BR112020018354A2 - Aumento de fornecimento gênico específico a tecido através de modificação de capsídeo - Google Patents

Abstract

proteínas do capsídeo modificadas, polinucleotídeos isolados, métodos para a preparação de proteínas do capsídeo modificadas, partículas virais recombinantes, sistemas de expressão recombinantes para a produção de partículas virais modificadas e métodos de edição e regulação gênica são proporcionados aqui.

Description

“AUMENTO DE FORNECIMENTO GÊNICO ESPECÍFICO A TECIDO ATRAVÉS DE MODIFICAÇÃO DE CAPSÍDEO” RELATÓRIO DESCRITIVO REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS CORRELATOS

[001] Este Pedido de Patente reivindica prioridade ao Pedido de Patente U.S. Provisório No. de Série 62/644,317, depositado em 16 de março de 2018, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência.

DECLARAÇÃO EM RELAÇÃO AO SUPORTE DO GOVERNO

[002] A invenção foi realizada com suporte do governo sob o No. de Concessão 82081315 outorgado pelos National Institutes of Health and the National Center for Advancing Translational Sciences. O governo tem certos direitos na invenção.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [002.1] O presente Pedido de patente contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é incorporada aqui como referência em sua totalidade. A dita cópia de ASCII, criada em 26 de fevereiro de 2019, foi nomeada 106887- 7170_SL.txt e tem um tamanho de 18.492 bytes.

ANTECEDENTES

[003] Foram feitos esforços para modificar os capsídeos de AAV para fornecimento gênico aprimorado. Por exemplo, a WO 2017/165859A1 descreve uma modificação do capsídeo viral em que a Cas9 é fundida ou conjugada à proteína do capsídeo viral para promover a edição gênica customizável. Referências adicionais descreveram o uso do embaralhamento da família de DNA (Grimm a

Kay), substituições de lisina na AAVrh74 (US 2015/006556), mutações nas posições 195, 199, 201 ou 202 de AAVrh74 (US 9.840.719) e modificações na AAVrh48 (EP 2359866). Mais referências adicionais detalham bibliotecas de peptídeos aleatórios que são exibidas na superfície de um AAV (por exemplo, Muller (2003) Nat. Biotechnol., Perabo (2003) Mol. Ther. e 7.588.722 (Grimm e Kay)).

[004] Os tratamentos com terapia gênica para Distrofias Musculares exigirão o fornecimento sistêmico de genes para as células musculares por todo o corpo. A opção de fornecimento mais eficiente é o uso do sistema circulatório do corpo para distribuir o vírus para as células musculares periféricas. Um problema para o fornecimento sistêmico é que a maioria dos sorotipos de AAV tem uma propensão natural de infectar as células do fígado [1]. Há aproximadamente 20 vezes mais células do fígado do que células musculares no corpo, pelas quais o vírus tem que passar durante o fornecimento sistêmico [2]. Estima-se que mais de 50% dos vetores de AAV ficam presos no fígado após uma injeção intravenosa sistêmica.

[005] Atualmente mais de 50% do vírus injetado de forma sistêmica são perdido no fígado onde é geralmente produzido pouco efeito terapêutico [4]. Através da alteração do direcionamento do fornecimento do vetor para o fígado e do aumento da ligação e da transdução específica para o músculo pode-se aumentar de forma significativa a expressão gênica específica para o músculo e o benefício terapêutico para o paciente enquanto são reduzidos os efeitos colaterais potenciais. Atualmente, os testes clínicos para o tratamento da Distrofia Muscular de Duchenne requerem o fornecimento de níveis altos de vetor (>5E+12 genomas do vetor por quilograma) para tentar atingir níveis terapêuticos de expressão gênica no músculo. Promotores específicos para o músculo são utilizados para reduzir a expressão gênica “fora do alvo”, mas não têm ação em direção ao aumento dos níveis totais de expressão gênica. Através do aumento da eficiência da transdução específica para o músculo, a dose total necessária para atingir um benefício terapêutico pode ser significativamente reduzida.

[006] A presente divulgação se direciona às limitações da técnica anterior e fornece também vantagens relacionadas.

SUMÁRIO

[007] O Requerente propõe uma abordagem para aumentar o fornecimento sistêmico do vetor para as células musculares que reduziria ou eliminaria a infecção de células do fígado à medida que o vírus circulasse. O Requerente formulou a hipótese de que os capsídeos de AAVrh74 modificados se direcionam para os mioblastos e as células satélites do músculo de forma mais eficiente que os vetores de AAVrh74 não modificados.

[008] A presente divulgação refere-se à proteína do capsídeo viral modificada que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente numa proteína do capsídeo viral modificada por substituição ou inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. O Requerente gerou três mutantes. UM dos mutantes (AAVmut4, asparagina para isoleucina no aminoácido 502 do capsídeo de VP1) Aumenta o fornecimento gênico globalmente para todos os tecidos testados até 56 vezes (Aumento entre 3 e 56 vezes dependendo do tecido) eficiência de transdução maior. Outro mutante (AAVmut5, triptofano para arginina no aminoácido 505 do capsídeo de VP1) aumenta o fornecimento gênico para o coração quase 50 vezes mais que AAVrh74. Um terceiro mutante (AAVYIG ou AAVYIGSR591) se direciona para um receptor encontrado primariamente sobre as células satélites que são consideradas células tronco do músculo embora o tropismo das células satélites ainda não tenha sido confirmado através da coloração IHC. Notavelmente, com base no conhecimento do Requerente da estrutura de cristal do AAV e da alfa 7 beta 1 integrina para projetar AAVYIG ou AAVYIGSR 591 acredita-se que tenha uma afinidade maior pelo músculo esquelético e uma afinidade menor pelo fígado.

[009] Para não ficar limitado à teoria, o Requerente fornece métodos para a obtenção de benefícios terapêuticos para um paciente através do aumento da dose efetiva que atinge o tecido alvo tal como o coração ou o músculo sem aumentar a dose total para o paciente. Através da redução da dose total necessária para atingir um benefício terapêutico, menos antígenos virais são fornecidos para o paciente, resultando de forma ideal em respostas imunológicas reduzidas para o vetor e maior segurança. A manufatura de produto farmacêutico para terapia gênica suficiente para conduzir testes clínicos em estágio tardio é o obstáculo principal no desenvolvimento adicional. A redução nos requerimentos de doses para atingir o benefício terapêutico resultará em exigências de manufatura reduzidas, custos reduzidos de manufatura, desenvolvimento mais rápido de testes clínicos e maior capacidade de tratar mais pacientes.

[0010] Consequentemente, esta divulgação refere-se a proteínas do capsídeo modificadas, polinucleotídeos isolados, métodos para a preparação de proteínas do capsídeo modificadas, partículas virais recombinantes e sistemas de expressão recombinantes para a produção de partículas virais modificadas. Um aspecto da divulgação refere-se a uma proteína do capsídeo viral modificada que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente numa proteína do capsídeo viral modificada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAVrh74. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em algumas modalidades, a modificação se direciona a um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (Tyr–Ile–Gly–Ser–Arg) (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74 ou um equivalente do mesmo. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor de rh74 normal.

[0011] Também é divulgado aqui um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína do capsídeo viral modificada que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente numa proteína do capsídeo viral modificada alterada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAVrh74. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74 ou um equivalente do mesmo. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor de rh74 normal.

[0012] É divulgada aqui uma partícula viral recombinante que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente numa proteína de capsídeo modificada que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente numa proteína do capsídeo viral modificada alterada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAVrh74. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor de rh74 normal. Em aspectos particulares, uma partícula viral recombinante compreende ou alternativamente consiste essencialmente em 5 ou mais proteínas do capsídeo modificadas por partícula viral (e/ou por capsídeo viral modificado).

[0013] Em outros aspectos, uma partícula viral recombinante compreende ou alternativamente consiste essencialmente entre 1 e 5 proteínas do capsídeo modificadas por partícula viral (e/ou por capsídeo viral modificado). Aspectos adicionais consideram um polinucleotídeo que codifica a proteína do capsídeo viral modificada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos divulgada aqui. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAVrh74. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor de rh74 normal.

[0014] Também são fornecidos os capsídeos modificados que são divulgados aqui que compreendem opcionalmente um transgene ou um sistema CRISPR para modificação gênica. São adicionalmente fornecidos polinucleotídeos que codificam os capsídeos modificados e vetores que codificam os ditos polinucleotídeos, bem como os complementos e os equivalentes um dos outros. Ainda aspectos adicionais referem-se a uma célula hospedeira que produz a partícula viral e/ou que compreende o vetor divulgado aqui. Ainda aspectos adicionais referem-se a um sistema de expressão para a produção da partícula viral divulgada aqui.

[0015] Esta divulgação proporciona ainda composições que compreendem um carreador e um ou mais de capsídeos modificados, um polinucleotídeo, um vetor, um plasmídeo, uma célula hospedeira ou um sistema de expressão. É adicionalmente fornecido um kit que compreende um ou mais de uma proteína de capsídeo modificada, um polinucleotídeo, um vetor, um plasmídeo, uma célula hospedeira ou um sistema de expressão e instruções para uso.

[0016] É adicionalmente aqui divulgado um método de tratamento de uma doença alvo ou um tecido disfuncional em um indivíduo que necessita do mesmo, que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou consiste adicionalmente ainda na administração ao indivíduo de uma quantidade eficiente de uma partícula viral recombinante que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente numa proteína de capsídeo modificada que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente numa proteína do capsídeo viral modificada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAVrh74. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em modalidades adicionais, esta partícula viral aumenta a eficácia de fornecimento do tratamento entre aproximadamente 3 e 56 vezes para o tecido doente ou disfuncional em relação a AAVrh74. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em modalidades adicionais, as doenças ou o tecido disfuncional é o tecido cardíaco. **Ainda em modalidades adicionais, esta partícula viral aumenta a eficácia do fornecimento de tratamento entre aproximadamente 50 vezes ou mais para o tecido cardíaco em relação a AAVrh74. Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor de rh74 normal. Em algumas modalidades, a partícula viral compreende uma quantidade eficiente de um tratamento adequado para o tecido doente ou disfuncional. Em algumas modalidades, o tratamento é a edição gênica com base em CRISPR/Cas9.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0017] As FIGS. 1A-1E mostram a análise estrutural da biblioteca de capsídeos do sorotipo 9 do vírus adeno-associado (AAV9). (a) Representação gráfica do monômero da subunidade de VP3 do AAV9 obtida utilizando SWISS-MODEL com estrutura de cristal do AAV8 servindo como molde (pdb id: 2QA0). A GH loop contendo os aminoácidos 390–627 (numeração de VP1) está na cor cinza. (b) Renderização da superfície de um modelo do capsídeo do AAV9 com 60 subunidades de VP3 gerado utilizando as coordenadas de simetria icosaédrica T = 1 no VIPERdb. As regiões da GH loop de subunidades de VP3 diferentes, que circundam o poro de cinco dobras icosaédrico e interdigitando no eixo de simetria de três dobras são destacados na cor cinza. (c) Gráfico do trímero de subunidades VP3 do AAV9 gerado em VIPERdb com mutações pontuais de 43 clones representativos da biblioteca do AAV9 representada por esferas na cor cinza. (d) Vista lateral do trímero do capsídeo (rotação de 90º) mostrando a maioria das mutações pontuais (esferas na cor cinza) em clusters sobre os laços externos. (e) Projeção de roadmap esférico dos resíduos da superfície dentro da região do trímero do capsídeo. Os resíduos destacados em vermelho representam um subconjunto de dez variantes de AAV9 que contêm resíduos alterados localizados de forma proeminente sobre a superfície do capsídeo. Figura reproduzida de Pulicherla et al.[7].

[0018] A FIG. 2 mostra marcadores que podem ser separados por FACS para o isolamento de células tronco musculares. Figura reproduzida de Wang et.al., [13].

[0019] A FIG. 3 mostra a biodistribuição do vetor mutante de AAVrh74. Machos de camundongos CD-1 receberam injeção intravenosa de 1E+11 Vg de AAVrh74 ou dois mutantes de capsídeo de AAVrh74 /vírus repórter com lucEYFP e 3 semanas após os tecidos serem coletados e analisados em relação às cópias do genoma do vetor por qPCR.

