KR100563099B1 - ＶＥＧＦＲ 트렁케이티드 솔루블 ｃＤＮＡ를 함유하는재조합 아데노-연관 바이러스（ｒＡＡＶ）및 이를 함유하는대장암, 방광암 및/또는 폐암 특이적 유전자 치료제 - Google Patents

ＶＥＧＦＲ 트렁케이티드 솔루블 ｃＤＮＡ를 함유하는재조합 아데노-연관 바이러스（ｒＡＡＶ）및 이를 함유하는대장암, 방광암 및/또는 폐암 특이적 유전자 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 VEGF 수용체단백질(VEGFR)의 truncated soluble cDNA와 아데노-연관 바이러스(AAV) 시스템을 이용한 유전자 치료제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, VEGFR의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터 및 상기 벡터와 VEGF-A 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 포함하는 대장암, 방광암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유전자 치료제는 종양의 증식 및 전이에 필수적인 혈관신생에 관여하는 VEGF의 발현 및 기능을 억제하여, 종양의 성장을 감소시킴으로서 암을 유전자 차원에서 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
혈관신생과정, 유전자 치료제, VEGF, VEGF 수용체, 아데노-연관 바이러스

Description

ＶＥＧＦＲ 트렁케이티드 솔루블 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스（ｒＡＡＶ）및 이를 함유하는 대장암, 방광암 및/또는 폐암 특이적 유전자 치료제{Recombinant Adeno-associated Virus Comprising VEGFR Truncated Soluble cDNA and Gene Therapeutic Agent Specific to Large Intestine Cancer, Bladder Cancer and/or Lung Cancer Comprising the Same}
도 1은 rAAV-AShVEGF-A 벡터의 입자적정을 위한 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 rAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP 벡터의 입자적정을 위한 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 rAAV-TShVEGFR-1-GFP 벡터의 입자적정을 위한 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 rAAV-TShVEGFR-2-GFP 벡터의 입자적정을 위한 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 5는 rAAV-IRES-EGFP 벡터의 입자적정을 위한 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 rAAV-EGFP 벡터의 입자적정을 위한 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 7은 rAAV-AShVEGF-A의 트랜스덕션 효율을 측정한 공초점 현미경 사진이다.
도 8은 rAAV-TShVEGFR-1의 트랜스덕션 효율을 측정한 공초점 현미경 사진이다.
도 9는 rAAV-TShVEGFR-2의 트랜스덕션 효율을 측정한 공초점 현미경 사진이다.
도 10은 rAAV-IRES-GFP의 트랜스덕션 효율을 측정한 공초점 현미경 사진이다.
도 11은 각 암세포주에서 rAAV-AShVEGF-A 벡터의 VEGF 양 감소효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 rAAV 벡터들을 주사한 tumor 모델 누드마우스에서 종양의 체적 변화를 나타낸 그래프이다.
발명의 분야
본 발명은 VEGF 수용체단백질(VEGFR)의 truncated soluble cDNA와 아데노-연관 바이러스(AAV) 시스템을 이용한 유전자 치료제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, VEGFR의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터 및 상기 벡터와 VEGF-A 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 포함하는 대장암, 방광암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제에 관한 것이다.
발명의 배경
암으로 인한 사망률은 국내·외를 막론하고 해마다 증가하는 추세이다. 암은 세계적으로 감염성 질환 및 심혈관계 질환과 더불어 주요한 사망원인 중 하나로 손꼽히고 있다. 세계보건기구(WHO)의 세계 보건 보고서(World Health Report)에 따르면, 2004년 총 사망자의 12.5%인 7,121,000명이 암으로 사망하였으며, 식습관, 환경의 변화 및 수명연장으로 인하여 향후 25년 내에 암 발생인구가 매년 약 3천만 명으로 늘어나고, 이중 2천만 명의 인구가 암으로 사망할 것으로 예상하고 있다.
현재 암치료에 사용되는 방법은 크게 외과적 수술, 방사선 치료 및 약물치료가 있는데, 이들 방법은 암치료를 위해 독자적으로 사용되거나 두 가지 이상의 방법이 병용된다.
일반적으로, 외과적 수술은 다양한 암의 단계에서 적용될 수 있다. 초기단계의 암들은 대체적으로 외과적 수술로 치료가 가능하지만, 암이 많이 진전되었거나 전이가 일어난 경우에는 외과적 수술만으로 어렵기 때문에 방사선 치료 또는 약물치료를 같이 사용한다.
방사선 치료는 외부에서 방사선을 조사하거나, 체내로 투여한 방사성 물질에서부터 나온 X-선 또는 γ-선을 암세포에 조사하여 암을 치료한다.
약물치료는 항암제를 경구나 주사로 투여하여 암세포의 증식에 필요한 DNA나 관련 효소를 파괴하거나 억제하는 방법이다. 다른 방법에 비하여, 약물치료가 가지는 장점은 몸의 어떤 부위에 생긴 암이라도 약물이 도달할 수 있고, 전이된 암을 치료한다는 것이다. 현재 약물치료는 전이성 암 치료의 표준요법으로 사용되고 있다. 물론 전이된 암을 약물요법으로 완치할 수 있는 것은 아니지만, 증상을 완화시킴으로써 수명을 연장시키는 중요한 역할을 한다. 하지만, 이러한 약물요법의 주류를 이루고 있는 화학요법제는 부작용, 항암제 내성 등의 문제점을 가지고 있다.
