JP2023115149A - キャプシド改変による組織特異的遺伝子送達の増加 - Google Patents

Abstract

【課題】キャプシド改変による組織特異的遺伝子送達の増加の提供。【解決手段】改変されたキャプシドタンパク質、単離されたポリヌクレオチド、改変されたキャプシドタンパク質の調製のための方法、組換えウイルス粒子、改変されたウイルス粒子の生成のための組換え発現系、ならびに遺伝子編集および調節の方法が、本明細書で提供される。出願人は、ウイルスが循環するにつれて、肝細胞の感染を低減または排除することになる、筋細胞へのベクターの全身送達を増加させるためのアプローチを提唱する。出願人は、改変されたＡＡＶｒｈ７４キャプシドが、改変されていないＡＡＶｒｈ７４ベクターより効率的に筋肉の筋芽細胞およびサテライト細胞を標的化すると仮定する。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１８年３月１６日出願の米国仮特許出願第６２／６４４，３１７号（その内容は、本明細書に参考として援用される）の優先権を主張する。

政府支援に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＴＲ００１０６８の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
［０００２．１］
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されており、その全体において参考として援用される配列表を含む。上記ＡＳＣＩＩコピー（作成日：２０１９年２月２６日）は、名称１０６８８７－７１７０＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズ１８，４９２バイトである。

背景
遺伝子送達の改善のために、ＡＡＶキャプシドを改変する努力がなされてきた。例えば、ＷＯ ２０１７／１６５８５９Ａ１は、Ｃａｓ９をウイルスキャプシドタンパク質に融合または結合体化させてカスタマイズ可能な遺伝子編集を促進する、ウイルスキャプシド改変を記載する。さらなる参考文献は、ＤＮＡファミリーシャフリングの使用（Ｇｒｉｍｍ ａｎｄ Ｋａｙ）、ＡＡＶｒｈ７４に対するリジン置換（ＵＳ ２０１５／００６５５６）、ＡＡＶｒｈ７４の１９５位、１９９位、２０１位、または２０２位での変異（ＵＳ ９，８４０，７１９）、およびＡＡＶｒｈ４８に対する改変（ＥＰ ２３５９８６６）を記載している。なおさらなる参考文献は、ＡＡＶ表面にディスプレイされているランダムペプチドライブラリー（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ （２００３） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， Ｐｅｒａｂｏ （２００３） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．， および７，５８８，７２２（Ｇｒｉｍｍ ａｎｄ Ｋａｙ））を詳述する。

筋ジストロフィーの遺伝子治療処置は、身体全体の筋細胞への遺伝子の全身送達を要する。最も効率的な送達選択肢は、その身体の循環系を使用して、そのウイルスを末梢筋細胞へと分布させることである。全身送達の課題は、ＡＡＶの大部分の血清型が、肝細胞に感染する自然の傾向があることである［１］。身体には、筋細胞よりおよそ２０倍多くの肝細胞が存在し、そのウイルスは、全身送達の間に肝臓を横切らなければならない［２］。ＡＡＶベクターのうちの５０％超が、全身性の静脈内注射後に、肝臓に捕捉されたままであると予測される。
現在、全身性に注射されるウイルスのうちの５０％超が、肝臓において喪失し、肝臓では、治療効果は通常はほとんど実現されない［４］。肝臓へのベクター送達の標的化を解除し、そして筋特異的結合および形質導入を増加させることによって、筋特異的遺伝子発現および患者に対する治療利益を有意に改善し得、それと同時に、潜在的副作用を低減し得る。現在、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置の臨床試験は、筋において治療レベルの遺伝子発現を達成しようと試みるために、高レベルのベクター（＞５Ｅ＋１２ ベクターゲノム／ｋｇ）の送達を要する。筋特異的プロモーターは、「オフターゲット」遺伝子発現を低減するために使用されるが、遺伝子発現の全体的レベルを増加させることに対しては何の効果もない。筋特異的形質導入の効率を増加させることによって、治療利益を達成するために必要とされる全体的な用量を、有意に低減し得る。
本開示は、先行技術の制限に対処し、関連する利点も提供する。

米国特許出願公開第２０１５／００６５５６号明細書 米国特許第９，８４０，７１９号明細書 欧州特許出願公開第２３５９８６６号明細書

Ｍｕｌｌｅｒ （２００３） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｅｒａｂｏ （２００３） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．

要旨
出願人は、ウイルスが循環するにつれて、肝細胞の感染を低減または排除することになる、筋細胞へのベクターの全身送達を増加させるためのアプローチを提唱する。出願人は、改変されたＡＡＶｒｈ７４キャプシドが、改変されていないＡＡＶｒｈ７４ベクターより効率的に筋肉の筋芽細胞およびサテライト細胞を標的化すると仮定する。

本開示は、アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変されるウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる、改変されたウイルスキャプシドタンパク質に関する。出願人は、３種の変異体を生成した。その変異体のうちの１つ（ＡＡＶｍｕｔ４、ＶＰ１キャプシドのアミノ酸５０２においてアスパラギンからイソロイシンへ）は、遺伝子送達を、全ての試験した組織へと全体的に、５６倍（組織に依存して、３倍～５６倍の間で増加させる）高い形質導入効率まで増加させる。別の変異体（ＡＡＶｍｕｔ５， ＶＰ１キャプシドのアミノ酸５０５においてトリプトファンからアルギニンへ）は、心臓への遺伝子送達を、ＡＡＶｒｈ７４と比較してほぼ５０倍増加させる。第３の変異体（ＡＡＶＹＩＧまたはＡＡＶＹＩＧＳＲ５９１）は、筋幹細胞と考えられるサテライト細胞上で主に見出されるレセプターを標的化するが、そのサテライト細胞向性は、未だにＩＨＣ染色によって確認されなければならない。顕著なことには、ＡＡＶＹＩＧまたはＡＡＶＹＩＧＳＲ ５９１をデザインするためのＡＡＶ結晶構造およびα７β１インテグリンの出願人の知見に基づいて、ＡＡＶＹＩＧまたはＡＡＶＹＩＧＳＲ ５９１は、骨格筋に対してより高い親和性を、および肝臓に対してより低い親和性を有すると考えられる。

理論によって拘束されないが、出願人は、標的組織（例えば、心臓または筋）に達する有効用量を、その患者への全体的な用量を増加させることなく増加させることによって、患者に対する治療利益を達成する方法を提供する。治療利益を達成するために必要とされる全体的用量を低減することによって、より少ないウイルス抗原が、その患者に送達され、理想的には、そのベクターに対する低減した免疫応答および増加した安全性を生じる。後期臨床試験を行うために十分な遺伝子治療薬物製品を製造することは、さらなる開発における大きなハードルである。治療利益を達成する用量要件を低減することで、製造要件の低減、製造コストの低減、より迅速な臨床試験開発およびより多くの患者を処置するより高い能力がもたらされる。

よって、本開示は、改変されたキャプシドタンパク質、単離されたポリヌクレオチド、改変されたキャプシドタンパク質の調製のための方法、組換えウイルス粒子および改変されたウイルス粒子の生成のための組換え発現系に関する。本開示の一局面は、アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変されるウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる、改変されたウイルスキャプシドタンパク質に関する。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じて、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。さらなる実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位においてアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。いくつかの実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５においてトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。いくつかの実施形態において、上記改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。いくつかの実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ）（配列番号２）の挿入またはその等価物である。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有する、および／または正常なｒｈ７４レセプター結合を変化させる可能性のある領域に配置される。

アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変される、改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる、改変されたウイルスキャプシドタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドがまた、本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じてＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。さらなる実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。いくつかの実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。いくつかの実施形態において、上記改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。いくつかの実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（配列番号２）の挿入またはその等価物である。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有する、および／または正常なｒｈ７４レセプター結合を変化させる可能性のある領域に配置される。

アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変される、改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる、改変されたキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる組換えウイルス粒子が、本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じてＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。さらなる実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。いくつかの実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。いくつかの実施形態において、上記改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。いくつかの実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（配列番号２）の挿入である。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有する、および／または正常なｒｈ７４レセプター結合を変化させる可能性のある領域に配置される。特定の局面において、上記組換えウイルス粒子は、ウイルス粒子１個あたり（および／または改変されたウイルスキャプシド１個あたり）５またはこれより多くの改変されたキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になる。

他の局面において、上記組換えウイルス粒子は、ウイルス粒子１個あたり（および／または改変されたウイルスキャプシド１個あたり）１～５個の間の改変されたキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になる。さらなる局面は、本明細書で開示されるアミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変される、ウイルスキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを企図する。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じてＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。さらなる実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。いくつかの実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。いくつかの実施形態において、上記改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。いくつかの実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（配列番号２）の挿入である。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有する、および／または正常なｒｈ７４レセプター結合を変化させる可能性のある領域に配置される。

