KR20200131843A - 캡시드 변형에 의한 증가하는 조직 특정 유전자 전달 - Google Patents

Abstract

변형된 캡시드 단백질, 분리된 폴리뉴클레오타이드, 변형된 캡시드 단백질의 제조 방법, 재조합 바이러스 입자, 변형된 바이러스 입자의 생성을 위한 재조합 발현 시스템, 및 유전자 편집 및 조절 방법이 본원에서 제공된다.

Description

캡시드 변형에 의한 증가하는 조직 특정 유전자 전달

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018년 3월 16일에 출원된 미국 예비출원 일련 번호 62/644,317호에 대한 35 U.S.C. § 119 (e) 하의 우선권을 주장하며, 상기 출원의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

정부 지원에 대한 진술

본 발명은 미국 국립 보건원 및 국립 중개 과학 발전 센터가 부여한 승인 번호 82081315 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 특정 권리를 가진다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하며, 본원에 그 전문이 참조로 포함된다. 2019년 2월 26일에 생성된 상기 ASCII 복사물의 명칭은 106887-7170_SL.txt이고 크기는 18,492 바이트이다.

개선된 유전자 전달을 위해 AAV 캡시드를 변형시키려는 노력이 이루어져왔다. 예를 들어, WO 2017/165859A1은 Cas9가 맞춤형 유전자 편집을 촉진하기 위하여 바이러스 캡시드 단백질에 융합되거나 컨쥬게이션되어 있는 바이러스 캡시드 변형을 기술한다. 추가의 참고문헌들은 DNA 패밀리 셔플링 (Grimm and Kay), AAVrh74로의 리신 치환 (US 2015/006556), AAVrh74의 위치 195, 199, 201, 또는 202에서의 돌연변이 (US 9,840,719), 및 AAVrh48에 대한 변형 (EP 2359866)을 사용하는 것을 기술하였다. 또한 추가의 참고문헌이 AAV 표면에서 드러나는 무작위 펩타이드 라이브러리를 상세하게 설명한다 (예컨대, Muller (2003) Nat. Biotechnol., Perabo (2003) Mol. Ther., 및 7,588,722 (Grimm and Kay)).

근이영양증(Muscular Dystrophies)에 대한 유전자 요법 치료는 신체 전체에서 근육 세포로의 유전자의 전신 전달을 필요로 할 것이다. 가장 효율적인 전달 옵션은 말초 근육 세포까지 바이러스를 분포시키는 신체의 순환계를 사용하는 것이다. 전신 전달에 대한 이슈는 AAV의 대부분의 혈청형이 간 세포를 감염시키는 자연스러운 성향을 가지고 있다는 것이다 [1]. 신체에는 근육 세포보다 대략 20배 더 많은 간 세포가 있고, 그것을 바이러스가 전신 전달 중에 통과해야 한다 [2]. AAV 벡터의 50% 이상이 전신 정맥내 주사 후에 간에 갇히는 것으로 추정된다.

현재 전신 주사된 바이러스의 50% 이상이 치료 효과가 거의 일상적으로 나타나지 않는 간에서 손실된다 [4]. 간으로의 벡터 전달을 탈-표적화하고 근육 특정 결합 및 형질도입을 증가시킴으로써 근육 특정 유전자 발현 및 환자에 대한 치료적 이익을 상당히 개선시킬 수 있는 한편 잠재적인 부작용을 줄일 수 있다. 듀시엔 근이영양증의 치료를 위한 현재의 임상 실험은 근육에서 치료적 수준의 유전자 발현을 이루기 위한 시도로 고수준의 벡터 (킬로그램당 >5E+12 벡터 게놈)의 전달을 필요로 한다. "표적 외" 유전자 발현을 감소시키기 위해 근육 특정 프로모터가 사용되지만 유전자 발현의 전체 수준을 증가시키는 것에 대해서는 아무 것도 하지 않는다. 근육-특정 형질도입의 효율을 증가시킴으로써, 치료적 이익을 이루기 위해 필요한 전체적인 용량이 상당히 감소될 수 있다.

본 개시는 선행 기술의 한계를 해결하고 또한 관련된 장점을 제공한다.

출원인은 바이러스가 순환함에 따라 간 세포의 감염을 감소시키거나 제거하도록 근육 세포에 벡터의 전신 전달을 증가시키기 위한 접근법을 제안한다. 출원인은 변형된 AAVrh74 캡시드가 근육 근모세포 및 위성 세포(satellite cells)를 미변형 AAVrh74 벡터보다 더 효율적으로 표적으로 한다고 가설을 세웠다.

본 개시는 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 바이러스 캡시드 단백질에 관한 것이다. 출원인은 3개의 돌연변이를 생성하였다. 돌연변이 중 하나 (AAVmut4, VP1 캡시드의 아미노산 502에서 아스파라긴이 아이소류신으로 변함)는 최대 56배 (조직에 따라 3 내지 56배 증가) 더 높은 형질도입 효율로 테스트한 모든 조직에 대해 전체적으로 유전자 전달을 증가시킨다. 또 다른 돌연변이 (AAVmut5, VP1 캡시드의 아미노산 505에서 트립토판이 아르기닌으로 변함)는 AAVrh74보다 거의 50배 능가하여 심장으로의 유전자 전달을 증가시킨다. 제3 돌연변이 (AAVYIG 또는 AAVYIGSR591)는 근육 줄기 세포로 간주되는 위성 세포에서 주로 발견된 수용체를 표적으로 하지만 위성 세포 향성은 아직 IHC 염색에 의해 확인되지 않았다. 특히, AAV 결정 구조 및 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 출원인의 지식을 토대로 AAVYIG 또는 AAVYIGSR 591을 설계하는 것은 골격근에 대한 더 높은 친화성 및 간에 대한 더 낮은 친화성을 갖는 것으로 여겨진다.

이론에 의해 얽매이기를 바라지는 않지만, 출원인은 환자에 대한 전체적인 용량을 증가시키기 않으면서 심장 또는 근육과 같은 표적 조직에 도달하는 유효량을 증가시킴으로써 환자에 대한 치료적 이익을 이루기 위한 방법을 제공한다. 치료적 이익을 이루기 위해 필요한 전체 용량을 감소시킴으로써, 더 적은 바이러스 항원이 환자에게 전달되고, 이상적으로는 벡터에 대한 감소된 면역 반응 및 증가된 안전성이 초래된다. 후기 단계 임상 실험을 수행하기에 충분한 유전자 요법 약물 제품을 제조하는 것은 추후 개발에서 주요 장애물이다. 치료적 이익을 이루기 위해 용량 필요조건을 감소시키는 것은 감소된 제조 필요조건, 감소된 제조 비용, 더 빠른 임상 실험 개발 및 보다 많은 환자를 치료하는 더 큰 능력을 초래할 것이다.

따라서, 본 개시는 변형된 캡시드 단백질, 분리된 폴리뉴클레오타이드, 변형된 캡시드 단백질의 제조 방법, 재조합 바이러스 입자 및 변형된 바이러스 입자의 생성을 위한 재조합 발현 시스템에 관한 것이다. 개시의 한 측면은 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 바이러스 캡시드 단백질에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은, 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 위성 세포에서, 선택적으로 근육 줄기 세포에서 주로 발견된 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) (SEQ ID NO: 2) 또는 그것의 동등물의 삽입이다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 높은 친화성을 갖거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다.

또한 본원에는 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드가 개시된다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 주로 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포 상에서 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (SEQ ID NO: 2) 또는 그것의 동등물의 삽입이다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 높은 친화성을 갖거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다.

본원에는 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 캡시드 단백질을 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 재조합 바이러스 입자가 개시된다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 주로 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포 상에서 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (SEQ ID NO: 2)의 삽입이다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 높은 친화성을 갖거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다. 특정 측면으로, 재조합 바이러스 입자는 바이러스 입자당 (및/또는 변형된 바이러스 캡시드당) 5개 이상의 변형된 캡시드 단백질을 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것들로 이루어진다.

다른 측면으로, 재조합 바이러스 입자는 바이러스 입자당 (및/또는 변형된 바이러스 캡시드당) 1 내지 5개의 변형된 캡시드 단백질을 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것들로 이루어진다. 추가의 측면은 본원에 개시된 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은, 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 주로 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포 상에서 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (SEQ ID NO: 2)의 삽입이다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 높은 친화성을 갖거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다.

또한 유전자 변형을 위해 도입유전자 또는 CRISPR 시스템을 선택적으로 포함하는 본원에 개시된 변형된 캡시드가 제공된다. 추가로 변형된 캡시드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 벡터, 뿐만 아니라 각각의 보체 및 동등물이 제공된다. 또한 추가의 측면은 바이러스 입자를 생성하는 및/또는 본원에서 개시된 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한 추가의 측면은 본원에 개시된 바이러스 입자의 생성을 위한 발현 시스템에 관한 것이다.

본 개시는 또한 담체, 및 변형된 캡시드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 플라스미드, 숙주 세포, 또는 발현 시스템 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 추가로 변형된 캡시드 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 플라스미드, 숙주 세포, 또는 발현 시스템 중 하나 이상 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 제공된다.

추가로 본원에는 필요로 하는 대상체에서 표적 질환 또는 기능장애 조직을 치료하는 방법이 개시되며, 방법은 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 캡시드 단백질을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 재조합 바이러스 입자의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은, 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 추가의 구체예에서, 이 바이러스 입자는 AAVrh74와 비교하여 질환에 걸린 또는 기능장애 조직에 대한 치료 전달의 효능을 약 3 내지 56배 증가시킨다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 추가의 구체예에서, 질환 또는 기능장애 조직은 심장 조직이다. **또한 추가의 구체예에서, 이 바이러스 입자는 AAVrh74와 비교하여 치료 전달의 효능을 약 50배 이상 증가시킨다. 일부 구체예에서, 변형은 주로 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포 상에서 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (SEQ ID NO: 2)의 삽입이다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 높은 친화성을 갖거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다. 일부 구체예에서, 바이러스 입자는 질환 또는 기능장애 조직에 적합한 치료의 유효량을 포함한다. 일부 구체예에서, 치료는 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집이다.

도 1A-1E는 아데노-관련 바이러스 혈청형 9 (AAV9) 캡시드 라이브러리의 구조적 분석을 도시한다. (a) 주형으로 작용하는 AAV8의 결정 구조를 포함한 SWISS-모델을 사용하여 얻어진 AAV9 VP3 하위유닛 모노머의 카툰 표현 (pdb id: 2QA0). 아미노산 390-627 (VP1 넘버링)을 함유한 GH 루프는 회색으로 표시된다. (b) VIPERdb에 대해 T = 1 정이십면체 대칭 좌표를 사용하여 생성된 60개의 VP3 하위유닛을 가진 AAV9 캡시드 모델의 표면 렌더링. 정이십면체 5겹 기공을 둘러싸고 있고 삼중 대칭축에서 맞물려 있는, 상이한 VP3 하위유닛으로부터의 GH 루프 영역이 회색으로 강조된다. (c) 회색 구로 묘사된 AAV9 라이브러리로부터의 43개의 대표적인 클론의 점 돌연변이를 가진 VIPERdb 상에 생성된 AAV9 VP3 하위유닛 트라이머의 카툰. (d) 외부 루프상에 클러스터링된 대부분의 점 돌연변이 (회색 구)를 보여주는 캡시드 트라이머의 측면도 (90° 회전). (e) 캡시드 트라이머 영역 내에서 표면 잔기들의 전체 로드맵 투시도. 적색으로 강조된 잔기는 캡시드 표면상에 대부분 위치한 변경된 잔기를 함유한 10개의 AAV9 변이체의 하위세트를 나타낸다. 도면은 Pulicherla et al [7]으로부터 재현되었다.
도 2는 근육 줄기 세포의 분리를 위한 FACS 분류 가능한 마커를 도시한다. 도면은 Wang et.al. [13]으로부터 재현되었다.
도 3은 AAVrh74 돌연변이 벡터 생물분포를 도시한다. CD-1 수컷 마우스가 1E+11 Vg의 AAVrh74 또는 AAVrh74 캡시드 /lucEYFP 리포터 바이러스의 2개의 돌연변이로 정맥내 주사되었고 3주 후에 조직이 수득되어 qPCR에 의해 벡터 게놈 복사물에 대해 검정되었다.
도 4는 AAVmut4 및 mut5 발광의 살아있는 동물 영상을 도시한다. 성체 CD-1 수컷 마우스가 꼬리 정맥을 통해 동일한 루시페라제 벡터를 함유한 1E+11 Vg의 AAVrh74 또는 AAVmut4 중 어느 하나로 주사되었다. 마우스는 주사 후 3주 후에 루시페라제 발현에 대해 영상화되었다. 2개의 별도의 실험이 동일한 조건 하에서 수행되었다. 실험 1, 광자 A의 헤드 정량화, 또는 광자의 레그(leg) 정량화, B를 포함한 A 및 B에서 동일한 동물. 실험 2는 4주 후에 수행된 별도의 동물을 포함한, 실험 1의 반복이다. 4마리씩의 각 그룹에서 가장 좌측의 동물은 AAVrh74 대조군 바이러스로 주사되었고, 각 그룹의 다음 3마리 동물은 AAVmut4 바이러스로 주사되었다.
도 5는 AAVYIG 또는 AAVYIGSR591 발광의 살아있는 동물 영상을 도시한다. 성체 CD-1 마우스가 꼬리 정맥을 통해 루시페라제 벡터를 함유한 1E+11 Vg의 AAVYIG 또는 AAVYIGSR591 바이러스로 주사되었다. 마우스들은 주사 후 3주 후에 루시페라제 발현에 대해 영상화되었고, 복부 또는 등쪽 위치에서 각 마우스 위에 전신 광자 수가 표시되었다.