그러나, 생명과학분야의 눈부신 발전에 힘입어 생물요법제가 급성장하고 있다. 생물요법제는 신체 본연의 면역 기능을 회복시키거나 증가시킴으로써 암세포의 활동력을 약화시켜 암의 진행을 막는 것을 치료적 근거로 삼고 있다. 신체의 면역 체계가 제 기능을 발휘할 때 암세포들을 효과적으로 사멸시킬 수 있으나, 그렇지 않은 경우 암세포가 쉽게 증식하거나, 또는 다른 병원균들이 쉽게 공격을 가할 수 있게 된다. 생물요법제의 상기 단점을 보완하기 위해 외과적 수술요법, 방사선요법, 화학요법 등과 같은 다른 치료법들과 같이 사용되기도 한다.
현재 생명과학분야에서 관심을 받고 있는 생물요법제로는 안티센스 항암제 및 혈관생성 억제제를 들 수 있다. 안티센스 항암제는 암세포의 특이적 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 DNA단편을 사용하여, mRNA의 프로세싱 또는 단백질의 발현을 저해하는 방법으로, 암세포의 사멸을 유도하는 것이다. 인간게놈 프로젝트의 결과로 인하여 30,000여개의 유전자 서열이 판독되고, 100,000여개의 mRNA서열을 알 수 있게 되었다. 이로써 암세포와 연관된 mRNA 후보군에 대한 정보가 대량 확보되면서, 신호전달 체계와 관련된 유전자, 세포사멸(apoptosis) 및 세포 증식에 관련된 유전자들에 대한 안티센스 항암제를 스크리닝하여 임상 실험중에 있다.
종양의 성장은 이에 필요한 산소 및 영양분을 공급해주는 새로운 혈관의 생 성(angiogenesis)이 있어야 가능하다. 일반적으로 암세포가 증식함에 따라 종양 내부는 저산소 상태가 되고, 조직이 괴사하게 된다. 또한, 종양 자체의 압력에 의해 혈관이 파괴됨으로써 저산소 상태는 더욱 악화된다. 이러한 저산소 상태를 극복하기 위하여 종양은 신혈관 생성과 관련된 인자들(VEGF, bFGF, IL-8, PDGF, PD-EGF 등)을 발현하게 되어 신혈관 생성을 촉진하게 된다. 즉, 신혈관 생성은 종양의 성장에 있어서 필수적인 과정인 것이다.
신혈관 생성 억제제는 이러한 종양의 신혈관 생성을 방해하여 종양의 성장을 저해함으로써, 암을 치료하는 것을 목적으로 한다. 직접적인 신혈관 생성 억제제는 혈관 내피세포의 증식 및 이동을 방해하거나, 신혈관 생성인자에 대한 반응을 억제함으로써 신혈관 생성을 방해한다. 직접적인 신혈관 생성 억제제는 후천내성(acquired drug resistance)을 보다 적게 유발한다는 장점을 지니고 있다.
간접적인 신혈관 생성 억제제는 신혈관 생성을 활성화시키는 종양내의 단백질 발현을 억제하거나, 상기 종양 단백질과 혈관 내피 세포표면 수용체 사이의 결합을 차단함으로써 신혈관 생성을 억제한다.
상기 기술한 바와 같이, 치료분야의 변화양상을 살펴보면, 인공적인 화학물질에서 천연 생체내 물질을 이용하는 방향으로 변화하고 있음을 알 수 있다. 특히, 다양한 분야의 유전체 연구 사업들이 진행되면서 각종 질병의 병인으로 작용하는 유전자들이 발견되고 있다. 이러한 연구 결과들을 임상적인 치료나 예방효과와 연결짓기 위하여, 기능이 소실되거나 변형된 유전자를 교정하기 위한 유전자를 체내에 도입하여 기능을 정상화시키거나 치료기능을 활성화 시켜주는 유전자 전달 기술 에 대한 연구, 즉 유전자 치료(gene therapy) 분야에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 상기 유전자 치료분야는 최근 수년간 관심과 연구가 집중되면서 그에 따른 결과들도 급증하고 있다.
유전자 치료법은 유전자 전달 및 발현에 의하여 질병을 치료하는 방법으로서, 약물치료와는 달리 장애가 있는 특정 유전자를 목표로 유전적 결함을 교정하는 치료법이다. 유전자 치료의 궁극적인 목표는 살아있는 세포를 유전적으로 변형하여 유익한 치료 효과를 얻는 것이다. 상기 치료법은 질환부위로 유전인자의 정확한 전달, 생체 내에서의 완전한 분해, 독성 및 면역 항원성 부재(不在) 및 유전인자의 장기간 안정적인 발현이라는 장점을 지니고 있어서, 질병치료에 있어 더할 나위없는 최선의 치료법으로 각광받고 있다.
유전자 치료의 주 연구분야는 특정 질병에 치료효과를 나타내는 유전자를 도입하거나, 항암제 등에 저항성을 나타내도록 정상세포의 저항기능을 증강시키거나, 각종 유전성 질환자에 있어서 변형되거나 소실된 유전자를 대체하는 분야로 요약할 수 있다.
유전자 치료법은 크게 생체내(in vivo)와 생체외(in vitro) 두 가지로 구분된다. in vivo 유전자 치료법은 치료 유전자를 직접 체내에 주입하는 것이고, in vitro 유전자 치료법은 일차적으로 목적 세포(target cell)를 시험관내에서 배양하고, 이들 세포에 유전자를 도입시킨 다음, 유전자 변형된 세포를 다시 체내로 주입하는 것이다. 현재 유전자 치료 연구 분야에서는 in vivo 유전자 치료법보다는 in vitro 유전자 치료법을 많이 사용하고 있다.
유전자 전달 기술은 크게 바이러스를 수송체로 사용하는 방법(viral vector-based transfer method), 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비바이러스성 방법(non-viral delivery method) 및 세포막에 일시적인 전기자극을 가하여 유전자를 도입하는 전기 투과법(electroporation) 등의 물리적 방법으로 구분할 수 있다.
