CN111819286B - 通过衣壳修饰增加组织特异性的基因递送 - Google Patents

通过衣壳修饰增加组织特异性的基因递送 Download PDF

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Abstract

本文提供经修饰的衣壳蛋白、分离的多核苷酸、用于制备经修饰的衣壳蛋白的方法、重组病毒颗粒、用于产生经修饰的病毒颗粒的重组表达系统、以及基因编辑和调控的方法。

Description

通过衣壳修饰增加组织特异性的基因递送
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2018年3月16日提交的美国临时申请序列号62/644,317的优先权，其全文通过引用并入本文。
关于政府支持的申明
本发明是在来自国家卫生研究院的拨款TR001068号的政府支持下完成的。在本发明中政府享有一定的权利。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全文通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2019年2月26日，名为106887-7170_SL.txt，大小为18,492字节。
背景
人们已经做了修饰AAV衣壳以改善基因递送的努力。例如，WO2017/165859A1描述了一种病毒衣壳修饰，其中Cas9与病毒衣壳蛋白融合或结合以促进可定制的基因编辑。进一步的参考文献描述了使用DNA家族改组（Grimm和Kay）、对AAVrh74进行赖氨酸替换（US2015/006556）、AAVrh74的195、199、201或202位突变（US 9,840,719）和对AAVrh48的修饰（EP 2359866）。更进一步的参考文献详细描述了在AAV表面上示出的随机肽文库（例如，Muller (2003) Nat. Biotechnol., Perabo (2003) Mol. Ther., and 7,588,722(Grimm and Kay)）。
肌营养不良症的基因治疗方法需要基因向全身肌肉细胞的全身递送。最有效的递送方式是利用人体的循环系统以将病毒散布到周围的肌肉细胞。全身递送的一个问题是，大多数血清型的AAV具有感染肝细胞的自然倾向[1]。在体内，肝细胞是肌肉细胞的大约20倍，而病毒必须在全身传递时穿过[2]。据估计，全身静脉内注射后，超过50％的AAV载体保留在肝脏中。
目前，超过50％的全身性注射的病毒在肝脏中损失，在其中通常无法实现治疗效果[4]。通过将脱靶（de-targeting）载体递送至肝脏并增加肌肉特异性结合和转导，可以显著改善肌肉特异性基因表达和对患者的治疗效果，同时减少潜在的副作用。目前，用于治疗杜兴（Duchene）肌营养不良症的临床试验要求递送高水平的载体（每公斤 > 5E + 12个载体基因组），以尝试达到肌肉中基因表达的治疗水平。肌肉特异性启动子可用于减少“脱靶”基因表达，但对增加基因表达的总体水平没有作用。通过增加肌肉特异性转导的效率，可以显著降低获得治疗益处所需的总剂量。
本公开解决了现有技术的限制并且还提供了相关的优点。
概述
申请人提出了一种增加载体向肌肉细胞的全身递送的方法可以减少或消除病毒循环时肝细胞的感染。申请人假设，经修饰的AAVrh74衣壳比未经修饰的AAVrh74载体更有效地靶向肌肉成肌细胞和卫星细胞。
本公开涉及经修饰的病毒衣壳蛋白，其包含通过氨基酸置换或插入1至7个氨基酸来修饰的病毒衣壳蛋白，或基本上由其组成，或进一步由其组成。申请人已经产生了三个突变体。突变体之一（AAVmut4，在VP1衣壳的氨基酸502处的天冬酰胺变为异亮氨酸）增加对所有测试组织的全身基因递送，将转导效率提高高达56倍（根据组织，增加3至56倍）。另一个突变体（AAVmut5，在VP1衣壳的氨基酸505处色氨酸变为精氨酸）向心脏的基因递送比AAVrh74增加了几乎50倍。第三个突变体（AAVYIG或AAVYIGSR591）靶向主要存在于被认为是肌肉干细胞的卫星细胞上的受体，尽管尚未通过IHC染色确认卫星细胞趋向性（tropism）。值得注意的是，基于申请人对AAV晶体结构和α7β1整合蛋白的了解，设计AAVYIG或AAVYIGSR591被认为对骨骼肌具有较高的亲和力且对肝脏具有较低的亲和力。
不受理论的束缚，申请人提供了通过增加到达靶组织（例如心脏或肌肉）的有效剂量而不增加对患者的总剂量来对患者实现治疗益处的方法。通过减少获得治疗益处所需的总剂量，更少的病毒抗原被递送给患者，理想地导致对载体的免疫应答降低和安全性提高。制造足够的基因治疗药物产品以进行后期临床试验是进一步发展的主要障碍。降低获得治疗益处的剂量需求将导致制造要求降低、制造成本降低、更快的临床试验进展以及更大的治疗更多患者的能力。
因此，本公开涉及经修饰的衣壳蛋白、分离的多核苷酸、制备经修饰的衣壳蛋白的方法、重组病毒颗粒和用于产生经修饰的病毒颗粒的重组表达系统。本公开的一个方面涉及一种经修饰的病毒衣壳蛋白，其包含通过氨基酸置换或插入1至7个氨基酸来修饰的病毒衣壳蛋白，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg）（SEQ ID NO：2）或其等效物。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。
本文还公开了编码经修饰的病毒衣壳蛋白的分离的多核苷酸，经修饰的病毒衣壳蛋白包括通过氨基酸取代或插入1至7个氨基酸来修饰的经修饰的病毒衣壳蛋白，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQID NO：2）或其等效物。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。
本文公开了包含经修饰的衣壳蛋白的重组病毒颗粒，或基本上由其组成，或进一步由其组成，经修饰的衣壳蛋白包含通过氨基酸取代或插入1至7个氨基酸来修饰的经修饰的病毒衣壳蛋白，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQ ID NO：2）。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。在特定方面，重组病毒颗粒每个病毒颗粒（和/或每个经修饰的病毒衣壳）包含5个或更多个经修饰的衣壳蛋白，或基本上由其组成。
在其他方面，重组病毒颗粒每个病毒颗粒（和/或每个经修饰的病毒衣壳）包含1至5个经修饰的衣壳蛋白，或基本上由其组成。其他方面考虑编码本文公开的通过氨基酸取代或插入1至7个氨基酸来修饰的病毒衣壳蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQ ID NO：2）。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。
本公开还提供了如本文公开的经修饰的衣壳，其任选地包含用于基因修饰的转基因或CRISPR系统。还提供了编码经修饰的衣壳的多核苷酸和编码所述多核苷酸的载体，及其每一个的补体和等效物。更进一步的方面涉及产生病毒颗粒和/或包含本文所公开的载体的宿主细胞。更进一步的方面涉及用于产生本文所公开的病毒颗粒的表达系统。
本公开还提供了组合物，其包含载体和经修饰的衣壳、多核苷酸、载体、质粒、宿主细胞或表达系统中的一种或多种。还提供了一种试剂盒，其包含经修饰的衣壳蛋白、多核苷酸、载体、质粒、宿主细胞或表达系统中的一种或多种和使用说明。
本文还公开了在有需要的对象中治疗靶标疾病或功能障碍组织的方法，其包含向对象施用有效量的重组病毒颗粒，或替代地基本上由该步骤组成，或进一步由该步骤组成，所述重组病毒颗粒包含经修饰的衣壳蛋白，或替代地基本上由其组成，或进一步由其组成，所述经修饰的衣壳蛋白包含通过氨基酸取代或插入1至7个氨基酸来修饰的病毒衣壳蛋白，或替代地基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在进一步的实施方案中，对于患病或功能障碍的组织，相对于AAVrh74，该病毒颗粒增加治疗递送的功效约3至56倍。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在进一步的实施方案中，疾病或功能障碍组织是心脏组织。**在另外的实施方案中，对于心脏组织，相对于AAVrh74，该病毒颗粒增加治疗递送的功效约50倍或更多倍。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQ ID NO：2）。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。在一些实施方案中，病毒颗粒包含有效量的适合疾病或功能障碍组织的治疗。在一些实施方案中，治疗是基于CRISPR/Cas9的基因编辑。
附图说明
图1A-1E显示了腺相关病毒血清型9（AAV9）衣壳文库的结构分析。（a）使用SWISS-MODEL以AAV8的晶体结构作为模板（pdb id：2QA0）获得的AAV9 VP3亚基单体的图像表示。含有氨基酸390–627（VP1编号）的GH环以灰色显示。（b）在VIPERdb上使用T = 1二十面体对称坐标生成的具有60个VP3亚基的AAV9衣壳模型的面绘制（Surface rendering）。灰色突出显示了来自不同VP3亚基的GH环区域，这些区域围绕二十面体五重孔并在三重对称轴上相互交叉。（c）在VIPERdb上生成的AAV9 VP3亚基三聚体的图像，其灰色球形描绘的是来自AAV9文库的43个代表性克隆的点突变。（d）衣壳三聚体的侧视图（旋转90°）显示了聚集在外环上的大多数点突变（灰色球体）。（e）衣壳三聚体区域内的表面残基的球形路线图投影。以红色突出显示的残基代表含有明显位于衣壳表面上的改变的残基的十个AAV9变体的子集。图复制自Pulicherla等人[7]。
图2显示了用于分离肌肉干细胞的FACS分选标记物。该图复制自Wang等人[13]。
图3显示了AAVrh74突变体载体的生物分布。向CD-1雄性小鼠静脉内注射1E +11Vg的AAVrh74或AAVrh74衣壳/lucEYFP报告基因病毒的两个突变体，并在3周后收集组织并通过qPCR检测载体基因组拷贝。
图4显示了AAVmut4和mut5发光的活体动物成像。通过尾静脉向成年CD-1小鼠注射1E+11 Vg的含有相同荧光素酶载体的AAVrh74或AAVmut4病毒。注射3周后对小鼠进行荧光素酶表达成像。在相同条件下进行了两个单独的实验。实验1，A和B中相同的动物进行头部光子定量（A）或者腿部光子定量（B）。实验2是实验1的重复，在4周后进行的单独动物实验。每组4只动物，最左边的动物注射AAVrh74对照病毒，每组其余3只动物注射AAVmut4病毒。
图5示出了AAVYIG或AAVYIGSR591发光的活体动物成像。通过尾静脉向成年CD-1小鼠注射1E + 11 Vg的含有荧光素酶载体的AAVYIG或AAVYIGSR591病毒。注射3周后对小鼠进行萤光素酶表达成像，显示了每只小鼠腹侧或背侧的全身光子计数。
详细说明
在下文中将更全面地描述根据本公开的实施方案。然而，本公开的各方面可以以不同的形式实施，并且不应被解释为限于本文阐述的实施方案。而是，提供这些实施方案使得本公开将是透彻和完整的，并将向本领域技术人员充分传达本发明的范围。在本文的描述中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于进行限制。
除非另有定义，否则本文中使用的所有术语（包括技术和科学术语）具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。将进一步理解的是，术语（例如在常用词典中定义的那些）应该被解释为具有与其在本申请和相关技术的上下文中的含义一致的含义，并且不应该以理想化或过于正式的意义来解释，除非在本文中明确地定义。尽管以下没有明确定义，但应该根据其常用含义来解释这些术语。
在本文的描述中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。
除非另有说明，否则本技术的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，它们在本领域技术范围内。
