KR20200102943A - 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 - Google Patents

암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 Download PDF

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KR20200102943A
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Abstract

본 발명은 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임은 정상 조직에는 작용하지 않고 암 조직 특이적으로 발현되어 안전성이 높고, 전사 후 수준에서 발현 효율이 우수하므로 암을 치료하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 재조합 벡터는 CMV 프로모터, SD/SA 및 WPRE를 보유하여 리보자임의 발현 효율이 높고, miR-122T를 보유함으로써 miR-122에 의해 활성이 조절될 수 있어 안전성이 우수하다. 따라서, HCV가 원인인 간암 중에서 miR-122의 발현 수준이 정상 조직보다 암 조직에서 높게 나타나는 일부 간암을 제외한 모든 간암을 치료하는 데 효과적으로 이용될 수 있고, miR-122를 실질적으로 발현하지 않는 다른 암종에서도 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도{TUMOR-TARGETING TRANS-SPLICING RIBOZYME AND USE THEREOF}
본 발명은 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도에 관한 것이다.
텔로머레이즈(telomerase)는 리보뉴클레오단백질(ribonucleoprotein)로, 염색체의 3' 말단에 존재하는 텔로미어의 끝 부위에 TTAGGG 서열을 반복하여 첨가함으로써 DNA 복제시 짧아지는 텔로미어 부위를 복원하여 세포의 영속적인 증식을 가능하게 한다. 텔로머레이즈는 암세포의 영속성(immortality) 및 증식능력을 조절하는 가장 중요한 효소 중의 하나로, 조혈세포 및 80~90%의 암세포들이 텔로머레이즈 활성을 가진 반면 암세포 인근의 정상 세포들은 그 활성을 갖고 있지 않고, 더욱이 진행된 전이암의 영속적 성장에 텔로머레이즈 재활성이 주요한 영향을 끼치고 있다.
사람의 텔로머레이즈는 기질 RNA로 작용하는 인간 텔로머레이즈 RNA(human telomerase RNA, hTR)와 촉매 기능을 하는 인간 텔로머레이즈 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)의 2개 구성으로 이루어져 있다. 인간 텔로머레이즈 역전사효소(hTERT) 유전자는 텔로머레이즈 활성과 비례하여 발현되고, 세포내 hTERT 수준과 세포의 텔로머레이즈 활성은 깊은 상관관계가 있다. 특히, 암환자의 90% 이상에서 TERT 활성이 관찰된다.
최근, 이러한 hTERT를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자임(trans-splicing ribozyme)이 알려지면서, 이를 이용한 암 치료제를 개발하려는 시도가 활발히 진행되고 있다. 그러나 트랜스-스플라이싱 리보자임과 조직 특이적인 프로모터와의 조합은 높은 조직 특이성을 보이는 반면 발현 효율이 매우 낮아, 치료 효율 측면의 단점이 문제된다. 또한, 줄기세포, 조혈모세포, 생식세포, 정상적으로 세포 분열하는 간 세포(regenerating normal liver cell) 등의 정상 세포에서도 텔로머레이즈 활성이 나타나므로, hTERT를 표적으로 하는 치료가 상기 세포에 대한 독성을 유발할 수 있다. 간세포는 비록 약하지만 정상 간세포의 5%가 텔로머레이즈 활성을 갖고 있으며, 재생 중인 간(regenerating liver)은 텔로머레이즈 활성이 증가되는 것으로 알려져 있다. 특히, 간세포 암종(Hepatocellular carcinoma, HCC)은 대부분 간경화가 동반되며, 이러한 간경화 부위에서 재생 결절을 구성하는 비종양성의 간세포(non-tumorous hepatocytes)에서는 낮은 수준이지만 TERT가 발현된다.
대한민국 공개특허 제10-2016-0038674호는 조직 특이적 프로모터, 암 특이적 유전자를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자임, 및 상기 리보자임의 3' 엑손에 연결된 목적 유전자를 포함하는 리보자임-목적 유전자 발현 카세트에 마이크로 RNA-122(microRNA-122, miR-122)를 인식하는 핵산 서열이 추가적으로 연결된 재조합 벡터와, 이로부터 발현된 리보자임의 간암 예방 또는 치료 용도를 개시하고 있다. 상기 miR-122는 정상 간에서 매우 과량 발현된다고 알려진 마이크로 RNA로서 간암으로 진행될 경우 그 발현이 낮아진다. 종래 기술은 이러한 현상에 기반하여, 리보자임 발현 벡터의 3' UTR 부위에 miR-122 표적 부위를 도입함으로써, 간으로 전달된 리보자임이 정상 간에서는 과발현된 miR-122에 의해 발현이 되지 않지만, miR-122 수준이 낮아진 간암에서는 발현되어 작용할 수 있도록 한 것이다.
그러나 종래기술은 치료 효과를 나타내기 위해 벡터가 도입된 바이러스를 높은 농도로 처리해야 하는 문제가 있었다. 또한, 간염 C 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV) 감염이 원인인 간암 조직에서는 많은 경우 정상 간보다 miR-122의 발현이 증가한다는 보고가 있어, 이와 같이 miR-122의 발현이 증가되어 있는 간암이나 간암 이외에 다른 암에 적용할 수 있는지 여부가 문제되었다.
대한민국 공개특허 제10-2016-0038674호
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로서, 안전성 및 발현 효율이 우수한 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임의 암 치료 용도를 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명은
(i) 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus, CMV) 프로모터; 및
(ii) 암 특이적 유전자를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자임, 상기 리보자임의 3' 엑손에 연결된 목적 유전자를 포함하는, 리보자임-목적 유전자 발현 카세트를 포함하며,
상기 발현카세트는 리보자임-목적 유전자 발현 카세트의 5' 말단에 스플라이싱 공여/스플라이싱 수여 서열(splicing donor/splicing acceptor sequence, SD/SA sequence)이 연결되고, 3' 말단에 WPRE(Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element)가 연결된 것으로,
(iii) 상기 WPRE의 3' 말단에 마이크로 RNA-122(microRNA-122, miR-122)를 인식하는 핵산 서열이 추가로 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로부터 발현된 리보자임을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터, 유전자 전달 시스템 또는 리보자임을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임은 정상 조직에는 작용하지 않고 암 조직에서 특이적으로 발현되어 안전성이 높고, 전사 후 수준에서 발현 효율이 우수하므로 암을 치료하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 재조합 벡터는 CMV 프로모터, SD/SA 및 WPRE 서열을 보유하여 리보자임의 발현 효율이 높고, miR-122T를 보유하여 miR-122에 의해 활성이 조절될 수 있어 안전성이 우수하다. 따라서, HCV가 원인인 간암 중에서, miR-122의 발현이 정상 조직보다 암 조직에서 높게 나타나는 일부 간암을 제외하면, 모든 간암을 치료하는 데 효과적으로 이용될 수 있고, miR-122를 실질적으로 발현하지 않는 다른 암의 치료에도 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 CMV 프로모터 기반 hTERT 표적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 목적 유전자 발현 카세트의 구성을 나타내는 모식도이다.
도 2는 miR-122를 발현하지 않는 Hep3B 세포주(a) 및 miR-122를 발현하는 Huh-7.5 세포주(b)에서 형질도입된 ECRT-122T 아데노바이러스의 MOI에 따른 세포 생존 비율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 miR-122를 발현하지 않는 세포주(a: Hep3B, b: SNU398, c: SNU449)에서 형질도입된 ECRT-122T 아데노바이러스의 MOI에 따른 세포 생존 비율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 miR-122를 발현하는 세포주(a: Huh-7, b: Huh-7.5)에서 형질도입된 ECRT-122T 아데노바이러스의 MOI에 따른 세포 생존 비율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 miR-122를 발현하거나 또는 발현하지 않는 다양한 간암 세포주에서 형질도입된 ECRT-122T 아데노바이러스의 MOI에 따른 세포 생존 비율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 소라페닙에 대해 감수성이 있거나 또는 감수성이 없는 간암 환자 유래의 세포주에서 형질도입된 ECRT-122T 아데노바이러스의 MOI에 따른 세포 생존 비율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 동물 간암 모델에서 ECRT 또는 ECRT-122T를 발현하는 아데노바이러스의 주입용량에 따른 종양 무게(a), 종양 조직(b) 및 간 효소(GOT: glutamic oxaloacetic transaminase, GPT: glutamic pyruvic transaminase) 수치(c)를 확인한 결과이다.
도 8은 miR-122를 발현하는 Huh-7 세포주에서 형질도입된 재조합 벡터의 MOI에 따른 RNA 발현량(a: E4, b: 리보자임, c: miR-122)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 miR-122를 발현하는 Huh-7.5 세포주에서 형질도입된 ECRT-122T 아데노바이러스의 MOI에 따른 RNA 발현량(a: E4, b: 리보자임, c: miR-122)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 miR-122 테트라사이클린-온 시스템을 갖는 Hep3B 안정화 세포주 클론(#7-14, 7-4 및 7-2)에서 형질도입된 ECRT-122T 아데노바이러스의 MOI 및 테트라사이클린 농도에 따른 세포 생존 비율, miR-122 발현량, 및 리보자임 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 간암 환자의 정상 간 조직과 간암 조직에서 miR-122의 발현량을 비교한 그래프이다(a: 전체 환자군, b: HBV 연관 환자군, c: HCV 연관 환자군, d: 알코올 연관 환자군, e: HBV 및 HCV 연관 환자군을 제외한 만성 간염 연관 환자군, f: 기타 병인 환자군).
도 12는 환자의 간암 세포에서 유래한 간암 세포주에서 hTERT의 mRNA(a) 및 단백질 수준(b), miR-122 수준(c)을 분석한 결과이다.
도 13은 대장암 세포주, 교모세포종 세포주, 흑색종 세포주, 자궁경부암 세포주, 폐암 세포주, 골육종 세포주 및 유방암 세포주에서 형질도입된 ECRT-122T 아데노바이러스의 MOI에 따른 세포 생존 비율을 나타낸 그래프이다.
도 14는 담도암 세포주(a: SNU478, b: SNU869)에서 형질도입된 ECRT-122T 아데노바이러스의 MOI에 따른 세포 생존 비율을 나타낸 그래프이다.
도 15는 누드 마우스에 교모세포종 세포인 LN229 세포주를 주입하여 종양 형성을 유도한 후 ECRT-122T 아데노바이러스를 투여하여 종양 크기(a) 및 종양 무게(b)를 확인한 그래프이다.
도 16은 누드 마우스에 교모세포종 세포인 U87MG 세포주를 주입하여 종양 형성을 유도한 후 ECRT-122T 아데노바이러스를 투여하여 종양 크기를 확인한 그래프이다.
도 17은 정상 ICR 마우스에 ECRT-122T 아데노바이러스를 정맥주사로 주입한 후 주요 조직에서 재조합 벡터의 분포 정도를 나타낸 그래프이다.
도 18은 랫트에 ECRT-122T 아데노바이러스를 간 동맥 주사로 주입한 후 주요 조직에서 재조합 벡터의 분포 정도를 나타낸 그래프이다.
