KR20060005163A - ＶＥＧＦ-Ａ 안티센스 ｃＤＮＡ와 아데노-연관 바이러스를함유하는 대장암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 VEGF-A 안티센스 cDNA(antisense cDNA)와 아데노-연관 바이러스를 함유하는 유전자 치료제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, VEGF-A 안티센스 cDNA와 아데노-연관 바이러스를 함유하는 대장암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 유전자 치료제는 종양에 의한 혈관신생의 유발에 있어서 주요한 역할을 담당하는 것으로 알려진 VEGF의 기능을 억제하여, 종양의 성장 및 증식에 필수적인 혈관신생을 억제하므로 암의 유전적 치료에 유용하다.

대장암, 폐암, 혈관신생, 유전자 치료제, VEGF, 아데노-연관 바이러스

Description

ＶＥＧＦ-Ａ 안티센스 ｃＤＮＡ와 아데노-연관 바이러스를 함유하는 대장암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제{Colon Cancer and/or Lung Cancer-specific Gene Therapeutic Agent Comprising VEGF-A Antisense cDNA and Adeno-associated Virus}

도 1은 본 발명에 따른 pAAV-AShVEGF-A 벡터를 나타낸 것이다.

도 2는 pAAV-AShVEGF-A 벡터를 KpnI 및 XhoI 제한효소로 처리하여 전기영동으로 확인한 것을 나타낸 것이다. M은 DNA 마커(marker)이고, 레인 1 및 2는 클로닝에 사용된 벡터를 KpnI 및 XhoI 제한효소로 처리한 것이고, 레인 3 내지 8은 pAAV-AShVEGF-A 벡터를 KpnI 및 XhoI 제한효소로 처리한 것이다. 박스로 표시된 부분에서 위쪽에 나타난 밴드는 벡터를, 아래쪽에 나타난 밴드는 벡터에 삽입된 VEGF-A 안티센스 cDNA를 나타낸다.

도 3은 본 발명에 따른 유전자 치료제(rAAV-AShVEGF-A)로 암 세포주를 처리한 후, Biotrak ELISA 키트로 VEGF 단백질을 정량한 결과를 나타낸 것이다.

발명의 분야

본 발명은 VEGF-A 안티센스 cDNA(antisense cDNA)와 아데노-연관 바이러스를 함유하는 유전자 치료제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, VEGF-A 안티센스 cDNA와 아데노-연관 바이러스를 함유하는 대장암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제에 관한 것이다.

발명의 배경

암은 세계적으로 감염성 질환 및 심혈관계 질환과 더불어 주요한 사망원인 중 하나로 손꼽히고 있으며, 이로 인한 사망률은 해마다 증가하고 있다. 세계보건기구(WHO)의 세계 보건 보고서(World Health Report)에 따르면, 2001년 총 사망자의 12.6%인 7,115,000명이 암으로 사망하였으며, 식습관, 환경의 변화 및 수명연장으로 인하여 향후 25년 내에 암 발생인구가 매년 약 3천만 명으로 늘어나고, 이중 2천만 명의 인구가 암으로 사망할 것으로 예상하고 있다.

인류가 극복하지 못한 많은 질환 중에서도 특히 암은 우리에게 가장 위협적인 질환인 것은 의심의 여지가 없다. 이와 같은 형상은 우리나라뿐만 아니라, 해외 대부분의 나라에서 공통적으로 나타나고 있다. 이렇듯 사회적 피해가 큰 암을 치료하는 것은 인간의 수명연장과 더불어 인적·물적 피해를 줄이기 위한 의미를 크게 갖고 있어서 최우선적으로 극복해야 할 질병으로 인식되고 있다.

