CN102690842B - 一种表达人抗体全基因的重组腺病毒(rAdv)载体及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子药物和基因治疗领域，具体而言，利用rAdv穿梭表达载体pDC316构建高效表达人抗体全基因的rAdv载体表达系统，该表达系统不仅在细胞水平上有很好表达抗体的效果，而且在哺乳动物体内短期就有很高的表达，还可持续长期的表达，本发明为rAdv载体表达抗体全基因在抗体治疗、肿瘤治疗和新型抗体疫苗体内表达的研究提供了重要基础，也为我国新型中和抗体基因疫苗的研究提供了新方向。

Description

一种表达人抗体全基因的重组腺病毒(rAdv)载体及其方法

技术领域

本发明涉及分子药物和基因治疗领域，具体而言，利用rAdv穿梭表达载体pDC316构建高效表达人抗体全基因的rAdv载体表达系统，在具体应用中将不限于本研究中所使用的载体及抗体基因。该表达系统不仅在细胞水平上有很好表达抗体的效果，而且在哺乳动物体内短期就有很高的表达，本发明为rAdv载体表达抗体全基因在抗体治疗、肿瘤治疗和新型抗体疫苗体内表达的研究提供了重要基础，也为我国新型中和抗体基因疫苗的研究提供了新方向。

背景技术

抗体(Antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，抗体具有特异性强、副作用小、免疫原性低、生物活性单一等特点，由于其独有的特征已迅速应用于生物学和医学的很多领域。目前世界上有30多个抗体药物已经获得批准上市，主要集中在肿瘤、自身免疫性疾病和感染类疾病等方面。目前应用的抗体药物的种类主要有鼠源性抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体，鼠源性抗体由于能够诱发人体产生人抗鼠抗体、半衰期短，引起过敏反应和超敏反应等缺点，影响其在肿瘤、器官移植等疾病和的诊断和治疗上的应用。人-鼠嵌合抗体和人源化抗体由于与抗原的结合能力弱，长时间使用能诱发人体产生人抗鼠抗体也是其应用受到限制，而人抗体具有更低的免疫原性、更好的安全性、更慢的清除周期，目前抗体药物的发展主要方向是向全人抗体发展，有的抗体在临床治疗比较成功，但对于抗体的广泛应用还是受到生产能力的限制，提高抗体全基因的表达效率，包括在体内的基因治疗和体外哺乳细胞的大量表达等方面都将产生重要的意义。

当前，我国表达载体和细胞株改造都远远落后于欧美国家，所以治疗性抗体药物重点解决的问题之一是建立高效表达抗体基因的载体。抗体的基本结构相似，都是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)通过二硫键连接而成，将重链和轻链构建在载体上进行高效的表达是关键所在，这样就涉及到双基因共表达的构建策略。双基因共表达的构建策略主要有以下几个方面：(1)双启动子的构建策略，这种策略是用双表达盒表达两个基因，用各自独立的启动子转录不同的基因，启动子可以一样也可以不一样，载体上有两个启动子和两个PolyA。这种构建策略的缺点是内部启动子占用了载体上有限的克隆空间，为了增加克隆空间可以用两个启动子和一个PolyA的构建方案，这两种方案在不同的载体中转录效果也不尽相同。真核载体常用的启动子有CMV、EF-1α、hPGK、CAG、mPGK等，不同启动子有不同的转录效率，同时在不同组织中转录的效率也不尽相同；(2)引入IRES的构建策略，两个基因之间插入内核糖体插入位点(internal ribosomal entry site，IRES)序列使其为同一启动子驱动而转录为单个mRNA，但翻译为两种不同的蛋白质。这种构建方案能够避免双启动子转录时的相互干扰，但置于IRES下游基因表达量远远比上游基因表达量的效率低很多；(3)融合表达的构建策略，用连接肽(linker)将两个基因相连，在一个启动子调控下翻译出具双功能的融合蛋白分子，但对于抗体来说需要轻、重链分别表达才能组装成功能和立体结构完整的IgG。除此之外还有供体/受体位点剪切构建策略、Furin切割构建策略、2A序列自我切割构建策略等，这些构建策略由于在体内切割效率低，两基因的表达效率也很不稳定，还有部分剪切的调节机制还都不清楚。