상기 전달 기술 중에서, 바이러스 수송체를 사용하는 방법은 치료유전자로 대체된 유전자를 지니는 일부 또는 전체의 복제능력이 결손된 벡터로서 유전인자의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있기 때문에 유전자치료를 위해 선호하는 방법이다. 바이러스 수송체 또는 바이러스 벡터로 사용되는 바이러스로는 RNA 바이러스 벡터(레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등)와 DNA 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 등)가 있으며, 이 외에도 단순포진 바이러스 벡터(herpes simplex viral vector), 알파 바이러스 벡터(alpha viral vector) 등이 있다. 이중에서도 특히 연구가 활발히 진행되고 있는 것은 레트로바이러스와 아데노바이러스이다.
숙주세포의 게놈에 통합기능이 있는 레트로바이러스(Retrovirus)의 특징은 인체에 해가 없지만 통합 시 정상세포의 기능을 억제할 수 있고, 다양한 세포에 감염되고, 증식이 쉬우며, 1~7 kb 정도의 외부 유전자를 수용할 수 있고, 복제결핍 바이러스를 생성할 수 있는 능력이 있다는 것이다. 그러나, 유사분열 이후의 세포에 감염되기 힘들며, in vivo 상태에서 유전자 전달이 어렵고, 체세포 조직을 항시 in vitro에서 증식하여야만 한다는 단점도 지니고 있다. 또한, 레트로바이러스는 원형암유전자(proto-oncogene)에 통합될 수 있어 돌연변이의 위험성이 있고 세포를 괴사시킬 수도 있다.
한편, 아데노바이러스(Adenovirus)는 클로닝 벡터(cloning vector)로 여러 가지 장점을 가지는데, 중간정도의 크기로 세포 핵 속에서 복제될 수 있으며, 임상적으로 무독성이고, 외부 유전자를 삽입하여도 안정적이며, 유전자의 재배열이나 손실이 일어나지 않고, 진핵생물을 형질전환시킬 수 있으며, 숙주세포 염색체에 통합되어도 안정적이면서도 높은 수준으로 발현된다. 아데노바이러스의 좋은 숙주세포는 인간의 조혈, 림프, 골수종의 원인이 되는 세포이다. 그러나, 선상 DNA라서 증식이 어렵고, 감염된 바이러스를 회복시키는 것이 쉽지 않으며, 바이러스의 감염율이 낮다. 또한 전달된 유전자의 발현이 1~2주 후에 가장 많이 되고, 일부 세포에서는 3~4주정도만 발현이 유지된다. 또한, 문제가 되는 것은 높은 면역 항원성을 갖는다는 것이다.
아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus, AAV)는 상기와 같은 문제점들을 보완할 수 있으면서, 유전자 치료제로의 많은 장점을 가지고 있어 최근에 선호되고 있다. AAV는 단일가닥의 원바이러스(Provirus)로서, 복제하기 위하여 보조바이러스를 필요로 하고, AAV 게놈(genome)은 4,680 bp로서 감염세포의 염색체 19번 특정부위에 삽입이 가능하다. 트랜스 유전자(trans-gene)는 각각 145bp의 두 개의 역위말단반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열부분과 시그날 서열(signal sequence)부분에 의해 연결된 플라스미드 DNA(plasmid DNA)에 삽입된다. AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 다른 플라스미드 DNA와 함께 트랜스펙션 (transfection)시키고 아데노바이러스는 보조바이러스로서 첨가한다. AAV는 유전자를 전달하는 숙주세포의 범위가 넓고, 반복투여 시 면역 부작용이 적으며, 유전자 발현 기간이 긴 장점을 지니고 있다. 더구나, AAV 게놈이 숙주세포의 염색체에 통합되어도 안전하고, 숙주의 유전자발현을 변형시키거나 재배열시키지 않는다.
1994년 CFTR 유전인자를 포함한 AAV 벡터가 섬유아세포증(cystic fibrosis) 치료를 위하여 NIH에 승인된 이래, 다양한 질병의 임상치료에 이용되고 있다. 혈액응고인자인 인자 IX 유전자(factor IX gene)를 포함한 AAV벡터는 B형 혈우병(hemophilia B)을 치료에 이용되고 있고, AAV 벡터를 이용한 A형 혈우병 (hemophilia A) 치료제 개발이 진행되고 있다. 또한, 여러 가지 종류의 항암유전자를 함유한 AAV 벡터는 종양 백신으로 사용하는 경우가 인증되었다.
VEGF를 사용한 유전자 치료로는 폐순환승압을 치료하기 위해 맥관형성 인자를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 결손 아데노바이러스(대한민국 특허출원: 10-2001-7013633)를 예로 들 수 있지만, 상기 치료법은 VEGF 센스 염기서열을 사용하였기 때문에 허혈성 질환 치료에 한해서만 사용이 가능하고, 신혈관생성에 의한 질병, 특히, 암의 치료에는 사용이 불가하다. 더욱이, 아데노바이러스는 면역 항원성이 높고, 숙주세포로의 감염성이 낮을 뿐 아니라, 발현 기간이 짧은 단점을 지니고 있어 치료용으로 사용하기에는 부적절하다.
암을 치료용 폴리펩타이드에 대한 연구는 기존에 많이 진행되어 왔지만, 상기 물질들의 대부분은 화학요법제에 속한다. 그리고, 폴리뉴클레오티드에 대한 연구도 지속적으로 진행되어 왔지만, 바이러스 벡터 등을 통하여 효율적으로 생체내 에 이동시키는 방법과 연계해서는 그 결과가 미흡하다.
