型，由三个高变区相连。每条链中的高变区通过FR区紧密的靠在一起并与另一链的高变区一起形成了抗体的抗原结合部位。

抗体的高变区(CDR)指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”即“CDR”的氨基酸残基。

恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应子功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个片段有单个抗原结合位点)以及一个残余的“Fc”片段(该名称反映了其容易结晶的能力)。用胃蛋白酶处理产生了一个F(ab’)₂片段，该片段有两个抗原结合位点，并仍能与抗原交联。

“Fv”是最小的抗体片段，它含有全部抗原识别和结合位点。该区域由非共价地紧密结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚物组成。在该构型中，各可变区中的三个高变区相互作用，在VH-VL二聚物表面上界定了抗原结合位点。6个高变区共同组成抗体抗原结合特异性。然而。即使是单个可变区(或Fv的一半，它只包含对抗原有特异性三个可变区)，也能识别并结合抗原，只是其亲和力比完整的结合位点低。

Fab片段还含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于，在重链CH1区的羧基端多几个残基(包括来自铰链区的一个或多个半胱氨酸)。Fab’-SH在本文表示恒定区的半胱氨酸残基携带了游离巯基的Fab’。F(ab’)₂抗体片段最初是以Fab’片段对的形式产生的，在其间有铰链半胱氨酸。

人鼠嵌合抗体是最早研究的含有人恒定区的抗体。抗体与抗原的结合完全取决于抗体的可变区，抗体的恒定区与抗原结合无关，但恒定区是抗体分子免疫原性的主要部位，因此通过用人的恒定区取代鼠单抗的恒定区，即人鼠嵌合抗体。它可消除抗体在人体中大部分异源性，并保留亲本鼠单抗结合抗原的特异性和亲和力，由于抗体各功能区形成相对独立的空间构象，使得恒定区的置换操作较为简单，目前已构建了多个人鼠嵌合抗体，美国已正式批准4个人鼠嵌合抗体上市，分别为ReoPro(抗血小板受体IIb IIIa的人鼠嵌合抗体，用于治疗冠心病)、Rituxan(抗CD20的人鼠嵌合抗体，用于治疗淋巴瘤)、Simulect(抗CD25的人鼠嵌合抗体，用于治疗移植排斥)及Remicade(抗TNF-α的人鼠嵌合抗体，用于治疗炎症性肠病、类风湿性关节炎)，并在临床应用中取得良好疗效。

由于仅将鼠单抗的恒定区替换成人的抗体恒定区，不能完全消除单抗的异源性，可变区中存在的鼠源性序列仍然可以诱导人体产生针对鼠源性抗体的抗抗体(HAMA)，它会中和治疗抗体，使其被快速清除。抗体轻、重链可变区的6个高变区(CDR)形成CDR平面直接接触抗原，决定了抗体的特异性，抗体的可变区中框架区(FR)只是作为支持CDR的支架，其立体构象极为保守，因此为人鼠嵌合抗体的鼠源性FR改变成人源性的FR区，从而最大限度地减少鼠单抗的异源性，这种单抗称之为人源化的抗体。目前，美国已正式批准6个人鼠嵌合抗体上市，分别为Zanapax(抗CD25的人源化抗体，用于治疗移植排斥)、Herceptin(抗Her2的人源化抗体，用于治疗乳腺癌)、synagis(抗呼吸道合胞病毒F蛋白的人源化抗体，用于治疗呼吸道合胞病毒感染)、mylotarg(抗CD33的人源化抗体，用于治疗急性髓性白血病)及CAMPATH(抗CD52的人源化抗体，用于治疗慢性淋巴细胞性白血病)并在临床应用中取得良好疗效。

人的抗体是指完全来源于人的单克隆抗体，它的可变区及恒定区均为人源性。它来源于转基因小鼠及抗体库技术。目前已有多个人的抗体进入临床试验。

本发明中含有人恒定区的全抗体选自：

1)人鼠嵌合抗体的核苷酸序列；

2)人源化的抗体的核苷酸序列；

3)人的抗体的核苷酸序列。

基因治疗出于安全原因的考虑，病毒载体是通过缺失病毒本身的部分基因，通常缺失基因是病毒增殖与复制的关键基因，从而成为增殖能力缺失的缺陷型病毒。将这种病毒增殖与复制的关键基因转染细胞建立病毒包装细胞株，包装细胞株内和病毒载体联合可产生缺陷型病毒，该缺陷型病毒对靶细胞具有感染能力，但由于病毒缺失病毒增殖与复制的关键基因，因而不能在靶细胞内复制及增殖，这是一个终末感染。因此，增殖能力缺失的病毒载体是一种基因运输工具，它利用了病毒对细胞的高感染率，从而将目的基因转入靶细胞中。

人腺病毒是DNA肿瘤病毒家族成员，能造成人类良性呼吸道感染，人腺病毒分为A、B、C、D、E及F共6种及1-47个血清型。人腺病毒在人体内不会引起癌症，但A与B种在啮齿类动物中有一定致癌性，而其它人腺病毒致癌作用弱或无。目前应用于基因治疗腺载体极大多数采用C种的2及5血清型腺病毒，均无致癌性。感染时病毒在细胞核中保持游离状态，能有效地转染分裂期和非分裂期细胞。

所有腺病毒载体均有转染分裂期和非分裂期细胞的能力，转染率较高，它是非整合型载体，无致癌性。腺病毒载体的缺点在于运输的基因不能持续表达，通常只表达5～20天，其基因短期表达是由于腺病毒蛋白激发的免疫反应所致。

腺病毒很容易进行临床应用规模的商业化生产，其病毒滴度很容易达到10¹²vp/ml，其病毒储藏及运送条件均十分清楚，目前它在肿瘤基因治疗中占主导地位。

本发明提供一类重组病毒，该病毒为增殖能力缺陷的重组腺病毒。

第一代腺病毒为E1缺失(有时还加上E3缺失)。E1区位于大小为36kb的基因组的左侧末端，编码其它早期和晚期基因表达所必须的蛋白质，在这一区域可以有最大为3150bp的缺损。E1区的产物是病毒生长所必须的，因此E1区缺失的腺病毒只能在某些能够提供E1区蛋白的辅助细胞株如293、911或PER.C6中复制增殖，而在极大多数体细胞中均不能复制。E3区编码产物可以抵抗宿主的防御机制，这些产物不是病毒体外复制所必需的，因此并不要辅助细胞株。然而，在一些项目中，希望保存甚至增加一些E3区产物的表达。例如，腺病毒“死亡蛋白”(death protein)E3-11.6K，它可以促进被感染的细胞释放病毒颗粒。还有gp19K，它参与的表达产物可以减少宿主的细胞毒性T细胞对载体的免疫反应，并且增加其下游外源基因表达的持续性，但可能不是增加整个E3区的持续表达。E3区最大插入容量为3.1kb。由于腺病毒能够包装成38kb的大小而不影响生长速度和病毒滴度，因此E1区能够装载5.1kb，而E1/E3同时去除后插入容量为8.2kb。