在抗体药物治疗和应用中，很重要的一点是要提高抗体的表达量，同时也要避免启动子相互干扰，以免造成不同基因表达水平的不一致。抗体全基因的表达，由于轻链表达量大于重链表达量才能更好更多的组装成完整的抗体，所以应该尝试多种双基因载体构建的方案，而且不同的构建方案在不同的载体在表达抗体时，其表达效率不尽相同。基于以上理论，为建立Adv载体高效表达抗体全基因技术平台。我们在专利“一种表达人抗体全基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体及其方法”(申请号：201210106947.1)的基础上采用了多种双基因表达策略并获得一种高效表达抗体全基因的最佳方案。

腺病毒(adenovirus，Ad)无包膜，外壳是一个二十面体结构，由240个六面体和12个五邻体构成；内部有约36kb的线性化双链基因组，分为100个图距单位。近年来，研究者们已对腺病毒六邻体蛋白的结构、功能进行了广泛的研究。按病毒复制的时间，可将基因组分为早区(E区)及晚区(L区)：前者包括E1、E2、E3、E4，编码病毒调节蛋白及功能蛋白；后者分为L1、L2、L3、L4、L5，编码病毒结构蛋白。目前对腺病毒的分子生物学特性研究得最为详细的是人腺病毒2型(Ad2)和人腺病毒5型(Ad5)，目前绝大多数编码有潜在治疗作用的基因载体是用Ad5构建的。

腺病毒载体具有很多优点：(1)宿主范围广泛，可感染人和多种哺乳动物。既可感染分裂期细胞，也可感染静止或终末分化细胞；(2)感染滴度高。在293细胞中增殖的重组腺病毒滴度可高达到10¹⁰pfu/ml；(3)安全性高。腺病毒活疫苗在美国军队使用二、三十年，证明是安全有效的；(4)产生的大量外源蛋白质接近于翻译后水平的成熟蛋白质，即磷酸化和糖基化；(5)稳定性好。-80℃可保存多年，冻干后不需冷藏；(6)应用方便。根据不同需要，可选择口服、滴鼻或气管、静脉、腹腔内、皮下或肌肉途径。由于腺病毒载体具有以上的优点，腺病毒载体在近年来被广泛应用的真核基因运载工具，因而已在基因工程疫苗研制和基因治疗中显示出巨大的潜在应用价值。

重组腺病毒载体的构建策略有3种：①在细胞内同源重组，产生重组腺病毒：将纯化的腺病毒全长DNA和外源基因同时插入带有腺病毒基因片段的穿梭质粒中，将腺病毒DNA和重组质粒共转染包装293细胞，随机重组成腺病毒基因组，进一步包装成病毒颗粒，该方法病毒产量低，随机性强，效率较低；②将腺病毒全长DNA序列克隆入穿梭质粒中，转化感受态大肠杆菌，在细菌中复制腺病毒DNA序列，然后将外源基因片段插入有抗性基因的真核表达质粒，将重组真核质粒线性化后，转化带穿梭质粒的大肠杆菌，在细菌Cre重组酶的作用下，大肠杆菌发生同源重组，将外源基因表达盒插入腺病毒DNA中，用该方法可构建缺失任何区段的腺病毒DNA；③将稀有的限制性内切酶位点引入穿梭质粒和腺病毒骨架载体中，将外源基因克隆入穿梭质粒中，通过酶切连接的方法，将外源基因克隆入腺病毒骨架载体，转化大肠杆菌复制重组质粒，转染相应的包装293细胞系后，即可产生复制缺陷型的重组腺病毒，该方法效率很高，因而得到较广泛的应用，在目前基因治疗研究中较多见。