[0020] A FIG. 4 mostra a obtenção de imagens em animais vivos de luminescência de AAVmut4 e mut5. Camundongos CD-1 adultos receberam injeção via veia caudal de 1E+11 Vg do vírus AAVrh74 ou AAVmut4 contendo o mesmo vetor da luciferase. Foram obtidas imagens dos camundongos 3 semanas após a injeção em relação a expressão da luciferase. Dois experimentos separados foram realizados sob as mesmas condições. Exp. 1, mesmos animais em A e B com quantificação de fótons na cabeça A ou quantificação de fótons nas pernas, B. O Exp.2 e uma repetição do Exp. 1 com animais separados realizado 4 semanas depois. O animal mais à esquerda de cada grupo de 4 recebeu a injeção de vírus de controle AAVrh74, a seguir 3 animais de cada grupo receberam injeção de vírus AAVmut4.

[0021] A FIG. 5 mostra a obtenção de imagens em animais vivos de luminescência de AAVYIG ou AAVYIGSR591. Camundongos CD-1 adultos receberam injeção via veia caudal de 1E+11 Vg de vírus AAVYIG ou AAVYIGSR591 contendo o vetor da luciferase. As imagens foram obtidas dos camundongos 3 semanas após a injeção em relação à expressão da luciferase com as contagens de fótons de corpo inteiro acima de cada camundongo na posição ventral ou dorsal.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0022] Modalidades de acordo com a presente divulgação serão descritas de forma mais completa posteriormente aqui. Aspectos da divulgação podem, entretanto, ser incorporados em formas diferentes e não devem ser interpretados como limitados pelas modalidades apresentadas aqui. Ao invés disso, estas modalidades são fornecidas de forma que esta divulgação seja criteriosa e completa e transmita completamente o âmbito da invenção para os peritos na técnica. A terminologia utilizada na descrição aqui tem a finalidade de descrever apenas modalidades particulares e não se pretende que seja limitante.

[0023] A não ser que seja definido de outra maneira, todos os termos (incluindo termos técnicos e científicos) utilizados aqui têm o mesmo significado que é comumente entendido por um perito comum na técnica à qual a invenção pertence. Será adicionalmente entendido que termos, tais com os definidos em dicionários comumente utilizados, devem ser interpretados como tendo um significado que é coerente com seu significado no contexto da presente aplicação e na técnica relevante e não devem ser interpretados em um sentido idealizado ou excessivamente formal dessa maneira definido aqui. Embora não seja definido explicitamente abaixo, estes termos devem ser interpretados de acordo com seu significado comum.

[0024] A terminologia utilizada na descrição aqui tem a finalidade apenas de descrever modalidades particulares e não se pretende que seja limitante da invenção. Todas as publicações, os pedidos de patentes, as patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporados aqui como referência em sua totalidade.

[0025] A prática da presente tecnologia empregará, a não ser que seja indicado de outra maneira, técnicas convencionais de cultura de tecido, imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celular e DNA recombinante, que estão dentro da perícia da técnica.

[0026] A não ser que o contexto indique o contrário, pretende-se especificamente que as várias características da invenção descritas aqui possam ser utilizadas em qualquer combinação. Além disso, a divulgação considera ainda que, em algumas modalidades, qualquer característica ou combinação de características apresentadas aqui pode ser excluída ou omitida. Para ilustração, se o Relatório Descritivo declarar que um complexo compreende os componentes A, B e C, pretende-se especificamente que qualquer um de A, B ou C ou uma combinação dos mesmos possa ser omitida e desaprovada individualmente ou em qualquer combinação.

[0027] A não ser que indicado explicitamente o contrário, pretende-se que as todas as modalidades, as características e os termos especificados incluam tanto a modalidade, a característica ou o termo citado quanto seus equivalentes biológicos.

[0028] Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo faixas, são aproximações que são variadas ( + ) ou ( - ) por incrementos de 1,0 ou 0,1, quando apropriado ou alternativamente através de uma variação de +/- 15 % ou alternativamente 10% ou alternativamente 5%

ou alternativamente 2%. Deve ser entendido, embora nem sempre declarado explicitamente, que todas as designações numéricas são precedidas pelo termo “aproximadamente”. Também deve ser entendido, embora nem sempre declarado explicitamente, que os reagentes descritos aqui são meramente exemplos e que seus equivalentes são conhecidos na técnica.

[0029] Ao longo de toda esta divulgação, várias publicações, patentes e Relatórios Descritivos de patentes publicadas são referidos por uma citação de identificação ou por um número arábico. A citação completa para as publicações identificadas por um algarismo arábico é encontrada precedendo imediatamente as Reivindicações. As divulgações destas publicações, patentes e relatórios descritivos de patentes publicadas são incorporadas aqui como referência na presente divulgação em sua totalidade para descrever de forma mais completa o estado da técnica ao qual a invenção pertence.

Definições

[0030] A prática da presente tecnologia empregará, a não ser que seja indicado de outra maneira, técnicas convencionais de química orgânica, farmacologia, imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celular e DNA recombinante, que estão dentro da perícia da técnica. Ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)).

[0031] Como utilizado na descrição da invenção e nas Reivindicações em anexo, pretende-se que as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluam também as formas no plural, a não ser que o contexto indique claramente o contrário.

[0032] Como utilizado aqui, pretende-se que o termo “compreendendo” signifique que as composições e os métodos incluem os elementos citados, mas não excluem os outros. Como utilizado aqui, a expressão de transição consistindo essencialmente em (e variantes gramaticais) deve ser interpretada como abrangendo os materiais ou as etapas citadas e aquilo que não afeta materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da modalidade citada. Assim, o termo “consistindo essencialmente em” como utilizado aqui não deve ser interpretado como equivalente a “compreendendo”. “Consistindo em” deve significar a exclusão de mais que elementos traços de outros ingredientes e etapas de métodos substanciais para a administração das composições divulgadas aqui. Os aspectos definidos por cada um destes termos de transição estão dentro do âmbito presente divulgação.

[0033] É entendido que o termo “aproximadamente”, como utilizado aqui quando se refere a um valor mensurável tal como uma quantidade ou uma concentração e similar, abranja variações de 20%, 10%, 5%, 1 %, 0,5% ou até mesmo 0,1 % da quantidade especificada.

[0034] Os termos “aceitável”, “eficiente” ou “suficiente” quando utilizados para descrever a seleção de quaisquer componentes, faixas, formas de dosagem etc. divulgados aqui significam que o dito componente, faixa, forma de dosagem etc. seja adequado para a finalidade divulgada.

[0035] Ainda, como utilizado aqui, “e/ou” refere-se e abrange quaisquer e todas as combinações possíveis de um ou mais dos itens listados associados, bem como a falta de combinações quando interpretado na alternativa (“ou”).

[0036] O termo “célula” como utilizado aqui pode se referir a uma célula procariótica ou eucariótica, opcionalmente obtida de um indivíduo ou uma fonte disponível comercialmente.

[0037] As “Células eucarióticas” compreendem todos os reinos da vida exceto a monera. Podem ser facilmente distinguidas através de um núcleo ligado à membrana. Animais, plantas, fungos e protistas são eucariotos ou organismos cujas células são organizadas em estruturas complexas por membranas internas e um citoesqueleto. A estrutura ligada à membrana mais característica é o núcleo. A não ser que seja citado especificamente, o termo “hospedeiro” includes um hospedeiro eucariótico, incluindo, por exemplo, células de levedura, planta superior, inseto e mamífero. Exemplos não limitantes de células ou hospedeiros eucarióticos incluem símios, bovinos, suínos, camundongos, ratos, aves, répteis e humanos, por exemplo, células HEK293 e células 293T.

[0038] As “Células procarióticas” que geralmente não têm um núcleo ou quaisquer outras organelas ligadas à membrana e são divididas em dois domínios, bactérias e Archaea. Em adição ao DNA cromossômico, estas células também podem conter informação genética em um laço circular chamada de epissomo. As células de bactérias são muito pequenas, aproximadamente do tamanho de mitocôndrias de animais (aproximadamente 1-2 μm de diâmetro e 10 μm de comprimento). As células procarióticas apresentam três formatos principais: formato de bastão, esférico e espiral. Ao invés de passar por processos de replicação elaborados como os eucariotos, as células de bactérias se dividem por fissão binária. Exemplos incluem, mas não são limitados a bactérias Bacillus, bactéria E. coli e bactéria Salmonella.

[0039] O termo “codifica” como é aplicado às sequências de ácido nucleico refere-se a um polinucleotídeo que se diz “que codifica” um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado através dos métodos bem conhecidos pelos peritos na técnica, pode ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para o polipeptídeo e/ou um fragmento do mesmo. O filamento antissenso é o complemento deste ácido nucleico e a sequência codificadora pode ser deduzida partindo do mesmo.

[0040] Os termos “equivalente” ou “equivalente biológico” são utilizados de forma intercambiável quando se referem a um modo particular, um material biológico ou celular e significam aqueles que têm homologia mínima enquanto ainda mantêm a estrutura ou a funcionalidade desejada. Exemplos não limitantes de polipeptídeos equivalentes, incluem um polipeptídeo que tem pelo menos 60% ou alternativamente pelo menos 65% ou alternativamente pelo menos 70% ou alternativamente pelo menos 75% ou alternativamente 80% ou alternativamente pelo menos 85% ou alternativamente pelo menos 90% ou alternativamente pelo menos 95% de identidade com o mesmo em relação a sequências polipeptídicas ou um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo ou seu complemento que se hibridiza sob condições de alta estringência a um polinucleotídeo que codifica tais sequências polipeptídicas. As condições de alta estringência são descritas aqui e incorporadas aqui como referência. Alternativamente, um equivalente do mesmo é um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo ou um complemento do mesmo, que tem pelo menos 70% ou alternativamente pelo menos 75% ou alternativamente 80% ou alternativamente pelo menos 85% ou alternativamente pelo menos 90% ou alternativamente pelo menos 95% de identidade ou identidade de sequência de pelo menos 97% com o polinucleotídeo de referência, por exemplo, o polinucleotídeo do tipo selvagem.

[0041] Exemplos não limitantes de polipeptídeos equivalentes, incluem um polinucleotídeo que tem pelo menos 60% ou alternativamente pelo menos 65% ou alternativamente pelo menos 70% ou alternativamente pelo menos 75% ou alternativamente 80% ou alternativamente pelo menos 85% ou alternativamente pelo menos 90% ou alternativamente pelo menos 95% ou alternativamente pelo menos 97%, de identidade com um polinucleotídeo de referência. Um equivalente também significa um polinucleotídeo ou seu complemento que se hibridiza sob condições de alta estringência com um polinucleotídeo de referência.

[0042] Um polinucleotídeo ou uma região polinucleotídica (ou um polipeptídeo ou uma região polipeptídica) que tem certa porcentagem

(por exemplo, 80%, 85%, 90% ou 95%) de “identidade de sequência” com outra sequência significa que, quando alinhadas, a porcentagem de bases (ou aminoácidos) é a mesma quando se comparam as duas sequências. O alinhamento e a porcentagem de homologia ou a identidade de sequência podem ser determinados utilizando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo, os descritos em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1. Em certas modalidades, parâmetros pré-estabelecidos são utilizados para o alinhamento. Um exemplo não limitante de programa de alinhamento é BLAST, que utiliza parâmetros pré-estabelecidos. Em particular, exemplos de programas incluem BLASTN e BLASTP, que utilizam os parâmetros pré- estabelecidos a seguir: Código genético=padrão; filtro=nenhum; filamento=ambos; limite=60; expectativa=10; Matrix=BLOSUM62; Descrições=50 sequências; separar por=HIGH SCORE; Bases de Dados=não redundantes, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR. Os detalhes destes programas podem ser encontrados no endereço da Internet a seguir: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST. A identidade de sequência e a porcentagem de identidade podem ser determinadas através da incorporação das mesmas no clustalW (disponível no endereço da web:genome.jp/tools/clustalw/, acessado pela última vez em 13 de janeiro de 2017).

[0043] “Homologia” ou “identidade” ou “similaridade” refere-se à similaridade de sequência entre dois peptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico. A homologia pode ser determinada através da comparação de uma posição em cada sequência que pode ser alinhada com a finalidade de comparação. Quando uma posição na sequência comparada for ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são homólogas nesta posição. Um grau de homologia entre as sequências é uma função do número de combinação ou de posições homólogas compartilhadas pelas sequências. Uma sequência “não relacionada” ou “não homóloga” compartilha menos de 40% de identidade ou alternativamente menos de 25% de identidade, com uma das sequências da presente divulgação.

[0044] “Homologia” ou “identidade” ou “similaridade” também pode se referir a duas moléculas de ácido nucleico que se hibridizam sob condições estringentes.

[0045] “Hibridização” refere-se a uma reação na qual um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado através da ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeos. A ligação de hidrogênio pode ocorrer através do pareamento de bases de Watson-Crick, da ligação de Hoogstein ou de qualquer outra maneira específica para a sequência. O complexo pode compreender dois filamentos que formam uma estrutura em dúplex, três ou mais filamentos que formam um complexo multifilamentado, um filamento de autohibridização individual ou qualquer combinação destes. Uma reação de hibridização pode constituir de uma etapa em um processo mais extenso, tal como o início de uma reação da PCR ou a clivagem enzimática de um polinucleotídeo por uma ribozima.