本发明提供一类重组病毒，该腺病毒E1区缺失并伴有E3缺失或E3不缺失，该腺病毒仍具有感染能力但缺失了增殖能力。

第一代腺病毒载体在体内能引起明显的免疫反应，其原因主要是病毒蛋白的重新合成引起的，由此产生了第二代腺病毒载体。已经构建了许多不同的细胞株，它们能够表达E2a DNA结合蛋白、E2b编码末端蛋白和病毒DNA聚合酶，所有/大部分E4的产物。相应的病毒基因组缺损可以允许最大可插入14kb的表达盒。

本发明提供一类重组病毒，该病毒E1区缺失并伴有E2缺失。

本发明提供一类重组病毒，该病毒E1区缺失并伴有E4缺失。

第三代腺病是空壳腺病毒，除了保留病毒DNA复制和包装所必须的顺式作用序列外，它缺失了其他所有的病毒基因，这样的病毒载体从理论上能够装载大小约为37kb的多个外源基因。

本发明提供一类重组病毒，该病毒为空壳重组病毒。

腺相关病毒(AAV)是一种小的、非致病的、单链DNA病毒。它的复制需要依赖于腺病毒或疱疹病毒等。腺相关病毒本身有两个基因，但不同的剪切可编码七个蛋白质：rep基因编码病毒的复制、整合功能，包括Rep78，Rep6，Rep52及Rep40；cap基因编码病毒的结构组分，包括VP1、VP2及VP3。rep和cap的两端各有一个反向末端重复序列(ITRs)。

病毒载体是用治疗基因替代rep和cap基因来构建的。Rep蛋白和Cap蛋白由包装细胞产生，故病毒复制还需要腺病毒蛋白的帮助。AAV能通过Rep蛋白定点特异性整合到19号染色体。然而，由于载体不编码Rep基因，进入靶细胞后并不能特异性整合到19号染色体。

AAV病毒对多种细胞具有高亲和力，因此AAV载体适用范围广泛。同时由于AAV的Cap基因容易改造，因此不少研究者通过对Cap的改造以设计靶向性转染的病毒载体。在多种动物试验中，肌肉、肝脏、脑等长周期细胞的AAV载体基因表达持续存在。长期表达缘于载体随机整合和一些载体DNA以染色体外DNA形式存在。目前，基因表达起源于整合的DNA和染色体外DNA的比例尚不清楚。同时AAV非常稳定，易于保存及运输。目前作为基因治疗最常用的AAV病毒载体是2型AAV病毒载体及1型AAV病毒载体，对于目的基因的表达，后者比前者高数百倍，甚至上千倍。

本发明提供一类重组病毒，当所用其中所述病毒为增殖能力缺陷的重组腺相关病毒。

本发明提供一类重组重组病毒，本发明所述的重组病毒中，编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有治疗肿瘤作用并含有人恒定区的全抗体蛋白，均可被用于本发明。其编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：编码抗新生血管生成并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞生长因子受体或抗体片段的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞膜抗原并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列。

本发明提供一类重组病毒，所述治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体为编码抗新生血管生成并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，本发明所述的重组病毒中，编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有抗新生血管生成并含有人恒定区的全抗体蛋白，均可被用于本发明。其所述编码抗新生血管生成并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：抗血管内皮生长因子并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，抗血管内皮生长因子受体2并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，抗整合素的αvβ3并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，抑制新生血管内皮生成并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列。

血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成中起关键作用，它通过促进血管生成从而在肿瘤生成及转移中发挥重要作用。抗血管内管生长因子的抗体及抗体片段可阻断血管内皮生长因子与其受体(特别血管内皮生长因子受体2)结合，抑制肿瘤新生血管的生成，从而抑制肿瘤的生长及转移。美国Genentech公司的抗血管内皮生长因子的嵌合性抗体(Avastin，另一个名称为Bevacizumab)已处于晚期实体瘤的III期临床试验阶段。美国ImCloneSystems公司的针对抗血管内皮生长因子受体2(KDR)的抗体IMC-1C11已进入肿瘤的I期临床试验。整合素的αvβ3通过细胞间基质与内皮细胞之间信号传递从而参予新生血管的生成，抗整合素的αvβ3的抗体可抑制新生血管生成，从而抑制肿瘤的形成。

本发明提供一类重组病毒，所述治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体为编码抗肿瘤细胞生长因子受体并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，本发明所述的重组病毒中，编码抗肿瘤细胞生长因子受体并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有抗肿瘤细胞生长因子受体并含有人恒定区的全抗体蛋白，均可被用于本发明。其所述编码抗肿瘤细胞生长因子受体并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：抗表皮生长因子受体1并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，抗表皮生长因子受体2并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列。

人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor)在多种恶性肿瘤细胞转化上起关键作用，它在多种肿瘤细胞中过表达。人表皮生长因子受体也被称为ErbB受体，目前已有四个成员被识别，分别表皮生长因子受体1(HER1，又称为ErbB1或EGFR)、表皮生长因子受体2(HER2，又称为ErbB1或Neu)、表皮生长因子受体3(HER3，又称为ErbB3)及表皮生长因子受体4(HER4，又称为ErbB4)。阻断表皮生长因子受体信号传导可抑制肿瘤细胞生长。美国ImClone Systems公司的针对表皮生长因子受体1嵌合抗体IMC-C225对多种晚期肿瘤有明显的治疗作用，目前该抗体已在III及IV期临床试验。美国另一家生物公司Abgenix公司的针对表皮生长因子受体1的人的抗体ABX-EGF对多种晚期肿瘤有明显的治疗作用，目前该抗体已在II期临床试验。美国Genentech公司的针对表皮生长因子受体2的人源化抗体Herceptin(又称为Trastuzumab)已于1998年美国FDA批准进行临床应用，它与化疗联合产生明显的临床疗效。该公司的另一个针对表皮生长因子受体2的人源化抗体2C4亦已进入I期临床试验。

本发明提供一类重组病毒，所述治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体为编码抗肿瘤细胞膜抗原并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，本发明所述的重组病毒中，编码抗肿瘤细胞膜抗原并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有抗肿瘤细胞膜抗原并含有人恒定区的全抗体蛋白，均可被用于本发明。其所述编码抗肿瘤细胞膜抗原并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：抗CD20并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，抗CD52并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，抗MUC1并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列。

由于CD20存在于所有的B淋巴细胞中，抗CD20抗体可杀灭所有的B淋巴细胞，从而大大降低针对腺病毒载体抗体的产生，从而使腺病毒载体重复使用成为可能。同时由于B细胞淋巴瘤本身亦存在着抗体产生障碍，这也可导致针对腺病毒载体抗体减少。因此应用含有腺病毒携带治疗肿瘤区并含有人恒定区的抗CD20的全抗体，具有明显的治疗B细胞淋巴瘤的作用。美国Genentech公司的抗CD20的嵌合抗体Rituxan(又称为Rituximab)用于治疗B-细胞淋巴瘤，已于1997年批准临床正式应用。