AdMaxTM腺病毒系统是由腺病毒载体鼻祖Dr.Frank Graham在1999年创建的一套重组腺病毒构建系统，该系统基本原理是通过Cre-loxP或FLP-frt重组酶，使共转染到293细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和辅助质粒(腺病毒基因组质粒)在重组酶的作用下产生重组腺病毒。得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺陷型腺病毒。

发明内容

本发明目的是提供利用Adv载体系统构建包含人抗体重链和轻链全基因的高效双基因表达系统。

本发明以HIV人中和抗体2G12全基因为模型，利用Adv5型穿梭表达载体pDC316(Microbix Biosystems公司，参见附图1)构建高效表达人抗体全基因的腺病毒载体表达系统。研究思路是在“一种表达人抗体全基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体及其方法”专利的基础上(申请号：201210106947.1)，通过6种双基因表达的构建策略(参见附图3)，在细胞水平上比较表达2G12的效果(参见附图4)，在此过程中构建了pDC316/eLcH载体(参见附图2)，通过与骨架载体pBHGlox(delta)1，3Cre(Microbix Biosystems公司，参见附图6)共转染HEK293细胞包装出rAdv。本专利对此表达系统在SCID小鼠体内进行了接种rAdv的验证，结果证明此系统不仅在细胞水平有很好表达抗体的效果，同时在哺乳动物体内短期内就能够检测到抗体的表达，而且接种12周时仍具有高水平的表达(参见附图5)。本发明为Adv载体表达抗体全基因在抗体治疗、基因功能性研究、反义治疗、疫苗开发等领域提供了一个很好的平台。

pDC316/eLcH载体构建元件组成依次是：

ITR-Ad--promoter1(hEF-1αpromoter)--murine IgG1 signal peptide—目的抗体L chain--promoter2(hCMV IE promoter)--murine IgG1 signal peptide-目的抗体H chain--SV40 polyA--LoxP--ColE ori---Ampicillin resistance--Ad-ITR

利用pDC316/eLcH的构建方案分别构建和表达了不同类型的HIV-1人全基因中和抗体，包括HIV-1 gp120 CD4结合位点中和抗体(N12-B2)、CD4诱导中和抗体(N12-I2、N12-I15)和其它类型的中和抗体(N12-O2)(N12-B2，N12-I2，N12-I15，N12-O2中和抗体详见美国专利WO-2007-134200和WO-2010-056898)，表达这些抗HIV人中和抗体全基因的目的是验证所建立Adv表达人抗体全基因的平台。通过pDC316/eLcH的构建方案表达的这四种抗体在细胞水平的表达效果见表1。

表1四种抗体基因构建质粒瞬时转染293T细胞72小时进行ELISA检测结果

此发明在载体构建时，在载体的多克隆位点引入便于各种抗体轻重链基因插入的酶切位点，载体的多克隆位点插入的酶切位点及其顺序为EcoRⅠ--NotⅠ--SfiⅠ，因为这三个酶切位点是人基因中比较稀有的酶切位点，在表达其它的人抗体基因时就不需为加入新酶切位点而改造载体。此外利用SfiⅠ内切酶识别序列的特殊性，在重链两端都是SfiⅠ，仅用SfiⅠ单酶切就可以将其构建在载体上，而且不改变其方向。(参见附图3)

