CN110699367B

CN110699367B - 编码人nadh脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用

Info

Publication number: CN110699367B
Application number: CN201810747248.2A
Authority: CN
Inventors: 李斌
Original assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co ltd
Priority date: 2018-07-09
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2038-07-09
Also published as: CN110699367A

Abstract

本发明公开了编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。还公开了一种融合核酸，其包含所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸。进一步公开了一种重组表达载体，其包含上述核酸或融合核酸。还公开了一种转化体，其在宿主中导入上述核酸或融合核酸。本发明所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸表达量更高，因此可在线粒体中获得更多的人NADH脱氢酶亚单位4蛋白，能较好地治疗Leber遗传性视神经病变。

Description

编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用。

背景技术

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy,LHON)是一种退行性视力障碍，通常表现为中央视力的双侧丧失。平均发病年龄在20岁中期，通常在数周至数月内没有疼痛，直到双眼视力恶化到0.1以下，严重影响患者的生活质量。LHON是由于线粒体基因突变引起的，与NADH泛醌氧化还原酶、即线粒体呼吸链的复合体I亚基的三个线粒体基因之一的突变有关。研究表明，影响ND1基因的G3460A突变、影响ND6基因的T14484C突变和影响ND4基因的G11778A突变被认为是LHON的主要原因，并且每种突变都具有永久性视力丧失的显著风险。所有这些都与视网膜神经节细胞的局灶性退化有关。

两个主要的LHON突变G3460A和T14484C导致患者血小板中分离的线粒体NADH脱氢酶活性降低80％。然而，从G11778A细胞中分离出的线粒体显示复合物I和呼吸链中大多数其他成分的活性接近正常。对中国LHON患者而言，G11778A位点突变患者占90％。在11778位点的突变，使人NADH脱氢酶亚单位4蛋白(ND4蛋白)的精氨酸转变成组氨酸，导致功能障碍、视神经损伤和Leber遗传性视神经病变，其发病率高、预后差。

LHON治疗的主要问题产生于将DNA输送到细胞器的障碍。现有技术CN 102634527B公开了一种重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的基因(ND4基因)及其表达载体构建方法，由COX10的编码28个氨基酸的肽链，引导ND4蛋白进入到线粒体中。CN 104450747 A公开了一种用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒-NADH脱氢酶亚单位4(ND4)基因全长以及药剂。该基因其由CAG启动子序列、带COX10的线粒体定位序列的ND4的编码序列和UTR组成。将CN 102634527 B的药剂，或CN 104450747 A的含有CAG-Cox10-ND4的药剂注入眼玻璃体腔中，用于治疗Leber遗传性视神经病变，该等药剂能够在玻璃体腔内保持活力，并转染到视神经细胞，该蛋白N前端的信号肽定向引导该蛋白进入线粒体，成熟的ND4蛋白发挥作用。但是，该技术还存在转染效率不高，治疗效果不佳的缺点。

因此，本领域亟需开发一种转染效率不高，治疗效果好的人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的表达体系及制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种转染效率不高，治疗效果好的人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的表达体系及制备方法。

本发明的目的是提供一种编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的优化核酸序列、载体及制备方法。

本发明的第一方面，提供了一种编码人NADH脱氢酶亚单位4(ND4)蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自下组：

(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；和

(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括DNA序列、cDNA序列、或mRNA序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括单链序列和双链序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括与SEQ ID NO.:1完全互补的核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种融合核酸，所述融合核酸包含如本发明第一方面所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述融合核酸还包含选自下组的序列：线粒体靶向肽的编码序列、UTR序列、或其组合。

在另一优选例中，所述线粒体靶向肽的编码序列包括：COX10序列和/或OPA1序列。

在另一优选例中，所述COX10的编码序列具有如SEQ ID NO.:2所示的序列。

在另一优选例中，所述OPA1的编码序列具有如SEQ ID NO.:3所示的序列。

在另一优选例中，所述UTR序列包括3’-UTR和/或5’-UTR，较佳地为3’-UTR。

在另一优选例中，所述UTR序列具有如SEQ ID NO.:4或11所示的序列。

在另一优选例中，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：

Z0-Z1-Z2-Z3 (I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z0为无、或5’-UTR序列；

Z1为线粒体靶向肽的编码序列；

Z2为如本发明第一方面所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核苷酸序列；和

Z3为3’-UTR序列。

在另一优选例中，所述的Z1为COX10或OPA1的编码序列。

在另一优选例中，所述融合核酸从5’-3’端的结构为COX10-ND4-UTR。

在另一优选例中，所述融合核酸的序列如SEQ ID NO.:5所示；其中，

第1-84位为COX10的编码序列；

第85-1464位为编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核苷酸序列；

第1465-2889位为3’-UTR序列。

在另一优选例中，所述融合核酸从5’-3’端的结构为OPA1-ND4-UTR。较佳地，所述融合核酸序列如SEQ ID NO.:10所示。

在另一优选例中，所述序列如SEQ ID NO.:10所示的融合核酸中，

第1-266位为OPA1的编码序列；

第267-1646位为编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核苷酸序列；

第1647-2271位为3’-UTR序列。

在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为1-30nt，较佳地1-15nt，更佳地3-6nt。

在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列来源于限制性内切酶酶切形成的核苷酸接头序列。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体。

在另一优选例中，所述AAV载体的血清型选自：AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述载体为含有或插入有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸的AAV载体；较佳地为AAV载体质粒pSNaV。

在另一优选例中，所述载体用于表达重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其染色体中整合有外源的如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：HEK293细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。较佳地，所述宿主细胞为(视网膜)神经节细胞。

本发明的第五方面，提供了如本发明第三方面所述的载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力和/或治疗视网膜退化性疾病。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗眼部疾病。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗视网膜神经节细胞的局灶性退化。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗遗传性视神经病变，较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。

本发明的第六方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述药物制剂中载体的含量为1×10⁹-1×10¹⁶，较佳地1×10¹²-1×10¹³个病毒/毫升。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病，较佳地治疗视网膜神经节细胞的局灶性退化。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗遗传性视神经病变，较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。

本发明的第七方面，提供了一种治疗方法，所述方法包括将本发明第三方面所述的载体施用于需要的对象。

在另一优选例中，将所述载体引入到需要的对象的眼睛内。

在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述治疗方法为治疗眼部疾病的方法。

在另一优选例中，所述眼部疾病为遗传性视神经病变，较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。

本发明的第八方面，提供了一种重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的制备方法，包括步骤：培养权利要求5所述的宿主细胞，从而得到重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了ND4融合核酸与经优化的ND4融合核酸的核苷酸序列对比。其中，“ND4基因”行序列为未优化的ND4融合核酸序列，“优化ND4基因”行序列为经优化的ND4融合核酸。

图2显示了PCR核酸电泳验证ND4(泳道A)和优化ND4(泳道B)基因克隆结果。

图3显示了以β-actin为内参基因(白色柱形)，qPCR比较rAAV2-优化ND4(左侧黑色柱形)和rAAV2-ND4(右侧黑色柱形)在基因水平上的表达量。

图4显示了以β-actin为内参蛋白(白色柱形)，免疫印迹比较rAAV2-优化ND4(左侧黑色柱形)和rAAV2-ND4(右侧黑色柱形)在蛋白水平上的表达量。

图5显示了兔眼玻切镜下眼底拍照，其中A为注射rAAV2-ND4病毒，B为注射rAAV2-优化ND4病毒。

图6显示了人眼玻璃体腔rAAV2-优化ND4病毒注射实验后眼底拍照结果，其中A为治疗前，B为治疗后。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，对重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白基因编码序列进行了针对性优化设计，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞中进行高效转录和高效表达ND4蛋白的核苷酸序列和融合核酸，并构建了重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的重组表达载体。经过特殊优化后的ND4编码序列(SEQ ID NO.:1)的转录效率和翻译效率显著提高，重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白表达量提高了一倍以上。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。

