KR20220107932A

KR20220107932A - 면역관문 억제제를 발현하는 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220107932A
Application number: KR1020210193826A
Authority: KR
Inventors: 이성욱; 조은이; 김태영; 박혜림
Original assignee: 알지노믹스 주식회사
Priority date: 2021-01-25
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-08-02
Also published as: KR102471898B1

Abstract

본 발명은 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임은 정상 조직에는 작용하지 않고 암 조직에서 특이적으로 발현되어 안전성이 높고, 전사 후 수준에서 발현 효율이 우수한 특징이 있으며, 리보자임의 3' 엑손에는 하나 이상의 목적 유전자가 연결되어 있어 체내로 도입시 암 치료 유전자 및 면역관문 억제제를 같이 발현하므로 암을 치료하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

면역관문 억제제를 발현하는 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도{TUMOR-TARGETING TRANS-SPLICING RIBOZYME EXPRESSING IMMUNE CHECKPOINT INHIBITOR AND USE THEREOF}

본 발명은 암세포에서 면역관문 억제제를 발현하는 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도에 관한 것이다.

의학 기술이 발전하면서 암 치료 기술도 계속 개발되고 있다. 특히 최근에 인체의 면역 시스템을 이용해 개발된 면역항암요법의 치료 효과가 입증되면서 기존의 화학치료제 및 표적치료제를 사용하였던 항암치료 요법은 면역치료제를 이용하는 면역항암요법으로 패러다임 전환이 진행되고 있다.

통상적으로 이루어지는 항암 치료는 수술을 통한 종양 절제법이다. 이때 절제 전의 종양 크기 축소 또는 절제 후의 잔존 암세포 사멸 및 재발방지를 목적으로 방사선치료 및 화학치료가 병행된다. 제1세대 항암제(1970년대 이후)로 일컬어지는 방사선 치료 및 화학치료는 암세포가 무한대로 분열 증폭하는 과정을 방해하여 암세포의 사멸을 유도한다. 하지만 방사선 치료와 화학 치료법은 암세포뿐만 아니라 정상세포의 사멸도 유도하는 부작용이 있었다.

2000년대에 들어서 정상세포와 구분하여 암세포만을 선택적으로 공격하는 표적 항암제가 개발되어, 상기 제1세대 항암 치료제의 부작용을 대폭 줄일 수 있는 제2세대 항암제로 일컬어졌다. 특정 표적 단백질에만 작용하는 표적 항암제는 암을 유발하는 단백질에만 작용해 암세포를 선택적으로 억제함으로써 치료 효과를 나타낸다. 따라서 암의 종류에 따라 유발 단백질 또는 치료 효과를 나타내는 단백질이 상이하기 때문에 표적 단백질의 종류에 맞는 항암제를 사용하여야 한다. 표적 항암제의 또 다른 한계점은 암세포가 표적 항암제에 대해 내성을 획득하는 기작을 갖는다는 점이다. 즉 암세포 자신이 표적 항암제의 표적이 되지 않도록 돌연 변이를 일으켜 항암제 회피 능력을 획득하기 때문에 표적 항암제가 암세포로 인식하지 않을 수 있다.

제3세대 항암제인 면역 항암제는 인체의 면역체계를 활성화시켜 자가면역력을 높여서 면역세포가 암세포를 공격하여 제거하도록 한다. 면역 항암제에 의해 암세포 공격 기능이 향상된 면역세포는 암세포가 그 기능 및 성질을 완전히 바꾸지 않는한 처음 공격했던 암세포를 기억하고 지속적으로 공격한다.

면역 항암제는 크게 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor), 면역세포치료제 (immune cell therapy), 치료용 항체(therapeutic antibody) 및 항암 백신 (anticancer vaccine)으로 분류할 수 있다. 면역관문 억제제는 T 세포 억제에 관여하는 면역관문 단백질(immune checkpoint protein)의 활성을 차단하여 T 세포를 활성화시킴으로써 암세포를 공격하는 약제로서 대표적으로 CTLA 4, PD-1, PD-L1 등을 인식하는 항체를 사용한다.

그러나 면역 항암제에 대한 암 환자의 반응률은 아직까지 15 내지 45% 수준에 머무르고 있고, 암의 종류 및 환자에 따라 반응률이 상이하며, 암뿐만 아니라 피부 및 위장관계, 갑상선 및 부신 등 체내 다양한 장기에 영향을 미쳐 부작용이 점점 보고되고 있는 실정이다.

면역항암제 개발 현황, BRIC View 2019-T05

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로서, 면역관문 억제제 유전자를 포함한 2 이상의 서로 다른 암 치료용 유전자를 포함하는 트랜스 스플라이싱 리보자임, 상기 리보자임을 발현할 수 있는 벡터 및 유전자 전달 시스템을 제공하는 것에 목적이 있다.

또한, 상기 트랜스 스플라이싱 리보자임은 암 특이적 유전자를 표적하여 암 세포에서 능동적으로 작동할 수 있는바, 본 발명은 상기 리보자임, 벡터, 또는 유전자 전달 시스템의 암 치료 용도 제공을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 암 특이적 유전자를 표적으로 하는 트랜스 스플라이싱 리보자임으로서, 상기 리보자임은 3' 엑손에 연결된 목적 유전자를 포함하며, 상기 목적 유전자는 면역관문 억제제 유전자를 포함하는 2 이상의 암 치료용 유전자인 것을 특징으로 하는, 트랜스 스플라이싱 리보자임을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 트랜스 스플라이싱 리보자임은 5' - trans-splicing ribozyme - 암 치료용 유전자 - 면역관문 억제제 유전자 - 3'의 구조를 가질 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 2 이상의 암 치료용 유전자 중 1 종은 면역관문 억제제를 암호화하는 유전자이고, 다른 하나는 이와 구별되는 암 치료용 유전자로서 약제감수성 유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 사이토카인 유전자 및 항신생 혈관 생성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 약제감수성 유전자는 HSVtk(Herpes Simplex Virus thymidine kinase)일 수 있으며, 서열번호 5의 염기서열로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 암특이적 유전자는 TERT(Telomerase Reverse Transcriptase) mRNA, AFP(alphafetoprotein) mRNA, CEA(carcinoembryonic antigen) mRNA, PSA(Prostate-specific antigen) mRNA, CKAP2(Cytoskeleton-associated protein 2) mRNA 및 돌연변이 RAS(Rat sarcoma) mRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 trans-splicing ribozyme은 TERT 유전자를 표적으로 할 수 있으며, 서열번호 4의 염기서열로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 면역관문 억제제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR, TIGIT, CD47, VISTA 또는 A2aR의 억제제일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 트랜스 스플라이싱 리보자임은 3' 말단 위치에 마이크로 RNA-122a(miR-122a)의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 서열번호 6의 염기서열을 포함할 수 있고, 상기 서열이 2~10회 반복된 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 트랜스 스플라이싱 리보자임에서 면역관문억제제 유전자와 이를 제외한 암 치료용 유전자는 자가 절단 펩타이드(self-cleaving peptide)를 암호화하는 유전자로 연결될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 자가 절단 펩타이드는 P2A일 수 있으며, 서열번호 7의 염기서열로 암호화될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 트랜스 스플라이싱 리보자임을 발현할 수 있는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 발현 벡터는 상기 리보자임 유전자와 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로모터는 조직 특이적으로 작동하는 프로모터일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 유전자 전달 시스템과 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 트랜스 스플라이싱 리보자임, 상기 발현 벡터, 및 상기 유전자 전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 트랜스 스플라이싱 리보자임, 상기 발현 벡터, 및 상기 유전자 전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 항암제 제조를 위한 상기 트랜스 스플라이싱 리보자임, 상기 발현 벡터, 및/또는 상기 유전자 전달 시스템의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 약학적 조성물 및 항암제는 경구 또는 주사제 형태로 정맥 내, 동맥 내, 암조직 내 및/또는 피하를 경로로 투여되는 것일 수 있으며, 상기 암 치료 방법에 있어서도 개체에 투여는 상기 경로로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 암은 간암, 교모세포종, 담도암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 골암, 유방암, 대장암, 위암, 전립선암, 백혈병, 자궁암, 난소암, 림프종, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 암일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 암은 면역관문억제제 내성 암일 수 있다.