이중에서 폐암 및 대장암은 사망원인인 암중에서 수년간 각각 3, 4위를 차지 하고 있으며, 사망자 수 또한 해마다 증가하고 있다. 우리나라에서 암에 의한 사망이 주로 간암(암에 의한 사망원인 3위, 2002년 통계), 위암(암에 의한 사망원인 2위, 2002년 통계) 및 폐암(암에 의한 사망원인 1위, 2002년 통계)으로 이루어져서 상기 세 가지의 암에 대한 치료에 대한 연구는 활발히 진행되어 왔지만, 그 외의 암에 대한 연구는 상대적으로 미흡하였다. 그러나, 대장암(암에 의한 사망원인 4위, 2002년 통계)을 비롯한 다른 여러 가지의 암들에 의한 사망이 증가하면서 상기 암에 대한 연구도 적극적으로 진행되고 있는 상황이며, 그 결과들도 발표되고 있다.

현재 암치료에 사용되는 방법은 크게 외과적 수술, 방사선 치료 및 약물치료가 있는데, 이들 방법은 암치료를 위해 독자적으로 사용되거나 두 가지 이상의 방법이 병용된다. 일반적으로, 외과적 수술은 다양한 암의 단계에서 적용될 수 있다. 초기단계의 암들은 대체적으로 외과적 수술로 치료가 가능하지만, 암이 많이 진전되었거나 전이가 일어난 경우에는 외과적 수술만으로 어렵기 때문에 방사선 치료 또는 약물치료를 같이 사용한다. 방사선 치료는 외부에서 방사선을 조사하거나, 체내로 투여한 방사성 물질에서부터 나온 X-선 또는 γ-선을 암세포에 조사하여 암을 치료한다.

약물치료는 항암제를 경구나 주사로 투여하여 암세포의 증식에 필요한 DNA나 관련 효소를 파괴하거나 억제하는 방법이다. 다른 방법에 비하여, 약물치료가 가지는 장점은 몸의 어떤 부위에 생긴 암이라도 약물이 도달할 수 있고, 전이된 암을 치료한다는 것이다. 현재 약물치료는 전이성 암 치료의 표준요법으로 사용되고 있 다. 물론 전이된 암을 약물요법으로 완치할 수 있는 것은 아니지만, 증상을 완화시킴으로써 수명을 연장시키는 중요한 역할을 한다. 하지만, 이러한 약물요법의 주류를 이루고 있는 화학요법제는 부작용, 항암제 내성 등의 문제점을 가지고 있다.

상기 문제점 해결을 위하여, 최근 10년간 생명과학분야의 눈부신 발전에 힘입어 생물요법제가 급성장하고 있다. 생물요법제는 신체 본연의 면역기능을 회복시키거나 증가시킴으로써 암세포의 활동력을 약화시켜 암의 진행을 막는 것을 치료적 근거로 삼고 있다. 신체의 면역체계가 제 기능을 발휘할 때는 암세포들을 효과적으로 사멸시킬 수 있으나, 그렇지 않은 경우에는 암세포가 쉽게 증식하거나, 또는 다른 병원균들이 쉽게 공격을 가할 수 있게 된다. 외과적 수술요법, 방사선요법, 화학요법 등은 일시적으로 정상세포 군에도 큰 손상을 일으켜 면역기능을 저하시킬 수 있어서, 생물요법제의 상기 단점을 보완하기 위해 다른 치료법들과 같이 사용되기도 한다.

현재 관심을 받고 있는 생물요법제로는 안티센스 항암제 및 혈관생성 억제제를 들 수 있다. 안티센스 항암제는 암세포의 특이적 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 DNA단편을 사용하여, mRNA의 프로세싱(processing) 또는 단백질의 발현을 저해하는 방법으로, 암세포의 사멸을 유도할 수 있다. 인간 게놈 프로젝트의 결과로 인하여 30,000여개의 유전자 서열이 판독되고, 100,000여개의 mRNA 서열을 알 수 있게 되었다. 이로써 암세포와 연관된 mRNA 후보군에 대한 정보가 대량 확보되면서, 신호전달 체계와 관련된 유전자, 세포사멸 프로그램(apoptosis) 및 세포 증식에 관련된 유전자들에 대하여 안티센스 항암제를 스크리닝하여 임상 실험중에 있 다.