본 개시에 따르는 구체예들은 이하에서 보다 전체적으로 기술될 것이다. 그러나, 개시의 측면들은 상이한 형태로 구체화될 수 있고 본원에 제시된 구체예들로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 오히려, 이들 구체예는 본 개시가 철저하고 완전할 것이고, 기술분야의 숙련된 사람들에게 발명의 범주를 완전하게 전달하도록 제공된다. 본원의 설명에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술할 목적이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어 (기술적 및 과학적 용어를 포함함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에서 정의된 것과 같은 용어는 본 출원 및 관련 기술의 맥락에서 그것의 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하고 본원에서 분명하게 명시되지 않는 한 이상적이거나 또는 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않아야 하는 것이 추가로 이해될 것이다. 하기에서 명백하게 정의되지 않지만, 이러한 용어는 그것의 일반적인 의미에 따라 해석되어야 한다.

본원의 설명에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술할 목적이며 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.

본 기술의 실시는 다르게 표시되지 않는 한, 기술분야의 숙련된 지식 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 및 재조합 DNA의 종래 기법들을 사용할 것이다.

맥락이 다르게 나타내지 않는 한, 본원에서 기술된 발명의 다양한 특징은 임의의 조합으로 사용될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다. 더욱이, 개시는 또한, 일부 구체예에서, 본원에 제시된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 배제되거나 생략될 수 있는 것을 고려한다. 예를 들어, 만약 명세서가 복합체가 구성요소 A, B 및 C를 포함하는 것을 기재한다면, 그것은 구체적으로 A, B 또는 C, 또는 이것들의 조합 중 어느 것이든지 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략될 수 있고 부인될 수 있는 것으로 의도된다.

분명하게 다르게 나타내지 않는 한, 모든 명시된 구체예, 특징, 및 용어는 이용된 구체예, 특징, 또는 용어 및 그것의 생물학적 동등물을 전부 포함하는 것으로 의도된다.

범위를 포함한 모든 수치 표시, 예컨대, pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량은 필요에 따라 1.0 또는 0.1의 증분만큼, 또는 대안으로 +/- 15%, 또는 대안으로 10%, 또는 대안으로 5%, 또는 대안으로 2%의 편차만큼 (+) 또는 (-)로 달라지는 근사치이다. 비록 언제나 분명하게 기재되지는 않지만, 모든 숫자 표시는 용어 "약"이 선행되는 것이 이해되어야 한다. 또한, 비록 언제나 분명하게 기재되지는 않지만, 본원에서 기술된 시약은 단지 에시적인 것이고 그것의 동등물이 기술분야에 알려져 있는 것이 이해되어야 한다.

본 개시 전체에서, 다양한 출판물, 특허 및 공개된 특허 명세서가 식별 인용 또는 아라비아 숫자로 참조된다. 아라비아 숫자에 의해 식별된 출판물에 대한 전체적인 인용은 청구범위 바로 앞에 있다. 이들 출판물, 특허 및 공개된 특허 명세서의 개시내용은 본 발명이 속하는 기술분야의 상태를 보다 전체적으로 기술하기 위해 그 전문이 본 개시에 참조로 포함된다.

정의

본 기술의 실시는, 다르게 표시되지 않는 한, 기술분야의 숙련도 내에 있는 유기 화학, 약물학, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 종래 기법을 사용할 것이다. 예컨대, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd edition (1989); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)) 참조.

발명의 설명 및 청구범위에서 사용되는 바, 단일 형태를 나타내는 단어들은 맥락이 분명하게 다른 것을 나타내지 않는 한, 또한 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "포함하는"은 조성물과 방법이 인용된 요소들을 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않는 것을 의미하기 위해 의도된다. 본원에서 사용되는 바, 본질적으로 (및 문법적 변형)으로 이루어진 전환 문구는 인용된 물질 또는 단계 및 실질적으로 인용된 구체예의 기본적이고 신규한 특징(들)에 영향을 주지 않는 것들을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 그러므로, 본원에서 사용되는 용어 "본질적으로 이루어지는"은 "포함하는"과 동등하게 해석되지 않아야 한다. "이루어지는"은 본원에 개시된 조성물을 투여하기 위한 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량 요소 이상을 배제하는 것을 의미할 것이다. 이들 전환 용어의 각각에 의해 정의된 측면들은 본 개시의 범주 내에 있다.

본원에서 사용되는 용어 "약"은 양 또는 농도 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때, 명시된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 또는 심지어 0.1%의 편차를 포함하는 것을 의미한다.

용어 "허용되는", "효과적인" 또는 "충분한"은 본원에 개시된 임의의 구성요소, 범위, 용량 형태 등의 선택을 기술하기 위해 사용될 때 상기 구성요소, 범위, 용량 형태 등이 개시된 목적에 적합한 것을 의도한다.

또한 본원에서 사용되는 바, "및/또는"은 관련된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안으로 해석될 때 ("또는") 조합의 부족을 나타내며 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "세포"는 선택적으로 대상체 또는 상업적으로 입수 가능한 공급원으로부터 얻어진 원핵 세포 또는 진핵 세포 중 어느 하나를 나타낼 수 있다.

"진핵 세포"는 원핵생물계(monera)를 제외한 모든 생명 왕국(life kingdom)을 포함한다. 이것은 막-결합 핵을 통해 쉽게 구별될 수 있다. 동물, 식물, 진균, 및 원생생물은 그것의 세포가 내부 막 및 세포골격에 의해 복잡한 구조로 조직되어 있는 진핵생물 또는 유기체이다. 가장 특징적인 막-결합 구조는 핵이다. 구체적으로 인용되지 않는 한, 용어 "숙주"는 예를 들어, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포를 포함한 진핵 숙주를 포함한다. 진핵 세포 또는 숙주의 비제한적인 예로는 유인원, 소, 돼지, 쥐과, 래트, 조류, 파충류 및 인간, 예컨대, HEK293 세포 및 293T 세포를 들 수 있다.

"원핵 세포"는 보통 핵 또는 다른 막-결합 소기관이 없고 두 영역, 박테리아 및 고세균으로 나누어진다. 염색체 DNA에 더불어, 이들 세포는 또한 에피솜으로 불리는 원형 루프에 유전자 정보를 함유할 수 있다. 박테리아 세포는 매우 작고, 대략 동물 미토콘드리아의 크기이다 (약 1-2 μm 직경 및 10 μm 길이). 원핵 세포는 3가지 주요 형상을 특징으로 한다: 막대형, 구형, 및 나선형. 진핵세포와 같은 정교한 복제 과정을 통해 진행되는 대신, 박테리아 세포는 이분법(binary fission)에 의해 분할한다. 예로는 한정하는 것은 아니지만, 바실루스(Bacillus) 박테리아, 대장균(E. coli) 박테리아, 및 살모넬라(Salmonella) 박테리아를 들 수 있다.

용어 "암호화하다"는 그것이 핵산 서열에 적용될 때에, 만약 그것의 천연 상태에서 또는 기술분야의 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 조작될 때 전사되어 및/또는 번역되어 폴리펩타이드 및/또는 그것의 단편에 대한 mRNA를 생성한다면 폴리펩타이드를 "암호화한다"고 말할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 안티센스 가닥은 이러한 핵산의 보체이며, 암호화 서열은 그것으로부터 추론될 수 있다.

용어 "동등한" 또는 "생물학적 동등한"은 특정 분자, 생물학적, 또는 세포 물질을 언급할 때 상호교환적으로 사용되며 여전히 원하는 구조 또는 기능성을 유지하는 한편 최소 상동성을 가지는 것들을 의도한다. 동등한 폴리펩타이드의 비제한적인 예로는, 그것에 대해 또는 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 60%, 또는 대안으로 적어도 65%, 또는 대안으로 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 75%, 또는 대안으로 80%, 또는 대안으로 적어도 85%, 또는 대안으로 적어도 90%, 또는 대안으로 적어도 95% 동일성을 가지는 폴리펩타이드, 또는 엄격한 조건 하에서 이러한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 들 수 있다. 대안으로, 그것의 동등물은 참조 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 야생형 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 75%, 또는 대안으로 80%, 또는 대안으로 적어도 85%, 또는 대안으로 적어도 90%, 또는 대안으로 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 97% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오타이드 또는 그것에 대한 보체에 의해 암호화된 폴리펩타이드이다.

동등한 폴리펩타이드의 비제한적인 예로는, 참조 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 60%, 또는 대안으로 적어도 65%, 또는 대안으로 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 75%, 또는 대안으로 80%, 또는 대안으로 적어도 85%, 또는 대안으로 적어도 90%, 또는 대안으로 적어도 95%, 또는 대안으로 적어도 97% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.

다른 서열에 대해 특정 백분율 (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)의 "서열 동일성"을 가지는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 (또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은 정렬될 때, 그 백분율의 염기 (또는 아미노산)가 두 서열을 비교하여 동일한 것을 의미한다. 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 기술분야에 알려져 있는 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1에 기재되어 있는 것을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 디폴트 파라미터가 정렬에 사용된다. 비제한적인 예시의 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 특히, 예시의 프로그램은 다음의 디폴트 파라미터를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP를 들 수 있다: 유전자 코드=표준; 필터=없음; 가닥=양 가닥; 컷오프=60; 기대값=10; 매트릭스=BLOSUM62; 설명=50개 서열; 분류 방식=고득점; 데이터베이스=비-환원성, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 번역+SwissProtein+SPupdate+PIR. 이들 프로그램의 상세한 내용은 다음의 인터넷 주소에서 알 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST. 서열 동일성 및 퍼센트 동일성은 서열을 clustalW (웹 주소:genome.jp/tools/clustalw/에서 이용 가능함, 2017년 1월 13일에 최종 승인됨)에 포함시킴으로써 결정될 수 있다.

"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 펩타이드 사이 또는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 상동성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열에서 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 차지되면, 분자는 그 위치에서 상동한다. 서열 사이의 상동성 정도는 서열들에 의해 공유된 매치되는 또는 상동하는 위치의 수의 함수이다. "관련없는" 또는 "비상동성" 서열은 본 개시의 서열들 중 하나와 40% 미만의 동일성, 또는 대안으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.

"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 또한 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 두 핵산 분자를 나타낼 수 있다.

"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 반응하여 뉴클레오타이드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 나타낸다. 수소 결합은 왓슨-크릭 쌍형성, 후그스타인 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열-특이적 방식으로 일어날 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 두 가닥, 다중-가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자체-혼성화 가닥, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 보다 광범위한 과정, 예컨대 PCR 반응의 시작, 또는 리보자임에 의한 폴리뉴클레오타이드의 효소적 절단에서 단계 구성할 수 있다.

엄격한 혼성화 조건의 예로는 다음을 포함한다: 약 25℃ 내지 약 37℃의 인큐베이션 온도; 약 6xSSC 내지 약 10xSSC의 혼성화 완충제 농도; 약 0% 내지 약 25%의 포름아미드 농도; 및 약 4xSSC 내지 약 8xSSC의 세척 용액. 중간 혼성화 조건의 예로는 다음을 포함한다: 약 40℃ 내지 약 50℃의 인큐베이션 온도; 약 9xSSC 내지 약 2xSSC의 완충제 농도; 약 30% 내지 약 50%의 포름아미드 농도; 및 약 5xSSC 내지 약 2xSSC의 세척 용액. 높은 엄격성 조건의 예로는 다음을 포함한다: 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1xSSC 내지 약 0.1xSSC의 완충제 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아미드 농도; 및 약 1xSSC, 0.1xSSC의 세척 용액, 또는 탈이온수. 일반적으로, 혼성화 인큐베이션 시간은 5분 내지 24시간이고, 1, 2회, 또는 그 이상의 세척 단계가 있으며, 세척 인큐베이션 시간은 약 1, 2, 또는 15분이다. SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트레이트 완충제이다. 다른 완충제 시스템을 사용하는 SSC의 동등물이 사용될 수 있는 것이 인지된다.