CD52在大多数正常和恶性成熟淋巴细胞(包括T淋巴细胞和B淋巴细胞)表面具有高表达，而不表达于造血干细胞，抗CD52抗体可杀灭所有的成热淋巴细胞，从而大大降低针对腺病毒载体抗体及T细胞免疫的产生，从而使腺病毒载体重复使用成为可能。因此应用含有腺病毒携带治疗肿瘤区并含有人恒定区的抗CD52的全抗体，具有明显的治疗淋巴瘤的作用。抗CD20的人源化抗体Campath用于治疗慢性淋巴细胞性白血病，已于2001年批准临床正式应用。

MUC1广泛存于多种肿瘤中，美国Antisoma公司抗MUC1人源化抗体已进入临床试验。

本发明提供一类重组重组病毒，所述治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体为编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列，本发明所述的重组病毒中，编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有抗肿瘤抗原的独特型单克隆全抗体的蛋白，均可被用于本发明。其所述编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：抗17-1A的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列，抗癌胚抗原的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列，抗GD3的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列，抗MUC1的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列。

抗独特型单克隆抗体(anti-idiotypic mAb，也可用Ab2表示)又称之抗个体基因型抗体，它模拟肿瘤细胞表面的抗原，可引起细胞毒T细胞和辅助T细胞反应，从而达到治疗肿瘤的目的。17-1A在上皮来源的肿瘤细胞内高表达，德国于1997年已批准由GlaxoWellcome/Centocor公司生产的抗17-1A独特型单克隆抗体(Panorex)用于治疗结肠癌。美国ImClone Systems公司的针对抗的GD3的独特型单克隆抗体BEC2抗体IMC-1C11已进入肿瘤的III期临床试验。

本发明提供一类的重组重组病毒，所述编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：Ig G的核苷酸序列或Ig M的核苷酸序列。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同两类(称为kappa(κ)和lambda(λ)中一类。

根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgGT和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG4、IgA-1和IgA-2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区称为α、β、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

本发明提供一类重组重组病毒，所述编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列可与抗癌基因的核苷酸序列产生融合基因的核苷酸序列，该抗癌基因只要能够具有治疗肿瘤作用的基因，均可被用于本发明。其编码治疗肿瘤基因可选自下述之一种：为血管抑制基因、细胞因子基因、前药转换酶基因及细胞毒性基因之一种。

其抗癌基因可以是血管抑制基因，血管抑制基因抑制肿瘤新生血管形成，可阻断肿瘤细胞的营养供应，从而导致肿瘤细胞因营养不足而死亡，肿瘤明显萎缩乃至完全消褪。同时抑制肿瘤新生血管的形成，也达到阻断肿瘤转移的通路的目的。本发明所述的重组病毒中，其中所述的血管抑制基因的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有血管抑制的基因，均可被用于本发明。其所述的血管抑制基因的核苷酸序列可选自下述之一种：内皮抑素基因，血管生成抑素基因，血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-4结构、Kringle1-5结构、Kringle1-3结构、Kringle1-3加上Kringle5结构、血小板反应蛋白基因、血小板因子4基因、纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)基因及纤维结合素基因。

其抗癌基因可以是细胞因子基因，细胞因子基因具有激活免疫细胞，增加造血功能等，本发明所述的重组病毒中，其中所述的细胞因子基因的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有细胞因子功能的基因，均可被用于本发明。其所述的细胞因子基因的核苷酸序列可选自下述之一种：白细胞介素2、白细胞介素12、粒-单集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、Light及Flt3配体。

其抗癌基因可以是前药转换酶基因，前药转换酶基因可使无毒性药物转变成毒性药物，从而增强对肿瘤细胞的杀伤。本发明所述的重组病毒中，其中所述的前药转换酶基因的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有前药转换酶基因，均可被用于本发明。其所述的前药转换酶基因的核苷酸序列可选自下述之一种：单纯疱疹重组病毒胸腺嘧啶激酶、细菌β-内酰胺酶及大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶；

本发明所述的重组病毒中，其中所述的毒素基因的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有毒素基因，均可被用于本发明。其所述的毒素基因的核苷酸序列可选自下述之一种：，可以是：绿脓杆菌外毒片段。

本发明提供一类重组病毒，其中编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列受启动子控制。只要能够启动子功能，均可被用于本发明。其启动子可以为以下启动子之一：猴重组病毒40(Simian virus40，按常规简称为SV40)启动子，劳斯氏肉瘤重组病毒(Rous Sarcoma Virus，按常规简称为RSV)LTR启动子，人巨细胞重组病毒(按常规简称为HCMV)IE启动子，鼠巨细胞重组病毒(按常规简称为MCMV)IE启动子及人腺病主要晚期表达启动子(按常规简称为MLP)。

本发明提供一类重组病毒，该重组病毒是腺病毒体时，在控制编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体表达的启动子的转录起始位点与抗体的翻译起始位点中插入内含子，插入内含子后可使抗体表达量大大增加。这种内含子包括，但不限于选自的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有增加抗体的表达的内含子，均可被用于本发明。其所述的内含子可以为杂合内含子，杂合内含子可以选下述之一：含有腺病毒主要晚期mRNA的第三个引导顺序的5’剪接位点和一个免疫球蛋白的3’剪接位点的杂合内含子，含有腺病毒主要晚期mRNA的第一个引导顺序的5’剪接位点和一个免疫球蛋白的3’剪接位点的杂合内含子。

本发明在上述这种修饰重组病毒基因组中插入编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，本发明所述的编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列为编码抗新生血管生成并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞生长因子受体或抗体片段的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞膜抗原并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列。随着重组病毒感染肿瘤细胞，使肿瘤细胞高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体，从而抑制肿瘤血管形成，抑制肿瘤形成、生长及转移。

本发明在上述这种修饰重组病毒基因组中插入编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，本发明所述的编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列为编码抗新生血管生成并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞生长因子受体或抗体片段的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞膜抗原并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列。随着重组病毒感染正常细胞，使正常细胞高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体，从而抑制肿瘤血管形成，抑制肿瘤形成、生长及转移。

本发明的又一方面，提供了一种利用本发明的重组病毒应用于肿瘤的治疗，其包括如下步骤：1)将该重组病毒体外或体内感染肿瘤细胞，2)在肿瘤细胞内表达治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体，抑制肿瘤形成、生长及转移。本发明中所述的哺乳动物包括但不限于人，猴，牛，羊，猪，犬，猫等等。

在本发明的又一方面，还提供了一种利用本发明的重组病毒治疗哺乳动物尤其是人类肿瘤的方法，其中还包括在本发明所述重组病毒感染肿瘤细胞之前、同时和/或之后施用化学抗肿瘤药物。

本发明的又一方面，提供了一种利用本发明的重组病毒应用于肿瘤的治疗，其包括如下步骤：1)将该重组病毒体外或体内感染正常细胞，2)在正常细胞内表达治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体，抑制肿瘤形成、生长及转移。。本发明中所述的哺乳动物包括但不限于人，猴，牛，羊，猪，犬，猫等等。