如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。

术语“人NADH脱氢酶亚单位4蛋白”、“ND4(蛋白)”、“多肽”、“本发明多肽”和“本发明蛋白”可互换使用。

腺相关病毒

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。

重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

在本发明一个优选的实施例中，载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV含有大约4700碱基并在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。

AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请No.PCT/US2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239；美国专利No.4,797,368、6,596,535和5,139,941，以及欧洲专利No.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于AAV的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒，和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。

在一些实施方案中，重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16的AAV病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的，并在美国专利No.6,596,535中有所描述。

核酸编码序列

本发明的要解决的技术问题是克服现有技术中NADH脱氢酶亚单位4蛋白转染效率不高、治疗效果不佳的技术缺陷。本发明提供一种靶向性NADH脱氢酶亚单位4蛋白及其制备方法和应用。经研究发现，本发明优化的ND4基因序列(SEQ ID NO.:1)，使ND4蛋白表达效率更高，有更多的ND4蛋白在患者视神经节细胞发挥生理作用。

本发明所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO.:1所示。所述编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸，其全长为1380bp。在本发明中，所述编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸又称作ND4优化基因或ND4优化核酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

在本发明较佳的实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术利用所述宿主细胞表达ND4蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明ND4蛋白的宿主细胞(如哺乳动物细胞)。一般来说包括步骤：将本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体转导入宿主细胞内。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。

宿主细胞可以是原核细胞，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有：CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择HEK细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、神经细胞为宿主细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

序列优化

本发明改变了COX10的线粒体编码序列为核酸编码序列(如SEQ ID NO：2所示)且进行ND4核苷酸序列优化(如SEQ ID NO：1所示，在本发明中简称优化ND4基因/核酸)，此序列是经过特殊优化，转录效率和翻译效率显著提高，优化的COX10+ND4和未优化的COX10+ND4序列的同源性为75.89％。

在本发明中，提供了优化的、转录效率和翻译效率高的重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的编码序列，所述编码序列如SEQ ID NO.:1所示。

如本文所用，所述“优化的ND4编码序列”、“优化ND4编码基因”均指一种用于编码重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

ATGCTGAAGCTGATCGTGCCCACCATCATGCTGCTGCCTCTGACCTGGCTGAGCAAGAAACACATGATCTGGATCAACACCACCACGCACAGCCTGATCATCAGCATCATCCCTCTGCTGTTCTTCAACCAGATCAACAACAACCTGTTCAGCTGCAGCCCCACCTTCAGCAGCGACCCTCTGACAACACCTCTGCTGATGCTGACCACCTGGCTGCTGCCCCTCACAATCATGGCCTCTCAGAGACACCTGAGCAGCGAGCCCCTGAGCCGGAAGAAACTGTACCTGAGCATGCTGATCTCCCTGCAGATCTCTCTGATCATGACCTTCACCGCCACCGAGCTGATCATGTTCTACATCTTTTTCGAGACAACGCTGATCCCCACACTGGCCATCATCACCAGATGGGGCAACCAGCCTGAGAGACTGAACGCCGGCACCTACTTTCTGTTCTACACCCTCGTGGGCAGCCTGCCACTGCTGATTGCCCTGATCTACACCCACAACACCCTGGGCTCCCTGAACATCCTGCTGCTGACACTGACAGCCCAAGAGCTGAGCAACAGCTGGGCCAACAATCTGATGTGGCTGGCCTACACAATGGCCTTCATGGTCAAGATGCCCCTGTACGGCCTGCACCTGTGGCTGCCTAAAGCTCATGTGGAAGCCCCTATCGCCGGCTCTATGGTGCTGGCTGCAGTGCTGCTGAAACTCGGCGGCTACGGCATGATGCGGCTGACCCTGATTCTGAATCCCCTGACCAAGCACATGGCCTATCCATTTCTGGTGCTGAGCCTGTGGGGCATGATTATGACCAGCAGCATCTGCCTGCGGCAGACCGATCTGAAGTCCCTGATCGCCTACAGCTCCATCAGCCACATGGCCCTGGTGGTCACCGCCATCCTGATTCAGACCCCTTGGAGCTTTACAGGCGCCGTGATCCTGATGATTGCCCACGGCCTGACAAGCAGCCTGCTGTTTTGTCTGGCCAACAGCAACTACGAGCGGACCCACAGCAGAATCATGATCCTGTCTCAGGGCCTGCAGACCCTCCTGCCTCTTATGGCTTTTTGGTGGCTGCTGGCCTCTCTGGCCAATCTGGCACTGCCTCCTACCATCAATCTGCTGGGCGAGCTGAGCGTGCTGGTCACCACATTCAGCTGGTCCAATATCACCCTGCTGCTCACCGGCCTGAACATGCTGGTTACAGCCCTGTACTCCCTGTACATGTTCACCACCACACAGTGGGGAAGCCTGACACACCACATCAACAATATGAAGCCCAGCTTCACCCGCGAGAACACCCTGATGTTCATGCATCTGAGCCCCATTCTGCTGCTGTCCCTGAATCCTGATATCATCACCGGCTTCTCCAGCTGA(SEQ ID NO.:1)

融合核酸

本发明还提供了一种融合核酸，其包含所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸。

如本文所用，“融合核酸”指由两个或两个以上不同来源的核苷酸序列连接而成的核酸，或者由同一来源但其天然位置并不互相连接的两个或两个以上核苷酸序列连接而成的核酸。本发明的融合核酸所编码的蛋白称作融合蛋白，在本发明中即ND4优化蛋白。

优选地，所述融合核酸在所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸可操作性地连接有线粒体靶向肽的编码序列和/或UTR序列。优选地，当所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸连接了线粒体靶向肽的编码序列时，所述线粒体靶向肽的编码序列为如SEQ ID NO.:2所示的COX10基因的线粒体靶向肽的编码序列(简称COX10序列)，或如SEQ IDNO.:3所示的OPA1序列；当所述的编码ND4蛋白的核酸连接了UTR序列时，所述UTR序列如SEQID NO.:4或SEQ ID NO.:11所示。

ATGGCCGCCTCTCCACACACACTGAGTAGCAGACTGCTGACCGGCTGTGTTGGCGGCTCTGTGTGGTATCTGGAACGGCGGACA(SEQ ID NO.:2)

GTGCTGCCCGCCTAGAAAGGGTGAAGTGGTTGTTTCCGTGACGGACTGAGTACGGGTGCCTGTCAGGCTCTTGCGGAAGTCCATGCGCCATTGGGAGGGCCTCGGCCGCGGCTCTGTGCCCTTGCTGCTGAGGGCCACTTCCTGGGTCATTCCTGGACCGGGAGCCGGGCTGGGGCTCACACGGGGGCTCCCGCGTGGCCGTCTCGGCGCCTGCGTGACCTCCCCGCCGGCGGGATGTGGCGACTACGTCGGGCCGCTGTGGCCTG(SEQ ID NO.:3)

