KR20080062374A

KR20080062374A - 재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 ２ 벡터의 대량 생산및 정제 방법

Info

Publication number: KR20080062374A
Application number: KR1020060138112A
Authority: KR
Inventors: 박기랑; 조영화
Original assignee: 박기랑; 주식회사 에스이씨
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2006-12-29
Publication date: 2008-07-03

Abstract

본 발명은 재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 2(rAAV2) 벡터의 대량 생산 및 정제 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 기존의 방법에 비해 rAAV2 벡터를 최적의 조건에서 대량으로 생산하는 방법 및 정제 정도를 향상시킬 수 있는 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, rAAV2 벡터의 생산 효율 및 감염 효율성이 향상되고, 오염된 단백질에 기인하는 면역반응을 최소화할 수 있으므로, 효율적으로 유전자 치료제를 생산하는데 유용하다.

아데노-연관 바이러스, AAV, 유전자치료

Description

재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 ２ 벡터의 대량 생산 및 정제 방법{Method for Mass Production and Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Sero Type 2 Vector}

도 1은 rAAV2-GFP 벡터 생산을 위해 형질전환된 HEK293 세포 또는 293T 세포에서의 GFP 발현 정도를 100배 비율의 형광현미경으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 rAAV2-GFP 벡터 생산을 위해 형질전환된 HEK293 세포 또는 293T 세포에서 GFP의 발현 정도를 200배 비율의 형광현미경으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 형질전환된 HEK293 세포 또는 293T 세포의 세포 용해액으로부터 얻은 rAAV2-GFP 벡터의 생산 효율성을 총 바이러스 파티클을 정량하여 시간별로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따라 생산된 rAAV2 벡터를 MKN74 인간 유래 위암세포주에 처리하고, 벡터량에 따른 감염 효율을 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명에 따른 rAAV2 벡터를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명에 따른 rAAV2 벡터를 CsCl 밀도구배법과 센트리콘 여과법을 함께 사용하여 정제한 rAAV2 벡터의 정제 정도를 코마시 블루 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

발명의 분야

배경기술

유전자 치료법은 유전자 전달 및 발현에 의하여 질병을 치료하는 방법으로서, 약물 치료와는 달리 장애가 있는 특정 유전자를 목표로 유전적 결함을 교정하는 치료법이다. 유전자 치료의 궁극적인 목표는 살아있는 세포를 유전적으로 변형하여 유익한 치료효과를 얻는 것이다. 상기 치료법은 질환 부위로 유전인자의 정확한 전달, 생체 내에서의 완전한 분해, 독성 및 면역 항원성 부재(不在) 및 유전인 자의 장기간 안정적인 발현이라는 장점을 지니고 있어서, 질병치료에 있어 더할 나위 없는 최선의 치료법으로 각광받고 있다.

유전자 치료의 주 연구 분야는 특정 질병에 치료 효과를 나타내는 유전자를 도입하거나, 항암제 등에 저항성을 나타내도록 정상세포의 저항 기능을 증강시키거나, 각종 유전성 질환자에 있어서 변형되거나 소실된 유전자를 대체하는 분야로 요약할 수 있다.

유전자 치료법은 크게 생체 내(in vivo)와 생체 외(ex vivo) 두 가지로 구분된다. in vivo 유전자 치료법은 치료 유전자를 직접 체내에 주입하는 것이고, ex vivo 유전자 치료법은 일차적으로 목적 세포(target cell)를 시험관 내에서 배양하고, 이들 세포에 유전자를 도입시킨 다음, 유전자 변형된 세포를 다시 체내로 주입하는 것이다. 현재 유전자 치료 연구 분야에서는 in vivo 유전자 치료법보다는 ex vivo 유전자 치료법을 많이 사용하고 있다.

유전자 전달 기술은 크게 바이러스를 수송체로 사용하는 방법(viral vector-based transfer method), 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비-바이러스성 방법(non-viral delivery method) 및 세포막에 일시적인 전기자극을 가하여 유전자를 도입하는 전기 투과법(electroporation) 등의 물리적 방법으로 구분할 수 있다.