此发明建立了双抗体ELISA法定量测定人IgG含量的方法，该方法简单，重复性好，特异性强，背景低，可直接定量测定血清及纯化样品等各种培养物中人抗体的含量。

附图说明

图1为表达载体pDC316质粒图谱

图2为表达最佳的载体pDC316/ELCH质粒图谱

图3为pDC316载体采用6种不同方案表达2G12轻、重链的构建示意图

图4为pDC316/2G12采用6种双基因构建方案的表达量的比较图

图5为rAdv-2G12在SCID小鼠体内不同时间的平均表达量

图6为骨架载体pBHGlox(delta)1，3Cre质粒图谱

具体实施方案

实施例1：pDC316表达2G12全基因各种表达方案的构建步骤

1.穿梭质粒pDC316/cLcH以及pDC316/cLAcH的构建

(1)在载体pDC316的多克隆位点插入linker：

为便于将IgG的轻链(L)和重链(H)插入载体，设计含有EcoRⅠ-NotⅠ-SfiⅠ-BglⅡ的linker39，其两端拥有EcoRⅠ和BglⅡ酶切位点的粘末端，与载体pDC316相连接为pDC316/linker39。linker39设计的引物如下：

Linker 39F：5′…aattcataagaatgcggccgctataggccaactaggcca…3′(SEQ ID NO.1)

Linker 39R：5′…gatctggcctagttggcctatagcggccgcattcttatg…3′(SEQ ID NO.2)

(2)PCR扩增2G12-L(EcoRⅠ，NotⅠ)、2G12-LA(EcoRⅠ，NotⅠ)、2G12-H(SfiⅠ，SfiⅠ)和CMV(NotⅠ，SfiⅠ)。扩增出的2G12轻链基因序列(2G12-L)如SEQ ID13所示；2G12重链基因序列(2G12-H)如SEQ ID14所示；2G12-LA(是2G12的轻链基因(简称L)和SV40 polyA(简称A)的融合基因)。

引物如下：

2G12-L(EcoRⅠ，NotⅠ)

2G12-Lc F：5′…cgcgaattccaccatgggatggtcatg…3′(SEQ ID NO.3)

2G12-Lc R：5′…gaatgcggccgcctaacactctcccctgttg…3′(SEQ ID NO.4)2G12-LA(EcoRⅠ，NotⅠ)

2G12-Lc/pAF：5′…cgcgaattccaccatgggatggtcatg…3′(SEQ ID NO.5)

2G12-Lc/pAR：5′…gaatgcggccgcgatccagacatgataagatac…3′(SEQ ID NO.6)2G12-H(SfiⅠ，SfiⅠ)

2G12-Hc F：5′…taggccttgtaggcctccaccatgggatggtcatg…3′(SEQ ID NO.7)

2G12-Hc R：5′…atggcctagttggcctcatttacccggagacagggagag…3′(SEQ ID NO.8)CMV(NotⅠ，SfiⅠ)

CMV1F：5′…tagcggccgcttcgagctcgcccgacattg…3′(SEQ ID NO.9)

CMV1R：5′…taggcctacaaggccgatctgacggttcactaaac gagctc…3′(SEQ ID NO.10)EF-1α(NotⅠ，SfiⅠ)

EF-1a NotⅠ：5′…tatagcggccgcggctccggtgcccgtcagtg…3′(SEQ ID NO.15)

EF-1a SfiⅠ：5′…gcggcctacaaggcctcacgacacctgaaatggaag…3′(SEQ IDNO.16)

(3)通过T4连接酶将扩增出来的2G12-L、2G12-H、2G12-LA、CMV、EF-1α片段分别连接于pGEM-T载体上，构建成为T/L、T/H、T/LA、T/CMV、T/EF-1α(NS)质粒。

(4)通过酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ将2G12的L和LA插入载体pDC316/linker39构建为2G12-pDC316/L、2G12-pDC316/LA。

(5)通过酶切位点NotⅠ和SfiⅠ将CMV和2G12-H分别共同连接到2G12-pDC316/L和2G12-pDC316/LA，构建为pDC316/cLcH、pDC316/cLAcH。

2.EF-1α替换载体CMV启动子方案

(1)T/EF-1α的构建

PCR扩增EF-1α，目的是将载体pDC316的CMV启动子替换为EF-1α启动子，EF-1α的设计引物如下：

EF-1α XbalⅠ：5′…attctagaggctccggtgcccgtcagtg…3′(SEQ ID NO.11)