GAGCACTGGGACGCCCACCGCCCCTTTCCCTCCGCTGCCAGGCGAGCATGTTGTGGTAATTCTGGAACACAAGAAGAGAAATTGCTGGGTTTAGAACAAGATTATAAACGAATTCGGTGCTCAGTGATCACTTGACAGTTTTTTTTTTTTTTAAATATTACCCAAAATGCTCCCCAAATAAGAAATGCATCAGCTCAGTCAGTGAATACAAAAAAGGAATTATTTTTCCCTTTGAGGGTCTTTTATACATCTCTCCTCCAACCCCACCCTCTATTCTGTTTCTTCCTCCTCACATGGGGGTACACATACACAGCTTCCTCTTTTGGTTCCATCCTTACCACCACACCACACGCACACTCCACATGCCCAGCAGAGTGGCACTTGGTGGCCAGAAAGTGTGAGCCTCATGATCTGCTGTCTGTAGTTCTGTGAGCTCAGGTCCCTCAAAGGCCTCGGAGCACCCCCTTCCTTGTGACTGAGCCAGGGCCTGCATTTTTGGTTTTCCCCACCCCACACATTCTCAACCATAGTCCTTCTAACAATACCAATAGCTAGGACCCGGCTGCTGTGCACTGGGACTGGGGATTCCACATGTTTGCCTTGGGAGTCTCAAGCTGGACTGCCAGCCCCTGTCCTCCCTTCACCCCCATTGCGTATGAGCATTTCAGAACTCCAAGGAGTCACAGGCATCTTTATAGTTCACGTTAACATATAGACACTGTTGGAAGCAGTTCCTTCTAAAAGGGTAGCCCTGGACTTAATACCAGCCGGATACCTCTGGCCCCCACCCCATTACTGTACCTCTGGAGTCACTACTGTGGGTCGCCACTCCTCTGCTACACAGCACGGCTTTTTCAAGGCTGTATTGAGAAGGGAAGTTAGGAAGAAGGGTGTGCTGGGCTAACCAGCCCACAGAGCTCACATTCCTGTCCCTTGGGTGAAAAATACATGTCCATCCTGATATCTCCTGAATTCAGAAATTAGCCTCCACATGTGCAATGGCTTTAAGAGCCAGAAGCAGGGTTCTGGGAATTTTGCAAGTTACCTGTGGCCAGGTGTGGTCTCGGTTACCAAATACGGTTACCTGCAGCTTTTTAGTCCTTTGTGCTCCCACGGGTCTACAGAGTCCCATCTGCCCAAAGGTCTTGAAGCTTGACAGGATGTTTTCGATTACTCAGTCTCCCAGGGCACTACTGGTCCGTAGGATTCGATTGGTCGGGGTAGGAGAGTTAAACAACATTTAAACAGAGTTCTCTCAAAAATGTCTAAAGGGATTGTAGGTAGATAACATCCAATCACTGTTTGCACTTATCTGAAATCTTCCCTCTTGGCTGCCCCCAGGTATTTACTGTGGAGAACATTGCATAGGAATGTCTGGAAAAAGCTTCTACAACTTGTTACAGCCTTCACATTTGTAGAAGCTTT(SEQ ID NO.:4)

GAGCACTGGGACGCCCACCGCCCCTTTCCCTCCGCTGCCAGGCGAGCATGTTGTGGTAATTCTGGAACACAAGAAGAGAAATTGCTGGGTTTAGAACAAGATTATAAACGAATTCGGTGCTCAGTGATCACTTGACAGTTTTTTTTTTTTTTAAATATTACCCAAAATGCTCCCCAAATAAGAAATGCATCAGCTCAGTCAGTGAATACAAAAAAGGAATTATTTTTCCCTTTGAGGGTCTTTTATACATCTCTCCTCCAACCCCACCCTCTATTCTGTTTCTTCCTCCTCACATGGGGGTACACATACACAGCTTCCTCTTTTGGTTCCATCCTTACCACCACACCACACGCACACTCCACATGCCCAGCAGAGTGGCACTTGGTGGCCAGAAAGTGTGAGCCTCATGATCTGCTGTCTGTAGTTCTGTGAGCTCAGGTCCCTCAAAGGCCTCGGAGCACCCCCTTCCTTGTGACTGAGCCAGGGCCTGCATTTTTGGTTTTCCCCACCCCACACATTCTCAACCATAGTCCTTCTAACAATACCAATAGCTAGGACCCGGCTGCTGTGCACTGGGACTGGGGATTCCACATGTTTGCCTTGGGAGTCTCAAGCTGGACTGCCA(SEQ ID NO.:11)

在另一优选例中，在所述融合核酸中，所述COX10的编码序列、所述编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸、所述UTR序列由5’端至3’端依次排列。

在另一优选例中，所述融合核酸的序列如SEQ ID NO.:5所示。具体地，所述融合核酸的核苷酸序列其全长为2889bp，自1bp至84bp位置为优化的COX10序列(共84bp)；85bp至1464bp位置为优化ND4基因，即所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸(共1380bp)，1465bp至2889bp位置为UTR序列(共1425bp，又称3’UTR)。COX10序列引导ND4蛋白进入到线粒体中，发挥其生理功能；3’UTR是非编码序列，设计在ND4蛋白的后面，其作用是稳定线粒体靶向肽的编码序列和ND4的表达。其中，优化的COX10+ND4和未优化的COX10+ND4序列的同源性为75.89％。