[0046] Exemplos de condições de hibridização estringentes incluem: temperaturas de incubação de aproximadamente 25º C a aproximadamente 37º C; concentrações do tampão de hibridização de aproximadamente 6×SSC a aproximadamente 10×SSC; concentrações de formamida de aproximadamente 0% a aproximadamente 25%; e soluções de lavagem de aproximadamente 4×SSC a aproximadamente 8×SSC. Exemplos de condições de hibridização moderadas incluem: temperaturas de incubação de aproximadamente 40º C a aproximadamente 50º C; concentrações de tampão de aproximadamente 9×SSC a aproximadamente 2×SSC; concentrações de formamida de aproximadamente 30% a aproximadamente 50%; e soluções de lavagem de aproximadamente 5×SSC a aproximadamente 2×SSC. Exemplos de condições de estringência alta incluem: temperaturas de incubação de aproximadamente 55º C a aproximadamente 68º C; concentrações de tampão de aproximadamente 1×SSC a aproximadamente 0,1×SSC; concentrações de formamida de aproximadamente 55% a aproximadamente 75%; e soluções de lavagem de aproximadamente 1×SSC, 0,1×SSC ou água deionizada. Em geral, os tempos de incubação da hibridização são de 5 minutos a 24 horas, com 1, 2 ou mais etapas de lavagem e tempos de incubação de lavagem são de aproximadamente 1, 2 ou 15 minutos. SSC é NaCl a 0,15 M e tampão citrato a 15 mM. É entendido que equivalentes de SSC utilizando outros sistemas de tampão também podem ser empregados.

[0047] Como utilizado aqui, “expressão” refere-se ao processo através do qual os polinucleotídeos são transcritos em mRNA e/ou ao processo através do qual o mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Se o polinucleotídeo for derivado do DNA genômico, a expressão pode incluir o splicing do mRNA em uma célula eucariótica.

[0048] O termo “isolado” como utilizado aqui refere-se a moléculas ou agentes biológicos ou materiais celulares que são substancialmente livres de outros materiais.

[0049] Como utilizado aqui, o termo “funcional” pode ser utilizado para modificar qualquer molécula, agente biológico ou material celular para significar que realiza um efeito especificado particular.

[0050] Como utilizado aqui, os termos “sequência de ácido nucleico” e “polinucleotídeo” são utilizados de forma intercambiável para se referirem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, este termo inclui, mas não está limitado a DNA ou RNA de filamento simples, duplo ou múltiplo, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA- RNA ou um polímero que compreende bases de purina e pirimidina ou outras bases nucleotídicas naturais, quimica- ou bioquimicamente modificadas, não naturais ou derivatizadas.

[0051] Os termos “proteína”, “peptídeo” e “polipeptídeo” são utilizados de forma intercambiável e em seu sentido mais amplo se referem a um composto de duas ou mais subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos ou peptideomiméticos. As subunidades podem ser ligadas por ligações peptídicas. Em outro aspecto, a subunidade pode ser ligada por outras ligações, por exemplo, éster, éter etc. Uma proteína ou um peptídeo tem que conter pelo menos dois aminoácidos e nenhuma limitação é colocada sobre o número máximo de aminoácidos que podem compreender a sequência de uma proteína ou um peptídeo. Como utilizado aqui o termo “aminoácido” refere-se a aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e isômeros ópticos tanto D quanto L, análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.

[0052] Como utilizado aqui, o termo “sistema de expressão recombinante” refere-se a uma construção genética ou construções para a expressão de certo material genético formado através de recombinação.

[0053] Um “veículo de fornecimento gênico” é definido como qualquer molécula que pode carregar polinucleotídeos inseridos em uma célula hospedeira. Exemplos de veículos de fornecimento gênico são lipossomos, micelas, polímeros biocompatíveis, incluindo polímeros naturais e polímeros sintéticos; lipoproteínas; polipeptídeos; polissacarídeos; lipopolissacarídeos; envelopes virais artificiais; partículas metálicas; e bactérias ou vírus, tais como baculovírus, adenovírus e retrovírus, bacteriófago, cosmídeo, plasmídeo, vetores fúngicos e outros veículos de recombinação tipicamente utilizados na técnica que foram descritos para expressão em uma variedade de hospedeiros eucarióticos e procarióticos e podem ser utilizados para terapia gênica bem como para simples expressão de proteínas.

[0054] Um polinucleotídeo divulgado aqui pode ser fornecido para uma célula ou tecido utilizando um veículo de fornecimento gênico. “Fornecimento gênico”, “transferência gênica”, “transdução” e similares, como são utilizados aqui, são termos que se referem à introdução de um polinucleotídeo exógeno (algumas vezes referido como um

“transgene”) em uma célula hospedeira, independentemente do método utilizado para a introdução. Tais métodos incluem uma variedade de técnicas bem conhecidas como transferência gênica mediada por vetor (por exemplo, através de infecção/transfecção viral ou vários outros complexos de fornecimento gênico com base em proteína ou com base em lipídeo) bem como técnicas que facilitam o fornecimento de polinucleotídeos “nus” (tais como eletroporação, fornecimento com “pistola gênica” e várias outras técnicas utilizadas para a introdução de polinucleotídeos). O polinucleotídeo introduzido pode ser mantido estavelmente ou de forma transitória na célula hospedeiro. A manutenção estável requer tipicamente que o polinucleotídeo introduzido contenha uma origem de replicação compatível com a célula hospedeira ou se integre em um replicon da célula hospedeira tal como um replicon extracromossômico (por exemplo, um plasmídeo) ou um cromossomo nuclear ou mitocondrial. É conhecido um número de vetores que são capazes de mediar a transferência de genes para células de mamíferos, como é conhecido na técnica e descrito aqui.

[0055] Um “plasmídeo” é uma molécula de DNA extracromossômica separada do DNA cromossômico que é capaz de se replicar de forma independente do DNA cromossômico. Em muitos casos, é circular e tem filamento duplo. Os plasmídeos fornecem um mecanismo para transferência gênica horizontal dentro de uma população de micro-organismos e fornecem tipicamente uma vantagem seletiva sob certa condição ambiental. Os plasmídeos podem carregar genes que fornecem resistência a antibióticos que ocorrem naturalmente em um nicho ambiental competitivo ou alternativamente as proteínas produzidas podem agir como toxinas sob circunstâncias similares.

[0056] Os “plasmídeos” utilizados na engenharia genética são chamados de “vetores plasmideais”. Muitos plasmídeos estão disponíveis comercialmente para estes usos. O gene que será replicado é inserido em cópias de um plasmídeo que contêm genes que tornam as células resistentes a antibióticos particulares e um sítio de clonagem múltipla (MCS ou poliligante), que é uma região curta que contém vários sítios de restrição comumente utilizados que permitem a fácil inserção de fragmentos de DNA nesta localização. Outro uso importante dos plasmídeos é produzir grandes quantidades de proteínas. Neste caso, os pesquisadores cultivam as bactérias que contêm um plasmídeo que carrega o gene de interesse. Assim como a bactéria produz as proteínas para conferir sua resistência a antibióticos, esta também pode ser induzida para produzir grandes quantidades de proteínas partindo do gene inserido.

[0057] Um “cromossomo artificial de levedura” ou “YAC” refere-se a um vetor utilizado para clonar grandes fragmentos de DNA (maiores que 100 kb e de até 3000 kb). É um cromossomo construído artificialmente e contém as sequências teloméricas, centroméricas e de origem de replicação necessárias para a replicação e a preservação nas células de levedura. Construídos utilizando um plasmídeo circular inicial, estes são linearizados através da utilização de enzimas de restrição e então a DNA ligase pode adicionar uma sequência ou um gene de interesse dentro da molécula linear através do uso de pontas coesivas. Os vetores de expressão em levedura, tais como YACs, YIps (plasmídeo de integração em levedura) e YEps (plasmídeo epissomal de levedura), são extremamente úteis uma vez que podem ser obtidos produtos de proteínas eucarióticas com modificações pós-tradução já que as leveduras por si próprias são células eucarióticas, entretanto, foi observado que os YACs são mais instáveis que os BACs, produzindo efeitos quiméricos.

[0058] Um “vetor viral” é definido como um vírus ou uma partícula viral produzida de forma recombinante que compreende um polinucleotídeo que será fornecido para uma célula hospedeira, in vivo, ex vivo ou in vitro.

[0059] Exemplos de vetores virais incluem vetores retrovirais, vetores adenovirais, vetores de vírus adeno-associados, vetores alfavirais e similares. Os vetores com base no vírus mosaico do tabaco (TMV) infeccioso podem ser utilizados para produzir proteínas e foi relatado que expressam Griffithsin e folhas de tabaco (O'Keefe et al. (2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104). Os vetores alfavirais, tais como os vetores com base no vírus Semliki Forest e vetores com base no vírus Sindbis, também foram desenvolvidos para uso na terapia gênica e na imunoterapia. Ver, Schlesinger & Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 e Ying et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827. Em aspectos nos quais a transferência genica é mediada por um vetor retroviral, uma construção de vetor refere-se ao polinucleotídeo que compreende o genoma retroviral ou parte do mesmo e um gene terapêutico. Detalhes adicionais para métodos modernos de vetores para uso na transferência gênica podem ser encontrados, por exemplo, em Kotterman et al. (2015) Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook Annual Review of Biomedical Engineering 17.

[0060] Como utilizado aqui, “transferência gênica mediada por retrovírus” ou “transdução retroviral” carrega o mesmo significado e se refere ao processo através do qual um gene ou sequências de ácido nucleico são estavelmente transferidas para a célula hospedeira em virtude do vírus entrar na célula e se integrar seu genoma no genoma da célula hospedeira. O vírus pode entrar na célula hospedeira através de seu mecanismo normal de infecção ou ser modificado de forma que se ligue a um receptor ou um ligante de superfície da célula hospedeira diferente para entrar na célula. Como utilizado aqui, vetor retroviral refere-se a uma partícula viral capaz de introduzir ácido nucleico exógeno em uma célula través de um mecanismo de entrada viral ou similar ao viral.

[0061] Os retrovírus carregam sua informação genética na forma de RNA; entretanto, assim que o vírus infecta uma célula, o RNA é transcrito de forma reversa na forma de DNA que se integra no DNA genômico da célula infectada. A forma de DNA integrada é chamada de pró-vírus.

[0062] Em aspectos em que a transferência gênica é mediada por um vetor de vírus de DNA, tal como um adenovírus (Ad) ou um vírus adeno-associado (AAV), uma construção de vetor refere-se ao polinucleotídeo que compreende o genoma viral ou parte do mesmo e um transgene. Os adenovírus (Ads) são um grupo de vírus homogêneos relativamente bem caracterizados, que inclui mais de 50 sorotipos. Os Ads não requerem integração no genoma da célula hospedeira. Os vetores derivados de Ad recombinantes, particularmente aqueles que reduzem o potencial de recombinação e produção de vírus do tipo selvagem, também foram construídos. Estes vetores estão disponíveis comercialmente de fontes tais como Takara Bio USA (Mountain View, CA), Vector Biolabs (Philadelphia, PA) e Creative Biogene (Shirley, NY). O AAV do tipo selvagem tem capacidade de infecção e especificidade de integração altas no genoma das células hospedeiras. Ver, Wold e Toth (2013) Curr. Gene. Ther. 13(6):421-433, Hermonat & Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 e Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996.

[0063] Os vetores que contêm tanto um promotor quanto um sítio de clonagem no qual um polinucleotídeo pode ser ligado de forma operacional são bem conhecidos na técnica. Estes vetores são capazes de transcrever RNA in vitro ou in vivo e estão disponíveis comercialmente de fontes tais como Agilent Technologies (Santa Clara, Calif.) e Promega Biotech (Madison, Wis.). Com a finalidade de otimizar a expressão e/ou a transcrição in vitro, pode ser necessário remover, adicionar ou alterar as partes não traduzidas a 5′ e/ou a 3′ dos clones para eliminar códons de início da tradução alternativos inapropriados potenciais extras ou outras sequências que possam interferir ou reduzir a expressão, no nível de transcrição ou de tradução. Alternativamente, sítios de ligação ao ribossomo consensos podem ser inseridos imediatamente a 5’ do códon de início para aumentar a expressão.