본원에서 사용되는 바, "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 계속해서 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 나타낸다. 만약 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래되면, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "분리된"은 실질적으로 다른 물질이 없는 분자 또는 생물학적 물질 또는 세포 물질을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "기능적"은 임의의 분자, 생물학적 물질, 또는 세포 물질을 그것이 특정, 명시된 효과를 이루는 것을 의도하기 위해 변형시키기 위해 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "핵산 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드"는, 리보뉴클레오타이드이거나 데옥시리보뉴클레오타이드인, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 그러므로, 이 용어는, 한정하는 것은 아니지만, 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥의 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연의, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.

용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 상호교환적으로 사용되고 가장 넓은 의미로 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드 모방물의 둘 이상의 하위유닛의 합성물을 나타낸다. 하위유닛은 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 다른 측면으로, 하위유닛은 다른 결합, 예컨대, 에스테르, 에테르, 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질의 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 없다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 나타내며, 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체, 아미노산 유사체 및 펩티드 모방물을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "재조합 발현 시스템"은 재조합에 의해 형성된 특정 유전자 물질의 발현을 위한 유전자 구성물 또는 구성물들을 나타낸다.

"유전자 전달 비히클"은 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포로 운반할 수 있는 임의의 분자로서 정의된다. 유전자 전달 비히클의 예는 리포솜, 천연 중합체 및 합성 중합체를 포함한 미셸 생체적합성 중합체; 리포단백질; 폴리펩타이드; 다당; 리포다당; 인공 바이러스 엔벨로프; 금속 입자; 및 박테리아 또는 바이러스, 예컨대 배큘로바이러스, 아데노바이러스 및 레트로바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 플라스미드, 진균 벡터 및 다양한 진핵 및 원핵 세포에서 발현을 위해 기술되어 있는 기술분야에서 전형적으로 사용되고, 단순 단백질 발현을 위해서뿐만 아니라 유전자 요법을 위해 사용될 수 있는 다른 재조합 비히클이다.

본원에서 개시된 폴리뉴클레오타이드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 세포 또는 조직에 전달될 수 있다. 본원에서 사용되는 "유전자 전달", "유전자 전달", "형질도입", 등은 외인성 폴리뉴클레오타이드 (때로 "도입유전자"로서 언급됨)의 숙주 세포로의 도입을 나타내는 용어이며, 도입에 사용된 방법과 무관하다. 이러한 방법으로는 벡터-매개 유전자 전달 (예컨대, 바이러스 감염/트랜스펙션, 또는 다양한 다른 단백질-기반 또는 지질-기반 유전자 전달 복합체에 의한)과 같은 다양한 잘 알려져 있는 기법뿐만 아니라 "네이키드" 폴리뉴클레오타이드의 전달을 용이하게 하는 기법 (예컨대 전자천공법, "유전자 총" 전달 및 폴리뉴클레오타이드의 도입을 위해 사용된 다양한 다른 기법)을 포함한다. 도입된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서 안정적으로 또는 일시적으로 유지된다. 안정적인 유지는 전형적으로 도입된 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포와 부합하는 복제 기원을 함유하거나 또는 염색체외 레플리콘 (예컨대, 플라스미드) 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체와 같은 숙주 세포의 레플리콘으로 통합되는 것을 필요로 한다. 기술분야에 알려져 있고 본원에서 기술된 것과 같이 많은 벡터가 유전자의 포유류 세포로의 전달을 매개할 수 있는 것으로 알려져 있다.

"플라스미드"는 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있는 염색체 DNA와 별도의 염색체외 DNA 분자이다. 많은 경우에, 이것은 원형이고 이중 가닥이다. 플라스미드는 미생물 집단 내에서 수평적인 유전자 전달을 위한 메커니즘을 전달하고 전형적으로 주어진 환경 상태 하에서 선택적 장점을 제공한다. 플라스미드는 경쟁적인 환경 틈새에서 자연적으로 발생하는 항생물질에 대한 내성을 제공하는 유전자를 운반하거나, 또는 대안으로 생성된 단백질은 유사한 환경 하에서 독소로서 작용할 수 있다.

유전자 조작에서 사용된 "플라스미드"는 "플라스미드 벡터"로 불린다. 많은 플라스미드가 이러한 용도로 상업적으로 이용 가능하다. 복제될 유전자는 세포가 특정 항생물질에 대해 내성이 되게 하는 유전자 및 그 위치에서 DNA 단편의 쉬운 삽입을 허용하는 여러 개의 통상적으로 사용된 제한 부위를 함유한 짧은 영역인 다중 클로닝 부위 (MCS, 또는 폴리링커)를 함유한 플라스미드의 복사물에 삽입된다. 플라스미드의 또 다른 주요 용도는 대량의 단백질을 만드는 것이다. 이 경우에, 연구자들은 관심 있는 유전자를 은닉한 플라스미드를 함유한 박테리아를 성장시킨다. 박테리아가 그것의 항생물질 내성을 부여하는 단백질을 생성하는 것처럼, 그것은 또한 삽입된 유전자로부터 다량의 단백질을 생성하기 위해 유도될 수 있다.

"효모 인공 염색체" 또는 "YAC"는 큰 DNA 단편 (100 kb보다 크고 최대 3000 kb)을 클로닝하기 위해 사용된 벡터를 나타낸다. 이것은 인공적으로 구성된 염색체이고 효모 세포에서 복제 및 보존을 위해 필요한 텔로머, 센트로미어, 및 복제 기원 서열을 함유한다. 초기 원형 플라스미드를 사용하여 구축되어, 그것은 제한 효소를 사용함으로써 선형화된 후, DNA 결찰효소가 관심 있는 서열 또는 유전자를 부착 단부(cohesive end)의 사용에 의해 선형 분자 내에 첨가할 수 있다. 효모 발현 벡터, 예컨대 YAC, YIp (효모 통합 플라스미드), 및 YEp (효모 에피솜성 플라스미드)가, 효모 자체가 진핵 세포이기 때문에 당업자가 번역 후 변형을 포함한 진핵 단백질 생성물을 얻을 수 있기 때문에 특히 유용하지만, YAC는 키메라 효과를 생성하므로 BAC보다 더 불안정한 것으로 나타났다.

"바이러스 벡터"는 생체내에서, 생체외에서 또는 시험관내에서 숙주 세포로 전달될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합에 의해 생성된 바이러스 또는 바이러스 입자로서 정의된다.

바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 감염성 담배 모자이크 바이러스 (TMV)-기반 벡터가 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있고 담배 잎에서 그리피스신(Griffithsin)을 발현하는 것으로 보고되었다 (O'Keefe et al. (2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104). 알파바이러스 벡터, 예컨대 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스-기반 벡터 및 신드비스(Sindbis) 바이러스-기반 벡터가 또한 유전자 요법 및 면역요법에서 사용하기 위해 개발되었다. Schlesinger & Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 및 Ying et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827 참조. 유전자 전달이 레트로바이러스 벡터에 의해 매개되는 경우의 측면에서, 벡터 구성물은 레트로바이러스 게놈 또는 그것의 부분, 및 치료 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 유전자 전달에서 사용하기 위한 벡터의 현대적인 방법에 대한 추가의 상세한 내용은, 예를 들어 Kotterman et al. (2015) Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook Annual Review of Biomedical Engineering 17에서 알 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "레트로바이러스 매개된 유전자 전달" 또는 "레트로바이러스 형질도입"은 동일한 의미를 지니며, 유전자 또는 핵산 서열이 세포에 들어가서 그것의 게놈을 숙주 세포 게놈에 통합시키는 바이러스에 의해 숙주 세포에 안정적으로 전달되는 과정을 나타낸다. 바이러스는 그것의 정상적인 감염 메커니즘을 통해 숙주 세포에 들어가거나 또는 세포에 들어가기 위하여 상이한 숙주 세포 표면 수용체 또는 리간드에 결합하도록 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 또는 바이러스-유사 유입 메커니즘을 통해 세포에 외인성 핵산을 도입시킬 수 있는 바이러스 입자를 나타낸다.

레트로바이러스는 그것의 유전자 정보를 RNA 형태로 운반한다; 그러나, 바이러스가 세포를 감염시킨 후에는, RNA는 감염된 세포의 게놈 DNA에 통합되는 DNA 형태로 역전사된다. 통합된 DNA 형태는 프로바이러스로 불린다.

유전자 전달이 DNA 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 (Ad) 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV)에 의해 매개되는 경우의 측면에서, 벡터 구성물은 바이러스 게놈 또는 그것의 부분, 및 도입유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 아데노바이러스 (Ad)는 바이러스의 상대적으로 잘 특성화된, 균일화된 그룹으로 50개 이상의 혈청형을 포함한다. Ad는 숙주 세포 게놈으로의 통합을 필요로 하지 않는다. 재조합 Ad 유도된 벡터, 특히 야생형 바이러스의 재조합 및 생성의 가능성을 감소시키는 것들이 또한 구성되었다. 이러한 벡터는 Takara Bio USA (Mountain View, CA), Vector Biolabs (Philadelphia, PA), 및 Creative Biogene (Shirley, NY)과 같은 공급처로부터 상업적으로 입수 가능하다. 야생형 AAV는 숙주 세포의 게놈에 통합되는 고감염성 및 특이성을 가진다. Wold and Toth (2013) Curr. Gene. Ther. 13(6):421-433, Hermonat & Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470, 및 Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 참조.

프로모터 및 폴리뉴클레오타이드가 작동 가능하게 연결될 수 있는 클로닝 부위 둘 다를 함유하는 벡터는 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 벡터는 시험관내에서 또는 생체내에서 RNA를 전사할 수 있고, Agilent Technologies (Santa Clara, Calif.) 및 Promega Biotech (Madison, Wis.)와 같은 공급처로부터 상업적으로 입수 가능하다. 발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위하여, 잠재적인 부적절한 대체 번역 개시 코돈 또는 전사 또는 번역 수준에서 간섭할 수 있는 다른 서열 또는 발현을 제거하기 위하여 클론의 5' 및/또는 3' 미번역 부분을 제거, 첨가 또는 변경할 필요가 있을 수 있다. 대안으로, 공통 리보솜 결합 부위가 발현을 향상시키기 위하여 시작 코돈의 바로 5'에 삽입될 수 있다.