도 19는 랫트에 ECRT-122T 아데노바이러스를 간 동맥 주사로 주입한 후 각 장기에서 게놈 DNA(gDNA)를 분리하여 HSVtk DNA를 정량한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 랫트에 ECRT-122T 아데노바이러스를 간 동맥 주사로 주입한 후 간에서 분리한 RNA로부터 리보자임 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 정상 ICR 마우스에 ECRT-122T 아데노바이러스를 주입하고, GCV를 처리한 후 AST 및 ALT 수준을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 정상 ICR 마우스에 ECRT-122T 아데노바이러스를 주입하고, GCV를 처리한 후 마우스의 체중(a), 사료 소비량(b) 및 간 무게(c)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 정상 ICR 마우스에 다른 용량의 ECRT-122T 아데노바이러스를 주입하고, GCV를 처리한 후 수행한 간의 조직병리학적 검사 결과를 나타낸다.
도 24는 정상 ICR 마우스에 ECRT-122T 아데노바이러스를 주입한 후, AST 및 ALT 수준을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 정상 ICR 마우스에 ECRT-122T 아데노바이러스를 주입한 후, 마우스의 체중(a), 사료 소비량(b) 및 간 무게(c)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 26은 정상 ICR 마우스에 다른 용량의 ECRT-122T 아데노바이러스를 주입한 후 수행한 간의 조직병리학적 검사 결과를 나타낸다.
도 27은 마우스에 Hep3B 세포를 주입하여 간암 형성을 유도한 후 CRT-122T 또는 ECRT-122T 아데노바이러스를 투여하여 항암 효능을 비교한 결과를 나타낸다.
도 28은 마우스 이종이식 피하 모델에 SNU398 세포를 주입하여 종양 형성을 유도한 후 CRT-122T 또는 ECRT-122T 아데노바이러스를 투여하여 항암 효능을 비교한 결과를 나타낸다.
도 29는 정상 ICR 마우스에 ECRT 또는 ECRT-122T 아데노바이러스를 주입한 후 AST 및 ALT 수준을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
재조합 벡터
본 발명의 한 양태는
(i) 사이토메갈로바이러스 프로모터; 및
(ii) 암 특이적 유전자 서열을 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자임, 상기 리보자임의 3' 엑손에 연결된 목적 유전자를 포함하는, 리보자임-목적 유전자 발현 카세트를 포함하며,
상기 발현 카세트는 리보자임-목적 유전자 발현 카세트의 5' 말단에 스플라이싱 공여/스플라이싱 수여 서열(SD/SA sequence)이 연결되고, 3' 말단에 WPRE가 연결된 것으로,
(iii) 상기 WPRE의 3' 말단에는 마이크로 RNA-122를 인식하는 핵산 서열이 추가로 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터이다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 사용하고, 리보자임 및 목적 유전자의 양 말단에 SD/SA 서열 및 WPRE를 구성요소로 포함시킬 때 생체 내에서 암 치료 효과가 탁월한 것을 기초로, CMV 프로모터, SD/SA 서열 및 WPRE를 동시에 사용하고, miR-122를 인식하는 핵산 서열을 추가로 포함함으로써 간암 세포뿐만 아니라 다양한 암세포의 치료가 가능하도록 한 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용된 용어, "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 벡터 내에 포함된 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 구조물을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하는 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 유전자를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다.
예를 들어, 리보자임 암호화 서열을 프로모터에 작동 가능하게 연결시키면 리보자임 암호화 서열의 발현은 프로모터의 영향 또는 조절 하에 있게 된다. 2개의 핵산 서열(리보자임 암호화 서열 및 이 서열의 5' 말단의 프로모터 부위 서열)은 프로모터 작용이 유도되어 리보자임 암호화 서열이 전사되면 작동 가능하게 연결된 것이며, 상기 두 서열 사이의 연결 특성이 프레임 변경 돌연변이(frameshift mutation)를 유도하지 않고, 발현 조절 서열이 리보자임의 발현을 저해하지 않으면 작동 가능하게 연결된 것으로 볼 수 있다. 재조합 벡터와의 작동 가능한 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서와 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 또는 바이러스 벡터 등일 수 있고, 가장 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 바람직하게는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus, HIV), 마우스 백혈병 바이러스(Murine leukemia virus, MLV), 조류 육종/백혈병 바이러스(Avian sarcoma/leucosis virus, ASLV), 비장 괴사 바이러스(Spleen necrosis virus, SNV), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV), 마우스 유방 종양 바이러스(Mouse mammary tumor virus, MMTV) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus, AAV), 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus, HSV) 등에서 유래한 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 가장 바람직하게는 재조합 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "발현 카세트"라는 용어는 CMV 프로모터와 트랜스-스플라이싱 리보자임-목적 유전자를 포함하고, 트랜스-스플라이싱 리보자임-목적 유전자의 각 말단에 SD/SA 서열 및 WPRE 서열이 존재하며, 상기 WPRE의 3' 말단에는 miR-122를 인식하는 핵산 서열이 추가로 연결된 것을 특징으로 하여 트랜스-스플라이싱 리보자임-목적 유전자를 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다.
본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임-목적 유전자 발현 카세트는 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임과 목적 유전자가 연결된 서열에 전사 수준을 조절하는 서열, 즉 조절 유도체를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명에서는 특히 스플라이싱 공여/스플라이싱 수여 서열(splicing donor/splicing acceptor sequence, SD/SA sequence) 및/또는 WPRE(Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element)이 연결되고, 상기 WPRE의 3' 말단에는 miR-122를 인식하는 서열이 추가로 연결되어 있을 수 있다. 이로 인해 리보자임-목적 유전자의 발현 수준을 조절할 수 있고, miR-122가 일정 수준 이하일 때에만 리보자임이 발현되도록 하여 정상 간세포에 미치는 영향을 최소화할 수 있다.
본 발명에 따른 리보자임-목적 유전자 발현 카세트는 바람직하게는 리보자임의 5' 말단에 스플라이싱 공여/스플라이싱 수여 서열(SD/SA)이 연결되고, 목적 유전자의 3' 말단에는 WPRE가 연결되며, 상기 WPRE의 3' 말단에 miR-122를 인식하는 서열이 연결된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 SD/SA는 전사 시작(transcription initiation)과 RNA 중합효소(polymerase) Ⅱ의 프로세싱(processing) 및 mRNA의 핵에서 세포질로의 이동(nucleocytoplasmic export)을 증가시키며, 본 발명에 따른 WPRE는 mRNA의 프로세싱과 핵에서 세포질로의 이동을 증가시켜 각각 pre-mRNA의 수준을 증가시킬 수 있다. 상기와 같은 구성을 통하여 세포 내에서 리보자임의 RNA 수준을 현저히 증가시켜 생체 내에서 암세포의 사멸은 높이면서 암 세포 특이적으로 발현이 이루어지도록 함으로써 정상 세포에 미치는 독성은 오히려 감소하도록 할 수 있다.
본 발명에 따른 SD/SA 서열은 RNA 전사체의 인트론을 제거하는 스플라이싱 반응에 있어서 잘려 나가는 인트론의 시작부분과 끝나는 부분에 해당하는 서열로서, 일반적으로 SD 서열은 인트론 5' 말단의 GU 서열일 수 있으며, SA 서열은 인트론의 3' 말단의 AG 서열일 수 있다.
본 발명에 따른 WPRE는 DNA에 전사를 촉진하는 3차 구조를 유도하여, 유전자의 발현을 증가시키는 서열을 의미한다.
본 발명에서 상기 SD/SA 서열 및 WPRE 서열은 각각 서열번호 6 및 서열번호 7의 서열을 포함할 수 있으나, 목적 유전자 발현 카세트 내에 존재하면서 목적 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있는 한 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 miR-122를 인식하는 핵산 서열은 본 명세서 내에서 miR-122T(microRNA-122 target site)로 명명된다. 상기 miR-122T는 서열번호 5의 서열을 1회 이상 포함할 수 있고, 예를 들어 1회 내지 10회, 바람직하게는 1회 내지 5회, 더욱 바람직하게는 1회 내지 3회 반복하여 포함할 수 있다. miR-122는 정상 간세포에서는 정상적으로 발현되나, 간암 세포에서는 발현량이 감소하는 특징이 있다. 이를 이용하여 간암 세포에 대한 민감도 및 특이도를 증가시킨 치료제를 개발할 수 있으며, 본 발명에서는 목적 유전자가 연결된 리보자임에 miR-122를 인식하는 핵산 서열을 연결함으로써 간암 세포 특이적인 리보자임의 발현이 이루어질 수 있도록 하였다.
본 발명의 일 실시예에서, SD/SA 및 WPRE가 추가로 연결된 경우, 리보자임의 발현이 증가하여 세포사를 유도하는 효과가 더욱 증가한다. 또한, miR-122를 표적으로 하는 miR-122T를 연결함으로써 miR-122의 발현이 정상적으로 이루어지는 정상 간세포에 대해서는 세포사를 유도하지 않고 miR-122의 발현이 감소된 간암 세포에 대해서만 세포사를 유도하여 간암 세포 특이적으로 치료가 가능함을 확인하였다(도 2).
본 발명에서 사용된 "암 특이적 유전자"라는 용어는 암세포에서만 특이적으로 발현되거나 또는 현저하게 과발현되는 유전자를 의미한다. 상기 암 특이적 유전자는 본 발명에 따른 리보자임이 암 특이적으로 작용할 수 있는 특징을 부가할 수 있다. 이러한 암 특이적 유전자는 바람직하게는 TERT(Telomerase reverse transcriptase) mRNA, AFP(alphafetoprotein) mRNA, CEA(carcinoembryonic antigen) mRNA, PSA(Prostate-specific antigen) mRNA, CKAP2(Cytoskeleton-associated protein 2) mRNA, 또는 mutant RAS(Rat sarcoma) mRNA일 수 있고, 더 바람직하게는 TERT(Telomerase reverse transcriptase) mRNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 hTERT(human telomerase reverse transcriptase) mRNA 서열일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "TERT"는 암 세포의 영속성(immortality) 및 증식(proliferation) 능력을 조절하는 가장 중요한 효소 중의 하나로, 염색체에 말단소립(telomere) 구조를 형성해 염색체 끝을 보호하는 역할을 통해 세포의 노화를 억제하는 효소를 의미한다. 정상적인 세포에서는 세포가 분열할 때마다 말단소립의 길이가 조금씩 줄어들어 결국 유전물질이 손실되고, 세포가 사멸하게 된다. 그러나 암세포에서는 이 효소가 말단소립을 계속적으로 연장시켜 주기 때문에 세포가 사멸하지 않으며, 암세포의 불멸성에 직접 기여함으로써 암을 치료하는데 중대한 장애 요소로 알려져 있다. 본 발명에서는 암 특이적 유전자로 서열번호 2의 서열을 포함하는 hTERT mRNA를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용된 "프로모터"라는 용어는 DNA의 일부분으로 전사를 개시할 수 있도록 RNA 중합효소의 결합에 관여한다. 일반적으로 표적 유전자에 인접하여 이의 상류에 위치하며, RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소를 유도하는 단백질인 전사 인자(transcription factor)가 결합하는 자리로서 상기 효소 또는 단백질이 올바른 전사 시작 부위에 위치하도록 유도할 수 있다. 즉, 센스 가닥(sense strand)에서 전사하고자 하는 유전자의 5' 부위에 위치하여 RNA 중합효소가 직접 또는 전사인자를 통해 해당 위치에 결합하여 표적 유전자에 대한 mRNA 합성을 개시하도록 유도하는 것으로 특정한 유전자 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 프로모터는 유전자의 발현을 높이기 위한 관점에서 서열번호 1의 서열을 포함하는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 재조합 벡터에 CMV 프로모터를 도입하면 리보자임의 발현 효율이 우수하며, 재조합 벡터가 보유한 miR-122T로 인해 miR-122의 조절을 받긴 하지만, 높은 리보자임 발현에 의해 어느 정도의 miR-122 발현에도 불구하고 세포사를 유도하고 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 3 및 4).