在本发明的又一方面，还提供了一种利用本发明的重组病毒治疗哺乳动物尤其是人类肿瘤的方法，其中还包括在本发明所述重组病毒感染正常细胞之前、同时和/或之后施用化学抗肿瘤药物。

为了进一步提高治疗效果，本发明提出的高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的重组病毒可以与常规化疗药物(如顺铂、5-氟脲嘧啶丝裂霉素C等)、生物毒素(如蛇毒素)、单克隆治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体一起用于治疗肿瘤，其作为抗肿瘤药物效果更好。在本发明的又一实施方案中，本发明的重组病毒与X-线联合应用，可产生更为有效的抗肿瘤效应。

本发明提供一类重组病毒，所述重组病毒本身通过在肿瘤细胞中的复制和增殖，可以特异性抑制肿瘤细胞的生长。

本发明再一方面，提供了本发明所述的重组病毒用于抑制肿瘤细胞的生长的用途。

重组病毒向靶细胞的送递有多种方式，包括但不限于脂质体，本领域熟知的常规转染方法(如磷酸钙沉淀或电穿孔)，直接注射，及静脉内灌注。送递方法主要取决于特定重组重组病毒(包括其形态)以及靶细胞的类型和位置(即细胞在体外还是在体内)。

若使用包装的重组病毒，则其可在适当的生理学上可接受载体中以剂量约10⁴至约10¹⁴给予。感染复数通常范围是约0.001至100。若所给予的是多核苷酸(即未包装成重组病毒)，则其剂量可以是约0.01μg至约1000μg。具体的给药量可根据该重组病毒的有关常识(可方便地得自如已公布的文献)而定，亦可凭经验确定。重组病毒的给予可以是一次，也可以是多次，这取决于其目的用途和宿主的免疫应答能力，还可多重地同时注射给药。若不期望产生免疫应答，则可用各种免疫抑制剂减少免疫应答，以便能重复给药而不产生强免疫应答。

本发明还包括内含本文所述重组病毒的组合物，如药物组合物。这类组合物可体内给药。优选地，这些组合物更进一步包含药物学上可接受的赋形剂。这些可包含有效量的本发明重组病毒于药物学上可接受的赋形剂中的组合物适于以单位剂量形式、无菌的胃肠道外溶液或悬浮液、无菌的非胃肠道外溶液或口服液或悬浮液，水包油或油包水乳液等全身性给药于个体。非胃肠道外和胃肠道外药物送递配方为本领域已知，可参见Remington’s药物科学，18版，Mack Publishing(1990)。药物组合物还包括本发明重组病毒的冻干形式和/或重建形式(包括包装成重组病毒的那些)。

本发明还提供治疗方法，其中将有效量的本文所述重组病毒施用于个体。应用重组病毒的治疗方法可用于肿瘤(如肝细胞癌)患者。还可用于肿瘤高危人群，如那些有此类病的家族史和/或有已切除或以其它形式(如化疗)治疗过的疾病的个体。决定是否适于施用本发明的重组病毒将特别依据可评估的临床参数，如血清学指标及组织活检样品的组织学检查。通常施用含重组病毒的药物组合物。药物组合物如上述。

重组病毒的用量取决于多种因素，如具体的重组病毒类型，给药途径，个体的身体状况，疾病发展程度，所用的具体肿瘤治疗基因。

若施用包装的重组腺病毒，则用量为约10⁴至约10¹⁴，优选约10⁴至约10¹²，更优选约10⁴至约10¹⁰。若施用多核苷酸，则用量为约0.01μg至约100μg，优选0.1μg至约500μg，更优选约0.5μg至约200μg。可同时或先后施用不止一种重组病毒。通常是周期性给药，同时监控任何反应。可经如肿瘤内、静脉内或腹膜内给药。

与现有的肿瘤治疗方法相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供一类治疗肿瘤的重组病毒，动物实验证明，这种重组病毒可用于治疗肿瘤。

本发明提供一类高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的肿瘤细胞内特异性增殖的重组病毒的构建方法。该方法通常易行可用于构建高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的肿瘤细胞内特异性增殖的重组病毒。

本发明提供一种在体内及体外杀灭肿瘤细胞、而基本上不影响正常细胞，并在体内及体外肿瘤细胞内高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体，与化学抗肿瘤药物结合，更有效地杀灭肿瘤细胞，达到高效低毒应用于治疗肿瘤的目的。

人类腺病毒有6个不同亚属，分为A、B、C、D、E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病性史并不相同。本发明以腺病毒C亚属中的5型(Ad5)作为例证，对本发明加以进一步具体说明，本发明构建手段均是现有技术人员能够实现。

附图说明

图1是重组腺病毒SG002、SG102及对照腺重组病毒Ad5-Lac Z体外感染的WI-38、BJ及SK-Br-3后，WI-38、BJ及SK-Br-3细胞上清中人源化抗体的表达量图。

图2是重组腺病毒SG002体外感染的WI-38及SK-Br-3后，WI-38及SK-Br-3细胞上清分泌人源化抗体与Herceptin对人表皮生长因子受体2(Her2)阳性的乳腺癌细胞SK-Br-3增殖抑制作用图。细胞增殖率＝治疗细胞数/对照细胞数×100％

图3是重组腺病毒SG002及对照腺重组病毒Ad5-Lac Z分别按1×10⁹及5×10⁹pfu尾静脉给予Balb/c小鼠治疗1周后小鼠血清中人源化抗体的表达量图。

图4是实施例2构建的重组病毒图。

具体实施方式

例1.分别携带抗人表皮生长因子受体1(EGFR)的人的抗体SG-EGFR基因、抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因及抗人CD20的人鼠嵌合抗体SG-CD20基因的表达载体的构建

pShuttle-CMV购于美国Qbiogene，含有人巨细胞病毒启动子(CMV IE)及SV40 poly A加尾信号，应用PCR技术克隆人巨细胞病毒启动子(CMV IE)及SV40 poly A加尾信号，并在上下游位置中分别加入Bgl II酶切位点，在其人巨细胞病毒启动子(CMV IE)及SV40poly A加尾信号之间插入多克隆位点，分别为EcoR I、Sal I、Hind III、Xho I及BamHI酶切位点，其方法采用定位突变双次PCR技术(方法参见PCR Protools Current Methodsand Applications，White BA主编，Humana Press Inc.1993年出版-文献1)。其引物分别为应用引物1与引物2对pShuttle-CMV进行PCR，其产物长度为621bp。

引物1：GGG GTA CCT AGA TCT TAG TAA TCA ATT ACG GGG TCA

引物2：GAG AAG CTT GTC GAC GAA TTC CTA GCG GAT CTG ACG GTT CAC应用引物3与引物4对pShuttle-CMV进行PCR，其产物长度为293bp。