상기 전달 기술 중에서, 바이러스 수송체를 사용하는 방법은 치료유전자로 대체된 유전자를 지니는 일부 또는 전체의 복제 능력이 결손된 벡터로서 유전인자의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있기 때문에 유전자 치료를 위해 선호되는 방법 이다. 바이러스 수송체 또는 바이러스 벡터로 사용되는 바이러스로는 RNA 바이러스 벡터(레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등)와 DNA 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 등)가 있으며, 이 외에도 단순포진 바이러스 벡터(herpes simplex viral vector), 알파 바이러스 벡터(alpha viral vector) 등이 있다. 이 중에서도 특히 연구가 활발히 진행되고 있는 것은 레트로바이러스와 아데노바이러스이다.

숙주세포의 게놈에 통합기능이 있는 레트로바이러스(retrovirus)의 특징은 인체에 해가 없지만 통합시 정상세포의 기능을 억제할 수 있고, 다양한 세포에 감염되고, 증식이 쉬우며, 1~7kb 정도의 외부 유전자를 수용할 수 있고, 복제결핍 바이러스를 생성할 수 있는 능력이 있다는 것이다. 그러나, 유사분열 이후의 세포에 감염되기 힘들며, in vivo 상태에서 유전자 전달이 어렵고, 체세포 조직을 항시 in vitro에서 증식하여야만 한다는 단점도 지니고 있다. 또한, 레트로바이러스는 원형암유전자(proto-oncogene)에 통합될 수 있어 돌연변이의 위험성이 있고 세포를 괴사시킬 수도 있다.

한편, 아데노바이러스(Adenovirus)는 클로닝 벡터(cloning vector)로 여러 가지 장점을 가지는데, 중간 정도의 크기로 세포 핵 속에서 복제될 수 있으며, 임상적으로 무독성이고, 외부 유전자를 삽입하여도 안정적이며, 유전자의 재배열이나 손실이 일어나지 않고, 진핵생물을 형질전환시킬 수 있으며, 숙주세포 염색체에 통합되어도 안정적이면서도 높은 수준으로 발현된다. 아데노바이러스의 좋은 숙주세포는 인간의 조혈세포, 림프구, 골수종의 원인이 되는 세포이다. 그러나, 선상 DNA 라서 증식이 어렵고, 감염된 바이러스를 회복시키는 것이 쉽지 않으며, 바이러스의 감염률이 낮다. 또한, 전달된 유전자는 1~2주 후에 가장 많이 발현되고, 일부 세포에서는 3~4주 정도만 발현이 유지된다. 또한, 문제가 되는 것은 높은 면역원성을 갖는다는 것이다.

아데노-연관 바이러스(Adeno-Associated virus, AAV)는 상기와 같은 문제점들을 보완할 수 있으면서, 유전자 치료제로의 많은 장점을 가지고 있어 최근에 선호되고 있다. AAV는 단일 가닥의 원바이러스(Provirus)로서, 복제하기 위하여 보조바이러스를 필요로 하고, AAV 게놈은 4,680 bp로서 감염세포의 염색체 19번 특정 부위에 삽입이 가능하다. 트랜스-유전자(trans-gene)는 각각 145bp의 두 개의 역위말단반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열부분과 시그날 서열(signal sequence)부분에 의해 연결된 플라스미드 DNA(plasmid DNA)에 삽입된다. AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 다른 플라스미드 DNA와 함께 트랜스펙션(transfection)시키고 아데노바이러스는 보조바이러스로서 첨가한다. AAV는 유전자를 전달하는 숙주세포의 범위가 넓고, 반복 투여시 면역 부작용이 적으며, 유전자 발현 기간이 긴 장점을 지니고 있다. 더구나, AAV 게놈은 숙주세포의 염색체에 통합되어도 안전하고, 숙주의 유전자 발현을 변형시키거나 재배열시키지 않는다.