遺伝子改変のために、導入遺伝子またはＣＲＩＳＰＲシステムを必要に応じて含む、本明細書で開示されるとおりの改変されたキャプシドがまた、提供される。上記改変されたキャプシドをコードするポリヌクレオチドおよび上記ポリヌクレオチドをコードするベクター、ならびにこれらの各々の相補物および等価物が、さらに提供される。なおさらなる局面は、上記ウイルス粒子を生成するおよび／または本明細書で開示されるベクターを含む宿主細胞に関する。なおさらなる局面は、本明細書で開示されるウイルス粒子の生成のための発現系に関する。

本開示はまた、キャリア、および改変されたキャプシド、ポリヌクレオチド、ベクター、プラスミド、宿主細胞、または発現系のうちの１またはこれより多くを含む組成物を提供する。改変されたキャプシドタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、プラスミド、宿主細胞、または発現系のうちの１またはこれより多く、および使用のための指示を含むキットが、さらに提供される。

必要性のある被験体において標的疾患または機能不全組織を処置する方法であって、上記被験体に、アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる、改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる、有効量の組換えウイルス粒子を投与することを包含するか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる方法が、本明細書でさらに開示される。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じてＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。さらなる実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。さらなる実施形態において、このウイルス粒子は、ＡＡＶｒｈ７４と比較して、上記疾患または機能不全組織に関して約３～５６倍の間で処置送達の有効性を増加させる。いくつかの実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。さらなる実施形態において、上記疾患または機能不全組織は、心臓組織である。^＊＊なおさらなる実施形態において、このウイルス粒子は、ＡＡＶｒｈ７４と比較して、心臓組織に対して約５０倍またはこれより高く処置送達の有効性を増加させる。いくつかの実施形態において、上記改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。いくつかの実施形態において、上記改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（配列番号２）の挿入である。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有する、および／または正常なｒｈ７４レセプター結合を変化させる可能性のある領域に配置される。いくつかの実施形態において、上記ウイルス粒子は、上記疾患または機能不全組織に適した処置の有効量を含む。いくつかの実施形態において、上記処置は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用すること、アミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換、およびＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（配列番号２）の挿入、またはそれら各々の等価物の群から選択される１またはこれより多くの改変を含む、改変されたＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１キャプシドタンパク質。
(項目２)
項目１に記載の改変されたＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１を含む組換えウイルス粒子。
(項目３)
前記組換えウイルス粒子は、改変されたＡＡＶｒｈ７４である、項目２に記載の組換えウイルス粒子。
(項目４)
導入遺伝子またはＣＲＩＳＰＲシステムをさらに含む、項目１～３のいずれかに記載の組換えウイルス粒子。
(項目５)
必要に応じて、ベクター内に含まれる、項目１に記載の改変されたＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１をコードするポリヌクレオチドおよび／または項目２もしくは３に記載の組換えウイルス粒子。
(項目６)
必要に応じて項目５に記載のベクターを含む、項目３に記載の組換えウイルス粒子を生成するための組換え発現系。
(項目７)
項目５に記載のポリヌクレオチドまたはベクターを含む、宿主細胞。
(項目８)
細胞においてポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質を改変するための方法であって、前記方法は、前記細胞に、有効量の、項目１もしくは４に記載の改変されたキャプシドタンパク質を含む組換えウイルス粒子、または項目２に記載のウイルス粒子を送達することを包含する方法。
(項目９)
前記細胞は、哺乳動物細胞である、項目８に記載の方法。
(項目１０)
前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、項目９に記載の方法。
(項目１１)
被験体においてポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質を改変するための方法であって、前記方法は、前記被験体に、有効量の、項目１もしくは４に記載の改変されたキャプシドタンパク質を含む組換えウイルス粒子、または項目２に記載のウイルス粒子を投与することを包含する方法。
(項目１２)
前記被験体は、哺乳動物である、項目１１に記載の方法。
(項目１３)
前記哺乳動物はヒトである、項目１２に記載の方法。
(項目１４)
前記投与は、局所または全身である、項目１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１５)
項目１もしくは４に記載の改変されたキャプシドタンパク質を含む組換えウイルス粒子、または項目２に記載のウイルス粒子を含むキット。

図１Ａ～１Ｅは、アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）キャプシドライブラリーの構造解析を示す。（ａ）テンプレートとして働くＡＡＶ８の結晶構造（ｐｄｂ ｉｄ： ２ＱＡ０）とともにＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬを使用して得たＡＡＶ９ ＶＰ３サブユニットモノマーのリボン表現。アミノ酸３９０～６２７（ＶＰ１番号付け）を含むＧＨループは、グレーで色づけされる。（ｂ）ＶＩＰＥＲｄｂでＴ＝１ 正二十面体対称座標を使用して生成される６０個のＶＰ３サブユニットを有するＡＡＶ９キャプシドモデルの表面レンダリング。その正二十面体の五回対称軸にある細孔（ｆｉｖｅｆｏｌｄ ｐｏｒｅ）を取り囲み、その三回対称軸で互いに組まれている異なるＶＰ３サブユニットに由来するＧＨループ領域は、グレーで強調される。（ｃ）グレーの球によって示されるＡＡＶ９ライブラリーに由来する４３個の代表的クローンの点変異を有するＶＩＰＥＲｄｂで生成されるＡＡＶ９ ＶＰ３サブユニットトリマーのリボン。（ｄ）その外側のループ上でクラスター化した点変異（グレーの球）の大部分を示すキャプシドトリマー（９０°回転）の側面図。（ｅ）そのキャプシドトリマー領域内の表面残基の球面ロードマップ投影図。赤色で強調した残基は、そのキャプシド表面に突出して位置した変化した残基を含む１０のＡＡＶ９改変体の部分セットを表す。図は、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．［７］から再掲。

図２は、筋幹細胞の単離のためのＦＡＣＳソート可能なマーカーを示す。図は、Ｗａｎｇ ｅｔ．ａｌ．［１３］から再掲。

図３は、ＡＡＶｒｈ７４変異ベクター生体内分布を示す。ＣＤ－１雄性マウスを、ＡＡＶｒｈ７４またはＡＡＶｒｈ７４キャプシド／ｌｕｃＥＹＦＰレポーターウイルスの２種の変異体の１Ｅ＋１１ Ｖｇを静脈内注射し、３週間後に、組織を採取し、ｑＰＣＲによってベクターゲノムコピーに関してアッセイした。

図４は、ＡＡＶｍｕｔ４およびｍｕｔ５ルミネッセンスの生きている動物のイメージングを示す。成体ＣＤ－１マウスに、同じルシフェラーゼベクターを含むＡＡＶｒｈ７４またはＡＡＶｍｕｔ４ウイルスのいずれかの１Ｅ＋１１ Ｖｇを、尾静脈を介して注射した。マウスを、ルシフェラーゼ発現に関して注射の３週間後にイメージングした。２回の別個の実験を、同じ条件下で行った。実験１，ＡおよびＢにおいて同じ動物。頭部の光子定量Ａ、または脚の光子定量Ｂのいずれか。実験２は、別個の動物で４週間後に行った、実験１の反復である。各群４匹のうちの最も左の動物に、ＡＡＶｒｈ７４コントロールウイルスを注射し、次に、各群のうちの３匹の動物に、ＡＡＶｍｕｔ４ウイルスを注射する。

図５は、ＡＡＶＹＩＧまたはＡＡＶＹＩＧＳＲ５９１ルミネッセンスの生きている動物のイメージングを示す。成体ＣＤ－１マウスに、そのルシフェラーゼベクターを含むＡＡＶＹＩＧまたはＡＡＶＹＩＧＳＲ５９１ウイルスの１Ｅ＋１１ Ｖｇを、尾静脈を介して注射した。マウスをルシフェラーゼ発現に関して注射の３週間後にイメージングし、全身光子計数を腹臥位または仰臥位のいずれかで各マウスの上に示した。

詳細な説明
本開示に従う実施形態は、本明細書中以降、より詳細に記載される。しかし、本開示の局面は、異なる形態で具現化され得、本明細書で示される実施形態に限定されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完全で完璧であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。本明細書中の記載において使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、限定されることは意図されない。

別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語（例えば、一般に使用される辞書の中で定義されるもの）は、本出願および関連分野の状況においてそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書で明示的にそのように定義されなければ、理想的なまたは過度に形式的な意味において解釈されるべきではないことは、さらに理解される。以下では明示的に定義されないが、このような用語は、それらの一般的意味に従って解釈されるべきである。

本明細書中の記載において使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、本発明の限定であることは意図されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。

本技術の実施は、別段示されなければ、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来の技術を使用し、これらの技術は、当該分野の技術範囲内である。

状況が別段示さなければ、本明細書に記載される発明の種々の特徴は、任意の組み合わせにおいて使用され得ることは、具体的に意図される。さらに、本開示はまた、いくつかの実施形態において、本明細書に示される任意の特徴または特徴の組み合わせが、除外され得るかまたは省略され得ることを企図する。例証するために、複合体が構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むことを本明細書が述べる場合、Ａ、ＢまたはＣのうちのいずれか、またはこれらの組み合わせが、単独でもまたは任意の組み合わせにおいても省略および放棄され得ることは、具体的に意図される。