EF-1α EcoRⅠ1：5′…gccgaattctattagtaccaagctaattcctcacg…3′(SEQ ID NO.12)

通过T4连接酶将扩增出来的EF-1α片段连接于pGEM-T载体上，构建成T/EF-1α(XE)。

(2)重组质粒pDC316/eLcH、pDC316/eLAcH的构建

通过酶切位点XbaⅠ、EcoRⅠ，将T/EF-1α(XE)的-EF-1α片段分别连接到重组质粒pDC316/cLcH和pDC316/cLAcH上，构建成重组质粒pDC316/eLcH和pDC316/eLAcH。

3.目的片段更换CMV方案

(1)重组质粒pDC316/eLeH的构建

通过酶切位点NotⅠ、SfiⅠ，将T/EF-1α(NS)的-EF-1α片段连接到pDC316/eLcH上，构建成重组质粒pDC316/eLeH。

(2)重组质粒pDC316/eLAeH的构建。

通过酶切位点EcoRⅠ、NotⅠ，将T/LA的-LA片段连接到pDC316/eLeH上，构建成重组质粒pDC316/eLAeH。

实施例2：双抗体夹心ELISA法定量测定人IgG含量的方法

(1)包被：包被Goat anti human kappa，UNLB(公司：Southern Biotech，货号：2070-01)，50ng/孔，4℃包被过夜，PBST洗三遍，不包被右下角2x2空白对照孔。

(2)封闭：用5％的脱脂奶粉封闭，100μl/孔，37℃封闭1小时，PBST洗三遍。

(3)加标准品和待测样品：

在同一酶标板上加入IgG标准品(Invitrogen，lot 1069920A，TEF 027102)和待测样品，标准品从第一孔以0.1μg/ml开始连续8个稀释度进行倍比稀释，做两个复孔；待测样品(包括细胞表达上清、小鼠血清等)以一定稀释度连续8个稀释孔进行倍比稀释，做两个复孔，37℃孵育1小时，PBST洗三遍。

(4)加酶标抗体：将1∶7500稀释的Peroxidase-Conjugated Goat Anti-Human IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司)加入每个反应孔中，100μl/孔，37℃孵育1小时，PBST洗五遍。

(5)显色：每孔加入临时配制的TMB底物溶液(北京万泰生物药业股份有限公司)100μl，室温避光反应10分钟左右。

(6)终止反应：每孔中加入2M硫酸50μl终止反应。

(7)结果检测：用酶标仪在450nm测定吸收值。

(8)人IgG定量：以标准品及对应的OD值做散点图，据校准曲线计算出待测样品的IgG含量。

实施例3：2G12采用6种双基因构建方案在细胞水平上的表达

将提取的高纯度的6种构建方案的质粒(pDC316/eLcH、pDC316/eLeH、pDC316/eLAcH、pDC316/eLAeH、pDC316/cLcH、pDC316/cLAcH)瞬时转染293T细胞，用FuGENE HD转染试剂(罗氏，Cat.No.04709705001)转染，具体操作按FuGENE HD说明书进行，通过双抗体夹心ELISA法测定人IgG含量方法(方法见实施例2)检测转染72小时细胞上清的人IgG含量。结果如表1中所示，通过比较这6种构建方案的表达，获得pDC316/eLcH是高效表达人抗体全基因的最佳方案。

表2

实施例4：重组腺病毒Adv-2G12的包装

以含10％胎牛血清的DMEM培养基培养293细胞，4×10⁵/孔接种到六孔板中，每孔含2mL细胞悬液，在37℃的CO₂培养箱中培养过夜，使其密度达到80％-90％之间。在六孔板上做好标记，做上阴性对照。