이에, 본 발명자들은 항암효과가 높은 rAAV 벡터에 VEGFR truncated soluble cDNA가 삽입되도록 제작된 rAAV-TShVEGFR-1 및 rAAV-TShVEGFR-2을 제작하고, 상기 rAAV-hVEFGR이 in vivo 상에서 종양억제효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 유전자치료용 VEGFR-1 truncated soluble cDNA 또는 VEGFR-2 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 VEGFR-1 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터, VEGFR-2 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터 및 VEGF-A 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 포함하는 대장암, 방광암 및/또는 폐암 특이적 유전자치료제를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 서열번호 4의 VEGFR-1의 truncated soluble cDNA를 함유하는 pAAV 벡터, AAV rep-cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 동물세포주에 트랜스펙션하는 단계; (b) 상기 트랜스펙션된 동물세포주를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 세포주를 파쇄한 다음, 재조합 rAAV 입자를 분리·정제하는 단계를 거쳐 제조되고, 서열번호 4의 VEGFR-1의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 서열번호 9의 VEGFR-2의 truncated soluble cDNA를 함유하는 pAAV 벡터, AAV rep-cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 동물세포주에 트랜스펙션하는 단계; (b) 상기 트랜스펙션된 동물세포주를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 세포주를 파쇄한 다음, 재조합 rAAV 입자를 분리·정제하는 단계를 거쳐 제조되고, 서열번호 9의 VEGFR-2의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 VEGFR-1의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터, VEGFR-2의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터 및 서열번호 1의 VEGF-A 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 포함하는 대장암, 방광암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자 치료제는 서열번호 4의 VEGFR-1의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터, AAV rep-cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 동물세포주에 트랜스펙션하고, 상기 트랜스펙션된 동물세포주를 배양한 다음, 이를 파쇄하여 재조합 rAAV 입자를 분리·정제하여 제조된 서열번호 4의 VEGFR-1의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터임을 특징으로 하는 유전자 치료제일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 유전자 치료제는 서열번호 9의 VEGFR-2의 truncated soluble cDNA를 함유하는 pAAV 벡터, AAV rep-cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 동물세포주에 트랜스펙션하고, 상기 트랜스펙션된 동물세포주를 배양한 다음, 이를 파쇄하여 재조합 rAAV 입자를 분리·정제하여 제조된 서열번호 9의 VEGFR-2의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터임을 특징으로 하는 유전자 치료제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 혈관신생 억제기능 유전자를 함유한 pAAV 플라스미드 클로닝
클로닝 방법에 따라 pAAV-FIX cis plasmid DNA (US 6,093,292)를 이용하여 VEGF-A (NCBI accession # NM_003376 for human) cDNA를 안티센스 방향으로 pAAV- FIX cis plasmid DNA에 삽입시키기 위하여, pAAV-FIX cis plasmid DNA에 함유된 factor IX cDNA 유전자를 상기 VEGF-A isoform의 안티센스 cDNA로 대체시켜 pAAV-AShVEGF-A의 trans-gene constructs를 제작하였다. 또한, VEGF-A isoform 안티센스 cDNA가 IRES-EGFP에 연결된 pAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP의 trans-gene constructs를 제작하였다. VEGF의 세가지 isoform과 작용하는 수용체인 VEGFR-1 (Flt-1; NCBI accession # NM_002019 for human)와 VEGFR-2 (Kdr/Flk-1; NCBI accession # AF063658 for human)의 truncated soluble cDNA도 같은 방식으로 삽입 혹은 대치하여, pAAV-TShVEGFR-1 및 pAAV-TShVEGFR-2의 trans-gene constructs를 제작하였다. 아울러 VEGF 수용체단백질 cDNA에 GFP를 tagging하여, pAAV-TShVEGFR-1-GFP 및 pAAV-TShVEGFR-2-GFP의 2가지 trans-gene constructs를 만들었고, 이상의 6 가지 플라스미드를 확인하기 위해 모두 sequencing 방법으로 면밀히 분석하였다. 항상 trans-gene은 각각 145bp의 두 개의 역위말단반복서열부분 (ITR)과 human cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter, SV40 early mRNA polyadenylation signal 서열부분에 의해 연결된 플라스미드 DNA에 삽입시켰다.
(1) pAAV-AShVEGF-A의 제작
HUVEC(Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., USA) 세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였으며, 하기의 AShVEGF-A 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 429bp의 인간 VEGF-A isoform 안티센스 cDNA(서열번호 1)(1025-1453 위치)를 증폭하였다. 증폭 단편을 제한효소 KpnI 및 XhoI으로 처리하여, 동일한 제한효소로 절단된 pAAV-FIX cis 플라스미드 DNA와 라이게이션시켜, pAAV-AShVEGF-A를 제작하였다.
AShVEGF-A F2:GG GGTACC GTCTTGCTCTATCTTTC(서열번호 2)
KpnI
AShVEGF-A R1:CC CTCGAG GGCCTCCGAAACCATGAACT(서열번호 3)
XhoI
(2) pAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP의 제작
pEGFP-N1 플라스미드 DNA(Clontech, USA)를 제한효소 KpnI 및 NotI으로 처리하여 linearized insert를 준비하고, 상기 pAAV-FIX cis plasmid DNA를 제한효소 KpnI 및 NotI으로 처리하여 상기 insert와 라이게이션시켜 pAAV-EGFP를 제작하였다.
pIRES2-EGFP 플라스미드 DNA(Clontech, USA)를 제한효소 NheI으로 처리하고 Klenow 단편으로 blunt시킨 다음, 제한효소 NotI으로 처리하여 linearized insert을 준비하고, 상기 pAAV-EGFP 플라스미드 DNA를 제한효소 KpnI으로 처리하고, T4 DNA 폴리머레이즈로 blunt시킨 다음, 제한효소 NotI으로 처리한 linearized 벡터와 라이게이션 하여, pAAV-IRES-EGFP를 제작하였다.