ATGGCCGCCTCTCCACACACACTGAGTAGCAGACTGCTGACCGGCTGTGTTGGCGGCTCTGTGTGGTATCTGGAACGGCGGACAATGCTGAAGCTGATCGTGCCCACCATCATGCTGCTGCCTCTGACCTGGCTGAGCAAGAAACACATGATCTGGATCAACACCACCACGCACAGCCTGATCATCAGCATCATCCCTCTGCTGTTCTTCAACCAGATCAACAACAACCTGTTCAGCTGCAGCCCCACCTTCAGCAGCGACCCTCTGACAACACCTCTGCTGATGCTGACCACCTGGCTGCTGCCCCTCACAATCATGGCCTCTCAGAGACACCTGAGCAGCGAGCCCCTGAGCCGGAAGAAACTGTACCTGAGCATGCTGATCTCCCTGCAGATCTCTCTGATCATGACCTTCACCGCCACCGAGCTGATCATGTTCTACATCTTTTTCGAGACAACGCTGATCCCCACACTGGCCATCATCACCAGATGGGGCAACCAGCCTGAGAGACTGAACGCCGGCACCTACTTTCTGTTCTACACCCTCGTGGGCAGCCTGCCACTGCTGATTGCCCTGATCTACACCCACAACACCCTGGGCTCCCTGAACATCCTGCTGCTGACACTGACAGCCCAAGAGCTGAGCAACAGCTGGGCCAACAATCTGATGTGGCTGGCCTACACAATGGCCTTCATGGTCAAGATGCCCCTGTACGGCCTGCACCTGTGGCTGCCTAAAGCTCATGTGGAAGCCCCTATCGCCGGCTCTATGGTGCTGGCTGCAGTGCTGCTGAAACTCGGCGGCTACGGCATGATGCGGCTGACCCTGATTCTGAATCCCCTGACCAAGCACATGGCCTATCCATTTCTGGTGCTGAGCCTGTGGGGCATGATTATGACCAGCAGCATCTGCCTGCGGCAGACCGATCTGAAGTCCCTGATCGCCTACAGCTCCATCAGCCACATGGCCCTGGTGGTCACCGCCATCCTGATTCAGACCCCTTGGAGCTTTACAGGCGCCGTGATCCTGATGATTGCCCACGGCCTGACAAGCAGCCTGCTGTTTTGTCTGGCCAACAGCAACTACGAGCGGACCCACAGCAGAATCATGATCCTGTCTCAGGGCCTGCAGACCCTCCTGCCTCTTATGGCTTTTTGGTGGCTGCTGGCCTCTCTGGCCAATCTGGCACTGCCTCCTACCATCAATCTGCTGGGCGAGCTGAGCGTGCTGGTCACCACATTCAGCTGGTCCAATATCACCCTGCTGCTCACCGGCCTGAACATGCTGGTTACAGCCCTGTACTCCCTGTACATGTTCACCACCACACAGTGGGGAAGCCTGACACACCACATCAACAATATGAAGCCCAGCTTCACCCGCGAGAACACCCTGATGTTCATGCATCTGAGCCCCATTCTGCTGCTGTCCCTGAATCCTGATATCATCACCGGCTTCTCCAGCTGAGAGCACTGGGACGCCCACCGCCCCTTTCCCTCCGCTGCCAGGCGAGCATGTTGTGGTAATTCTGGAACACAAGAAGAGAAATTGCTGGGTTTAGAACAAGATTATAAACGAATTCGGTGCTCAGTGATCACTTGACAGTTTTTTTTTTTTTTAAATATTACCCAAAATGCTCCCCAAATAAGAAATGCATCAGCTCAGTCAGTGAATACAAAAAAGGAATTATTTTTCCCTTTGAGGGTCTTTTATACATCTCTCCTCCAACCCCACCCTCTATTCTGTTTCTTCCTCCTCACATGGGGGTACACATACACAGCTTCCTCTTTTGGTTCCATCCTTACCACCACACCACACGCACACTCCACATGCCCAGCAGAGTGGCACTTGGTGGCCAGAAAGTGTGAGCCTCATGATCTGCTGTCTGTAGTTCTGTGAGCTCAGGTCCCTCAAAGGCCTCGGAGCACCCCCTTCCTTGTGACTGAGCCAGGGCCTGCATTTTTGGTTTTCCCCACCCCACACATTCTCAACCATAGTCCTTCTAACAATACCAATAGCTAGGACCCGGCTGCTGTGCACTGGGACTGGGGATTCCACATGTTTGCCTTGGGAGTCTCAAGCTGGACTGCCAGCCCCTGTCCTCCCTTCACCCCCATTGCGTATGAGCATTTCAGAACTCCAAGGAGTCACAGGCATCTTTATAGTTCACGTTAACATATAGACACTGTTGGAAGCAGTTCCTTCTAAAAGGGTAGCCCTGGACTTAATACCAGCCGGATACCTCTGGCCCCCACCCCATTACTGTACCTCTGGAGTCACTACTGTGGGTCGCCACTCCTCTGCTACACAGCACGGCTTTTTCAAGGCTGTATTGAGAAGGGAAGTTAGGAAGAAGGGTGTGCTGGGCTAACCAGCCCACAGAGCTCACATTCCTGTCCCTTGGGTGAAAAATACATGTCCATCCTGATATCTCCTGAATTCAGAAATTAGCCTCCACATGTGCAATGGCTTTAAGAGCCAGAAGCAGGGTTCTGGGAATTTTGCAAGTTACCTGTGGCCAGGTGTGGTCTCGGTTACCAAATACGGTTACCTGCAGCTTTTTAGTCCTTTGTGCTCCCACGGGTCTACAGAGTCCCATCTGCCCAAAGGTCTTGAAGCTTGACAGGATGTTTTCGATTACTCAGTCTCCCAGGGCACTACTGGTCCGTAGGATTCGATTGGTCGGGGTAGGAGAGTTAAACAACATTTAAACAGAGTTCTCTCAAAAATGTCTAAAGGGATTGTAGGTAGATAACATCCAATCACTGTTTGCACTTATCTGAAATCTTCCCTCTTGGCTGCCCCCAGGTATTTACTGTGGAGAACATTGCATAGGAATGTCTGGAAAAAGCTTCTACAACTTGTTACAGCCTTCACATTTGTAGAAGCTTT(SEQ ID NO.:5)

在另一优选例中，所述融合核酸的序列如SEQ ID NO.:10所示。

GTGCTGCCCGCCTAGAAAGGGTGAAGTGGTTGTTTCCGTGACGGACTGAGTACGGGTGCCTGTCAGGCTCTTGCGGAAGTCCATGCGCCATTGGGAGGGCCTCGGCCGCGGCTCTGTGCCCTTGCTGCTGAGGGCCACTTCCTGGGTCATTCCTGGACCGGGAGCCGGGCTGGGGCTCACACGGGGGCTCCCGCGTGGCCGTCTCGGCGCCTGCGTGACCTCCCCGCCGGCGGGATGTGGCGACTACGTCGGGCCGCTGTGGCCTGATGCTGAAGCTGATCGTGCCCACCATCATGCTGCTGCCTCTGACCTGGCTGAGCAAGAAACACATGATCTGGATCAACACCACCACGCACAGCCTGATCATCAGCATCATCCCTCTGCTGTTCTTCAACCAGATCAACAACAACCTGTTCAGCTGCAGCCCCACCTTCAGCAGCGACCCTCTGACAACACCTCTGCTGATGCTGACCACCTGGCTGCTGCCCCTCACAATCATGGCCTCTCAGAGACACCTGAGCAGCGAGCCCCTGAGCCGGAAGAAACTGTACCTGAGCATGCTGATCTCCCTGCAGATCTCTCTGATCATGACCTTCACCGCCACCGAGCTGATCATGTTCTACATCTTTTTCGAGACAACGCTGATCCCCACACTGGCCATCATCACCAGATGGGGCAACCAGCCTGAGAGACTGAACGCCGGCACCTACTTTCTGTTCTACACCCTCGTGGGCAGCCTGCCACTGCTGATTGCCCTGATCTACACCCACAACACCCTGGGCTCCCTGAACATCCTGCTGCTGACACTGACAGCCCAAGAGCTGAGCAACAGCTGGGCCAACAATCTGATGTGGCTGGCCTACACAATGGCCTTCATGGTCAAGATGCCCCTGTACGGCCTGCACCTGTGGCTGCCTAAAGCTCATGTGGAAGCCCCTATCGCCGGCTCTATGGTGCTGGCTGCAGTGCTGCTGAAACTCGGCGGCTACGGCATGATGCGGCTGACCCTGATTCTGAATCCCCTGACCAAGCACATGGCCTATCCATTTCTGGTGCTGAGCCTGTGGGGCATGATTATGACCAGCAGCATCTGCCTGCGGCAGACCGATCTGAAGTCCCTGATCGCCTACAGCTCCATCAGCCACATGGCCCTGGTGGTCACCGCCATCCTGATTCAGACCCCTTGGAGCTTTACAGGCGCCGTGATCCTGATGATTGCCCACGGCCTGACAAGCAGCCTGCTGTTTTGTCTGGCCAACAGCAACTACGAGCGGACCCACAGCAGAATCATGATCCTGTCTCAGGGCCTGCAGACCCTCCTGCCTCTTATGGCTTTTTGGTGGCTGCTGGCCTCTCTGGCCAATCTGGCACTGCCTCCTACCATCAATCTGCTGGGCGAGCTGAGCGTGCTGGTCACCACATTCAGCTGGTCCAATATCACCCTGCTGCTCACCGGCCTGAACATGCTGGTTACAGCCCTGTACTCCCTGTACATGTTCACCACCACACAGTGGGGAAGCCTGACACACCACATCAACAATATGAAGCCCAGCTTCACCCGCGAGAACACCCTGATGTTCATGCATCTGAGCCCCATTCTGCTGCTGTCCCTGAATCCTGATATCATCACCGGCTTCTCCAGCTGAGAGCACTGGGACGCCCACCGCCCCTTTCCCTCCGCTGCCAGGCGAGCATGTTGTGGTAATTCTGGAACACAAGAAGAGAAATTGCTGGGTTTAGAACAAGATTATAAACGAATTCGGTGCTCAGTGATCACTTGACAGTTTTTTTTTTTTTTAAATATTACCCAAAATGCTCCCCAAATAAGAAATGCATCAGCTCAGTCAGTGAATACAAAAAAGGAATTATTTTTCCCTTTGAGGGTCTTTTATACATCTCTCCTCCAACCCCACCCTCTATTCTGTTTCTTCCTCCTCACATGGGGGTACACATACACAGCTTCCTCTTTTGGTTCCATCCTTACCACCACACCACACGCACACTCCACATGCCCAGCAGAGTGGCACTTGGTGGCCAGAAAGTGTGAGCCTCATGATCTGCTGTCTGTAGTTCTGTGAGCTCAGGTCCCTCAAAGGCCTCGGAGCACCCCCTTCCTTGTGACTGAGCCAGGGCCTGCATTTTTGGTTTTCCCCACCCCACACATTCTCAACCATAGTCCTTCTAACAATACCAATAGCTAGGACCCGGCTGCTGTGCACTGGGACTGGGGATTCCACATGTTTGCCTTGGGAGTCTCAAGCTGGACTGCCA(SEQ ID NO.:10)