본 발명에서 사용된 "리보자임"이라는 용어는 효소처럼 작용하는 RNA 분자 또는 그 RNA 분자를 포함하는 단백질로 구성되는 분자로 RNA 효소 또는 촉매적 RNA라고도 불린다. 명확한 3차 구조를 갖는 RNA 분자로 화학반응을 수행하며 촉매적 또는 자기촉매적 특성을 가진다. 일부 리보자임은 자기 또는 다른 RNA 분자를 절단하여 활성을 저해하고, 다른 리보자임은 리보솜의 아미노전달효소(aminotransferase) 활성을 촉매하는 것으로 알려져다. 이러한 리보자임에는 망치머리(hammerhead) 리보자임, VS 리보자임 및 헤어핀(hairpin) 리보자임 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 리보자임은 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 암 특이적 유전자의 활성을 저해시켜서 선택적인 항암 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 암 치료 유전자와 접합된 형태로 발현되어 암 치료 유전자를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 암 특이적 유전자를 불활성화시키고, 암 치료 유전자를 활성화시킬 수 있는 특성을 나타낸다면 어떠한 형태의 것이라도 사용 가능하다.
본 발명에 따른 리보자임은 바람직하게는 상기에서 설명한 hTERT mRNA를 표적하는 리보자임일 수 있으며, hTERT가 과다 발현되는 암세포를 표적으로 하여 hTERT mRNA를 특이적으로 절단하여 발현을 억제시키고, 치료 유전자를 특이적으로 발현시키는 역할을 할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "트랜스-스플라이싱(trans-splicing)"은 서로 다른 유전자로부터의 RNA를 서로 연결하는 것을 의미한다. 바람직하게는 암에 특이적인 hTERT의 mRNA를 인지하여 트랜스-스플라이싱하는 능력이 검증된 hTERT 표적 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임을 사용하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "목적 유전자"라는 용어는 상기 리보자임에 의하여 암 특이적 유전자의 mRNA와 연결되어 발현이 유도되는 유전자를 의미한다.
본 발명에 따른 목적 유전자는 바람직하게는 암 치료용 유전자 또는 리포터 유전자일 수 있고, 가장 바람직하게는 암 치료용 유전자일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "암 치료 유전자(anti-cancer therapeutic gene)"라는 용어는 암세포에서 발현시 치료학적 효과를 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 암 치료 유전자는 상기 리보자임과 접합된 형태로 발현되거나 또는 독립적으로 발현되어, 항암활성을 나타낼 수 있다. 이러한 암 치료 유전자는 바람직하게는 약제 감수성 유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 사이토카인 유전자, 및 항신생 혈관 생성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 가장 바람직하게는 약제 감수성 유전자일 수 있다.
본 발명에서는 상기 암 치료 유전자를 단독으로 사용하거나 또는 둘 이상의 유전자를 복합적으로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약제 감수성 유전자(drug-sensitizing gene)는 독성이 없는 전구체(prodrug)를 독성물질로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자로 유전자가 도입된 세포가 사멸하게 되므로 자살 유전자(suicide gene)로도 불린다. 즉, 정상 세포에는 독성이 없는 전구체를 전신적으로 투여했을 때 암세포에서만 전구체가 독성 대사체(toxic metabolite)로 전환되어 약제에 대한 감수성을 변화시킴으로써 암세포를 파괴시키는 방법이다. 이러한 약제 감수성 유전자는 바람직하게는 간시클로비르(ganciclovir)를 전구체로 이용하는 HSVtk(Herpes simplex virus-thymidine kinase) 유전자, 또는 5-플루오로시토신(5-fluorocytosine, 5-FC)를 전구체로 하는 대장균의 사이토신 탈아미노효소 (cytosine deaminase, CD) 유전자일 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 4의 서열을 포함하는 HSVtk 유전자일 수 있다.
본 발명에 따른 세포사멸 유전자(proapoptotic gene)는 발현되면 프로그램된 세포사를 유도하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 당업자에게 공지된 세포사멸 유전자로, p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자 및 카스파제를 코딩하는 유전자가 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 세포증식 억제 유전자(cytostatic gene)는 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 그 예로 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 생장 중지 특이성 호메오박스(growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 세포독성 유전자(cytotoxic gene)는 세포 내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 그 예로, 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 대표적으로 종양 괴사 인자(tumor necrosisfactor-α, TNF-α), p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자, MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일 단백질(adenomatous polyposis coil protein), 결손된 결장 종양(DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제 인자 유전자, MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자, VHL 유전자 또는 sPD-1(programmed death-1)가 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 항원성 유전자(antigenic gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 당업자에게 공지된 항원성 유전자의 예로 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 및 p53이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 사이토카인 유전자(cytokine gene)는 세포 내에서 발현되어 사이토카인을 생성하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 대표적으로 GMCSF, 인터루킨(IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20), 인터페론 α, β, γ(인터페론 α-2b) 및 인터페론 α-2α-1과 같은 융합체 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 항-신생혈관 생성 유전자(anti-angiogenic gene)는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포 밖으로 방출하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 그 예로 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "HSV-tk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)"는 단순 포진 바이러스로부터 유래되는 티미딘 인산화 효소를 의미한다. 이 효소는 독성이 없는 전구체(prodrug)를 독성물질로 전환시킴으로써, 그 유전자가 이입된 세포가 사멸하게 하는 약제 감수성 유전자의 대표적인 예이다. 본 발명에 있어 HSVtk 유전자는 본 발명에 따른 리보자임에 접합된 형태로 발현되어 항암 활성을 나타내는 암 치료 유전자로 사용될 수 있다. 이러한 HSVtk 유전자는 바람직하게는 진뱅크(genbank) 등록번호 AAP13943, P03176, AAA45811, P04407, Q9QNF7, KIBET3, P17402, P06478, P06479, AAB30917, P08333, BAB84107, AAP13885, AAL73990, AAG40842, BAB11942, NP_044624, NP_044492, CAB06747 등에 기재된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "리포터 유전자"는 본 발명의 일 예에 따른 재조합 벡터의 도입 여부 또는 리보자임의 발현 효율을 모니터링하기 위해 사용되는 유전자로서 감염된 세포 또는 조직의 손상이 없이 모니터링할 수 있는 유전자라면 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 루시퍼라제(luciferase), 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein; mGFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescentprotein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 변형된 적색 형광 단백질(modified red fluorescent protein; mRFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP) 또는 증강된 남색 형광 단백질(ECFP)일 수 있다.
목적 유전자로 리포터 유전자를 삽입하여 암세포 특이적인 리보자임의 발현 정도를 관찰할 수 있으며, 특히 본 발명의 리보자임은 프로모터 및 마이크로 RNA 표적 사이트를 포함하고 있어, 정상 세포에서는 발현되지 않고 암세포 특이적으로 발현할 수 있다. 이를 이용하여 특정 조직에서 암이 발생했는지 여부를 진단하는데 적용할 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.
유전자 전달 시스템
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템이다.
본 발명에서 사용된 용어, "유전자 전달 시스템(gene delivery system)"은 목적하는 유전자 및/또는 핵산 서열의 세포 내부로의 전달 효율을 높여 발현 효율을 증가시킬 수 있는 시스템을 의미하며, 바이러스 매개 시스템 및 비바이러스 시스템으로 분류될 수 있다.
바이러스 매개 시스템은 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터와 같은 바이러스성 벡터를 사용하며, 인간 세포에 감염을 일으키는 바이러스 고유의 세포 내 침투 기전을 이용하므로 비바이러스성 시스템보다 세포내 유전자 전달 효율이 비교적 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 세포 내로 들어간 다음 비바이러스성 벡터는 엔도솜이 리소좀과 융합된 다음 엔도리소솜에서 유전자들이 분해되는 문제점이 있으나, 바이러스성 벡터는 리소솜을 통과하지 않고 핵 내로 유전자를 전달하는 기전에 의하여 유전자의 손실이 작아서 유전자 전달 효율이 높은 장점이 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 바이러스성 벡터는 상기 재조합 벡터에서 설명한 바와 같이 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 등에서 유래한 벡터일 수 있다. 이러한 바이러스성 벡터는 바이러스 입자에 조립된 후 감염(infection)과 같은 형질도입(transduction) 방법으로 세포 내부로 도입될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 유전자 전달체의 예로 상기 설명한 재조합 벡터를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 고안하였다. 즉, 상기 재조합 아데노바이러스는 암 특이적 유전자에 특이적인 트랜스-스플라이싱 리보자임을 발현하는 재조합 벡터를 목적하는 세포(예를 들어, 암세포)로 전달하는 기능을 수행하며, 세포 내로 전달된 재조합 벡터는 세포내 전사 시스템에 의해 발현된다. 발현된 트랜스-스플라이싱 리보자임은 암세포 내에 많이 존재하는 암 특이적 유전자의 전사체에 리보자임에 연결된 목적 유전자를 삽입할 수 있다.
상기 비바이러스성 시스템은 핵산 및/또는 유전자의 전달 매개체로 양이온성 지질 전달체 또는 양이온성 고분자 전달체 등을 이용하거나, 전기 천공법을 사용하는 방법이다.
양이온성 지질 전달체는 주로 양이온성 지질로 이루어진 나노미터 크기의 리포좀이나 지질 소재 나노입자의 양전하를 이용하여 음전하인 유전자, 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 핵산과 복합체를 형성시킨 후 이 복합체를 탐식 작용으로 세포 내로 전달하는 방법이다. 세포 내로 전달된 복합체는 엔도솜에서 리소좀으로 1차 전달된 다음 세포질로 빠져 나와 발현된다. 양이온성 고분자 전달체는 지질 대신 고분자를 사용하는 것을 제외하면 양이온성 지질 전달체와 유사한 방식으로 유전자를 전달하며, 대표적인 양이온성 고분자로는 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine), 폴리라이신(poly-L-lysine), 키토산(chitosan) 등이 있다.
따라서, 본 발명의 재조합 벡터가 양이온성 지질 전달체 또는 양이온성 고분자 전달체와 결합하여 형성된 복합체는 유전자 전달체로 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 유전자 전달 시스템은 상기 설명한 재조합 벡터를 포함하며, 바이러스 매개 시스템 및 비바이러스 시스템 모두 사용될 수 있으나, 바이러스 매개 시스템을 사용하는 것이 바림직하다.
리보자임
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 재조합 벡터로부터 발현된 리보자임이다.
본 발명에 따른 재조합 벡터 또는 리보자임에 관한 내용은 앞서 설명한 바와 같다.
약학적 조성물
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템, 또는 리보자임을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.