[0064] Os veículos de fornecimento gênico também incluem complexos de DNA/lipossomos, micelas e complexos de proteína-DNA viral alvos. Os lipossomos que também compreendem um anticorpo de direcionamento ou um fragmento do mesmo podem ser utilizados nos métodos divulgados aqui. Em adição ao fornecimento de polinucleotídeos para uma célula ou uma população de células, a introdução direta das proteínas descritas aqui na célula ou na população de células pode ser realizada através da técnica não limitante de transfecção de proteína, alternativamente condições de cultura que podem aumentar a expressão e/ou promover a atividade das proteínas divulgadas aqui são outras técnicas não limitantes.

[0065] Como utilizado aqui, o termo “capsídeo viral” ou “capsídeo” refere-se à carapaça ou ao revestimento proteico de uma partícula viral. Os capsídeos funcionam para encapsidar, proteger, transportar e liberar um genoma viral dentro da célula hospedeira. Os capsídeos são geralmente compreendidos de subunidades estruturais oligoméricas de proteína (“proteínas do capsídeo”). Como utilizado aqui, o termo “encapsidado(a)” significa inserido dentro de um capsídeo viral.

[0066] Como utilizado aqui, o termo “helper” em referência a um vírus ou um plasmídeo refere-se a um vírus ou um plasmídeo utilizado para fornecer os componentes adicionais necessários para replicação e empacotamento de uma partícula viral ou partícula viral recombinante, tal como o AAV modificado divulgado aqui. Os componentes codificados por um vírus helper podem incluir quaisquer genes necessários para a montagem do virion, encapsidação, replicação do genoma e/ou empacotamento. Por exemplo, o vírus helper pode codificar enzimas necessárias para a replicação do genoma viral. Os exemplos não limitantes de vírus helper e plasmídeos adequados para uso com construções de AAV incluem pHELP (plasmídeo), adenovírus (vírus) ou herpesvírus (vírus).

[0067] Como utilizado aqui, o termo “AAV” é uma abreviação padrão para vírus adeno-associado. O vírus adeno-associado é um parvovírus de DNA de filamento simples que cresce apenas em células nas quais são fornecidas certas funções por um vírus helper coinfectante. Informação geral e revisões do AAV podem ser encontradas, por exemplo, em Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169- 228 e Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York). É perfeitamente esperado que os mesmos princípios descritos nestas revisões sejam aplicáveis aos sorotipos de AAV adicionais caracterizados após as datas de publicação das revisões porque é bem sabido que os vários sorotipos são muito intimamente relacionados, tanto estruturalmente quanto funcionalmente, mesmo no nível genético. (Ver, por exemplo, Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; e Rose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974)). Por exemplo, aparentemente todos os sorotipos de AAV exibem propriedades de replicação muito similares mediadas por genes rep homólogos; e todos carregam três proteínas de capsídeo relacionadas tais como as expressas em AAV2. O grau de parentesco é adicionalmente sugerido pela análise de heterodúplex que revela hibridização cruzada extensiva entre os sorotipos ao longo do comprimento do genoma; e a presença de segmentos de autoanelamento análogos nos terminais que correspondem a "sequências de repetição terminal invertidas" (ITRs). Os padrões de infectividade similares também sugerem que as funções de replicação em cada sorotipo estão sob controle regulatório similar.

[0068] Um “vetor de AAV” como utilizado aqui refere-se a um vetor que compreende um ou mais polinucleotídeos de interesse (ou transgenes) que são flanqueados por sequências de repetição terminal (ITRs) do AAV. Estes vetores de AAV podem ser replicados e empacotados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira que foi transfectadas com um vetor que codifica e expressa produtos dos genes rep e cap.

[0069] Um “virion de AAV” ou “partícula viral de AAV” ou “partícula de vetor de AAV” refere-se a uma partícula viral composta de pelo menos uma proteína do capsídeo de AAV e um vetor de AAV com polinucleotídeo encapsidado. Se a partícula compreender um polinucleotídeo heterólogo (isto é, um polinucleotídeo sem ser um genoma do AAV do tipo selvagem tal como um transgene que será fornecido para uma célula de mamífero), esta é tipicamente referida como uma “partícula de vetor de AAV” ou simplesmente um “vetor de AAV”. Assim, a produção da partícula de vetor de AAV inclui necessariamente a produção do vetor de AAV, de forma que um vetor esteja contido dentro de uma partícula de vetor de AAV.

[0070] O vírus adeno-associado (AAV) é um parvovírus deficiente em relação à replicação, cujo genoma de DNA de filamento simples tem aproximadamente 4,7 kb de comprimento incluindo duas repetições terminais invertidas (ITRs) de 145 nucleotídeos. Há vários sorotipos de AAV. As sequências de nucleotídeos dos genomas dos sorotipos de AAV são conhecidas. Por exemplo, o genoma completo de AAV-1 é fornecido no GenBank Accession No. NC_002077; o genoma completo de AAV-2 é fornecido no GenBank Accession No. NC_001401 e Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 { 1983); o genoma completo de AAV-3 é fornecido no GenBank Accession No. NC_1829; o genoma completo de AAV-4 é fornecido no GenBank Accession No. NC_001829; o genoma do AAV-5 é fornecido no GenBank Accession No. AF085716; o genoma completo de AAV-6 é fornecido no GenBank Accession No. NC_00 1862; pelo menos partes dos genomas de AAV-7 e AAV-8 são fornecidas nos GenBank Accession Nos. AX753246 e AX753249, respectivamente; o genoma do AAV-9 é fornecido em Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); o genoma do AAV-10 é fornecido em Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); e o genoma do AAV-11 é fornecido em Virology, 330(2): 375-383 (2004). A sequência do genoma do AAV rh.74 é fornecida na Patente U.S.

9.434.928, incorporada aqui como referência. As sequências que agem in cis que direcionam a replicação do DNA viral (rep), encapsidação/empacotamento e integração no cromossomo da célula hospedeira estão contidas dentro das ITRs do AAV. Três promotores de AAV (chamados de p5, pl9 e p40 por suas localizações relativas no mapa) controlam a expressão dos dois quadros abertos de leitura internos do AAV que codificam os genes rep e cap. Os dois promotores de rep (p5 e pi 9), acoplados ao splicing diferencial do íntron de AAV individual (nos nucleotídeos 2107 e 2227), resultam na produção de quatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40) partindo do gene rep. As proteínas rep possuem várias atividades enzimáticas que são em última análise responsáveis pela replicação do genoma viral. O gene cap é expresso partindo do promotor p40 e codifica as três proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3. O splicing alternativo e os sítios de início da tradução que não são consensos são responsáveis pela produção das três proteínas do capsídeo relacionadas. Um único sítio de poliadenilação consenso fica localizado na posição 95 do mapa do genoma do AAV. O ciclo de vida e a genética do AAV são revisados em Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97- 129 (1992).

[0071] O AAV possui características únicas que o tornam atraentes como um vetor para o fornecimento de DNA estranho para células, por exemplo, na terapia gênica. A infecção de células em cultura com AAV é não citopática e a infecção natural de seres humanos e outros animais é silenciosa e assintomática. Além disso, o AAV infecta muitas células de mamíferos permitindo a possibilidade de direcionamento para muitos tecidos diferentes in vivo. Além disso, o AAV transduz lentamente células que estão se dividindo ou não e pode persistir essencialmente por toda a vida destas células na forma de um epissomo nuclear transcricionalmente ativo (elemento extracromossômico). O pró-genoma viral de AAV é inserido na forma de DNA clonado nos plasmídeos, o que torna a construção de genomas recombinantes possível. Além disso, uma vez que os sinais que direcionam a replicação do AAV e a encapsidação do genoma estão contidos dentro das ITRs do genoma do AAV, parte ou todos os aproximadamente 4,3 kb internos do genoma (que codificam as proteínas de replicação e estruturais do capsídeo, rep- cap) podem ser substituídos por DNA estranho. Para gerar vetores de

AAV, as proteínas rep e cap podem ser fornecidas in trans. Outra característica significativa do AAV é que este é um vírus extremamente estável e amistoso. Ele resiste facilmente às condições utilizadas para inativar adenovírus (56º a 65ºC durante várias horas), tornando a preservação com resfriamento do AAV menos crítica. O AAV pode até mesmo ser liofilizado. Finalmente, as células infectadas com AAV não são resistentes à superinfecção.

[0072] Vários estudos demonstraram expressão de proteína mediada pelo AAV recombinante durante um período longo (> 1,5 ano) no músculo. Ver, Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996); e Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996). Ver também, Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) e Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001). Além disso, uma vez que o músculo é altamente vascularizado, a transdução do AAV recombinante resultou no aparecimento de produtos do transgene na circulação sistêmica após a injeção intramuscular como descrito em Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) e Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921- 13926 (1997). Além disso, Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002) demonstraram que miofibras esqueléticas possuem os fatores celulares necessários para a glicosilação, o dobramento e a secreção corretos dos anticorpos, indicando que o músculo é capaz de expressar estavelmente os agentes terapêuticos proteicos secretados. Os genomas do AAV recombinantes (rAAV) da invenção compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica γ-sarcoglicana (por exemplo, SEQ ID NO: 1) e uma ou mais ITRs do AAV que flanqueiam a molécula de ácido nucleico. O DNA do AAV nos genomas do rAAV pode ser de qualquer sorotipo de AAV para o qual um vírus recombinantes pode ser derivado incluindo, mas sem limitação, sorotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV- 6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV- 10, AAV-11, AAV- 12, AAV-13 e AAV rh74. A produção do rAAV pseudotipado é divulgada, por exemplo, na WO 01/83692. Outros tipos de variantes de rAAV, por exemplo, rAAV com mutações no capsídeo, também são considerados. Ver, por exemplo, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014). As sequências de nucleotídeos dos genomas de vários sorotipos de AAV são conhecidas na técnica.

[0073] O termo “Cas9” refere-se a uma endonuclease associada à CRISPR referida por este nome. Exemplos não limitantes de Cas9s são fornecidos aqui, por exemplo, a Cas9 fornecida no UniProtKB G3ECR1 (CAS9_STRTR) ou a Cas9 de Staphylococcus aureus, bem como a Cas9 de nuclease “morta”, ortólogos e equivalentes biológicos de cada uma destas. Os ortólogos incluem, mas não são limitados a Cas9 de Streptococcus pyogenes (“spCas9”); Cas 9 de Streptococcus thermophiles, Legionella pneumophilia, Neisseria lactamica, Neisseria meningitides, Francisella novicida; e Cpf1 (que realiza funções de corte análogas às da Cas9) de várias espécies bacterianas incluindo Acidaminococcus spp. e Francisella novicida U112.

[0074] Como utilizado aqui, o termo “CRISPR” refere-se a uma técnica de manipulação genética específica para a sequência que se baseia na via de repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente em clusters. A CRISPR pode ser utilizada para realizar edição gênica e/ou regulação gênica, bem como para simplesmente direcionar proteínas para uma locação genômica específica. A edição gênica refere-se a um tipo de engenharia genética em que a sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo alvo é alterada através da introdução de deleções, inserções ou substituições de bases na sequência de polinucleotídeos. Em alguns aspectos, a edição gênica mediada por CRISPR utiliza as vias de ligação de extremidades não homólogas (NHEJ) ou de recombinação homóloga para realizar as edições. A regulação gênica refere-se ao aumento ou à redução da produção de produtos gênicos específicos tal proteína ou RNA.

[0075] O termo “gRNA” ou “RNA guia” como utilizado aqui refere-se às sequências de RNA guia utilizadas para direcionar genes específicos para correção empregando a técnica de CRISPR. As técnicas de planejamento de gRNAs e polinucleotídeos terapêuticos doadores para especificidade de alvo são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, Doench, J., et al. Nature biotechnology 2014; 32(12):1262-7, Mohr, S. et al. (2016) FEBS Journal 283: 3232-38 e Graham, D., et al. Genome Biol. 2015; 16: 260. O gRNA compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente num polinucleotídeo de fusão que compreende CRISPR RNA (crRNA) e CRIPSPR RNA de ativação in trans (tracrRNA); ou um polinucleotídeo que compreende CRISPR RNA (crRNA) e CRIPSPR RNA de ativação in trans (tracrRNA). Em alguns aspectos, um gRNA é sintético (Kelley, M. et al. (2016) J of Biotechnology 233 (2016) 74-83). Como utilizado aqui, um equivalente biológico de um gRNA inclui, mas não é limitado a polinucleotídeos ou moléculas de direcionamento que podem guiar uma Cas9 ou seu equivalente para uma sequência de nucleotídeos específica tal como uma região específica do genoma de uma célula.

[0076] Pretende-se que uma “composição” signifique uma combinação de polipeptídeo, polinucleotídeo ou anticorpo ativo e outro composto ou composição, inerte (por exemplo, uma marcação detectável) ou ativa (por exemplo, um veículo de fornecimento gênico).