除非上下文另外指出，否则具体意图是可以以任何组合使用本文描述的本发明的各种特征。此外，本公开还预期在一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。为了说明这一点，如果说明书指出复合物包含组分A、B和C，则具体意图是A、B或C中的任何一个或其组合可以以单数形式或以任何组合形式被省略和放弃。
除非另外明确指出，否则所有指定的实施方案、特征和术语意图包括所列举的实施方案、特征或术语及其生物学等效物。
所有数字值（包括范围），例如pH、温度、时间、浓度和分子量，都是适当地变化（+）或（-）1.0或0.1的增值的近似值，或替代地变化+/- 15%、或替代地10%、或替代地5%、或替代地2%。应当理解的是，尽管并非总是明确地说明，但所有数字值前面都有术语“约”。还应当理解的是，尽管并非总是明确说明，但本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等效物在本领域中是已知的。
在整个本公开中，通过识别引用或通过阿拉伯数字引用了各种出版物、专利和公开的专利说明书。可以在权利要求书的前面找到对由阿拉伯数字标识的出版物的完整引用。这些出版物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用整体并入本公开中，以更全面地描述本发明所涉及的技术水平。
定义
除非另有说明，否则本技术的实践将采用有机化学、药理学、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这是在本领域的技术范围内。参见，例如，Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ndedition (1989)；Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al.eds., (1987))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2:A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds.(1995))，Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, a Laboratory Manual，以及Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))。
除非上下文另有明确说明，否则如本发明的描述和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式。
如本文使用的，术语“包含”旨在意为组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素。如本文中所使用的，“基本上由……组成”（和语法变体）的过渡短语应被解释为包含所列举的材料或步骤以及那些不实质地影响所列举的实施方案的基本和新颖特征的材料或步骤。因此，本文所使用的术语“基本上由……组成”不应当被解释为等同于“包含”。“由……组成”应当意为排除多于微量元素的其他成分和用于施用本文公开的组合物的实质性方法步骤。这些过渡术语中的每一个所定义的方面都在本公开的范围内。
如本文使用的，当涉及可测量值（例如量或浓度等）时，术语“约”意在包含指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％、或者甚至0.1％的变化。
当用于描述本文公开的任何组分、范围、剂型等的选择时，术语或“可接受的”、“有效的”或“足够的”意指所述组分、范围、剂型等适合于所公开的目的。
同样如本文使用的，“和/或”是指并且包含一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代的（“或”）方式解释时缺乏组合。
如本文使用的，术语“细胞”可以指原核或真核细胞，任选地从对象或可商购的来源获得。
“真核细胞”包含除无核原虫类之外的所有生命的界。通过膜结合的核可以很容易地区分它们。动物、植物、真菌和原生生物是真核生物或其细胞通过内膜和细胞骨架组织成复杂的结构的生物。最有特色的膜结合的结构是细胞核。除非特别说明，否则术语“宿主”包括真核宿主，包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。真核细胞或宿主的非限制性实施例包括猿猴、牛、猪、小鼠、大鼠、鸟、爬虫和人，例如，HEK293细胞和293T细胞。
“原核细胞”通常缺少细胞核或任何其他膜结合细胞器，被分为两类——细菌和古细菌。除了染色体DNA，这些细胞还可以在称为附加体的环状环中含有遗传信息。细菌细胞非常小，大约相当于动物线粒体的尺寸（直径约1-2 μm，长10 μm）。原核细胞具有三种主要形状：杆状、球形和螺旋形。细菌细胞没有经历像真核生物这样复杂的复制过程，而是通过二分裂来分裂。实施例包括但不限于芽孢杆菌细菌、大肠杆菌细菌和沙门氏菌细菌。
术语“编码”在被应用至核酸序列时是指，被陈述来“编码”多肽的多核苷酸，以其天然状态或者在通过本领域技术人员熟知的方法操纵时，可以被转录和/或翻译来产生用于该多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这样的核酸的互补序列，并且编码序列可以由此导出。
当涉及特定分子、生物或细胞材料时，术语“等效物”或“生物等效物”可互换使用，并且意指具有最小同源性且仍保持所需结构或功能的那些。等效多肽的非限制性实施例包括与其或与多肽序列具有至少60％、或替代地至少65%、或替代地至少70%、或替代地至少75%、或替代地80%、或替代地至少85%、或替代地至少90%、或替代地至少95%同一性的多肽，或由在高严格条件下与编码此类多肽序列的多核苷酸杂交的多核苷酸或其互补序列编码的多肽。高严格性条件在本文中被描述，并通过引用并入本文。替代地，其等效物是由与参考多核苷酸（例如野生型多核苷酸）具有至少70％、或替代地至少75%、或替代地80%、或替代地至少85%、或替代地至少90%、或替代地至少95%同一性、或至少97%序列同一性的多核苷酸或其互补序列编码的多肽。
等效多肽的非限制性实施例包括与参考多核苷酸具有至少60％、或替代地至少65%、或替代地至少70%、或替代地至少75%、或替代地80%、或替代地至少85%、或替代地至少90%、或替代地至少95%、或替代地至少97%同一性的多核苷酸。等效物还意指在高严格条件下与参考多核苷酸杂交的多核苷酸或其互补序列。
多核苷酸或多核苷酸区域（或多肽或多肽区域）与另一个序列具有一定百分比（例如80%、85%、90%或95%）的“序列同一性”是指，当被比对时，该百分比的碱基（或氨基酸）在两个序列的比较中是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定比对和同源性或序列同一性百分比，例如在Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds.1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1中描述的软件程序。在某些实施方案中，默认参数被用于比对。非限制性示例性比对程序是使用默认参数的BLAST。特别地，示例性程序包括BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码 = 标准；筛选 = 无；链 = 两个；截点 = 60；预期 = 10；矩阵 = BLOSUM62；描述 = 50个序列；排序 = HIGH SCORE；数据库 = 不重复的，GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations +SwissProtein + SPupdate + PIR。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。序列同一性和同一性百分比可以通过将它们并入到clustalW（可从网址genome.jp/tools/clustalw/获得，最后访问时间为2017年1月13日）中来确定。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较为了进行比较而被比对的每个序列中的位置，确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源性的程度是这些序列享有的匹配的或同源的位置的数目的函数。“不相关的”或“非同源的”序列与本文公开的序列中的一个享有少于40%的同一性、或者替代地少于25%的同一性。
“同源性”或“同一性”或“相似性”也可以指在严格条件下杂交的两个核酸分子。
“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应来形成复合物，并且该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而被稳定的反应。可以通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或通过任何其他序列特异性的方式来发生氢键结合。所述复合物可以包括形成双螺旋结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单一的自我杂交的链、或这些的任何组合。杂交反应可以由在更广泛的过程中的步骤组成，例如PCR过程的起始步骤、或者通过核酶进行的多核苷酸的酶裂解步骤。
严格杂交条件的实施例包括：约25℃至约37℃的孵育温度；约6x SSC至约10x SSC的杂交缓冲液浓度；约0%至约25%的甲酰胺浓度；以及约4x SSC至约8x SSC的洗涤溶液。中度杂交条件的实施例包括：约40℃至约50℃的孵育温度；约9x SSC至约2x SSC的缓冲液浓度；约30%至约50%的甲酰胺浓度；以及约5x SSC至约2x SSC的洗涤溶液。高严格杂交条件的实施例包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1x SSC至约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55%至约75%的甲酰胺浓度；以及约1x SSC至约0.1x SSC的洗涤溶液、或去离子水。一般来说，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具有1、2、或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1、2或15分钟。SSC是0.15 M NaCl和15 mM柠檬酸缓冲液。应该理解的是，可以采用使用其他缓冲系统的SSC的等效物。
如本文使用的，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或被转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括mRNA在真核细胞中的剪接。
如本文使用的，术语“分离的”是指，分子或生物体或细胞材料基本上不含其他材料。
如本文使用的，术语“功能性”可用于修饰任何分子、生物或细胞材料，以使其实现特定的指定作用。
如本文使用的，术语“核酸序列”和“多核苷酸”被可互换地使用来指任何长度的核苷酸（核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸）的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学的或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”被可互换地使用，并且在其最广泛的意义上是指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物子单元的化合物。所述子单元可以通过肽键而被连接。在另一方面，所述子单元可以通过其他键（例如酯键、醚键等）被连接。蛋白质或肽必须包括至少两个氨基酸，并且对于可以组成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。如本文使用的，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。
如本文使用的，术语“重组表达系统”是指用于通过重组形成的某些遗传物质的表达的一种或多种遗传构建体。