유전자 전달 비히클은 또한 DNA/리보솜 복합체, 미셸 및 표적화된 바이러스 단백질-DNA 복합체를 포함한다. 또한 표적화 항체 또는 그것의 단편을 포함하는 리포솜이 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 세포 또는 세포 집단으로 폴리뉴클레오타이드의 전달에 더불어, 본원에 기술된 단백질의 세포 또는 세포 집단으로의 직접적인 도입은 단백질 트랜스펙션의 비제한적인 기법에 의해 실시될 수 있고, 대안으로 발현을 향상시키거나 및/또는 본원에서 개시된 단백질의 활성을 촉진할 수 있는 배양 조건이 다른 비제한적 기법이다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "바이러스 캡시드" 또는 "캡시드"는 바이러스 입자의 단백성 껍질 또는 코트를 나타낸다. 캡시드는 바이러스 게놈을 캡시드화, 보호, 수송, 및 숙주 세포로 방출시키는 기능을 한다. 캡시드는 일반적으로 단백질 ("캡시드 단백질")의 올리고머 구조적 하위유닛을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "캡시드화된"은 바이러스 캡시드 내에 포함되는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, 바이러스 또는 플라스미드와 관련하여 용어 "헬퍼"는 바이러스 입자 또는 재조합 바이러스 입자, 예컨대 본원에서 개시된 변형된 AAV의 복제 및 포장에 필요한 추가적인 구성요소를 제공하기 위해 사용된 바이러스 또는 플라스미드를 나타낸다. 헬퍼 바이러스에 의해 암호화된 구성요소는 비리온 조립, 캡시드화, 게놈 복제, 및/또는 포장에 필요한 모든 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 헬퍼 바이러스는 바이러스 게놈의 복제에 필요한 효소들을 암호화할 수 있다. AAV 구성물과 함께 사용하기에 적합한 헬퍼 바이러스 및 플라스미드의 비제한적인 예로는 pHELP (플라스미드), 아데노바이러스 (바이러스), 또는 헤르페스바이러스 (바이러스)를 들 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 ""AAV"는 아데노-관련 바이러스에 대한 표준 약어이다. 아데노-관련 바이러스는 특정 기능이 공-감염 헬퍼 바이러스에 의해 제공되는 세포에서만 성장하는 단일 가닥 DNA 파보바이러스이다. AAV의 일반적인 정보 및 리뷰는, 예를 들어, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169- 228, 및 Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)에서 찾을 수 있다. 이들 리뷰에서 기술된 동일한 원리는, 다양한 혈청형이 유전자 수준에서도 구조적으로 및 기능적으로 꽤 밀접하게 관련된 것으로 잘 알려져 있기 때문에, 리뷰의 출판일 후에 특성화된 추가적인 AAV 혈청형에 적용될 것이라고 충분히 예상된다. (예를 들어, Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; 및 Rose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974) 참조). 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 상동성 rep 유전자에 의해 매개된 매우 유사한 복제 특성을 분명하게 나타내고; 모두 AAV2에서 발현된 것과 같은 3개의 관련 캡시드 단백질을 포함한다. 관련 정도는 게놈의 길이를 따라 혈청형 사이에서 광범위한 교차-혼성화를 나타내는 헤테로듀플렉스 분석; 및 "반전된 말단 반복 서열" (ITR)에 상응하는 말단에서의 유사한 자가-어닐링 분절의 존재에 의해 추가로 제시된다. 유사한 감염성 패턴 또한 각 혈청형에서의 복제 기능이 유사한 조절 제어 하에 있는 것을 제시한다.

본원에서 사용되는 바 "AAV 벡터"는 AAV 말단 반복 서열 (ITR)이 옆에 있는 관심 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 (또는 도입유전자)를 포함하는 벡터를 나타낸다. 이러한 AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자 생성물을 암호화하고 발현하는 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포에 존재할 때 감염성 바이러스 입자로 복제되고 포장될 수 있다.

"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 나타낸다. 만약 입자가 이종성 폴리뉴클레오타이드 (즉 포유류 세포에 전달될 도입유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드)를 포함하면, 그것은 전형적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 단순히 "AAV 벡터"로서 언급된다. 그러므로, AAV 벡터 입자의 생성은 본질적으로 AAV 벡터의 생성을 포함하며, 이러한 벡터는 AAV 벡터 입자 내에 함유된다.

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 복제-결핍 파보바이러스이고, 그것의 단일 가닥 DNA 게놈은 2개의 145개 뉴클레오타이드 반전 말단 반복부 (ITR)를 포함한 약 4.7 kb 길이이다. AAV의 다중 혈청형이 있다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열이 알려져 있다. 예를 들어, AAV-1의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_002077로 제공되고; AAV-2의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001401로 및 Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)에 제공되며; AAV-3의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_1829로 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001829로 제공되며; AAV-5 게놈은 GenBank 수탁 번호 AF085716으로 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_00 1862로 제공되며; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 부분은 각각 GenBank 수탁 번호 AX753246 및 AX753249로 제공되고; AAV-9 게놈은 Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)에 제공되며; AAV-10 게놈은 Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)에 제공되고; AAV-11 게놈은 Virology, 330(2): 375-383 (2004)에 제공된다. AAV rh.74 게놈의 서열은 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제 9,434,928호에 제공된다. 바이러스 DNA 복제 (rep), 캡시드화/포장 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 Cis-작용 서열은 AAV ITR 내에 함유된다. 3개의 AAV 프로모터 (이것들의 상대적인 지도 위치에 대해 p5, pl9, 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 2개의 AAV 내부 오픈 리딩 프레임의 발현을 구동한다. 단일 AAV 인트론의 차등 스플라이싱 (뉴클레오타이드 2107 및 2227에서)과 결합된 2개의 rep 프로모터 (p5 및 pi 9)는 rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질 (rep 78, rep 68, rep 52, 및 rep 40)의 생성을 초래한다. Rep 단백질은 결국 바이러스 게놈의 복제에 기여하는 다중 효소 특성을 가진다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고 그것은 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 암호화한다. 대체 스플라이싱 및 비-공통 번역 시작 부위는 3개의 관련된 캡시드 단백질의 생성에 기여한다. 단일 공통 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 지도 위치 95에 위치한다. AAV의 라이프 사이클 및 유전학은 uzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)에서 리뷰된다.

AAV는, 예를 들어, 유전자 요법에서 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 매력적인 것이 되게 만드는 특유한 특징을 가진다. 배양 중의 세포의 AAV 감염은 비-세포병성이고, 인간 및 다른 동물의 자연스러운 감염은 침묵성이며 무증상이다. 더욱이, AAV는 많은 포유류 세포를 감염시켜서 많은 상이한 조직의 생체내에서의 표적화를 가능하게 한다. 더욱이, AAV는 서서히 분할하는 및 비분할 세포를 형질도입시키고, 전사적으로 활성인 핵 에피솜 (염색체외 요소)으로서 그런 세포의 수명 동안 본질적으로 지속적일 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은 재조합 게놈의 구성을 실현 가능하게 만드는 클로닝된 DNA로서 플라스미드에 삽입된다. 나아가, AAV 복제 및 게놈 캡시드화를 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 함유되기 때문에, 게놈 내부의 대략 4.3 kb (복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap을 암호화함)의 일부 또는 전부는 외래 DNA로 대체될 수 있다. AAV 벡터를 생성하기 위하여, rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은 그것이 매우 안정적이고 활기찬 바이러스라는 것이다. 그것은 아데노바이러스를 비활성화하기 위해 사용된 조건 (여러 시간 동안 56 내지 65℃)을 쉽게 견뎌서 AAV 의 저온 보존을 덜 중요하게 만든다. AAV는 심지어 동결건조될 수 있다. 마지막으로, AAV-감염 세포는 슈퍼감염에 대해 내성이 없다.

다수의 연구가 근육에서 장기간 (>1.5년) 재조합 AAV-매개된 단ㅂ개질 발현을 입증하였다. Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996); 및 Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996) 참조. 또한 Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) 및 Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001) 참조. 더욱이, 근육이 고도로 혈관화되어 있기 때문에, 재조합 AAV 형질도입은 문헌에서 기재된 것과 같이 근육내 주사 후에 전신 순환에서 도입유전자 생성물의 출현을 초래하였다: Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) 및 Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921- 13926 (1997). 더욱이, Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002)는 골격 근섬유가 정확한 항체 글리코실화, 접힘, 및 분비에 대해 필요한 세포 인자를 가지는 것을 입증하였는데, 이것은 근육이 분비된 단백질 치료제의 안정적인 발현을 할 수 있는 것을 가리킨다. 발명의 재조합 AAV (rAAV) 게놈은 γ-사르코글리칸을 암호화하는 핵산 분자 (예컨대, SEQ ID NO: 1) 및 그 핵산 분자의 옆에 있는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. rAAV 게놈의 AAV DNA는 AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV- 10, AAV-11, AAV- 12, AAV-13 및 AAV rh74를 포함하여, 그것에 대해 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 의사 분류된(pseudotyped) rAAV 의 제조는, 예를 들어, WO 01/83692에서 개시된다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 가진 rAAV가 또한 고려된다. 예를 들어, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014) 참조. 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열이 기술분야에 알려져 있다.

용어 "Cas9"는 이 명칭에 의해 언급된 CRISPR 관련 엔도뉴클레아제를 나타낸다. Cas9의 비제한적인 예는 본원에서 제공되는데, 예컨대 UniProtKB G3ECR1 (CAS9_STRTR)에서 제공된 Cas9 또는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9, 뿐만 아니라 뉴클레아제 죽은 Cas9, 이것들의 각각의 직렬상동체(ortholog) 및 생물학적 동등물을 들 수 있다. 직렬상동체로는 한정하는 것은 아니지만 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 ("SpCas9"; 스트렙토코쿠스 써모필레스(Streptococcus thermophiles), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 나이세리아 락타미카(Neisseria lactamica), 나이세리아 메닝기티데스(Neisseria meningitides), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida)로부터의 Cas 9; 및 악시드아미노코쿠스 종(Acidaminococcus spp.) 및 프라시셀란 노비시다(Francisella novicida) U112를 포함한 다양한 박테리아 종으로부터의 Cpf1 (Cas9와 유사한 절단 기능을 수행함)을 들 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "CRISPR"은 클러스터링된 규칙적인 간격을 두고 반복된 짧은 회문식 반복부 경로에 의존적인 서열 특이적 유전자 조작 기법을 나타낸다. CRISPR은 유전자 편집 및/또는 유전자 조절을 수행하기 위해, 뿐만 아니라 단순하게 단백질을 특이적 게놈 위치로 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 편집은 표적 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 결실, 삽입, 또는 염기 치환의 도입을 통해 폴리뉴클레오타이드 서열로 변경되는 유전자 조작의 유형을 나타낸다. 일부 측면으로, CRISPR-매개된 유전자 편집은 편집을 수행하기 위하여 비상동성 단부-결합 (NHEJ) 또는 상동성 재조합의 경로를 활용한다. 유전자 조절은 단백질 또는 RNA와 같은 특정 유전자 생성물의 생성을 증가시키거나 감소시키는 것을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "gRNA" 또는 "가이드 RNA"는 CRISPR 기법을 사용하는 교정을 위해 특정 유전자를 표적화하기 위해 사용된 가이드 RNA를 나타낸다. gRNA 및 표적 특이성에 대한 도너 치료적 폴리뉴클레오타이드를 설계하는 기법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Doench, J., et al. Nature biotechnology 2014; 32(12):1262-7, Mohr, S. et al. (2016) FEBS Journal 283: 3232-38, 및 Graham, D., et al. Genome Biol. 2015; 16: 260. gRNA는 CRISPR RNA (crRNA) 및 교차-활성화 CRIPSPR RNA (tracrRNA)를 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드; 또는 CRISPR RNA (crRNA) 및 교차-활성화 CRIPSPR RNA (tracrRNA)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것들로 이루어진다. 일부 측면으로, gRNA는 합성이다 (Kelley, M. et al. (2016) J of Biotechnology 233 (2016) 74-83). 본원에서 사용되는 바, gRNA의 생물학적 동등물로는, 한정하는 것은 아니지만 Cas9 또는 그것의 동등물을 세포의 게놈의 특정 영역과 같은 특정 뉴클레오타이드 서열로 안내할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 표적화 분자를 들 수 있다.

"조성물"은 활성 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체 및 다른 화합물 또는 조성물, 비활성 (예컨대, 검출 가능한 표지) 또는 활성 (예컨대, 유전자 전달 비히클)의 조합을 의미하는 것으로 의도된다.

"제약학적 조성물"은 활성 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체와, 조성물이 시험관내에서, 생체내에서 또는 생체외에서 진단 또는 치료적으로 사용되기에 적합하게 만드는 비활성 또는 활성 담체, 예컨대 고체 지지체의 조합을 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "제약학적으로 허용되는 담체"는 임의의 표준 제약학적 담체, 예컨대 인산염 완충된 식염수 용액, 물, 및 에멀션, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀션, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다. 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예는 Martin (1975) Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)을 참조한다.

진단 또는 치료의 "대상체"는 세포 또는 포유류, 또는 인간과 같은 동물이다. 대상체는 특정 종에 한정되지 않으며 진단 또는 치료에 대해 비인간 동물 대상체를 포함하고 감염 또는 동물 모델의 대상이 되는 것들, 예를 들어, 유인원, 쥐과, 예컨대 래트, 마우스, 친칠라, 개과, 예컨대 개, 토끼과, 예컨대 토끼, 가축, 스포츠 동물, 및 애완동물이다. 인간 환자도 이 용어 내에 포함된다.