表达载体和宿主细胞

本发明还提供了一种用于ND4蛋白的表达载体，它含有本发明的优化ND4编码序列。

通过提供的序列信息，熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的核酸序列或载体。

优选地，编码ND4蛋白的核酸序列作为载体，优选地表达载体被提供。优选地，其可作为优选地适用于在视网膜靶细胞中转导和表达的基因治疗载体被提供。载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体:腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。优选地，病毒载体是复制缺陷的(replicationdefective)，尽管设想其可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶视网膜细胞的基因组。用于向视网膜靶细胞引入编码ND4蛋白的核酸序列的优选的病毒载体是AAV载体，例如自身互补的腺相关病毒(scAAV)。使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8载体)可以实现选择性靶向。

病毒载体可被修饰以缺失任何非必需的序列。例如，AAV中，病毒可被修饰以缺失全部或部分的IX基因、Ela和/或Elb基因。对于野生型AAV，没有辅助病毒诸如腺病毒的存在，复制是非常低效率的。对于重组的腺相关病毒，优选地，复制基因和衣壳基因以反式被提供(在pRep/Cap质粒中)，并且仅AAV基因组的2ITR被保留并且包装进入病毒体，同时需要的腺病毒基因被被腺病毒或另一个质粒提供。也可对慢病毒载体做出类似的修饰。

病毒载体具有进入细胞的能力。然而，非病毒载体诸如质粒可与剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类剂包括聚阳离子剂。可选地，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用，并且优选地适于在人类中使用。

载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在视网膜靶细胞中的表达。

“可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。

启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导在内视网膜细胞中遍在的表达，或神经元特异的表达。在后一种情况中，启动子可以指导细胞类型特异的表达，例如对给视神经节细胞。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如，合适的启动子可以选自由以下组成的组:L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。使用细胞特异的启动子可以实现靶向，例如Grm6-SV40用于选择性靶向给视神经细胞。Grm6启动子是Grm6基因的200碱基对增强子序列和SV40真核启动予的融合体，Grm6基因编码给视神经细胞特异的代谢型谷氨酸受体mGluR6。Grm6基因的优选的来源是小鼠和人类。使用泛-神经元的启动子可以实现遍在的表达，其实例在本领域是己知的并且可得的。一个此类实例是CAG。CAG启动于是CMV早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子的融合体。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

许多表达载体可应用ND4蛋白在哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)表达。本发明优选用腺相关病毒作为表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，用于表达ND4蛋白。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)，提高ND4蛋白的表达量。

制剂和组合物

本发明提供一种制剂或组合物，所述制剂或组合物含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病。

本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的载体(vector)，例如病毒载体(包括腺相关病毒载体)。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗眼部疾病。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。

在本发明中，所述载体可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，优选地，载体作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如

)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明提供的编码ND4的核酸或融合核酸，可以体外或体内生产ND4蛋白或ND4融合蛋白，所述融合蛋白或者含所述融合蛋白的制剂可应用于制备治疗Leber遗传性视神经病变的药物。

经优化的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸表达量更高，从而翻译出更多的ND4融合蛋白，而COX10序列可以准确地将ND4融合蛋白定位到线粒体内膜上，因此有更多的ND4蛋白转染到在线粒体中。将含有COX10-优化ND4融合核酸的药剂注入兔眼玻璃体腔中，该药剂在玻璃体腔内保持活力，并转染到视神经细胞。优化ND4核酸编码比现有技术更多的ND4蛋白，其转染效率更高，能较好地治疗Leber遗传性视神经病变。

与现有技术相比，本发明主要具有以下优点：

1.本发明重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白(ND4)编码基因序列进行了特殊优化。与ND4的未优化的DNA编码序列相比，转录效率和翻译效率显著提高。优化后的序列ND4蛋白表达量显著提高、生物活性高。

2.本发明优化后的COX10序列或OPA1序列可以准确地将ND4融合蛋白定位到线粒体内膜上，因此有更多的ND4蛋白转染到在线粒体中。

3.本发明优化的ND4编码基因(SEQ ID NO.:1)或融合核酸能够非常有效地治疗Leber遗传性视神经病变，并且安全性好。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实验器材

凝胶成像系统：Gene Genius公司；TaqDNA聚合酶：生工生物工程(上海)有限公司；Marker：生工生物工程(上海)有限公司；6×DNA Loading Dye：生工生物工程(上海)有限公司；PCR产物纯化回收试剂盒：生工生物工程(上海)有限公司；KpnI/SalI酶：生工生物工程(上海)有限公司；Lipofectamine 2000试剂盒：美国Invitrogen公司。

实施例1质粒的构建和重组腺相关病毒的制备

1.1质粒制备：获取人的ND4核苷酸序列后(美国国家生物技术信息中心参考序列：yp_003024035.1)，本发明改变了COX10的线粒体编码序列为核酸编码序列(如SEQ ID NO：2所示)且进行ND4核苷酸序列优化(如SEQ ID NO：1所示，在本发明中简称优化ND4基因/核酸)，此序列是经过特殊优化，转录效率和翻译效率显著提高，优化的COX10+ND4和未优化的COX10+ND4序列的同源性为75.89％。并在优化ND4基因的3’端连接UTR序列(如SEQ ID NO：4所示)，其融合基因(或称融合核酸)的序列如SEQ ID NO.:5所示，由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。通过PCR扩增全长基因(图2)，通过EcoRI/SalI酶切在融合基因上形成粘性末端，并将融合基因嵌入有EcoRI/SalI酶切位点的腺相关病毒载体pSNaV，即pSNaV/rAAV2/2-优化ND4(以下简称为pAAV2-优化ND4)。重组子的筛选和鉴定步骤同CN 102634527B，简述如下：取37℃培养后的LB平板，出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有Amp 100mg/L的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养8h。培养好后取菌液，提取质粒，质粒提取步骤参照Biomiga说明书，使用EcoRI/SalI酶切鉴定。对照pSNaV/rAAV2/2-ND4(以下简称为pAAV2-ND4)制备参见CN 102634527 B。

1.2细胞转染：转染前一天，将HEK293细胞接种于225cm²细胞培养瓶中，接种密度3.0×10⁷个/mL细胞，培养基为DMEM+10％牛血清，置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜。转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染pAAV2-ND4和pAAV2-优化ND4(具体转染步骤参见CN 102634527B实施例1)。转染48h后，收取细胞。

1.3重组腺相关病毒的收集、浓缩与纯化：

1.3.1病毒的收集：1)准备干冰乙醇浴(或液氮)和37℃水浴；2)将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中；3)1000rpm/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1ml PBS重悬；4)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移，冻融四次，冻和融各10分钟，每次融解后稍加震荡。

1.3.2病毒的浓缩：1)10,000g离心去除细胞碎片，将离心上清转移到一个新离心管中；2)用0.45μm滤器过滤除杂质；3)加入各1/2体积的1M NaCl、10％PEG8000溶液，混合均匀，4℃过夜；4)12,000rpm离心2h，弃上清，病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解，待完全溶解后用0.22μm滤器过滤除菌；5)加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA(终浓度为50U/ml)。合上管盖，颠倒几次以充分混合。在37℃孵育30分钟；6)用0.45μm过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的rAAV2病毒。