“基因递送载体”被定义为可以将插入的多核苷酸携带到宿主细胞中的任何分子。基因递送载体的实施例是脂质体、胶束生物相容的聚合物（包括天然聚合物和合成聚合物）；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金属颗粒；以及细菌、或病毒，例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体以及已经被描述用于在多种真核和原核宿主中表达的本领域通常使用的并且可以用于基因治疗以及简单的蛋白质表达的其他重组载体。
可以使用基因递送载体将本文公开的多核苷酸递送至细胞或组织。如本文使用的，“基因递送”、“基因转移”、“转导”等是指指将外源多核苷酸（有时称为“转基因”）引入宿主细胞的术语，而不论采用哪种方法引入。这样的方法包括多种众所周知的技术，例如载体介导的基因转移（通过，例如，病毒感染/转染，或各种其他基于蛋白质或基于脂质的基因递送复合物）以及促进“裸”多核苷酸递送的技术（例如电穿孔，“基因枪（gene gun）”递送和用于引入多核苷酸的各种其他技术）。所引入的多核苷酸可以在宿主细胞中稳定或瞬时维持。稳定的维持通常需要所引入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点或整合到宿主细胞的复制子中，例如染色体外复制子（例如质粒）或核或线粒体染色体。如本领域已知和本文所述的，已知许多载体能够介导基因向哺乳动物细胞的转移。
“质粒”是与染色体DNA分离的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA而进行复制。在许多情况下，它是环形的和双链的。质粒提供了在微生物群体内水平基因转移的机制，并且通常在给定的环境状态下提供选择优势。质粒可以携带在竞争性环境中对天然存在的抗生素具有抗性的基因，或者替代地产生的蛋白质可以在类似情况下充当毒素。
基因工程中使用的“质粒”被称为“质粒载体”。许多从商业上获得的质粒可用于此类用途。要复制的基因被插入含有使细胞对特定抗生素具有抗性的基因和多个克隆位点（MCS，或多连接子）的质粒的拷贝中，所述克隆位点是含有几个常用的限制性酶切位点的短区域，其允许在该位置轻松插入DNA片段。质粒的另一主要用途是制备大量蛋白质。在这种情况下，研究人员使含有带有目的基因的质粒的细菌生长。正如细菌产生蛋白质以赋予其抗生素抗性一样，其也可以被诱导以从插入的基因产生大量蛋白质。
“酵母人工染色体”或“YAC”是指用于克隆大DNA片段（大于100 kb和最大3000 kb）的载体。它是人工构建的染色体，并且包含在酵母细胞中复制和保存所需的端粒、着丝粒和复制起始序列。构建使用最初的环状质粒，使用限制酶将环状质粒线性化，然后DNA连接酶可以通过使用粘性末端在线性分子内添加感兴趣的序列或基因。酵母表达载体（例如YAC、YIp（酵母整合质粒）、以及YEp（酵母游离质粒））非常有用，因为酵母本身就是真核细胞，因此可以得到具有翻译后修饰的真核蛋白质产物，但是已发现YAC比BAC更加不稳定，产生嵌合效应。
“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含在体内、离体或体外递送至宿主细胞的多核苷酸。
病毒载体的实施例包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、α病毒载体等。基于传染性烟草花叶病毒（TMV）的载体可以被用于制造蛋白质，并且已经被报道在烟草叶片中表达Griffithsin（O'Keefe et al. (2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104）。甲病毒属（Alphavirus）载体也已被开发用于基因治疗和免疫治疗，例如基于Semliki Forest病毒的载体和基于Sindbis病毒的载体。参见Schlesinger &Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 and Ying et al. (1999) Nat.Med. 5(7):823-827。在逆转录病毒载体介导基因转移的方面，载体构建体是指包含逆转录病毒基因组或其一部分以及治疗基因的多核苷酸。关于用于基因转移的载体的现代方法的更多细节可以在例如Kotterman et al. (2015) Viral Vectors for Gene Therapy:Translational and Clinical Outlook Annual Review of Biomedical Engineering 17中发现。
如本文使用的，“逆转录病毒介导的基因转移”或“逆转录病毒转导”具有相同的含义，并且是指借助于病毒进入细胞并将其基因组整合到宿主细胞基因组中而将基因或核酸序列稳定转移到宿主细胞中的过程。病毒可以通过其正常的感染机制进入宿主细胞，或者被修饰使其与不同的宿主细胞表面受体或配体结合来进入细胞。如本文所用，逆转录病毒载体是指能够通过病毒或类病毒进入机制将外源核酸引入细胞的病毒颗粒。
逆转录病毒以RNA形式携带其遗传信息；但是，一旦病毒感染细胞，RNA就会逆转录为DNA形式，并整合到被感染细胞的基因组DNA中。整合的DNA形式称为前病毒（provirus）。
在基因转移由DNA病毒载体（例如腺病毒（Ad）或腺相关病毒（AAV））介导的方面中，载体构建体是指包含病毒基因组或其一部分和转基因的多核苷酸。腺病毒（Ad）是相对良好地被表征的同质病毒群，包括超过50种血清型。腺病毒不需要整合到宿主细胞基因组中。还构建了重组Ad衍生的载体，特别是那些减少野生型病毒的重组和产生的可能性的载体。这类载体可以从例如Takara Bio USA (Mountain View, CA)、Vector Biolabs(Philadelphia, PA)和Creative Biogene (Shirley, NY)的来源商购获得。野生型AAV具有整合到宿主细胞的基因组中的高感染性和特异性。参见，Wold and Toth (2013) Curr.Gene. Ther. 13(6):421-433、Hermonat & Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 81:6466-6470和Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996。
含有启动子和可以被可操作地连接进多核苷酸的克隆位点的载体是本领域众所周知的。这样的载体能够在体外或体内转录RNA，并且可以商购获得，例如从AgilentTechnologies (Santa Clara, Calif.)和Promega Biotech (Madison, Wis.)。为了优化表达和/或体外转录，在转录或翻译水平上，可能有必要去除、添加或改变克隆的5'和/或3'非翻译部分，以消除可能干扰或减少表达的额外的、潜在的不适当的替代翻译起始密码子或其他序列。或者，可以在起始密码子的5'处立即插入共有核糖体结合位点以增强表达。
基因递送载体还包括DNA/脂质体复合物、胶束和靶向病毒蛋白-DNA复合物。还包含靶向抗体或其片段的脂质体可以被用于本文公开的方法中。除了将多核苷酸递送到细胞或细胞群外，通过非限制性的蛋白质转染技术可以将本文公开的蛋白质直接引入细胞或细胞群，替代地能够增强本文公开的蛋白质的表达和/或促进活性的培养条件是其他非限制性技术。
如本文施用的，术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指病毒颗粒的蛋白质壳或外壳。衣壳的功能是衣壳化（encapsidate）、保护、运输病毒基因组并将其释放到宿主细胞中。衣壳通常由蛋白质（“衣壳蛋白”）的寡聚结构亚基组成。如本文所用，术语“衣壳化”是指封闭在病毒衣壳内。
如本文使用的，关于病毒或质粒的术语“辅助（子）”是指用于提供复制和包装病毒颗粒或重组病毒颗粒（例如本文公开的经修饰的AAV）所必需的另外的组分的病毒或质粒。辅助病毒编码的组分可以包括病毒粒子组装、衣壳化、基因组复制和/或包装所需的任何基因。例如，辅助病毒可以编码用于病毒基因组的复制的必需的酶。辅助病毒和适用于AAV构建体的质粒的非限制性实施例包括pHELP（质粒）、腺病毒（病毒）或疱疹病毒（病毒）。
如本文使用的，术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是一种单链DNA细小病毒，仅在通过共感染辅助病毒提供某些功能的细胞中生长。AAV的一般信息和评论可以参见例如Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169- 228, andBerns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)。完全可以预期，这些评论中描述的相同原理将适用于在评论公布之日后表征的其他AAV血清型，因为众所周知，各种血清型在结构上和功能上甚至在遗传水平上都十分紧密相关。（参见，例如，Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R.Pattison, ed.; and Rose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974)）。例如，所有AAV血清型显然都表现出由同源rep基因介导的非常相似的复制特性；并且都携带有三种相关的衣壳蛋白，例如在AAV2中表达的那些。异源双链分析进一步表明了相关程度，该分析揭示了沿基因组长度的血清型之间广泛的交叉杂交；以及在末端与“反向末端重复序列”（ITR）相对应的类似自退火片段的存在。相似的传染性模式也表明，每种血清型中的复制功能都处于相似的调节控制之下。
如本文使用的，“AAV载体”是指包含侧接于AAV末端重复序列（ITR）的一个或多个感兴趣的多核苷酸（或转基因）的载体。当存在于已经用编码和表达rep和cap基因产物的载体转染的宿主细胞中时，这样的AAV载体可以被复制并被包装成感染性病毒颗粒。
“AAV病毒粒子”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸AAV载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸（即，野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如要递送至哺乳动物细胞的转基因），则通常称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，因为这种载体被包含在AAV载体颗粒内。
腺相关病毒（AAV）是一种复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度约为4.7kb，包括两个145个核苷酸的反向末端重复序列（ITR）。AAV有多种血清型。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，GenBank登录号NC_002077中提供了AAV-1的完整基因组；GenBank登录号NC_001401和Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 { 1983)中提供了AAV-2的完整基因组；GenBank登录号NC_1829中提供了AAV-3的完整基因组；GenBank登录号NC_001829中提供了AAV-4的完整基因组；GenBank登录号AF085716中提供了AAV-5的完整基因组；GenBank登录号NC_00 1862中提供了AAV-6的完整基因组；GenBank登录号AX753246和AX753249中分别提供了AAV-7和AAV-8基因组的至少一部分；Gao et al., J.Virol., 78: 6381-6388 (2004)中提供了AAV-9基因组；Mol. Ther., 13(1): 67-76(2006)中提供了AA-10基因组；以及Virology, 330(2): 375-383 (2004)中提供了AAV-11基因组。美国专利9,434,928中提供了AAV rh.74基因组的序列，其内容通过引用并入本文。指导病毒DNA复制（rep）、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列被包含在AAVITR中。三个AAV启动子（因其相对图谱位置而命名为p5、p19和p40）驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子（p5和pi9），加上单个AAV内含子的差异剪接（在核苷酸2107和2227处），导致从rep基因产生四个rep蛋白（rep78、rep68、rep52和rep40）。Rep蛋白具有最终负责复制病毒基因组的多种酶学性质。Cap基因是从p40启动子表达的，并且它编码三个衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代的剪接和非共有的翻译起始位点负责三个相关的衣壳蛋白的产生。单个共有多聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)中综述了AAV的生命周期和遗传学。