상기 pAAV-IRES-EGFP 플라스미드를 제한효소 BamHI으로 처리하고, 앞에서 구축된 pAAV-AShVEGF-A 플라스미드 DNA를 제한효소 BamHI으로 처리하여 상기 두 DNA 단편을 라이게이션하여 pAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP를 제작하였다.
(3) pAAV-TShVEGFR-1의 제작
암세포주 LCSC#1 세포(WO 02/061069)로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였으며, 하기 TShVEGFR-1 F1 및 TShVEGFR-1 R3 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 1968bp의 truncated soluble human VEGFR-1 수용체 cDNA(서열번호 4) (250-2217 위치)를 증폭하였다. 증폭단편을 제한효소 KpnI 및 XhoI으로 처리하여, 동일한 제한효소로 절단된 pAAV-FIX cis 플라스미드 DNA와 라이게이션시켜, pAAV-TShVEGFR-1을 제작하였다.
TShVEGFR-1 F1:
AA GGTACCGCCACC ATGGTCAGCTACTGGGACA(서열번호 5)
Kpn I Kozak
TShVEGFR-1 R3:
CG CTCGAGCTA TCTGATTGTAATTTCTTTCTTCTG(서열번호6)
Xho I stop codon
(4) pAAV-TShVEGFR-1-GFP construct 클로닝
암세포주 LCSC#1 세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였으며, 상기 TShVEGFR-1 F1 및 하기 TShVEGFR-1 R1 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 1969bp의 truncated soluble human VEGFR-1 수용체 cDNA(서열번호 7: 250-2218 위치)를 증폭하였다. 증폭 단편은 제한효소 KpnI 및 ApaI으로 처리하여, 동일한 제한 효소로 절단된 pAAV-EGFP 플라스미드와 라이게이션시켜, truncated soluble VEGFR-1 cDNA에 GFP 표지단백질이 tagging된 pAAV-TShVEGFR-1-GFP를 제작하였다.
TShVEGFR-1 R1:
CC GGGCCC CTCTGATTGTAATTTCTTTCTTCTG (서열번호 8)
Apa I
(5) pAAV-TShVEGFR-2의 제작
암세포주 LCSC#1 세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였으며, 하기 TShVEGFR-2 F1 및 TShVEGFR-2 R2 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 2402bp의 truncated soluble human VEGFR-2 수용체 cDNA(서열번호 9: 1-2402 위치)를 증폭하였다. 증폭 단편은 제한효소 KpnI 및 XhoI으로 처리하여, 동일한 제한효소로 절단된 pAAV-FIX cis 플라스미드 DNA와 라이게이션시켜, pAAV-TShVEGFR-2를 제작하였다.
TShVEGFR-2 F1:
GG GGTACCGCCACC ATGGAGAGCAAGGTGCT (서열목록 10)
Kpn I Kozak
TShVEGFR-2 R2:
CG CTCGAGT TAGCCTGTCTTCAGTTCCCCTCCATT(서열목록 11)
Xho I stop codon
(6) pAAV-TShVEGFR-2-GFP construct 클로닝
암세포주 LCSC#1 세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였으며, 상기 TShVEGFR-2 F1 및 하기 TShVEGFR-2 R1 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 2397bp의 truncated soluble human VEGFR-2 수용체 cDNA(서열번호 12: 1-2397위치)를 증폭하였다. 증폭단편을 제한효소 KpnI 및 ApaI으로 처리하여, 동일한 제한효소로 절단된 pAAV-EGFP 플라스미드와 라이게이션시켜, truncated soluble VEGFR-1 cDNA에 GFP 표지단백질이 tagging된 pAAV-TShVEGFR-2-GFP를 제작하였다.
TShVEGFR-2 R1
CC GGGCCCG TGTCTTCAGTTCCCCTCCA (서열번호 13)
Apa I
실시예 2. 혈관신생억제 유전자치료제로 이용되는 rAAV 벡터 구축
유전자 치료에 이용되는 재조합 AAV (rAAV) 벡터를 제작하기 위해서는 실시예 1에서 제작된 각각의 pAAV 플라스미드 DNA 이외에 AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 AAV rep-cap 플라스미드 DNA (pAAV-RC 플라스미드, Stratagene Co., USA)와 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 (pHelper 플라스미드, Stratagene Co., USA)가 필요하다. 상기 세 가지 종류의 플라스미드 DNA를 HEK293 (human embryonic kidney 293; ATCC CRL-1573) 세포에 모두 트랜스팩션시킨 다음, 96시간 배양한 후, HEK293 세포를 모아서 초음파 파쇄하고, 재조합 AAV (rAAV) particle을 CsCl 밀도구배 원심분리를 3번 반복하여, RI (Refractive Index)가 1.37~1.41 g/ml인 부분을 모아 순수하게 분리하였다.
상기 분리된 rAAV particles의 적정(titration)은 CMV 프로모터 부위의 PCR 프라이머[CMV F1 : 5'-GGG CGT GGA TAG CGG TTT GAC TC-3' (서열번호 14), CMV R1 : 5'-CGG GGC GGG GTT ATT ACG ACA TT-3' (서열번호 15)]를 제작하여 Quantitative PCR 방법으로 적정하였다. 이때 농도를 알고 있는 각 pAAV 플라스미드 DNA를 표준물질로 이용하였으며, 상기 방법으로 생산 분리된 재조합 rAAV 벡터는 보통 1012∼1013 viral particles/ml의 rAAV particle titer를 얻었음을 확인하였다.
하기에는 각 rAAV의 입자적정 결과를 나타내었다.