1994년 CFTR 유전인자를 포함한 AAV 벡터가 섬유아세포증(cystic fibrosis) 치료를 위하여 NIH에 승인된 이래, 다양한 질병의 임상치료에 이용되고 있다. 혈액응고인자인 인자 IX 유전자(factor IX gene)를 포함한 AAV 벡터는 B형 혈우병(hemophilia B) 치료에 이용되고 있고, AAV 벡터를 이용한 A형 혈우병 (hemophilia A) 치료제 개발이 진행되고 있다. 또한, 여러 가지 종류의 항암유전자를 함유한 AAV 벡터는 종양 백신으로 사용하는 경우가 인증되었다.

유전자치료에 사용되는 AAV 벡터 중 가장 널리 사용되고 있는 것이 rAAV2 혈청형 벡터이고, rAAV2 혈청형 벡터에 대해서는 바이러스의 유전자 복제 기전, 염색체 삽입 기전 등을 포함한 많은 연구가 축적되어 왔다. 그러나, AAV2를 암환자에 재차 투여했을 경우 첫 번째 투여시에 발생한 면역 반응에 의해, 2차 투여시에는 바이러스가 중화되어 치료효율이 급격히 떨어지는 단점이 있다.

또한, AAV는 독자적인 자가복제 능력이 없기 때문에, 치료에 필요한 정도의 재조합 AAV를 효과적으로 만들어내기가 쉽지 않다. 상기 단점으로 인하여, 재조합 AAV가 유전자 치료 연구의 초기 생성 과정에서부터 널리 사용되지는 않았지만, 바이러스의 생활사에 대한 꾸준한 연구의 결과, 헬퍼바이러스-유리 생산 시스템(Xiano, X., Li, J. and Samulski, R.J., J. Virol., 72:2224, 1998; Grimm, D. et al ., Hum . Gene Ther., 9:2745, 1998; Matsushita, T. et al ., Gene Ther., 5:938, 1998; Donway, J.E. et al ., Gene Ther., 6:986, 1999; Allen, Mol. Ther., 1:88, 1999; Cao, L. et al ., J. Virol., 74:11456, 2000)와 같은 rAAV 생산을 위한 효과적인 방법들이 고안되었다. 상기 방법 중, rAAV를 생산하기 위해 가장 광범위하게 사용되는 방법은 목적 유전자를 코딩하는 rAAV 발현벡터와 AAV rep - cap 유전자 발현벡터 및 감염성 입자 형성에 필요한 아데노 바이러스 기원 유전자의 발현벡터를 모두 포괄하는 헬퍼플라스미드(AAV rep - cap 유전자 및 아데노 연관 바이러스 감염성 입자 형성에 필요한 상기 아데노 바이러스 기원 유전자를 동시에 포함하 는 플라스미드)를 HEK 293 세포와 같이, 아데노 바이러스의 E1 유전자로 형질전환된 포장용 세포주에 이중 또는 삼중 형질도입시키는 방법이다.

대부분의 경우에 있어서, 형질도입은 인간 배아 신장 293 세포(HEK 293)와 같이 아데노바이러스의 E1 유전자를 보충할 수 있는 포장용 세포주를 부착 배양한 상태에서 수행하는 것이 일반적이다 (Grimm, D., Methods, 28:146, 2002; Zolotukhin, S. et al ., Methods, 28:158, 2002). 그러나, 종래의 연구 결과를 종합하면, 동물 실험에서 치료효과를 입증하는데 필요한 rAAV의 양은 1013 입자 정도로서, 이 정도의 rAAV를 생산하기 위해서는 15㎠ 배양 접시를 기준으로 최소한 20에서 많게는 5,000개의 HEK 293 배양 접시에 대한 형질도입이 필요하다 (Kay, M.A. et al ., Nat . Genet., 24:257, 2000; Chuah, M.K. et al ., J. Gene Med., 3:3, 2001; Matsushita, T. et al ., Gene Ther., 5:938, 1998; Gao, G.P. et al ., Hum . Gene Ther., 9:2353, 1998; Zolotukhin, S. et al ., Gene Ther., 6:973, 1999; Chadeuf, G. et al ., J. Gene Med., 2:260, 2000; Drittanti, L. et al ., Gene Ther., 7:924, 2000; Drittanti, L. et al., J. Gene Med., 3:59, 2001).