본 발명에 따른 트랜스-스플라이싱 리보자임은 정상 조직에는 작용하지 않고 암 조직에서 특이적으로 발현되어 안전성이 높고, 전사 후 수준에서 발현 효율이 우수한 특징이 있다. 또한, 본 발명의 리보자임의 3' 엑손에는 하나 이상의 목적 유전자가 연결되어 있어 체내로 도입하면 암 치료 유전자 및 면역관문 억제제를 발현하여 면역세포의 작용과 활성을 증가시켜 발현된 암 치료 유전자와 함께 항암 효능에 시너지 효과를 나타내어 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 CRT-122T/ICI의 기본 구성 및 항암 기전을 개략적으로 나타낸 도면이다. CRT-122T/ICI란 암치료용 유전자 (HSVtk)와 면역관문억제제(ICI)를 암특이적으로 발현하며 3' 말단에 miR-122a에 대한 상보적 서열(mir-T)을 가진 TERT 표적 트랜스-스플라이싱 리보자임을 발현할 수 있는 벡터이다.
도 2는 PD1scFv (PD1에 대한 scFv) 또는 PDL1scFv (PDL1에 대한 scFv) 를 발현하는 CRT-122T/ICI의 구성을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 간암 세포주에서 다양한 RZ-001+의 세포사 유도 활성을 확인하여 RZ-001과 동등성을 확인한 결과이다. RZ-001+란 CRT-122T/ICI를 포함한 벡터를 발현할 수 있는 바이러스 벡터이다. RZ-001란 암치료용 유전자 (HSVtk)를 암특이적으로 발현하며 3' 말단에 miR-122a에 대한 상보적 서열(mir-T)을 가진 hTERT 표적 트랜스-스플라이싱 리보자임을 발현할 수 있는 바이러스 벡터이다 (특허등록번호; 10-2252423).
도 4는 뇌종양 세포주에서 다양한 RZ-001+의 세포사 유도 활성을 확인하여 RZ-001과 동등성을 확인한 결과이다.
도 5는 폐암 세포주 및 흑색종 세포주에서 다양한 RZ-001+의 세포사 유도 활성을 확인하여 RZ-001과 동등성을 확인한 결과이다.
도 6은 면역관문 억제제인 scFvPD1(N) 또는 scFvPD1(I) 을 발현하는 안정화 세포주를 제작한 후 면역관문 억제제의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 7은 인간 PD1(hPD1) 또는 마우스 PD1(mPD1)을 발현하는 세포 용해물과 scFvPD1을 발현하는 안정화 세포주에서 회수한 scFvPD1을 반응시킨 결과이다.
도 8는 마우스 간암 세포주인 Hepa1-6 세포로 마우스 PD1(mPD1)을 발현하는 안정화 세포주를 제작한 후 mPD1의 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 9는 Hepa1-6 세포 및 마우스 PD1(mPD1)을 발현하는 Hepa1-6 세포 (Hepa1- 6/mPD1) 각각에 mRZ-001+를 처리한 후 바이러스 감염 정도를 확인한 결과이다. mRZ-001+란 암치료용 유전자 (HSVtk)와 면역관문억제제(ICI)를 암특이적으로 발현하며 3' 말단에 miR-122a에 대한 상보적 서열(mir-T)을 가진 mouse TERT 표적 트랜스-스플라이싱 리보자임을 발현할 수 있는 바이러스 벡터이다.
도 10은 Hepa1-6, Hepa1-6/mPD1 및 Hepa1c1c7 세포 각각에 mRZ-001+를 처리한 후 세포 생존률 (cell viability)을 확인한 결과이다.
도 11은 Hepa1-6, Hepa1-6/mPD1 및 Hepa1c1c7 세포 각각에 mRZ-001+를 처리한 후 면역관문 억제제의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
도 12은 Hepa1-6 세포에 mRZ-001+를 처리한 후 세포 사멸(apoptosis) 수준을 유세포 분석기로 확인한 결과를 나타낸다.
도 13는 Hepa1-6/mPDL1 세포에 mRZ-001+를 처리한 후 세포 사멸 수준을 유세포 분석기로 확인한 결과를 나타낸다.
도 14는 Hep3b 및 SNU398 세포에 RZ-001+를 처리한 후 각 세포에서 목적 유전자(HSVtk 및 scFv)의 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 15는 RZ-001+를 처리한 간암세포주에서 발현된 리보자임에 의하여 TERT mRNA를 표적으로 트랜스 스플라이싱이 발생하였는지 여부와 그 발생 위치를 확인한 결과이다.
도 16은 Hep3b 및 SNU398 세포에 RZ-001+를 처리하고 PD1/PDL1 blockade bioassay를 수행한 결과이다.
도 17은 인간 간암 세포주인 SNU398과 인간 뇌종양 세포주인 U87MG 각 세포에서 PD-L1의 발현을 확인한 결과이다.
도 18는 10MOI 또는 20MOI 농도로 RZ-001+를 처리한 U87MG 세포에서 면역관문억제제의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 19은 U87MG 세포에 RZ-001+를 양을 증가하면서 처리하고 PD1/PDL1 blockade bioassay를 수행한 결과이다. 대조군으로 Atezolizumab (anti-PDL1)에 의한 PD1/PDL1 blockade bioassay를 수행하였다.
도 20는 PBMC-인간화 간암모델에서 RZ-001 투여, RZ-001+_At 투여, 또는 RZ-001과 At 병용 투여(RZ-001/At)에 따른 종양의 성장 저해 및 무게 감소와 각 투여 약물의 간독성을 확인한 결과이다.
도 21는 Orthotopic 뇌종양 syngeneic 모델의 각 약물 투여 군의 MRI 사진이다.
도 22은 Orthotopic 뇌종양 syngeneic 모델에서 mRZ-001 투여와 mRZ-001+ 투여에 따른 종양 크기 감소 정도를 비교하여 확인한 결과이다.
도 23는 Orthotopic 뇌종양 syngeneic 모델에서 mRZ-001과 mRZ-001+ 투여군의 혈청 ALT 및 AST 수준을 확인한 결과이다.
도 24은 Xenograft Orthotopic 뇌종양 모델에서 RZ-001+의 효과 확인을 위한 실험 개략도 이다.
도 25은 Xenograft Orthotopic 뇌종양 모델에 RZ-001 또는 RZ-001+를 투여한 마우스의 실험 경과에 따른 IVIS 촬영 이미지 이다.
도 26는 Xenograft Orthotopic 뇌종양 모델에서 RZ-001 또는 RZ-001+를 투여한 마우스의 실험 경과에 따른 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 27은 Xenograft Orthotopic 뇌종양 모델에서 RZ-001 또는 RZ-001+의 항암 효과를 확인한 결과이다.

본 발명자들은 이전의 연구에서 암 특이적 유전자, 구체적으로 TERT mRNA를 표적으로 하는 트랜스 스플라이싱 리보자임을 이용하여 암의 증식 및 성장을 억제하고, 상기 리보자임에 목적 유전자, 특히 암 치료용 유전자를 결합하여 암 세포의 사멸을 유도함으로써 암을 치료할 수 있는 트랜스 스플라이싱 리보자임과 이를 발현하는 벡터를 제작한 바 있다.

이전 연구에서 트랜스 스플라이싱 리보자임 발현 벡터는 CRT-122T로 명명하였으며 그 기본적인 구조는 아래와 같은 구조를 포함한다.

[ 5'- 프로모터 - TERT targeting ribozyme - 목적 유전자(HSVtk) - miR-122T - 3' ]

CRT-122T에서 SD/SA 및 WPRE 서열이 추가된 벡터를 발현할 수 있는 바이러스 벡터를 RZ-001로 명기하였으며 (KR 10-2252423), RZ-001은 다양한 암종에 작용하여 세포사를 유도하며, 종양의 성장을 억제하여 암의 치료에 적용가능하다.

본 발명자들은 이전 연구에 나아가 보다 효과적으로 암의 치료가 가능한 트랜스 스플라이싱 리보자임 개발을 위하여 리보자임에 의해 발현되는 목적 유전자를 2종으로 확대하고, 상기 목적 유전자에 면역관문억제제 유전자를 포함시켰으며, 상기 리보자임을 발현할 수 있는 벡터로서 CRT-122T/ICI를 개발하였다. 본 발명의 CRT-122T/ICI의 기본 구조는 아래와 같다(도 1).

[ 5'- 프로모터- TERT targeting ribozyme - 목적 유전자 - 자가 절단 펩타이드 유전자 - 면역관문억제제 유전자 - miR-122T - 3' ]

한편, 본 명세서에서 CRT-122T/ICI가 암호화하는 면역관문억제제에 따라서 “/”를 기준으로후단에 타겟 면역관문단백질 또는 면역관문억제제를 표기하였다. 예를들어, 아테졸리주맙(Atezolizumab)을 발현하는 벡터는 CRT-122T/At로 표시한다.

본 발명자들은 구체적인 실험을 통해 CRT-122T/ICI는 간암세포주, 뇌종양 세포주, 폐암 세포주 및 흑색종 세포주에서 CRT-122T와 유사한 수준의 세포사 유도 활성을 나타내었다(실시예 2).

나아가, 본 발명자들은 CRT-122T/ICI를 발현하는 아데노바이러스(이하 “RZ-001+”로 명명함)를 제작하여 구체적인 실험을 통해 다양한 세포주에서의 작용을 확인하였다.

한편, 본 명세서에서 RZ-001+는 로딩된 CRT-122T/ICI의 종류에 따라서 RZ-001+_(타겟 면역관문단백질 또는 면역관문억제제)로 구분하여 표기하였다. 예를들어, CRT-122T/At를 포함하는 아데노바이러스는 RZ-001+_At로 표시한다.

구체적으로, RZ-001+로 암 세포를 감염시킨 후 상기 암세포의 생존율을 측정하여 RZ-001+ 감염에 따른 세포사멸 정도를 확인하였으며, 상기 RZ-001+ 감염에 따른 CRT-122T/ICI 도입이 면역관문 단백질과 결합하여 그 기능을 차단할 수 있는 항체를 발현하는지 확인하였고, 이어서 상기 항체가 원활히 분비되어 작용할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, RZ-001+ 감염에 따라 암 세포의 세포사가 증가하였으며, 상기 항체의 발현이 증가되고, 발현된 항체가 충분히 분비됨을 확인하였다(실시예 5 및 6).

이어서, 본 발명자들은 세포 실험에서 확인한 RZ-001+의 항암 활성이 생체 내에서도 동일하게 발현될 수 있는지 확인하고자 다양한 암 동물모델을 제작하여 RZ-001+를 투여하고 종양의 크기 및 무게를 측정하였다. 특히, 뇌 종양의 치료 약물로서의 유효성 평가를 위해서 BBB 등의 뇌 내 미세환경을 모사하는 Orthotopic 뇌종양 모델을 제작하여 뇌종양 치료제로서의 RZ-001+의 가능성을 확인하고자 하였다. 그 결과, 간암 동물모델 및 뇌종양 동물모델 모두에서 RZ-001+의 처리에 따라 종양의 크기 및 무게가 감소하였다. 특히 인간화 간암동물모델에서 RZ-001+_At 투여군은 RZ-001과 Atezolizumab의 병용투여군과 비교하여 유사한 수준으로 종양의 크기를 감소시켰으나, 간 독성에 있어서 병용투여군보다 낮은 간 독성을 나타내었는바 부작용이 없거나 적은 항암제로서 제공될 수 있음을 확인하였다(실시예 7). 나아가, orthotopic 뇌종양 syngeneic 동모델에서는 mRZ-001+_I (mCRT-122T_scFvPD1(I)) 투여군이 mRZ-001 투여군과 비교하여 더 효과적인 항암능을 나타내었다. 또한 인간 유래 뇌종양 세포를 이식한 Xenograft Orthotopic 뇌종양 모델에서도 RZ-001+의 유효한 항암 활성을 확인하였는바, 본 발명자들은 세포 내에서 암 특이적 유전자를 타겟으로 하며 면역관문억제제와 암 치료 물질을 발현할 수 있는 트랜스 스플라이싱 리보자임을 암 치료를 위해 제공한다.

본 발명의 트랜스 스플라이싱 리보자임이 포함하는 각 구성과 그 기본 구조는 아래와 같다.