引物3：GAA TTC GTC GAC AAG CTT CTC GAG GGA TCC ATC TAG ATA ACT GAT CAT A

引物4：ATA GTT TAG CGG CCG CTA AGA TCT AAG ATA CAT TGA TGA GTT TG

应用引物与引物4对上述片断进行PCR，其产物长度为893bp

应用Kpn I与Not I双酶切后，插入pBluescript中.进行测序，正确者命名为pClone1，其Bgl II酶切后长度为861bp。

脑心肌炎病毒(FMCV)的多顺反子(IRES)来源于pIRES-EYFP，该质粒购于美国Clontech公司。应用引物5与引物6对其进行PCR，其扩增长度为624bp

引物5：CCG GAA TTC ATC GAT TCT GTC GAC CTG CAG GAA TTG CCC CTC TCC CTC

引物6：TGC TCT AGA CCC GGG CTC GAG GGA TCC TTA ATC ATC GTG TTT TTC AAA G

用EcoR I+Xba I双酶切插入pUC19的EcoR I+Xba I酶切位点中，进行测序，命名为pUC19-IRES

用EcoR I+Xba I双酶切分别插入pClone1的EcoR I+Xba I酶切位点中，命名为pClone2。

质粒pClone2为含有脑心肌炎病毒(EMCV)的多顺反子(IRES)的双基因表达载体，其启动子为人巨细胞病毒启动子(CMV IE)，含有两个多克隆位点，第一个多克隆位点的酶切位点依次为EcoR I、Cla I、Sal I及Pst I，第二个多克隆位点的酶切位点依次为BamH I、Xho I、Xma I及Xba I。

抗人表皮生长因子受体1(EGFR)的人的抗体SG-EGFR由上海捷倍思基因技术有限公司进行全长基因合成，其轻链基因与重链基因的可变区与美国Abgenix公司的针对表皮生长因子受体1的人的抗体ABX-EGF的轻链基因与重链基因的可变区相同。含有SG-EGFR重链基因并在重链上游区引入BamH I酶切位点和重链下游区引入Xba I酶切位点的pUC19质粒命名为pUC-SG-EGFRH。含有SG-EGFR轻链基因并在轻链上游区引入EcoR I和轻链下游区引入Sal I酶切位点的pUC19质粒为pUC-SG-EGFRL。

SG-EGFR的重链基因的核苷酸序列

CGCGGATCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGTCTC

TGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTGATTACTACTGGACCTGGATTCGGCAGTCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTG

GACACATCTATTACAGTGGGAACACCAATTATAACCCCTCCCTCAAGAGTCGACTCACCATATCAATTGACACGTCC

AAGACTCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCATTTATTACTGTGTGCGAGATCGAGT

GACTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCT

TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC

GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTC

AGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGA

ATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCG

TGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTC

CCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGG

ACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC

CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCC

CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATG

AGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAG

AGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG

CAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA

ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGTAATCTAGAAAGCTTGGG→

SG-EGFR的轻链基因的核苷酸序列

   CCGGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAAC

CATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATCAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAAC

TCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTT

ACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTTCTGTCAACACTTTGATCATCTCCCGCTCGC

TTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGC

AGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAG

GTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCT

CAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC

TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAC→→

应用BamH I+Xba I将pUC-SG-EGFRH切下，定向插入pClone2载体BamH I+Xba I中，命名为pClone2-SG-EGFRH。应用EcoR I+Sal I将pUC-SG-EGFRL切下，定向插入pClone2-SG-EGFRH载体EcoR I+Sal I中，命名为pClone2-SG-EGFR。

抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因由上海捷倍思基因技术有限公司进行全长基因合成，其轻链基因与重链基因的可变区与美国Genentech公司的针对表皮生长因子受体2的人源化抗体Herceptin的轻链基因与重链基因的可变区相同。含有SG-HER重链基因并在重链上游区引入BamH I酶切位点和重链下游区引入Xho I酶切位点的pUC19质粒命名为pUC-SG-HERH。含有SG-HER轻链基因并在轻链上游区引入EcoR I和轻链下游区引入Sal I酶切位点的pUC19质粒为pUC-SG-HERL。

SG-HER的重链基因的核苷酸序列

    GGATCCACCATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAG

GGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTC

TTCTGCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCT

GGCCCAGGCAGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTG

CAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTT

GCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACAC

ATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGG

GAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGC

CCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA

CTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCC

TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC

TGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACAC

ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC

TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC

TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGT

GGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC

TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA

TCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT

GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCT

TCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAG

GCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGTAACTCGAG

SG-HER的轻链基因的核苷酸序列

    CCGGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAG

ATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGT

CAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATC

CTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTC

TGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAG

GTGGAGATCAAAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGC

CTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAT

CGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG

AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA

GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAC→

应用BamH I+Xho I将pUC-SG-HERH切下，定向插入pClone2载体BamH I+Xho I中，命名为pClone2-SG-HERH。应用EcoR I+Sal I将pUC-SG-HERL切下，定向插入pClone2-SG-HERH载体EcoR I+Sal I中，命名为pClone2-SG-HER。

抗人CD20的人鼠嵌合抗体SG-CD20基因由上海捷倍思基因技术有限公司进行全长基因合成，其轻链基因与重链基因的可变区与美国IDEC公司的针对CD20的人鼠嵌合抗体IDEC-C2B8(Rituximab)的轻链基因与重链基因的可变区相同。含有SG-CD20重链基因并在重链上游区引入BamH I酶切位点和重链下游区引入Xba I酶切位点的pUC19质粒命名为pUC-SG-CD20H。含有SG-CD20轻链基因并在轻链上游区引入EcoR I和轻链下游区引入SalI酶切位点的pUC19质粒为pUC-SG-CD20L。

SG-CD20的重链基因的核苷酸序列

    CGCGGATCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTCAGG

TACAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTAC

ACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGTCGGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTTATCC

CGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAG

CCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGACTTACTACGGCGGT

GACTGGTACTTCAATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTT

CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCG

AACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA

GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAA

TCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGT

GCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC

CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGA

CGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCC

TCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCC

ATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGA

GCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA

GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC

AAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA

CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGTAATCTAGA

SG-CD20的轻链基因的核苷酸序列

    CCGGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAC

AAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGC

TCAAGTGTAAGTTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAA

CCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACTTCTTACTCTCTCACCATCAGCAGAGTGG

AGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTAACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTG

GAAATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGC

CTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAT

CGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG

AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA

GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAC

应用BamH I+Xba I将pUC-SG-CD20H切下，定向插入pClone2载体BamH I+Xba I中，命名为pClone2-SG-CD20H。应用EcoR I+Sal I将pUC-SG-CD20L切下，定向插入pClone2-SG-CD20H载体EcoR I+Sal I中，命名为pClone2-SG-CD20。

例2.分别携带抗人表皮生长因子受体1(EGFR)的人的抗体SG-EGFR基因、抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因及抗人CD20的人鼠嵌合抗体SG-CD20基因的增殖缺陷腺病毒的重组。

腺病毒载体pDC315、pBHGlox(delta)ElCre及pBHGlox(delta)E1，3Cre购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)。