또한, 인간을 대상으로 하는 임상 실험을 하는데 있어서는 약 1013 내지 1014개의 입자가 1회의 임상 적용에 사용될 것으로 추정되기 때문에 훨씬 더 많은 수의 배양 접시와 그에 대한 형질도입이 필요하다 (Grimm, D. et al ., Hum . Gene Ther., 10:2445, 1999). 따라서, AAV 유래 유전자 전달체를 사용하는 각종 난치성 질환의 유전자 치료를 실현하는데 있어서 효과적인 rAAV의 대량 생산방법의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 재조합 아데노 연관 바이러스 입자를 정제하는 통상적인 방법으로는 CsCl, 이오딕사놀(iodixanol)과 같은 물질의 밀도차를 이용하는 초원심분리법(Zolotukhin, S. et al ., Gene Ther., 6:973, 1999)이 있으나, 상기 방법은 대량 생산에 부적합하고, 감염성 바이러스 벡터의 순수 분리 효율이 낮아 정제의 두 번째 단계에 이온교환수지를 사용하거나, AAV 바이러스의 유력한 수용체로 알려진 헤파린 황산염 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan) 수용체와 유사한 헤파린, 셀루핀 황산염(cellufine sulphate) 등의 친화력을 이용하는 친화성 수지(affinity resin)를 사용하는 정제법과 병행하여 사용하기도 한다 (Zolotukhin, S. et al ., Gene Ther., 6:973, 1999; O'Riordan, C.R. et al., J. Gene Med., 2:444, 2000; Zolotukhin, S. et al ., Methods, 28:158, 2002; Snyder, R.O. et al., Curr. Opin. Biotechnol., 13:418, 2002; 미국등록특허 제6,593,123호). 그러나, 헤파린 기반의 친화성 수지도 용량 증대에 한계가 있으며, 고순도를 필요로 하는 임상 등급의 재조합 아데노 연관 바이러스 정제 공정에 사용할 경우, 친화수지 유래 물질의 완벽한 제거를 확인해야 하는 등 산업용으로 사용하기 어려운 문제점을 가지고 있다.

이에, 본 발명자들은 재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 2(rAAV2) 벡터의 대량 생산 및 정제 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, rAAV2 벡터를 293T 세포에 도입하여 형질전환 후, 2~3일 동안 배양하여 rAAV2 벡터를 대량 생산할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 2(rAAV2)의 대량 생산방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 2(rAAV2)의 정제 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 목적유전자를 함유하는 pAAV 벡터, AAV2 레플리케이션(rep) 서열 및 AAV2 캡시드(cap) 서열을 함유하는 AAV rep - cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 293T 세포(ATCC CRL-11268)를 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 293T 세포를 2~3일 동안 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 세포주를 파쇄하여 rAAV2 벡터를 수득하는 단계를 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 2(rAAV2) 벡터의 대량 생산방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 치료유전자는 VEGFR-1(Vascular endothelial growth factor receptor-1) cDNA, VEGFR-2 cDNA, 안티센스 VEGF-A cDNA, 안티센스 VEGF-B cDNA 및 안티센스 VEGF-C cDNA로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 cDNA인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 목적유전자를 함유하는 pAAV 벡터, AAV2 레플리케이션(rep) 서열 및 AAV2 캡시드(cap) 서열을 함유하는 AAV rep-cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 세포를 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 세포를 파쇄하여 CsCl 밀도구배(CsCl density gradient) 원심분리하여 rAAV2 벡터를 분리하는 단계; 및 (d) 상기 분리된 rAAV2 벡터를 Centricon을 이용한 원심여과(centrifugal filtration)를 통해 정제하는 단계를 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 2(rAAV2) 벡터의 정제 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 세포는 293T 세포 또는 HEK293 세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태는 rAAV2 벡터의 대량 생산방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, pAAV-GFP 플라스미드 DNA, AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 AAV rep - cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드(pHelper)를 HEK293 또는 293T 세포에 트리플 코-트랜스펙션(triple co-transfection)하여 rAAV2-GFP 벡터를 제작하여 대량 생산을 위한 조건을 확인하였다. 그 결과, 상기 방법으로 트리플 코-트랜스펙션하여 형질전환한 293T 세포를 2~3일 동안 배양한 경우, rAAV2-GFP 벡터의 양이 가장 많은 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 양태는 CsCl 밀도구배법과 Centricon(Millipore, YM-100)을 이용한 원심여과(centrifugal filtration)법을 함께 사용하여 rAAV2 벡터를 정제하 는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 목적유전자를 함유하는 pAAV 벡터, AAV2 레플리케이션(rep) 서열 및 AAV2 캡시드(cap) 서열을 함유하는 AAV rep-cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 HEK293 또는 293T 세포를 트리플 코-트랜스펙션하여 배양한 후, 상기 형질전환된 세포를 파쇄하여 CsCl 밀도구배(CsCl density gradient) 원심분리하여 rAAV2 벡터를 분리한 다음, 상기 rAAV2 벡터를 Centricon을 이용한 원심여과(centrifugal filtration)를 통해 정제함으로써 기존의 CsCl 밀도구배 방법으로만 정제한 경우에 비하여 높은 정제 효율을 나타내었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. rAAV2-GFP 벡터의 생산