[5' - 암 특이적 유전자를 표적하는 리보자임 - 목적 유전자 - 자가 절단 펩타이드 유전자 - 면역관문억제제 유전자 - miR-122T - 3']

상기 트랜스 스플라이싱 리보자임은 표적하는 세포 내에서 암 특이적 유전자의 mRNA와 상보결합하여 그 유전자를 절단하고 목적 유전자 이하의 전사체를 발현시킬 수 있다.

본 발명의 트랜스 스플라이싱 리보자임은 5'

3' 순서대로 암 특이적 유전자를 표적하는 리보자임, 목적 유전자, 자가 절단 펩타이드 유전자, 면역관문억제제 유전자, 및 miR-122T를 포함하며, 각 구성은 그 기능을 유지하는 범위 내에서 직접적 또는 간접적 방법으로 작동 가능하게 연결된 것일 수 있고, 상기 트랜스 스플라이싱 리보자임은 특히 목적 유전자의 기능을 향상시키기 위하여 각 구성 사이에 조절 인자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 “리보자임”이라는 용어는 효소처럼 작용하는 RNA 분자 또는 그 RNA 분자를 포함하는 단백질로 구성되는 분자로 RNA 효소 또는 촉매적 RNA라고도 불린다. 명확한 3차 구조를 갖는 RNA 분자로 화학반응을 수행하며 촉매적 또는 자기촉매적 특성을 가진다. 일부 리보자임은 자기 또는 다른 RNA 분자를 절단하여 활성을 저해하고, 다른 리보자임은 리보솜의 아미노전달효소(aminotransferase) 활성을 촉매하는 것으로 알려져다. 이러한 리보자임에는 망치머리(hammerhead) 리보자임, VS 리보자임 및 헤어핀(hairpin) 리보자임 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 리보자임은 그룹 I 인트론의 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 암 특이적 유전자의 활성을 저해시켜서 선택적인 항암 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 암 치료 유전자와 접합된 형태로 발현되어 암 치료 유전자를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 암 특이적 유전자를 불활성화시키고, 암 치료 유전자를 활성화시킬 수 있는 특성을 나타낸다면 어떠한 형태의 것이라도 사용 가능하다.

본 발명에 따른 리보자임은 바람직하게는 상기에서 설명한 hTERT mRNA를 표적하는 리보자임일 수 있으며, hTERT가 과다 발현되는 암세포를 표적으로 하여 hTERT mRNA를 특이적으로 절단하여 발현을 억제시키고, 목적 유전자를 특이적으로 발현시키는 역할을 할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, “트랜스-스플라이싱(trans-splicing)”은 서로 다른 유전자로부터의 RNA를 서로 연결하는 것을 의미한다. 바람직하게는 암에 특이적인 hTERT의 mRNA를 인지하여 트랜스-스플라이싱하는 능력이 검증된 hTERT 표적 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임을 사용하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 “목적 유전자”라는 용어는 상기 리보자임에 의하여 암 특이적 유전자의 mRNA와 연결되어 발현이 유도되는 유전자를 의미한다.

본 발명에 따른 목적 유전자는 바람직하게는 암 치료용 유전자 또는 리포터 유전자일 수 있고, 가장 바람직하게는 암 치료용 유전자일 수 있다.

본 발명에서 사용된 “암 치료 유전자(anti-cancer therapeutic gene)”라는 용어는 암세포에서 발현시 치료학적 효과를 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 암 치료 유전자는 상기 리보자임과 접합된 형태로 발현되거나 또는 독립적으로 발현되어, 항암활성을 나타낼 수 있다. 이러한 암 치료 유전자는 바람직하게는 약제 감수성 유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 사이토카인 유전자, 및 항신생 혈관 생성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 가장 바람직하게는 약제 감수성 유전자일 수 있다.

본 발명에서는 상기 암 치료 유전자를 단독으로 사용하거나 또는 둘 이상의 유전자를 복합적으로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약제 감수성 유전자(drug-sensitizing gene)는 독성이 없는 전구체(prodrug)를 독성물질로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자로 유전자가 도입된 세포가 사멸하게 되므로 자살 유전자(suicide gene)로도 불린다. 즉, 정상 세포에는 독성이 없는 전구체를 전신적으로 투여했을 때 암세포에만 전구체가 독성 대사체(toxic metabolite)로 전환되어 약제에 대한 감수성을 변화시킴으로써 암세포를 파괴시키는 방법이다. 이러한 약제 감수성 유전자는 바람직하게는 간시클로비르(ganciclovir)를 전구체로 이용하는 HSVtk(Herpes simplex virus-thymidine kinase) 유전자, 또는 5-플루오로시토신(5-fluorocytosine, 5-FC)를 전구체로 하는 대장균의 사이토신 탈아미노효소 (cytosine deaminase, CD) 유전자일 수 있고, 가장 바람직하게는 HSVtk 유전자일 수 있다.

본 발명에 따른 세포사멸 유전자(proapoptotic gene)는 발현되면 프로그램된 세포사를 유도하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 당업자에게 공지된 세포사멸 유전자로, p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자 및 카스파제를 코딩하는 유전자가 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 세포증식 억제 유전자(cytostatic gene)는 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 그 예로 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 생장 중지 특이성 호메오박스(growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 세포독성 유전자(cytotoxic gene)는 세포 내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 그 예로, 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 대표적으로 종양 괴사 인자(tumor necrosisfactor-α, TNF-α), p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자, MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일 단백질(adenomatous polyposis coil protein), 결손된 결장 종양(DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제 인자 유전자, MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자, VHL 유전자 또는 sPD-1(programmed death-1)가 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 항원성 유전자(antigenic gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 당업자에게 공지된 항원성 유전자의 예로 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 및 p53이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 사이토카인 유전자(cytokine gene)는 세포 내에서 발현되어 사이토카인을 생성하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 대표적으로 GMCSF, 인터루킨(IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20), 인터페론 α, β, γ(인터페론 α-2b) 및 인터페론 α-2α-1과 같은 융합체 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 항-신생혈관 생성 유전자(anti-angiogenic gene)는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포 밖으로 방출하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 그 예로 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, “HSVtk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)”는 단순 포진 바이러스로부터 유래되는 티미딘 인산화 효소를 의미한다. 이 효소는 독성이 없는 전구체(prodrug)를 독성물질로 전환시킴으로써, 그 유전자가 이입된 세포가 사멸하게 하는 약제 감수성 유전자의 대표적인 예이다. 본 발명에 있어 HSVtk 유전자는 본 발명에 따른 리보자임에 접합된 형태로 발현되어 항암 활성을 나타내는 암 치료 유전자로 사용될 수 있다. 이러한 HSVtk 유전자는 바람직하게는 진뱅크(genbank) 등록번호 AAP13943, P03176, AAA45811, P04407, Q9QNF7, KIBET3, P17402, P06478, P06479, AAB30917, P08333, BAB84107, AAP13885, AAL73990, AAG40842, BAB11942, NP_044624, NP_044492, CAB06747 등에 기재된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, “리포터 유전자”는 본 발명의 일 예에 따른 재조합 벡터의 도입 여부 또는 리보자임의 발현 효율을 모니터링하기 위해 사용되는 유전자로서 감염된 세포 또는 조직의 손상이 없이 모니터링할 수 있는 유전자라면 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 루시퍼라제(luciferase), 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein; mGFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescentprotein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 변형된 적색 형광 단백질(modified red fluorescent protein; mRFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP) 또는 증강된 남색 형광 단백질(ECFP)일 수 있다.

목적 유전자로 리포터 유전자를 삽입하여 암세포 특이적인 리보자임의 발현 정도를 관찰할 수 있으며, 특히 본 발명의 리보자임은 프로모터 및 마이크로 RNA 표적 사이트를 포함하고 있어, 정상 세포에서는 발현되지 않고 암세포 특이적으로 발현할 수 있다. 이를 이용하여 특정 조직에서 암이 발생했는지 여부를 진단하는데 적용할 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.

본 명세서 내에서 miR-122의 일부 또는 전부와 상보적인 염기 서열은 miR-122T(microRNA-122 target site)로 명명된다. 본 발명에서 miR-122T는 miR-122와 상보결합하여 dsRNA를 형성할 수 있다면, 구체적인 서열에 차이가 있어도 무방하다. miR-122T는 상기 miR-122의 일부 또는 전부와 상보적인 염기서열을 1회 이상 포함할 수 있고, 예를 들어 1회 내지 10회, 바람직하게는 1회 내지 5회, 더욱 바람직하게는 1회 내지 3회 반복하여 포함할 수 있다. miR-122는 정상 간세포에서는 정상적으로 발현되나, 간암 세포에서는 발현량이 감소하는 특징이 있다. 이를 이용하여 간암 세포에 대한 민감도 및 특이도를 증가시킨 치료제를 개발할 수 있으며, 본 발명에서는 목적 유전자가 연결된 리보자임에 miR-122를 인식하는 핵산 서열을 연결함으로써 간암 세포 특이적인 리보자임의 발현이 이루어질 수 있도록 하였다.

본 발명에서 사용된 “암 특이적 유전자”라는 용어는 암세포에서만 특이적으로 발현되거나 또는 현저하게 과발현되는 유전자를 의미한다. 상기 암 특이적 유전자는 본 발명에 따른 리보자임이 암 특이적으로 작용할 수 있는 특징을 부가할 수 있다. 이러한 암 특이적 유전자는 바람직하게는 TERT(Telomerase reverse transcriptase) mRNA, AFP(alphafetoprotein) mRNA, CEA(carcinoembryonic antigen) mRNA, PSA(Prostate-specific antigen) mRNA, CKAP2(Cytoskeleton-associated protein 2) mRNA, 또는 mutant RAS(Rat sarcoma) mRNA일 수 있고, 더 바람직하게는 TERT(Telomerase reverse transcriptase) mRNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 hTERT(human telomerase reverse transcriptase) mRNA 서열일 수 있다. 본 발명의 트랜스 스플라이싱 리보자임은 상기 암 특이적 유전자를 표적으로 트랜스 스플라이싱을 유도하여 리보자임과 연결된 목적 유전자를 발현시킴으로써 교모세포종 세포주, 흑색종 세포주, 간암 세포주, 및 폐암 세포주에서 세포사 유도 효과를 확인하였다.