1.3.3病毒的纯化：1)向病毒浓缩液中添加固体CsCl直到密度为1.41g/ml(折射率为1.372)；2)将样品加入到超速离心管中，用预先配好的1.41g/ml CsCl溶液将离心管剩余空间填满；3)在175,000g下离心24小时，以形成密度梯度。按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行滴度测定。收集富集有rAAV2颗粒的组分；4)重复上述过程一次。将病毒装入100kDa的透析袋，4℃透析脱盐过夜。

至此，获得浓缩和纯化的重组腺相关病毒rAAV2-ND4和rAAV2-优化ND4。

如本领域技术人员所知，除COX10以外，OPA1(序列如SEQ ID NO.:3所示)也可与本发明的优化ND4基因融合，线粒体靶向肽的编码序列OPA1可将优化ND4基因表达的蛋白带入到线粒体内膜上，从而实现蛋白的线粒体靶向表达。

实施例2兔眼玻璃体腔注射rAAV2实验

取12只兔子平分为2组，分别用病毒液rAAV2-ND4和rAAV2-优化ND4(1×10¹⁰vg/0.05mL)在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射后进行裂隙灯、眼底照相检查，注射30天，各组分别进行RT-PCR检测和免疫印迹。

实施例3RT-PCR检测ND4的表达

分别提取转染rAAV2-ND4和rAAV2-优化-ND4的兔视神经细胞的RNA、反转录，利用TRIZOL试剂盒提取总RNA并反转录合成cDNA模板。用NCBI的保守结构域分析软件分析ND4的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物：

β-actin-S：CGAGATCGTGCGGGACAT(SEQ ID NO.:6)；

β-actin-A：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC(SEQ ID NO.:7)；

ND4-S：CTGCCTACGACAAACAGAC(SEQ ID NO.:8)；

ND4-A：AGTGCGTTCGTAGTTTGAG(SEQ ID NO.:9)；

荧光定量PCR的反应体系和反应程序：

在Real-time PCR Detection System仪器上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix12.5μL、ddH₂O₈μL、引物各1μL，cDNA样品2.5μL，总体系25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因β-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行荧光定量PCR。

按照95℃预变性1s，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。

采用相对定量方法研究基因表达量的差异，以β-actin为内参基因。

结果如图3所示，在mRNA水平，未优化的rAAV2-ND4组和经优化的rAAV2-优化ND4组的mRNA相对表达量分别为0.42±0.23和0.57±0.62，两组比较有显著性差异(p＜0.05，图3)。该结果出乎意料地表明，本发明的经优化的ND4的编码核苷酸序列(SEQ ID NO.:5的第85-1464位)和相应的融合核酸(SEQ ID NO.:5的第1-2889位)，居然意外地提高了转录效率，从而使得rAAV2-优化ND4组基因水平上表达明显比rAAV2-ND4组提高，提高幅度为约36％。该结果表明，在转录效率方面，rAAV2-优化ND4组的转录效率显著更高。

实施例4免疫印迹检测ND4的表达

分别提取转染rAAV2-ND4和rAAV2-优化-ND4的兔神经细胞的线粒体ND4蛋白，然后进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，点转移到聚偏氟膜上(Bio-Rad,Her-cules,CA,USA)，用于免疫检测，以β-actin为内参基因，用自动图像分析仪器(Li-Cor；Lincoln,NE,USA)对薄膜上条带进行观察分析，各蛋白带的积分光密度用归一化法积分，得到相同的样本对应的光学密度值，统计分析采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。

结果如图4所示。线粒体ND4蛋白表达分析rAAV2-ND4组的平均表达值0.32±0.11，而rAAV2-优化ND4组的平均表达值是0.68±0.20，rAAV2-优化ND4组的提高幅度为约112％，两组比较有显著性差异(p＜0.01，图4)。rAAV2-优化ND4组的蛋白水平上表达明显比未优化组提高，这表明，在翻译效率方面，本发明的经优化的ND4的编码核苷酸序列(SEQ ID NO.:5的第85-1464位)和相应的融合核酸(SEQ ID NO.:5的第1-2889位)的翻译效率更高。

实施例5兔子眼压和眼底照相

2组兔子分别于术后1、3、7、30天进行裂隙灯、眼压的检查。所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示参见图5，其中图5A为注射rAAV2-ND4的眼底照相结果，图5B为注射rAAV2-优化ND4的眼底照相结果。由图可见，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害。表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症，是安全的。

实施例6临床试验

2011到2012年进行9例临床试验，患者单眼玻璃体腔注射1×10¹⁰vg/0.05mLrAAV2-ND4作为对照组，2017年到2018年1月进行20例临床试验，患者单眼玻璃体腔注射1×10¹⁰vg/0.05mL rAAV2-优化ND4作为实验组，观察两组的临床疗效，采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。

两组临床疗效比较如表1，实验组视力最快提高时间为1个月，明显快于对照组的3个月，两组比较有显著性差异(p＜0.01)；实验组最佳视力恢复1.0，明显高于对照组的0.8，两组比较有显著性差异(p＜0.01)；实验组平均视力恢复0.582±0.086，明显高于对照组的0.344±0.062，两组比较有显著性差异(p＜0.01)。其中，rAAV2-优化ND4组治疗前后的眼底照相见图6，总体上对照组和实验组均无任何并发症发生，安全性非常好。

表1两次基因治疗LHON情况比较

实施例7

将序列如SEQ ID NO.:5中的COX10序列(第1-84位)替换为OPA1线粒体靶向肽序列(SEQ ID NO.:3)，第1465-2889位替换为如SEQ ID NO.:11所示的UTR序列，得到结构为OPA1-ND4-UTR的融合核酸，序列如SEQ ID NO.:10所示。

实验方法同实施例1-6，将其中SEQ ID NO.:5所示的融合核酸替换为本实施例SEQID NO.:10所示的融合核酸。结果发现，相比未优化的ND4编码序列，本发明的经优化的ND4的编码核苷酸序列(SEQ ID NO.:10的第267-1646位)和相应的融合核酸(SEQ ID NO.:10的第1-2271位)的ND4转录效率和翻译效率均显著提高，表达量也明显更高,能够有效地治疗Leber遗传性视神经病变，并且安全性好。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核酸及其应用

<130> P2018-1204

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1380

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atgctgaagc tgatcgtgcc caccatcatg ctgctgcctc tgacctggct gagcaagaaa 60

cacatgatct ggatcaacac caccacgcac agcctgatca tcagcatcat ccctctgctg 120

ttcttcaacc agatcaacaa caacctgttc agctgcagcc ccaccttcag cagcgaccct 180

ctgacaacac ctctgctgat gctgaccacc tggctgctgc ccctcacaat catggcctct 240

cagagacacc tgagcagcga gcccctgagc cggaagaaac tgtacctgag catgctgatc 300

tccctgcaga tctctctgat catgaccttc accgccaccg agctgatcat gttctacatc 360

tttttcgaga caacgctgat ccccacactg gccatcatca ccagatgggg caaccagcct 420

gagagactga acgccggcac ctactttctg ttctacaccc tcgtgggcag cctgccactg 480

ctgattgccc tgatctacac ccacaacacc ctgggctccc tgaacatcct gctgctgaca 540

ctgacagccc aagagctgag caacagctgg gccaacaatc tgatgtggct ggcctacaca 600

atggccttca tggtcaagat gcccctgtac ggcctgcacc tgtggctgcc taaagctcat 660

gtggaagccc ctatcgccgg ctctatggtg ctggctgcag tgctgctgaa actcggcggc 720

tacggcatga tgcggctgac cctgattctg aatcccctga ccaagcacat ggcctatcca 780

tttctggtgc tgagcctgtg gggcatgatt atgaccagca gcatctgcct gcggcagacc 840

gatctgaagt ccctgatcgc ctacagctcc atcagccaca tggccctggt ggtcaccgcc 900

atcctgattc agaccccttg gagctttaca ggcgccgtga tcctgatgat tgcccacggc 960

ctgacaagca gcctgctgtt ttgtctggcc aacagcaact acgagcggac ccacagcaga 1020

atcatgatcc tgtctcaggg cctgcagacc ctcctgcctc ttatggcttt ttggtggctg 1080

ctggcctctc tggccaatct ggcactgcct cctaccatca atctgctggg cgagctgagc 1140

gtgctggtca ccacattcag ctggtccaat atcaccctgc tgctcaccgg cctgaacatg 1200

ctggttacag ccctgtactc cctgtacatg ttcaccacca cacagtgggg aagcctgaca 1260

caccacatca acaatatgaa gcccagcttc acccgcgaga acaccctgat gttcatgcat 1320

ctgagcccca ttctgctgct gtccctgaat cctgatatca tcaccggctt ctccagctga 1380

<210> 2

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atggccgcct ctccacacac actgagtagc agactgctga ccggctgtgt tggcggctct 60