(1) rAAV-AShVEGF-A의 입자적정
분광광도계로 농도를 측정한 pAAV-AShVEGF-A DNA를 연속적으로 희석하여 표준곡선용 PCR을 수행하여 각 농도별로 전기영동한 결과를 도 1a의 왼쪽 패널에 나타내었다. 왼쪽 레인으로부터 차례로, 104~108 분자수의 시료를 나타내며, 각 레인의 증폭된 DNA 밴드의 강도를 Imager densitometer(Alpha Innotech, USA)를 이용하여 측정하였다.
상기에서 순수 분리된 rAAV-AShVEGF-A 벡터를 연속적으로 희석하여 입자적정용 PCR을 수행하고, 각 농도별 전기영동한 결과를 도 1a의 오른쪽 패널에 나타내었 다. 왼쪽 레인으로부터 차례로, 10-3~100 희석배수의 시료를 나타내며, 각 레인의 증폭된 DNA 밴드 강도를 Imager densitometer를 이용하여 측정하였다.
상기 표준곡선용 PCR 결과를 이용하여 오른쪽 패널에 있는 표준곡선을 만들었고, 입자적정용 PCR 결과를 표준곡선에 적용하여 5×1011 viral particles/㎖ 라는 적정값(titer)을 얻었다 (도 1b).
(2) rAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP의 입자적정
분광광도계로 농도를 측정한 pAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP DNA를 연속적으로 희석하여 표준곡선용 PCR을 수행하여 각 농도별로 전기영동한 결과를 도 2a의 왼쪽 패널에 나타내었다. 오른쪽 레인으로부터 차례로, 103~109 분자수의 시료를 나타내며, 각 레인의 증폭된 DNA 밴드의 강도를 Imager densitometer(Alpha Innotech, USA)를 이용하여 측정하였다.
상기에서 순수 분리된 rAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP 벡터를 연속적으로 희석하여 입자적정용 PCR을 수행하고, 각 농도별 전기영동한 결과를 도 2a의 오른쪽 패널에 나타내었다. 오른쪽 레인으로부터 차례로, 10-4~100 희석배수의 시료를 나타내며, 각 레인의 증폭된 DNA 밴드 강도를 Imager densitometer를 이용하여 측정하였다.
상기 표준곡선용 PCR 결과를 이용하여 오른쪽 패널에 있는 표준곡선을 만들었고, 입자적정용 PCR 결과를 표준곡선에 적용하여 1.55×1011 viral particles/㎖ 라는 적정값(titer)을 얻었다 (도 2b).
(3) rAAV-TShVEGFR-1-GFP의 입자적정
분광광도계로 농도를 측정한 pAAV-TShVEGFR-1-GFP DNA를 연속적으로 희석하여 표준곡선용 PCR을 수행하여 각 농도별로 전기영동한 결과를 도 3a의 왼쪽 패널에 나타내었다. 왼쪽 레인으로부터 차례로, 103~108 분자수의 시료를 나타내며, 각 레인의 증폭된 DNA 밴드의 강도를 Imager densitometer(Alpha Innotech, USA)를 이용하여 측정하였다.
상기에서 순수 분리된 rAAV-TShVEGFR-1-GFP 벡터를 연속적으로 희석하여 입자적정용 PCR을 수행하고, 각 농도별 전기영동한 결과를 도 3a의 오른쪽 패널에 나타내었다. 왼쪽 레인으로부터 차례로, 10-4~100 희석배수의 시료를 나타내며, 각 레인의 증폭된 DNA 밴드 강도를 Imager densitometer를 이용하여 측정하였다.
상기 표준곡선용 PCR 결과를 이용하여 오른쪽 패널에 있는 표준곡선을 만들었고, 입자적정용 PCR 결과를 표준곡선에 적용하여 1.36×1011 viral particles/㎖라는 적정값(titer)을 얻었다 (도 3b).
(4) rAAV-TShVEGFR-2-GFP의 입자적정
분광광도계로 농도를 측정한 pAAV-TShVEGFR-2-GFP DNA를 연속적으로 희석하여 표준곡선용 PCR을 수행하여 각 농도별로 전기영동한 결과를 도 4a의 왼쪽 패널 에 나타내었다. 왼쪽 레인으로부터 차례로, 103~108 분자수의 시료를 나타내며, 각 레인의 증폭된 DNA 밴드의 강도를 Imager densitometer(Alpha Innotech, USA)를 이용하여 측정하였다.
상기에서 순수 분리된 rAAV-TShVEGFR-2-GFP 벡터를 연속적으로 희석하여 입자적정용 PCR을 수행하고, 각 농도별 전기영동한 결과를 도 4a의 오른쪽 패널에 나타내었다. 왼쪽 레인으로부터 차례로, 10-4~100 희석배수의 시료를 나타내며, 각 레인의 증폭된 DNA 밴드 강도를 Imager densitometer를 이용하여 측정하였다.
상기 표준곡선용 PCR 결과를 이용하여 오른쪽 패널에 있는 표준곡선을 만들었고, 입자적정용 PCR 결과를 표준곡선에 적용하여 1.12×1012 viral particles/㎖라는 적정값(titer)을 얻었다 (도 4b).
(5) rAAV-IRES-EGFP의 입자적정
분광광도계로 농도를 측정한 pAAV-IRES-EGFP DNA를 연속적으로 희석하여 표준곡선용 PCR을 수행하여 각 농도별로 전기영동한 결과를 도 5a의 왼쪽 패널에 나타내었다. 오른쪽 레인으로부터 차례로, 103~108 분자수의 시료를 나타내며, 각 레인의 증폭된 DNA 밴드의 강도를 Imager densitometer(Alpha Innotech, USA)를 이용하여 측정하였다.