본 발명에서 사용된 용어, “TERT(Telomerase reverse transcriptase)”는 암 세포의 영속성(immortality) 및 증식(proliferation) 능력을 조절하는 가장 중요한 효소 중의 하나로, 염색체에 말단소립(telomere) 구조를 형성해 염색체 끝을 보호하는 역할을 통해 세포의 노화를 억제하는 효소를 의미한다. 정상적인 세포에서는 세포가 분열할 때마다 말단소립의 길이가 조금씩 줄어들어 결국 유전물질이 손실되고, 세포가 사멸하게 된다. 그러나 암세포에서는 이 효소가 말단소립을 계속적으로 연장시켜 주기 때문에 세포가 사멸하지 않으며, 암세포의 불멸성에 직접 기여함으로써 암을 치료하는데 중대한 장애 요소로 알려져 있다. 본 발명에서는 암 특이적 유전자로 hTERT mRNA를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용된 용어, “유전자 전달 시스템(gene delivery system)”은 목적하는 유전자 및/또는 핵산 서열의 세포 내부로의 전달 효율을 높여 발현 효율을 증가시킬 수 있는 시스템을 의미하며, 바이러스 매개 시스템 및 비바이러스 시스템으로 분류될 수 있다.

바이러스 매개 시스템은 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터와 같은 바이러스성 벡터를 사용하며, 인간 세포에 감염을 일으키는 바이러스 고유의 세포 내 침투 기전을 이용하므로 비바이러스성 시스템보다 세포내 유전자 전달 효율이 비교적 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 세포 내로 들어간 다음 비바이러스성 벡터는 엔도솜이 리소좀과 융합된 다음 엔도리소솜에서 유전자들이 분해되는 문제점이 있으나, 바이러스성 벡터는 리소솜을 통과하지 않고 핵 내로 유전자를 전달하는 기전에 의하여 유전자의 손실이 작아서 유전자 전달 효율이 높은 장점이 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 바이러스성 벡터는 상기 재조합 벡터에서 설명한 바와 같이 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 등에서 유래한 벡터일 수 있다. 이러한 바이러스성 벡터는 바이러스 입자에 조립된 후 감염(infection)과 같은 형질도입(transduction) 방법으로 세포 내부로 도입될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 유전자 전달체의 예로 상기 설명한 재조합 벡터를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 고안하였다. 즉, 상기 재조합 아데노바이러스는 암 특이적 유전자에 특이적인 트랜스-스플라이싱 리보자임을 발현하는 재조합 벡터를 목적하는 세포(예를 들어, 암세포)로 전달하는 기능을 수행하며, 세포 내로 전달된 재조합 벡터는 세포내 전사 시스템에 의해 발현된다. 발현된 트랜스-스플라이싱 리보자임은 암세포 내에 많이 존재하는 암 특이적 유전자의 전사체에 리보자임에 연결된 목적 유전자를 삽입할 수 있다.

본 명세서에서 RZ-001는 CRT-122T를 발현하는 아데노바이러스를 의미하고, RZ-001+는 CRT-122T/ICI를 발현하는 아데노바이러스를 의미한다.

상기 비바이러스성 시스템은 핵산 및/또는 유전자의 전달 매개체로 양이온성 지질 전달체 또는 양이온성 고분자 전달체 등을 이용하거나, 전기 천공법을 사용하는 방법이다.

양이온성 지질 전달체는 주로 양이온성 지질로 이루어진 나노미터 크기의 리포좀이나 지질 소재 나노입자의 양전하를 이용하여 음전하인 유전자, 유전자를 포함하는 발현 벡터 또는 핵산과 복합체를 형성시킨 후 이 복합체를 탐식 작용으로 세포 내로 전달하는 방법이다. 세포 내로 전달된 복합체는 엔도솜에서 리소좀으로 1차 전달된 다음 세포질로 빠져나와 발현된다. 양이온성 고분자 전달체는 지질 대신 고분자를 사용하는 것을 제외하면 양이온성 지질 전달체와 유사한 방식으로 유전자를 전달하며, 대표적인 양이온성 고분자로는 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine), 폴리라이신(poly-L-lysine), 키토산(chitosan) 등이 있다.

따라서, 본 발명의 재조합 벡터가 양이온성 지질 전달체 또는 양이온성 고분자 전달체와 결합하여 형성된 복합체는 유전자 전달체로 사용될 수 있다.

본 발명에서, 상기 유전자 전달 시스템은 상기 설명한 재조합 벡터를 포함하며, 바이러스 매개 시스템 및 비바이러스 시스템 모두 사용될 수 있으나, 바이러스 매개 시스템을 사용하는 것이 바림직하다.

본 발명에서 사용된 용어, “벡터”는 적당한 숙주세포에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 벡터 내에 포함된 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 구조물을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어, “작동 가능하게 연결된(operably linked)”은 일반적 기능을 수행하는 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 유전자를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 본 발명의 리보자임 또는 벡터에서 각 구성은 직접적 연결인 것으로 명시하지 않는한 서로 작동 가능하게 연결된 것으로 본다.

예를 들어, 리보자임 암호화 서열을 프로모터에 작동 가능하게 연결시키면 리보자임 암호화 서열의 발현은 프로모터의 영향 또는 조절 하에 있게 된다. 2개의 핵산 서열(리보자임 암호화 서열 및 이 서열의 5' 말단의 프로모터 부위 서열)은 프로모터 작용이 유도되어 리보자임 암호화 서열이 전사되면 작동 가능하게 연결된 것이며, 상기 두 서열 사이의 연결 특성이 프레임 변경 돌연변이(frameshift mutation)를 유도하지 않고, 발현 조절 서열이 리보자임의 발현을 저해하지 않으면 작동 가능하게 연결된 것으로 볼 수 있다. 재조합 벡터와의 작동 가능한 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서와 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 세포 내에서 트랜스 스플라이싱 리보자임의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 조절 인자를 추가로 포함할 수 있다. 리보자임의 발현 증가를 위한 조절 인자의 비제한적 예로는 스플라이싱 공여/스플라이싱 수여 서열 (SD/SA) 및 WPRE이 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 또는 바이러스 벡터 등일 수 있고, 가장 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 바람직하게는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus, HIV), 마우스 백혈병 바이러스(Murine leukemia virus, MLV), 조류 육종/백혈병 바이러스(Avian sarcoma/leucosis virus, ASLV), 비장 괴사 바이러스(Spleen necrosis virus, SNV), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV), 마우스 유방 종양 바이러스(Mouse mammary tumor virus, MMTV) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus, AAV), 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus, HSV) 등에서 유래한 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 가장 바람직하게는 재조합 아데노바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명에서 사용된 “프로모터”라는 용어는 DNA의 일부분으로 전사를 개시할 수 있도록 RNA 중합효소의 결합에 관여한다. 일반적으로 표적 유전자에 인접하여 이의 상류에 위치하며, RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소를 유도하는 단백질인 전사 인자(transcription factor)가 결합하는 자리로서 상기 효소 또는 단백질이 올바른 전사 시작 부위에 위치하도록 유도할 수 있다. 즉, 센스 가닥(sense strand)에서 전사하고자 하는 유전자의 5' 부위에 위치하여 RNA 중합효소가 직접 또는 전사인자를 통해 해당 위치에 결합하여 표적 유전자에 대한 mRNA 합성을 개시하도록 유도하는 것으로 특정한 유전자 서열을 갖는다.

한편, 본 발명의 트랜스 스플라이싱 리보자임은 다양한 암종에서 세포사 유도 활성을 가지며 간 독성이 없거나 매우 낮은바, 암의 치료를 위하여 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 "암"이라는 용어는 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로는 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시킨 상태를 의미한다.

본 발명에 따른 암은 바람직하게는 간암, 교모세포종, 담도암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 골암, 유방암, 대장암, 위암, 전립선암, 백혈병, 자궁암, 난소암, 림프종, 또는 뇌암일 수 있고, 더 바람직하게는 간암, 폐암, 흑색종, 교모세포종, 및/또는 담도암일 수 있으며, 가장 바람직하게는 간암 및/또는 뇌암일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 암은 바람직하게는 암 조직에서 발현되는 miR-122의 카피수(발현량)가 상기 약학적 조성물에 의해 암 조직에서 발현되는 리보자임의 카피수의 100배 미만인 것일 수 있다.

한편, 본 발명자들은 이전의 연구에서 세포사를 유도할 수 있는 miR-122T를 보유한 hTERT 표적 리보자임의 발현량과 세포 내 miR-122의 발현량을 비교한 결과, 리보자임에 대한 miR-122의 비율이 높아질수록 리보자임의 발현이 감소하여 세포사 유도 효과가 감소함을 확인하였다. 따라서, 암 조직 내의 miR-122 발현량에 따라 항암 효과를 나타내기 위한 리보자임의 양을 유추하여 리보자임을 발현하는 아데노바이러스의 주입량을 결정할 수 있다. 구체적으로 miR-122의 최소 카피수가 리보자임 카피수의 약 100배 이상이면 miR-122 표적 부위를 갖는 리보자임의 기능(발현)이 약화되므로, 암 조직에서 발현되는 miR-122의 카피수가 본 발명에 따른 약학적 조성물에 의해 암 조직에서 발현되는 리보자임의 카피수의 100배 미만이면 높은 항암 효능을 얻을 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 암은 바람직하게는 암 조직에서 miR-122가 실질적으로 발현되지 않는 암일 수 있다. 상기 “암 조직에서 miR-122가 실질적으로 발현되지 않는 암”이란 암 조직에서 miR-122가 발현되기는 하지만 miR-122 표적 부위를 갖는 리보자임의 기능에 실질적인 영향을 미치지 않을 정도로 암 조직에서 발현되는 miR-122의 카피수가 적은 암을 의미한다.

본 발명자들은 기 연구를 통해 암 조직에서 miR-122가 실질적으로 발현되지 않는 대장암, 교모세포종, 흑색종, 자궁경부암, 폐암, 골육종, 유방암 및 담도암 세포주에서 본 발명에 따른 리보자임의 항암 효능을 확인하였다.