別段明示的に示されなければ、全ての特定される実施形態、特徴、および用語は、記載される実施形態、特徴、または用語およびその生物学的等価物の両方を含むことを意図する。

全ての数値表記、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量（範囲を含む）は、概算値であり、その概算値は、適切な場合、１．０または０．１の増分で（＋）または（－）、または代わりに±１５％、もしくは代わりに１０％、もしくは代わりに５％、もしくは代わりに２％の変動で、変わる。常に明示的に述べられるわけではないが、全ての数値表記に用語「約（ａｂｏｕｔ）」が前に置かれていることは、理解されるべきである。常に明示的に述べられるわけではないが、本明細書で記載される試薬が例示に過ぎず、そのようなものの等価物が当該分野で公知であることもまた、理解されるべきである。

本開示全体を通じて、種々の刊行物、特許および公開された特許明細書は、特定する引用によって、またはアラビア数字によって参照される。アラビア数字によって特定される刊行物の完全な引用は、特許請求の範囲の直前に見出される。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示は、本発明が関連する分野の技術水準をより十分に記載するために、それらの全体において本開示に参考として援用される。

定義
本技術の実施は、別段示されなければ、有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来の技術を使用し、これらの技術は、当該分野の技術範囲内である。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（１９８９）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．編，（１９８７））；シリーズ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）： ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，編（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， 編（１９８７））。

本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、状況が別段明らかに示さなければ、複数形も含むことが意図される。

本明細書で使用される場合、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、組成物および方法がその記載される要素を含むが、他を排除しないことを意味することが意図される。本明細書で使用される場合、移行句、から本質的になる（および文法上の異形）は、その記載される物質またはステップ、およびその記載される実施形態の基本的および新規な特性に本質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されるべきである。従って、用語「から本質的になる」は、本明細書で使用される場合、「含む、包含する」に等価と解釈されるべきではない。「からなる」は、他の成分の微量要素を超えるものを排除することおよび本明細書で開示される組成物を投与するための実質的方法ステップを意味するものとする。これら移行の用語の各々によって定義される局面は、本開示の範囲内である。

本明細書で使用される場合の用語「約」は、量または濃度などのような測定可能な値に言及する場合、その特定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動を包含することが意味される。

本明細書で開示される任意の構成要素、範囲、用量形態などの選択を記載するために使用される場合の用語または「受容可能な」、「有効な、効果的な（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または「十分な」は、上記構成要素、範囲、用量形態などが、その開示される目的のために適していることを意図する。

また、本明細書で使用される場合、「および／または」とは、その関連して列挙される項目のうちの１またはこれより多くの任意のおよび全ての可能な組み合わせ、ならびに代替手段（「または」）において解釈される場合に、組み合わせの欠如に言及および包含する。

用語「細胞」とは、本明細書で使用される場合、原核生物または真核生物の細胞のいずれか（必要に応じて、被験体または市販の供給源から得られる）に言及し得る。

「真核生物細胞」とは、モネラ界を除く生命界の全てを包含する。それらは、膜結合した核を通じて容易に区別され得る。動物、植物、真菌、および原生生物は、その細胞が内膜および細胞骨格によって複雑な構造へと組織化されている真核生物または生物である。最も特徴的な膜結合した構造は、核である。具体的に記載されなければ、用語「宿主」とは、真核生物宿主（例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞が挙げられる）を含む。真核生物細胞または宿主の非限定的な例としては、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、鳥類、爬虫類およびヒト（例えば、ＨＥＫ２９３細胞および２９３Ｔ細胞）が挙げられる。

「原核生物細胞」とは、核または任意の他の膜結合したオルガネラを通常は欠いており、２つの領域、細菌および古細菌へと分けられる。染色体ＤＮＡに加えて、これらの細胞はまた、エピソームといわれる環状ループの中に遺伝情報を含み得る。細菌細胞は、非常に小さく、およそ動物のミトコンドリアのサイズである（直径約１～２μｍおよび長さ１０μｍ）。原核生物細胞は、３つの主要な形状を特徴とする：杆状、球状、およびらせん状。真核生物のような精巧な複製プロセスを経る代わりに、細菌細胞は、２分裂によって分裂する。例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細菌、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌が挙げられるが、これらに限定されない。

用語「コードする」とは、核酸配列に適用される場合、ポリペプチドを「コードする」といわれるポリヌクレオチドであって、その天然の状態において、または当業者に周知の方法によって操作される場合に、そのポリペプチドおよび／またはそのフラグメントのｍＲＮＡを生成するために転写および／または翻訳され得るものに言及する。そのアンチセンス鎖は、このような核酸の相補体であり、そのコードする配列は、そこから推測され得る。

用語「等価な」または「生物学的等価物」は、特定の分子、生物学的物質または細胞物質に言及する場合に交換可能に使用され、望ましい構造または機能性をなお維持しながら、最小の相同性を有するものを意図する。等価なポリペプチドの非限定的な例としては、それに対してまたはポリペプチド配列に対して少なくとも６０％、または代わりに少なくとも６５％、または代わりに少なくとも７０％、または代わりに少なくとも７５％、または代わりに８０％、または代わりに少なくとも８５％、または代わりに少なくとも９０％、または代わりに少なくとも９５％ 同一性を有するポリペプチド、あるいはこのようなポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその相補体によってコードされるポリペプチドが挙げられる。高ストリンジェンシーの条件は、本明細書で記載され、参考として援用される。あるいは、その等価物は、その参照ポリヌクレオチド、例えば、その野生型ポリヌクレオチドと少なくとも７０％、または代わりに少なくとも７５％、または代わりに８０％、または代わりに少なくとも８５％、または代わりに少なくとも９０％、または代わりに少なくとも９５％ 同一性、または少なくとも９７％配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはその相補体によってコードされるポリペプチドである。

等価なポリペプチドの非限定的な例としては、参照ポリヌクレオチドと少なくとも６０％、または代わりに少なくとも６５％、または代わりに少なくとも７０％、または代わりに少なくとも７５％、または代わりに８０％、または代わりに少なくとも８５％、または代わりに少なくとも９０％、または代わりに少なくとも９５％、または代わりに少なくとも９７％ 同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。等価物はまた、参照ポリヌクレオチドと高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその相補体を意図する。

別の配列との「配列同一性」の特定のパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）は、整列させた場合、塩基（またはアミノ酸）のそのパーセンテージが、その２つの配列を比較することにおいて同じであることが意味される。そのアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編 １９８７） Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０， 第７．７．１８節、表７．７．１に記載されるものを使用して決定され得る。ある種の実施形態において、デフォルトパラメーターは、アラインメントのために使用される。非限定的な例示的アラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用する、ＢＬＡＳＴである。特に、例示的プログラムとしては、以下のデフォルトパラメーターを使用する、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰが挙げられる： 遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；ソート＝ハイスコア；データベース＝非重複，
ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る： ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。配列同一性およびパーセント同一性は、それらをｃｌｕｓｔａｌＷ（以下のウェブアドレスで入手可能：ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／， 最終アクセス日：２０１７年１月１３日）に組み込むことによって決定され得る。

「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間での、または２つの核酸分子間での配列類似性に言及する。相同性は、比較目的で整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定され得る。その比較される配列における位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占有される場合、その分子は、その位置で相同である。配列間の相同性の程度は、その配列によって共有されるマッチするまたは相同な位置の数の関数である。「関連しない」または「非相同な」配列は、４０％未満の同一性、または代わりに２５％未満の同一性を、本開示の配列のうちの１つと共有する。

「相同性」または「同一性」または「類似性」はまた、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸分子に言及し得る。

「ハイブリダイゼーション」とは、１またはこれより多くのポリヌクレオチドが反応して、そのヌクレオチド残基の塩基間で水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応に言及する。その水素結合は、ワトソン－クリック塩基対合、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的様式で起こり得る。その複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本またはこれより多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のような、より広範なプロセスにおけるステップを構成し得る。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、以下が挙げられる： 約２５℃～約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％～約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣの洗浄溶液。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、以下が挙げられる：約４０℃～約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％～約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの洗浄溶液。高ストリンジェンシー条件の例としては、以下が挙げられる：約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％～約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液。概して、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、５分間～２４時間であり、１回、２回、またはこれより多くの洗浄ステップ、および洗浄インキュベーション時間は、約１分間、２分間、または１５分間である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸塩緩衝液である。他の緩衝液システムを使用するＳＳＣの等価物が使用され得ることは、理解される。

本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドをｍＲＮＡへと転写するプロセスおよび／またはその転写したｍＲＮＡをその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳するプロセスに言及する。そのポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核生物細胞においてそのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

用語「単離された」とは、本明細書で使用される場合、他の物質を実質的に含まない分子、または生物製剤または細胞物質に言及する。

本明細書で使用される場合、用語「機能的」は、任意の分子、生物学的物質、または細胞物質を改変して、それが特有の、特定された効果を達成することを意図するために使用され得る。