AAV具有独特的功能，使其作为将外源DNA递送至细胞的载体（例如在基因治疗中）有吸引力。培养物中细胞的AAV感染是非细胞病变的，人类和其他动物的自然感染是隐形的且无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，从而有可能在体内靶向许多不同的组织。此外，AAV缓慢转导分裂和非分裂的细胞，并且可以作为转录活性核附加体（染色体外元素）在这些细胞的生命周期中持续存在。AAV前病毒基因组作为克隆的DNA被插入质粒中，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导AAV复制和基因组衣壳化的信号被包含在AAV基因组的ITR中，所以基因组内部大约4.3 kb的部分或全部（编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap）可以被外源DNA代替。为了产生AAV载体，可以以反式形式提供rep和cap蛋白。AAV的另一个重要特征是它是一种非常稳定和强烈（hearty）的病毒。它可以轻松承受用于灭活腺病毒的条件（56℃至65℃持续数小时），从而使AAV的冷藏不那么关键。AAV甚至可以冻干。最后，AAV感染的细胞对超级感染没有抵抗力。
多项研究证明，重组AAV介导的蛋白质在肌肉中长期表达（>1.5年）。参见，Clarket al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc.USA, 93: 14082-14087 (1996)和Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996)。还参见，Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000)和Chao et al., Mol Ther, 4:217-222(2001)。此外，如在Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997)和Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921- 13926 (1997)中所述，由于肌肉高度血管化，所以重组AAV转导导致肌肉注射后全身循环中出现转基因产物。此外，Lewiset al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002)证明了骨骼肌纤维具有正确的抗体糖基化、折叠和分泌所必需的细胞因子，表明肌肉能够稳定表达分泌的蛋白质治疗剂。本发明的重组AAV（rAAV）基因组包含编码γ-肌聚糖（sarcoglycan）的核酸分子（例如，SEQ ID NO：1）和在该核酸分子侧翼的一个或多个AAV ITR。rAAV基因组中的AAV DNA可以来自用于可以衍生包括但不限于以下AAV血清型的重组病毒的任何AAV血清型：AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAV rh74。假型rAAV的产生公开于例如WO 01/83692。也可以预期其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见，例如Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)。各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。
术语“Cas9”是指该名称所指的CRISPR相关的核酸内切酶。本文提供了非限制性示例性Cas9，例如，UniProtKB G3ECR1（CAS9_STRTR）中提供的Cas9或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）Cas9、以及核酸酶致死（nuclease dead）Cas9、其每一个的直系同源物和生物等效物。直系同源物包括但不限于：酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9（“spCas9”），来自嗜热链球菌（Streptococcus thermophiles）、嗜肺军团菌（Legionella pneumophilia）、乳酸奈瑟球菌（Neisseria lactamica）、脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides）、新凶手弗朗西丝菌（Francisella novicida）的Cas 9；以及来自不同细菌种类（包括氨基酸球菌属（Acidaminococcus spp.）和新凶手弗朗西丝菌（Francisella novicida）U112）的Cpf1（进行与Cas9类似的切割功能）。
如本文使用的，术语“CRISPR”是指依赖于规律成簇的间隔短回文重复序列通路的序列特异性基因操作的技术。CRISPR可用于执行基因编辑和/或基因调控，以及用于简单地将蛋白质靶向至特定的基因组位置。基因编辑是指一种基因工程的类型，其中通过向多核苷酸序列引入缺失、插入、或碱基取代来改变靶多核苷酸的核苷酸序列。在一些方面，CRISPR-介导的基因编辑利用非同源末端连接（NHEJ）或同源重组的途径来执行该编辑。基因调控是指增加或减少特定基因产物（例如蛋白质或RNA）的产生。
如本文使用的，术语“gRNA”或“指导RNA”是指用于靶向特定基因以利用CRISPR技术进行修正的指导RNA序列。设计用于靶标特异性的gRNA和供体治疗性多核苷酸的技术是本领域众所周知的。例如，Doench, J., et al. Nature biotechnology 2014、32(12):1262-7, Mohr, S. et al. (2016) FEBS Journal 283: 3232-38和Graham, D., et al.Genome Biol. 2015; 16: 260。gRNA包含含有CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRIPSPR RNA（tracrRNA）的融合多核苷酸或含有CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRIPSPR RNA（tracrRNA）的多核苷酸，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些方面，gRNA是合成的（Kelley, M. et al. (2016) J of Biotechnology 233 (2016) 74-83）。如本文所用，gRNA的生物学等效物包括但不限于可以将Cas9或其等效物引导至特定核苷酸序列（例如细胞基因组的特定区域）的多核苷酸或靶向分子。
“组合物”旨在表示活性多肽、多核苷酸或抗体与惰性（例如，可检测的标记）或活性（例如，基因递送载体）的另一种化合物或组合物的组合。
“药物组合物”旨在包括活性多肽、多核苷酸或抗体与惰性或活性载体（例如固体支持物）的组合，从而使该组合物适合于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。
如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”包含任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水和乳剂（例如油/水或水/油乳剂），以及各种类型的润湿剂。该组合物还可以包含稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和佐剂的实施例参见Martin (1975) Remington’sPharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)。
诊断或治疗的“对象”是细胞或动物，例如哺乳动物或人类。对象不仅限于特定物种，还包括经受诊断或治疗的非人类动物，并且是经受感染或动物建模的，例如猿猴、鼠类（例如大鼠、小鼠、灰鼠）、犬类（例如狗）、兔类（例如兔子）、家畜、运动动物和宠物。该术语也包括人类患者。
术语“组织”在本文中用于指活的或死的生物的组织，或衍生自或设计为模仿活的或死的生物的任何组织。该组织可以是健康的、患病的和/或具有遗传突变。生物组织可以包括任何单个组织（例如，可以相互连接的细胞的集合）或组成生物体的器官或部分或区域的一组组织。组织可以包含均质的细胞材料，或者可以是复合结构，例如在包括胸部的身体区域中发现的复合结构，所述胸部例如可以包括肺组织、骨骼组织和/或肌肉组织。示例性组织包括但不限于源自肝、肺、甲状腺、皮肤、胰腺、血管、膀胱、肾脏、脑、胆管树、十二指肠、腹主动脉、静脉、心脏和肠的组织，包括其任何组合。
如本文使用的，“治疗”在对象中的疾病是指（1）防止症状或疾病在预先有倾向的或尚未显示疾病症状的对象中发生；（2）抑制疾病或阻止其发展或复发；或者（3）改善或消退疾病或疾病的症状。如本领域中理解的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果（包括临床结果）的方法。对于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于以下中的一种或多种：一个或多个症状的缓解或改善，病症（包括疾病）的程度的降低，病症（包括疾病）的稳定化（即不恶化）状态，病症（包括疾病）的延迟或减缓，病症（包括疾病）、状态和缓解（无论是部分还是全部）的进展、改善或缓解，无论是可检测的还是不可检测的。
执行本公开技术的方式
经修饰的病毒衣壳和制备方法
目前，AAV载体的递送依赖于基于病毒的自然趋向性的将血清型选择用于组织靶向或直接注射入靶标组织。如果需要全身递送来获得最大的治疗益处，那么血清型选择是结合组织特异性启动子用于组织靶向的唯一可用选择。如本文所述的，申请人已经鉴定了负责受体结合和进入的特定氨基酸，从而减少了进行详尽的诱变研究来鉴定AAVrh74 [7-11]中关键氨基酸的需要（图1）。鉴定出肝脏脱靶的关键区域后，申请人开发了经修饰的衣壳，其可以丰富肌肉特异性载体的转导。将减少肝脏中的载体损失与感兴趣的基因的肌肉细胞特异性递送相结合的积极影响将大大提高在神经肌肉疾病的全身治疗中达到临床疗效阈值的机会。
本公开涉及经修饰的衣壳蛋白、分离的多核苷酸、制备经修饰的衣壳蛋白的方法、重组病毒颗粒和用于产生经修饰的病毒颗粒的重组表达系统。本公开的一方面涉及经修饰的病毒衣壳蛋白，其包含通过氨基酸置换或插入1至7个氨基酸来修饰的病毒衣壳蛋白，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg）（SEQ ID NO：2）。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。经修饰的衣壳可以被并入其他病毒递送系统中。
在另一方面，经修饰的病毒颗粒还包含用于基因修饰的转基因和/或用于基因修饰的CRISPR系统。
本文还公开了编码经修饰的病毒衣壳蛋白的分离的多核苷酸，经修饰的病毒衣壳蛋白包括通过氨基酸取代或插入1至7个氨基酸来修饰的经修饰的病毒衣壳蛋白，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQ ID NO：2）。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。