본 발명에서 면역관문억제제(Immune checkpoint inhibitor: ICI)는 T세포의 면역 기능 유지를 위한 PD-L1과 PD-1의 결합 저해기능 등을 수행하는 것으로서, 종양 내부로 침윤된 T-cell의 활성을 억제하는 PD-1또는 PDL-1을 저해하므로 T-cell의 활성을 극대화하여 항암 효과를 상승시킬 수 있다. 본 발명은 구체적인 실험에서 본 발명의 리보자임에 서열번호 1 내지 3의 면역관문억제제 발현 서열을 포함시켜 세포 내에서 발현을 유도하고 그 기능을 확인하였으나, T-cell 활성을 위해 면역관문 단백질을 표적으로 하는 면역관문억제제라면 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용된 "예방"이라는 용어는 본 발명에 따른 병용물 또는 약학적 조성물의 투여로 암을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용된 "치료"라는 용어는 본 발명에 따른 병용물 또는 약학적 조성물의 투여로 암이 호전되거나 그 증상을 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으나, 비경구로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 암조직 내 또는 피하로 직접 투여될 수 있으며, 주사제로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 주사제는 환자에게 투여시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수 있으며, 투여시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 다음 투여하는 형태일 수도 있다. 또한, 주사제로 제조될 때 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등과 혼합될 수 있고, 단위 투약 앰플 또는 다중 투약 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 단독으로 사용되거나, 또는 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용될 수 있다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

실시예 1: 면역관문 억제제 발현 트랜스-스플라이싱 리보자임 제작

기존에 제작한 트랜스-스플라이싱 리보자임을 변형한 재조합 벡터를 고안하였다. 구체적으로, CMV 프로모터를 포함하며, hTERT mRNA의 +21번 uridine을 포함한 부위를 표적으로 하고, 326 뉴클레오티드 길이의 안티-센스(anti-sense)를 보유하며, miR122 표적 부위인 miR-122T를 가지고, 치료 유전자로 HSV-tk를 보유하는 트랜스-스플라이싱 리보자임 발현 컨스트럭트에서 HSV-tk의 말단에 펩티드 절단 부위를 코딩 하는 핵산 서열인 P2A와 면역관문 억제제 발현 서열을 추가로 도입하였다.

면역관문 억제제로는 당 업계에 공지된 PD1 항체, PDL1 항체 서열을 응용하여 제작한 scFvPD1 (single chain variable fragment PD1)과 scFvPDL1을 이용하였다. 본 발명에서는 scFvPD1은 아미노산 서열에 차이가 있는 2종 항체를 사용하였으며, 각 2종 항체를 암호화하는 유전자는 서열번호 1 및 2에 나타내었다 (이하, 각각 scFvPD1(I) 및 scFvPD1(N)으로 기재함). 또한, scFvPDL1을 암호화하는 유전자 서열은 서열번호 3에 나타내었다(이하 scFvPDL1(A)로 기재함).

면역관문 억제제의 말단에는 플래그 태그(FLAG Tag) 서열을 도입하고, 컨스트럭트(construct)의 3' 말단 부위에는 3 카피(copy)의 miR-122T를 삽입하여 miR-122에 의해 리보자임의 발현이 조절될 수 있도록 하였다.

한편, 리보자임이 마우스 TERT(mTERT) mRNA의 +67번 uridine을 포함한 부위를 표적하고, 100 뉴클레오타이드 길이의 안티-센스를 보유하는 것만 제외하고 상기와 동일한 구성을 포함하는 재조합 벡터(mCRT-122T/면역관문 억제제) 또한 제작하였다.

고안된 트랜스-스플라이싱 리보자임의 발현 벡터는 mCRT-122T/ICI로 명명하고, 이의 벡터 구조를 도 2에 나타내었다.

한편, 이하 실험에서는 이전의 연구에서 제작된 mCRT-122T와 mCRT-122T/ICI의 활성을 비교하여 확인하며, mCRT-122T의 구조는 아래와 같다.

5' - CMV 프로모터 - mTERT ribozyme - HSVtk - miR-122T(3X) - 3'

한편, CRT-122T/ICI 벡터를 발현하는 아데노바이러스는 RZ-001+로 mCRT-122T/ICI 벡터를 발현하는 아데노바이러스는 mRZ-001+로 각각 명명하고, CRT-122T 벡터를 발현하는 아데노바이러스는 RZ-001로 명명하였다.

실시예 2. RZ-001+ 세포사 유도실험을 통한 RZ-001과 동등성 확인

2-1. 인간 간암세포주에서 동등성 확인

이전의 연구에서 제작된 RZ-001과 동등성을 비교하기 위하여 인간 간암세포주에서 세포사 유도 실험을 수행하였다.

구체적으로 SNU398 및 Hep3b를 96 웰 플레이트에 1x10⁴ cells/well/100ul로 분주하고, 다음날 사용한 배지를 제거한 후 FBS 2% 배지에서 RZ-001과 RZ-001+를 상이한 감염 다중도(Multiplicity of Infection, MOI)로 처리하였다(0.01~10 MOI). 바이러스 처리 24시간 후 2일 간격으로 3회 100uM GCV를 처리하였다. 마지막으로 GCV를 처리한 다음날 각 웰마다 10ul EZ-Cytox regent (DOGEN, EZ-1000)을 처리하고 37℃ 에서 배양 후 Abs 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, RZ-001 또는 RZ-001+ 처리 농도가 증가함에 따라 간암세포의 세포 사멸이 증가함을 확인하여, 면역관문 억제제 유전자 추가에 따른 hTERT targeting ribozyme에 의한 세포사 유도 활성에 문제가 없음을 알 수 있었다. 또한, 면역시스템의 부재 조건인 in vitro 세포주 수준에서 RZ-001+는 RZ-001과 hTERT targeting ribozyme에 의한 활성이 동등함을 알 수 있었다(도 3).

2-2. 인간 뇌종양 세포주에서 동등성 확인

인간 뇌종양 세포주 U87MG를 96 웰 플레이트에 1x10⁴ cells/well/100ul로 분주하고 다음날 사용한 배지를 제거한 후 FBS 2% 배지에서 RZ-001과 RZ-001+를 각각 다양한 농도로 처리하였다(0.01~10 MOI). 바이러스 처리 24시간 후 2일 간격으로 3회 100uM GCV를 처리하였다. 마지막으로 GCV를 처리한 다음날 각 웰마다 10ul EZ-Cytox regent (DOGEN, EZ-1000)을 처리하고 37℃ 에서 배양 후 Abs 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

Mock는 transgene이 포함되지 않아 transgene을 발현하지 않는 adenovirus control로 사용되었으며, adenovirus 감염에 의한 비특이적인 세포사 유도가 없음을 확인하기 위한 negative control로 사용하였다. 또한, CT는 CMV-HSVtk로써, HSVtk에 의한 GCV 인산화를 통해 발생하는 세포사 유도 확인을 위한 positive control로 사용하였다.

흡광도 측정 결과로부터 RZ-001 및 모든 RZ-001+ 처리군에서 세포사가 유도됨을 확인할 수 있었다. 상기로부터 모든 RZ-001+는 뇌종양 세포에서도 세포사 유도 활성을 나타내었으며, 특히, 0.5MOI 이상에서는 모든 RZ-001+가 RZ-001과 동일한 효과를 나타냄을 알 수 있다(도 4).

2-3. 폐암 세포주 및 흑색종 세포주에서 동등성 확인

인간 폐암 세포주인 A549 세포주와 인간 흑색종 세포주 A375P 및 A375SM를 대상으로 RZ-001+의 세포사멸 효과를 확인하고자 하였다. 각 세포주를 96 웰 플레이트에 1x10⁴ cells/well/100ul로 분주하고, 그 다음날 사용 배지를 FBS 2% 배지로 교환한 후 RZ-001+를 농도를 달리하여 처리하였다. 바이러스 처리 다음날부터 2일 간격으로 3회 100uM 농도의 GCV를 처리하고, 마지막 GCV 처리 24시간 후 각 웰에 10ul EZ-Cytox regent (DOGEN, EZ-1000)를 처리하여 37℃에서 배양하고 Abs 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, RZ-001+는 흑색종 세포와 폐암 세포의 세포 사멸을 유도하며, 1 MOI 이상에서 RZ-001+_PD1(I)를 제외한 RZ-001+가 RZ-001과 비슷한 수준의 세포사 유도 활성을 나타냄을 알 수 있었다(도 5).

실시예 3: 면역관문 억제제 발현 안정화 세포주 제작

3-1. 안정화 세포주 제작

상기 실시예 1에서 제작한 벡터의 효과를 확인하기 전에 면역관문 억제제를 발현하는 안정화 세포주(stable cell line)를 하기와 같이 제작하였다.

293A 세포를 35 ㎜ 배양 접시에 2x10⁵ 개 분주한 후, 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 각각의 면역관문 억제제 발현 벡터 1 ㎍과 Opti-MEM 100 ㎕를 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 섞고, Lipofectamine 2000 5 ㎕와 무혈청 배지 100 ㎕를 다른 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 혼합한 후 5분 동안 상온에 방치하였다. 이후 상기 두 튜브의 내용물을 혼합하고, 리포좀(liposome) 형태의 복합체를 이룰 수 있도록 20분 동안 상온에서 보관하였다. 20분 후 튜브를 10초 동안 원심 분리한 후 각각의 세포 위에 뿌려 형질주입(transfection)하고, 4시간 후 새로운 배지로 갈아주었다. 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후 1X PBS로 세포를 세척하고, 트립신(trypsin)을 처리하여 세포를 떼어낸 후 100 mm 배양 접시로 옮겨 배양하였다. 2일 내지 3일에 한 번씩 항생제인 제네티신 (geneticin, G418)을 5 ㎍/㎖의 농도로 포함하는 배지로 갈아주었다. 세포 클론들을 선별하여 각각을 키운 후, 면역관문 억제제의 발현 여부를 확인하였다.

세포 상등액으로부터 단백질을 분리하여 웨스턴 블롯팅을 수행하고, 세포에서는 RNA를 추출하여 RT-PCR로 면역관문 억제제의 발현 수준을 확인하였다.

3-2. 면역관문 억제제 발현 여부 및 친화도 확인

상기 3-1에서 제작한 안정화 세포주를 배양한 후 세포 상등액 (supernatant)으로부터 단백질을 분리하여 웨스턴 블롯팅을 수행하고, 세포에서는 RNA를 추출하여 RT-PCR로 면역관문 억제제의 발현 여부를 확인하였다.