本明細書で使用される場合、用語「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）のポリマー形態をいうために、交換可能に使用される。従って、この用語は、１本鎖、２本鎖、もしくは多重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基、または他の天然の、化学的にもしくは生化学的に改変された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。

用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、アミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣物の２またはこれより多くのサブユニットの化合物に言及するために、交換可能に、およびそれらの最も広い意味において使用される。そのサブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の局面において、そのサブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結され得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限は置かない。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」とは、グリシン、ならびにＤおよびＬ両方の光学異性体、アミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含め、天然および／または非天然のまたは合成のアミノ酸のいずれかに言及する。

本明細書で使用される場合、用語「組換え発現系」とは、組換えによって形成されるある種の遺伝物質の発現のための遺伝的構築物に言及する。

「遺伝子送達ビヒクル」は、宿主細胞に挿入されたポリヌクレオチドを運び得る任意の分子として定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、当該分野で代表的に使用される、リポソーム、ミセル、生体適合性ポリマー（天然のポリマーおよび合成のポリマーを含む）；リポタンパク質；ポリペプチド；ポリサッカリド；リポポリサッカリド；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；ならびに細菌、またはウイルス（例えば、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス）、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターおよび他の組換えビヒクルであり、これらは、種々の真核生物および原核生物宿主における発現に関して記載されており、遺伝子治療のために、および単純なタンパク質発現のために使用され得る。

本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して、細胞または組織へと送達され得る。「遺伝子送達」、「遺伝子移入」、「形質導入すること（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）」などは、本明細書で使用される場合、導入に使用される方法に関係なく、外因性ポリヌクレオチド（ときおり「導入遺伝子」といわれる）を宿主細胞に導入することに言及する用語である。このような方法としては、種々の周知の技術（例えば、ベクター媒介性遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または種々の他のタンパク質ベースのもしくは脂質ベースの遺伝子送達複合体による）、ならびに「裸の（ｎａｋｅｄ）」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技術（例えば、エレクトロポレーション、「遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）」送達およびポリヌクレオチドの導入に使用される種々の他の技術）が挙げられる。その導入されたポリヌクレオチドは、その宿主細胞の中で安定してまたは一過性に維持され得る。安定な維持は、代表的には、その導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性の複製起点を含むか、あるいは宿主細胞のレプリコン（例えば、染色体外レプリコン（例えば、プラスミド））または核もしくはミトコンドリア染色体へと組み込むことを要するかのいずれかである。多くのベクターは、当該分野で公知でありかつ本明細書で記載されるように、哺乳動物細胞への遺伝子の移入を媒介し得ることが公知である。

「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製し得る、染色体ＤＮＡとは分離した染色体外ＤＮＡ分子である。多くの場合、それは、環状および２本鎖である。プラスミドは、微生物の集団内での遺伝子の水平伝播の機構を提供し、代表的には、所定の環境状態下で選択的利点を提供する。プラスミドは、競合する環境的ニッチにおいて天然に存在する抗生物質に耐性を提供する遺伝子を有し得るか、または代わりにその生成されるタンパク質は、類似の環境下で毒素として作用し得る。

遺伝子操作において使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」といわれる。多くのプラスミドは、このような使用のために市販されている。複製されるべき遺伝子は、細胞を特定の抗生物質に対して耐性にする遺伝子、およびマルチクローニング部位（ＭＣＳ、またはポリリンカー）（この部位は、この位置においてＤＮＡフラグメントの容易な挿入を可能にするいくつかの一般に使用される制限部位を含む短い領域である）を含むプラスミドのコピーの中に挿入される。プラスミドの別の主要な使用は、多量のタンパク質を作製することである。この場合、研究者らは、目的の遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を成長させる。単にその細菌はタンパク質を生成して、その抗生物質耐性を付与するので、それはまた、その挿入された遺伝子から多量のタンパク質を生成するように誘導され得る。

「酵母人工染色体」または「ＹＡＣ」とは、大きなＤＮＡフラグメント（１００ｋｂより大きく、３０００ｋｂまで）をクローニングするために使用されるベクターに言及する。それは、人工的に構築された染色体であり、酵母細胞での複製および保存のために必要とされるテロメア、セントロメア、および複製起点配列を含む。最初の環状プラスミドを使用して構築すると、それらは、制限酵素を使用することによって直線状にされ、次いで、ＤＮＡリガーゼは、付着末端の使用によってその直線状分子内で目的の配列または遺伝子を付加し得る。酵母発現ベクター（例えば、ＹＡＣ、ＹＩｐ（酵母組み込みプラスミド）、およびＹＥｐ（酵母エピソームプラスミド））は、酵母がそれ自体真核生物細胞であることから、翻訳後修飾を伴う真核生物タンパク質生成物を得ることができるので極めて有用であるが、ＹＡＣは、キメラ効果を生じてＢＡＣより不安定であることが見出されている。

「ウイルスベクター」は、宿主細胞へと、インビボ、エキソビボまたはインビトロのいずれかで送達されるべきポリヌクレオチドを含む組換え生成ウイルスまたはウイルス粒子として定義される。

ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが挙げられる。感染性のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベースのベクターは、タンパク質を製造するために使用され得、タバコ葉においてグリフィスシン（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓｉｎ）を発現することが報告されている（Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０６（１５）：６０９９－６１０４）。アルファウイルスベクター（例えば、セムリキ森林ウイルスベースのベクターおよびシンドビスウイルスベースのベクター）はまた、遺伝子治療および免疫療法における使用のために開発されている。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ ＆ Ｄｕｂｅｎｓｋｙ （１９９９） Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５：４３４－４３９およびＹｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５（７）：８２３－８２７を参照のこと。遺伝子移入がレトロウイルスベクターによって媒介される局面において、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノムまたはその一部、および治療用遺伝子を含むポリヌクレオチドに言及する。遺伝子移入における使用のためのベクターの最新の方法に関するさらなる詳細は、例えば、Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｕｔｌｏｏｋ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １７に見出され得る。

本明細書で使用される場合、「レトロウイルス媒介性遺伝子移入」または「レトロウイルス形質導入」は、同じ意味を有し、そのウイルスが細胞に入り、そのゲノムを宿主ゲノムへと組み込むことから、遺伝子または核酸配列が、宿主細胞へと安定して移入されるプロセスに言及する。そのウイルスは、その通常の感染機構を介して宿主細胞へと入り得るか、または異なる宿主細胞表面レセプターもしくはリガンドに結合して、その細胞に入るように改変され得る。本明細書で使用される場合、レトロウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス様侵入機構を通じて、外因性核酸を細胞へと導入し得るウイルス粒子に言及する。

レトロウイルスは、ＲＮＡの形態でそれらの遺伝情報を運ぶ；しかし、そのウイルスがいったん細胞に感染すると、そのＲＮＡは、ＤＮＡ形態へと逆転写され、それは、その感染した細胞のゲノムＤＮＡへと組み込まれる。その組み込まれたＤＮＡ形態は、プロウイルスといわれる。

遺伝子移入がＤＮＡウイルスベクター（例えば、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））によって媒介される局面において、ベクター構築物は、そのウイルスゲノムまたはその一部、および導入遺伝子を含むポリヌクレオチドに言及する。アデノウイルス（Ａｄ）は、比較的十分に特徴付けられ、５０を超える血清型を含む、均質なウイルス群である。Ａｄは、宿主ゲノムへの組み込みを要しない。組換えＡｄ由来のベクター、特に、野生型ウイルスの組換えおよび生成の潜在性を低減するものはまた、構築されている。このようなベクターは、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ
Ｖｉｅｗ， ＣＡ）、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ）、およびＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｇｅｎｅ（Ｓｈｉｒｌｅｙ， ＮＹ）のような供給元から市販されている。野生型ＡＡＶは、高い感染性および宿主細胞のゲノムへの組み込みの特異性を有する。Ｗｏｌｄ ａｎｄ Ｔｏｔｈ （２０１３） Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｒ． １３（６）：４２１－４３３， Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６４６６－６４７０、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９８８－３９９６を参照のこと。

プロモーター、およびポリヌクレオチドが作動可能に連結され得るクローニング部位の両方を含むベクターは、当該分で周知である。このようなベクターは、ＲＮＡをインビトロまたはインビボで転写し得、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）のような供給元から市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、そのクローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変化させて、余分な潜在的に不適切な代替の翻訳開始コドンまたは転写もしくは翻訳いずれかのレベルで、発現に干渉し得るかまたは発現を低減し得る他の配列を排除することは、必要であり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位は、発現を増強するために開始コドンのすぐ５’側に挿入され得る。