상기에서 순수 분리된 rAAV-IRES-EGFP 벡터를 연속적으로 희석하여 입자적정 용 PCR을 수행하고, 각 농도별 전기영동한 결과를 도 5a의 오른쪽 패널에 나타내었다. 오른쪽 레인으로부터 차례로, 10-4~100 희석배수의 시료를 나타내며, 각 레인의 증폭된 DNA 밴드 강도를 Imager densitometer를 이용하여 측정하였다.
상기 표준곡선용 PCR 결과를 이용하여 오른쪽 패널에 있는 표준곡선을 만들었고, 입자적정용 PCR 결과를 표준곡선에 적용하여 8.91×1011 viral particles/㎖라는 적정값(titer)을 얻었다 (도 5b).
(6) rAAV-EGFP의 입자적정
분광광도계로 농도를 측정한 pAAV-EGFP DNA를 연속적으로 희석하여 표준곡선용 PCR을 수행하여 각 농도별로 전기영동한 결과를 도 6a의 왼쪽 패널에 나타내었다. 오른쪽 레인으로부터 차례로, 105~109 분자수의 시료를 나타내며, 각 레인의 증폭된 DNA 밴드의 강도를 Imager densitometer(Alpha Innotech, USA)를 이용하여 측정하였다.
상기에서 순수 분리된 rAAV-EGFP 벡터를 연속적으로 희석하여 입자적정용 PCR을 수행하고, 각 농도별 전기영동한 결과를 도 6a의 오른쪽 패널에 나타내었다. 오른쪽 레인으로부터 차례로, 10-3~100 희석배수의 시료를 나타내며, 각 레인의 증폭된 DNA 밴드 강도를 Imager densitometer를 이용하여 측정하였다.
상기 표준곡선용 PCR 결과를 이용하여 오른쪽 패널에 있는 표준곡선을 만들 었고, 입자적정용 PCR 결과를 표준곡선에 적용하여 5.36×109 viral particles/㎖라는 적정값(titer)을 얻었다 (도 6b).
실시예 3. 암 세포주 배양 및 rAAV 벡터 유전자치료제 처리
암의 성장과 전이성을 방지하는 항암효과를 in vitro 상에서 연구하기 위해 인간 대장암세포주(T84: ATCC CCL-248), 인간 폐암세포주(LCSC#1: W0 02/061069), 인간 위암세포주(NUGC3, MKN45, MKN74)의 5가지 암 세포주를 각 세포주의 최적조건에서 배양하였다. 실시예 2에서 제조한 재조합 rAAV의 상기 암 세포주에 대한 항암효과를 실험하기 위하여, 세포를 6 well plate에 105 cell/well 만큼 분주하여 24시간 동안 키우고, 다양한 조합의 혈관신생억제 rAAV 벡터를 총 M.O.I.가 105 되도록 첨가하고, 24시간 동안 배양하였다. 본 실시예의 음성대조군으로는 rAAV를 처리하지 않은 동일 세포군 및 VEGF 안티센스가 삽입되어 있지 않은 GFP만을 발현하는 rAAV 벡터(rAAV-EGFP)를 사용하여 실시예 2에서 제조한 재조합 rAAV와 같은 조건으로 처리하여 사용하였다. rAAV 벡터가 처리된 세포는 1 x PBS로 두 번 씻어주고 새로운 최적조건의 배지를 첨가하여 72시간 동안 배양하였다.
실시예 4. 암세포주의 트랜스덕션 효율 측정
배양한 세포의 트랜스덕션(transduction) 효율은 GFP 단백질 발현을 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통하여 모니터링하여 확인하였다.
실시예 2에서 제조한 rAAV 벡터 중 GFP를 발현하는 rAAV를 실시예 3의 5가지 암세포주 (T84, LCSC#1, MKN45, MKN74, NUGC3)에 각 종류의 rAAV 벡터를 총 M.O.I.가 105 되게 24시간 처리하고, 48시간이 경과한 후 공초점 현미경 방법(excitation 488 nm; emission>500 nm)으로 GFP 단백질 발현을 모니터하여 트랜스덕션 효율을 측정하였다. rAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP는 Bicistronic 하게 GFP 단백질을 독립적으로 발현할 수 있으리라 예상되고, rAAV-TShVEGFR-1-GFP 및 rAAV-TShVEGFR-2-GFP 벡터는 GFP 단백질이 tagging 된 fusion 단백질을 발현하므로, GFP 단백질 발현을 모니터함으로써 infection 효율을 측정할 수 있다. 한편, rAAV 벡터를 전혀 처리하지 않은 음성 대조군 세포와 rAAV-IRES-EGFP 처리한 세포를 대조군으로 사용하여 함께 GFP 단백질 발현을 모니터하였다.
그 결과, 도 7 내지 도 10에 나타난 바와 같이, 상기 4 종류의 rAAV 벡터를 다섯 가지 암세포주에 감염시킨 결과, 트랜스덕션 효율은 거의 100%에 가까울 정도로 매우 높은 것으로 측정되었고, 항암 유전자 치료용 전달체로 rAAV가 매우 적합함을 확인할 수 있었다.
실시예 5. ELISA를 이용한 암세포주 내에서의 rAAV 벡터의 혈관신생억제 효과 확인
(1) rAAV-AShVEGF-A 벡터의 VEGF 양 감소효과 측정
rAAV-AShVEGF-A 벡터를 3 가지 위암세포주 (NUGC3, MKN74, MKN45), 1 가지 폐암 세포주(LCSC#1) 및 1 가지 대장암 세포주 (T84)에 총 M.O.I가 105 되게 24시간 처리하고, 72시간이 경과한 후 세포를 파쇄하여 세포 lysate를 준비하였다. 대조군으로는 rAAV 벡터를 전혀 처리하지 않은 세포군과 rAAV-EGFP 벡터를 처리한 군의 두가지 세포군을 사용하였다. 각 세포 lysates의 단백질 정량하고, 10 μg의 총단백질을 포함하는 lysates를 이용하여 ELISA (RPN2779, Amersham Biosciences, USA)를 수행하였고, rAAV-AShVEGF-A 벡터 처리에 의한 VEGF 양의 변화는 세 번 반복하여 측정하였다.