gtgtggtatc tggaacggcg gaca 84

<210> 3

<211> 266

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

gtgctgcccg cctagaaagg gtgaagtggt tgtttccgtg acggactgag tacgggtgcc 60

tgtcaggctc ttgcggaagt ccatgcgcca ttgggagggc ctcggccgcg gctctgtgcc 120

cttgctgctg agggccactt cctgggtcat tcctggaccg ggagccgggc tggggctcac 180

acgggggctc ccgcgtggcc gtctcggcgc ctgcgtgacc tccccgccgg cgggatgtgg 240

cgactacgtc gggccgctgt ggcctg 266

<210> 4

<211> 1425

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

gagcactggg acgcccaccg cccctttccc tccgctgcca ggcgagcatg ttgtggtaat 60

tctggaacac aagaagagaa attgctgggt ttagaacaag attataaacg aattcggtgc 120

tcagtgatca cttgacagtt tttttttttt ttaaatatta cccaaaatgc tccccaaata 180

agaaatgcat cagctcagtc agtgaataca aaaaaggaat tatttttccc tttgagggtc 240

ttttatacat ctctcctcca accccaccct ctattctgtt tcttcctcct cacatggggg 300

tacacataca cagcttcctc ttttggttcc atccttacca ccacaccaca cgcacactcc 360

acatgcccag cagagtggca cttggtggcc agaaagtgtg agcctcatga tctgctgtct 420

gtagttctgt gagctcaggt ccctcaaagg cctcggagca cccccttcct tgtgactgag 480

ccagggcctg catttttggt tttccccacc ccacacattc tcaaccatag tccttctaac 540

aataccaata gctaggaccc ggctgctgtg cactgggact ggggattcca catgtttgcc 600

ttgggagtct caagctggac tgccagcccc tgtcctccct tcacccccat tgcgtatgag 660

catttcagaa ctccaaggag tcacaggcat ctttatagtt cacgttaaca tatagacact 720

gttggaagca gttccttcta aaagggtagc cctggactta ataccagccg gatacctctg 780

gcccccaccc cattactgta cctctggagt cactactgtg ggtcgccact cctctgctac 840

acagcacggc tttttcaagg ctgtattgag aagggaagtt aggaagaagg gtgtgctggg 900

ctaaccagcc cacagagctc acattcctgt cccttgggtg aaaaatacat gtccatcctg 960

atatctcctg aattcagaaa ttagcctcca catgtgcaat ggctttaaga gccagaagca 1020

gggttctggg aattttgcaa gttacctgtg gccaggtgtg gtctcggtta ccaaatacgg 1080

ttacctgcag ctttttagtc ctttgtgctc ccacgggtct acagagtccc atctgcccaa 1140

aggtcttgaa gcttgacagg atgttttcga ttactcagtc tcccagggca ctactggtcc 1200

gtaggattcg attggtcggg gtaggagagt taaacaacat ttaaacagag ttctctcaaa 1260

aatgtctaaa gggattgtag gtagataaca tccaatcact gtttgcactt atctgaaatc 1320

ttccctcttg gctgccccca ggtatttact gtggagaaca ttgcatagga atgtctggaa 1380

aaagcttcta caacttgtta cagccttcac atttgtagaa gcttt 1425

<210> 5

<211> 2889

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

atggccgcct ctccacacac actgagtagc agactgctga ccggctgtgt tggcggctct 60

gtgtggtatc tggaacggcg gacaatgctg aagctgatcg tgcccaccat catgctgctg 120

cctctgacct ggctgagcaa gaaacacatg atctggatca acaccaccac gcacagcctg 180

atcatcagca tcatccctct gctgttcttc aaccagatca acaacaacct gttcagctgc 240

agccccacct tcagcagcga ccctctgaca acacctctgc tgatgctgac cacctggctg 300

ctgcccctca caatcatggc ctctcagaga cacctgagca gcgagcccct gagccggaag 360

aaactgtacc tgagcatgct gatctccctg cagatctctc tgatcatgac cttcaccgcc 420

accgagctga tcatgttcta catctttttc gagacaacgc tgatccccac actggccatc 480

atcaccagat ggggcaacca gcctgagaga ctgaacgccg gcacctactt tctgttctac 540

accctcgtgg gcagcctgcc actgctgatt gccctgatct acacccacaa caccctgggc 600

tccctgaaca tcctgctgct gacactgaca gcccaagagc tgagcaacag ctgggccaac 660

aatctgatgt ggctggccta cacaatggcc ttcatggtca agatgcccct gtacggcctg 720

cacctgtggc tgcctaaagc tcatgtggaa gcccctatcg ccggctctat ggtgctggct 780

gcagtgctgc tgaaactcgg cggctacggc atgatgcggc tgaccctgat tctgaatccc 840

ctgaccaagc acatggccta tccatttctg gtgctgagcc tgtggggcat gattatgacc 900

agcagcatct gcctgcggca gaccgatctg aagtccctga tcgcctacag ctccatcagc 960

cacatggccc tggtggtcac cgccatcctg attcagaccc cttggagctt tacaggcgcc 1020

gtgatcctga tgattgccca cggcctgaca agcagcctgc tgttttgtct ggccaacagc 1080

aactacgagc ggacccacag cagaatcatg atcctgtctc agggcctgca gaccctcctg 1140

cctcttatgg ctttttggtg gctgctggcc tctctggcca atctggcact gcctcctacc 1200

atcaatctgc tgggcgagct gagcgtgctg gtcaccacat tcagctggtc caatatcacc 1260

ctgctgctca ccggcctgaa catgctggtt acagccctgt actccctgta catgttcacc 1320

accacacagt ggggaagcct gacacaccac atcaacaata tgaagcccag cttcacccgc 1380

gagaacaccc tgatgttcat gcatctgagc cccattctgc tgctgtccct gaatcctgat 1440

atcatcaccg gcttctccag ctgagagcac tgggacgccc accgcccctt tccctccgct 1500

gccaggcgag catgttgtgg taattctgga acacaagaag agaaattgct gggtttagaa 1560

caagattata aacgaattcg gtgctcagtg atcacttgac agtttttttt ttttttaaat 1620

attacccaaa atgctcccca aataagaaat gcatcagctc agtcagtgaa tacaaaaaag 1680

gaattatttt tccctttgag ggtcttttat acatctctcc tccaacccca ccctctattc 1740

tgtttcttcc tcctcacatg ggggtacaca tacacagctt cctcttttgg ttccatcctt 1800

accaccacac cacacgcaca ctccacatgc ccagcagagt ggcacttggt ggccagaaag 1860

tgtgagcctc atgatctgct gtctgtagtt ctgtgagctc aggtccctca aaggcctcgg 1920

agcaccccct tccttgtgac tgagccaggg cctgcatttt tggttttccc caccccacac 1980

attctcaacc atagtccttc taacaatacc aatagctagg acccggctgc tgtgcactgg 2040

gactggggat tccacatgtt tgccttggga gtctcaagct ggactgccag cccctgtcct 2100

cccttcaccc ccattgcgta tgagcatttc agaactccaa ggagtcacag gcatctttat 2160

agttcacgtt aacatataga cactgttgga agcagttcct tctaaaaggg tagccctgga 2220

cttaatacca gccggatacc tctggccccc accccattac tgtacctctg gagtcactac 2280

tgtgggtcgc cactcctctg ctacacagca cggctttttc aaggctgtat tgagaaggga 2340

agttaggaag aagggtgtgc tgggctaacc agcccacaga gctcacattc ctgtcccttg 2400

ggtgaaaaat acatgtccat cctgatatct cctgaattca gaaattagcc tccacatgtg 2460

caatggcttt aagagccaga agcagggttc tgggaatttt gcaagttacc tgtggccagg 2520