실시예 1-1. pAAV-GFP 유전자 플라스미드의 제작

슈도타입 rAAV 벡터 구축 및 생산을 위하여 ① pAAV-치료유전자 플라스미드, ② AAV rep-cap 플라스미드 및 ③ 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 중에서 pAAV-치료유전자 플라스미드를 대신하여, GFP 유전자를 포함하는 pAAV-GFP 유전자 플라스미드를 제작하였다.

우선, AAV2 바이러스 게놈 유래의 역말단 반복서열(inverted terminal repeat, ITR)을 포함한 pAAV-FIX cis 플라스미드(US 6,093,292)를 이용하여 pAAV-GFP 플라스미드를 클로닝하였다. pAAV-FIX cis 플라스미드를 제한효소 Kpn I 및 Not I으로 처리하고, pEGFP-N1 플라스미드 DNA(Clontech., Cat. #6085-1)를 상기와 동일한 제한효소 Kpn I 및 Not I으로 처리하여 선형 벡터 및 삽입할 eGFP 단편을 준비하였다. 상기 선형벡터와 삽입 단편을 혼합하고 서브클로닝하여 pAAV-GFP를 제작하였다.

실시예 1-2. rAAV2-GFP 벡터의 생산

재조합 아데노-연관 바이러스(recombinant Adeno-Associated virus, rAAV) 벡터를 생산하기 위하여, 상기에서 제작된 pAAV-GFP 플라스미드 DNA, AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 AAV rep-cap 플라스미드 DNA인 pRC(Stratagene, Co., USA) 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드(pHelper, Stratagene Co., USA)를 HEK293(human embryonic kidney 293, ATCC CRL-1573) 또는 293T(ATCC CRL-11268) 세포에 트리플 코-트랜스펙션(triple co-transfection)하였다. 상기 형질전환된 세포를 배양하여 24, 48, 72시간 경과 시점에서 상기 세포를 모아 초음파 파쇄(sonication)한 다음, RNase와 DNase를 처리하여 CsCl 밀도구배(CsCl density gradient) 원심분리를 2번 반복하여 RI(Refractive Index)가 1.37~1.42g/㎖인 부분을 모아 재조합 AAV(rAAV) 파티클을 순수 분리하였다.

상기에서 분리된 rAAV 파티클을 정량하기 위하여, CMV 프로모터 부위의 서열 번호 1 및 서열번호 2의 PCR 프라이머를 제작하여 Quantitative PCR 방법 및 Real-time PCR 방법을 중복적으로 수행하였다. 이때, 농도를 알고 있는 각 pAAV 플라스미드 DNA를 표준 물질로 이용하였다.