[0077] Pretende-se que uma “composição farmacêutica” inclua a combinação de um polipeptídeo, um polinucleotídeo ou um anticorpo ativo com um carreador, inerte ou ativo tal como um suporte sólido, tornando a composição adequada para uso para diagnóstico ou terapêutico in vitro, in vivo ou ex vivo.

[0078] Como utilizado aqui, o termo “carreador farmaceuticamente aceitável” abrange qualquer um dos carreadores farmacêuticos padrões, tais como uma solução salina tamponada com fosfato, água e emulsões, tal como uma emulsão óleo/água ou água/óleo e vários tipos de agentes umectantes. As composições também podem incluir estabilizantes e conservantes. Para exemplos de carreadores, estabilizantes e adjuvantes, ver Martin (1975) Remington’s Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton).

[0079] Um “sujeito” a diagnóstico ou tratamento é uma célula ou um animal tal como um mamífero ou um ser humano. Um sujeito não é limitado a uma espécie específica e inclui animais não humanos sujeitos a diagnóstico e tratamento e são aqueles sujeitos a infecções ou modelos com animais, por exemplo, símios, murinos, tais como ratos, camundongos, chinchila, caninos, tais como cachorros, leporídeos, tais como coelhos, gado, animais para esportes e animais de companhia. Pacientes humanos também são incluídos dentro do termo.

[0080] O termo “tecido” é utilizado aqui para se referir ao tecido de um organismo vivo ou morto ou qualquer tecido derivado ou projetado para imitar um organismo vivo ou morto. O tecido pode ser saudável, morto e/ou ter mutações genéticas. O tecido biológico pode incluir qualquer tecido individual (por exemplo, um conjunto de células que podem estar interconectadas) ou um grupo de tecidos que constitui um órgão ou uma parte ou uma região do corpo de um organismo. O tecido pode compreender um material celular homogêneo ou pode ser uma estrutura compósita tal como a encontrada em regiões do corpo que incluem o tórax que, por exemplo, pode incluir tecido pulmonar, tecido esquelético e/ou tecido muscular. Os exemplos de tecidos incluem, mas não são limitados àqueles derivados do fígado, dos pulmões, da tireoide, da pele, do pâncreas, dos vasos sanguíneos, da bexiga, dos rins, do cérebro, árvore biliar, do duodeno, da aorta abdominal, da veia ilíaca, do coração e dos intestinos, incluindo qualquer combinação dos mesmos.

[0081] Como utilizado aqui, “tratar” ou “tratamento” de uma doença em um indivíduo refere-se a (1) prevenção da ocorrência dos sintomas ou da doença em um indivíduo que é predisposto ou não exibe ainda os sintomas da doença; (2) inibição da doença ou interrupção de seu desenvolvimento; ou (3) melhora ou causando a regressão da doença ou dos sintomas da doença. Como entendido na técnica, “tratamento” é uma abordagem para a obtenção de resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Para as finalidades da presente tecnologia, os resultados benéficos ou desejados podem incluir um ou mais, mas não são limitados a alívio ou melhora de um ou mais sintomas, diminuição da extensão de uma condição (incluindo uma doença), estabilização (isto é, não agravamento) do estado de uma condição (incluindo uma doença), retardo ou redução da velocidade da condição (incluindo uma doença), progressão, melhora ou paliação da condição (incluindo uma doença), estados e remissão (seja parcial ou total), seja detectável ou não detectável.

Modos de Realização da Divulgação Capsídeos Virais Modificados e Métodos de Preparação

[0082] O fornecimento do vetor de AAV se baseia atualmente no uso da seleção do sorotipo para o direcionamento para o tecido com base no tropismo natural do vírus ou através da injeção direta nos tecidos alvos. Se for necessário o fornecimento sistêmico para atingir o benefício terapêutico máximo, então a seleção do sorotipo é a única opção disponível para o direcionamento para o tecido combinada com os promotores específicos para o tecido. Como descrito aqui, o Requerente identificou por aproximação os aminoácidos específicos responsáveis pela ligação com o receptor e entrada reduzindo assim a necessidade de estudos de mutagênese elaborados para identificar os aminoácidos críticos no AAVrh74 [7-11] (FIG. 1). Com as regiões críticas para não direcionar para o fígado identificadas, o Requerente desenvolveu capsídeos modificados que enriquecem a transdução de vetor específico para o músculo. O impacto positivo da combinação da perda reduzida de vetor no fígado com fornecimento específico para células musculares do gene de interesse aumentará enormemente as chances de se encontrar o limite para a eficácia clínica no tratamento sistêmico de doenças neuromusculares.

[0083] Esta divulgação refere-se a proteínas do capsídeo modificadas, polinucleotídeos isolados, métodos para a preparação de proteínas do capsídeo modificadas, partículas virais recombinantes e sistemas de expressão recombinantes para a produção de partículas virais modificadas. Um aspecto da divulgação refere-se a uma proteína do capsídeo viral modificada que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente numa proteína do capsídeo viral modificada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAVrh74. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (Tyr–Ile–Gly–Ser–Arg) (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor de rh74 normal. Os capsídeos modificados podem ser incorporados em outros sistemas de fornecimento viral.

[0084] Em um aspecto adicional, as partículas virais modificadas compreendem ainda um transgene para modificação gênica e/ou um sistema CRISPR para modificação gênica.

[0085] Também é divulgado aqui um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína do capsídeo viral modificada que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente numa proteína do capsídeo viral modificada alterada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAVrh74. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor de rh74 normal.

[0086] É divulgada aqui uma partícula viral recombinante que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente numa proteína de capsídeo modificada que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente numa proteína do capsídeo viral modificada alterada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAVrh74. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em modalidades adicionais, esta partícula viral aumenta a eficácia do fornecimento de tratamento entre aproximadamente 3 e 56 vezes para o tecido doente ou disfuncional em relação a AAVrh74. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em modalidades adicionais, o tecido doente ou disfuncional é o tecido cardíaco. Ainda em modalidades adicionais, esta partícula viral aumenta a eficácia do fornecimento de tratamento entre aproximadamente 50 vezes ou mais para o tecido cardíaco em relação a AAVrh74. Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor de rh74 normal. Em algumas modalidades, a partícula viral compreende uma quantidade eficiente de um tratamento adequado para o tecido doente ou disfuncional. Em algumas modalidades, o tratamento é a edição gênica com base em CRISPR/Cas9.

[0087] O vírus modificado, por exemplo, AAV, pode ser empacotado utilizando um sistema de empacotamento viral tal como um sistema de empacotamento de retrovírus, adenovírus, herpes vírus ou baculovírus. Em algumas modalidades, o empacotamento é conseguido através da utilização de um vírus helper ou um plasmídeo helper e uma linhagem de célula. O vírus helper ou o plasmídeo helper contém elementos sequências que facilitam o fornecimento de materiais genéticos para o interior das células. Em outro aspecto, o plasmídeo helper ou um polinucleotídeo que compreende o plasmídeo helper é incorporado estavelmente no genoma de uma linhagem de célula de empacotamento, de forma que a linhagem de célula de empacotamento não necessite de transfecção adicional com um plasmídeo helper.

[0088] Um plasmídeo helper pode compreender, por exemplo, pelo menos uma sequência de DNA helper viral derivada de um genoma viral incompetente em relação à replicação que codifica in trans todas as proteínas do virion necessárias para o empacotamento de um AAV incompetente em relação à replicação e para produzir proteínas do virion capazes de empacotar o AAV incompetente em relação à replicação em um título algo, sem a produção de AAV competente em relação à replicação.

A sequência de DNA viral não tem a região que codifica o intensificador e/ou o promotor nativo da 5′ LTR viral do vírus e não possui tanto a sequência da função psi responsável pelo empacotamento do genoma helper quanto a 3′ LTR, mas codifica um sítio de poliadenilação estranho, por exemplo, o sítio de poliadenilação de SV40 e um intensificador e/ou um promotor estranho que direciona a transcrição eficiente em um tipo de célula em que a produção de vírus é desejada.

O vírus é um vírus de leucemia tal como um Vírus da Leucemia Murina de Moloney (MMLV), o vírus de Imunodeficiência Humana (HIV) ou o Vírus da Leucemia do Macaco Gibão (GALV). O intensificador e o promotor estranhos podem ser o intensificador e o promotor iniciais imediatos (IE) do citomegalovírus humano (HCMV), o intensificador e o promotor (região U3) do Vírus de Sarcoma Murino de Moloney (MMSV), a região U3 do Vírus de Sarcoma de Rous (RSV), a região U3 do Vírus Formador de Foco no Baço (SFFV) ou o intensificador IE do HCMV ligado ao promotor do Vírus da Leucemia Murina de Moloney (MMLV) nativo.

O plasmídeo helper pode consistir em duas sequências de DNA helper retrovirais codificadas pelo plasmídeo com base nos vetores de expressão, por exemplo, quando uma primeira sequência helper contém o cDNA que codifica as proteínas gag e pol do MMLV ou do GALV ecotrópico e uma segunda sequência helper contém o cDNA que codifica a proteína env.

O gene Env, que determina a faixa do hospedeiro, pode ser derivado dos genes que codificam as proteínas env do vírus da leucemia murina xenotrópicas, anfotrópicas, ecotrópicas, politrópicas (que formam foco em martas) ou 10A1 ou a proteína env do Vírus da Leucemia do Macaco Gibão (GALV), a proteína env (gp160) do Vírus da Imunodeficiência Humana, a proteína G do Vírus da Estomatite Vesicular (VSV), os produtos dos genes env do tipo I e do tipo II da Leucemia de Células T Humanas (HTLV), do gene de envelope quimérico derivado de combinações de um ou mais dos genes env mencionados anteriormente ou genes de envelope quiméricos que codificam o citoplasma e a transmembrana dos produtos dos genes env mencionados anteriormente e um anticorpo monoclonal direcionado contra uma molécula de superfície específica sobre uma célula alvo desejada

[0089] No processo de empacotamento, os plasmídeos helper e os plasmídeos que codificam as proteínas do vírus são cotransfectados de forma transitória em uma primeira população de células de mamífero que são capazes de produzir vírus, tais como as células renais embrionárias humanas, por exemplo, células 293 (ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.) para produzir sobrenadantes contendo retrovírus recombinantes em títulos altos. Em outro método da invenção esta primeira população de células transfectadas de forma transitória é então cocultivada com células alvos de mamífero, por exemplo, linfócitos humanos, para transduzir as células alvos com o gene estranho com alta eficiência.

Composições

[0090] Também é fornecida pela invenção uma composição ou um kit que compreende qualquer um ou mais dos vetores virais, células isoladas, sistema de empacotamento, partículas virais que são descritos aqui e um carreador. Em um aspecto, o carreador é um carreador farmaceuticamente aceitável. Estas composições podem ser utilizadas de forma terapêutica como é descrito aqui e podem ser utilizadas em combinação com outras terapias conhecidas.

Métodos de Administração de Partículas Virais Modificadas

[0091] É fornecido aqui um animal transgênico não humano que compreende uma proteína do capsídeo viral modificada alterada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAVrh74. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor de rh74 normal.

[0092] É divulgado aqui um método de edição gênica que compreende, consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente no contato de uma célula com uma partícula viral recombinante que compreende ou que consiste alternativamente essencialmente num capsídeo modificado em que o capsídeo modificado compreende ou consiste essencialmente numa proteína do capsídeo viral modificada que compreende ou que consiste alternativamente essencialmente ou ainda que consiste adicionalmente na proteína do capsídeo viral modificada alterada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor de rh74 normal. Em algumas modalidades, o contato ocorre in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades, a partícula viral compreende um ou mais polinucleotídeos e pelo menos um dos polinucleotídeos compreende ou consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente num polinucleotídeo que codifica um RNA guia (gRNA). Em alguns aspectos, pelo menos um dos polinucleotídeos compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente num polipeptídeo terapêutico. Em algumas modalidades, a partícula viral compreende uma Cas9 ou um equivalente da mesma.

[0093] É adicionalmente divulgado aqui um método de edição gênica em um indivíduo que necessita do mesmo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficiente de partícula viral recombinante que compreende ou que consiste alternativamente essencialmente num capsídeo modificado em que o capsídeo modificado compreende um capsídeo modificado em que o capsídeo modificado compreende uma proteína do capsídeo viral modificada que compreende ou que consiste alternativamente essencialmente ou ainda que consiste adicionalmente numa proteína do capsídeo viral modificada alterada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos.

Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAVrh74. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente.

Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida.

Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida.

Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares.

Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida.

Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor de rh74 normal.