遺伝子送達ビヒクルはまた、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセルおよび標的ウイルスタンパク質－ＤＮＡ複合体を含む。標的化抗体またはそのフラグメントをも含むリポソームは、本明細書で開示される方法において使用され得る。細胞または細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、その細胞または細胞集団への本明細書で記載されるタンパク質の直接導入は、タンパク質トランスフェクションの非限定的な技術によって行われ得、あるいは、発現を増強し得るおよび／または本明細書で開示されるタンパク質の活性を促進し得る培養条件は、他の非限定的な技術である。

本明細書で使用される場合、用語「ウイルスキャプシド」または「キャプシド」とは、ウイルス粒子のタンパク質の殻またはコートに言及する。キャプシドは、ウイルスゲノムをキャプシドで囲む（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅ）、保護する、輸送する、および宿主細胞へと放出するように機能する。キャプシドは概して、タンパク質（「キャプシドタンパク質」）のオリゴマー構造サブユニットから構成される。本明細書で使用される場合、用語「キャプシドで囲まれた（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅｄ）」とは、ウイルスキャプシド内に囲まれることを意味する。

本明細書で使用される場合、ウイルスまたはプラスミドへの言及における用語「ヘルパー」とは、ウイルス粒子または組換えウイルス粒子（例えば、本明細書で開示される改変されたＡＡＶ）の複製およびパッケージングに必要なさらなる構成要素を提供するために使用されるウイルスまたはプラスミドに言及する。ヘルパーウイルスによってコードされる構成要素は、ビリオンアセンブリ、キャプシド内の囲い込み（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）、ゲノム複製、および／またはパッケージングに必要とされる任意の遺伝子を含み得る。例えば、そのヘルパーウイルスは、そのウイルスゲノムの複製のための必要な酵素をコードし得る。ＡＡＶ構築物とともに使用するために適したヘルパーウイルスおよびプラスミドの非限定的な例としては、ｐＨＥＬＰ（プラスミド）、アデノウイルス（ウイルス）、またはヘルペスウイルス（ウイルス）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「ＡＡＶ」とは、アデノ随伴ウイルスの標準的略称である。アデノ随伴ウイルスは、ある種の機能が、ヘルパーウイルスと共感染することによって提供される細胞においてのみ成長する１本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶの一般的情報および総説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ， １９８９， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ， Ｖｏｌ． １， ｐｐ． １６９－ ２２８、およびＢｅｒｎｓ， １９９０， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ｐｐ． １７４３－１７６４， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）において見出され得る。これらの総説に記載される同じ原理が、その総説の刊行日後に特徴づけられたさらなるＡＡＶ血清型に適用可能であることは、十分に予測される。なぜなら種々の血清型が、構造的にも機能的にも、遺伝的レベルですら極めて密接に関連することが、周知であるからである（例えば、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｊ． Ｒ． Ｐａｔｔｉｓｏｎ編のＢｌａｃｋｌｏｗｅ， １９８８， ｐｐ． １６５－１７４；およびＲｏｓｅ， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３： １－６１ （１９７４）を参照のこと）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同性のｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似の複製特性を明らかに示す；そして全て、３種の関連するキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２において発現されるもの）を有する。関連性の程度は、ヘテロ二重鎖分析によってさらに示唆される。この分析は、そのゲノムの長さに沿って血清型間での広範な交差ハイブリダイゼーション；および「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に相当する、末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにする。類似の感染性パターンはまた、各血清タイプにおける複製機能が、類似の調節制御下にあることを示唆する。

「ＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれた目的の１またはこれより多くのポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクターに言及する。このようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子生成物をコードし、発現するベクターとともにトランスフェクトされた宿主細胞に存在する場合、複製され得、感染性ウイルス粒子へとパッケージされ得る。

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１個のＡＡＶキャプシドタンパク質およびキャプシドで囲まれたポリヌクレオチドＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子に言及する。その粒子が、異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド（例えば、哺乳動物細胞に送達されるべき導入遺伝子））を含む場合、それは代表的には、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」といわれる。従って、ＡＡＶベクター粒子の生成は、このようなベクターが、ＡＡＶベクター粒子内に含まれることから、ＡＡＶベクターの生成を必然的に含む。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その１本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの１４５ヌクレオチド逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含めて、長さが約４．７ｋｂである。ＡＡＶには多数の血清型が存在する。そのＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、公知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７に提供される；ＡＡＶ－２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ４５： ５５５－５６４ ｛１９８３）に提供される；ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９に提供される；ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９に提供される；ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６に提供される；ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００ １８６２に提供される；ＡＡＶ－７ゲノムおよびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供される；ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７８： ６３８１－６３８８ （２００４）に提供される；ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．， １３（１）： ６７－７６ （２００６）に提供される；そしてＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ３３０（２）： ３７５－３８３ （２００４）に提供される。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、米国特許第９，４３４，９２８号（本明細書に参考として援用される）に提供される。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド内の囲い込み／パッケージングおよび宿主細胞染色体組み込みを指向するシス作用性配列は、そのＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。３種のＡＡＶプロモーター（それらの相対的マップ位置から、ｐ５、ｐｌ９、およびｐ４０と称される）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。その２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐｉ ９）は、その単一のＡＡＶイントロンの（ヌクレオチド２１０７および２２２７での）差次的なスプライシングと対になって、そのｒｅｐ遺伝子から４種のｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ ７８、ｒｅｐ ６８、ｒｅｐ ５２、およびｒｅｐ ４０）の生成をもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、そのウイルスゲノムの複製を最終的に担う多数の酵素特性を有する。そのｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、その３種のキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位が、その３種の関連するキャプシドタンパク質の生成を担う。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、そのＡＡＶゲノムのマップ９５位に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５８： ９７－１２９ （１９９２）において総説されている。

ＡＡＶは、外来ＤＮＡを細胞へと、例えば、遺伝子治療において送達するためのベクターとして魅力的にする特有の特徴を有する。培養物における細胞のＡＡＶ感染は、非細胞障害性であり、ヒトおよび他の動物の天然の感染は、無症状および無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を許容する。さらに、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞および分裂しない細胞に形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）としてそれらの細胞の寿命の間、本質的に持続し得る。そのＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中にクローニングされたＤＮＡとして挿入され、これは、組換えゲノムの構築を実現可能にする。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムキャプシド内の囲い込みを指向するシグナルは、そのＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれることから、そのゲノムの内部のおよそ４．３ｋｂ（複製および構造キャプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）のうちのいくらかまたは全てを、外来ＤＮＡで置き換えることができる。ＡＡＶベクターを生成するために、そのｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の有意な特徴は、それが極めて安定でありかつ元気な（ｈｅａｒｔｙ）ウイルスであるということである。それは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存をそれほど重要でなくする。ＡＡＶは、さらに凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染した細胞は、重複感染に耐性でない。

多数の研究が、筋における長期（＞１．５年）の組換えＡＡＶ媒介性タンパク質発現を示した。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ８： ６５９－６６９ （１９９７）； Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔ． Ａｃａｄ Ｓｃ． ＵＳＡ， ９３： １４０８２－１４０８７ （１９９６）；およびＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７０： ８０９８－８１０８ （１９９６）を参照のこと。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２：６１９－６２３ （２０００）およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ４：２１７－２２２ （２００１）もまた参照のこと。さらに、筋は高度に血管化されているので、組換えＡＡＶ形質導入は、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９４： ５８０４－５８０９ （１９９７）およびＭｕｒｐｈｙ ｅｔ
ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９４： １３９２１－
１３９２６ （１９９７）に記載されるように、筋肉内注射後に全身循環において導入遺伝子生成物の出現をもたらした。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７６： ８７６９－８７７５ （２００２）は、骨格筋線維が、正確な抗体グリコシル化、折りたたみ、および分泌に必要な細胞因子を有することを示した。これは、筋が、分泌型タンパク質治療剤の安定な発現の能力があることを示す。本発明の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、γ－サルコグリカン（例えば、配列番号１）をコードする核酸分子およびその核酸分子に隣接する１またはこれより多くのＡＡＶ ＩＴＲを含む。そのｒＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ血清型 ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３およびＡＡＶ ｒｈ７４が挙げられるが、これらに限定されない）に由来し得る。偽型化ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ ０１／８３６９２に開示される。ｒＡＡＶ改変体の他のタイプ、例えば、キャプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２２（１１）： １９００－１９０９ （２０１４）を参照のこと。種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該分野で公知である。

用語「Ｃａｓ９」とは、この名称によって言及されるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼに言及する。非限定的で例示的Ｃａｓ９は、本明細書で提供される（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｇ３ＥＣＲ１（ＣＡＳ９＿ＳＴＲＴＲ）に提供されるＣａｓ９またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、ならびにヌクレアーゼデッドＣａｓ９（ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｅａｄ Ｃａｓ９）、これら各々のオルソログおよび生物学的等価物）。オルソログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（「ｓｐＣａｓ９」）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａに由来するＣａｓ９；ならびに種々の細菌種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２が挙げられる）に由来するＣｐｆ１（これは、Ｃａｓ９の類似の切断機能を果たす）。