具体步骤：

A.取三只无菌的1.5ml的EP管

1^#管(阴性对照)：

100μlDMEM+6μlFuGENE HD

2^#管(质量比1∶1)：

100μlDMEM+3.33μl Ad5骨架质粒(pBHGlox(delta)1，3Cre，1μg)+6.25μl pDC316/eLcH(1μg)

震荡混匀室温静止5Min，再加6μL FuGENE

HD震动混匀器充分混匀后，室温静止15min，使转染试剂充分包裹住质粒，形成均匀的混合悬液。

3^#管(质量比1∶4)：

100ul DMEM+5.33μl Ad5骨架质粒(pBHGlox(delta)1，3Cre，1.6μg)+2.5μl pDC316/eLcH(0.4μg)

震荡混匀，室温静止5min，再加6μL FuGENE HD转染试充分混匀后，室温静止15min，使转染试剂充分包裹住质粒，形成均匀的混合悬液。

B.将混合悬液缓缓加入六孔板中，将板子放于37℃，5％CO2培养箱中孵育7-14天，注意每天观察细胞的变化，看有无病变或者细菌污染的情况发生，培养基不足时注意补加，防止孔变干，此时期是双质粒在293细胞内重组成腺病毒基因组的过程。

大约7天后，加入质粒的细胞开始出现病变(CPE)，再观察1-2天，待细胞病变明显时，开始收获病毒。将细胞连同培养基一起移入1.5ml Eppendorf管中，在-80℃和37℃(水浴)反复冻融3次(使细胞破碎，释放病毒)；3000rpm离心10min，吸取上清，再用0.45滤膜过滤，即为原代病毒，命名为Adv-2G12。

实施例5：腺病毒Adv-2G12的纯化

收集一定量的重组腺病毒Adv-2G12后，就可以开始纯化了，本实验采用两次氯化铯密度梯度离心法纯化腺病毒，注意：为确保氯化铯密度梯度后较易分辨病毒带，扩增病毒至少需要3×10⁸细胞。

(1)不连续密度梯度离心

a)预冷离心转子至4℃。

b)在离心管中缓慢加入8ml 1.4g/ml氯化铯(53g+87ml 10mM Trz-HCL，PH 7.9)，

再非常轻缓地加入6ml 1.2g/ml氯化铯26.8+92ml10mM Tris-HCL，PH 7.9)。病毒最终的纯度有赖于密度梯度的质量。

c)超净台中在不连续梯度顶部加入20ml DMEM5％病毒保存液，病毒量必须少于10⁹细胞中所得的，否则将超过密度梯度负荷量。如果保存液的体积少于20ml，用PH7.9 10mM Tris-HCL调至20ml。

d)平衡离心管，100000×g(SW41转子上为24000rpw)4℃离心2小时。

e)超净台中取出离心管，用夹子直立固定离心管。

f)用10ml移液器从梯度顶部吸去大部分杂质。

g)大概吸到中间部位时，用1ml移液枪，沿离心管的内壁缓慢洗出，将病毒带吸出，置于一无菌的15ml离心管中。

h)加入1倍体积1×TE，这一步对于把溶液密度降低至1.2以下是必须的，病毒带的密度大约为1.345。

(2)连续密度梯度离心

a)使用连续密度发生器将12ml 1.4g/ml和14ml 1.2g/ml氯化铯连续密度梯度加入离心管中。

b)非常缓慢地在密度梯度顶部加入8-10ml稀释的病毒悬液。

c)100000×g 4℃离心16-20小时。

d)超速离心后，连续梯度溶液和不连续梯度溶液同样分层，但底部没有沉淀，因此通过底部穿刺即可获得感染性病毒带。溶液上部(含细胞成分)通常更为干净，大部分细胞碎片已通过第一步不连续梯度离心被去除了。