그 결과, 293A 세포에 도입한 면역관문 억제제 모두 잘 발현되는 것을 확인할 수 있었고(도 6의 A), mRNA 수준을 확인한 결과 잘 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6의 B).

3-3. 발현된 scFvPD1의 친화도 확인

인간 PD1(hPD1) 또는 마우스 PD1(mPD1)을 발현하는 세포를 배양하여 세포 용해물을 제조하고, 이를 96-웰 플레이트에 부착시켰다. 이후 상기 2-1의 안정화 세포주 배양액에서 회수한 scFvPD1(I)과 반응시켜 항체 친화도를 ELISA 방법으로 확인하였다. 대조군으로는 293A 세포 배양액을 사용하였다. 그 결과, 세포 용해물의 농도가 증가할수록 흡광도가 증가하는 것을 확인하여 scFvPD1(I)이 항체로서 잘 기능하는 것을 알 수 있었다(도 7)

3-4. 마우스 PDL1 발현 안정화 세포주 제작

암 치료 유전자와 면역관문 억제제 동시 발현의 병용 효과를 확인하기 위하여 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 마우스 PDL1(mPDL1)을 발현하는 안정화 세포주를 제작하였다. 간략하게 설명하면, 마우스 유래 간암 세포주인 Hepa1-6 세포주에 mPDL1/pCMV6를 도입하고, 제네티신을 처리하여 3주 동안 세포 클론을 선별하였다. 선별된 세포 클론을 배양하여 mPDL1의 발현 수준을 확인한 결과, 다른 마우스 간암 세포주(Hepa1-6, Hepa1c1c7)와 비교하여 높은 수준으로 mPDL1이 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 8).

이하에서 mPDL1이 도입된 Hepa1-6 안정화 세포주는 Hepa1-6/mPDL1으로 기재한다.

실시예 4. Hepa1-6 안정화 세포주에서 RZ-001+ 발현 벡터의 효과 확인

4-1. 감염 테스트

Hepa1-6 또는 Hepa1-6/mPDL1 세포주에 상기 실시예 1에서 제작한 mRZ-001+ 를 10 MOI 농도로 처리하였다.

사용한 벡터는 다음과 같다:

mCRT-122T (CMV 프로모터+mTERT 리보자임+HSVtk+miR-122T(3X)),

mCRT-122T/scFvPD1(I) (CMV 프로모터 + mTERT 리보자임 + HSVtk + scFvPD1(I) + miR-122T(3X)),

바이러스 처리 24 시간 후에 세포에서 genomic DNA를 추출하고, E4를 표적하는 RT-PCR을 수행하여 바이러스 감염 정도를 확인하였다.

그 결과, 각 실험군에서 E4의 Ct 평균값이 유사한 수준으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 9).

4-2. 세포 생존율 확인

Hepa1-6, Hepa1-6/mPDL1 및 Hepa1c1c7 세포 각각을 96-웰에 1x10⁴ 개 분주한 후, 상기 실시예 1에서 제작한 mRZ-001+ 발현 벡터를 포함하는 아데노바이러스를 상이한 MOI로 처리하였다. 아데노바이러스 처리 24시간 뒤 GCV(ganciclovir)를 세포 배양액에 희석하여 최종 농도 100 μM로 만든 후 각 웰에 첨가하였다. 2일 간격으로 총 3번의 GCV를 처리하고, 마지막 GCV 처리 24시간 뒤에 MTS assay 시약을 넣은 후 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.

확인 결과, 대조군(EGFP)과 비교하여 리보자임 발현 벡터를 처리한 실험군에서 세포 사멸이 증가하는 것을 알 수 있었고, 특히 mCRT-122T 처리군과 비교하여 면역관문 억제제 발현 벡터 처리군(mCRT-122T/scFvPD1(I)) 에서 세포 사멸 수준이 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다(도 10).

4-3. PD1 또는 PDL1 항체의 발현 비교

Hepa1-6, Hepa1-6/mPDL1 및 Hepa1c1c7 세포에 면역관문 억제제 발현 벡터를 포함하는 아데노바이러스를 50 MOI로 처리하고, 24시간 후에 세포에서 단백질을 분리하여 면역관문 억제제의 발현 수준을 확인하였다. 단백질의 예상 크기는 신호 펩티드를 포함하여 약 28 kDa이다.

확인 결과, 3종 세포주 모두에서 면역관문 억제제가 발현되었다(도 11).

4-4. 세포사멸 효능

Hepa1-6 및 Hepa1-6/mPDL1 세포 각각을 6-웰 플레이트에 2x10⁵ 개씩 분주하고, mRZ-001+ 발현 벡터를 포함하는 아데노바이러스를 5 MOI로 처리하였다. 바이러스 처리 24시간 후에 GCV를 세포 배양액에 희석하여 최종 농도 100 μM로 만든 후 각 웰에 첨가하였다. 24시간 동안 추가로 배양한 후 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide, PI)를 각 웰에 처리하여 유세포 분석기로 세포 사멸 (apoptosis) 정도를 분석하였다.

분석 결과, Hepa1-6 및 Hepa1-6/mPDL1 세포 모두 mCRT-122T 벡터 처리군에서는 GCV 처리에 의해 초기 세포 사멸 수준이 거의 변화가 없지만 면역관문 억제제 발현 벡터 처리군에서는 GCV 처리 후 초기 세포 사멸이 현저히 증가하는 것을 알 수 있었다(도 12 및 도 13).

실시예 5. 인간 간암세포주에서 RZ-001+ 발현 벡터 도입

5-1. RZ-001+ 도입에 따른 면역관문억제제 분비 확인

인간 간암세포주인 Hep3b와 SNU398 세포를 60π culture dish에 1x10⁶ cells 분주하고, 그 다음날 사용 배지를 FBS 2% 배지로 교환한 후 RZ-001+ 발현 벡터를 포함하는 아데노바이러스를 30MOI 처리하였다. 바이러스 처리 후 48 시간 경과 시 배지를 15ml 튜브에 담아 1,500 rpm으로 5 분 동안 원심분리하여 centrifuge 하여 세포 잔해를 제거하였다. 각각의 샘플을 10k centricon에 옮겨 담아 3,000 rpm에서 15-30 분 동안 농축하여 샘플의 총 볼륨이 500ul가 되도록 하였다. 농축된 샘플을 5x sample buffer를 사용하여 샘플을 제작하고 100℃에서 5min 동안 denaturation을 유도하였다. 준비된 샘플을 12% SDS-PAGE에 40ul씩 로딩하였다. 각 세포는 PBS로 세척하여 수확하였고 RIPA buffer를 넣어 4 ℃에서 20 분 동안 처리후 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 상층액을 취하고 상기 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 BCA 정량법에 의해 정량하였다. 정량한 단백질은 30ug/well 이 되도록 샘플을 제작하고 위와 동일하게 SDS-PAGE 로딩하였다. PAGE 분리가 끝나면 PVDF에 옮겨 5% skim milk in PBS-T에서 30분 동안 blocking을 진행하고, anti-FLAG를 1:1,000으로 희석하여 4℃, O/N 반응시켰다. 그 다음날 PBS-T로 세척 후 2차 항체 anti-mouse/HRP를 1:2,000으로 희석하여 1시간 동안 반응 후 ECL solution으로 발현량을 검출하였다.

그 결과, RZ-001+를 처리한 간암 세포주에서 scFv가 분비되는 것을 확인하였다. 특히, RZ-001+_PDL1(At)에서 가장 높은 scFv 분비 수준을 확인할 수 있었다. 상기로부터 RZ-001+ 발현 벡터가 도입된 세포가 scFv를 활발히 분비하며, RZ-001+가 암세포에 적용될 수 있음을 알 수 있다(도 14).

5-2. RZ-001+ 도입에 따른 트랜스 스플라이싱 반응 확인

실시예 5-1에서 아데노바이러스를 처리한 간암세포주에서 RZ-001+가 타겟으로 하는 TERT mRNA을 효과적으로 트랜스 스플라이싱하는지 확인하고자 하였다. 실시예 5-1에서 30 MOI 바이러스를 처리한 세포를 바이러스 처리 48시간 후 TRIzol을 사용하여 RNA를 준비하여 정량하였다. RT kit(Genet bio #SR3000)를 사용하여 3 ug RNA와 1uL RT primer를 혼합하여 반응시켰다 (50℃ 60min, 70℃ 10min). 하기 표 1의 프라이머 프리믹스(바이오니아, #k-2611)을 사용하여 PCR을 진행하였고, PCR은 95℃ 30 sec, 59 ℃ 30 sec, 72 ℃ 30 sec 조건으로 40 cycle을 수행하였다. 이어서 증폭산물을 2% agarose gel에 전기영동하여 타겟 사이즈의 밴드를 확인하였다. 상기 타겟 사이즈 밴드에서 gel elution을 통해 TA vector를 사용하여 클로닝을 진행하고 염기서열 분석을 수행하였다.

RT primer(HSV-tk)	5’ - agttagcctcccccatctc - 3'
hTERT	5′-GGAATTCGCAGCGCTGCGTCCTGCT-3′
HSVtk	5′-GTGAGGACCGTCTATATAAACCCGCAGTAG-3′

그 결과, RZ-001+를 처리한 간암 세포주 샘플에서 트랜스-스플라이싱이 일어났을 때 나올 수 있는 product size의 밴드를 확인할 수 있었으며, 상기 밴드의 product 염기서열은 표적 유전자의 타겟 부위에서 트랜스 스플라이싱이 발생한 것으로 확인되었다. 상기로부터 RZ-001+는 도입된 간암 세포에서 표적 유전자와 표적 부위에 정확히반응하여 트랜스-스플라이싱 반응을 유도할 수 있음을 알 수 있다(도 15).