그 결과, 도 11 및 표 1에 나타난 바와 같이, 대장암 세포주인 T84에서는 rAAV-EGFP 벡터를 처리한 control 군에 비해 rAAV-AShVEGF-A 벡터를 처리한 세포군의 VEGF 양이 55% 이상 감소하였고, 폐암 세포주인 LCSC#1에서는 control 세포군에 비해 VEGF 양이 45% 정도 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 세 가지 위암 세포주에서는 VEGF 양의 변화가 거의 관찰되지 않았다.
rAAV-AShVEGF-A처리에 의한 암세포주의 VEGF 양 변화
T84 MKN74 MKN45 NUGC3 LCSC#1
negative 20.32±0.28 2.95±0.37 19.13±0.67 16.13±0.95 4.78±0.18
GFP 26.62±0.71 3.69±0.31 11.92±0.72 13.55±0.55 5.27±0.24
AShVEGF-A 11.62±1.74 2.65±0.10 12.5±0.37 12.91±0.09 2.92±0.36
실시예 6. 혈관신생억제 in vivo 항암효과 연구
BABL/c 누드마우스 (BABL/c nu/nu mouse, ㈜중앙실험동물, Japan SLC, Inc.) 에 NCI-H460 인간 폐암세포주(ATCC HTB-177) 5 x 106 개를 피하주사 방법으로 주입하여 tumor model을 만들었다.
상기 암세포를 주입한 BABL/c 누드마우스의 종양체적이 200∼300 mm3에 이르면 1011∼1012 viral particles/1개체의 각종 조합의 rAAV 벡터(rAAV-AShVEGF-A, rAAV-TShVEGFR-1, rAAV-TShVEGFR-2, rAAV-TShVEGFR-1+rAAV-TShVEGFR-2 및 rAAV-TShVEGFR-1+rAAV-TShVEGFR-2+ rAAV-AShVEGF-A)를 미정맥 주사 방법 (tail vein injection)으로 트랜스덕션시켰다. 트랜스덕션 한 후 4주 동안 동물의 일반증상(일반상태, 운동성, 외관, 자율신경 및 사망여부)을 관찰하고, 체중을 측정하며, 전자캘리퍼스(Absolute digimatic, Mitutoyo Corp., Japan)를 이용하여 종양체적을 측정하였다. 트랜스덕션 후 28일째에 쥐를 부검하여 쥐로부터 고형암을 분리하고 Digital Plethysmometer(LE7500, Letica, Spain)를 이용하여 종양부피를 측정하였다. 각 장기(간, 비장, 신장, 심장, 폐, 고환 및 부고환)와 종양은 적출 후 10% 중성 포르말린 및 Bouin Solution(종양, 고환 및 부고환의 경우)으로 장기를 고정시킨 후, 파라핀 포매 섹션을 만들어 면역조직화학적 및 조직학적 분석을 수행하였다. 내피세포의 세포밀도를 측정하기 위해 anti-CD34 항체를 이용하여 면역조직화학적 분석을 수행하고, 헤마톡실린/에오신 염색으로 조직학적 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, HEPES를 주사한 음성대조군에 비하여, rAAV-AShVEGF-A, rAAV-TShVEGFR-1, rAAV-TShVEGFR-2, rAAV-TShVEGFR-1 + rAAV-TShVEGFR-2 및 rAAV-TShVEGFR-1 + rAAV-TShVEGFR-2 + rAAV-AShVEGF-A를 주사한 실험군에서 종양체적이 감소함을 확인할 수 있었으며, 특히, rAAV-TShVEGFR-1 + rAAV-TShVEGFR-2 + rAAV-AShVEGF-A를 함께 주사한 실험군에서 종양체적이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
본 발명은 유전자치료용 VEGFR-1의 truncated soluble cDNA 또는 VEGFR-2의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 제공하는 효과가 있다. 본 발명은 또한, VEGFR의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터 및 상기 VEGFR의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터 및 VEGF-A 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 모두 포함하는 대장암, 방광암 및/또는 폐암 특이적 유전자치료제를 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른, 유전자 치료제는 종양의 증식 및 전이에 필수적인 혈관신생에 관여하는 VEGF의 발현 및 기능을 억제하여, 종양의 성장을 감소시킴으로서 암을 유전자 차원에서 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 서열번호 4의 VEGFR-1의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터, 서열번호 9의 VEGFR-2의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터 및 서열번호 1의 VEGF-A 안티센스 cDNA를 포함하는 rAAV 벡터를 함유하는 대장암, 방광암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 서열번호 4의 VEGFR-1의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터는 서열번호 4의 VEGFR-1의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터, AAV rep-cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 동물세포주에 트랜스펙션하고, 상기 트랜스펙션된 동물세포주를 배양한 다음, 이를 파쇄하여 재조합 rAAV 입자를 분리·정제하여 제조된 것임을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  5. 제3항에 있어서, 상기 서열번호 9의 VEGFR-2의 truncated soluble cDNA를 함유하는 rAAV 벡터는 서열번호 9의 VEGFR-2의 truncated soluble cDNA를 함유하는 pAAV 벡터, AAV rep-cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 동물세포주에 트랜스펙션하고, 상기 트랜스펙션된 동물세포주를 배양한 다음, 이를 파쇄하여 재조합 rAAV 입자를 분리·정제하여 제조된 것임을 특징으로 하는 유전자 치료제.
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