将pClone2-SG-EGFFR用EcoR I+Xba I切下，定向插入pDC315载体EcoR I+Nhe I中，命名为pDC315-SG-EGFR。将pClone2-SG-HER用EcoR I+Xho I切下，定向插入pDC315载体EcoR I+Sal I中，命名为pDC315-SG-HER。将pClone2-SG-CD20用EcoR I+Xba I切下，定向插入pDC315载体EcoR I+Nhe I中，命名为pDC315-SG-CD20。

为进一步提高抗体表达量，在启动子的转录起始位点与抗体的翻译起始位点中插入内含子，该内含子为腺病毒主要晚期mRNA的第三个引导顺序的5’剪接位点和一个免疫球蛋白的3’剪接位点的杂合内含子。杂合内含子核苷酸序列由上海捷倍思基因技术有限公司进行全长合成，并在内含子上游区引入Spe I酶切位点和内含子下游区引入EcoR I酶切位点的pUC19质粒命名为pUC-Intron。

杂合内含子的核苷酸序列

    ACTAGTTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTG

TTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGG

CAGGCTTGAGATCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACT

CCCAGGTCCAACCGAATTC

合成两个DNA寡核苷酸片段做一个连接头，其DNA寡核苷酸序列为

引物7 AAT TAC TAG TCA GGA ATT CAA GCT TAG ATC TG

引物8 CTA GCA GAT CTA AGC TTG AAT TCC TGA CTA GT

将两个DNA寡核苷酸片段各0.1μg混合，100℃变性5分钟，然后缓慢降温复性，复性后应用T4噬菌体多核苷酸激酸进行磷酸化。将该磷酸化后的连接头插入pDC315载体的EcoR I和Nhe I位点，命名为pDC315-Linker，该载体的多克隆位点分别Spe I、EcoR I、Hind III、Bgl II、Nhe I、BamH I、Sal I积AccI。

应用Spe I+EcoR I酶切pUC-Intron，其片段插入PDC315-linker的Spe I+EcoR I酶切位点中，命名为pYQ10，该载体的多克隆位点分别EcoR I、Hind III、Bgl II、Nhe I、BamH I、Sal I积AccI。将pClone2-SG-HER用EcoR I+Xho I切下，定向插入pYQ10载体EcoR I+Sal I中，命名为pYQ10-SG-HER。

293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将PDC315-SG-EGFR含有5型腺病毒右臂的质粒pBHGlox(delta)ElCre通过Lipofectamine共转染至293细株。PDC315-SG-EGFR、PDC315-SG-EGFR及pYQ10-SG-HER分别与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHGlox(delta)E1，3Cre通过Lipofectamine共转染至293细株。共转染后9-14天出现重组病毒空斑，经过三次重组病毒空斑纯化，分别得到携带抗人表皮生长因子受体1(EGFR)的人的抗体SG-EGFR基因的增殖缺陷腺病毒Ad-SG-EGFR、抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的增殖缺陷腺病毒Ad-SG-HER、抗人CD20的人鼠嵌合抗体SG-CD20基因的增殖缺陷腺病毒Ad-SG-CD20及抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因并在MCMV启动子下游插入杂合内含子的增殖缺陷腺病毒Adi-SG-HER，分别记为SG001、SG002、SG003及SG102。

由上述方法构建的重组病毒见图4。

腺重组病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化重组腺病毒(方法参见Gene Transfer and Expression Protocols，Murray EJ主编，Humana Press 1991出版-文献2)。Ad-SG-EGFR(SG001)为5型腺病毒，E1区(腺病毒的bp342-bp3523缺失)缺失，插入含有鼠巨细胞病毒(MCMV)IE启动子、含有抗人表皮生长因子受体1的人的抗体SG-EGFR的轻链及重链基因及脑心肌炎病毒多顺反子、SV40 poly A加尾信号基因序列，重组病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。Ad-SG-HRE(SG002)为5型腺病毒，E1区(腺病毒的bp342-bp3523缺失)缺失，插入含有鼠巨细胞病毒(MCMV)IE启动子、含有抗人表皮生长因子受体2的人的抗体SG-HER的轻链及重链基因及脑心肌炎病毒多顺反子、SV40poly A加尾信号基因序列，同时伴有bp28133-bp30818(E3区部分序列)缺失，重组病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。Ad-SG-CD20(SG003)为5型腺病毒，E1区(腺病毒的bp342-bp3523缺失)缺失，插入含有鼠巨细胞病毒(MCMV)IE启动子、含有抗人表皮生长因子受体1的人的抗体SG-CD20的轻链及重链基因及脑心肌炎病毒多顺反子、SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有bp28133-bp 30818(E3区部分序列)缺失，重组病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。Adi-SG-HRE(SG102)为5型腺病毒，E1区(腺病毒的bp342-bp3523缺失)缺失，插入含有鼠巨细胞病毒(MCMV)IE启动子、含有腺病毒主要晚期mRNA的第三个引导顺序的5’剪接位点和一个免疫球蛋白的3’剪接位点的杂合内含子、含有抗人表皮生长因子受体2的人的抗体SG-HER的轻链及重链基因及脑心肌炎病毒多顺反子、SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有bp28133-bp30818(E3区部分序列)缺失，重组病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。

例3.携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的增殖缺陷腺相关病毒的重组。

2型腺相关病毒载体pTR美国俄亥俄州医学院石文芳博士赠送，pSH3载体由美国俄亥俄州医学院生化及分子生物学系James P.Trempe教授赠送。载体pTR含有2型腺相关病毒的两个未端重复序列ITR及包装信号序列ψ，pSH3含有5型腺病毒的E4、E2a、VA以及2型腺相关病毒的cap及rep。

将pClone2-SG-HER用EcoR I+Xho I切下，定向插入pTR载体EcoR I+Sal I中，命名为pTR-SG-HER。

将pTR-SG-HER与pSH3通过Lipofectamine共转染至293细株。共转染72小时后，收集细胞与上清，应用氯化铯梯度离心的方法纯化重组腺相关病毒(具体方法参见前述文献2)，得到携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的增殖缺陷腺相关病毒AAV-SG-HER、

例4：携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的重组腺病毒(SG002)的体外及体内表达人源化抗体

正常细胞株肺成纤维细胞WI-38、正常细胞株肺成纤维细胞BJ及人表皮生长因子受体2(Her2)阳性的肿瘤细胞SK-Br-3购于美国ATCC公司，将上述细胞株按5×10⁵细胞/孔铺在6-孔板中，在37℃孵箱5％CO2培养，第二天换无血清液体1ml，然后，分别加入对照腺病毒Ad5-Lac Z或携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的重组腺病毒SG002或携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因并在MCMV启动子下游插入杂合内含子的增殖缺陷腺病毒SG102。其病毒量为5×10⁶/孔，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液3ml培养，分别在72小时收集上清，应用夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测其上清的表达量。结果可见重组腺病毒SG002及SG102体外感染的WI-38、BJ及SK-Br-3后，WI-38、BJ及SK-Br-3均分泌大量人源化抗体，其SG102表达量明显高于SG002。而对照腺病毒Ad5-Lac Z则阴性。结果见图1。