Em algumas modalidades, a partícula viral compreende um ou mais polinucleotídeos e pelo menos um dos polinucleotídeos compreende ou consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente num polinucleotídeo que codifica um RNA guia (gRNA). Em alguns aspectos, pelo menos um dos polinucleotídeos compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente num polipeptídeo terapêutico.

Em algumas modalidades, a partícula viral compreende uma Cas9 ou um equivalente da mesma.

[0094] É fornecido aqui um animal transgênico não humano que compreende uma partícula do capsídeo viral recombinante que compreende ou que consiste alternativamente essencialmente ou que ainda consiste adicionalmente numa partícula viral recombinante que compreende ou que consiste alternativamente na essência num capsídeo modificado em que o capsídeo modificado compreende uma proteína do capsídeo viral modificada que compreende ou que consiste alternativamente essencialmente ou ainda que consiste adicionalmente numa proteína do capsídeo viral modificada alterada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor de rh74 normal.

[0095] Em alguns aspectos, o polinucleotídeo que codifica o gRNA compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente num polinucleotídeo de fusão que compreende CRISPR RNA (crRNA) e CRIPSPR RNA com ativação in trans (tracrRNA); ou um polinucleotídeo que compreende CRISPR RNA (crRNA) e CRIPSPR RNA com ativação in trans (tracrRNA). Em alguns aspectos, o gRNA é específico para uma região do DNA que necessita de edição gênica no indivíduo ou na célula que necessita da mesma.

[0096] Em alguns aspectos, a partícula viral recombinante compreende ainda um polinucleotídeo terapêutico. O polinucleotídeo terapêutico é qualquer polipeptídeo que pode ser utilizado para se direcionar a uma sequência de DNA que precisa ser editada, fornecer um molde de reparo para uma sequência de DNA que precisa ser editada ou fornecer uma reposição para uma sequência de DNA que precisa ser editada. Em aspectos adicionais, o polipeptídeo terapêutico compreende uma sequência do tipo selvagem de um gene que precisa ser editado no indivíduo ou na célula que necessita disso.

[0097] Ainda aspectos adicionais referem-se a métodos de tratamento de um indivíduo que tem uma doença, um distúrbio ou uma condição que compreende a administração do AAV modificado divulgado aqui ao indivíduo. Em alguns aspectos, a doença, o distúrbio ou a condição é selecionada do grupo de hemofilia, distrofia muscular, esclerose múltipla, alfa-1-antitripsina, esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer, atrofia muscular espinhal, fibrose cística, HIV, talassemia, coroideremia, doença de Parkinson, amaurose congênita de Leber, degeneração macular, deficiência de aminoácido aromático descarboxilase, acromatopsia, síndrome de Crigler Najjar, doença de Pompe, retinosquise ligada ao X, hipercolesteremia familiar homozigota, doença de Batten, degeneração da retina, deficiência de ornitina transcarbamilase, mucopolissacaridose (I-IX), hepatite B e hepatite C. Em um aspecto, a hemofilia é caracterizada pela deficiência de um ou mais do fator VIII ou do fator IX. Em alguns aspectos, a distrofia muscular é selecionada de distrofia muscular de Becker, distrofia muscular congênita, distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular distal, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular facioscapuloumeral, distrofia muscular do tipo cinturas, distrofia muscular miotônica e distrofia muscular oculofaríngea.

[0098] Em alguns aspectos, o RNA guia e/ou o polinucleotídeo terapêutico é projetado e/ou selecionado para tratar uma doença, um distúrbio ou uma condição selecionada do grupo de hemofilia, distrofia muscular, esclerose múltipla, alfa-1-antitripsina, esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer, atrofia muscular espinhal, fibrose cística, HIV, talassemia, coroideremia, doença de Parkinson, amaurose congênita de Leber, degeneração macular, deficiência de aminoácido aromático descarboxilase, acromatopsia, síndrome de Crigler Najjar, doença de Pompe, retinosquise ligada ao X, hipercolesteremia familiar homozigota, doença de Batten, degeneração da retina, deficiência de ornitina transcarbamilase, mucopolissacaridose (I-IX), hepatite B e hepatite C. Em um aspecto, a hemofilia é caracterizada pela deficiência de um ou mais do fator VIII ou do fator IX. Em alguns aspectos, a distrofia muscular é selecionada de distrofia muscular de Becker, distrofia muscular congênita, distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular distal, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular facioscapuloumeral, distrofia muscular do tipo cinturas, distrofia muscular miotônica e distrofia muscular oculofaríngea.

[0099] Em alguns aspectos, o RNA guia e/ou o polinucleotídeo terapêutico é projetado e/ou selecionado para tratar ou reparar um gene selecionado do grupo de Fator VIII (F8, NM_000132, NM_019863), Fator IX (F9, NM_000133, NM_001313913), distrofina (DMD, NM_000109, NM_004006, NM_004007, NM_004009, NM_004010), disferlina (DYSF, NM_001130455, NM_001130976, NM_001130977, NM_001130978, NM_001130979), emerina (EMD, NM_000117), lamina A/C (LMNA, NM_001257374, NM_001282624, NM_001282625, NM_001282626, NM_005572), homeobox 4 duplo (DUX4, NM_001205218, NM_001278056, NM_001293798, NM_001306068), miotonina-proteína quinase (MDPK, NM_001081560, NM_001081562,

NM_001081563, NM_001288764, NM_001288765), proteína de ligação ao ácido nucleico celular (CNBP, NM_003418, NM_001127192, NM_001127193, NM_001127194, NM_001127195), proteína-2 de ligação ao poliadenilato (PABP-2, NM_004643), Alfa-1-antitripsina, superóxido dismutase (SOD1, NM_000454), alsina (ALS2, NM_001135745, NM_020919), senataxina helicase (SETX, NM_015046), espatacsina (SPG11, NM_001160227, NM_025137), proteína FUS/TLS de ligação ao RNA (FUS, NM_001010850, NM_001170634, NM_001170937, NM_004960), proteína B/C associada à proteína de membrana associada à vesícula (VAPB, NM_001195677, NM_004738), angiogenina (ANG, NM_001145, NM_001097577), proteína 43 de ligação ao TAR DNA (TARDBP, NM_007375), Polifosfoinositídeo fosfatase (FIG4, NM_014845), optineurina (OPTN, NM_001008211, NM_001008212, NM_001008213, NM_021980), ataxina-2 (ATXN2, NP_001297050, NP_001297052, NP_002964), proteína que contém valosina (VCP, NM_007126), ubiquilina-2 (UBQLN2, NM_013444), receptor sigma-1 (SIGMAR1, NM_001282205, NM_001282206, NM_001282207, NM_001282208, NM_001282209), Proteína 2 b do corpo multivesicular carregada (CHMP2B, NM_001244644, NM_014043), profilina-1 (PFN1, NM_005022), Tirosina-proteína quinase do receptor erbB-4 (ERBB4, NM_001042599, NM_005235), Ribonucleoproteína heterogênea nuclear A1 (HNRNPA1, NM_002136, NM_031157), matrina-3 (MATR3, NM_199189, NM_001194954, NM_001194955, NM_001194956, NM_001282278), cadeia alfa-4A da tubulina (TUBA4A, NM_001278552, NM_006000), quadro aberto de leitura 72 do cromossomo 9 (C9orf72, NM_145005, NM_001256054, NM_018325), CHCD10, SQSTM1 (NM_001142298), TBK1, apolipoproteína E (NM_001302691, NM_000041, NM_001302688, NM_001302689, NM_001302690), SMN1 (NM_000344), SMN2 (NM_017411, NM_022875, NM_022876, NM_022877), CTFR (NM_000492), beta globina HBB PDB, CHM, alfa- sinucleína (SNCA, NM_000345), parquina (PRKN, NM_004562), quinase 2 com repetição rica em leucina (LRRK2 ou dardarina, NM_198578),

suposta quinase 1 induzida por PTEN (PINK1, NM_032409), DJ-1 (NM_001123377), maltase ácida (NM_000152), UDP- glucuronosiltransferase 1 (NM_000463), PPT-1 (NM_000310) ou ATP13A2 (NM_001141973).

[00100] Aspectos adicionais da invenção referem-se a composições que compreendem um carreador e o vírus modificado descrito aqui. Sucintamente, as composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender a partícula viral modificada descrita aqui, em combinação com um ou mais carreadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Estas composições podem compreender tampões tais como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e similares; carboidratos tal como glicose, manose, sacarose ou dextranas, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos tal como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tal com EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições da presente divulgação podem ser formuladas para administração oral, intravenosa, tópica, entérica e/ou parenteral. Em certas modalidades, as composições da presente divulgação são formuladas para administração intravenosa.

[00101] É considerado pelos peritos na técnica que gRNAs podem ser gerados para especificidade direcionada para tratar um gene específico, opcionalmente um gene associado a uma doença, um distúrbio ou uma condição. Assim, em combinação com Cas9, os RNA guias facilitam a especificidade direcionada do sistema CRISPR/Cas9. Aspectos adicionais tal como a escolha do promotor, como é discutido anteriormente, podem fornecer mecanismos adicionais para atingir a especificidade direcionada – por exemplo, seleção de um promotor para o RNA guia que codifica polinucleotídeo que facilita a expressão em um órgão ou um tecido particular. Consequentemente, é considerada aqui a seleção de gRNAs adequados para a doença, o distúrbio ou a condição particular.

[00102] A administração do AAV modificado ou das composições pode ser realizada em uma dose, de forma contínua ou intermitente ao longo de todo o curso de tratamento. A administração pode ocorrer através de qualquer modo de administração adequado, incluindo, mas sem limitação: intravenoso, intra-arterial, intramuscular, intracardíaco, intratecal, subventricular, epidural, intracerebral, intracerebroventricu- lar, sub-retinal, intravitreal, intra-articular, intraocular, intraperitoneal, intrauterino, intradérmico, subcutâneo, transdérmico, transmucosa e inalação.

[00103] Os métodos de determinação dos meios mais eficientes e da dosagem de administração são conhecidos pelos peritos na técnica e variação com a composição utilizada para terapia, a finalidade da terapia e o indivíduo que será tratado. Administrações únicas ou múltiplas podem ser realizadas com o nível e o padrão de doses sendo selecionados pelo médico atendente. É observado que a dosagem pode sofrer impacto com a rota de administração. As formulações de dosagens e os métodos de administração dos agentes adequados são conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos destas dosagens adequadas podem ser desde 1E+9 genomas do vetor até 1E+17 genomas do vetor por administração.

[00104] Em um aspecto adicional, a partícula viral modificada e as composições da invenção podem ser administradas em combinação com outros tratamentos, por exemplo, os tratamentos aprovados adequados para a doença, o distúrbio ou a condição particular. Um exemplo não limitante inclui o tratamento de distrofia muscular com uma combinação da partícula viral modificada e um ou mais esteroides. Pode-se determinar se o tratamento foi bem sucedido através do monitoramento de evidência clínica ou subclínica da modificação gênica, que é determinada pelo médico atendente.

[00105] Esta administração da partícula viral modificada ou de composições da invenção pode ser realizada para gerar um modelo com animal da doença, do distúrbio ou da condição desejada para ensaios experimentais e de verificação.

Capsídeos e Partículas de AAV Modificados

[00106] A presente divulgação fornece ainda uma modalidade específica, por exemplo, um vírus adeno-associado (AAV) modificado que compreende uma partícula viral recombinante que compreende ou que consiste alternativamente essencialmente num capsídeo modificado em que o capsídeo modificado compreende uma proteína do capsídeo viral modificada que compreende ou que consiste alternativamente na essência ou ainda que consiste adicionalmente numa proteína do capsídeo viral modificada alterada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de AAVrh74. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares. Em algumas modalidades, a modificação é uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, este peptídeo tem uma alta afinidade pela Alfa 7 beta 1 integrina e/ou fica posicionado em uma região que provavelmente alterará a ligação do receptor de rh74 normal.

[00107] Os vetores de vírus adeno-associado (AAV) são vetores defeituosos em relação à replicação que são engenheirados para fornecer carga genética para as células. Estes são vírus não envelopados que em sua forma de vetor possuem apenas as repetições terminais invertidas (ITR) do vírus original. As proteínas estruturais e enzimáticas do AAV são fornecidas “in trans” por plasmídeos adicionais e são transfectadas juntas em uma célula para gerar partículas engenheiradas para fornecimento gênico. Os AAVs têm sido amplamente utilizados para terapia genética – e, mais especificamente, com sistemas CRISPR/Cas9 – devido a sua segurança e sua eficiência. O AAV infecta eficientemente uma variedade de células e durante o processo de infecção o capsídeo se liga e entra no núcleo onde o genoma do vetor é fornecido.