서열번호 1 : 5'-GGC CGA CAA GCA GAA GAA C

서열번호 2 : 5'-CGC GCT TCT CGT TGG GGT CTT

실시예 2: rAAV2 - GFP 벡터의 생산율 및 최적 정제 조건 검색

rAAV2 벡터의 형질전환 효율을 확인하기 위하여, 상기 형질전환된 HEK293 및 293T 세포의 GFP(green fluorescence protein) 발현 정도를 시간별로 형광현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 293T 세포가 HEK293에 비해 GFP의 발현이 5배 정도 높았다 (도 1 및 도 2). 이는 293T 세포가 HEK293에 비해 형질전환 효율이 높다는 것을 의미하며, 형질전환 효율이 높으면 rAAV 벡터 생산율이 높다는 것을 시사한다.

상기 형질전환된 293T 세포의 경우, 배양 3일 이후부터 과다한 세포 분열로 인한 세포 덩어리의 부유 현상 및 세포사가 관찰되었고, GFP 발현의 측정이 거의 불가능하였다. 따라서, 형질전환된 세포의 배양 2일째 및 3일째를 대상으로 rAAV2-GFP 벡터의 최적 정제 조건을 확인하였다.

상기 형질전환된 HEK293 및 293T 세포의 세포 용해물로부터 CsCl 밀도구배 방법을 이용하여 rAAV2-GFP 벡터를 분리 정제하여 양을 비교하였다. 상기 형질전환 된 HEK293 세포를 배양한 경우, 배양 3일째 생산율(1.62×10¹²)이 배양 2일째(1.05×10¹²)보다 약간 증가하였고, 상기 형질전환된 293T 세포를 배양한 경우, 배양 3일째의 생산율(8.13×10¹²)이 배양 2일째(1.23×10¹³)보다 다소 낮은 생산율을 보였으나, 두 세포의 회수하는 시점에 따른 큰 변화는 없었다 (도 3의 A).

또한, 상기 형질전환된 293T 세포의 생산 효율성은 HEK293 세포에 비해, 배양 2일째는 10배 정도, 배양 3일째는 5배 정도 높았으며, 293T세포의 2일째 및 3일째 배양의 생산 효율성을 비교한 결과, 형질전환된 세포의 배양 2일째일 때 rAAV2-GFP 벡터의 생산 효율성이 높았다 (도 3의 B).

실시예 3. rAAV2-GFP 벡터의 감염률(transduction efficiency) 측정

rAAV2-GFP 벡터의 감염률을 측정하기 위하여, 293T 세포, HEK293 세포 및 MKN74 위암 세포주(한국생명공학연구원, JCRB0255, 대조군)를 24시간 동안 배양한 후, 상기 rAAV2-GFP 벡터를 2,000v.g./세포(M.O.I. 2K), 20,000v.g./세포(M.O.I. 20K) 및 200,000v.g./세포(M.O.I. 200K)로 처리하여 감염시킨 다음, 72시간 후 GFP 발현 여부를 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다.

그 결과, M.O.I. 200K 감염 조건에서 생산된 rAAV2-GFP 벡터의 감염 효율은 293T 세포와 HEK293 세포에서 유사하게 높게 나타났으나(>90%), M.O.I. 20K 또는 2K 감염 조건에서는 293T 세포에서 생산한 rAAV2-GFP 벡터가 수십 배 정도 높은 감염률을 보였다 (도 4).

실시예 4. rAAV2-GFP 벡터의 정제

실시예 4-1. rAAV2-GFP 벡터의 확인

상기 rAAV2-GFP 벡터를 확인하기 위하여, 항-AAV2 항체(Progen #61084, Germany)를 이용하여 웨스턴 블럿(western blot)을 수행하였다. 항-AAV2 항체를 1:200의 비율로 상온에서 3시간 동안 처리한 후, ECL(Amersham Biosciences, USA) 방법으로 확인하였다. 그 결과, rAAV2는 VP1(87 kDa), VP2(72 kDa) 및 VP3(62 kDa)의 3개의 밴드를 보였고, 이는 종래 알려진 rAAV2캡시드 단백질 크기와 일치하는 결과이다 (도 5).

실시예 4-2. rAAV의 정제 효율 향상 확인

상기 rAAV2-GFP 벡터를 CsCl 밀도구배법과 Centricon(Millipore, YM-100)을 이용하여 5000g, 20분, 4℃로 원심여과(centrifugal filtration)하는 방법을 함께 사용하여 정제함으로써 rAAV 벡터의 정제 정도를 향상시켰다.