其经SG002体外感染的WI38及SK-Br-3分泌的人源化抗体与美国Genentech公司的Herceptin分别按10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.1μg/ml及0μg/ml加入人表皮生长因子受体2(Her2)阳性的乳腺癌细胞SK-Br-3，其杀伤作用相似，见图2。说明经SG002体外感染的MAC-5及SK-Br-3分泌的人源化抗体与美国Genentech公司的Herceptin作用相同。

将对照腺病毒Ad5-Lac Z或携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的重组腺病毒(SG002)分别以1×10⁹pfu及5×10⁹pfu在尾静脉给予Balb/c小鼠治疗，1周后的应用夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测其小鼠血清的表达量，结果可见应用携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的重组腺病毒(SG002)体内感染后，其小鼠血清有大量人源化抗体表达，其表达水平与给予的病毒剂量成正比，其体内人源化抗体的血清浓度高于文献中Herceptin的治疗浓度，而对照腺病毒Ad5-Lac Z则阴性。结果见图3。

例5：携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的重组腺病毒(SG002)在裸鼠体内治疗移植乳腺癌肿瘤的治疗作用

进行了携带人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的重组腺病毒(SG002)在裸鼠体内研究，以治疗人表皮生长因子受体2(Her2)阳性的肿瘤细胞移植瘤。

乳腺癌细胞株BT-474购于美国ATCC公司，将4-5周龄的裸鼠皮下接种乳腺癌细胞株BT-474细胞1×10⁷，八周后形成100mm³肿瘤，分为末治疗组、对照腺病毒(Ad-Lac Z)及治疗组(SG002)，末治疗组不加任何治疗，对照腺病毒及治疗组在鼠尾静脉分别给予1×10⁹pfu对照腺病毒Ad5-Lac Z或用相同剂量的治疗重组病毒SG002，其未治疗组及对照腺病毒治疗组4周后肿瘤体增加3倍以上，而治疗组则肿瘤增大不明显，部分完全消褪。

                       SEQUENCE LISTING

<110>上海新霁生物科技有限公司

<120>高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区全抗体基因的重组病毒及其用途

<130>12

<140>03116733.0

<141>2003-04-30

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1(SG-EGFR重链基因)

<211>1368

<212>DNA

<213>重组病毒

<400>1

cgcggatcca ccatggagtt ttggctgagc tgggttttcc ttgttgctat tttaaaaggt    60

gtccagtgtg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtgatt actactggac ctggattcgg   120

cagtccccag ggaagggact ggagtggatt ggacacatct attacagtgg gaacaccaat   180

tataacccct ccctcaagag tcgactcacc atatcaattg acacgtccaa gactcagttc   240

tccctgaagc tgagttctgt gaccgctgcg gacacggcca tttattactg tgtgcgagat   300

cgagtgactg gtgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttcagcc   360

tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc   420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg   480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga   540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac   600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa   660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg   720

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag   780

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac   840

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc   900

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag   960

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa  1020

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg  1080

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc  1140

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg  1200

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag   1260

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag   1320

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatag taatctagaa agcttggg                1368

<210>2(SG-EGFR轻链基因)

<211>666

<212>DNA

<213>重组病毒

<400>2

ccggaattca ccatggaagc cccagctcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca     60

gataccaccg gaaccatcac ttgccaggcg agtcaggaca tcagcaacta tttaaattgg    120

tatcagcaga aaccagggaa agcccctaaa ctcctgatct acgatgcatc caatttggaa    180

acaggggtcc catcaaggtt cagtggaagt ggatctggga cagattttac tttcaccatc    240

agcagcctgc agcctgaaga tattgcaaca tatttctgtc aacactttga tcatctcccg    300

ctcgctttcg gcggagggac caaggtggag atcaaaactg tggctgcacc atctgtcttc    360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg    420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg    480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc    540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc    600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttgataa    660

gtcgac                                                               666

<210>3(SG-HER重链基因)

<211>1599

<212>DNA

<213>重组病毒

<400>3

ggatccacca tgagcactga aagcatgatc cgggacgtgg agctggccga ggaggcgctc     60

cccaagaaga caggggggcc ccagggctcc aggcggtgct tgttcctcag cctcttctcc    120

ttcctgatcg tggcaggcgc caccacgctc ttctgcctgc tgcactttgg agtgatcggc    180

ccccagaggg aagagttccc cagggacctc tctctaatca gccctctggc ccaggcagag    240

gttcagctgg tggagtctgg cggtggcctg gtgcagccag ggggctcact ccgtttgtcc    300

tgtgcagctt ctggcttcaa cattaaagac acctatatac actgggtgcg tcaggccccg    360

ggtaagggcc tggaatgggt tgcaaggatt tatcctacga atggttatac tagatatgcc    420

gatagcgtca agggccgttt cactataagc gcagacacat ccaaaaacac agcctacctg    480

cagatgaaca gcctgcgtgc tgaggacact gccgtctatt attgttctag atggggaggg    540

gacggcttct atgctatgga ctactggggt caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcggcc    600

tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc    660

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg    720

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga    780

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac    840

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa    900

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg    960

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag   1020

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac   1080

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc   1140

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag   1200

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa   1260

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg   1320

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc   1380

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg   1440

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag   1500

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag   1560

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatag taactcgag                          1599

<210>4(SG-HER轻链基因)

<211>723

<212>DNA

<213>重组病毒

<400>4

ccggaattca ccatggaagc cccagctcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca     60

gataccaccg gagatatcca gatgacccag tccccgagct ccctgtccgc ctctgtgggc    120

gatagggtca ccatcacctg ccgtgccagt caggatgtga atactgctgt agcctggtat    180

caacagaaac caggaaaagc tccgaaacta ctgatttact cggcatcctt cctctactct    240

ggagtccctt ctcgcttctc tggatccaga tctgggacgg atttcactct gaccatcagc    300

agtctgcagc cggaagactt cgcaacttat tactgtcagc aacattatac tactcctccc    360

acgttcggac agggtaccaa ggtggagatc aaaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc   420

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat   480

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt   540

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc   600

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc   660

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttgataagtc   720

gac                                                                 723

<210>5(SG-CD20重链基因)

<211>1434

<212>DNA

<213>重组病毒

<400>5

cgcggatcca ccatggagtt ttggctgagc tgggttttcc ttgttgctat tttaaaaggt     60

gtccagtgtc aggtacaact gcagcagcct ggggctgagc tggtgaagcc tggggcctca    120

gtgaagatgt cctgcaaggc ttctggctac acatttacca gttacaatat gcactgggta    180

aaacagacac ctggtcgggg cctggaatgg attggagcta tttatcccgg aaatggtgat    240

acttcctaca atcagaagtt caaaggcaag gccacattga ctgcagacaa atcctccagc    300

acagcctaca tgcagctcag cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca    360

agatcgactt actacggcgg tgactggtac ttcaatgtct ggggcgcagg gaccacggtc    420

accgtctctg cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag    480

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg    540

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc    600

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg    660

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag    720

aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa    780

ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc    840

tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc    900

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag    960

gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg   1020

ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag   1080

aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca   1140

tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat   1200

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc   1260

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac   1320

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac   1380

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatagtaatc taga         1434

<210>6(SG-CD20轻链基因)