[00108] A partícula estrutural do AAV é composta de 60 moléculas de proteína constituídas de VP1, VP2 e VP3. Cada partícula contém aproximadamente 5 proteínas VP1, 5 proteínas VP2 e 50 proteínas VP3 ordenadas em uma estrutura icosaédrica. Foi mostrado que as partículas de AAV2 podem suportar a inserção de peptídeos e proteínas em vários sítios dentro da estrutura do capsídeo. A capacidade de introduzir peptídeos únicos no capsídeo levou ao desenvolvimento de partículas de AAV com tropismo alterado, que permite que o vírus se ligue e infecte as células e os tecidos que normalmente podem ser refratários à infecção. Em adição, peptídeos grandes e até mesmo proteínas funcionais foram introduzidos no capsídeo de vetores de AAV2 com níveis variáveis de sucesso. Uma proteína fluorescente verde funcional (GFP, 30 kD de PM) contendo o capsídeo de AAV foi gerada e produziu vírus infeccioso que foi utilizado para rastrear infecções nas células.

[00109] Uma das restrições dos vetores de AAV para fornecimento gênico é a limitação do tamanho do inserto genético que pode ser eficientemente empacotado dentro das partículas. Por exemplo, o tamanho do genoma de AAV2 do tipo selvagem é de 4679 bases de DNA de filamento simples. O empacotamento de mesmo uma das novas variantes menores de Cas9 (Cas9 de Staphylococcus aureus, SaCas9, 130 kD de PM) requer aproximadamente 3255 pb apenas para a região codificadora. A adição de um promotor ubíquo ou específico para o tecido à construção pode adicionar mais 500-800 pb. A inclusão de mais 500 pb para uma sequência de adição de poli A e as ITR’s e o vetor fica próximo da capacidade de empacotamento de uma partícula de AAV. Para atingir a correção do gene CRISPR/Cas9 funcional também tem que ser incluído um RNA guia (gRNA) com a sequência alvo. Para ter este RNA expresso é necessário adicionalmente um promotor mínimo da polIII e sequência de término. Juntos, estes elementos são muito grandes para serem combinados dentro de um vetor de AAV que seja eficientemente empacotado. Pode-se escolher empacotar a construção de Cas9 e cassetes de expressão do RNA guia em vetores separados, mas para que estes sejam funcionais, ambos os vírus têm que infectar as mesmas células alvos.

[00110] Aspectos adicionais da divulgação referem-se a um sistema de expressão recombinante para a produção de tal AAV modificado. Em algumas modalidades o sistema de expressão recombinante compreende um grande número de plasmídeos; o grande número codificando todas as proteínas do vírus AAV – VP1, VP2 e VP3. Em algumas modalidades, cada proteína viral é codificada em um plasmídeo diferente. Em algumas modalidades, uma ou mais proteínas virais são codificadas no mesmo plasmídeo. Em algumas modalidades, pelo menos uma proteína viral é codificada na forma de uma proteína de fusão com Cas9.

[00111] Consequentemente, as modalidades divulgadas aqui se referem a um sistema de expressão recombinante para a produção de um AAV modificado que compreende um capsídeo modificado em que o capsídeo modificado compreende uma proteína do capsídeo viral modificada que compreende ou que consiste alternativamente essencialmente ou ainda que consiste adicionalmente numa proteína do capsídeo viral modificada alterada através da modificação ou da inserção de aminoácidos entre 1 a 7 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína do capsídeo viral é uma VP1, opcionalmente de

AAVrh74. Em modalidades adicionais, a modificação compreende a substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502 na VP1 de AAVrh74 ou uma modificação equivalente. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74. Em algum aspecto, outros aminoácidos no peptídeo são modificados, mas esta substituição é mantida. Em algumas modalidades, a modificação se direciona para um receptor encontrado primariamente nas células satélites, opcionalmente células tronco musculares.

[00112] Alguns aspectos referem-se a métodos de produção dos AAV modificados utilizando o sistema de expressão recombinante divulgado aqui.

[00113] Ainda aspectos adicionais referem-se a métodos de tratamento de um indivíduo que tem uma doença, um distúrbio ou uma condição que compreende a administração do AAV modificado divulgado aqui ao indivíduo. Em algumas modalidades, a doença, o distúrbio ou a condição é selecionada do grupo de hemofilia, distrofia muscular, esclerose múltipla, alfa-1-antitripsina, esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer, atrofia muscular espinhal, fibrose cística, HIV, talassemia, coroideremia, doença de Parkinson, amaurose congênita de Leber, degeneração macular, deficiência de aminoácido aromático descarboxilase, acromatopsia, síndrome de Crigler Najjar, doença de Pompe, retinosquise ligada ao X, hipercolesteremia familiar homozigota, doença de Batten, degeneração da retina, deficiência de ornitina transcarbamilase, mucopolissacaridose (I-IX), hepatite B e hepatite C. Em algumas modalidades, a hemofilia é caracterizada pela deficiência de um ou mais do fator VIII ou do fator IX. Em algumas modalidades, a distrofia muscular é selecionada de distrofia muscular de Becker, distrofia muscular congênita, distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular distal, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular facioscapuloumeral, distrofia muscular do tipo cinturas, distrofia muscular miotônica e distrofia muscular oculofaríngea.

Exemplos

[00114] Os exemplos a seguir são não limitantes e ilustrativos de procedimentos que podem ser utilizados em vários casos para efetuar a divulgação. Adicionalmente, todas as referências divulgadas aqui abaixo são incorporadas aqui como referência em sua totalidade.

[00115] AAVrh74 é um sorotipo de AAV identificado por investigadores no NCH que foi utilizado extensivamente em testes clínicos para o tratamento de doenças neuromusculares. Este infecta eficientemente os músculos cardíaco e esquelético humanos e há uma baixa prevalência de anticorpos neutralizadores preexistentes na população humana.

Exemplo 1 – Determinar o sorotipo modificado ótimo para máxima a biodistribuição máxima de mioblastos e células satélites através do fornecimento vascular.

[00116] As células satélites do músculo são 60 vezes mais abundantes que as células da fibra muscular no músculo esquelético

[2]. São uma população de células tronco de autorrenovação que facilita a capacidade de regeneração de longo prazo do músculo esquelético

[12]. Recentemente vários marcadores que podem ser separados por FACS foram identificados para o isolamento de células tronco musculares [13](FIG, 2). A Alfa 7 beta 1 integrina foi identificada como um marcador de seleção positiva de células tronco musculares e também é o receptor primário da laminina sobre os mioblastos esqueléticos e as miofibras de adultos. Os estudos de expressão também mostraram que a alfa 7 beta 1 integrina é expressa de forma abundante sobre o tecido muscular cardíaco e esquelético e apenas níveis baixos são encontrados no tecido do fígado. O Requerente modificou o capsídeo de AAVrh74 para expressar um peptídeo que foi mostrado que se ligava com alta afinidade à proteína alfa 7 beta 1 integrina. O Requerente posicionou o peptídeo em uma região que provavelmente altera o motivo de ligação do receptor de AAVrh74 normal com a finalidade de utilizar a α7β1-integrina como o receptor de ligação. Foram também identificadas duas mutações adicionais em outros aminoácidos de AAVrh74 que se supõe que sejam necessárias para a ligação e a entrada específicas para o fígado e foi demonstrado que são capazes de maior fornecimento geral e/ou específico para o músculo de genes repórteres após a injeção intravenosa do vetor (FIGS. 3-5).

[00117] Camundongos C57BL/6J receberam injeção intravenosa com os vírus com capsídeo modificado recém-criados ou AAVrh74 de controle (AAVmut4, AAVmut5 e AAVYIG ou YIGSR591) expressando a mesma proteína de fusão de luciferase-EYFP como demonstrado anteriormente e após 3 semanas, os camundongos foram sacrificados com perfusão com PBS/paraformaldeído seguida pela coloração imunohistoquímica dos músculos e dos órgãos seccionados para determinar as populações de células específicas que são transduzidas. Inicialmente, foram obtidas imagens dos camundongos semanalmente para expressão da luciferase utilizando o sistema de obtenção de imagens IVIS para confirmar a expressão gênica. Três semanas após a injeção, os camundongos sofreram perfusão, os tecidos foram coletados e fixados em paraformaldeído, seguido pelo seccionamento e pela coloração em relação à expressão de GFP por imunofluorescência e contra corados em relação à expressão de antígenos específicos para o tipo de célula para identificação. Esta abordagem possibilitou que o Requerente identificasse as populações de células específicas transduzidas pelos vetores de mutantes do capsídeo diferentes para determinar qual irá provavelmente ter o maior benefício para a doença muscular alvo.

[00118] AAVrh74 é o padrão atual para alto nível de expressão gênica nos músculos esqueléticos e cardíaco e foi utilizado como a estrutura básica para modificações do capsídeo. A biodistribuição do vetor após a injeção intravenosa de camundongos CD-1 foi determinada por qPCR três semanas após a injeção do controle e três vírus com capsídeo modificado (FIG. 3). O vetor mut4 exibiu uma biodistribuição global total maior de vetor com aumentos significativos nos quadríceps, no diafragma e no músculo cardíaco. Ao passo que mut5 e YIG ou YIGSR591 exibiram transdução do vetor significativamente maior do coração em relação ao AAVrh74.

TABELA 1 Tecido Quantidade de alteração de Mut4 em relação ao AAVrh74 Sangue 18 Cérebro 8 Pulmão 5 Quad 10 Diafragma 17 Coração 11 Baço 3 Rim 8 Fígado 56

[00119] As FIGS. 4 e 5 mostram maior expressão in vivo do gene da luciferase fornecido por mut4 e YIG ou YIGSR591 em relação ao AAVrh74 parental. A FIG. 4 mostra as quantidades de fótons aumentadas na região da cabeça ou na parte inferior do torso entre parênteses para mostrar a eficiência do vírus mut4 na transdução e na expressão gênica em uma ampla variedade de tecidos.

[00120] Camundongos C57BL/6J intracruzados (6 por grupo do vírus, 3 machos e 3 fêmeas) são utilizados para confirmar o perfil de biodistribuição prévio dos camundongos CD-1 cruzados com outros. Os 4 vírus são preparados e prontos para injeção nos camundongos após a chegada.

Equivalentes

[00121] A não ser que seja definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado que é comumente entendido por um perito comum na técnica à qual esta tecnologia pertence.

[00122] A presente tecnologia descrita aqui de forma ilustrativa pode ser adequadamente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não divulgados especificamente aqui. Assim, por exemplo, os termos “compreendendo”, “incluindo”, “contendo” etc. devem ser lidos expansivamente e sem limitação. Adicionalmente, os termos e as expressões empregados aqui foram utilizados como termos da descrição e não de limitação e não há intenção no uso destes termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou partes das mesmas, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do âmbito da presente tecnologia reivindicada.

[00123] Assim, deve ser entendido que os materiais, os métodos e os exemplos fornecidos aqui são representativos dos aspectos preferidos, são exemplos e não se pretende que sejam tidos como limitações do âmbito da presente tecnologia.

[00124] A presente tecnologia foi descrita de forma ampla e genérica aqui. Cada uma das espécies e dos grupos subgenéricos mais limitados que se encaixam dentro da divulgação genérica também faz parte da presente tecnologia. Isto inclui a descrição genérica da presente tecnologia com uma ressalva ou limitação negativa que remove qualquer assunto de objetivo do gênero, independentemente do fato ou não do material cortado ser especificamente citado aqui.

[00125] Em adição, quando as características ou os aspectos da presente tecnologia são descritos em termos dos grupos de Markush, os peritos na técnica reconhecerão que a presente tecnologia também é descrita aqui em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.

[00126] Todas as publicações, os pedidos de patentes, as patentes e outras referências mencionadas aqui são expressamente incorporados como referência em sua totalidade, até a mesma extensão como se cada um fosse incorporado como referência individualmente. No caso de conflito, o presente Relatório Descritivo, incluindo as definições, controlará.

[00127] Outros aspectos são apresentados dentro das Reivindicações a seguir.

Referências

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3. Tran, T., et al., Laminin drives survival signals to promote a contractile smooth muscle phenotype and airway hyperreactivity. FASEB J, 2013. 27(10): p. 3991-4003.

4. Mori, S., et al., Biodistribution of a low dose of intravenously administered AAV-2, 10, and 11 vectors to cynomolgus monkeys. Jpn J Infect Dis, 2006. 59(5): p. 285-93.

5. Grimm, D., et al., In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno- associated viruses. J Virol, 2008. 82(12): p. 5887-911.

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7. Pulicherla, N., et al., Engineering liver-detargeted AAV9 vectors for cardiac and musculoskeletal gene transfer. Mol Ther, 2011. 19(6): p. 1070-8.