本文公开了包含经修饰的衣壳蛋白的重组病毒颗粒，或基本上由其组成，或进一步由其组成，经修饰的衣壳蛋白包含通过氨基酸取代或插入1至7个氨基酸来修饰的经修饰的病毒衣壳蛋白，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在进一步的实施方案中，对于患病或功能障碍的组织，相对于AAVrh74，该病毒颗粒增加治疗递送的功效约3至56倍。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在进一步的实施方案中，疾病或功能障碍组织是心脏组织。在另外的实施方案中，对于心脏组织，相对于AAVrh74，该病毒颗粒增加治疗递送的功效约50倍或更多倍。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQ ID NO：2）。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。在一些实施方案中，病毒颗粒包含有效量的适合疾病或功能障碍组织的治疗。在一些实施方案中，治疗是基于CRISPR/Cas9的基因编辑。
可以使用病毒包装系统（例如逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或杆状病毒包装系统）包装经修饰的病毒（例如AAV）。在一些实施方案中，通过使用辅助病毒或辅助质粒和细胞系来实现包装。辅助病毒或辅助质粒含有促进遗传物质向细胞内传递的成分和序列。在另一方面，将辅助质粒或包含辅助质粒的多核苷酸稳定地并入包装细胞系的基因组中，使得包装细胞系不需要用辅助质粒进行另外的转染。
辅助质粒可以包含例如至少一个病毒辅助DNA序列，其衍生自反式编码包装复制缺陷型AAV所需的所有病毒粒子蛋白的复制缺陷型病毒基因组，用于产生能够以高滴度包装复制缺陷型AAV的病毒粒子蛋白，而不产生有复制能力的AAV。病毒DNA序列缺少编码病毒的病毒性5’LTR的天然增强子和/或启动子的区域，并且缺少负责包装辅助基因组的psi功能序列和3’LTR，但是编码外来的聚腺苷酸化位点（例如SV40聚腺苷酸化位点）、以及引导其中需要病毒生产的细胞类型中的有效转录的外来增强子和/或启动子。病毒是白血病病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、或长臂猿白血病病毒（GALV）。外来增强子和/或启动子可以是人类巨细胞病毒（HCMV）即时早期（IE）增强子和启动子、莫洛尼鼠肉瘤病毒（MMSV）的增强子和启动子（U3区域）、Rous肉瘤病毒（RSV）的U3区域、脾病灶形成病毒（SFFV）的U3区域、或连接到天然莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）启动子的HCMV IE增强子。辅助质粒可以由两个逆转录病毒辅助DNA序列组成，它们由基于质粒的表达载体编码，例如其中第一辅助序列包括编码嗜亲性MMLV或GALV的gag和pol蛋白的cDNA，并且第二辅助序列包括编码env蛋白的cDNA。Env基因确定宿主范围，可以衍生自编码以下的基因：嗜异性的、双嗜性的、嗜亲性、多嗜性的（貂病灶形成）或10A1鼠白血病病毒env蛋白、或长臂猿白血病病毒（GALV）env蛋白、人类免疫缺陷病毒env（gp160）蛋白、水泡性口炎病毒（VSV）G蛋白、人类T细胞白血病（HTLV）I型和II型env基因产物，嵌合包膜基因，其衍生自前述env基因或编码前述env基因产物的细胞质和跨膜结构域的嵌合包膜基因中的一个或多个以及针对在所需的靶细胞上的特异性表面分子的单克隆抗体的组合。
在包装过程中，将辅助质粒和编码AAV病毒蛋白的质粒瞬时共转染到能够产生病毒的哺乳动物细胞（例如人胚胎肾细胞，例如293细胞（ATCC No. CRL1573, ATCC,Rockville, Md.））的第一群体中，以产生高滴度的含重组逆转录病毒的上清液。在本发明的另一种方法中，然后将该瞬时转染的第一细胞群与哺乳动物靶细胞（例如人淋巴细胞）共培养，以用外源基因高效转导靶细胞。
组合物
本发明还提供了一种组合物或试剂盒，其包含任何一种或多种本文所述的病毒载体、分离的细胞、包装系统、病毒颗粒和载体。一方面，载体是药学上可接受的载体。这些组合物可以如本文所述地被用于治疗，并且可以被用于与其他已知疗法组合。
施用经修饰的病毒颗粒的方法
本文提供了一种非人转基因动物，其包含通过氨基酸置换或插入1至7个氨基酸来修饰的经修饰的病毒衣壳蛋白。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQ ID NO：2）。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。
本文公开了一种基因编辑方法，其包含使细胞与重组病毒颗粒接触，基本上由其组成，或进一步由其组成，所述重组病毒颗粒包含经修饰的衣壳，或替代地基本上由其组成，其中所述经修饰的衣壳包含经修饰的病毒衣壳蛋白，或基本上由其组成，所述经修饰的病毒衣壳蛋白包含通过氨基酸置换或插入1至7个氨基酸来修饰的经修饰的病毒衣壳蛋白，或替代地基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是这种取代是维持的。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQ ID NO：2）。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。在一些实施方案中，接触是体内或体外的。在一些实施方案中，病毒颗粒包含一种或多种多核苷酸，并且所述多核苷酸的至少一种包含编码指导RNA（gRNA）的多核苷酸，或基本上由其组成，或者进一步由其组成。在一些方面，多核苷酸的至少一种包含治疗性多肽，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒颗粒包含Cas9或其等效物。
本文进一步公开了一种在有需要的对象中基因编辑的方法，其包含向所述对象施用有效量的重组病毒颗粒，所述重组病毒颗粒包含经修饰的衣壳，或替代地基本上由其组成，其中所述经修饰的衣壳包含经修饰的衣壳，其中所述修饰的衣壳包含经修饰的病毒衣壳蛋白，所述经修饰的病毒衣壳蛋白包含通过氨基酸置换或插入1至7个氨基酸来修饰的经修饰的病毒衣壳蛋白，或替代地基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQ ID NO：2）。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。在一些实施方案中，病毒颗粒包含一种或多种多核苷酸，并且所述多核苷酸的至少一种包含编码指导RNA（gRNA）的多核苷酸，或基本上由其组成，或者进一步由其组成。在一些方面，多核苷酸的至少一种包含治疗性多肽，或替代地基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒颗粒包含Cas9或其等效物。
本文提供一种包含重组病毒衣壳颗粒的非人转基因动物，所述重组病毒衣壳颗粒包含重组病毒颗粒，或替代地基本上由其组成，或进一步由其组成，所述重组病毒颗粒包含经修饰的衣壳，或替代地基本上由其组成，其中所述经修饰的衣壳包含经修饰的病毒衣壳蛋白，所述经修饰的病毒衣壳蛋白包含通过氨基酸置换或插入1至7个氨基酸来修饰的经修饰的病毒衣壳蛋白，或替代地基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的505位氨基酸处色氨酸被精氨酸取代。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQ ID NO：2）。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是这种取代是维持的。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。
在一些方面，编码gRNA的多核苷酸包含含有CRISPR RNA（crRNA）和反式激活的CRIPSPR RNA（tracrRNA）的融合多核苷酸或含有CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRIPSPRRNA（tracrRNA）的多核苷酸，或替代地基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些方面，gRNA对需要在有需要的对象或细胞中进行基因编辑的DNA的区域具有特异性。
在一些方面，重组病毒颗粒进一步包含治疗性多核苷酸。治疗性多核苷酸是可以被用于靶向需要编辑的DNA序列、提供需要编辑的DNA序列的修复模板或提供需要编辑的DNA序列的替代的任何多肽。在其他方面，治疗性多肽包含需要在有需要的对象或细胞中进行基因编辑的基因的野生型序列。
更进一步的方面涉及治疗患有疾病、病症或病状的对象的方法，其包含向对象施用本文公开的经修饰的AAV。在一些方面，疾病、病症或病状选自血友病（hemophilia）、肌营养不良症、多发性硬化、α-1抗胰蛋白酶症（alpha-1-antitrypsin）、肌萎缩性脊髓侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）、阿尔兹海默症（Alzheimer’s）、脊髓性肌肉萎缩症（spinal muscular atrophy）、囊胞性纤维症（cystic fibrosis）、HIV、地中海贫血（thalassemia）、无脉络膜症（choroideremia）、帕金森症（Parkinson’s）、莱伯氏先天性黑朦症（Leber congenital amaurosis）、黄斑变性（macular degeneration）、芳香氨基酸脱羧酶不足症（aromatic amino acid decarboxylase deficiency）、全色盲（achromatopsia）、Crigler Najjar综合征、庞贝病（Pompe disease）、遗传性视网膜劈裂症（X-linked retinoschisis）、纯合子家族性血胆固醇（homozygous familialhypercholesteremia）、贝敦氏症（Batten disease）、视网膜变性（retinaldegeneration）、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症（ornithine transcarbamylasedeficiency）、粘多糖病（mucopolysarccharidosis）(I-IX)、乙型肝炎（hepatitis B）和丙型肝炎（hepatitis C）。在一方面，血友病的特征在于因子VIII或因子IX缺乏中的一种或多种。在一些方面，肌营养不良症选自贝克氏（Becker）肌营养不良症、先天性肌营养不良症、杜兴肌营养不良症、远端型肌营养不良症、埃-德二氏（Emery-Dreifuss）肌营养不良症、面肩胛肱型（facioscapulohumeral）肌营养不良症、肢节型（limb-girdle）肌营养不良症、强直性（myotonic）肌营养不良症和眼咽型（oculopharyngeal）肌营养不良症。
在一些方面，设计和/或选择指导RNA和/或治疗性多核苷酸来治疗选自以下的疾病、病症或病状：血友病、肌营养不良症、多发性硬化、α-1抗胰蛋白酶症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、阿尔兹海默症、脊髓性肌肉萎缩症、囊胞性纤维症、HIV、地中海贫血、无脉络膜症、帕金森症、莱伯氏先天性黑朦症、黄斑变性、芳香氨基酸脱羧酶不足症、全色盲、CriglerNajjar综合征、庞贝病、遗传性视网膜劈裂症、纯合子家族性血胆固醇、贝敦氏症、视网膜变性、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、粘多糖病(I-IX)、乙型肝炎和丙型肝炎。在一方面，血友病的特征在于因子VIII或因子IX缺乏中的一种或多种。在一些方面，肌营养不良症选自贝克氏肌营养不良症、先天性肌营养不良症、杜兴肌营养不良症、远端型肌营养不良症、埃-德二氏肌营养不良症、面肩胛肱型肌营养不良症、肢节型肌营养不良症、强直性肌营养不良症和眼咽型肌营养不良症。