<211>723

<212>DNA

<213>重组病毒

<400>6

ccggaattca ccatggaagc cccagctcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca     60

gataccaccg gacaaattgt tctctcccag tctccagcaa tcctgtctgc atctccaggg    120

gagaaggtca caatgacttg cagggccagc tcaagtgtaa gttacatcca ctggttccag    180

cagaagccag gatcctcccc caaaccctgg atttatgcca catccaacct ggcttctgga    240

gtccctgttc gcttcagtgg cagtgggtct gggacttctt actctctcac catcagcaga    300

gtggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccagcagt ggactagtaa cccacccacg    360

ttcggagggg ggaccaagct ggaaatcaaa cgtactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc    420

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat    480

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt    540

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc    600

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc    660

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttgataagtc    720

gac                                                                  723

<210>7

<211>246

<212>DNA

<213>杂合内含子

<400>7

actagttaac cagtcacagt cgcaaggtag gctgagcacc gtggcgggcg gcagcgggtg     60

gcggtcgggg ttgtttctgg cggaggtgct gctgatgatg taattaaagt aggcggtctt    120

gagacggcgg atggtcgagg tgaggtgtgg caggcttgag atcgatctgg ccatacactt    180

gagtgacaat gacatccact ttgcctttct ctccacaggt gtccactccc aggtccaacc   240

gaattc                                                              246

Claims (25)

1.一种重组病毒，其特征在于该重组病毒基因组中包含一种编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，该含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列选自：

1)人鼠嵌合抗体的核苷酸序列；

2)人源化抗体的核苷酸序列；

3)人抗体的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于所述重组病毒为增殖能力缺陷的腺病毒。

3.根据权利要求2所述的重组病毒，其特征在于所述病毒为腺病毒，该腺病毒E1区缺失并伴有E3缺失或E3不缺失。

4.根据权利要求2所述的重组病毒，其特征在于所述病毒为腺病毒，该腺病毒E1区缺失并伴有E2缺失。

5.根据权利要求2所述的重组病毒，其特征在于所述病毒为腺病毒，该腺病毒E1区缺失并伴有E4缺失。

6.根据权利要求2所述的重组病毒，其特征在于所述病毒为腺病毒，该腺病毒为空壳重组病毒。

7.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于所述重组病毒是增殖能力缺陷的腺相关病毒。

8.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：编码抗新生血管生成并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞生长因子受体并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞膜抗原并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列。

9.根据权利要求8所述的重组病毒，其特征在于所述编码抗新生血管生成并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：抗血管内皮生长因子并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，抗血管内皮生长因子受体2并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，抗整合素的αvβ3并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，抑制新生血管内皮生成并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列。

10.根据权利要求8所述的重组病毒，其特征在于所述编码抗肿瘤细胞生长因子受体并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：抗表皮生长因子受体1并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，抗表皮生长因子受体2并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列。

11.根据权利要求8所述的重组病毒，其特征在于所述编码抗肿瘤细胞膜抗原并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：抗17-1A并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，抗CD20并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，抗CD52并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列，抗MUC1并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列。

12.根据权利要求8所述的重组病毒，其特征在于所述编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：抗17-1A的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列，抗癌胚抗原的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列，抗GD3的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列，抗MUC1的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列。

13.根据权利要求8所述的重组病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：IgG的核苷酸序列，IgM的核苷酸序列。

14.根据权利要求8所述的重组病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体的核苷酸序列可与抗癌基因的核苷酸序列产生融合基因的核苷酸序列，该抗癌基因为血管抑制基因、细胞因子基因、前药转换酶基因及细胞毒性基因之一种；其中所述的血管抑制基因可以是：内皮抑素基因，血管生成抑素基因，血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-4结构、Kringle1-5结构、Kringle1-3结构、Kringle1-3加上Kringle5结构、血小板反应蛋白基因、血小板因子4基因、纤溶酶原激活因子抑制剂PAI基因及纤维结合素基因；所述的细胞因子基因可以是：白细胞介素2、白细胞介素12、粒-单集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、Light及Flt3配体；所述的前药转换酶基因可以是：单纯疱疹重组病毒胸腺嘧啶激酶、细菌β-内酰胺酶及大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶；所述的细胞毒性基因可以是：绿脓杆菌外毒片段。

15.根据权利要求8所述的重组病毒，其特征在于编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体核苷酸序列的表达受启动子控制，所述启动子可选自下述之一种：SV40启动子，RSV LTR启动子，人巨细胞重组病毒IE启动子，鼠巨细胞重组病毒IE启动子，人腺病主要晚期表达启动子。

16.根据权利要求9所述的重组病毒，其特征在于所述病毒为腺病毒，该腺病毒中控制编码治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体表达的启动子的转录起始位点与抗体的翻译起始位点中含有内含子，所述启动子可选自下述之一种：含有腺病毒主要晚期mRNA的第三个引导顺序的5’剪接位点和一个免疫球蛋白的3’剪接位点的杂合内含子，含有腺病毒主要晚期mRNA的第一个引导顺序的5’剪接位点和一个免疫球蛋白的3’剪接位点的杂合内含子。

17.根据权利要求1-16任一项所述的重组病毒的应用，其特征在于将该重组病毒用于体外感染肿瘤细胞，导致肿瘤细胞表达含人恒定区的全抗体。

18.根据权利要求1-16任一项所述的重组病毒的应用，其特征在于将该重组病毒用于体外感染正常细胞，导致正常细胞表达含人恒定区的全抗体。

19.根据权利要求1-16任一项所述的重组病毒用于治疗哺乳动物尤其是人类肿瘤的方法，其包括如下步骤：1)将该重组病毒体外或体内感染肿瘤细胞，2)在肿瘤细胞内表达治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体，抑制肿瘤形成、生长及转移。

20.根据权利要求19所述的应用，其还包括在权利要求1-16任一项所述重组病毒感染肿瘤细胞之前、同时或之后施用化学抗肿瘤药物的步骤。

21.根据权利要求1-16任一项所述的重组病毒用于治疗哺乳动物尤其是人类肿瘤的方法，其包括如下步骤：1)将该重组病毒体外或体内感染正常细胞，2)在正常细胞内表达治疗肿瘤并含有人恒定区的全抗体，抑制肿瘤形成、生长及转移。

22.根据权利要求21所述的应用，其还包括在权利要求1-16任一项所述重组病毒感染正常细胞之前、同时或之后施用化学抗肿瘤药物的步骤。

23.根据权利要求1-16所述的重组病毒，其还包括用于抑制肿瘤细胞的生长的用途。

24.根据权利要求1-16所述的重组病毒，其还包括在制备可用于治疗肿瘤的药物中的用途。

25.一种药物组合物，其包含权利要求1-16任一项所述的重组病毒以及药学上可接受的载体。

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