5-3. 분비된 면역관문억제제의 bioactivity 확인

이어서, RZ-001+가 도입된 간암 세포주가 분비하는 면역관문억제제가 효과적으로 면역관문 단백질과 결합하여 그 시그널을 차단할 수 있는지 확인하고자 PD1/PDL1 blockade bioassay(Promega, #J1250)를 수행하였다. PD1/PDL1 blockade bioassay는 PD-1 또는 PDL-1 면역항암제가 없는 조건에서 PD-1 effector cell의 표면에 있는 PD-1과 APC 세포 또는 암 세포에 존재하는 PDL1의 결합을 하면 PD1/PDL1 상호작용이 TCR 매개 발광을 억제하여 루시퍼라제 시그널이 검출되지 않지만, 면역항암제가 있는 조건에서는 면역항암제의 결합에 의해 PDL1과 PD1의 결합이 방해되어 TCR이 활성화되고 NFAT signal의 활성화를 통해 루시퍼라제 유전자 발현을 유도하여 루시퍼라제 시그널이 증가하는 시스템을 이용하는 것이다. 실험은 제조사의 권장 프로토콜에 따라 수행하였다. 구체적으로 white plate에 PDL1 aAPC/CHO-K1 세포를 풀어 준비하였다. 다음날 세포의 배지를 제거하고 실시예 4-1의 농축 샘플 40ul을 플레이트에 로딩하고, 농축 샘플을 로딩한 플레이트에 PD-1 effector cell을 풀고 37℃에서 6시간 동안 반응을 유도하였다. 이어서, bio-Glo reagent를 첨가하여 상온에서 5-10분 동안 배양한 후 luminometer로 형광을 측정하였다.

RZ-001+를 처리한 간암 세포주 샘플의 배양액을 이용하여 분비된 면역항암제의 활성을 측정한 결과, RZ-001+을 처리한 모든 세포에서 bioactivity의 증가를 확인할 수 있었으며, 상기로부터 RZ-001+ 바이러스 감염에 의해 세포 내에서 면역관문억제제가 생성되어 분비됨을 알 수 있다. 특히, 실시예 5-1의 결과와 대응되게 RZ-001+_At의 경우 bioactivity가 가장 많이 증가하였는바, 가장 많은 면역항암제가 생성 및 분비가 되었고, 분비된 면역항암제가 활성이 뛰어남을 알 수 있다(도 16).

실시예 6. 인간 뇌종양 세포주에서 RZ-001+ 발현 벡터 도입

6-1. RZ-001+ 가 도입된 세포주에서의 PD-L1 발현 확인

인간 간암세포주인 SNU398과 인간 뇌종양세포주 U87MG를 12 well plate에 5x10⁴ cells/well/1mL로 분주하고 2일간 배양한다. RIPA buffer를 사용하여 세포를 lysis 시켜 total protein을 추출한다. 추출한 total protein을 BCA 정량법으로 정량을 진행하여 모든 샘플이 동일한 단백질양이 되도록 준비하고, 준비된 단백질 샘플을 SDS-PAGE에 로딩 후 PVDF에 옮겨 5% skim milk in TBS-T에서 항원 항체반응을 진행하여 목적하는 단백질의 발현량을 측정하였다.

그 결과, 간암 세포주인 SNU398과 뇌종양 세포주인 U87MG 모두에서 PD-L1 단백질의 발현을 확인함으로써, 면역관문억제제를 발현하는 RZ-001+_PDL1의 간암 및 뇌암으로의 적용에 있어 유효성을 제시할 수 있다(도 17).

6-2. RZ-001+ 도입에 따른 면역관문억제제 분비 확인

상기 실시예 5-1과 동일하게 RZ-001+ 발현 벡터를 포함하는 아데노바이러스에 감염된 뇌종양 세포주에서 scFv의 분비를 확인하였다. 바이러스 처리 농도만 10 MOI 및 20 MOI로 실험 방법은 상기 실시예 5-1과 동일하게 수행하였다.

그 결과, Glioblastoma 세포주인 U87MG에서도 RZ-001+ 발현벡터 도입에 따라 세포에서scFv의 분비를 확인할 수 있었으며, 특히 RZ-001+_At 발현 벡터를 도입한 세포에서 가장 많은 scFv의 분비를 확인할 수 있었다(도 18).

6-3. 분비된 면역관문억제제의 bioactivity 확인

이어서, RZ-001+_PDL1(At) 발현 벡터를 포함하는 바이러스를 처리한 세포의 상등액을 분리하여 실시예 5-3과 동일하게 PD1/PDL1 blockade bioassay(Promega, #J1250)를 수행하였다. 대조군으로는 상용화된 atezolizumab을 이용하였다.

그 결과, 높은 MOI로 바이러스를 처리한 세포로부터 획득한 농축 샘플을 처리할수록 luciferase 활성이 증가됨을 확인하였다(도 19).

실시예 7. in vivo 에서 RZ-001+의 항암 효과 확인

7-1. PBMC-인간화 간암모델에서 RZ-001+의 효과 확인

마우스 이종이식 피하 모델(mouse xenograft subcutaneous model: ,6 주령 수컷 NOG) mouse에 human PBMC 5 x 10⁶ cells/head를 주입하여 PBMC 인간화 마우스(PBMC-humice)를 제작하고, 7~10일 동안 마우스의 체중 및 상태를 확인한 후 SNU-398 세포 5 x 10⁶ cells /50 μl를 subcutaneous injection하고 2주간 사육하여 간암 종양 모델을 구축하였다. 이어서, 종양의 성장 및 무게를 측정하고 군분리를 진행하여 각 그룹 별 약물 투여를 진행하였다. 추가로, 약물의 간 독성을 확인하기 위하여 AST/ALT 수준을 측정하였다.

각 그룹은 대조군, Atezolizumab(At) 투여군, RZ-001 투여군, RZ-001+_At 투여군, 및 RZ-001 및 Atezolizumab 병용 투여군으로 구분하였으며, 약물의 투여는 1 x 10⁹ VP/head, 48시간 간격으로 2회 종양 내 직접투여(intratumoral injection)하였으며, Atezolizumab 병용 투여는 5 mg/kg 용량으로 바이러스 투여 2일 후부터 2일 간격으로 3회, 정맥투여(intravenous injection) 하였다.

그 결과, RZ-001, Atezolizumab 각각 단독투여 대비, RZ-001+_At로 투여하였을 경우 종양 크기나 무게가 감소함을 확인하였고 RZ-001 및 At 병용투여와 유사하게 종양이 많이 감소함을 확인하였다. 한편, 간 독성 측정 결과 RZ-001+_At 투여군은 Atzolizumab 단독 또는 병용 투여군에 비해 AST/ALT 수준이 감소하였으며, Ad-Mock 대비해서 비슷한 수준을 나타내었는바, 간 독성이 현저히 억제됨을 알 수 있다(도 20).

7-2. Syngeneic Orthotopic 뇌종양 모델에서 RZ-001+의 효과 확인

면역활성을 가진 5주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 마취하고 정위적 도구를 이용하여 두피를 1cm 정중절개한 뒤 전정(bregma)를 기준으로 anterior 1mm, lateral 2.3 mm, 3 mm 깊이에 마우스 유래 뇌암 세포주(GL261) 1 x 10⁵ cells/head을 이식하여 Orthotopic 뇌종양 모델을 제작하였다. 7일 후 종양의 성장을 측정하고 군분리를 진행하여 각 그룹 별 약물 투여를 진행하였다.

약물의 투여는 아래와 같은 용량 및 용법으로 진행되었다.

mRZ-001과 mRZ-001+는 3ⅹ10⁹ VP/5uL를 1회 종양 내 직접 투여한다.

GCV는 100 ul 액량으로 50mg/kg 투여하고, 바이러스 투여 종료 시 다음날부터 1일 1회, 총 10회 투여한다.

실험 동물군은 mRZ-001 투여군 및 mRZ-001+ 투여군으로 구분하였으며, 대조군으로 PBS 투여군으로 구분하였다.

종양 크기를 측정하기 위하여 약물 투여 다음날을 포함하여 3일 주기로 MRI 촬영을 수행하였으며, 종양 이식 위치를 기준으로 5장의 slice를 선택하고 ImageJ 시스템을 이용하여 시간에 따른 종양의 관심영역(region of interest:ROI) 분석을 수행하였다(도 21). 구체적으로, MRI 영상은 Biospec 47/40 USR (Bruker, Ettlingen, Germany) horizontal bore magnet을 사용하였다. 촬영 중 동물은 마취된 상태로 영상 획득 중 호흡수, 심박수 및 체온은 animal monitoring-gating system 을 이용하여 관찰하였고 체온 유지를 위해 warm bed를 사용하였다. 종양성장 및 성장억제 확인을 위한 영상은 15장의 연속된 axial slice를 RARE sequence를 사용하여 촬영되었고 관련 조건은 아래와 같다.

repetition time (TR) = 2200 ms

echo time (TE) = 40 ms

slice thickness = 0.75 mm

matrix = 192 x 192

flip angle (FA) = 90

field of view (FOV) = 18 x 18 mm²

average = 4

echo train length (ETL) = 8

종양의 크기는 mRZ-001를 기준으로 다음날을 Day 1으로 설정하고 GCV 처리와 함께 Day10 까지 총 10회 처리에 따른 결과이고, PBS 투여군과 비교하여 종양의 크기 감소 정도를 확인하였다. 그 결과, 바이러스 감염에 따라 종양의 크기가 감소하였으며, mRZ-001+의 투여는 mRZ-001 투여보다 종양의 크기가 보다 큰 폭으로 감소하였다(도 22).

한편, mRZ-001+ 투여군은 대조군보다 낮은 AST, ALT 수준을 나타내었는바, 처리된 시료의생체 내 독성이 현저히 낮은 상태임을 알 수 있었다(도 23).

7-3. Xenograft Orthotopic 뇌종양 모델에서 RZ-001+의 효과 확인

상기 실시예 7-3에 이어서, 인간 유래 뇌종양 세포가 이식된 동물 모델에서 RZ-001+의 항암 효과를 확인하고자 하였다. 이에, 5주령 수컷 BALB/C nude 마우스에 Luciferase를 안정적으로 발현하는 인간 유래 뇌종양 세포 U87MG-Luci를 이용하여 상기 실시예 7-3과 동일한 방법으로 마우스에 이식하여 Xenograft Orthotopic 마우스 뇌종양 모델을 제작하였다. 7일 후 IVIS 촬영을 통해 종양의 성장을 측정하고 군분리를 진행하여 각 그룹 별 약물 투여를 진행하였다. (도 24).

약물의 투여는 아래와 같은 용량 및 용법으로 진행되었다.

RZ-001과 RZ-001+_AT는 1ⅹ10¹⁰ VP/Head를 1회 종양 내 직접 투여한다.

GCV는 바이러스 투여 종료 시 다음날부터 1일 1회, 총 10회 50mg/kg 투여한다.