종양의 성장은 이에 필요한 산소 및 영양분을 공급해주는 새로운 혈관의 생성(angiogenesis)이 있어야 가능하다. 일반적으로 암세포가 증식함에 따라 종양 내부는 저산소 상태가 되고, 조직이 괴사하게 된다. 또한, 종양 자체의 압력에 의해 혈관이 파괴됨으로써 저산소 상태는 더욱 악화된다. 이러한 저산소 상태를 극복하기 위하여 종양은 혈관신생과 관련된 인자들(VEGF, bFGF, IL-8, PDGF, PD-EGF, 등)을 발현하게 되어 혈관신생을 촉진하게 된다. 즉, 혈관신생은 종양의 성장에 있어서 필수적인 과정인 것이다.

혈관신생 억제제는 이러한 종양의 혈관신생을 방해하여 종양의 성장을 저해함으로써, 암을 치료하는 것을 목적으로 한다. 직접적인 혈관신생 억제제는 혈관 내피 세포의 증식 및 이동을 방해하거나, 혈관신생 유발인자에 대한 반응을 억제함으로써 신혈관 생성을 방해한다. 직접적인 혈관신생 억제제는 후천내성(acquired drug resistance)을 보다 적게 유발한다는 장점을 지니고 있다. 간접적인 혈관신생 억제제는 신혈관 생성을 활성화시키는 종양내의 단백질 발현을 억제하거나, 상기 종양 단백질과 혈관 내피 세포표면의 수용체사이의 결합을 차단함으로써 혈관신생을 억제한다.

상기 기술한 바와 같이, 치료분야의 변화양상을 살펴보면, 인공적인 화학물질에서 천연 생체내 물질을 이용하는 방향으로 변화하고 있음을 알 수 있다. 특히, 다양한 분야의 유전체 연구가 진행되면서 각종 질병의 병인으로 작용하는 유전자들이 발견되고 있다. 이러한 연구결과들을 임상적인 치료나 예방효과와 연결짓기 위 하여, 기능이 소실되거나 변형된 유전자를 교정하는 유전자를 체내에 도입하여 기능을 정상화시키거나 치료기능을 활성화시켜주는 유전자 전달기술에 대한 연구, 즉 유전자 치료(gene therapy) 분야에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

유전자 치료법은 유전자의 전달 및 발현에 의하여 질병을 치료하는 방법으로서, 약물치료와는 달리 장애가 있는 특정 유전자를 목표로 유전적 결함을 교정하는 치료법이다. 유전자 치료의 궁극적인 목표는 살아있는 세포를 유전적으로 변형하여 유익한 치료효과를 얻는 것이다. 상기 치료법은 질환부위로의 유전인자의 정확한 전달, 생체내에서의 완전한 분해, 독성 및 면역 항원성 부재(不在) 및 유전인자의 장기간 안정적인 발현이라는 장점을 지니고 있어서, 질병치료에 있어 더할 나위없는 최선의 치료법으로 각광받고 있다.

유전자 치료의 주 연구분야는 특정 질병에 치료효과를 나타내는 유전자를 도입하거나, 항암제 등에 저항성을 나타내도록 정상세포의 저항기능을 증강시키거나, 각종 유전성 질환자에 있어서 변형되거나 소실된 유전자를 대체하는 분야로 요약할 수 있다.

유전자 치료법은 크게 생체내(in vivo)와 생체외(ex vivo) 두 가지로 구분된다. in vivo 유전자 치료법은 치료 유전자를 직접 체내에 주입하는 것이고, ex vivo 유전자 치료법은 일차적으로 목적 세포(target cell)를 시험관내에서 배양하고 이들 세포에 유전자를 도입시킨 다음, 유전자 변형된 세포를 다시 체내로 주입하는 것이다. 현재 유전자 치료분야에서는 in vivo 유전자 치료법과 ex vivo 유전자 치료법을 병행하여 사용하고 있다.

유전자 전달기술은 크게 바이러스를 수송체로 사용하는 방법(viral vector-based transfer method), 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비바이러스성 방법(non-viral delivery method) 및 세포막에 일시적인 전기자극을 가하여 유전자를 도입하는 전기 투과법(electroporation) 등의 물리적 방법으로 구분할 수 있다.