tgtggtctcg gttaccaaat acggttacct gcagcttttt agtcctttgt gctcccacgg 2580

gtctacagag tcccatctgc ccaaaggtct tgaagcttga caggatgttt tcgattactc 2640

agtctcccag ggcactactg gtccgtagga ttcgattggt cggggtagga gagttaaaca 2700

acatttaaac agagttctct caaaaatgtc taaagggatt gtaggtagat aacatccaat 2760

cactgtttgc acttatctga aatcttccct cttggctgcc cccaggtatt tactgtggag 2820

aacattgcat aggaatgtct ggaaaaagct tctacaactt gttacagcct tcacatttgt 2880

agaagcttt 2889

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

cgagatcgtg cgggacat 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

caggaaggag ggctggaac 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

ctgcctacga caaacagac 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

agtgcgttcg tagtttgag 19

<210> 10

<211> 2271

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

gtgctgcccg cctagaaagg gtgaagtggt tgtttccgtg acggactgag tacgggtgcc 60

tgtcaggctc ttgcggaagt ccatgcgcca ttgggagggc ctcggccgcg gctctgtgcc 120

cttgctgctg agggccactt cctgggtcat tcctggaccg ggagccgggc tggggctcac 180

acgggggctc ccgcgtggcc gtctcggcgc ctgcgtgacc tccccgccgg cgggatgtgg 240

cgactacgtc gggccgctgt ggcctgatgc tgaagctgat cgtgcccacc atcatgctgc 300

tgcctctgac ctggctgagc aagaaacaca tgatctggat caacaccacc acgcacagcc 360

tgatcatcag catcatccct ctgctgttct tcaaccagat caacaacaac ctgttcagct 420

gcagccccac cttcagcagc gaccctctga caacacctct gctgatgctg accacctggc 480

tgctgcccct cacaatcatg gcctctcaga gacacctgag cagcgagccc ctgagccgga 540

agaaactgta cctgagcatg ctgatctccc tgcagatctc tctgatcatg accttcaccg 600

ccaccgagct gatcatgttc tacatctttt tcgagacaac gctgatcccc acactggcca 660

tcatcaccag atggggcaac cagcctgaga gactgaacgc cggcacctac tttctgttct 720

acaccctcgt gggcagcctg ccactgctga ttgccctgat ctacacccac aacaccctgg 780

gctccctgaa catcctgctg ctgacactga cagcccaaga gctgagcaac agctgggcca 840

acaatctgat gtggctggcc tacacaatgg ccttcatggt caagatgccc ctgtacggcc 900

tgcacctgtg gctgcctaaa gctcatgtgg aagcccctat cgccggctct atggtgctgg 960

ctgcagtgct gctgaaactc ggcggctacg gcatgatgcg gctgaccctg attctgaatc 1020

ccctgaccaa gcacatggcc tatccatttc tggtgctgag cctgtggggc atgattatga 1080

ccagcagcat ctgcctgcgg cagaccgatc tgaagtccct gatcgcctac agctccatca 1140

gccacatggc cctggtggtc accgccatcc tgattcagac cccttggagc tttacaggcg 1200

ccgtgatcct gatgattgcc cacggcctga caagcagcct gctgttttgt ctggccaaca 1260

gcaactacga gcggacccac agcagaatca tgatcctgtc tcagggcctg cagaccctcc 1320

tgcctcttat ggctttttgg tggctgctgg cctctctggc caatctggca ctgcctccta 1380

ccatcaatct gctgggcgag ctgagcgtgc tggtcaccac attcagctgg tccaatatca 1440

ccctgctgct caccggcctg aacatgctgg ttacagccct gtactccctg tacatgttca 1500

ccaccacaca gtggggaagc ctgacacacc acatcaacaa tatgaagccc agcttcaccc 1560

gcgagaacac cctgatgttc atgcatctga gccccattct gctgctgtcc ctgaatcctg 1620

atatcatcac cggcttctcc agctgagagc actgggacgc ccaccgcccc tttccctccg 1680

ctgccaggcg agcatgttgt ggtaattctg gaacacaaga agagaaattg ctgggtttag 1740

aacaagatta taaacgaatt cggtgctcag tgatcacttg acagtttttt ttttttttaa 1800

atattaccca aaatgctccc caaataagaa atgcatcagc tcagtcagtg aatacaaaaa 1860

aggaattatt tttccctttg agggtctttt atacatctct cctccaaccc caccctctat 1920

tctgtttctt cctcctcaca tgggggtaca catacacagc ttcctctttt ggttccatcc 1980

ttaccaccac accacacgca cactccacat gcccagcaga gtggcacttg gtggccagaa 2040

agtgtgagcc tcatgatctg ctgtctgtag ttctgtgagc tcaggtccct caaaggcctc 2100

ggagcacccc cttccttgtg actgagccag ggcctgcatt tttggttttc cccaccccac 2160

acattctcaa ccatagtcct tctaacaata ccaatagcta ggacccggct gctgtgcact 2220

gggactgggg attccacatg tttgccttgg gagtctcaag ctggactgcc a 2271

<210> 11

<211> 625

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

gagcactggg acgcccaccg cccctttccc tccgctgcca ggcgagcatg ttgtggtaat 60

tctggaacac aagaagagaa attgctgggt ttagaacaag attataaacg aattcggtgc 120

tcagtgatca cttgacagtt tttttttttt ttaaatatta cccaaaatgc tccccaaata 180

agaaatgcat cagctcagtc agtgaataca aaaaaggaat tatttttccc tttgagggtc 240

ttttatacat ctctcctcca accccaccct ctattctgtt tcttcctcct cacatggggg 300

tacacataca cagcttcctc ttttggttcc atccttacca ccacaccaca cgcacactcc 360

acatgcccag cagagtggca cttggtggcc agaaagtgtg agcctcatga tctgctgtct 420

gtagttctgt gagctcaggt ccctcaaagg cctcggagca cccccttcct tgtgactgag 480

ccagggcctg catttttggt tttccccacc ccacacattc tcaaccatag tccttctaac 540

aataccaata gctaggaccc ggctgctgtg cactgggact ggggattcca catgtttgcc 600

ttgggagtct caagctggac tgcca 625

Claims

1.一种编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

2.一种融合核酸，其特征在于，所述融合核酸包含如权利要求1所述的编码人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的核苷酸序列，并且，所述融合核酸的序列如SEQ ID NO: 5所示。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的融合核酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的载体，或其染色体中整合有外源的如权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的融合核酸。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自下组：HEK293细胞、感光细胞、双节细胞、视神经细胞、或其组合。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述感光细胞包括锥状细胞和/或杆状细胞。

7.如权利要求3所述的载体的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于Leber遗传性视神经病变。

8.一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有(a)权利要求3所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

9.一种重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的制备方法，其特征在于，包括步骤：培养权利要求4所述的宿主细胞，从而得到重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白。