본 발명에 따른 재조합 벡터, 유전자 전달 시스템, 또는 리보자임에 관한 내용은 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 "암"이라는 용어는 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로는 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시킨 상태를 의미한다.
본 발명에 따른 암은 바람직하게는 간암, 교모세포종, 담도암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 골암, 유방암, 대장암, 위암, 전립선암, 백혈병, 자궁암, 난소암, 림프종, 또는 뇌암일 수 있고, 더 바람직하게는 간암, 교모세포종, 또는 담도암일 수 있으며, 가장 바람직하게는 간암일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 암은 바람직하게는 암 조직에서 발현되는 miR-122의 카피수(발현량)가 상기 약학적 조성물에 의해 암 조직에서 발현되는 리보자임의 카피수의 100배 미만인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 세포사를 유도할 수 있는 miR-122T를 보유한 hTERT 표적 리보자임의 발현량과 세포 내 miR-122의 발현량을 비교한 결과, 리보자임에 대한 miR-122의 비율이 높아질수록 리보자임의 발현이 감소하여 세포사 유도 효과가 감소하였다(도 4, 8 및 9). 따라서, 암 조직 내의 miR-122 발현량에 따라 항암 효과를 나타내기 위한 리보자임의 양을 유추하여 리보자임을 발현하는 아데노바이러스의 주입량을 결정할 수 있다. 구체적으로 miR-122의 최소 카피수가 리보자임 카피수의 약 100배 이상이면 miR-122 표적 부위를 갖는 리보자임의 기능(발현)이 약화되므로, 암 조직에서 발현되는 miR-122의 카피수가 본 발명에 따른 약학적 조성물에 의해 암 조직에서 발현되는 리보자임의 카피수의 100배 미만이면 높은 항암 효능을 얻을 수 있음을 확인하였다(도 10).
또한, 본 발명에 따른 암은 바람직하게는 암 조직에서 miR-122가 실질적으로 발현되지 않는 암일 수 있다. 상기 "암 조직에서 miR-122가 실질적으로 발현되지 않는 암"이란 암 조직에서 miR-122가 발현되기는 하지만 miR-122 표적 부위를 갖는 리보자임의 기능에 실질적인 영향을 미치지 않을 정도로 암 조직에서 발현되는 miR-122의 카피수가 적은 암을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 암 조직에서 miR-122가 실질적으로 발현되지 않는 대장암, 교모세포종, 흑색종, 자궁경부암, 폐암, 골육종, 유방암 및 담도암 세포주에서 본 발명에 따른 리보자임의 항암 효능을 확인하였다(도 13 및 14).
또한, 본 발명에 따른 간암은 바람직하게는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus), 간암 조직에서 miR-122의 발현이 저하되는 C형 간염 바이러스, 알코올, 만성 간염, 간경변증, 비알코올성 지방간질환, 아플라톡신, 및 가족력으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 원인으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 다양한 병인 인자에 의해 발생한 간암에서 miR-122의 발현량을 분석하였다. 그 결과, HCV가 병인인 간암 중에서 일부와 나머지 병인에 의한 간암은 정상 간 조직에서의 miR-122 발현량이 간암 조직에서의 발현량보다 높았다. 따라서, 본 발명에 따른 리보자임은 miR-122에 의해 정상 간 조직에서는 그 기능이 약화되고, miR-122의 발현이 감소한 간암 조직에서는 작용할 수 있음을 확인하였다(도 11).
또한, 본 발명에 따른 간암은 소라페닙(sorafenib)에 저항성이 있는 것일 수 있다. 소라페닙은 진행성 간암에 대한 1차 치료제이며, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 리보자임은 소라페닙에 대해 감수성이 있는 세포주와 없는 세포주 모두에서 세포사를 유발하므로 소라페닙에 의해 치료가 될 수 없는 소라페닙 저항성 간암 환자군에도 적용 가능함을 확인하였다(도 6).
본 발명에서 사용된 "예방"이라는 용어는 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 조성물의 투여로 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용된 "치료"라는 용어는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 조성물의 투여로 암이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으나, 비경구로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 암조직 내 또는 피하로 직접 투여될 수 있으며, 주사제로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 주사제는 환자에게 투여시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수 있으며, 투여시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 다음 투여하는 형태일 수도 있다. 또한, 주사제로 제조될 때 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등과 혼합될 수 있고, 단위 투약 앰플 또는 다중 투약 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 단독으로 사용되거나, 또는 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용될 수 있다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: hTERT 표적 트랜스-스플라이싱 리보자임 재조합 벡터의 제작
miR-122 표적 부위인 miR-122T를 가지면서 높은 발현율을 나타내는 hTERT 표적 트랜스-스플라이싱 리보자임을 제작하기 위하여, 기존의 트랜스-스플라이싱 리보자임을 변형한 재조합 벡터를 고안하였다.
구체적으로, hTERT mRNA의 +21번 부위를 표적으로 하고, 326 뉴클레오티드 길이의 안티센스(antisense) 서열(서열번호 8)을 보유하며, 치료 유전자로 HSV-tk를 보유하는 트랜스-스플라이싱 리보자임에 CMV 프로모터를 도입하였다. CMV 프로모터와 리보자임 사이에는 SV40 인트론 스플라이싱 공여/수여(SV40 intron splicing donor/acceptor, SD/SA) 서열을 삽입하여 전사 효율을 높였다. 치료 유전자인 HSV-tk의 3' 부위에는 Woodchuck Hepatitis Virus의 전사 후 조절 인자(posttranscriptional Regulatory Element)인 WPRE를 삽입하여 치료 유전자의 단백질 발현 효율을 높였고, 컨스트럭트(construct)의 3' 말단 부위에 3 카피(copy)의 miR-122T를 삽입하여 miR-122에 의해 조절 받을 수 있도록 하였다.
고안된 트랜스-스플라이싱 리보자임의 전체 벡터 구조는 도 1에 나타낸 바와 같고, 이를 ECRT-122T라 명명하였다.
실시예 2: miR-122를 발현하는 Hep3B 안정화 세포주(stable cell line) 제작
Hep3B 세포를 35 ㎜ 배양 접시에 2x105개 분주한 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. Tet-repressor(TetR) miR-122 발현 벡터 1 ㎍과 Opti-MEM 100 ㎕를 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 섞고, Lipofectamin2000 5 ㎕와 무혈청 배지 100 ㎕를 다른 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 혼합한 후 5분 동안 상온에 방치하였다. 이후 상기 두 튜브의 내용물을 혼합하고, 리포좀(liposome) 형태의 복합체를 이룰 수 있도록 20분 동안 상온에서 보관하였다. 20분 후 튜브를 10초 동안 원심 분리한 후 각각의 세포 위에 뿌려 형질주입(transfection)하고, 4시간 후 새로운 배지로 갈아주었다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후 1X PBS로 세포를 세척하고, 트립신(trypsin)을 처리하여 세포를 떼어낸 후 100 mm 배양 접시로 옮겨 배양하였다. 2일 내지 3일에 한 번씩 항생제인 블라스티시딘(blasticidin)을 5 ㎍/㎖의 농도로 포함하는 배지로 갈아주었다. 세포 클론들을 선별하여 각각을 키운 후, RT-PCR로 TetR의 발현을 확인하였다.
실험예 1: ECRT-122T의 항암 효능 확인(in vitro)
1-1. miR-122 발현에 따른 ECRT-122T의 항암 효능 비교
실시예 1에서 제작한 ECRT-122T의 항암 효능이 miR-122 발현 여부에 따라 변하는지 확인하였다.
hTERT는 발현하고 miR-122는 발현하지 않는 Hep3B 세포주, hTERT 및 miR-122 모두 발현하는 Huh-7.5 간암 세포주를 준비하여 1x104개의 세포를 96-웰에 분주하였다. 다음날 세포에 처리할 감염 다중도(Multiplicity of Infection, MOI)에 따라 아데노바이러스(type 5)를 세포 배양 배지로 단계별로 희석하고, 총 부피 100 ㎕로 만든 후 각 웰에 처리하였다. 사용한 벡터는 다음과 같다: miR-122T를 갖는 ECRT-122T; miR-122T를 갖지 않는 ECRT; 및 CMV 프로모터, hTERT 표적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 HSVtk로 구성된 CRT. 아데노바이러스 처리 24시간 후에 GCV(ganciclovir)를 세포 배양 배지에 희석하여 최종적으로 200 μM이 되도록 섞은 뒤 각 웰에 처리하였다. 2일 간격으로 총 3번의 GCV를 처리하고, 마지막 GCV 처리 24시간 뒤에 MTS assay 시약을 넣은 후 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 살아있는 세포를 확인하였다.
그 결과, 도 2의 a에 나타낸 바와 같이, miR-122를 발현하지 않는 Hep3B 세포주에서는 miR-122 표적 부위의 유무에 상관없이(ECRT, ECRT-122T) 동일한 세포사가 유도되었다. SD/SA, WPRE, 및 miR-122T를 보유하지 않는 CRT는 세포사를 유도하긴 하지만 ECRT 및 ECRT-122T보다 효과가 떨어졌으며, 이로부터 ECRT 및 ECRT-122T에 도입된 인자에 의해 리보자임의 작용 효율이 높아진 것을 알 수 있었다.
반면, 도 2의 b에 나타낸 바와 같이, miR-122를 발현하는 Huh-7.5 세포주에서는 ECRT-122T에 의한 세포사 유도 효과가 감소하였으며, 이로부터 ECRT-122T에 도입된 miR-122 표적 부위에 miR-122가 작용하여 리보자임의 작용을 방해한 것을 알 수 있었다. 그러나 ECRT-122T는 여전히 CRT를 처리한 수준의 세포사를 유도하였으며, 이로부터 miR-122T로 인해 miR-122의 조절을 받긴 하지만, 리보자임의 높은 발현에 의해 어느 정도의 miR-122 발현에도 불구하고 항암 효과를 나타낼 수 있는 것을 확인하였다.
1-2. 프로모터에 따른 ECRT-122T의 항암 효능 비교
실시예 1에서 제작한 ECRT-122T의 항암 효과를 구성이 상이한 다른 벡터와 비교하였다.
구체적으로, hTERT는 발현되고 miR-122는 발현되지 않는 Hep3B, SNU398 및 SNU449 세포주와, hTERT 및 miR-122가 모두 발현되는 Huh-7 및 Huh-7.5 간암 세포주를 준비하였다. 상기 세포주들에 ECRT-122T, ECRT, CRT에 간 특이적 프로모터인 PEPCK 프로모터, SD/SA, WPRE 및 miR-122T를 도입한 EPRT-122T, 또는 miR-122T를 갖지 않는 EPRT를 처리한 뒤 상대적인 세포 생존율을 비교하였다. 세포 증식 분석은 실험예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, miR-122를 발현하지 않는 세포주에서는 miR-122 표적 부위의 유무에 상관없이(ECRT, ECRT-122T) 동일한 세포사가 유도되었다. ECRT-122T는 EPRT-122T보다 더 낮은 바이러스 MOI 처리 샘플에서도 높은 비율로 세포사를 유도하였는데, 이로부터 조직 특이적 프로모터인 PEPCK보다 CMV 프로모터가 더 강력하게 리보자임의 발현을 증가시켜 적은 양의 바이러스가 처리된 샘플에서도 높은 항암 효능을 나타낼 수 있음을 알 수 있었다. 또한, ECRT-122T는 miR-122T가 없는 ECRT와 동일한 항암 효능을 나타냈는데, 이로부터 miR-122T 도입으로 인한 리보자임 활성 저하가 없음을 알 수 있었다.