유전자 전달기술 중에서, 바이러스 수송체를 사용하는 방법은 치료유전자에 의해 대치된 유전자를 지니는 일부 또는 전체의 복제능력이 결손된 벡터로서 유전인자의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있기 때문에 유전자치료를 위해 선호하는 방법이다. 바이러스 수송체 또는 바이러스 벡터로 사용되는 바이러스로는 RNA 바이러스 벡터(레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등)와 DNA 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 등)가 있으며, 이 외에도 단순포진 바이러스 벡터(herpes simplex viral vector), 알파 바이러스 벡터(alpha viral vector) 등에 대한 연구도 진행되고 있다. 이중에서도 특히 연구가 활발히 진행되고 있는 것은 레트로바이러스와 아데노바이러스이다.

숙주세포의 게놈에 통합기능이 있는 레트로바이러스(Retrovirus)의 특징은 인체에 해가 없지만 통합시 정상세포의 기능을 억제할 수 있고, 다양한 세포에 감염되고, 증식이 쉬우며, 1~7 kb 정도의 외부 유전자를 수용할 수 있고, 복제결핍 바이러스를 생성할 수 있는 능력이 있다는 것이다. 그러나, 유사분열 이후의 세포에 감염되기 힘들며, in vivo 상태에서 유전자 전달이 어렵고, 항시 체세포 조직은 in vitro에서 증식되어야만 한다는 단점도 지니고 있다. 레트로바이러스는 원형암 유전자(proto-oncogene)에 통합될 수 있어 돌연변이의 위험성이 있고 세포를 괴사시킬 수도 있다.

한편, 아데노바이러스(Adenovirus)는 클로닝 벡터(cloning vector)로 여러 가지 장점이 있는데, 중간정도의 크기로 세포 핵 속에서 복제할 수 있으며, 임상적으로 무독성이고, 외부 유전자를 삽입하여도 안정적이며, 유전자의 재배열이나 손실이 일어나지 않고, 진핵생물을 형질전환할 수 있으며, 숙주세포 염색체에 통합되어도 안정적으로 높은 수준으로 발현된다. 아데노바이러스의 좋은 숙주세포는 인간의 조혈, 림프, 골수종의 원인이 되는 세포이다. 그러나, 선상 DNA라서 증식이 어렵고, 감염된 바이러스를 회복시키는 것이 쉽지 않으며, 바이러스의 감염율이 낮다. 또한 전달된 유전자의 발현이 1~2주 후에 가장 많이 되고, 일부 세포에서는 3~4주정도만 발현이 유지된다. 또한, 문제가 되는 것은 높은 면역 항원성을 갖는다는 것이다.

이러한 문제점들을 보완하면서 유전자 치료제로서의 장점이 많아 최근에 선호되는 아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus, AAV)는 단일가닥의 원바이러스(Provirus)로서, 복제하기 위하여 보조바이러스를 필요로 하고, AAV 게놈(genome)은 4,680bp로서 감염세포의 염색체 19번 특정부위에 삽입이 가능하다. 항상 트랜스 유전자(trans-gene)는 각각 145bp의 두 개의 역위말단반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열부분과 시그날 서열(signal sequence) 부분에 의해 연결된 플라스미드 DNA(plasmid DNA)에 삽입된다. AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 다른 플라스미드 DNA와 함께 트랜스펙션(transfection)시키고 아데노바이러스 는 보조바이러스로서 첨가한다.

AAV는 유전자를 전달하는 숙주세포의 범위가 넓고, 반복투여시 면역 부작용이 적으며, 유전자 발현기간이 긴 장점을 지니고 있다. 더구나, AAV 게놈이 숙주세포의 염색체에 통합되어도 안전하고, 숙주의 유전자발현을 변형시키거나 재배열시키지 않는다.