本明細書で使用される場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ」とは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート経路に依拠する配列特異的遺伝子操作の技術をいう。ＣＲＩＳＰＲは、遺伝子編集および／または遺伝子調節を行うために、ならびにタンパク質を特定のゲノム位置に単に標的化するために、使用され得る。遺伝子編集とは、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、そのポリヌクレオチド配列に対する欠失、挿入、または塩基置換の導入を通じて変更される遺伝子操作のタイプに言及する。いくつかの局面において、ＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子編集は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換えの経路を利用して、その編集を行う。遺伝子調節とは、特定の遺伝子生成物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）の生成の増加または減少に言及する。

用語「ｇＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ、とは、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、修正のために特定の遺伝子を標的化するために使用されるガイドＲＮＡ配列に言及する。標的特異性のためにｇＲＮＡおよびドナー治療用ポリヌクレオチドをデザインする技術は、当該分野で周知である。例えば、Ｄｏｅｎｃｈ， Ｊ．， ｅｔ
ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１４； ３２（１２）：１２６２－７， Ｍｏｈｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （２０１６） ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２８３： ３２３２－３８、およびＧｒａｈａｍ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ２０１５； １６： ２６０。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む融合ポリヌクレオチド；またはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる。いくつかの局面において、ｇＲＮＡは、合成のものである（Ｋｅｌｌｅｙ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３３ （２０１６） ７４－８３）。本明細書で使用される場合、ｇＲＮＡの生物学的等価物としては、Ｃａｓ９またはその等価物を特定のヌクレオチド配列（例えば、細胞のゲノムの特定の領域）にガイドし得るポリヌクレオチドまたは標的化分子が挙げられるが、これらに限定されない。

「組成物」は、活性なポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体および別の化合物または組成物（不活性（例えば、検出可能な標識）または活性（例えば、遺伝子送達ビヒクル））の組み合わせを意味することが意図される。

「医薬組成物」は、活性なポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体と、固体支持体のようなキャリア（不活性または活性）との組み合わせであって、その組成物をインビトロ、インビボまたはエキソビボでの診断的使用または治療的使用に適切にするものを含むことが意図される。

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、標準的な薬学的キャリア、例えば、リン酸緩衝食塩溶液、水、およびエマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョン）、および種々のタイプの湿潤剤のうちのいずれかを包含する。その組成物はまた、安定化剤および保存剤を含み得る。キャリア、安定化剤および補助剤の例に関しては、Ｍａｒｔｉｎ （１９７５） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．
Ｓｃｉ．， 第１５版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ． Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ）を参照のこと。

診断または処置の「被験体」とは、細胞または動物（例えば、哺乳動物）、またはヒトである。被験体は、特定の種に限定されず、診断または処置に対する非ヒト動物被験体を含み、感染または動物モデルに対するそれら被験体（例えば、サル、ネズミ科動物（例えば、ラット、マウス、チンチラ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）、ウサギ科動物（例えば、ウサギ）、家畜、競技用動物、および愛玩動物）である。ヒト患者は、同様にその用語内に含まれる。

用語「組織」は、生きている生物もしくは死んだ生物の組織、または生きている生物もしくは死んだ生物に由来するか、またはこれら生物を模倣するようにデザインされた任意の組織をいうために、本明細書で使用される。その組織は、健常であっても、病的であってもよい、および／または遺伝的変異を有していてもよい。その生物学的組織は、生物の身体の任意の単一の組織（例えば、相互に連絡し得る細胞の集まり）あるいは器官または一部もしくは領域を構成する組織の一群を含み得る。その組織は、均質な細胞物質を含んでいてもよいし、複合構造物（例えば、胸部を含む身体の領域において見出されるもの（それは、例えば、肺組織、骨格組織、および／または筋組織を含み得る））であってもよい。例示的な組織としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆管、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓および腸に由来するもの（これらの任意の組み合わせを含む）。

本明細書で使用される場合、被験体における疾患を「処置すること」または疾患の「処置」とは、（１）その症状もしくは疾患が、疾患の症状に罹りやすいかもしくはそれを未だ示していない被験体において起こることを防止する；（２）その疾患を阻害するかもしくはその進展を停止させる；または（３）その疾患もしくはその疾患の症状を改善するかもしくはその退縮を引き起こすことに言及する。当該分野で理解されるように、「処置」は、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本技術の目的のために、有益なまたは所望の結果は、検出可能であろうと検出不能であろうと、１もしくはこれより多くの症状の緩和もしくは改善、状態（疾患を含む）の程度の減少、状態（疾患を含む）の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、状態（疾患を含む）の遅延またはこれを遅らせること、状態（疾患を含む）の進展、改善または軽減、状態および寛解（部分的であろうが全体的であろうが）のうちの１またはこれより多くが挙げられ得るが、これらに限定されない。

開示を実施するための様式
改変されたウイルスキャプシドおよび調製方法
ＡＡＶベクター送達は現在、そのウイルスの天然の向性に基づいて、または標的組織への直接注射によって、組織標的化のための血清型選択を使用することに依拠する。最大の治療利益を達成するために全身送達が必要とされる場合、血清型選択は、組織特異的プロモーターと合わせて、組織標的化のための唯一の利用可能な選択肢である。本明細書で記載される場合、出願人は、レセプター結合および進入を担う特定のアミノ酸を同定し、それによって、ＡＡＶｒｈ７４における重要なアミノ酸を同定するために精巧な変異誘発研究の必要性を低減するアプローチを有する［７－１１］（図１）。肝臓の標的化解除のための重要な領域を同定したが、出願人は、筋特異的ベクター形質導入を富化する改変されたキャプシドを開発した。肝臓におけるベクター喪失の低減と、目的の遺伝子の筋細胞特異的送達とを組み合わせるという実際的な影響は、神経筋疾患の全身処置において臨床上の有効性の閾値を満たす見込みを大いに改善する。

本開示は、改変されたキャプシドタンパク質、単離されたポリヌクレオチド、改変されたキャプシドタンパク質の調製のための方法、組換えウイルス粒子および改変されたウイルス粒子の生成のための組換え発現系に関する。本開示の一局面は、アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる、改変されたウイルスキャプシドタンパク質に関する。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じてＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。さらなる実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。いくつかの実施形態において、その改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ）（配列番号２）の挿入である。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有する、および／または正常なｒｈ７４レセプター結合を変化させる可能性のある領域に配置される。その改変されたキャプシドは、他のウイルス送達システムへと組み込まれ得る。

さらなる局面において、その改変されたウイルス粒子は、遺伝子改変のための導入遺伝子および／または遺伝子改変のためのＣＲＩＳＰＲシステムをさらに含む。

アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変された、改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる、改変されたウイルスキャプシドタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドがまた、本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じてＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。さらなる実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（配列番号２）の挿入である。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有する、および／または正常なｒｈ７４レセプター結合を変化させる可能性のある領域に配置される。

アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変された、改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる、改変されたキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる、組換えウイルス粒子が、本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じてＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。さらなる実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。さらなる実施形態において、このウイルス粒子は、ＡＡＶｒｈ７４と比較して、処置送達の有効性を、その病的なまたは機能不全の組織に関して約３～５６倍の間で増加させる。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。さらなる実施形態において、その疾患または機能不全組織は、心臓組織である。なおさらなる実施形態において、このウイルス粒子は、ＡＡＶｒｈ７４と比較して、心臓組織に対して、約５０倍またはこれより高く処置送達の有効性を増加させる。いくつかの実施形態において、その改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（配列番号２）の挿入である。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有する、および／または正常なｒｈ７４レセプター結合を変化させる可能性のある領域に配置される。いくつかの実施形態において、そのウイルス粒子は、その疾患または機能不全組織に適した処置の有効量を含む。いくつかの実施形態において、その処置は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集である。

その改変されたウイルス、例えば、ＡＡＶは、ウイルスパッケージングシステム（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはバキュロウイルスのパッケージングシステム）を使用してパッケージされ得る。いくつかの実施形態において、パッケージングは、ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドおよび細胞株を使用することによって達成される。そのヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドは、細胞への遺伝物質の送達を促進するエレメントおよび配列を含む。別の局面において、そのヘルパープラスミドまたはそのヘルパープラスミドを含むポリヌクレオチドは、パッケージング細胞株のゲノムへと安定して組み込まれ、その結果、そのパッケージング細胞株は、ヘルパープラスミドでのさらなるトランスフェクションを必要としない。