在一些方面，设计和/或选择指导RNA和/或治疗性多核苷酸来靶向或修复选自以下的基因：因子VIII（F8，NM_000132、NM_019863）、因子IX（F9，NM_000133、NM_001313913）、肌营养不良蛋白（dystrophin，DMD，NM_000109、NM_004006、NM_004007、NM_004009、NM_004010）、Dysferlin（DYSF，NM_001130455、NM_001130976、NM_001130977、NM_001130978、NM_001130979）、emerin（EMD，NM_000117）、lamin A/C（LMNA，NM_001257374、NM_001282624、NM_001282625、NM_001282626、NM_005572）、双同源异型框4（DUX4，NM_001205218、NM_001278056、NM_001293798、NM_001306068）、myotonin蛋白激酶（MDPK，NM_001081560、NM_001081562、NM_001081563、NM_001288764、NM_001288765）、细胞核酸结合蛋白（CNBP，NM_003418、NM_001127192、NM_001127193、NM_001127194、NM_001127195）、聚腺苷酸结合蛋白2（PABP-2，NM_004643）、α-1抗胰蛋白酶、超氧化物歧化酶（SOD1，NM_000454）、alsin（ALS2，NM_001135745、NM_020919）、解旋酶senataxin（SETX，NM_015046）、spatacsin（SPG11，NM_001160227、NM_025137）、RNA结合蛋白FUS/TLS（FUS，NM_001010850、NM_001170634、NM_001170937、NM_004960）、囊泡相关膜蛋白相关蛋白B/C（VAPB，NM_001195677、NM_004738）、血管生成素（ANG，NM_001145、NM_001097577）、TAR DNA结合蛋白43（TARDBP，NM_007375）、多磷酸肌醇磷酸酶（FIG4, NM_014845）、视神经蛋白（OPTN，NM_001008211、NM_001008212、NM_001008213、NM_021980）、ataxin-2（ATXN2，NP_001297050、NP_001297052、NP_002964）、含缬酪肽蛋白（VCP，NM_007126）、泛醌蛋白2（UBQLN2，NM_013444）、Σ1受体（SIGMAR1，NM_001282205、NM_001282206、NM_001282207、NM_001282208、NM_001282209）、荷电多泡体蛋白2b（CHMP2B，NM_001244644、NM_014043）、抑制蛋白1（PFN1，NM_005022）、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-4（ERBB4，NM_001042599、NM_005235）、核内不均匀核糖核蛋白A1（HNRNPA1，NM_002136、NM_031157）、基质蛋白3（MATR3，NM_199189、NM_001194954、NM_001194955、NM_001194956、NM_001282278）、微管蛋白α4A链（TUBA4A，NM_001278552、NM_006000）、9号染色体开放阅读框72（C9orf72，NM_145005、NM_001256054、NM_018325）、CHCD10、SQSTM1（NM_001142298）、TBK1、载脂蛋白E（NM_001302691、NM_000041、NM_001302688、NM_001302689、NM_001302690）、SMN1（NM_000344）、SMN2（NM_017411、NM_022875、NM_022876、NM_022877）、CTFR（NM_000492）、β珠蛋白HBB PDB、CHM、α-突触核蛋白（SNCA，NM_000345）、parkin（PRKN，NM_004562）、富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2或dardarin，NM_198578）、PTEN诱导的假定激酶1（PINK1，NM_032409）、DJ-1（NM_001123377）、酸性麦芽糖酶（NM_000152）、UDP葡萄糖醛酸基转移酶1（NM_000463）、PPT-1（NM_000310）或ATP13A2（NM_001141973）。
本发明的其他方面涉及包含载体和本文所述的经修饰的病毒的组合物。简单来说，本发明的药物组合物可以包含本文所述的经修饰的病毒颗粒、以及一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包含：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂（例如氢氧化铝）；以及防腐剂。本公开的组合物可以被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外施用。在某些实施方案中，本公开的组合物被配制用于静脉内施用。
本领域技术人员应理解，可以产生gRNA用于靶标特异性来靶向特定基因，任选地与疾病、病症或病状相关的基因。因此，与Cas9结合，指导RNA促进了CRISPR/Cas9系统的靶标特异性。如上所述，例如启动子选择的其他方面可以提供实现靶标特异性的其他机制，例如，为编码在特定器官或组织中促进表达的多核苷酸的指导RNA选择启动子。因此，本文考虑用于特定疾病、病症或病状的合适gRNA的选择。
在整个治疗过程中，经修饰的AAV或组合物的施用可以以一个剂量连续或间歇地进行。施用可以通过任何合适的施用方式，包括但不限于：静脉内、动脉内、肌内、心内、鞘内、室下、硬膜外、大脑内、脑室内、视网膜下、玻璃体内、关节内、眼内、腹膜内、子宫内、皮内、皮下、经皮、经粘膜和吸入。
确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗的目的以及所治疗的对象而变化。单次或多次施用可以根据治疗医师选择的剂量水平和方式进行。注意，剂量可能受施用途径的影响。合适的剂型和施用药剂的方法是本领域已知的。这样的合适剂量的非限制性实施例可以低至每次施用1E + 9个载体基因组至多达1E + 17个载体基因组。
在另一方面，本发明的经修饰的病毒颗粒和组合物可以与其他治疗（例如适合于特定疾病、病症或病状的那些被批准的治疗）联合施用。非限制性实施例包括用经修饰的病毒颗粒和一种或多种类固醇的组合治疗肌营养不良症。可以通过监测治疗医师确定的基因修饰的临床或亚临床证据来确定治疗是否成功。
可以进行本发明的经修饰的病毒颗粒或组合物的这种施用，以产生用于实验和筛选测定的所需疾病、病症或病状的动物模型。
经修饰的AAV衣壳和颗粒
本公开还提供了一种具体实施方案，例如，一种经修饰的腺相关病毒（AAV）包含重组病毒颗粒，所述重组病毒颗粒包含经修饰的衣壳，或替代地基本上由其组成，其中所述经修饰的衣壳包含经修饰的病毒衣壳蛋白，所述经修饰的病毒衣壳蛋白包含通过氨基酸置换或插入1至7个氨基酸来修饰的经修饰的病毒衣壳蛋白，或替代地基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。在一些实施方案中，修饰是在AAVrh74的VP1的591位氨基酸处插入肽YIG或YIGSR（SEQ ID NO：2）。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，所述肽对α7β1整合蛋白具有高亲和力和/或位于可能改变正常rh74受体结合的区域中。
腺相关病毒（AAV）载体是复制缺陷型病毒，经过改造可有效地将遗传物质递送至细胞。它们是非包膜病毒，其载体形式仅具有原始病毒的反向末端重复序列（ITR）。结构和酶促AAV蛋白通过另外的质粒“反式”提供，并一起转染到细胞中，以产生用于基因递送的工程化颗粒。由于AAV的安全性和效率，其已经被广泛用于基因治疗，尤其是CRISPR/Cas9系统。AAV有效感染各种细胞，并且在感染过程中，衣壳结合至并进入载体基因组被递送的细胞核。
AAV结构颗粒由由VP1、VP2和VP3组成的60个蛋白质分子组成。每个颗粒包含约5个VP1蛋白、5个VP2蛋白和50个VP3蛋白，排列成二十面体结构。已经表明，AAV2颗粒可以支持肽和蛋白质在衣壳结构内各个位点的插入。将独特的肽引入衣壳的能力导致具有改变的趋向性的AAV颗粒的开发，这使得病毒结合并感染通常难以感染的细胞和组织。另外，已经将大的肽甚至功能性蛋白质以不同的水平成功引入了AAV2载体的衣壳中。生成了含有AAV衣壳的功能性绿色荧光蛋白（GFP，30 kD MW），并产生了被用于跟踪细胞感染的感染性病毒。
用于基因递送的AAV载体的限制之一是可以有效被包装进颗粒的遗传插入物的尺寸限制。例如，野生型AAV2基因组的尺寸是单链DNA，4679个碱基。仅包装Cas9的一个新的较小变体之一（金黄色葡萄球菌Cas9，SaCas9，130 kD MW）就需要大约3255 bp用于编码区。向构建体添加普遍存在的或组织特异性的启动子可以再增加500-800 bp。再加上500 bp的poly A添加序列和ITR和载体，就接近AAV颗粒的包装能力。为了实现功能性CRISPR/Cas9基因校正，还必须包括具有靶标序列的指导RNA（gRNA）。为了使该RNA进一步表达，需要最小的polIII启动子和终止序列。这些成分在一起太大，无法组合进AAV载体中被有效包装。人们可以选择将Cas9构建体和指导RNA表达盒包装进单独的载体中，但是，要使它们发挥功能，两种病毒都必须感染相同的靶细胞。
本公开的其他方面涉及用于产生这种经修饰的AAV的重组表达系统。在一些实施方案中，重组表达系统包含多个质粒；编码所有AAV病毒蛋白：VP1、VP2和VP3。在一些实施方案中，每种病毒蛋白在不同的质粒中被编码。在一些实施方案中，一种或多种病毒蛋白在同一质粒中被编码。在一些实施方案中，至少一种病毒蛋白被编码为Cas9的融合蛋白。
因此，本文公开的实施方案涉及用于产生包含经修饰的衣壳的经修饰的AAV的重组表达系统，其中所述经修饰的衣壳包含经修饰的病毒衣壳蛋白，所述经修饰的病毒衣壳蛋白包含通过氨基酸置换或插入1至7个氨基酸来修饰的经修饰的病毒衣壳蛋白，或替代地基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，病毒衣壳蛋白是VP1，任选地是AAVrh74。在进一步的实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的502位氨基酸处异亮氨酸取代天冬酰胺或等效修饰。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，修饰包含在AAVrh74的VP1的氨基酸505处色氨酸被精氨酸取代。在一些方面，肽中的其他氨基酸被修饰，但是维持了这种取代。在一些实施方案中，修饰靶向主要存在于卫星细胞（任选地是肌肉干细胞）上的受体。
一些方面涉及使用本文公开的重组表达系统产生经修饰的AAV的方法。
更进一步的方面涉及治疗患有疾病、病症或病状的对象的方法，其包含向对象施用本文公开的经修饰的AAV。在一些实施方案中，疾病、病症或病状选自：血友病、肌营养不良症、多发性硬化、α-1抗胰蛋白酶症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、阿尔兹海默症、脊髓性肌肉萎缩症、囊胞性纤维症、HIV、地中海贫血、无脉络膜症、帕金森症、莱伯氏先天性黑朦症、黄斑变性、芳香氨基酸脱羧酶不足症、全色盲、Crigler Najjar综合征、庞贝病、遗传性视网膜劈裂症、纯合子家族性血胆固醇、贝敦氏症、视网膜变性、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、粘多糖病(I-IX)、乙型肝炎和丙型肝炎。在一些实施方案中，血友病的特征在于因子VIII或因子IX缺乏中的一种或多种。在一些实施方案中，肌营养不良症选自贝克氏肌营养不良症、先天性肌营养不良症、杜兴肌营养不良症、远端型肌营养不良症、埃-德二氏肌营养不良症、面肩胛肱型肌营养不良症、肢节型肌营养不良症、强直性肌营养不良症和眼咽型肌营养不良症。
实施例
以下实施例是非限制性的，并且说明了可以在实施本公开内容的各种情况下使用的程序。另外，本文下面公开的所有参考文献通过引用整体并入本文。
AAVrh74是由NCH的研究人员鉴定的AAV血清型，已在临床试验中广泛用于治疗神经肌肉疾病。它可以有效感染人的心脏的和骨骼的肌肉，并且在人群中预先存在的中和抗体的流行率较低。