본원에서 사용되는 용어 "조직"은 살아있는 또는 죽은 유기체의 조직 또는 살아있는 또는 죽은 유기체로부터 유래된 또는 그것을 모방하도록 설계된 임의의 조직을 나타낸다. 조직은 건강하거나, 병에 걸렸거나, 및.또는 유전자 변형된 것일 수 있다. 생물학적 조직은 임의의 단일 조직 (예컨대, 상호연결될 수 있는 세포 집단) 또는 장기 또는 유기체의 신체의 부분 또는 영역을 구성하는 조직의 그룹을 포함할 수 있다. 조직은 균일한 세포 물질을 포함할 수 있거나 또는 그것은 예를 들어 폐 조직, 골격 조직, 및/또는 근육 조직을 포함할 수 있는 흉부를 포함한 신체의 영역에서 발견되는 것과 같은 복합 구조체일 수 있다. 예시의 조직으로는, 한정하는 것은 아니지만 간, 폐, 갑상선, 피부, 췌장, 혈관, 방광, 신장, 뇌, 담도계, 십이지장, 복부 대동맥, 장골 정맥, 심장 및 장으로부터 유래된 것들, 및 이것들의 임의의 조합을 들 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 대상체에서 질환의 "치료하는" 또는 "치료"는 (1) 질환의 성향이 있거나 질환의 증상을 아직 나타내지 않은 대상체에서 증상 또는 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; (2) 질환을 억제하거나 질환의 발달을 정지시키는 것; 또는 (3) 질환 또는 질환의 증상을 개선하거나 퇴행을 유발하는 것을 나타낸다. 기술분야에서 이해되는 것과 같이, "치료"는 임상 결과를 포함한, 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 기술의 목적에 대해, 유익한 또는 원하는 결과는 한정하는 것은 아니지만, 검출 가능하거나 검출 가능하지 않거나 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선, 질병 (질환 포함)의 정도의 감소, 질병 (질환 포함)의 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 질병 (질환 포함), 진행의 지연 또는 둔화, 질병 (질환 포함), 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 (부분적이거나 전체적임) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

개시를 수행하는 방식

변형된 바이러스 캡시드 및 제조 방법

AAV 벡터 전달은 현재 바이러스의 자연적인 향성을 토대로 한 또는 표적 조직으로의 직접적인 주사에 의한 조직 표적화를 위한 혈청형 선택의 사용에 의존한다. 만약 전신 전달이 최대 치료 이익을 이루기 위해 필요하다면, 혈청형 선택이 조직 특이적 프로모터와 조합된 조직 표적화를 위한 유일한 이용 가능한 옵션이다. 본원에서 기술된 것과 같이, 출원인은 수용체 결합 및 유입에 기여하는 특정 아미노산을 확인하고 그로써 AAVrh74에서 중요한 아미노산을 확인하기 위한 정교한 돌연변이유발 연구에 대한 필요성을 감소시키는 접근법을 가진다 [7-11] (도 1). 확인된 간 탈표적화에 대한 중요한 영역을 이용하여, 출원인은 근육 특정 벡터 형질도입을 풍부하게 하는 변형된 캡시드를 개발하였다. 간에서 감소된 벡터 손실을 고나심 있는 유전자의 근육 세포 특정 전달과 조합시키는 긍정적인 영향은 신경근 질환의 전신 치료에서 임상 효능에 대한 한계값을 충족시킬 기회를 크게 개선시킬 것이다.

본 개시는 변형된 캡시드 단백질, 분리된 폴리뉴클레오타이드, 변형된 캡시드 단백질의 제조 방법, 재조합 바이러스 입자 및 변형된 바이러스 입자의 생성을 위한 재조합 발현 시스템에 관한 것이다. 개시의 한 측면은 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 바이러스 캡시드 단백질에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은, 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 주로 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포에서 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) (SEQ ID NO: 2)의 삽입이다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 높은 친화성을 가지거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다. 변형된 캡시드는 다른 바이러스 전달 시스템에 통합될 수 있다.

추가의 측면으로, 변형된 바이러스 입자는 유전자 변형을 위한 도입유전자 및/또는 유전자 변형을 위한 CRISPR 시스템을 추가로 포함한다.

또한 본원에는 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드가 개시된다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질, 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 주로 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포에서 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) (SEQ ID NO: 2)의 삽입이다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 높은 친화성을 가지거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다.

본원에는 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 캡시드 단백질을 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 재조합 바이러스 입자가 개시된다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은, 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 추가의 구체예에서, 이 바이러스 입자는 AAVrh74에 비해 질환에 걸린 또는 기능장애 조직에 대한 치료 전달의 효능을 약 3 내지 56배 증가시킨다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 추가의 구체예에서, 질환 또는 기능장애 조직은 심장 조직이다. 또한 추가의 구체예에서, 이 바이러스 입자는 AAVrh74와 비교하여 심장 조직에 대한 치료 전달의 효능을 약 50배 이상 증가시킨다. 일부 구체예에서, 변형은 주로 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포에서 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (SEQ ID NO: 2)의 삽입이다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 높은 친화성을 가지거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다. 일부 구체예에서, 바이러스 입자는 질환 또는 기능장애 조직에 적합한 치료의 유효량을 포함한다. 일부 구체예에서, 치료는 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집이다.

변형된 바이러스, 예컨대, AAV는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 배큘로바이러스 포장 시스템과 같은 바이러스 포장 시스템을 사용하여 포장될 수 있다. 일부 구체예에서, 포장은 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드 및 세포주를 사용함으로써 이루어진다. 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드는 유전자 물질의 세포로의 전달을 용이하게 하는 요소 및 서열을 함유한다. 다른 측면으로, 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 플라스미드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 포장 세포주의 게놈으로 안정적으로 통합되어서, 포장 세포주는 헬퍼 플라스미드로의 추가적인 트랜스펙션을 필요로 하지 않는다.

헬퍼 플라스미드는, 예를 들어, 복제 무능 AAV를 포장하기 위해 필요한 모든 비리온 단백질을 트랜스로 암호화하는 복제-무능 바이러스 게놈으로부터 유래된, 및 복제-가능 AAV의 생성 없이, 복제-무능 AAV를 고역가로 포장할 수 있는 비리온 단백질을 생성하기 위한 적어도 하나의 바이러스 헬퍼 DNA 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 DNA 서열은 바이러스의 바이러스 5' LTR의 천연 인핸서 및/또는 프로모터를 암호화하는 영역이 없고, 헬퍼 게놈을 포장하는데 기여하는 psi 기능 서열 및 과 3' LTR이 둘 다 없지만, 외래 폴리아데닐화 부위, 예를 들어 SV40 폴리아데닐화 부위, 및 바이러스 생성이 바람직한 세포 유형에서 효율적인 전사를 지시하는 외래 인핸서 및/또는 프로모터를 암호화한다. 바이러스는 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 (MMLV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 또는 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV)와 같은 백혈병 바이러스이다. 외래 인핸서 및 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 즉시 초기 (IE) 인핸서 및 프로모터, 몰로니 쥐과 육종 바이러스 (MMSV)의 인핸서 및 프로모터 (U3 영역), 라우스 육종 바이러스 (RSV)의 U3 영역, 비장 초점 형성 바이러스 (SFFV)의 U3 영역, 또는 천연 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 (MMLV) 프로모터에 접합된 HCMV IE 인핸서일 수 있다. 헬퍼 플라스미드는, 예를 들어 제1 헬퍼 서열이 동종지향성(ecotropic) MMLV 또는 GALV의 gag 및 pol 단백질을 암호화하는 cDNA를 함유하고 제2 헬퍼 서열이 env 단백질을 암호화하는 cDNA를 함유한 경우에, 플라스미드 기반 발현 벡터에 의해 암호화된 2개의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열로 구성될 수 있다. 숙주 범위를 결정하는 Env 유전자는 이종향성(xenotropic), 양종향성(amphotropic), 동종지향성, 다중지향성(polytropic) (mink 초점 형성) 또는 10A1 쥐과 백혈병 바이러스 env 단백질, 또는 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV) env 단백질, 인간 면역결핍 바이러스 env (gp160) 단백질, 수포성 구내염 바이러스 (VSV) G 단백질, 인간 T 세포 백혈병 (HTLV) 타입 I 및 II env 유전자 생성물, 상기 언급된 env 유전자의 하나 이상의 조합으로부터 유래된 키메라 엔벨로프 유전자 또는 상기 언급된 env 유전자 생성물의 세포질 및 경막을 암호화하는 키메라 엔벨로프 유전자 및 원하는 표적 세포 상의 특정 표면 분자에 대해 지시된 단클론성 항체를을 암호화하는 유전자로부터 유래될 수 있다.

포장 과정에서, 헬퍼　플라스미드 및 AAV 바이러스 단백질을 암호화하는 플라스미드는 바이러스를 생성할 수 있는 포유류 세포, 에컨대 인간 배아 신장 세포, 예를 들어 293 세포 (ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.)의 제1 집단에 일시적으로 공-트랜스펙션되어 고역가 재조합 레트로바이러스-함유 상층액을 생성할 수 있다. 발명의 다른 방법에서 세포의 이 일시적으로 트랜스펙션된 제1 집단은 나중에 포유류 표적 세포, 예를 들어 인간 림프구와 공동 배양되어 표적 세포를 외래 유전자로 고효율로 형질도입시킨다.

조성물

또한 본 발명에 의해 본원에서 기술된 바이러스 벡터, 분리된 세포, 포장 시스템, 바이러스 입자 중 임의의 하나 이상 및 담체를 포함하는 조성물 또는 키트가 제공된다. 한 측면으로, 담체는 제약학적으로 허용되는 담체이다. 이들 조성물은 본원에서 기술된 것과 같이 치료적으로 사용될 수 있고 다른 공지된 치료법과 함께 사용될 수 있다.

변형된 바이러스 입자의 투여 방법

본원에는 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 비인간 형질도입 동물이 제공된다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은, 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 주로 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포 상에서 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (SEQ ID NO: 2)의 삽입이다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 높은 친화성을 갖거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다.

본원에는 세포를 변형된 캡시드를 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는 재조합 바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 유전자 편집 방법이 개시되며, 여기서 변형된 캡시드는 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나 본질적으로 그것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은, 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 주로 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포 상에서 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (SEQ ID NO: 2)의 삽입이다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 높은 친화성을 갖거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다. 일부 구체예에서, 접촉은 생체내에서 또는 시험관내에서 이루어진다. 일부 구체예에서, 바이러스 입자는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 가이드 RNA (gRNA)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 일부 측면으로, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 치료 폴리펩타이드를 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 바이러스 입자는 Cas9 또는 그것의 동등물을 포함한다.

추가로 본원에는 변형된 캡시드를 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는 재조합 바이러스 입자의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 유전자 편집하는 방법이 개시되며, 여기서 변형된 캡시드는 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은, 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 주로 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포 상에서 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (SEQ ID NO: 2)의 삽입이다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 높은 친화성을 갖거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다. 일부 구체예에서, 바이러스 입자는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 가이드 RNA (gRNA)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 일부 측면으로, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 치료 폴리펩타이드를 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 바이러스 입자는 Cas9 또는 그것의 동등물을 포함한다.

본원에는 변형된 캡시드를 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는 재조합 바이러스 입자를 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 재조합 바이러스 캡시드 입자를 포함하는 비인간 형질도입 동물이 제공되며, 여기서 변형된 캡시드는 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은, 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 주로 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포 상에서 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (SEQ ID NO: 2)의 삽입이다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 높은 친화성을 갖거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다.

일부 측면으로, gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 CRISPR RNA (crRNA) 및 교차-활성화 CRIPSPR RNA (tracrRNA)를 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드; 또는 CRISPR RNA (crRNA) 및 교차-활성화 CRIPSPR RNA (tracrRNA)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것들로 이루어진다. 일부 측면으로, gRNA는 그것을 필요로 하는 대상체 또는 세포에서 유전자 편집을 필요로 하는 DNA의 영역에 대해 특이적이다.

일부 측면으로, 재조합 바이러스 입자는 치료 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 치료 폴리뉴클레오타이드는 편집을 필요로 하는 DNA 서열을 표적화하기 위해 사용될 수 있는 임의의 폴리펩타이드이고, 편집을 필요로 하는 DNA 서열에 대한 수복 주형을 제공하거나 또는 편집을 필요로 하는 DNA 서열에 대한 대체를 제공한다. 추가의 측면으로, 치료 폴리펩타이드는 그것을 필요로 하는 대상체 또는 세포에서 편집을 필요로 하는 유전자의 야생형 서열을 포함한다.