ヘルパープラスミドは、例えば、複製能力のないＡＡＶをパッケージングするために、および複製能力のあるＡＡＶの生成なしに、複製能力のないＡＡＶを高力価でパッケージし得るビリオンタンパク質を生成するために、必要とされる全てのビリオンタンパク質をトランスでコードする複製能力のないウイルスゲノムに由来する少なくとも１つのウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含み得る。そのウイルスＤＮＡ配列は、そのウイルスのウイルス５’ ＬＴＲの天然のエンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする領域を欠き、ヘルパーゲノムのパッケージングを担うプサイ機能配列および３’ ＬＴＲの両方を欠くが、外来ポリアデニル化部位、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化部位、ならびにウイルス生成が望まれる細胞タイプにおいて効率的転写を指向する外来エンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする。そのウイルスは、白血病ウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）である。その外来エンハンサーおよびプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）最初期（ＩＥ）エンハンサーおよびプロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサーおよびプロモーター（Ｕ３領域）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域、または天然のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターに連結されたＨＣＭＶ ＩＥエンハンサーであり得る。そのヘルパープラスミドは、プラスミドベースの発現ベクターによってコードされる２つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列からなり得、例えば、ここで第１のヘルパー配列は、エコトロピックＭＭＬＶまたはＧＡＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを含み、第２のヘルパー配列は、ｅｎｖタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。そのＥｎｖ遺伝子（これは、宿主範囲を決定する）は、異種指向性、アンフォトロピック、エコトロピック、ポリトロピック（ミンク病巣形成）もしくは１０Ａ１マウス白血病ウイルスｅｎｖタンパク質、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスｅｎｖ（ｇｐ１６０）タンパク質、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）Ｇタンパク質、ヒトＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ）Ｉ型およびＩＩ型のｅｎｖ遺伝子生成物をコードする遺伝子、前述のｅｎｖ遺伝子のうちの１またはこれより多くの組み合わせに由来するキメラエンベロープ遺伝子または前述のｅｎｖ遺伝子生成物の細胞質および膜貫通部分ならびに所望の標的細胞上の特異的表面分子に対して向けられたモノクローナル抗体をコードするキメラエンベロープ遺伝子に由来し得る。

そのパッケージングプロセスにおいて、そのヘルパープラスミドおよびそのＡＡＶウイルスタンパク質をコードするプラスミドを、ウイルスを生成し得る哺乳動物細胞（例えば、ヒト胚性腎臓細胞、例えば、２９３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ１５７３， ＡＴＣＣ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．））の第１の集団へと一過性に共トランスフェクトして、高力価組換えレトロウイルス含有上清を生成する。本発明の別の方法では、この一過性にトランスフェクトされた第１の細胞集団を、次いで、哺乳動物標的細胞、例えば、ヒトリンパ球と共培養して、その標的細胞をその外来遺伝子で、高効率で形質導入する。

組成物
本明細書で記載されるとおりのウイルスベクター、単離された細胞、パッケージングシステム、ウイルス粒子およびキャリアのうちのいずれか１種またはこれより多くを含む組成物またはキットがまた、本発明によって提供される。一局面において、そのキャリアは、薬学的に受容可能なキャリアである。これらの組成物は、本明細書で記載されるように治療的に使用され得、他の公知の治療と組み合わせて使用され得る。

改変されたウイルス粒子を投与する方法
アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変された、改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含む非ヒトトランスジェニック動物が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じてＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。さらなる実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（配列番号２）の挿入である。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有する、および／または正常なｒｈ７４レセプター結合を変化させる可能性のある領域に配置される。

遺伝子編集の方法であって、細胞と、改変されたキャプシドを含むか、または代わりにそれから本質的になる組換えウイルス粒子とを接触させることを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる方法が、本明細書で開示され、ここでその改変されたキャプシドは、アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変された、改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含むか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じてＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。さらなる実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（配列番号２）の挿入である。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有する、および／または正常なｒｈ７４レセプター結合を変化させる可能性のある領域に配置される。いくつかの実施形態において、その接触は、インビボまたはインビトロである。いくつかの実施形態において、そのウイルス粒子は、１またはこれより多くのポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる。いくつかの局面において、そのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、治療用ポリペプチドを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる。いくつかの実施形態において、そのウイルス粒子は、Ｃａｓ９またはその等価物を含む。

必要性のある被験体における遺伝子編集の方法であって、その被験体に、有効量の、改変されたキャプシドを含むか、または代わりにそれから本質的になる組換えウイルス粒子を投与することを包含する方法が本明細書でさらに開示され、ここでその改変されたキャプシドは、アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変された、改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じてＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。さらなる実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（配列番号２）の挿入である。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有する、および／または正常なｒｈ７４レセプター結合を変化させる可能性のある領域に配置される。いくつかの実施形態において、そのウイルス粒子は、１またはこれより多くのポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる。いくつかの局面において、そのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、治療用ポリペプチドを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる。いくつかの実施形態において、そのウイルス粒子は、Ｃａｓ９またはその等価物を含む。

改変されたキャプシドを含むか、または代わりにそれから本質的になる組換えウイルス粒子を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる組換えウイルスキャプシド粒子を含む非ヒトトランスジェニック動物が、本明細書で提供され、ここでその改変されたキャプシドは、アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変された、改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じてＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。さらなる実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（配列番号２）の挿入である。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有する、および／または正常なｒｈ７４レセプター結合を変化させる可能性のある領域に配置される。

いくつかの局面において、そのｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む融合ポリヌクレオチド；またはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる。いくつかの局面において、そのｇＲＮＡは、必要性のある被験体または細胞において遺伝子編集の必要性があるＤＮＡの領域に特異的である。

いくつかの局面において、その組換えウイルス粒子は、治療用ポリヌクレオチドをさらに含む。その治療用ポリヌクレオチドは、編集の必要性のあるＤＮＡ配列を標的化するために、編集の必要性のあるＤＮＡ配列の修復テンプレートを提供するために、または編集の必要性のあるＤＮＡ配列の置換を提供するために、使用され得る任意のポリペプチドである。さらなる局面において、その治療用ポリペプチドは、必要性のある被験体または細胞において遺伝子編集の必要性がある遺伝子の野生型配列を含む。

なおさらなる局面は、疾患、障害、または状態を有する被験体を処置する方法であって、本明細書で開示される改変されたＡＡＶをその被験体に投与することを包含する方法に関する。いくつかの局面において、その疾患、障害、または状態は、血友病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、α１アンチトリプシン、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー、脊髄性筋萎縮症、嚢胞性線維症、ＨＩＶ、サラセミア、全脈絡膜萎縮症、パーキンソン、レーバー先天性黒内障、黄斑変性、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素欠損症、色覚異常、クリグラー・ナジャー症候群、ポンペ病、Ｘ連鎖性網膜分離症、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、バッテン病、網膜変性、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、ムコ多糖症（Ｉ－ＩＸ）、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎の群から選択される。一局面において、その血友病は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子欠損症のうちの１またはこれより多くによって特徴づけられる。いくつかの局面において、その筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、および眼咽頭型筋ジストロフィーから選択される。

いくつかの局面において、ガイドＲＮＡおよび／またはその治療用ポリヌクレオチドは、血友病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、α１アンチトリプシン、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー、脊髄性筋萎縮症、嚢胞性線維症、ＨＩＶ、サラセミア、全脈絡膜萎縮症、パーキンソン、レーバー先天性黒内障、黄斑変性、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素欠損症、色覚異常、クリグラー・ナジャー症候群、ポンペ病、Ｘ連鎖性網膜分離症、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、バッテン病、網膜変性、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、ムコ多糖症（Ｉ－ＩＸ）、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎の群から選択される疾患、障害、または状態を処置するために、デザインおよび／または選択される。一局面において、その血友病は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子欠損症のうちの１またはこれより多くによって特徴づけられる。いくつかの局面において、その筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、および眼咽頭型筋ジストロフィーから選択される。