实施例1-通过血管递送确定用于最大的成肌肉细胞和卫星细胞生物分布的最佳 经修饰的血清型。
骨骼肌中的卫星肌肉细胞比肌纤维细胞多60倍[2]。它们是自我更新的干细胞群体，有助于骨骼肌的长期再生能力[12]。最近，已经鉴定出几种可通过FACS分类的标记物，用于分离肌肉干细胞[13]（图2）。α7β1整合蛋白已经被鉴定为阳性肌肉干细胞选择标记物，并且还是骨骼成肌肉细胞和成年肌纤维的主要层粘连蛋白受体。表达研究表明，α7β1整合蛋白在心脏和骨骼肌组织中大量表达，而在肝组织中仅发现较低水平。申请人已经修饰了AAVrh74衣壳来表达一种肽，该肽已经显示出与α7β1整合蛋白高亲和力结合。申请人已将肽定位在可能改变正常AAVrh74受体结合基序的区域中，以便利用α7β1-整合蛋白作为结合受体。申请人还确定了被认为是肝脏特异性结合和进入所必需的AAVrh74的其他氨基酸的另外两个突变，并且所述突变显示在静脉内注射载体后能够增加报告基因的整体和/或肌肉特异性递送（图3-5）。
向C57BL/6J小鼠静脉内注射表达与先前证明的相同的荧光素酶-EYFP融合蛋白的新创建的经修饰的衣壳病毒或对照AAVrh74（AAVmut4、AAVmut5和AAVYIG或YIGSR591），并在3周后用PBS/低聚甲醛灌注来处死小鼠，然后对切片肌肉和器官进行免疫组织化学染色来确定被转导的特定细胞群。最初，每周使用IVIS成像系统对小鼠进行荧光素酶表达成像，以确认基因表达。注射后三周，给小鼠灌注，将组织收集并固定在低聚甲醛中，然后切片和通过免疫荧光进行GFP表达染色，并复染以鉴定细胞类型特异性抗原的表达。这种方法使申请人能够确定由不同衣壳突变载体转导的特定细胞群，从而确定哪种可能对目标肌肉疾病的益处最大。
AAVrh74是目前在骨骼肌和心肌中高水平基因表达的标准，并被用作衣壳修饰的骨架。注射对照和三种衣壳经修饰的病毒后三周，通过qPCR确定静脉内注射后CD-1小鼠的载体生物分布（图3）。mut4载体显示出载体的整体生物分布总体增加，股四头肌、横膈膜和心肌中显著增加。相比于AAVrh74，mut5和YIG或YIGSR591显示出心脏的载体转导显著增加。
表 1
组织 Mut4高于AAVrh74的倍数变化
血液 18
脑 8
肺 5
股四头肌 10
横膈膜 17
心 11
脾 3
肾 8
肝 56
图4和5显示了mut4和YIG或YIGSR591递送的萤光素酶基因在体内的表达高于亲本AAVrh74。图4显示了被圈出来的头部区域或下部躯干中增加的光子计数，以显示mut4病毒在多种组织中的转导和基因表达的有效性。
近交C57BL/6J小鼠（每个病毒组6只，雄性3只，雌性3只）被用于确认近亲CD-1小鼠的先前的生物分布特征。准备这4种病毒，并准备在它们到达时给小鼠注射。
等效物
除非另有定义，否则本文所用的所有的技术和科学的术语都具有如本发明的所属领域中的普通技术人员中的一个通常所理解的相同的含义。
可以在缺少在本文没有具体公开的任何元素或限制的情况下，适当地实施本文说明性地描述的本技术。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应该被广泛且没有限制地理解。此外，本文采用的术语和表达已经被用作描述而非限制，在这些术语和表达的使用中，没有意图排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，但是应该认识到，在本发明技术的范围之内各种变化都是可能的。
因此，应该理解的是，在此提供的材料、方法和实施例是优选的方面的代表，是示例性的，并且不旨在作为对本技术的范围的限制。
本文广泛地和一般地描述了本技术。落入一般性描述之内的较窄的种类和亚属分组中的每一个也都形成本技术的一部分。这包括了具有从该属中移除任何主题的附带条件或负面限制的本技术的一般性描述，无论被删除的材料是否在本文中被具体描述。
此外，在以马库什组描述本技术的特征或方面的情况中，本领域技术人员将认识到，还借此以该马库什组中的任何单独成员或成员的亚组描述了本技术。
在本文中提及的所有公开文献、专利申请、专利和其他参考文献，其整体都以引用的方式明确地合并入本文中，至如同每个都单独地以引用的方式合并的相同程度。如发生冲突，以本说明书（包括定义）为准。
在以下权利要求中阐述了其他方面。
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序列
SEQ ID NO:1 NM_000231.2 智人肌聚糖γ(SGCG), mRNA
GAAACTCGTGAGAGCCCTTTCTCCAGGGACAGTTGCTGAAGCTTCATCCTTTGCTCTCATTCTGTAAGTCATAGAAAAGTTTGAAACATTCTGTCTGTGGTAGAGCTCGGGCCAGCTGTAGTTCATTCGCCAGTGTGCTTTTCTTAATATCTAAGATGGTGCGTGAGCAGTACACTACAGCCACAGAAGGCATCTGCATAGAGAGGCCAGAGAATCAGTATGTCTACAAAATTGGCATTTATGGCTGGAGAAAGCGCTGTCTCTACTTGTTTGTTCTTCTTTTACTCATCATCCTCGTTGTGAATTTAGCTCTTACAATTTGGATTCTTAAAGTGATGTGGTTTTCTCCAGCAGGAATGGGCCACTTGTGTGTAACAAAAGATGGACTGCGCTTGGAAGGGGAATCAGAATTTTTATTCCCATTGTATGCCAAAGAAATACACTCCAGAGTGGACTCATCTCTGCTTCTACAATCAACCCAGAATGTGACTGTAAATGCGCGCAACTCAGAAGGGGAGGTCACAGGCAGGTTAAAAGTCGGTCCCAAAATGGTAGAAGTCCAGAATCAACAGTTTCAGATCAACTCCAACGACGGCAAGCCACTATTTACTGTAGATGAGAAGGAAGTTGTGGTTGGTACAGATAAACTTCGAGTAACTGGGCCTGAAGGGGCTCTTTTTGAACATTCAGTGGAGACACCCCTTGTCAGAGCCGACCCGTTTCAAGACCTTAGATTAGAATCCCCCACTCGGAGTCTAAGCATGGATGCCCCAAGGGGTGTGCATATTCAAGCTCACGCTGGGAAAATTGAGGCGCTTTCTCAAATGGATATTCTTTTTCATAGTAGTGATGGAATGCTTGTGCTTGATGCTGAAACTGTGTGCTTACCCAAGCTGGTGCAGGGGACGTGGGGTCCCTCTGGCAGCTCACAGAGCCTCTACGAAATCTGTGTGTGTCCAGATGGGAAGCTGTACCTGTCTGTGGCCGGTGTGAGCACCACGTGCCAGGAGCACAGCCACATCTGCCTCTGAGCTGCCTGCGTCCTCTCGGTGAGCTGTGCAGTGCCGGCCCCAGATCCTCACACCCAGGGAGCAGCTGCACATCGTGAAAGACTGAGGCAGCGTGGATGGGAAGTAAACGCTTCCAGAGGAACTCAGAAAAAATTATGTGCCAGTGAAAGTGTTTGGACAAAAACTACATGATCTCAAAATGCACGTGGATGTGAGACACAAAAGTTGACAAAATGGAAAAGCAATGTGTTTTTCCACTGGATTAATTTTCACCGGAACAATTGCGAATTCTCTCTGCCTCGCCTCCCCCTATCTTGTCCGTGTGGGCACACACTGAGTGTTGAGTTGCCGTGTGGAGTTAATGTATGACGCTCCACTGTGGATATCTAATGCCCTGTTGAGAGTAGCCTTGCTCAGTACTAAAATGCCCCAAAGTTCTATACAGCATTTCCTTTATAGCATTCAAACCTCACATCCTCCCTTCAGTTTAATGCAAGTAAGTCAGGTTTCACAAGAAAATTTTCAAGTTTTGAAGGGAATTTGAGGTTGATCTGGTTTTCAAGATGTAGTTAAAGGAATAAATCACTCAAAATTAAACTTTCTGTATATAGTCAATAAGCAATAAAAACCTCATTTTTCAGAGTTAAAAAA
衣壳基因的野生型AAV rh74核苷酸序列(SEQ ID NO: 3):
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgcgagtggtgggacctgaaacctggagccccgaaacccaaagccaaccagcaaaagcaggacaacggccggggtctggtgcttcctggctacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctccaagcgggtgacaatccgtacctgcggtataatcacgccgacgccgagtttcaggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgcgcagtcttccaggccaaaaagcgggttctcgaacctctgggcctggttgaatcgccggttaagacggctcctggaaagaagagaccggtagagccatcaccccagcgctctccagactcctctacgggcatcggcaagaaaggccagcagcccgcaaaaaagagactcaattttgggcagactggcgactcagagtcagtccccgaccctcaaccaatcggagaaccaccagcaggcccctctggtctgggatctggtacaatggctgcaggcggtggcgctccaatggcagacaataacgaaggcgccgacggagtgggtagttcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgcacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaagcaaatctccaacgggacctcgggaggaagcaccaacgacaacacctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggattccggcccaagaggctcaacttcaagctcttcaacatccaagtcaaggaggtcacgcagaatgaaggcaccaagaccatcgccaataaccttaccagcacgattcaggtctttacggactcggaataccagctcccgtacgtgctcggctcggcgcaccagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtcttcatgattcctcagtacgggtacctgactctgaacaatggcagtcaggctgtgggccggtcgtccttctactgcctggagtactttccttctcaaatgctgagaacgggcaacaactttgaattcagctacaacttcgaggacgtgcccttccacagcagctacgcgcacagccagagcctggaccggctgatgaaccctctcatcgaccagtacttgtactacctgtcccggactcaaagcacgggcggtactgcaggaactcagcagttgctattttctcaggccgggcctaacaacatgtcggctcaggccaagaactggctacccggtccctgctaccggcagcaacgcgtctccacgacactgtcgcagaacaacaacagcaactttgcctggacgggtgccaccaagtatcatctgaatggcagagactctctggtgaatcctggcgttgccatggctacccacaaggacgacgaagagcgattttttccatccagcggagtcttaatgtttgggaaacagggagctggaaaagacaacgtggactatagcagcgtgatgctaaccagcgaggaagaaataaagaccaccaacccagtggccacagaacagtacggcgtggtggccgataacctgcaacagcaaaacgccgctcctattgtaggggccgtcaatagtcaaggagccttacctggcatggtgtggcagaaccgggacgtgtacctgcagggtcccatctgggccaagattcctcatacggacggcaactttcatccctcgccgctgatgggaggctttggactgaagcatccgcctcctcagatcctgattaaaaacacacctgttcccgcggatcctccgaccaccttcaatcaggccaagctggcttctttcatcacgcagtacagtaccggccaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggagaacagcaaacgctggaacccagagattcagtacacttccaactactacaaatctacaaatgtggactttgctgtcaatactgagggtacttattccgagcctcgccccattggcacccgttacctcacccgtaatctgtaa