또한 추가의 측면은 본원에서 개시된 변형된 AAV를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애, 또는 질병을 가진 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면으로, 질환, 장애, 또는 질병은 혈우병, 근이영양증, 다발성 경화증, 알파-1-항트립신, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 척추 근육 위축, 낭포성 섬유증, HIV, 지중해 빈혈, 맥락막혈증, 파킨슨병, Leber 선천성 흑암시, 황반 변성, 방향족 아미노산 탈카르복실라제 결핍, 전색맹, 크리글러 나자르(Crigler Najjar) 증후군, 폼페병, X-연관성 망막 분열증, 동형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증, 바텐병, 망막 변성, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍, 점액 다육종증 (I-IX), B형 간염, 및 C형 간염의 군으로부터 선택된다. 한 측면으로, 혈우병은 제VIII 인자 또는 제IX 인자 결핍 중 하나 이상을 특징으로 한다. 일부 측면으로, 근이영양증은 베커 근이영양증, 선천성 근이영양증, 뒤쉔 근이영양증, 원위 근이영양증, 에머리-드레퓌스 근이영양증, 견갑상완 근이영양증, 사지-거들 근이영양증, 근긴장성 근이영양증 및 안구인두 근이영양증으로부터 선택된다.

일부 측면으로, 가이드 RNA 및/또는 치료 폴리뉴클레오타이드는 혈우병, 근이영양증, 다발성 경화증, 알파-1-항트립신, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 척추 근육 위축, 낭포성 섬유증, HIV, 지중해 빈혈, 맥락막혈증, 파킨슨병, Leber 선천성 흑암시, 황반 변성, 방향족 아미노산 탈카르복실라제 결핍, 전색맹, 크리글러 나자르 증후군, 폼페병, X-연관성 망막 분열증, 동형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증, 바텐병, 망막 변성, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍, 점액 다육종증 (I-IX), B형 간염, 및 C형 간염의 군으로부터 선택된 질환, 장애, 또는 질병을 치료하기 위해 설계 및/또는 선택된다. 한 측면으로, 혈우병은 제VIII 인자 또는 제IX 인자 결핍 중 하나 이상을 특징으로 한다. 일부 측면으로, 근이영양증은 베커 근이영양증, 선천성 근이영양증, 뒤쉔 근이영양증, 원위 근이영양증, 에머리-드레퓌스 근이영양증, 견갑상완 근이영양증, 사지-거들 근이영양증, 근긴장성 근이영양증, 및 안구인두 근이영양증으로부터 선택된다.

일부 측면으로, 가이드 RNA 및/또는 치료 폴리뉴클레오타이드는 제VIII 인자 (F8, NM_000132, NM_019863), 제IX 인자 (F9, NM_000133, NM_001313913), 디스트로핀 (DMD, NM_000109, NM_004006, NM_004007, NM_004009, NM_004010), 디스페를린 (DYSF, NM_001130455, NM_001130976, NM_001130977, NM_001130978, NM_001130979), 에메린 (EMD, NM_000117), 라민 A/C (LMNA, NM_001257374, NM_001282624, NM_001282625, NM_001282626, NM_005572), 이중 호메오박스 4 (DUX4, NM_001205218, NM_001278056, NM_001293798, NM_001306068), 미오토닌-단백질 키나제 (MDPK, NM_001081560, NM_001081562, NM_001081563, NM_001288764, NM_001288765), 세포 핵산-결합 단백질 (CNBP, NM_003418, NM_001127192, NM_001127193, NM_001127194, NM_001127195), 폴리아데닐레이트-결합 단백질-2 (PABP-2, NM_004643), 알파-1-항트립신, 수퍼옥사이드 이스뮤타제 (SOD1, NM_000454), 알신 (ALS2, NM_001135745, NM_020919), 헬라카제 ㅅ세나탁신 (SETX, NM_015046), 스파탁신 (SPG11, NM_001160227, NM_025137), RNA-binding 단백질 FUS/TLS (FUS, NM_001010850, NM_001170634, NM_001170937, NM_004960), 소포-관련 막 단백질-회합 단백질 B/C (VAPB, NM_001195677, NM_004738), 안지오게닌 (ANG, NM_001145, NM_001097577), TAR DNA-결합 단백질 43 (TARDBP, NM_007375), 폴리포스포이노시타이드 포스파타제 (FIG4, NM_014845), 옵티뉴린 (OPTN, NM_001008211, NM_001008212, NM_001008213, NM_021980), 아탁신-2 (ATXN2, NP_001297050, NP_001297052, NP_002964), 발로신-함유 단백질 (VCP, NM_007126), 유비퀼린-2 (UBQLN2, NM_013444), 시그마-1 수용체 (SIGMAR1, NM_001282205, NM_001282206, NM_001282207, NM_001282208, NM_001282209), 대전된 다중소포체 단백질 2b (CHMP2B, NM_001244644, NM_014043), 프로필린-1 (PFN1, NM_005022), 수용체 티로신-단백질 키나제 erbB-4 (ERBB4, NM_001042599, NM_005235), 이종성 핵 리보뉴클레오단백질 A1 (HNRNPA1, NM_002136, NM_031157), 마트린-3 (MATR3, NM_199189, NM_001194954, NM_001194955, NM_001194956, NM_001282278), 튜불린 알파-4A 사슬 (TUBA4A, NM_001278552, NM_006000), 염색체 9 오픈 리딩 프레임 72 (C9orf72, NM_145005, NM_001256054, NM_018325), CHCD10, SQSTM1 (NM_001142298), TBK1, 아포리포단백질 E (NM_001302691, NM_000041, NM_001302688, NM_001302689, NM_001302690), SMN1 (NM_000344), SMN2 (NM_017411, NM_022875, NM_022876, NM_022877), CTFR (NM_000492), 베타 글로빈 HBB PDB, CHM, 알파-시누클레인 (SNCA, NM_000345), 파르킨 (PRKN, NM_004562), 류신-풍부 반복 키나제 2 (LRRK2 또는 다르다린, NM_198578), PTEN-유도 추정 키나제 1 (PINK1, NM_032409), DJ-1 (NM_001123377), 산 말타제 (NM_000152), UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1 (NM_000463), PPT-1 (NM_000310), 또는 ATP13A2 (NM_001141973)의 군으로부터 선택된 유전자를 표적화 또는 수복하기 위해 설계 및/또는 선택된다.

발명의 추가적인 측면은 담체 및 본원에서 기술된 변형된 바이러스를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 간단히 설명하면, 본 발명의 제약학적 조성물은 본원에 기술된 변형된 바이러스 입자를, 하나 이상의 제약학적으로 또는 생리적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 완충제; 글루코스, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩타이드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트화제; 보조제 (예컨대, 알루미늄 하이드록사이드); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 개시의 조성물은 경구, 정맥내, 국소, 장, 및/또는 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시의 조성물은 정맥내 투여를 위해 제제화된다.

기술분야의 숙련된 사람들에게는 gRNA가 특정 유전자, 선택적으로 질환, 장애, 또는 질병과 관련된 유전자를 표적화하기 위한 표적 특이성을 위해 생성될 수 있다는 것이 인정된다. 그러므로, Cas9와 조합하여, 가이드 RNA는 CRISPR/Cas9 시스템의 표적 특이성을 용이하게 한다. 상기에서 논의된 것과 같이, 프로모터 선택과 같은 추가의 측면은 표적 특이성을 이루는 추가적인 메커니즘 - 예컨대, 특정 장기 또는 조직에서 발현을 용이하게 하는 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 가이드 RNA에 대한 프로모터를 선택하는 것을 제공할 수 있다. 따라서, 특정 질환, 장애, 또는 질병에 대한 적합한 gRNA의 선택이 본원에서 고려된다.

변형된 AAV 또는 조성물의 투여는 전 치료 과정을 통해 1회 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 실시될 수 있다. 투여는 한정하는 것은 아니지만, 다음을 포함한 임의의 적합한 투여 방식을 통해 이루어질 수 있다: 정맥내, 동맥내, 근육내, 심장내, 척수강내, 심실하, 경막외, 뇌내, 뇌실내, 망막하, 유리체내, 관절내, 안구내, 복강내, 자궁내, 피내, 피하, 경피, 경점막 및 흡입.

투여의 가장 효과적인 수단 및 투여량을 투여하는 방법은 기술분야의 숙련된 사람들에게 알려져 있고 치료법에 사용된 조성물, 치료법의 목적 및 치료되는 대상에 따라 달라질 것이다. 단일 또는 다중 투여가 치료하는 의사에 의해 선택된 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 투여량은 투여 경로에 의해 영향을 받을 수 있는 것이 주지된다. 적합한 투여 제제 및 작용제의 투여 방법은 기술분야에 알려져 있다. 이러한 적합한 투여량의 비제한적인 예는 투여당 1E+9 벡터 게놈만큼 낮거나 1E+17 벡터 게놈만큼 높을 수 있다.

추가의 측면으로, 발명의 변형된 바이러스 입자 및 조성물은 다른 치료, 예컨대, 특정 질환, 장애, 또는 질병에 적합한 승인된 치료와 함께 투여될 수 있다. 비제한적인 예로는 변형된 바이러스 입자와 하나 이상의 스테로이드의 조합으로 근이영양증을 치료하는 것을 들 수 있다. 당업자는 치료하는 의사에 의해 측정되는 바와 같이, 유전자 변형의 임상 또는 하위임상 증거에 대해 모니터링함으로써 치료가 성공적인지의 여부를 결정할 수 있다.

발명의 변형된 바이러스 입자 또는 조성물의 이런 투여는 실험 및 스크리닝 검정을 위해 원하는 질환, 장애, 또는 질병의 동물 모델을 생성하기 위해 실시될 수 있다.

변형된 AAV 캡시드 및 입자

본 개시는 특정 구체예, 예컨대, 변형된 캡시드를 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는 재조합 바이러스를 포함하는 변형된 아데노-관련 바이러스 (AAV)를 제공하며, 여기서 변형된 캡시드는 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은, 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 주로 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포 상에서 발견되는 수용체를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (SEQ ID NO: 2)의 삽입이다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 이 펩타이드는 알파 7 베타 1 인테그린에 대한 높은 친화성을 갖거나 및/또는 정상적인 rh74 수용체 결합을 변경시킬 가능성이 있는 영역에 위치한다.

아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터는 유전자 카고를 세포에 효율적으로 전달하기 위해 조작된 복제 결핍 바이러스이다. 이것들은 이들의 벡터 형태에서 원래의 바이러스의 반전된 말단 반복부 (ITR)만을 가지는 비-엔벨로프 바이러스이다. 구조적 및 효소적 AAV 단백질은 추가적인 플라스미드에 의해 트랜스로 공급되고 유전자 전달을 위한 조작된 입자를 생성하기 위해 세포에 함께 트랜스펙션된다. AAV는 이들의 안전성 및 효율로 인해 유전자 요법에 광범위하게 - 보다 구체적으로 CRIPS/Cas9 시스템과 함께 - 사용되어 왔다. AAV는 다양한 세포를 효율적으로 감염시키고 감염 과정 중에 캡시드는 핵에 결합하여 그 안으로 들어가서 벡터 게놈이 전달된다.

AAV 구조 입자는 VP1, VP2 및 VP3으로 구성된 60개의 단백질 분자로 구성된다. 각각의 입자는 정이십면체 구조로 정렬된 대략 5개의 VP1 단백질, 5개의 VP2 단백질 및 50개의 VP3 단백질을 함유한다. AAV2 입자는 캡시드 구조 내의 다양한 부위에서 펩타이드 및 단백질의 삽입을 지지할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 특유한 펩타이드를 캡시드에 도입시키는 능력은 정상적으로 감염에 대해 불응성일 수 있는 세포 및 조직에 바이러스가 결합하여 그것을 감염시키는 것을 허용하는 변경된 향성을 가진 AAV 입자를 개발하는 것으로 이어졌다. 더불어, 큰 펩타이드 및 심지어 기능적인 단백질은 AAV2 벡터의 캡시드에 도입되었고, 성공 수준은 달랐다. AAV 캡시드를 함유한 기능적 녹색 형광 단백질 (GFP, 30 kD MW)이 생성되었고 세포 감염을 추적하는 데 사용된 감염성 바이러스를 생산하였다.

유전자 전달을 위한 AAV 벡터를 사용할 때의 제약 중 하나는 입자 안으로 효율적으로 포장될 수 있는 유전자 삽입물의 크기 제한이다. 예를 들어, 야생형 AAV2 게놈의 크기는 단일 가닥 DNA의 4679 염기이다. Cas9의 새로운 더 작은 변이체 중 하나 (스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9, SaCas9, 130 kD MW)의 포장은 단지 코딩 영역에 대해 대략 3255 bp를 필요로 한다. 구성물에 편재성 또는 조직 특이적 프로모터를 첨가하는 것은 또 다른 500 내지 800 bp를 추가할 수 있다. 폴리 A 첨가 서열 및 ITR 및 벡터를 위해 또 다른 500 bp를 포함시키는 것은 AAV 입자의 포장 용량에 가까워진다. 기능적 CRISPR/Cas9 유전자 교정을 이루기 위해 표적 서열을 가진 가이드 RNA (gRNA)가 또한 포함되어야 한다. 이런 RNA가 발현되기 위해서는 최소한의 polIII 프로모터 및 종결 서열을 추가로 필요로 한다. 이들 요소를 함께 하면 효율적으로 포장되는 AAV 벡터로 조합되기에는 너무 크다. 당업자는 Cas9 구성물 및 가이드 RNA 발현 카세트를 별도의 벡터에 포장하는 것을 선택할 수 있지만, 이것들이 기능적이 되기 위해서는, 두 바이러스가 동일한 표적 세포를 감염시켜야 한다.