바이러스 투여 후 3일 간격으로 IVIS 촬영을 수행하여 luciferase를 발현하는 종양 세포의 성장을 추적하였으며, 바이러스 투여 19일 후에 마지막으로 IVIS 촬영 후 다음날 (Day 20)에 마우스를 희생하고 부검을 실시하였다. (도 25). 각 약물의 투여군의 마우스는 실험기간 동안 꾸준한 체중을 유지하였는바, RZ-001+의 독성이 없거나 매우 낮은 것으로 볼 수 있었다(도 26). 한편, 항암 효과에 있어서 RZ-001과 RZ-001+ 모두 우수하였으며, 특히 RZ-001+_At의 항암능이 RZ-001보다 우수함을 확인할 수 있었는바, 뇌종양에 있어서도 RZ-001+가 우수한 항암효과가 있음을 알 수 있다(도 27).

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

<110> RZNOMICS INC. <120> TUMOR-TARGETING TRANS-SPLICING RIBOZYME EXPRESSING IMMUNE CHECKPOINT INHIBITOR AND USE THEREOF <130> APC-2021-0824 <150> KR 10-2021-0010416 <151> 2021-01-25 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene encoding scFv PD1(I) <400> 1 caggtacaac ttgttcagtc cggagctgaa gtgaaaaagc cgggcgcgtc tgttaaggta 60 agctgcaagg cttcaggcta tactttcacg gcgcagtaca tgcattgggt cagacaagct 120 ccaggccaag gtcttgaatg gatggggatc atcaacccga gtgggggtga aacaggctat 180 gctcaaaagt tccagggtcg agtcaccatg actcgggata cctccacgtc taccgtttac 240 atggagctga gcagtttgag gagcgaagat actgccgtat actattgtgc caaggaaggt 300 gttgcggacg gttatgggct cgttgatgta tgggggcaag gcacgatggt taccgtctca 360 tctggtggag gaggttctgg gggtggaggc tcaggaggag gggggtcagg tggcggagga 420 tccgaaatcg tgttgaccca gagtcctgca acactgagtc tgtccccagg ggagagagcc 480 accttgtcct gtagagcgag ccagtctgta agctcttatc tggcttggta tcagcaaaaa 540 cctgggcagg cgccgcgcct cctcatctat gacgcgagca agagggcaac agggatacca 600 gcgagattct ctgggtcagg atcagggaca gacttcacac tcacgatcag ctctttggaa 660 ccagaagatt ttgcagtcta ctattgtgat caacgaaaca actggcctct cacgttcgga 720 ggagggacta aagtagaaat taaa 744 <210> 2 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene encoding scFv PD1(N) <400> 2 caggtccaac ttgtcgagag cggcggtgga gtggtacagc ctgggcgatc cttgcggctt 60 gattgcaagg cgagcggaat aaccttcagc aacagtggga tgcactgggt aagacaagcg 120 ccaggcaagg ggctcgagtg ggtcgctgtc atctggtatg acggaagtaa acgatattac 180 gccgatagtg taaagggaag gtttacgatc agtagggata actctaaaaa tacgctcttt 240 cttcaaatga acagtcttcg agcagaagat acagcggtgt attattgtgc tactaatgac 300 gattattggg gccagggtac tctcgttacg gtaagctctg gtggaggagg aagtggtggc 360 ggaggtagtg gaggtggcgg ctccgggggt ggaggatccg agatagtact cacacaaagt 420 cctgctacgc tttcactctc ccctggagag agagctactc tctcatgccg agcctcccag 480 agtgtgagtt catatttggc gtggtaccag cagaagcccg gccaagcccc ccgattgctc 540 atatatgacg ccagtaatcg cgcgactggt atacctgccc ggtttagcgg aagtggatcc 600 gggacggact ttaccctgac aatttcttca ctggagcctg aagacttcgc cgtatattat 660 tgtcaacaat cctccaattg gccaagaact tttggccaag gaacgaaagt tgagataaaa 720 720 <210> 3 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene encoding scFv PDL1(A) <400> 3 gaagttcaac tggtggagtc tggagggggt ttggtgcagc caggcgggag tttgaggctc 60 agctgcgccg cctctggatt caccttctcc gatagctgga tccattgggt caggcaagcg 120 cctggtaaag ggttggagtg ggtcgcatgg atatctcctt atggagggtc tacatattat 180 gccgactctg tcaagggaag attcacgata tccgcagaca caagtaagaa tacagcatac 240 cttcaaatga actccctgcg cgctgaagac acggcggttt attattgcgc taggcggcac 300 tggccagggg gttttgacta ttggggtcaa ggtaccttgg tcacggtttc atccggcggc 360 ggtggtagcg gtggtggagg tagcgggggt ggtggaagtg ggggtggagg ctcagacatc 420 caaatgacac aaagcccatc ctccctgagc gctagtgtgg gggaccgggt cacgataacc 480 tgccgggcta gccaagatgt gagcacagca gtcgcctggt atcagcagaa gcccgggaag 540 gccccaaaac tcctcatata ctctgcttct tttctctatt ccggtgtgcc ctctcgattc 600 tcaggcagtg ggtcaggaac cgacttcacg ctgaccatct caagtttgca gccggaagac 660 ttcgcaacgt attattgcca gcaatacctc taccatcctg ccactttcgg tcaggggacg 720 aaagtagaga ttaaa 735 <210> 4 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding hTERT targeting ribozyme <400> 4 ggcaggaaaa gttatcaggc atgcacctgg tagctagtct ttaaaccaat agattgcatc 60 ggtttaaaag gcaagaccgt caaattgcgg gaaaggggtc aacagccgtt cagtaccaag 120 tctcagggga aactttgaga tggccttgca aagggtatgg taataagctg acggacatgg 180 tcctaaccac gcagccaagt cctaagtcaa cagatcttct gttgatatgg atgcagttca 240 cagactaaat gtcggtcggg gaagatgtat tcttctcata agatatagtc ggacctctcc 300 ttaatgggag ctagcggatg aagtgatgca acactggagc cgctgggaac taatttgtat 360 gcgaaagtat attgattagt tttggagtac tcg 393 <210> 5 <211> 1128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding HSVkt <400> 5 atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60 ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120 cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180 gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240 gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300 tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360 atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420 cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480 ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540 agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600 acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660 cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720 ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780 cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840 cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900 aacggcgacc tgtacaacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960 cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020 ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca cccccggctc cataccgacg 1080 atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaac 1128 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding miR-122T <400> 6 caaacaccat tgtcacactc ca 22 <210> 7 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding p2a <400> 7 gccacaaact tctctctgct aaagcaagca ggtgatgttg aagaaaaccc cgggcct 57 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer(HSV-tk) of primer premix <400> 8 agttagcctc ccccatctc 19 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTERT primer of primer premix <400> 9 ggaattcgca gcgctgcgtc ctgct 25 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSVkt primer of primer premix <400> 10 gtgaggaccg tctatataaa cccgcagtag 30

Claims

암 특이적 유전자를 표적으로 하는 트랜스 스플라이싱 리보자임으로서,
상기 리보자임은 3' 엑손에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하며,
상기 목적 유전자는 면역관문 억제제 유전자를 포함하는 2 이상의 암 치료용 유전자인 것을 특징으로 하는, 트랜스 스플라이싱 리보자임.
제1항에 있어서,
상기 트랜스 스플라이싱 리보자임은 5' - trans-splicing ribozyme - 암 치료용 유전자 - 면역관문 억제제 유전자 - 3'의 구조를 가지며,
상기 암 치료용 유전자는 면역관문 억제제 유전자와 구별되는 것인, 트랜스 스플라이싱 리보자임.
제1항에 있어서,
상기 암특이적 유전자는 TERT(Telomerase Reverse Transcriptase) mRNA, AFP(alphafetoprotein) mRNA, CEA(carcinoembryonic antigen) mRNA, PSA(Prostate-specific antigen) mRNA, CKAP2(Cytoskeleton-associated protein 2) mRNA 및 돌연변이 RAS(Rat sarcoma) mRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 인, 트랜스 스플라이싱 리보자임.
제1항에 있어서,
상기 치료용 유전자는 약제감수성 유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 사이토카인 유전자 및 항신생 혈관 생성 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 유전자인, 트랜스 스플라이싱 리보자임.
제1항에 있어서,
상기 약제감수성 유전자는 HSVtk(Herpes Simplex Virus thymidine kinase)인 것인, 트랜스 스플라이싱 리보자임.
제1항에 있어서,
상기 면역관문 억제제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR, TIGIT, CD47, VISTA 또는 A2aR의 억제제인, 트랜스 스플라이싱 리보자임.
제1항에 있어서,
상기 트랜스 스플라이싱 리보자임은 3' 말단 위치에 마이크로 RNA-122a(miR-122a)의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 1 카피(copy) 이상 추가로 포함하는 것인, 트랜스 스플라이싱 리보자임.
제1항에 있어서,
상기 2 이상의 암 치료용 유전자는 자가 절단 펩타이드(self-cleaving peptide)를 암호화하는 유전자로 연결된 것인, 트랜스 스플라이싱 리보자임.
제8항에 있어서,
상기 자가 절단 펩타이드는 P2A인 것인, 트랜스 스플라이싱 리보자임.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 트랜스 스플라이싱 리보자임을 포함하는 비바이러스성 유전자 전달 시스템.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 트랜스 스플라이싱 리보자임을 발현할 수 있는 발현 벡터.
제11항에 있어서,
상기 발현 벡터는 상기 리보자임 유전자와 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 것인, 발현 벡터.
제11항 또는 제12항의 발현 벡터를 발현하는 유전자 전달 시스템.
제11항 또는 제12항의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 트랜스 스플라이싱 리보자임; 제10항의 비바이러스성 유전자 전달 시스템; 제11항 또는 제12항의 발현 벡터; 및 제13항의 유전자 전달 시스템;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
제15항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 경구 또는 주사제 형태로 정맥 내, 동맥 내, 암조직 내, 또는 피하의 경로로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
제15항에 있어서,
상기 암은 간암, 교모세포종, 담도암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 골암, 유방암, 대장암, 위암, 전립선암, 백혈병, 자궁암, 난소암, 림프종, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 암인, 약학적 조성물.
제15항에 있어서,
상기 암은 면역관문억제제 내성 암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제15항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법.