8. DiMattia, M.A., et al., Structural insight into the unique properties of adeno-associated virus serotype 9. J Virol, 2012. 86(12): p. 6947-58.

9. Li, C., et al., Single amino acid modification of adeno-associated virus capsid changes transduction and humoral immune profiles. J Virol, 2012. 86(15): p. 7752-9.

10. Raupp, C., et al., The threefold protrusions of adeno-associated virus type 8 are involved in cell surface targeting as well as postattachment processing. J Virol, 2012. 86(17): p. 9396-408.

11. Govindasamy, L., et al., Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol, 2013. 87(20): p. 11187-99.

12. Bentzinger, C.F., et al., Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep, 2013. 14(12): p. 1062-72.

13. Wang, Y.X., N.A. Dumont, and M.A. Rudnicki, Muscle stem cells at a glance. J Cell Sci, 2014. 127(21): p. 4543-8.

14. Loiler, S.A., et al., Targeting recombinant adeno-associated virus vectors to enhance gene transfer to pancreatic islets and liver. Gene Ther, 2003. 10(18): p. 1551-8.

Sequências

SEQ ID NO:1 NM_000231.2 Sarcoglicana gama (SGCG) de Homo sapiens, mRNA

GAAACTCGTGAGAGCCCTTTCTCCAGGGACAGTTGCTGAAGCTTCATCC TTTGCTCTCATTCTGTAAGTCATAGAAAAGTTTGAAACATTCTGTCTGTGG TAGAGCTCGGGCCAGCTGTAGTTCATTCGCCAGTGTGCTTTTCTTAATAT CTAAGATGGTGCGTGAGCAGTACACTACAGCCACAGAAGGCATCTGCAT AGAGAGGCCAGAGAATCAGTATGTCTACAAAATTGGCATTTATGGCTGGA GAAAGCGCTGTCTCTACTTGTTTGTTCTTCTTTTACTCATCATCCTCGTTG TGAATTTAGCTCTTACAATTTGGATTCTTAAAGTGATGTGGTTTTCTCCAG CAGGAATGGGCCACTTGTGTGTAACAAAAGATGGACTGCGCTTGGAAGG GGAATCAGAATTTTTATTCCCATTGTATGCCAAAGAAATACACTCCAGAGT GGACTCATCTCTGCTTCTACAATCAACCCAGAATGTGACTGTAAATGCGC GCAACTCAGAAGGGGAGGTCACAGGCAGGTTAAAAGTCGGTCCCAAAAT GGTAGAAGTCCAGAATCAACAGTTTCAGATCAACTCCAACGACGGCAAG CCACTATTTACTGTAGATGAGAAGGAAGTTGTGGTTGGTACAGATAAACT TCGAGTAACTGGGCCTGAAGGGGCTCTTTTTGAACATTCAGTGGAGACA CCCCTTGTCAGAGCCGACCCGTTTCAAGACCTTAGATTAGAATCCCCCA CTCGGAGTCTAAGCATGGATGCCCCAAGGGGTGTGCATATTCAAGCTCA CGCTGGGAAAATTGAGGCGCTTTCTCAAATGGATATTCTTTTTCATAGTA GTGATGGAATGCTTGTGCTTGATGCTGAAACTGTGTGCTTACCCAAGCTG GTGCAGGGGACGTGGGGTCCCTCTGGCAGCTCACAGAGCCTCTACGAA ATCTGTGTGTGTCCAGATGGGAAGCTGTACCTGTCTGTGGCCGGTGTGA GCACCACGTGCCAGGAGCACAGCCACATCTGCCTCTGAGCTGCCTGCG TCCTCTCGGTGAGCTGTGCAGTGCCGGCCCCAGATCCTCACACCCAGG GAGCAGCTGCACATCGTGAAAGACTGAGGCAGCGTGGATGGGAAGTAA ACGCTTCCAGAGGAACTCAGAAAAAATTATGTGCCAGTGAAAGTGTTTGG ACAAAAACTACATGATCTCAAAATGCACGTGGATGTGAGACACAAAAGTT GACAAAATGGAAAAGCAATGTGTTTTTCCACTGGATTAATTTTCACCGGA ACAATTGCGAATTCTCTCTGCCTCGCCTCCCCCTATCTTGTCCGTGTGGG CACACACTGAGTGTTGAGTTGCCGTGTGGAGTTAATGTATGACGCTCCA CTGTGGATATCTAATGCCCTGTTGAGAGTAGCCTTGCTCAGTACTAAAAT GCCCCAAAGTTCTATACAGCATTTCCTTTATAGCATTCAAACCTCACATCC TCCCTTCAGTTTAATGCAAGTAAGTCAGGTTTCACAAGAAAATTTTCAAGT TTTGAAGGGAATTTGAGGTTGATCTGGTTTTCAAGATGTAGTTAAAGGAA TAAATCACTCAAAATTAAACTTTCTGTATATAGTCAATAAGCAATAAAAACC

TCATTTTTCAGAGTTAAAAAA Sequência de nucleotídeos do gene do capsídeo do AAV rh74 do tipo selvagem (SEQ ID NO: 3): atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgcgagtggtggg acctgaaacctggagccccgaaacccaaagccaaccagcaaaagcaggacaacggccggggtctg gtgcttcctggctacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggggagcccgtcaacgcggc ggacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctccaagcgggtgacaatccgtac ctgcggtataatcacgccgacgccgagtttcaggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaac ctcgggcgcgcagtcttccaggccaaaaagcgggttctcgaacctctgggcctggttgaatcgccggtt aagacggctcctggaaagaagagaccggtagagccatcaccccagcgctctccagactcctctacgg gcatcggcaagaaaggccagcagcccgcaaaaaagagactcaattttgggcagactggcgactcag agtcagtccccgaccctcaaccaatcggagaaccaccagcaggcccctctggtctgggatctggtaca atggctgcaggcggtggcgctccaatggcagacaataacgaaggcgccgacggagtgggtagttcctc aggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgcacctggg ccctgcccacctacaacaaccacctctacaagcaaatctccaacgggacctcgggaggaagcaccaa cgacaacacctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttt tcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggattccggcccaagaggctcaacttcaa gctcttcaacatccaagtcaaggaggtcacgcagaatgaaggcaccaagaccatcgccaataacctt accagcacgattcaggtctttacggactcggaataccagctcccgtacgtgctcggctcggcgcaccag ggctgcctgcctccgttcccggcggacgtcttcatgattcctcagtacgggtacctgactctgaacaatg gcagtcaggctgtgggccggtcgtccttctactgcctggagtactttccttctcaaatgctgagaacgggc aacaactttgaattcagctacaacttcgaggacgtgcccttccacagcagctacgcgcacagccagag cctggaccggctgatgaaccctctcatcgaccagtacttgtactacctgtcccggactcaaagcacggg cggtactgcaggaactcagcagttgctattttctcaggccgggcctaacaacatgtcggctcaggccaa gaactggctacccggtccctgctaccggcagcaacgcgtctccacgacactgtcgcagaacaacaac agcaactttgcctggacgggtgccaccaagtatcatctgaatggcagagactctctggtgaatcctggc gttgccatggctacccacaaggacgacgaagagcgattttttccatccagcggagtcttaatgtttggga aacagggagctggaaaagacaacgtggactatagcagcgtgatgctaaccagcgaggaagaaataa agaccaccaacccagtggccacagaacagtacggcgtggtggccgataacctgcaacagcaaaacg ccgctcctattgtaggggccgtcaatagtcaaggagccttacctggcatggtgtggcagaaccgggacg tgtacctgcagggtcccatctgggccaagattcctcatacggacggcaactttcatccctcgccgctgat gggaggctttggactgaagcatccgcctcctcagatcctgattaaaaacacacctgttcccgcggatcc tccgaccaccttcaatcaggccaagctggcttctttcatcacgcagtacagtaccggccaggtcagcgt ggagatcgagtgggagctgcagaaggagaacagcaaacgctggaacccagagattcagtacacttcc aactactacaaatctacaaatgtggactttgctgtcaatactgagggtacttattccgagcctcgcccca ttggcacccgttacctcacccgtaatctgtaa Sequência de aminoácidos do AAV rh74 do tipo selvagem (SEQ ID NO: 4):

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHAD AEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVE PSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSG LGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTR TWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSP RDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFT DSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCL EYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLS RTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQN NNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGK QGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGA VNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPP

PQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWN PEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL* Capsídeos Modificados – Sequências de AA (SEQ ID NO: 5)

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHAD AEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVE PSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSG LGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTR TWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSP RDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFT DSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCL EYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLS RTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQN NNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGK QGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNYIGSRGA VNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPP PQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWN PEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína de Capsídeo VP1 de AAVrh74 Modificado, caracterizada por que compreende uma ou mais modificações selecionadas do grupo de uma substituição de isoleucina pela asparagina na posição de aminoácido 502, uma substituição de triptofano pela arginina no aminoácido 505 na VP1 de AAVrh74 e uma inserção do peptídeo YIG ou YIGSR (SEQ ID NO: 2) na posição de aminoácido 591 na VP1 de AAVrh74 ou um equivalente de cada um.

2. Partícula Viral Recombinante, caracterizada por que compreende a VP1 do AAVrh74 modificada conforme definida na Reivindicação 1.

3. Partícula Viral Recombinante, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizada por que uma partícula viral recombinante é um AAVrh74 modificado.

4. Partícula Viral Recombinante, conforme definida em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3, caracterizada por que que compreende ainda um transgene ou um sistema CRISPR.

5. Polinucleotídeo, que codifica a VP1 de AAVrh74 modificada, conforme definida na Reivindicação 1, e/ou Partícula Viral Recombinante, de acordo com a Reivindicação 2 ou 3, caracterizado(a) por que está opcionalmente contida num vetor.

6. Sistema de Expressão Recombinante, para produção de uma partícula viral recombinante conforme definida na Reivindicação 3, caracterizado por que compreende opcionalmente o vetor conforme definido na Reivindicação 5.

7. Célula Hospedeira, caracterizada por que compreende o polinucleotídeo ou o vetor conforme definido na Reivindicação 5.

8. Método Para Modificar Polinucleotídeo e/ou Proteína em Célula, caracterizado por que compreende o fornecimento à célula de uma quantidade eficiente de uma partícula viral recombinante que compreende a proteína do capsídeo modificada conforme definida na Reivindicação 1 ou 4 ou a partícula viral conforme definida na Reivindicação 2.

9. Método Para Modificar Polinucleotídeo e/ou Proteína em Célula, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que a célula é uma célula de mamífero.

10. Método Para Modificar Polinucleotídeo e/ou Proteína em Célula, de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por que a célula de mamífero é uma célula humana.

11. Método Para Modificar Polinucleotídeo e/ou Proteína em Indivíduo, caracterizado por que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficiente de uma partícula viral recombinante que compreende a proteína do capsídeo modificada conforme definida na Reivindicação 1 ou 4 ou a partícula viral conforme definida na Reivindicação 2.

12. Método Para Modificar Polinucleotídeo e/ou Proteína em Indivíduo, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que o indivíduo é um mamífero.

13. Método Para Modificar Polinucleotídeo e/ou Proteína em Indivíduo, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que o mamífero é um ser humano.

14. Método Para Modificar Polinucleotídeo e/ou Proteína em Indivíduo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 11 a 13, caracterizado por que a administração é local ou sistêmica.

15. Kit, caracterizado por que compreende uma partícula viral recombinante que compreende a proteína do capsídeo modificada conforme definida na Reivindicação 1 ou 4 ou a partícula viral conforme definida na Reivindicação 2.

16. Uso de Proteína de Capsídeo VP1 de AAVrh74 Modificado, conforme definido na Reivindicação 1, de Partícula Viral Recombinante, conforme definida na Reivindicação 2 e suas dependentes, de Polinucleotídeo, conforme definido na Reivindicação 5, e de Sistema de Expressão Recombinante, conforme definido na Reivindicação 6, caracterizado por que é no fabrico de medicamentos para o tratamento, entre outras doenças, de hemofilia, distrofia muscular, esclerose múltipla, alfa-1-antitripsina, esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer, atrofia muscular espinhal, fibrose cística, HIV, talassemia, coroideremia, doença de Parkinson, amaurose congênita de Leber, degeneração macular, deficiência de aminoácido aromático descarboxilase, acromatopsia, síndrome de Crigler Najjar, doença de Pompe, retinosquise ligada ao X, hipercolesteremia familiar homozigota, doença de Batten, degeneração da retina, deficiência de ornitina transcarbamilase, mucopolissacaridose (I-IX), hepatite B e hepatite C.