1994년 CFTR 유전인자를 포함한 AAV 벡터가 섬유아세포증(cystic fibrosis) 치료를 위하여 NIH에 승인된 이래, 많은 주목을 받고 다양한 질병의 임상치료에 이용되고 있다. 혈액응고인자인 인자 IX 유전자(factor IX gene)를 포함한 AAV벡터는 B형 혈우병(hemophilia B)을 치료하는데 이용되고 있으며, 바이엘(Bayer) 제약회사와 아비젠(Avigen)사가 공동으로 개발하고 있다. 또한, AAV 벡터를 이용한 A형 혈우병(hemophilia A) 치료제 개발이 매우 활발히 진행되고 있다. 또한, 여러가지 종류의 항암유전자를 함유한 AAV 벡터는 종양백신으로 사용하는 경우가 인증되었다.

상기 기술한 바와 같이, 질병치료를 위한 유전자 치료는 최근 그 연구가 활발히 진행되어 왔다. VEGF를 사용한 유전자 치료로는 폐순환승압을 치료하기 위해 맥관형성 인자를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 결손 아데노바이러스(출원번호: 10-2001-7013633)를 예로 들 수 있지만, 상기 치료법은 VEGF 센스 염기서열을 사용하였기 때문에 허혈성 질환치료에 한해서만 사용이 가능하고, 혈관신생에 의한 질병, 특히, 암의 치료에는 사용이 불가하다. 더욱이, 아데노바이러스는 면역 항원성이 높고, 숙주세포로의 감염성이 낮을 뿐 아니라, 발현기간이 짧은 단점을 지니고 있어 치료용으로 사용하기에는 부적절함을 지니고 있다.

암을 치료하기 위한 폴리펩타이드에 대한 연구는 기존에 많이 진행되어 왔지만, 상기 물질들의 대부분은 2-히드록시-5-페닐아조 벤조산 유도체의 사용(출원번호: 10-1996-7003670), 프럭탄 함유 조성물(출원번호: 10-1999-7010687) 등과 같은 화학용법제에 속한다. 그리고, 폴리뉴클레오티드에 대한 연구도 지속적으로 진행되어 왔지만, 바이러스 벡터 등을 통하여 효율적으로 생체내에 이동시키는 방법과의 연계면에서는 결과가 미흡하여 현재 이에 대한 연구가 진행중인 것들이 많다.

본 발명자들은 암을 유전적으로 치료하기 위하여 예의 노력한 결과, VEGF-A 안티센스 cDNA와 아데노-연관 바이러스를 함유하는 유전자 전달벡터가 혈관신생의 강력한 유발자인 VEGF의 기능을 저해함으로써 특정 암의 치료에 효과적이라는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 VEGF-A 안티센스 cDNA와 아데노-연관 바이러스를 함유하는 대장암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1의 VEGF-A 안티센스 cDNA와 아데노-연관 바이러스를 함유하는 유전자 전달벡터(pAAV-AShVEGF-A)를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 유전자 전달벡터(pAAV-AShVEGF-A), AAV rep-cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 동물세포주에 트랜스펙션하는 단계; (b) 상기 트랜스펙션된 동물세포주를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 세포주를 파쇄한 다음, 재조합 AAV 입자를 분리·정제하는 단계를 포함하는 VEGF-A 안티센스 cDNA를 함유하는 대장암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, VEGF-A 안티센스 cDNA를 함유하는 대장암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제(rAAV)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 rAAV를 유효성분으로 함유하는 대장암 및/또는 페암의 유전자 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 대장암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제로 이용되는 재조합 AAV 벡터(recombinant AAV vector)를 구축하기 위하여, pSub201 AAV용 플라스미드 DNA 또는 B형 혈우병치료제로 승인된 rAAV 벡터를 구축할 때 쓰이는 pAAV-FIX cis plasmid DNA(US 6,093,292)를 출발물질로 이용하였다. 상기 pAAV-FIX 시스 플라스미드 DNA(pAAV-FIX cis plasmid DNA)에 함유되어 있는 인자 IX cDNA 유전자를 VEGF-A 이소폼(isoform)의 안티센스 cDNA로 대체하여 시스-유전자(cis-gene) 벡터, pAAV-AShVEGF-A를 제작하였다. 상기 시스-유전자는 두 개의 역위말단 반복서열 부분(각각 145bp)과 인간 사이토메가로바이러스-매개 초기 프로모터(human cytomegalovirus(CMV) immediate early promoter), SV40 초기 mRNA 폴리아데닐레이션 시그날 서열(SV40 early mRNA polyadenylation signal sequence) 부분에 의해 연결된 플라스미드 DNA에 삽입되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예1: pAAV-AShVEGF-A 벡터 클로닝