한편, 도 4에 나타낸 바와 같이, miR-122를 발현하는 세포주에서는 EPRT-122T에 의한 세포사가 관찰되지 않았는데, 이로부터 miR-122가 miR-122T에 작용하여 리보자임의 발현을 감소시킨 것임을 알 수 있었다. 그러나 ECRT-122T는 miR-122의 발현에도 불구하고 세포사를 유도하였는데, 이로부터 PEPCK 보다 CMV 프로모터가 더 강력하게 리보자임의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다. 다만, miR-122가 없는 세포주와 다르게 ECRT-122T에 의한 세포사 정도가 ECRT보다는 낮았는데, 이로부터 ECRT-122T의 miR-122T가 miR-122에 의해 조절 되어 리보자임의 발현이 낮아졌음을 알 수 있었다.
추가로 다양한 간암 세포주에서 CRT-122T, ECRT-122T 및 EPRT-122T의 항암 효과를 비교하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 거의 모든 간암 세포주에서 ECRT-122T의 MOI가 증가함에 따라 세포사가 증가하였으며, 비교군(CRT-122T 및 EPRT-122T)보다 ECRT-122T의 항암 효과가 우수하였다.
본 실험예의 결과로부터 리보자임에 CMV 프로모터, SD/SA 및 WPRE를 도입함으로써 리보자임의 발현이 증가하여 항암 효능이 증가하고, miR-122T의 도입으로 인해 miR-122에 의한 리보자임의 활성이 조절될 수 있으므로, ECRT-122T는 간암 치료에 있어 항암 효능과 안전성이 최적화된 물질임을 알 수 있었다.
1-3. ECRT-122T의 소라페닙(sorafenib) 저항성 간암에의 적용
진행성 간암에 대하여 1차 치료제로 사용되고 있는 소라페닙에 감수성이 있는 간암에서 ECRT-122T의 항암 효능을 확인하였다.
구체적으로, 소라페닙에 대해 감수성이 있는 간암 환자 또는, 감수성이 없는(저항성이 있는) 간암 환자 유래의 세포주를 준비하고, ECRT-122T 또는 ECRT를 처리한 뒤 상대적인 세포 생존율을 비교하였다. 세포 증식 분석은 실험예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 소라페닙에 대해 감수성이 있는 세포주와 감수성이 없는 세포주 모두에서 세포사가 관찰되었다. 이로부터 ECRT-122T는 소라페닙에 의해 치료될 수 없는 소라페닙 저항성 간암 환자군에도 적용 가능함을 알 수 있었다.
실험예 2: ECRT-122T의 항암 효능 확인(in vivo)
간암 동물 모델에서 ECRT-122T에 의한 항암 효능 및 간 독성을 확인하였다.
비장내 간 전이 마우스 모델에 miR-122를 발현하지 않는 Hep3B 세포주를 비장에 주입하여 정위의(orthotopic) 다발성(multifocal) 간암을 유발하고, ECRT 또는 ECRT-122T를 발현하는 아데노바이러스를 꼬리정맥 주입(tail-vein injection)으로 전신 투여한 뒤 GCV를 주입하여 항암 효능을 확인하였다.
그 결과, 도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, 대조군(PBS 주입)과 비교하여 ECRT-122T를 주입한 실험군에서는 대부분의 암이 사멸하였다. 이때, 동일양의 바이러스를 주입한 실험군에서 miR-122T를 보유하지 않은 ECRT보다 ECRT-122T가 좀 더 우수한 항암 효능을 나타내었다. 이로부터 miR-122T의 도입으로 정상 간 조직에서는 리보자임 발현이 억제되므로 정상 간에서는 안전성을 확보할 수 있고, 암 조직에서는 높은 항암 효능을 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 도 7c에 나타낸 바와 같이, 대조군(PBS 주입)과 비교하여 ECRT-122T를 주입한 실험군은 비슷한 수준의 간 독성 수치를 보였는데, 이로부터 아데노바이러스를 이용한 ECRT-122T 생체 내 전달이 적절함을 알 수 있었다.
실험예 3: miR-122 발현량과 리보자임 발현량의 상관관계
miR-122의 발현량에 따른 리보자임의 작용을 분석하기 위해, miR-122 발현량과 리보자임 발현량의 상관관계를 분석하였다.
hTERT 및 miR-122 모두 발현되는 Huh-7 및 Huh-7.5 간암 세포주를 준비하여 ECRT, ECRT-122T, EPRT, 또는 EPRT-122T를 발현하는 아데노바이러스를 처리한 뒤, TRI 시약으로 총 RNA 5 ㎍을 추출하였다.
추출한 총 RNA에 랜덤 프라이머(5'-NNNNNN-3')로 역전사 과정을 수행하여 cDNA를 합성하고, 합성한 cDNA 2 ㎕에 10x PCR 버퍼, dNTP 10mM, 각각의 프라이머 10 pmole, taq polymerase 2.5 unit, 10x cybergreen 1 ㎕를 첨가한 후 dH2O로 최종 부피 70 ㎕를 맞추었다. 이를 20 ㎕씩 분주하고, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초, 40 사이클의 조건으로 실시간 PCR을 수행하여 리보자임의 발현량을 확인하였다. 리보자임의 PCR에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
프라이머 서열(5'-3') 서열(5'-3')
리보자임_전방향 프라이머 TTCCGGAGGACAGACACATCGA (서열번호 10)
리보자임_역방향 프라이머 GCAGATACCGCACCGTATTGGC (서열번호 11)
다음으로 추출한 총 RNA로부터 mature miR-122 probe(ABI)를 이용하여 cDNA를 합성하고, 합성한 cDNA 2 ㎕에 20x Taqman small RNA assay 3.5 ㎕, 2x Taqman Universal PCR Master Mix II(ABI) 35 ㎕를 첨가하여 dH2O로 최종 부피 70 ㎕를 맞추었다. 이를 20 ㎕씩 분주하고, 95℃ 15초, 60℃ 60초, 40 사이클 조건으로 PCR을 수행하여 miR-122의 발현량을 확인하였다. miR-122의 PCR은 ABI 사에서 제공하는 Taqman probe를 이용하였다(Assay ID: 002245).
그 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이, Huh-7 세포주에서는 miR-122가 약 1000~2000 카피 정도 발현되는 것을 확인하였고, 도 8b에 나타낸 바와 같이, ECRT-122T 또는 ECRT 처리군 모두 MOI가 증가함에 따라 리보자임의 발현량이 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한, 감염 농도 5 MOI 이하에서는 ECRT 처리군보다 ECRT-122T 처리군에서 리보자임이 더 많이 발현되나, 10 MOI를 처리하면 ECRT 처리군보다 ECRT-122T 처리군에서 리보자임 발현량이 감소하였다. 이로부터 Huh-7이 발현하는 miR-122가 miR-122T에 작용하여 리보자임의 발현을 감소시켰음을 알 수 있었다.
한편, ECRT-122T를 10 MOI로 처리하였을 때 리보자임 및 miR-122의 카피수비율은 약 1:2.5(600 카피: 1500 카피)로서, MOI에 따른 세포사 비율을 확인한 도 4a에서 10 MOI에서도 ECRT-122T에 의한 세포사가 유도되는 것은 리보자임에 대한 miR-122의 비율이 낮아, miR-122에 의한 리보자임의 발현 억제가 충분치 않았기 때문임을 알 수 있었다.
한편, 도 9c에 나타낸 바와 같이, Huh-7.5 세포주에서는 miR-122가 약 10000~15000 카피 정도 발현되었고, 이는 Huh-7보다 높은 수치로서 리보자임에 의한 세포사 유도 정도가 Huh-7에서보다 낮음을 알 수 있었다. 또한, 도 9b에 나타낸 바와 같이, Huh-7에서와는 반대로 동일한 감염 조건에서 ECRT-122T 처리군보다 ECRT 처리군의 리보자임 발현량이 같거나 높았으며, 10 MOI를 처리한 경우 발현되는 리보자임의 카피 수가 Huh-7(약 600 카피)에서 보다 더 낮았다(약 120 카피). 상기 결과와 MOI에 따른 세포사 비율을 나타낸 도 4b의 결과로부터, 리보자임과 miR-122의 비율이 높아질수록 리보자임의 발현이 감소하여 세포사 유도 효과가 감소하는 것을 알 수 있었다.
실험예 4: miR-122의 발현량에 따른 리보자임의 작용
miR-122의 발현량과 리보자임의 상호작용을 더 자세히 분석하기 위해, miR-122의 발현량에 따른 리보자임의 작용을 분석하였다.
실시예 2에서 제작한 miR-122 테트라사이클린-온 시스템을 가진 안정화 세포주(Hep3B)에 EPRT, EPRT-122T, 또는 miR-122가 결합하지 못하도록 임의로 서열을 바꾼 돌연변이 miR-122 표적 부위를 보유한 EPRT-mt 122T 벡터를 발현하는 아데노바이러스를 처리한 뒤, 상대적인 세포 생존율을 비교하였다. 실시예 2에서 제작한 세포주는 테트라사이클린 처리 농도에 의존적으로 miR-122의 발현이 증가하며 발현 정도가 각기 다른 3개 클론의 안정화 세포주를 이용해 실험을 수행하였다. 세포 증식 분석은 실험예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, EPRT-122T 처리군은 테트라사이클린 처리 농도가 증가함에 따라 miR-122 카피 수가 증가하고, 그에 따라 EPRT-122T에 의한 세포사가 감소하였다. 반면, EPRT, EPRT-mt 122T 처리군, 또는 양성 대조군인 PT의 경우 miR-122 발현량과는 무관하게 세포사 유도 효과가 유지되었다. 또한, 테트라사이클린 처리 농도가 증가함에 따라 miR-122의 카피수는 증가하였고, 이에 따라 리보자임의 카피수는 감소하였다. 상기 결과는 실험에 사용한 3개의 독립적 클론에서 모두 동일하였다.
상기 실험에서 확인된 miR-122와 리보자임의 카피수 간의 상관관계를 수치화하였다. 그 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 세포주마다 그 비율은 다르나 miR-122의 최소 카피수가 리보자임 카피수의 약 100배 이상이면 miR-122 표적 부위를 갖는 리보자임의 기능이 현저히 약화되었다. 이 결과로부터 miR-122 표적 부위를 보유한 트랜스-스플라이싱 리보자임은 miR-122에 의해 발현이 조절될 수 있으므로, miR-122의 발현량에 따라 항암 효과를 나타내기 위한 리보자임의 양을 유추하여 리보자임을 발현하는 아데노바이러스의 주입양을 결정할 수 있음을 알 수 있었다.