개시의 추가의 측면은 이러한 변형된 AAV의 생성을 위한 재조합 발현 시스템에 관한 것이다. 일부 구체예에서 재조합 발현 시스템은 복수의 플라스미드; AAV 바이러스 단백질 - VP1, VP2, 및 VP3을 전부 암호화하는 복수를 포함한다. 일부 구체예에서, 각각의 바이러스 단백질은 상이한 플라스미드에서 암호화된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 동일한 플라스미드에서 암호화된다. 일부 구체예에서, 적어도 한 바이러스 단백질이 Cas9와의 융합 단백질로서 암호화된다.

따라서, 본원에 개시된 구체예는 변형된 캡시드를 포함하는 변형된 AAV의 생성을 위한 재조합 발현 시스템에 관한 것이며, 여기서 변형된 캡시드는 1 내지 7개 아미노산의 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 변형된 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 변형된 바이러스 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이러스 캡시드 단백질은, 선택적으로 AAVrh74의 VP1이다. 추가의 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라긴에 대한 아이소류신의 치환 또는 동등한 변형을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 측면으로, 펩타이드의 다른 아미노산이 변형되지만 이 치환은 유지된다. 일부 구체예에서, 변형은 주로 위성 세포, 선택적으로 근육 줄기 세포 상에서 발견되는 수용체를 표적으로 한다.

일부 측면은 본원에서 개시된 재조합 발현 시스템을 사용하여 변형된 AAV를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한 추가의 측면은 본원에서 개시된 변형된 AAV를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애, 또는 질병을 가진 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 질환, 장애, 또는 질병은 혈우병, 근이영양증, 다발성 경화증, 알파-1-항트립신, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 척추 근육 위축, 낭포성 섬유증, HIV, 지중해 빈혈, 맥락막혈증, 파킨슨병, Leber 선천성 흑암시, 황반 변성, 방향족 아미노산 탈카르복실라제 결핍, 전색맹, 크리글러 나자르 증후군, 폼페병, X-연관성 망막 분열증, 동형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증, 바텐병, 망막 변성, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍, 점액 다육종증 (I-IX), B형 간염, 및 C형 간염의 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 혈우병은 제VIII 인자 또는 제IX 인자 결핍 중 하나 이상을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 근이영양증은 베커 근이영양증, 선천성 근이영양증, 뒤쉔 근이영양증, 원위 근이영양증, 에머리-드레퓌스 근이영양증, 견갑상완 근이영양증, 사지-거들 근이영양증, 근긴장성 근이영양증, 및 안구인두 근이영양증으로부터 선택된다.

실시예

다음의 실시예는 개시를 실제로 실시하는 다양한 경우에 사용될 수 있는 비제한적이고 예시적인 과정이다. 추가적으로, 하기 본원에서 개시된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.

AAVrh74는 신경근육 질환의 치료를 위한 임상 실험에서 광범위하게 사용되어 온 NCH의 연구자들에 의해 확인된 AAV의 혈청형이다. 이것은 인간 심장 및 골격근을 효율적으로 감염시키고, 인간 집단에서 기존의 중화 항체의 유병률은 낮다.

실시예 1 - 혈관 전달에 의한 최대 근모세포 및 위성 세포 생물분포를 위한 최적의 변형된 혈청형을 결정한다.

근육 위성 세포는 골격근에서 근육 섬유 세포보다 60배 더 풍부하다 [2]. 이것들은 골격근의 장기간 재생 능력을 촉진하는 자체-재생 줄기 세포 집단이다 [12]. 최근 여러 개의 FACS-분류 가능한 마커가 근육 줄기 세포의 분리를 위해 확인되었다 [13](도 2). 알파 7 베타 1 인테그린은 양성 근육 줄기 세포 선택 마커로서 확인되었고 또한 골격 근모세포 및 성인 근섬유 상의 일차 라미닌 수용체이다. 발현 연구 결과 알파 7 베타 1 인테그린이 심장 및 골격근 조직에서 풍부하게 발현되며 간 조직에서만 낮은 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 출원인은 알파 7 베타 1 인테그린 단백질에 대해 높은 친화도로 결합하는 것으로 밝혀진 펩타이드를 발현시키기 위하여 AAVrh74 캡시드를 변형시켰다. 출원인은 α7β1-인테그린을 결합 수용체로서 사용하기 위하여 정상적인 AAVrh74 수용체 결합 모티프를 변경시킬 가능성이 있는 영역에 펩타이드를 배치하였다. 간 특이적 결합 및 유입에 필요할 것으로 가설을 세운 AAVrh74의 또 다른 아미노산에서 2개의 추가적인 돌연변이를 또한 확인하였고 그것들은 벡터의 정맥내 주사 후에 리포터 유전자의 증가된 전체 및/또는 근육 특정 전달을 가능하게 하는 것으로 나타났다 (도 3 내지 5).

C57BL/6J 마우스를 새롭게 생성한 변형된 캡시드 바이러스 또는 이전에 입증된 것과 동일한 루시페라제-EYFP 융합 단백질을 발현하는 대조군 AAVrh74 (AAVmut4, AAVmut5 및 AAVYIG 또는 YIGSR591)로 정맥내 주사하였고, 3주 후에, 마우스를 PBS/파라포름알데하이드 관류로 희생시킨 후 섹션화한 근육 및 장기를 면역조직화학적으로 염색하여 형질도입된 특정 세포 집단을 측정하였다. 처음에, 마우스를 IVIS 영상화 시스템을 사용하여 루시페라제 발현에 대해 주마다 영상화하여 유전자 발현을 확인한다. 주사 후 3주 후에, 마우스를 관류하고, 조직을 수득하여 파라포름알데하이드에 고정시킨 후, 섹션화하고 면역형광에 의해 GFP 발현에 대해 염색하고 확인을 위해 세포 유형 특이적 항원의 발현에 대해 대비염색하였다. 이 접근법은 출원인이 어느 것이 표적화된 근육 질환에 대해 최대 이익을 가질 가능성이 있는가를 결정하기 위해 상이한 캡시드 돌연변이 벡터에 의해 형질도입된 특정 세포 집단을 확인하는 것을 가능하게 하였다.

AAVrh74는 현재 골격 및 심장 근육에서 고수준의 유전자 발현에 대한 표준이고 캡시드 변형에 대한 골격으로서 사용하였다. CD-1 마우스의 정맥내 주사 후에 벡터 생물분포를 대조군 및 3개의 캡시드 변형된 바이러스의 주사 후 3주 후에 qPCR에 의해 결정하였다 (도 3). mut4 벡터는 벡터의 전체적으로 증가된 전체 생물분포를 보여주었고 대퇴사두근(quad), 횡경막 및 심장 근육에서 상당한 증가가 있었다. 반면, mut5 및 YIG 또는 YIGSR591은 AAVrh74보다 심장의 상당히 증가된 벡터 형질도입을 보였다.

조직	AAVrh74를 능가하는 Mut4 배수 변화
혈액	18
뇌	8
폐	5
Quad	10
횡경막	17
심장	11
비장	3
신장	8
간	56

도 4 및 5는 모(parental) AAVrh74를 능가하는 mut4 및 YIG 또는 YIGSR591 전달된 루시페라제 유전자의 향상된 생체내 발현을 도시한다. 도 4는 광범위한 조직에서 형질도입 및 유전자 발현에 있어 mut4 바이러스의 유효성을 나타내기 위해 괄호로 묶인 헤드 영역 또는 하부 몸통에서 증가된 광자 수를 보여준다.

근친 교배된 C57BL/6J 마우스 (바이러스 그룹당 6마리, 3마리 수컷 및 3마리 암컷)를 사용하여 이계 교배된 CD-1 마우스의 이전의 생물분포 프로파일을 확인한다. 4개의 바이러스를 제조하고 도착했을 때 마우스에게 주사할 준비가 되었다.

동등물

다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 기술이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다.

본원에서 예시적으로 기술된 본 기술은 본원에서 구체적으로 개시되지 않은 어떠한 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재시에 적합하게 실시될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 용어 "포함하는", "함유하는" 등은 확장적으로 및 제한 없이 판독되어야 한다. 추가적으로, 본원에서 사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로서 제한 없이 사용되었고, 제시되고 기술된 특징 또는 그것의 일부의 어떠한 동등물을 배제하는 그러한 용어 및 표현의 사용은 의도되지 않지만, 다양한 변형이 청구되는 본 기술의 범주 내에서 가능한 것으로 인식된다.

그러므로, 본원에서 제공된 물질, 방법, 및 실시예는 바람직한 측면을 나타내고, 예시적이며, 본 기술의 범주에 대한 제한으로서 의도되지 않는 것이 이해되어야 한다.

본 기술은 본원에서 폭넓고 일반적으로 기술되었다. 일반적인 개시 내에 속하는 보다 좁은 종 및 하위-일반 그룹화의 각각 또한 본 기술의 일부를 형성한다. 이것은 삭제된 물질이 본원에서 구체적으로 인용되었는지의 여부와 관계없이, 속(genus)으로부터 어떠한 주제를 제거하는 단서 또는 부정적 제한과 함께 본 기술의 일반적인 설명을 포함한다.

또한, 본 기술의 특징 또는 측면이 Markush 그룹의 관점에서 기술되는 경우, 기술분야의 숙련된 사람드른 본 기술이 또한 그로 인해 Markush 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원들의 하위그룹의 관점에서도 기술되는 것을 인식할 것이다.

본원에서 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 각각이 개별적으로 참조로 포함되는 것과 같은 정도로 그 전문이 분명하게 참조로 포함된다. 이해충돌의 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.

다른 측면들은 다음의 청구범위 내에서 제시된다.

참고문헌

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13. Wang, Y.X., N.A. Dumont, and M.A. Rudnicki, Muscle stem cells at a glance. J Cell Sci, 2014. 127(21): p. 4543-8.

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서열

SEQ ID NO:1 NM_000231.2 호모 사피엔스 사르코글리칸 감마 (SGCG), mRNA

GAAACTCGTGAGAGCCCTTTCTCCAGGGACAGTTGCTGAAGCTTCATCCTTTGCTCTCATTCTGTAAGTCA

TAGAAAAGTTTGAAACATTCTGTCTGTGGTAGAGCTCGGGCCAGCTGTAGTTCATTCGCCAGTGTGCTTTT

CTTAATATCTAAGATGGTGCGTGAGCAGTACACTACAGCCACAGAAGGCATCTGCATAGAGAGGCCAGAGA

ATCAGTATGTCTACAAAATTGGCATTTATGGCTGGAGAAAGCGCTGTCTCTACTTGTTTGTTCTTCTTTTA

CTCATCATCCTCGTTGTGAATTTAGCTCTTACAATTTGGATTCTTAAAGTGATGTGGTTTTCTCCAGCAGG

AATGGGCCACTTGTGTGTAACAAAAGATGGACTGCGCTTGGAAGGGGAATCAGAATTTTTATTCCCATTGT

ATGCCAAAGAAATACACTCCAGAGTGGACTCATCTCTGCTTCTACAATCAACCCAGAATGTGACTGTAAAT

GCGCGCAACTCAGAAGGGGAGGTCACAGGCAGGTTAAAAGTCGGTCCCAAAATGGTAGAAGTCCAGAATCA

ACAGTTTCAGATCAACTCCAACGACGGCAAGCCACTATTTACTGTAGATGAGAAGGAAGTTGTGGTTGGTA

CAGATAAACTTCGAGTAACTGGGCCTGAAGGGGCTCTTTTTGAACATTCAGTGGAGACACCCCTTGTCAGA

GCCGACCCGTTTCAAGACCTTAGATTAGAATCCCCCACTCGGAGTCTAAGCATGGATGCCCCAAGGGGTGT

GCATATTCAAGCTCACGCTGGGAAAATTGAGGCGCTTTCTCAAATGGATATTCTTTTTCATAGTAGTGATG

GAATGCTTGTGCTTGATGCTGAAACTGTGTGCTTACCCAAGCTGGTGCAGGGGACGTGGGGTCCCTCTGGC

AGCTCACAGAGCCTCTACGAAATCTGTGTGTGTCCAGATGGGAAGCTGTACCTGTCTGTGGCCGGTGTGAG

CACCACGTGCCAGGAGCACAGCCACATCTGCCTCTGAGCTGCCTGCGTCCTCTCGGTGAGCTGTGCAGTGC

CGGCCCCAGATCCTCACACCCAGGGAGCAGCTGCACATCGTGAAAGACTGAGGCAGCGTGGATGGGAAGTA

AACGCTTCCAGAGGAACTCAGAAAAAATTATGTGCCAGTGAAAGTGTTTGGACAAAAACTACATGATCTCA

AAATGCACGTGGATGTGAGACACAAAAGTTGACAAAATGGAAAAGCAATGTGTTTTTCCACTGGATTAATT

TTCACCGGAACAATTGCGAATTCTCTCTGCCTCGCCTCCCCCTATCTTGTCCGTGTGGGCACACACTGAGT

GTTGAGTTGCCGTGTGGAGTTAATGTATGACGCTCCACTGTGGATATCTAATGCCCTGTTGAGAGTAGCCT

TGCTCAGTACTAAAATGCCCCAAAGTTCTATACAGCATTTCCTTTATAGCATTCAAACCTCACATCCTCCC

TTCAGTTTAATGCAAGTAAGTCAGGTTTCACAAGAAAATTTTCAAGTTTTGAAGGGAATTTGAGGTTGATC

TGGTTTTCAAGATGTAGTTAAAGGAATAAATCACTCAAAATTAAACTTTCTGTATATAGTCAATAAGCAAT

AAAAACCTCATTTTTCAGAGTTAAAAAA

캡시드 유전자의 야생형 AAV rh74 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO: 3):

atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgcgagtggtggga

cctgaaacctggagccccgaaacccaaagccaaccagcaaaagcaggacaacggccggggtctggtgcttc

ctggctacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcg

gccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctccaagcgggtgacaatccgtacctgcggtataatca

cgccgacgccgagtttcaggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgcgcagtct

tccaggccaaaaagcgggttctcgaacctctgggcctggttgaatcgccggttaagacggctcctggaaag

aagagaccggtagagccatcaccccagcgctctccagactcctctacgggcatcggcaagaaaggccagca

gcccgcaaaaaagagactcaattttgggcagactggcgactcagagtcagtccccgaccctcaaccaatcg

gagaaccaccagcaggcccctctggtctgggatctggtacaatggctgcaggcggtggcgctccaatggca

gacaataacgaaggcgccgacggagtgggtagttcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctggg

cgacagagtcatcaccaccagcacccgcacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaagcaaa

tctccaacgggacctcgggaggaagcaccaacgacaacacctacttcggctacagcaccccctgggggtat

tttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactgggg

attccggcccaagaggctcaacttcaagctcttcaacatccaagtcaaggaggtcacgcagaatgaaggca

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gtgctcggctcggcgcaccagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtcttcatgattcctcagtacgg

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ctcaaatgctgagaacgggcaacaactttgaattcagctacaacttcgaggacgtgcccttccacagcagc

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gggagctgcagaaggagaacagcaaacgctggaacccagagattcagtacacttccaactactacaaatct

acaaatgtggactttgctgtcaatactgagggtacttattccgagcctcgccccattggcacccgttacct

cacccgtaatctgtaa

야생형 AAV rh74 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 4):

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAA

ALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGK

KRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMA

DNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGY

FDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPY

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YAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQ

NNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEI

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변형된 캡시드 - AA 서열 (SEQ ID NO: 5)

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KRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMA

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SEQUENCE LISTING <110> RESEARCH INSTITUTE AT NATIONWIDE CHILDREN'S HOSPITAL <120> INCREASING TISSUE SPECIFIC GENE DELIVERY BY CAPSID MODIFICATION <130> 106887-7170 <140> <141> <150> 62/644,317 <151> 2018-03-16 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1661 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaaactcgtg agagcccttt ctccagggac agttgctgaa gcttcatcct ttgctctcat 60 tctgtaagtc atagaaaagt ttgaaacatt ctgtctgtgg tagagctcgg gccagctgta 120 gttcattcgc cagtgtgctt ttcttaatat ctaagatggt gcgtgagcag tacactacag 180 ccacagaagg catctgcata gagaggccag agaatcagta tgtctacaaa attggcattt 240 atggctggag aaagcgctgt ctctacttgt ttgttcttct tttactcatc atcctcgttg 300 tgaatttagc tcttacaatt tggattctta aagtgatgtg gttttctcca gcaggaatgg 360 gccacttgtg tgtaacaaaa gatggactgc gcttggaagg ggaatcagaa tttttattcc 420 cattgtatgc caaagaaata cactccagag tggactcatc tctgcttcta caatcaaccc 480 agaatgtgac tgtaaatgcg cgcaactcag aaggggaggt cacaggcagg ttaaaagtcg 540 gtcccaaaat ggtagaagtc cagaatcaac agtttcagat caactccaac gacggcaagc 600 cactatttac tgtagatgag aaggaagttg tggttggtac agataaactt cgagtaactg 660 ggcctgaagg ggctcttttt gaacattcag tggagacacc ccttgtcaga gccgacccgt 720 ttcaagacct tagattagaa tcccccactc ggagtctaag catggatgcc ccaaggggtg 780 tgcatattca agctcacgct gggaaaattg aggcgctttc tcaaatggat attctttttc 840 atagtagtga tggaatgctt gtgcttgatg ctgaaactgt gtgcttaccc aagctggtgc 900 aggggacgtg gggtccctct ggcagctcac agagcctcta cgaaatctgt gtgtgtccag 960 atgggaagct gtacctgtct gtggccggtg tgagcaccac gtgccaggag cacagccaca 1020 tctgcctctg agctgcctgc gtcctctcgg tgagctgtgc agtgccggcc ccagatcctc 1080 acacccaggg agcagctgca catcgtgaaa gactgaggca gcgtggatgg gaagtaaacg 1140 cttccagagg aactcagaaa aaattatgtg ccagtgaaag tgtttggaca aaaactacat 1200 gatctcaaaa tgcacgtgga tgtgagacac aaaagttgac aaaatggaaa agcaatgtgt 1260 ttttccactg gattaatttt caccggaaca attgcgaatt ctctctgcct cgcctccccc 1320 tatcttgtcc gtgtgggcac acactgagtg ttgagttgcc gtgtggagtt aatgtatgac 1380 gctccactgt ggatatctaa tgccctgttg agagtagcct tgctcagtac taaaatgccc 1440 caaagttcta tacagcattt cctttatagc attcaaacct cacatcctcc cttcagttta 1500 atgcaagtaa gtcaggtttc acaagaaaat tttcaagttt tgaagggaat ttgaggttga 1560 tctggttttc aagatgtagt taaaggaata aatcactcaa aattaaactt tctgtatata 1620 gtcaataagc aataaaaacc tcatttttca gagttaaaaa a 1661 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 3 <211> 2217 <212> DNA <213> Adeno-associated virus <400> 3 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60 gagtggtggg acctgaaacc tggagccccg aaacccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120 aacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctcc aagcgggtga caatccgtac ctgcggtata atcacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgcgc agtcttccag 360 gccaaaaagc gggttctcga acctctgggc ctggttgaat cgccggttaa gacggctcct 420 ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgctctc cagactcctc tacgggcatc 480 ggcaagaaag gccagcagcc cgcaaaaaag agactcaatt ttgggcagac tggcgactca 540 gagtcagtcc ccgaccctca accaatcgga gaaccaccag caggcccctc tggtctggga 600 tctggtacaa tggctgcagg cggtggcgct ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660 ggagtgggta gttcctcagg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720 atcaccacca gcacccgcac ctgggccctg cccacctaca acaaccacct ctacaagcaa 780 atctccaacg ggacctcggg aggaagcacc aacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 840 ccctgggggt attttgactt caacagattc cactgccact tttcaccacg tgactggcag 900 cgactcatca acaacaactg gggattccgg cccaagaggc tcaacttcaa gctcttcaac 960 atccaagtca aggaggtcac gcagaatgaa ggcaccaaga ccatcgccaa taaccttacc 1020 agcacgattc aggtctttac ggactcggaa taccagctcc cgtacgtgct cggctcggcg 1080 caccagggct gcctgcctcc gttcccggcg gacgtcttca tgattcctca gtacgggtac 1140 ctgactctga acaatggcag tcaggctgtg ggccggtcgt ccttctactg cctggagtac 1200 tttccttctc aaatgctgag aacgggcaac aactttgaat tcagctacaa cttcgaggac 1260 gtgcccttcc acagcagcta cgcgcacagc cagagcctgg accggctgat gaaccctctc 1320 atcgaccagt acttgtacta cctgtcccgg actcaaagca cgggcggtac tgcaggaact 1380 cagcagttgc tattttctca ggccgggcct aacaacatgt cggctcaggc caagaactgg 1440 ctacccggtc cctgctaccg gcagcaacgc gtctccacga cactgtcgca gaacaacaac 1500 agcaactttg cctggacggg tgccaccaag tatcatctga atggcagaga ctctctggtg 1560 aatcctggcg ttgccatggc tacccacaag gacgacgaag agcgattttt tccatccagc 1620 ggagtcttaa tgtttgggaa acagggagct ggaaaagaca acgtggacta tagcagcgtg 1680 atgctaacca gcgaggaaga aataaagacc accaacccag tggccacaga acagtacggc 1740 gtggtggccg ataacctgca acagcaaaac gccgctccta ttgtaggggc cgtcaatagt 1800 caaggagcct tacctggcat ggtgtggcag aaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc 1860 tgggccaaga ttcctcatac ggacggcaac tttcatccct cgccgctgat gggaggcttt 1920 ggactgaagc atccgcctcc tcagatcctg attaaaaaca cacctgttcc cgcggatcct 1980 ccgaccacct tcaatcaggc caagctggct tctttcatca cgcagtacag taccggccag 2040 gtcagcgtgg agatcgagtg ggagctgcag aaggagaaca gcaaacgctg gaacccagag 2100 attcagtaca cttccaacta ctacaaatct acaaatgtgg actttgctgt caatactgag 2160 ggtacttatt ccgagcctcg ccccattggc acccgttacc tcacccgtaa tctgtaa 2217 <210> 4 <211> 738 <212> PRT <213> Adeno-associated virus <400> 4 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp 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Claims (15)

1. 변형된 AAVrh74 VP1 캡시드 단백질로서, AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 502에서 아스파라기에 대한 아이소류신의 치환, AAVrh74의 VP1의 아미노산 505에서 트립토판의 아르기닌으로의 치환, 및 AAVrh74의 VP1의 아미노산 위치 591에서 펩타이드 YIG 또는 YIGSR (SEQ ID NO: 2)의 삽입, 또는 이것들의 각각의 동등물의 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 변형된 AAVrh74 VP1 캡시드 단백질.
2. 제1항의 변형된 AAVrh74 VP1을 포함하는 재조합 바이러스 입자.
3. 제2항에 있어서, 재조합 바이러스 입자는 변형된 AAVrh74인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 입자.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 도입유전자 또는 CRISPR 시스템을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 입자.
5. 선택적으로 벡터 내에 함유되어 있는, 제1항의 변형된 AAVrh74 VP1 및/또는 제2항 또는 제3항의 재조합 바이러스 입자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
6. 선택적으로 제5항의 벡터를 포함하는 제3항의 재조합 바이러스 입자를 제조하기 위한 재조합 발현 시스템.
7. 제5항의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
8. 세포에서 폴리뉴클레오타이드 및/또는 단백질을 변형시키는 방법으로서, 세포에 제1항 또는 제4항의 변형된 캡시드 단백질, 또는 제2항의 바이러스 입자를 포함하는 재조합 바이러스 입자의 유효량을 전달하는 단계를 포함하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 포유류 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 대상체에서 폴리뉴클레오타이드 및/또는 단백질을 변형시키는 방법으로서, 대상체에게 제1항 또는 제4항의 변형된 캡시드 단백질, 또는 제2항의 바이러스 입자를 포함하는 재조합 바이러스 입자의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 대상체는 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 포유류는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 국소적이거나 전신적인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제1항 또는 제4항의 변형된 캡시드 단백질, 또는 제2항의 바이러스 입자를 포함하는 재조합 바이러스 입자를 포함하는 키트.

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