野生型AAV rh74氨基酸序列(SEQ ID NO: 4):
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经修饰的衣壳 – AA序列(SEQ ID NO: 5)
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序列表
<110> 国家儿童医院研究所
<120> 通过衣壳修饰增加组织特异性的基因递送
<130> 106887-7170
<140>
<141>
<150> 62/644,317
<151> 2018-03-16
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1661
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
gaaactcgtg agagcccttt ctccagggac agttgctgaa gcttcatcct ttgctctcat 60
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tgaatttagc tcttacaatt tggattctta aagtgatgtg gttttctcca gcaggaatgg 360
gccacttgtg tgtaacaaaa gatggactgc gcttggaagg ggaatcagaa tttttattcc 420
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gtcaataagc aataaaaacc tcatttttca gagttaaaaa a 1661
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 2
Tyr Ile Gly Ser Arg
1 5
<210> 3
<211> 2217
<212> DNA
<213> 腺相关病毒
<400> 3
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60
gagtggtggg acctgaaacc tggagccccg aaacccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120
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atgctaacca gcgaggaaga aataaagacc accaacccag tggccacaga acagtacggc 1740
gtggtggccg ataacctgca acagcaaaac gccgctccta ttgtaggggc cgtcaatagt 1800
caaggagcct tacctggcat ggtgtggcag aaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc 1860
tgggccaaga ttcctcatac ggacggcaac tttcatccct cgccgctgat gggaggcttt 1920
ggactgaagc atccgcctcc tcagatcctg attaaaaaca cacctgttcc cgcggatcct 1980
ccgaccacct tcaatcaggc caagctggct tctttcatca cgcagtacag taccggccag 2040
gtcagcgtgg agatcgagtg ggagctgcag aaggagaaca gcaaacgctg gaacccagag 2100
attcagtaca cttccaacta ctacaaatct acaaatgtgg actttgctgt caatactgag 2160
ggtacttatt ccgagcctcg ccccattggc acccgttacc tcacccgtaa tctgtaa 2217
<210> 4
<211> 738
<212> PRT
<213> 腺相关病毒
<400> 4
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145 150 155 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165 170 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro
180 185 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195 200 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210 215 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225 230 235 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245 250 255
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260 265 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275 280 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
290 295 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn
305 310 315 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325 330 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
340 345 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
355 360 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
370 375 380
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Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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565 570 575
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580 585 590
Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
595 600 605
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705 710 715 720
Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
725 730 735
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<210> 5
<211> 738
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 5
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
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Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
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Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
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225 230 235 240
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245 250 255
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485 490 495
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Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Tyr Ile
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Gly Ser Arg Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
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Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
725 730 735
Asn Leu

Claims (17)

1.一种经修饰的AAVrh74 VP1衣壳蛋白，其中在野生型AAVrh74氨基酸序列SEQ ID NO：4的502位氨基酸处为异亮氨酸取代天冬酰胺。
2.一种重组病毒颗粒，其包含如权利要求1所述的经修饰的AAVrh74 VP1衣壳蛋白。
3.根据权利要求2所述的重组病毒颗粒，其中所述重组病毒颗粒是经修饰的AAVrh74。
4.根据权利要求2-3的任一项所述的重组病毒颗粒，其进一步包含转基因或CRISPR系统。
5.一种多核苷酸，其编码如权利要求1所述的经修饰的AAVrh74 VP1衣壳蛋白和/或如权利要求2或3所述的重组病毒颗粒。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸被包含在载体中。
7.一种重组表达系统，其用于产生如权利要求3所述的重组病毒颗粒。
8.根据权利要求7所述的重组表达系统，其中所述重组表达系统包含如权利要求6所述的载体。
9.一种宿主细胞，其包含如权利要求5所述的多核苷酸或如权利要求6所述的载体。
10.一种用于修饰细胞中的多核苷酸和/或蛋白质的体外方法，其包含向所述细胞递送有效量的如权利要求2或4所述的重组病毒颗粒。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
13.重组病毒颗粒在制备用于修饰对象中的多核苷酸和/或蛋白质的药物中的应用，其中所述重组病毒颗粒包含权利要求2或4所述的病毒颗粒。
14.根据权利要求13所述的应用，其中所述对象是哺乳动物。
15.根据权利要求14所述的应用，其中所述哺乳动物是人。
16.根据权利要求13-15的任一项所述的应用，其中所述药物的施用是局部的或全身的。
17.一种试剂盒，其包含如权利要求2或4所述的重组病毒颗粒。
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