세포 miR-122 카피수/세포 리보자임 카피수/세포 세포사 효율 (%) miR-122/ 리보자임 (배수)
테트라사이클린 테트라사이클린 테트라사이클린 테트라사이클린
- + - + - + - +
Hep3B miR-122 안정화 세포주 #7-2 1,010 9,910 27 7 46 29 37 1,416
Hep3B miR-122 안정화 세포주 #7-4 961 13,800 18 7 40 14 53 1,971
Hep3B miR-122 안정화 세포주 #7-14 66 1164 29 10 25 0 2.6 116
Huh-7 11,600 29 0 400
Huh-7.5 66,300 111 0 597
실험예 5: 간암 환자 조직에서 miR-122 발현 분석
간암 환자의 정상 간 조직과 간암 조직에서 miR-122의 발현을 실시간 PCR로 분석하였다.
구체적으로, 국내 간암 환자 70명의 인체 유래물 조직을 분양 받아 miR-122 발현을 분석하였다. 간암 환자의 정상 간 조직, 간암 조직 각각을 1 ㎖의 Trizol 용액에 담근 후 균질화(homogenization)하여 분쇄하고 상온에 5분 동안 방치하였다. 이후, 0.2 ㎖의 클로로포름을 첨가하여 상온에서 3분 동안 방치하고, 이를 12,000 rpm으로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 상층액만 분리하였다. 분리한 상층액에 0.5 ㎖의 이소프로판올을 첨가하여 -20℃에서 반응시키고, 이를 다시 14,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 RNA 펠렛을 얻은 뒤 100 ㎕의 RNase-free water에 녹였다. 추출한 RNA 50 ng을 TaqMan miRNA Reverse Transcription kit 방법에 따라 역전사하여 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA 1 ㎕를 TaqMan 2X Universal PCR Master Mix와 섞어 ABI StepOne plus 장비로 PCR을 수행하였다. PCR은 ABI사에서 제공하는 Taqman probe를 이용하여 수행하였다(Assay ID: 002245).
그 결과, 도 11a에 나타낸 바와 같이, 70명 중 48명의 환자(68.6%)에서 정상 간 조직보다 간암 조직에서의 miR-122의 발현량이 낮게 나타났다. 병인에 따라 분석한 결과, 도 11b, 11d 내지 11f에 나타낸 바와 같이 HBV 연관 환자 8명 중 8명, 알코올 연관 환자 2명 중 2명, 만성 간염 연관 환자 7명 중 6명, 그 외의 간암 병인 환자 35명중 26명이 간암 조직에서 miR-122의 발현이 정상 간 조직보다 낮은 것으로 나타났다. 반면에, 도 11c에 나타낸 바와 같이, HCV 연관 환자군에서는 18명 중 6명 만이 간암 조직에서 miR-122의 발현이 낮게 나타났다. 이로부터 HCV가 원인인 간암에서는 다른 병인들과는 반대로 오히려 간암이 진행 되는 경우 miR-122의 발현이 증가 또는 유지되는 환자가 더 많은 것을 알 수 있었다.
또한, 통계 분석을 실시한 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, HCV 연관 환자인 경우 miR-122의 발현이 정상 간 조직보다 간암 조직에서 높게 관찰되는 현상이 통계적으로 유의했고, 다른 간염 바이러스인 HBV의 경우는 모든 간암 조직에서 miR-122의 발현이 감소되는 현상이 통계적으로 유의했다. 이로부터 HCV 연관 환자의 간암 조직에서 miR-122의 발현이 감소되지 않거나 증가하는 결과는 통계적으로 유의미하며, 이는 간염 바이러스에 의한 일반적 현상이 아닌 HCV 특이적 현상임을 알 수 있었다.
병인 환자 수
(n=70) 		miR-122 수준
정상 > 암 		miR-122 수준
정상 <= 암 		P value
그룹 1 0.0021
HBV 8 (11.4%) 8 (100%) 0 (0%)
HCV 18 (25.7%) 6 (33.3%) 12 (66.7%)
알코올 2 (2.9%) 2 (100%) 0 (0%)
만성 간염 7 (10%) 6 (85.7%) 1 (14.3%)
기타 35 (50%) 26 (74.3%) 9 (25.7%)
그룹 2 0.0498
비 HBV 62 (88.6%) 40 (64.5%) 22 (35.5%)
HBV 8 (11.4%) 8 (100%) 0 (0%)
그룹 3 0.0007
비 HCV 52 (74.3%) 42 (80.8%) 10 (19.2%)
HCV 18 (25.7%) 6 (33.3%) 12 (66.7%)
상기 결과로부터, HCV가 병인인 간암 중에서 miR-122 발현이 정상 간 조직보다 간암 조직에서 증가된 환자를 제외한 나머지 간암 환자에 ECRT-122T를 적용하면 miR-122에 의해 정상 간 조직에서는 작용을 하지 못하고, miR-122의 발현이 감소해 있는 간암 조직에서는 작용하므로 암 특이적으로 항암 작용을 나타낼 수 있을 것이다.
추가로 환자의 간암 세포에서 유래한 간암 세포주에서 hTERT의 mRNA 및 단백질 수준 및 miR-122 수준을 분석하였다. 간암 세포주를 배양하여 당 업계에 알려진 방법에 따라 RNA 및 단백질을 분리하였다. RNA는 qRT-PCT에 사용하고, 단백질은 전기영동하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
그 결과, 도 12a 및 12b에 나타낸 바와 같이 대부분의 간암 세포주에서 ECRT-122T의 표적 분자인 hTERT mRNA가 발현되는 것을 확인할 수 있었고, hTERT 단백질 수준 또한 비슷한 경향을 보였다. 또한, 간암에서 발현이 감소해 있다는 보고와 마찬가지로 각 간암 세포주에서 miR-122가 거의 발현되지 않는 것을 확인하였다(도 12c).
실험예 6: miR-122를 발현하지 않는 간암 외의 다른 암종에의 적용
6-1. 세포 실험 (in vitro)
miR-122를 실질적으로 발현하지 않는 조직의 암 세포주에서 ECRT-122T의 항암 효능을 확인하였다.
구체적으로, hTERT를 발현하는 교모세포종 세포주, 대장암 세포주, 흑색종 세포주, 자궁경부암 세포주, 폐암 세포주, 골육종 세포주, 유방암 세포주 및 담도암 세포주에 ECRT-122T를 발현하는 아데노바이러스를 처리한 뒤, 상대적인 세포 생존율을 비교하였다. 세포 증식 분석은 실험예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 거의 모든 암 세포주에서 MOI가 증가함에 따라 세포사가 증가하였으며, 비교군(CRT-122T 및 EPRT-122T)보다 ECRT-122T의 항암 효과가 우수하였다. 구체적으로 간 조직 특이적 프로모터를 포함하는 EPRT-122T는 세포사를 유도하지 못하는 경우가 많았고, CRT-122T는 세포사는 유도하나 ECRT-122T보다 그 효율이 낮았다.
교모세포종 세포주인 T98G와 U87MG 세포주에서는 약 1 MOI 이하에서 90% 정도의 세포사가 나타났고, LN229 세포주에서는 5 MOI 이상에서 90% 정도의 세포사가 나타났다. 또한, 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포주에서는 0.5 MOI 이하에서 90% 이상의 세포사가 나타났고, 흑색종 세포주인 SK-MEL2 세포주에서는 약 1 MOI 이하에서 90% 정도의 세포사를 확인할 수 있었다.
또한, 도 14에 나타낸 바와 같이 담도암 세포인 SNU478과 SNU869 세포주에서도 MOI가 증가함에 따라 세포사가 증가하였다.
6-2. 동물 실험 (in vivo)
6주령의 수컷 Balb/c-nunu 마우스에 교모세포종 세포인 LN229 세포주 1x107개(100 ㎕) 또는 U87MG 세포주 5x106개(100 ㎕)를 피하에 주입하여 종양 형성을 유도하였다. 종양이 일정 크기로 자라면 ECRT-122T를 발현하는 아데노바이러스를 1.0x109 VP(100 ㎕) 용량으로 2일에 한 번씩 총 3회 주입하였다. GCV는 첫번째 바이러스 주입 24시간 후부터 50 ㎎/㎏ 용량을 하루에 2회씩 10일 동안 투여(총 20회)하였다.
실험 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 대조군(Ad-EGFP 주입)에서는 종양 크기가 계속 증가하나, ECRT-122T를 주입한 실험군에서는 종양이 거의 생장하지 않는 것을 알 수 있었고, 종양 무게 또한 모두 ECRT-122T를 주입한 실험군에서 적었다. 또한, 도 16에 나타낸 바와 같이 U87MG 세포주를 이용한 실험에서도 ECRT-122T의 종양 생장 억제 효과를 확인할 수 있었다.
본 실험예의 결과로부터 ECRT-122T로부터 발현되는 리보자임은 간암 이외에 miR-122를 발현하지 않는 다양한 암종에 대해서도 효과적으로 적용될 수 있음을 확인하였다. 또한, ECRT-122T를 간암 이외의 다른 암에 대한 항암제로 전신 또는 국소 투여하면 정상 간으로 도입될 수 있는데 이때 miR-122T의 작용으로 정상 간에서의 독성 유도를 억제할 수 있을 것이다.
실험예 7: ECRT-122T의 생체내 분포 확인
7-1. 정맥 주입
정상 ICR 마우스에 ECRT-122T를 발현하는 아데노바이러스를 2.5x1010 VP 용량으로 정맥주사로 주입하고, 8일, 11일 및 15일 후에 각 주요 장기를 분리하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 하고, 라이보자임 검출용 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 주요 조직에서 ECRT-122T의 분포를 확인하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이 주입한 대부분의 아데노바이러스가 간에 분포하는 것을 확인하여 간암을 표적으로 하는 ECRT-122T의 전달에 아데노바이러스가 적합한 것을 알 수 있었다. 또한, 주입한 ECRT-122T는 전신 도입 후 11일째에 혈액 내에서 완전히 소실되었고, 전신 주입 8일 후부터 2주 이내에 바이러스성 DNA의 70%가 소실되는 것을 확인할 수 있었다.
7-2. 간 동맥(hepatic artery injection) 주입
랫트(rat)에 ECRT-122T를 발현하는 아데노바이러스를 2.5x1011 VP 용량으로 간 동맥 주사(hepatic artery injection)로 주입하고, 상기 7-1과 동일한 방법으로 주요 조직에서 ECRT-122T의 분포를 확인하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이 주입 후 2일째에 간에서 가장 많은 양의 ECRT-122T DNA가 나타나는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 경향은 주입 후 14일까지 유지되었다. 바이러스성 DNA는 주입 후 14일에 간에서 98%가 소실되었고, 다른 조직에서도 거의 대부분 소실되었다.
또한, 랫트의 각 장기에서 게놈 DNA(gDNA)를 분리하여 HSVtk DNA를 정량하였다. 그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이 주입 후 14일째에 거의 모든 장기에서 HSVtk DNA가 소실되는 것을 알 수 있었다.
랫트의 간에서 총 RNA를 추출하고, qRT-PCR로 리보자임 발현 정도를 확인하였다. 그 결과, 도 20a에 나타낸 바와 같이 ECRT-122T 주입 후 2일째부터 리보자임이 발현되는 것을 알 수 있었고, 주입 후 14일에는 2일차 대비 약 3.85%의 리보자임만 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 게놈 DNA에서도 확인한 결과, 도 20b에 나타낸 바와 같이 주입 후 2일째 대비 14일째에는 아데노바이러스의 gDNA가 거의 소실되어 약 2.23% 정도만 남아 있는 것을 알 수 있었다.