e)用10ml移液器从离心管顶部吸去大部分梯度溶液和杂质，避免吸到底部含病毒的蓝白色条带。这有助于在收集病毒时降低溶液流出速度。

f)用1ml移液枪沿内壁缓慢洗出多余杂质，直至将蓝白色病毒带。

g)蓝白色病毒带收集完后再将剩余的梯度溶液转入烧杯。

(3)病毒溶液去盐和浓缩

氯化铯是通过透析去除的，这一步至关重要，因为高浓度氯化铯可能会影响病毒对细胞或组织的感染。含10mM Tris(PH8.0)，2mM MgCl₂，5％蔗糖的病毒缓冲液可允许病毒浓缩至10¹³vp/ml，并且具有良好的稳定性。将病毒带在分子筛为25000道尔顿的纤维素酯膜中进行4℃透析，去除氯化铯盐。由于病毒分子量较大，大小约90nm，因此不能穿过透析膜。缓冲液的体积应为病毒溶液的200倍，每次透析3小时，然后更换缓冲液，3次更换缓冲液后应已无痕量氯化铯。透析后的病毒溶液每管500μl分装保存于-80℃。

实施例6：rAdv-2G12在SCID小鼠体内表达的实验

1.疫苗免疫和分组

12只8周龄SCID雌性小鼠随机分成3组，第1组：PBS对照组，3只，与实验组相同的免疫时间点，肌肉注射200μl无菌PBS；第2组：rAdv空病毒对照组，3只，与实验组相同的免疫时间点，肌肉注射200μl rAdv空病毒；第3组：rAdv-2G12病毒免疫组，6只，于实验开始的0周肌肉注射200μl纯化的rAdv-2G12病毒载体，所用rAdv剂量为：1×10⁸vg/只。

2.双抗体ELISA法测定SCID小鼠血清中人IgG量及其中和活性

方法见实施例2：双抗体ELISA法定量测定人IgG含量的方法。

rAdv-2G12注射2周就可以检测到抗体2G12的表达，2G12在体内的表达一直在增加，到12周时仍在高效的表达，而且表达越来越高。(结果参见表二、图5)

将SCID小鼠血清中的IgG进行纯化，纯化后IgG对HIV-1假病毒有较好的中和活性，SCID小鼠血清的中和实验结果证明2G12-rAdv/eLcH在动物体内不仅能够长期高效的表达2G12，而且表达的2G12具有中和活性，说明本发明建立了Adv表达人抗体全基因的技术平台。

表3

Claims (3)

1.一种表达人抗体全基因的重组腺病毒(rAdv)载体，其特征在于，利用Adv5型穿梭表达载体pDC316构建而成，所述载体的基因结构单元为：5′ITR-Ad-promoterl-murineIgG1signal peptide-L chain-promoter2-murine IgG1signal peptide–Hchain-SV40polyA-LoxP-ColE ori-Ampicillin resistance-Ad-ITR，其中所述的promoter1为：hEF-1αpromoter；所述的promoter2为hCMV IE promoter。

2.如权利要求1所述的重组腺病毒(rAdv)载体，其特征在于所表达的抗体为HIV人中和抗体2G12全基因。

3.一种构建如权利要求2所述的重组腺病毒(rAdv)载体的方法，其具体构建方法为：

1)通过PCR的方法改造pDC316，并在载体pDC316的多克隆位点插入linker；

2)利用PCR技术扩增出hEF-1αpromoter、murine IgG1signal peptide、目的抗体的轻链、hCMV IE promoter、murine IgG1signal peptide、目的蛋白的重链、SV40polyA等基因结构单元；

3）利用酶切位点将步骤2）中各结构单元顺次连接，克隆到改造好的pDC316载体的多克隆位点中，形成5′ITR-Ad-promoterl-murine IgG1signal peptide-L chain-promoter2-murineIgG1signal peptide–H chain-SV40polyA-LoxP-ColE ori-Ampicillin resistance-Ad-ITR的基因结构单元，其中所述的promoter1为：hEF-1αpromoter；所述的promoter2为hCMV IEpromoter；

4)即得到权利要求2所述的重组腺病毒(rAdv)载体。

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