pAAV-FIX 시스 플라스미드 DNA(US 6,093,292)를 KpnI 및 XhoI 제한효소로 처리하여 선형벡터(linearized vector)를 제작하였다. HUVEC 세포(Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)로부터 추출한 RNA를 사용하여 RT-PCR을 통해 cDNA를 합성하고, 하기 서열번호 2와 3의 VEGF-A 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 서열번호 1의 염기서열을 가지는 인간의 VEGF-A 안티센스 cDNA를 증폭하였다.

서열번호 2 (forward): 5'- GGGGTACCGTCTTGCTCTATCTTTC -3'

서열번호 3 (reverse): 5'- CCCTCGAGGGCCTCCGAAACCATGAACT -3'

상기 증폭된 VEGF-A 안티센스 cDNA를 KpnI 및 XhoI 제한효소로 처리한 다음, 상기 제작된 선형벡터와 혼합하고 T4 DNA 리가아제(ligase)를 첨가하여 서브클로닝을 수행함으로써, pAAV-AShVEGF-A 벡터를 제작하였다 (도 1). 상기 제작된 pAAV-AShVEGF-A 벡터를 KpnI 및 XhoI 제한효소로 처리한 다음 전기영동함으로써, 클로닝된 것을 확인하였다 (도 2).

실시예2: 대장암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제로 이용되는 rAAV벡터의 제작

실시예 1에서 제작된 pAAV-AShVEGF-A 플리스미드 DNA, AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 AAV rep-cap 플라스미드 DNA(Stratagene Co.) 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드(Stratagene Co.)를 동시에 HEK293(human embryonic kidney 293, ATCC CRL-1573) 동물세포에 트랜스펙션(transfection)한 다음, 96시간 배양한 후, HEK293 세포를 모아서 소니케이션(sonication)하였다.

상기 소니케이션한 세포 분해물(cell lysate)을 3번 반복하여 CsCl 밀도구배 원심분리를 수행한 다음, 굴절계(refractometer)를 이용하여 RI(Refractive Index)가 1.37~1.41g/㎖인 부분을 수득하여, 재조합 AAV 입자(recombinant AAV particle)를 순수하게 분리하였다.

입자 적정(titration)은 정량적인 PCR(Quantitative PCR) 방법을 통하여 수행하였다. 상기 순수 분리된 rAAV 입자를 연속적으로 희석하고 하기 서열번호 4와 5의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 표준곡선 PCR과 비교하여 AAV 게놈 수를 계산하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃, 5min(1 cycle) → ((94℃, 30sec → 70℃, 40sec)(25 cycle)).

서열번호 4 (forward): 5'-GGGCGTGGATAGCGGTTTGACTC-3'

서열번호 5 (reverse): 5'-CGGGGCGGGGTTATTACGACATT-3'

PCR 표준곡선은 pAAV-AShVEGF-A 플라스미드 DNA를 연속적으로 희석(serial dilution)하여 분자수에 따른 증폭(amplification)을 통해 구하였다. 그 결과, 5 X 10¹¹ AAV 게놈/㎖의 입자 적정농도(titre)를 수득하였다.

실시예3: rAAV 벡터에 의한 유전자 치료효과

rAAV-AShVEGF-A 벡터로 5가지 암세포주(T84, MKN74, MKN45, NUGC3 및 LCSC#1)에 M.O.I = 100 K (1 : 1 x 10⁵)를 처리하여 VEGF 단백질의 양이 감소하는 것을 ELISA(Biotrak VEGF, human ELISA system, Amersham Biosciences, USA)로 확인하였다.