본 결과를 통해 ECRT-122T 아데노바이러스를 정맥 또는 동맥으로 주입해도 생체내 분포는 유사하게 나타나고, 주입 후 14일이 지나면 바이러스성 DNA는 거의 소실되는 것을 알 수 있었다.
실험예 8: GCV 처리 유무에 따른 ECRT-122T의 독성 확인
8-1. GCV 미처리
정상 ICR 마우스에 ECRT-122T 아데노바이러스를 1회 주입하고, 주입 후 15일, 29일에 AST 및 ALT 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이 2.5x1010 VP 실험군에서 미약한 독성이 나타났고, 나머지 용량의 실험군에서는 PBS 주입군과 비슷한 정도의 AST 및 ALT 수준이 나타나 독성이 거의 없는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 22에 나타낸 바와 같이 실험 기간 동안 마우스의 체중, 사료 소비량 및 간 무게에서 이상 소견은 확인할 수 없었다. 아데노바이러스를 정맥 내로 1회 투여한 후 29일 후에 실시한 간의 조직병리학적 검사 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이 2.5x1010 VP 실험군(G3)에서 간세포 괴사(화살표)와 염증이 관찰되어 미약한 간 손상이 유발된 것을 알 수 있었다. 1.0x1010 VP 실험군(G2)에서는 염증성 세포가 국소적으로 침윤(화살표)되었으나, 간 손상은 유발되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 도 21에서 cv는 중심 정맥(central vein), p는 문맥 공간(portal area)을 의미한다.
하기 표 4에 조직병리학적 검사 결과를 정리하였다.
Histopathology
/Groups 		G1 G2 G3 G4
0.5x10 10 1.0x10 10 2.5x10 10 Vehicle
(PBS)
No. examined 4 5 5 5
No specific lesion 4 (100) 4 (80) 0 (0.00) 5 (100)
Inflammatory foci with hepatocyte necrosis 0 (0.00) 1 (20.0) 4 (80.0) 0 (0.00)
Grades: Minimal 0 1 3 0
Mild 0 0 1 0
Cell infiltration, mononuclear cells, periductal, focal 0 (0.00) 0 (0.00) 2 (40.0) 0 (0.00)
Grades: Minimal 0 0 2 0
8-2. GCV 처리
정상 ICR 마우스에 ECRT-122T 아데노바이러스를 주입하고, GCV를 1일 2회씩 10일 동안 투여한 후 AST 및 ALT 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 24에 나타낸 바와 같이 2.5x1010 VP 실험군을 제외한 나머지 용량의 실험군에서는 대조군(PBS 주입군)과 비슷한 정도의 AST 및 ALT 수준이 나타나 독성이 거의 없는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 25a 및 25b에 나타낸 바와 같이 실험 과정 동안 마우스의 체중, 사료 소비량은 유의미한 변화가 없었고, 도 25c에 나타낸 바와 같이 간 무게 또한 이상 소견을 확인할 수 없었다.
간의 조직 병리학적 분석 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이 PBS 주입군(G1), PBS+GCV 투여군(G2) 및 0.25x1010 VP+GCV 투여군(G5)에서는 이상 소견을 확인할 수 없었다. 반면, 1.0x1010 VP+GCV 투여군(G3)에서는 중성구의 침윤으로 형성된 국소 미세농양(microabscess)(굵은 화살표)을 확인할 수 있었으나, 간 손상이 유발되지는 않았다. 2.5x1010 VP+GCV 투여군(G4)에서는 큰 핵을 갖는 비대화된 간세포, 괴사성 간세포(굵은 화살표), 다발성 염증세포 침윤(원), 증가된 간세포 유사분열(굵은 화살표) 및 담세관(b) 주변의 림프구성 세포 침윤이 관찰되어 간 손상이 유발된 것을 알 수 있었다. GCV를 투여하지 않은 G6(1.0x1010 VP 주입군)에서는 유사분열하는 간세포(화살표)의 수가 약간 증가하였다.
하기 표 5에 조직병리학적 검사 결과를 정리하였다.
Histopathology
/Groups 		G1 G2 G3 G4 G5 G6
Vehicle
(PBS) 		PBS+GCV 1.0x10 10
+GCV 		2.5x10 10
+GCV 		0.25x10 10
+GCV 		1.0x10 10
No. examined 5 5 5 5 5 5
No specific lesion 5 (100) 4 (80.0) 3 (60.0) 0 (0.00) 5 (100) 3 (60.0)
Cell infiltration, mononuclear or mixed cells, multifocal 0 (0.00) 1 (20.0) 1 (20.0) 4 (80.0) 0 (0.00) 0 (0.00)
Grades: Minimal 0 1 1 0 0 0
Mild 0 0 0 4 0 0
Microabscess, focal 0 (0.00) 0 (0.00) 1 (20.0) 0 (0.00) 0 (0.00) 0 (0.00)
Grades: Minimal 0 0 1 0 0 0
Hepatocytomegaly, diffuse 0 (0.00) 0 (0.00) 0 (0.00) 5 (100) 0 (0.00) 0 (0.00)
Grades: Minimal 0 0 0 1 0 0
Mild 0 0 0 2 0 0
Moderate 0 0 0 2 0 0
Necrotic hepatocytes 0 (0.00) 0 (0.00) 0 (0.00) 3 (60.0) 0 (0.00) 0 (0.00)
Grades: Minimal 0 0 0 2 0 0
Mild 0 0 0 1 0 0
Hepatocytic mitosis, increased, diffuse 0 (0.00) 0 (0.00) 0 (0.00) 4 (80.0) 0 (0.00) 1 (20.0)
Grades: Minimal 0 0 0 2 0 1
Mild 0 0 0 1 0 0
Moderate 0 0 0 1 0 0
Oval cell hyperplasia 0 (0.00) 0 (0.00) 0 (0.00) 3 (60.0) 0 (0.00) 0 (0.00)
Grades: Minimal 0 0 0 3 0 0
Pericholangitis, (multi)focal 0 (0.00) 0 (0.00) 0 (0.00) 3 (60.0) 0 (0.00) 1 (20.0)
Grades: Minimal 0 0 0 3 0 1
AST 및 ALT 수준, 조직 병리학적 검사 결과 아데노바이러스를 2.5x1010 VP/head 용량으로 정맥 내로 투여하고, GCV를 1일 2회, 10일 동안 투여하면 간세포 괴사와 염증을 유발하는 등 간 손상이 유도되는 것으로 나타났다. 그러나 0.25x1010 VP/head 및 1.0 x 1010 VP/head로 단독 또는 GCV와 병용 투여하였을 때 투여 후 15일까지는 간 손상과 관련된 AST 및 ALT 수치가 증가하였으나, 29일째에 실시한 조직학적 검사에서는 간에서 아데노바이러스 투여와 관련된 것으로 판단되는 유의할 만한 독성학적 변화는 관찰되지 않았다.
비교예 1: CRT-122T 및 ECRT-122T의 효능 비교
1-1. 항암 효능 비교
마우스 국제 표준 모델에 Hep3B 세포를 3x106개 주입하여 간암 형성을 유도하고, CRT-122T 또는 ECRT-122T 벡터를 포함하는 아데노바이러스를 투여하여 항암 효능을 비교하였다. 상기 CRT-122T는 ECRT-122T에서 SV40 인트론 스플라이싱 공여/수여(SD/SA) 서열, WPRE이 제거된 형태이다.
그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이 아데노바이러스를 2.5x1010 VP(virus particle)로 주입하였을 때 CRT-122T와 비교하여 ECRT-122T의 항암 효능이 더 우수한 것을 알 수 있었다. CRT-122T의 항암 효능은 ECRT-122T를 1.25x1010 VP 용량으로 투여한 것과 비슷하였다.
1-2. 항암 효능 비교
마우스 이종이식 피하 모델(mouse xenograft subcutaneous model)에 SNU398 세포를 주입하여 종양 형성을 유도하고, 종양이 일정 크기 이상으로 자라면 CRT-122T 또는 ECRT-122T 벡터를 포함하는 아데노바이러스를 1x109 VP 용량으로 2일에 한 번씩, 총 2회 암 조직 내에 주입(intratumoral injection, I.T. injection)하였다. 아데노바이러스 주입 후 마우스를 사육하면서 3일 간격으로 종양 크기, 체중을 측정하고, 22일 후 마우스를 희생시켜 최종 종양 크기, 간 무게, AST(aspartate transaminase) 및 ALT(alanine transaminase) 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 28a 및 28b에 나타낸 바와 같이 CRT-122T와 비교하여 ECRT-122T의 항암 효능이 더 우수한 것을 확인할 수 있었다. 마우스의 체중과 간 무게는 실험군 사이에 유의미한 차이가 없었으며, AST 및 ALT 수준으로부터 아데노바이러스가 간 독성을 유도하지 않는 것을 알 수 있었다(도 28c 내지 28e).
상기 결과를 통하여 소량의 아데노바이러스만 주입하여도 충분한 항암 효과를 얻을 수 있는 것을 확인하였으며, CRT-122T와 비교하여 ECRT-122T의 항암 효능이 현저히 우수한 것을 알 수 있었다.
1-3. 독성 비교
아데노바이러스의 주입 용량에 따른 독성을 확인하기 위해 정상 ICR 마우스에 ECRT 또는 ECRT-122T 아데노바이러스를 주입하고, 주입 후 2일, 7일 및 14일에 AST 및 ALT 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 29에 나타낸 바와 같이 ECRT를 2.5x1010 VP 용량으로 투여한 마우스에서는 매우 높은 간 독성이 주입 후 14일째까지 유지되었으나, ECRT-122T를 2.5x1010 VP 용량으로 투여한 마우스에서는 ECRT와 비교하여 간 독성이 매우 낮은 것을 알 수 있었다.