즉, HEK293(human embryonic kidney 293, ATCC CRL-1573) 또는 293T(ATCC CRL-11268) 세포에 상기 rAAV2-GFP 벡터를 트리플 코-트랜스펙션(triple co-transfection)한 후, 상기 형질전환된 세포를 배양한지 24, 48 시간이 경과하면 상기 세포들을 모아 초음파 파쇄(sonication)한 다음, RNase와 DNase를 처리하여 CsCl 밀도구배(CsCl density gradient) 원심분리를 2번 반복하여 RI(Refractive Index)가 1.37~1.42g/㎖인 부분을 모아 재조합 AAV(rAAV) 파티클을 순수 분리하였고, 이렇게 분리된 rAAV2-GFP 벡터를 Centricon(Millipore, YM-100)을 이용하여 5000g, 20분, 4℃로 원심여과(centrifugal filtration)하는 방법으로 정제하였다.

이때, 기존의 CsCl 밀도구배 방법으로만 정제된 rAAV2-GFP 벡터를 대조군으로 사용하였으며, 상기에서 정제된 rAAV2-GFP 벡터를 12% SDS-PAGE한 후, 코마시 블루(Coomassie Blue) 염색법으로 정제 효율을 확인하였다.

그 결과, 원심 여과법과 CsCl 밀도구배법과 Centricon을 함께 사용하여 정제한 경우가 기존 CsCl 밀도구배법에 의해 정제한 경우보다 휠씬 높은 정제 효율을 보였고, 주된 캡시드 단백질(VP1, VP2, VP3) 밴드만을 확인할 수 있었다 (도 6).

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 2(rAAV2) 벡터의 대량 생산 및 정제 방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, rAAV2 벡터의 생산 효율성 및 감염 효율성이 증가되고, 생산비용이 절감되며, 정제 정도를 향상시켜 오염되어 있던 단백질에 기인하는 면역반응을 최소화할 수 있으므로, 임상 시험용 유전자 치료제 생산에 유용하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> PARK, Kee Rang SEC LTD. CO <120> METHOD FOR MASS PRODUCTION AND PURIFICATION OF RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS SERO TYPE 2 VECTOR <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggccgacaag cagaagaac 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cgcgcttctc gttggggtct t 21

Claims

다음 단계를 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 2(rAAV2) 벡터의 대량 생산방법:

(a) 목적유전자를 함유하는 pAAV 벡터, AAV2 레플리케이션(rep) 서열 및 AAV2 캡시드(cap) 서열을 함유하는 AAV rep - cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 293T 세포(ATCC CRL-11268)를 형질전환시키는 단계;

(b) 상기 형질전환된 293T 세포를 2~3일 동안 배양하는 단계; 및

(c) 상기 배양된 세포주를 파쇄하여 rAAV2 벡터를 수득하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 목적유전자는 VEGFR-1(Vascular endothelial growth factor receptor-1) cDNA, VEGFR-2 cDNA, 안티센스 VEGF-A cDNA, 안티센스 VEGF-B cDNA 및 안티센스 VEGF-C cDNA로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 cDNA인 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스 혈청형 2(rAAV2) 벡터의 정제 방법:

(a) 목적유전자를 함유하는 pAAV 벡터, AAV2 레플리케이션(rep) 서열 및 AAV2 캡시드(cap) 서열을 함유하는 AAV rep - cap 플라스미드 DNA 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드로 세포를 형질전환시키는 단계;

(b) 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계;

(c) 상기 배양된 세포를 파쇄하여 CsCl 밀도구배(CsCl density gradient) 원심분리하여 rAAV2 벡터를 분리하는 단계; 및

(d) 상기 분리된 rAAV2 벡터를 Centricon을 이용한 원심여과(centrifugal filtration)를 통해 정제하는 단계.
제3항에 있어서, 상기 세포는 293T 세포 또는 HEK293 세포인 것을 특징으로 하는 방법.