인간 대장암세포주(T84: ATCC CCL-248), 인간 폐암세포주(LCSC#1:WO02/061069), 세가지 위암세포주(MKN74, MKN45, NUGC3) 각각을 1.5 x 10⁶ 세포수/35mm 디쉬(dish)가 되도록 준비한 후, 각 디쉬에 1.5 x 10¹¹ rAAV 게놈을 첨가하고 24시간 동안 처리하였다. rAAV를 전혀 처리하지 않은 것(negative)과 rAAV-GFP를 같은 M.O.I로 처리한 것(GFP)을 대조군(control)으로 하였다. 24시간 동안 처리하여 감염(infection)시킨 후, 바이러스를 제거하고, 그 후 48시간 동안 새로운 완전배지에서 배양하였다.

상기 배양된 세포를 파쇄하고 세포 분해물을 이용하여 ELISA를 수행함으로써, 상기 분해물내에 존재하는 VEGF 단백질의 양을 측정하였다 (도 3). 측정한 VEGF 단백질의 양을 수치화하여 하기 표 1과 같이 나타내었다.

	T84	MKN74	MKN45	NUGC3	LCSC#1
negative	20.32±0.28	2.95±0.37	19.13±0.67	16.13±0.95	4.78±0.18
GFP	26.62±0.71	3.69±0.31	11.92±0.72	13.55±0.55	5.27±0.24
AS-hVEGF-A	11.62±1.74	2.65±0.10	12.5±0.37	12.91±0.09	2.92±0.36

위암세포주에서 발현된 VEGF 단백질의 양은 대조군과 비교하여 주목할 만큼 감소되지는 않았다. 그러나, 대장암세포주 및 폐암세포주에는 발현된 VEGF 단백질의 양이, 대조군에 비해, 약 50% 정도 감소하였다. 이 결과로부터, 본 발명에 따른 유전자 치료제는 대장암 및/또는 폐암에 대하여 특이적인 유전자 치료효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.

본 발명은, VEGF-A 안티센스 cDNA와 아데노-연관 바이러스를 함유하는 대장암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 유전자 치료제는 종양에 의한 혈관신생의 유발에 있어서 주요한 역할을 담당하는 것으로 알려진 VEGF의 기능을 억제하여, 종양의 성장 및 증식에 필수적인 혈관신생을 억제하므로 암의 유전적 치료에 유용하다.

<110> Chungcheongbuk-do <120> Colon Cancer and/or Lung Cancer-specific Gene Therapeutic Agent Comprising VEGF-A Antisense cDNA and Adeno-associated Virus <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 428 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggcctccgaa accatgaact ttctgctgtc ttgggtgcat tggagccttg ccttgctgct 60 ctacctccac catgccaagt ggtcccaggc tgcacccatg gcagaaggag gagggcagaa 120 tcatcacgaa gtggtgaagt tcatggatgt ctatcagcgc agctactgcc atccaatcga 180 gaccctggtg gacatcttcc aggagtaccc tgatgagatc gagtacatct tcaagccatc 240 ctgtgtgccc ctgatgcgat gcgggggctg ctgcaatgac gagggcctgg agtgtgtgcc 300 cactgaggag tccaacatca ccatgcagat tatgcggatc aaacctcacc aaggccagca 360 cataggagag atgagcttcc tacagcacaa caaatgtgaa tgcagaccaa agaaagatag 420 agcaagac 428 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggggtaccgt cttgctctat ctttc 25 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccctcgaggg cctccgaaac catgaact 28 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gggcgtggat agcggtttga ctc 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cggggcgggg ttattacgac att 23

Claims (3)

1. 서열번호 1의 VEGF-A 안티센스 cDNA와 아데노-연관 바이러스를 함유하는 유전자 전달벡터(pAAV-AShVEGF-A).
2. 다음의 단계를 포함하는 대장암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제의 제조방법:

   (a) 제1항의 유전자 전달벡터, AAV rep-cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 동물세포주에 트랜스펙션하는 단계;

   (b) 상기 트랜스펙션된 동물세포주를 배양하는 단계; 및

   (c) 상기 배양된 세포주를 파쇄한 다음, 재조합 AAV(rAAV) 입자를 분리·정제하는 단계.
3. 제2항의 방법에 의해 제조되고, VEGF-A 안티센스 cDNA와 아데노-연관 바이러스를 함유하는 대장암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제(rAAV).

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