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tcctgcctga aggagctggt 300 ggcccgagtg ctgcagaggc tgtgcgagcg cggcgcgaag aacgtgctgg ccttcggctt 360 cgcgctgctg gacggggccc gcgggggccc ccccgaggcc ttcaccacca gcgtgcgcag 420 ctacctgccc aacacggtga ccgacgcact gcgggggagc ggggcgtggg ggctgctgct 480 gcgccgcgtg ggcgacgacg tgctggttca cctgctggca cgctgcgcgc tctttgtgct 540 ggtggctccc agctgcgcct accaggtgtg cgggccgccg ctgtaccagc tcggcgctgc 600 cactcaggcc cggcccccgc cacacgctag tggaccccga aggcgtctgg gatgcgaacg 660 ggcctggaac catagcgtca gggaggccgg ggtccccctg ggcctgccag ccccgggtgc 720 gaggaggcgc gggggcagtg ccagccgaag tctgccgttg cccaagaggc ccaggcgtgg 780 cgctgcccct gagccggagc ggacgcccgt tgggcagggg tcctgggccc acccgggcag 840 gacgcgtgga ccgagtgacc gtggtttctg tgtggtgtca cctgccagac ccgccgaaga 900 agccacctct ttggagggtg cgctctctgg cacgcgccac tcccacccat ccgtgggccg 960 ccagcaccac gcgggccccc catccacatc gcggccacca cgtccctggg acacgccttg 1020 tcccccggtg tacgccgaga ccaagcactt cctctactcc tcaggcgaca aggagcagct 1080 gcggccctcc ttcctactca gctctctgag gcccagcctg actggcgctc ggaggctcgt 1140 ggagaccatc tttctgggtt ccaggccctg gatgccaggg actccccgca ggttgccccg 1200 cctgccccag cgctactggc aaatgcggcc cctgtttctg gagctgcttg ggaaccacgc 1260 gcagtgcccc tacggggtgc tcctcaagac gcactgcccg ctgcgagctg cggtcacccc 1320 agcagccggt gtctgtgccc gggagaagcc ccagggctct gtggcggccc ccgaggagga 1380 ggacacagac ccccgtcgcc tggtgcagct gctccgccag cacagcagcc cctggcaggt 1440 gtacggcttc gtgcgggcct gcctgcgccg gctggtgccc ccaggcctct ggggctccag 1500 gcacaacgaa cgccgcttcc tcaggaacac caagaagttc atctccctgg ggaagcatgc 1560 caagctctcg ctgcaggagc tgacgtggaa gatgagcgtg cgggactgcg cttggctgcg 1620 caggagccca ggggttggct gtgttccggc cgcagagcac cgtctgcgtg aggagatcct 1680 ggccaagttc ctgcactggc tgatgagtgt gtacgtcgtc gagctgctca ggtctttctt 1740 ttatgtcacg gagaccacgt ttcaaaagaa caggctcttt ttctaccgga agagtgtctg 1800 gagcaagttg caaagcattg gaatcagaca gcacttgaag agggtgcagc tgcgggagct 1860 gtcggaagca gaggtcaggc agcatcggga agccaggccc gccctgctga cgtccagact 1920 ccgcttcatc cccaagcctg acgggctgcg gccgattgtg aacatggact acgtcgtggg 1980 agccagaacg ttccgcagag aaaagagggc cgagcgtctc acctcgaggg tgaaggcact 2040 gttcagcgtg ctcaactacg agcgggcgcg gcgccccggc ctcctgggcg cctctgtgct 2100 gggcctggac gatatccaca gggcctggcg caccttcgtg ctgcgtgtgc gggcccagga 2160 cccgccgcct gagctgtact ttgtcaaggt ggatgtgacg ggcgcgtacg acaccatccc 2220 ccaggacagg ctcacggagg tcatcgccag catcatcaaa ccccagaaca cgtactgcgt 2280 gcgtcggtat gccgtggtcc agaaggccgc ccatgggcac gtccgcaagg ccttcaagag 2340 ccacgtctct accttgacag acctccagcc gtacatgcga cagttcgtgg ctcacctgca 2400 ggagaccagc ccgctgaggg atgccgtcgt catcgagcag agctcctccc tgaatgaggc 2460 cagcagtggc ctcttcgacg tcttcctacg cttcatgtgc caccacgccg tgcgcatcag 2520 gggcaagtcc tacgtccagt gccaggggat cccgcagggc tccatcctct ccacgctgct 2580 ctgcagcctg tgctacggcg acatggagaa caagctgttt gcggggattc ggcgggacgg 2640 gctgctcctg cgtttggtgg atgatttctt gttggtgaca cctcacctca cccacgcgaa 2700 aaccttcctc aggaccctgg tccgaggtgt ccctgagtat ggctgcgtgg tgaacttgcg 2760 gaagacagtg gtgaacttcc ctgtagaaga cgaggccctg ggtggcacgg cttttgttca 2820 gatgccggcc cacggcctat tcccctggtg cggcctgctg ctggataccc ggaccctgga 2880 ggtgcagagc gactactcca gctatgcccg gacctccatc agagccagtc tcaccttcaa 2940 ccgcggcttc aaggctggga ggaacatgcg tcgcaaactc tttggggtct tgcggctgaa 3000 gtgtcacagc ctgtttctgg atttgcaggt gaacagcctc cagacggtgt gcaccaacat 3060 ctacaagatc ctcctgctgc aggcgtacag gtttcacgca tgtgtgctgc agctcccatt 3120 tcatcagcaa gtttggaaga accccacatt tttcctgcgc gtcatctctg acacggcctc 3180 cctctgctac tccatcctga aagccaagaa cgcagggatg tcgctggggg ccaagggcgc 3240 cgccggccct ctgccctccg aggccgtgca gtggctgtgc caccaagcat tcctgctcaa 3300 gctgactcga caccgtgtca cctacgtgcc actcctgggg tcactcagga cagcccagac 3360 gcagctgagt cggaagctcc cggggacgac gctgactgcc ctggaggccg cagccaaccc 3420 ggcactgccc tcagacttca agaccatcct ggactgatgg ccacccgccc acagccaggc 3480 cgagagcaga caccagcagc cctgtcacgc cgggctctac gtcccaggga gggaggggcg 3540 gcccacaccc aggcccgcac cgctgggagt ctgaggcctg agtgagtgtt tggccgaggc 3600 ctgcatgtcc ggctgaaggc tgagtgtccg gctgaggcct gagcgagtgt ccagccaagg 3660 gctgagtgtc cagcacacct gccgtcttca cttccccaca ggctggcgct cggctccacc 3720 ccagggccag cttttcctca ccaggagccc ggcttccact ccccacatag gaatagtcca 3780 tccccagatt cgccattgtt cacccctcgc cctgccctcc tttgccttcc acccccacca 3840 tccaggtgga gaccctgaga aggaccctgg gagctctggg aatttggagt gaccaaaggt 3900 gtgccctgta cacaggcgag gaccctgcac ctggatgggg gtccctgtgg gtcaaattgg 3960 ggggaggtgc tgtgggagta aaatactgaa tatatgagtt tttcagtttt gaaaaaaa 4018 <210> 3 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTERT targeting trans-splicing ribozyme <400> 3 ggcaggaaaa gttatcaggc atgcacctgg tagctagtct ttaaaccaat agattgcatc 60 ggtttaaaag gcaagaccgt caaattgcgg gaaaggggtc aacagccgtt cagtaccaag 120 tctcagggga aactttgaga tggccttgca aagggtatgg taataagctg acggacatgg 180 tcctaaccac gcagccaagt cctaagtcaa cagatcttct gttgatatgg atgcagttca 240 cagactaaat gtcggtcggg gaagatgtat tcttctcata agatatagtc ggacctctcc 300 ttaatgggag ctagcggatg aagtgatgca acactggagc cgctgggaac taatttgtat 360 gcgaaagtat attgattagt tttggagtac tcg 393 <210> 4 <211> 1131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-tk <400> 4 atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60 ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120 cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180 gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240 gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300 tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360 atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420 cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480 ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540 agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600 acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660 cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720 ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780 cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840 cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900 aacggcgacc tgtacaacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960 cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020 ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca cccccggctc cataccgacg 1080 atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaactg a 1131 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122T <400> 5 caaacaccat tgtcacactc ca 22 <210> 6 <211> 181 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SD/SA sequence <400> 6 agatctgaac tgaaaaacca gaaagttaac tggtaagttt agtctttttg tcttttattt 60 caggtcccgg atccggtggt ggtgcaaatc aaagaactgc tcctcagtgg atgttgcctt 120 tacttctagg cctgtacgga agtgttactt ctgctctaaa agctgcggaa ttgtacccag 180 g 181 <210> 7 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WPRE sequence <400> 7 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540 cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589 <210> 8 <211> 326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribozyme antisense sequence <400> 8 aaggccagca cgttcttcgc gccgcgctcg cacagcctct gcagcactcg ggccaccagc 60 tccttcaggc aggacacctg gcggaaggag ggggcggcgg ggggcggccg tgcgtcccag 120 ggcacgcaca ccaggcactg ggccaccagc gcgcggaaag ccgccgggtc cccgcgctgc 180 accagccgcc agccctgggg ccccaggcgc cgcacgaacg tggccagcgg cagcacctcg 240 cggtagtggc tgcgcagcag ggagcgcacg gctcggcagc ggggagcgcg cggcatcgcg 300 ggggtggccg gggccagggc ttccca 326 <210> 9 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-globin poly(A) signal <400> 9 aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctca 56 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribozyme forward primer <400> 10 ttccggagga cagacacatc ga 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribozyme reverse primer <400> 11 gcagataccg caccgtattg gc 22

Claims (19)

  1. (i) 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus, CMV) 프로모터; 및
    (ii) 암 특이적 유전자 서열을 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자임, 상기 리보자임의 3' 엑손에 연결된 목적 유전자를 포함하는, 리보자임-목적 유전자 발현 카세트를 포함하고,
    상기 발현 카세트는 리보자임-목적 유전자 발현 카세트의 5' 말단에 스플라이싱 공여/스플라이싱 수여 서열(splicing donor/splicing acceptor sequence, SD/SA sequence)이 연결되고, 3' 말단에 WPRE(Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element)가 연결된 것으로,
    (iii) 상기 WPRE의 3' 말단에 마이크로 RNA-122(microRNA-122, miR-122)를 인식하는 핵산 서열이 추가로 연결된 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암 특이적 유전자 서열은 TERT(Telomerase Reverse Transcriptase) mRNA, AFP(alphafetoprotein) mRNA, CEA(carcinoembryonic antigen) mRNA, PSA(Prostate-specific antigen) mRNA, CKAP2(Cytoskeleton-associated protein 2) mRNA 및 돌연변이 RAS(Rat sarcoma) mRNA로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 재조합 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 TERT mRNA 서열은 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 목적 유전자는 암 치료용 유전자 또는 리포터 유전자인 것인, 재조합 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 암 치료용 유전자는 약제 감수성 유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 사이토카인 유전자 및 항신생 혈관 생성 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 재조합 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 약제 감수성 유전자는 HSVtk(Herpes Simplex Virus thymidine kinase) 유전자인 것인, 재조합 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 HSVtk 유전자는 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터.
  9. 제5항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 루시퍼라제(luciferase), 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein; mGFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 변형된 적색 형광 단백질(mRFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP) 또는 증강된 남색 형광 단백질(ECFP)인 것인, 재조합 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 상기 마이크로 RNA-122를 인식하는 핵산 서열은 서열번호 5의 핵산 서열을 1 카피 이상 포함하는 것인, 재조합 벡터.
  11. 제1항의 재조합 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템.
  12. 제1항의 재조합 벡터로부터 발현된 리보자임.
  13. 제1항의 재조합 벡터, 제11항의 유전자 전달 시스템, 또는 제12항의 리보자임을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암은 간암, 교모세포종, 담도암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 골암, 유방암, 대장암, 위암, 전립선암, 백혈병, 자궁암, 난소암, 림프종, 또는 뇌암인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 암은 암 조직에서 발현되는 miR-122의 카피수가 상기 약학적 조성물에 의해 암 조직에서 발현되는 리보자임의 카피수의 100배 미만인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암은 암 조직에서 miR-122가 실질적으로 발현되지 않는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 간암은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus), 간암 조직에서 miR-122의 발현이 저하되는 C형 간염 바이러스, 알코올, 만성 간염, 간경변, 비알코올성 지방간, 아플라톡신, 및 가족력으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 원인으로 하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 암조직 내 및 피하로 이루어진 군에서 선택되는 경로로 투여되는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사제 형태로 투여되는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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