いくつかの局面において、そのガイドＲＮＡおよび／またはその治療用ポリヌクレオチドは、以下の群から選択される遺伝子を標的化または修復するためにデザインおよび／または選択される：第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８， ＮＭ＿０００１３２， ＮＭ＿０１９８６３）、第ＩＸ因子（Ｆ９， ＮＭ＿０００１３３， ＮＭ＿００１３１３９１３）、ジストロフィン（ＤＭＤ， ＮＭ＿０００１０９， ＮＭ＿００４００６， ＮＭ＿００４００７， ＮＭ＿００４００９， ＮＭ＿００４０１０）、ディスフェルリン（ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ）（ＤＹＳＦ， ＮＭ＿００１１３０４５５， ＮＭ＿００１１３０９７６， ＮＭ＿００１１３０９７７， ＮＭ＿００１１３０９７８， ＮＭ＿００１１３０９７９）、エメリン（ＥＭＤ， ＮＭ＿０００１１７）、ラミンＡ／Ｃ（ＬＭＮＡ， ＮＭ＿００１２５７３７４， ＮＭ＿００１２８２６２４， ＮＭ＿００１２８２６２５， ＮＭ＿００１２８２６２６， ＮＭ＿００５５７２）、ダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４， ＮＭ＿００１２０５２１８， ＮＭ＿００１２７８０５６， ＮＭ＿００１２９３７９８， ＮＭ＿００１３０６０６８）、ミオトニンプロテインキナーゼ（ＭＤＰＫ， ＮＭ＿００１０８１５６０， ＮＭ＿００１０８１５６２， ＮＭ＿００１０８１５６３， ＮＭ＿００１２８８７６４， ＮＭ＿００１２８８７６５）、細胞核酸結合タンパク質（ＣＮＢＰ， ＮＭ＿００３４１８， ＮＭ＿００１１２７１９２， ＮＭ＿００１１２７１９３， ＮＭ＿００１１２７１９４， ＮＭ＿００１１２７１９５）、ポリアデニレート結合タンパク質－２（ＰＡＢＰ－２， ＮＭ＿００４６４３）、α１アンチトリプシン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１， ＮＭ＿０００４５４）、アルシン（ａｌｓｉｎ）（ＡＬＳ２， ＮＭ＿００１１３５７４５， ＮＭ＿０２０９１９）、ヘリカーゼセナタキシン（ＳＥＴＸ， ＮＭ＿０１５０４６）、スパタクシン（ＳＰＧ１１， ＮＭ＿００１１６０２２７， ＮＭ＿０２５１３７）、ＲＮＡ結合タンパク質ＦＵＳ／ＴＬＳ（ＦＵＳ， ＮＭ＿００１０１０８５０， ＮＭ＿００１１７０６３４， ＮＭ＿００１１７０９３７， ＮＭ＿００４９６０）、小胞結合膜タンパク質関連タンパク質Ｂ／Ｃ（Ｖｅｓｉｃｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ／Ｃ）（ＶＡＰＢ， ＮＭ＿００１１９５６７７， ＮＭ＿００４７３８）、アンギオゲニン（ＡＮＧ， ＮＭ＿００１１４５， ＮＭ＿００１０９７５７７）、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＡＲＤＢＰ， ＮＭ＿００７３７５）、ポリホスホイノシチドホスファターゼ（ＦＩＧ４， ＮＭ＿０１４８４５）、オプチニューリン（ＯＰＴＮ， ＮＭ＿００１００８２１１， ＮＭ＿００１００８２１２， ＮＭ＿００１００８２１３， ＮＭ＿０２１９８０）、アタキシン－２（ＡＴＸＮ２， ＮＰ＿００１２９７０５０， ＮＰ＿００１２９７０５２， ＮＰ＿００２９６４）、バロシン含有タンパク質（ＶＣＰ， ＮＭ＿００７１２６）、ユビキリン－２（ＵＢＱＬＮ２， ＮＭ＿０１３４４４）、シグマ１レセプター（ＳＩＧＭＡＲ１， ＮＭ＿００１２８２２０５， ＮＭ＿００１２８２２０６， ＮＭ＿００１２８２２０７， ＮＭ＿００１２８２２０８， ＮＭ＿００１２８２２０９）、荷電多小胞体タンパク質２ｂ（ｃｈａｒｇｅｄ ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ｂ）（ＣＨＭＰ２Ｂ， ＮＭ＿００１２４４６４４， ＮＭ＿０１４０４３）、プロフィリン－１（ＰＦＮ１， ＮＭ＿００５０２２）、レセプターチロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ－４（ＥＲＢＢ４， ＮＭ＿００１０４２５９９， ＮＭ＿００５２３５）、ヘテロ核リボタンパク質Ａ１（ＨＮＲＮＰＡ１， ＮＭ＿００２１３６， ＮＭ＿０３１１５７）、ｍａｔｒｉｎ－３（ＭＡＴＲ３， ＮＭ＿１９９１８９， ＮＭ＿００１１９４９５４， ＮＭ＿００１１９４９５５， ＮＭ＿００１１９４９５６， ＮＭ＿００１２８２２７８）、チューブリンα－４Ａ鎖（ＴＵＢＡ４Ａ， ＮＭ＿００１２７８５５２， ＮＭ＿００６０００）、第９染色体オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ｏｒｆ７２， ＮＭ＿１４５００５， ＮＭ＿００１２５６０５４， ＮＭ＿０１８３２５）、ＣＨＣＤ１０、ＳＱＳＴＭ１（ＮＭ＿００１１４２２９８）、ＴＢＫ１、アポリポタンパク質Ｅ（ＮＭ＿００１３０２６９１， ＮＭ＿００００４１， ＮＭ＿００１３０２６８８， ＮＭ＿００１３０２６８９， ＮＭ＿００１３０２６９０）、ＳＭＮ１（ＮＭ＿０００３４４）、ＳＭＮ２（ＮＭ＿０１７４１１， ＮＭ＿０２２８７５， ＮＭ＿０２２８７６，
ＮＭ＿０２２８７７）、ＣＴＦＲ（ＮＭ＿０００４９２）、βグロビンＨＢＢ ＰＤＢ、ＣＨＭ、αシヌクレイン（ＳＮＣＡ， ＮＭ＿０００３４５）、ｐａｒｋｉｎ（ＰＲＫＮ， ＮＭ＿００４５６２）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２またはｄａｒｄａｒｉｎ， ＮＭ＿１９８５７８）、ＰＴＥＮ誘導性推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１， ＮＭ＿０３２４０９）、ＤＪ－１（ＮＭ＿００１１２３３７７）、酸性マルターゼ（ＮＭ＿０００１５２）、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ１（ＮＭ＿０００４６３）、ＰＰＴ－１（ＮＭ＿０００３１０）、またはＡＴＰ１３Ａ２（ＮＭ＿００１１４１９７３）。

本発明のさらなる局面は、キャリアおよび本明細書で記載される改変されたウイルスを含む組成物に関する。簡潔には、本発明の医薬組成物は、本明細書で記載される改変されたウイルス粒子を、１またはこれより多くの薬学的にまたは生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。このような組成物は、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など）；炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール）；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；抗酸化剤；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本開示の組成物は、経口、静脈内、局所、経腸、および／または非経口投与のために製剤化され得る。ある種の実施形態において、本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化される。

ｇＲＮＡが、特定の遺伝子、必要に応じて、疾患、障害、または状態と関連する遺伝子を標的化する標的特異性のために生成され得ることは、当業者によって認識される。従って、Ｃａｓ９との組み合わせにおいて、そのガイドＲＮＡは、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの標的特異性を促進する。プロモーター選択（上記で考察されるとおり）のようなさらなる局面は、標的特異性を達成する－例えば、特定の器官または組織において発現を促進するポリヌクレオチドをコードするガイドＲＮＡに関するプロモーターを選択する、さらなる機構を提供し得る。よって、その特定の疾患、障害、または状態に適切なｇＲＮＡの選択は、本明細書で企図される。

その改変されたＡＡＶまたは組成物の投与は、１用量で、処置の過程全体を通して連続してまたは間欠的に、もたらされ得る。投与は、任意の適切な投与様式を通じてのものであり、以下が挙げられるが、これらに限定されない：静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内、脳室下、硬膜外、脳内、脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、眼内、腹腔内、子宮内、皮内、皮下、経皮、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｃｏｓａｌ）、および吸入。

投与の最も有効な手段および投与量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療に使用される組成物、その治療の目的および処置されている被験体に伴って変動する。１回のまたは多数の投与が、その処置する医師によって選択される用量レベルおよびパターンで行われ得る。投与量は、投与経路によって影響され得ることが注記される。薬剤の適切な投与製剤および投与法は、当該分野で公知である。このような適切な投与量の非限定的な例は、投与１回あたり１Ｅ＋９ベクターゲノム程度の少なさから１Ｅ＋１７ベクターゲノム程度の多さであり得る。

さらなる局面において、本発明の改変されたウイルス粒子および組成物は、他の処置、例えば、その特定の疾患、障害、または状態に適しているそれらの承認された処置と組み合わせて投与され得る。非限定的な例としては、その改変されたウイルス粒子および１またはこれより多くのステロイドの組み合わせでの筋ジストロフィーの処置が挙げられる。その処置が、その処置する医師によって決定される場合、遺伝子改変の臨床的または準臨床的証拠に関してモニターすることによって成功したかどうかが決定され得る。

本発明の改変されたウイルス粒子または組成物のこの投与は、実験およびスクリーニングアッセイのために望ましい疾患、障害、または状態の動物モデルを生成するために行われ得る。

改変されたＡＡＶキャプシドおよび粒子
本開示はまた、特定の実施形態、例えば、改変されたキャプシドを含むか、または代わりにそれから本質的になる組換えウイルス粒子を含む改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供し、ここでその改変されたキャプシドは、アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変された、改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じてＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。さらなる実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５９１位でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ（配列番号２）の挿入である。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有する、および／または正常なｒｈ７４レセプター結合を変化させる可能性のある領域に配置される。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、遺伝子カーゴを効率的に細胞に送達するように操作された複製欠損ウイルスである。それらは、それらのベクター形態において、その元のウイルスの逆方向末端反復（ＩＴＲ）のみを有する非エンベロープウイルスである。その構造的および酵素的なＡＡＶタンパク質は、さらなるプラスミドによって「トランスで」供給され、遺伝子送達のためのその操作された粒子を生成するために、細胞へと一緒にトランスフェクトされる。ＡＡＶは、遺伝子治療に－およびより具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムとともに－それらの安全性および効率に起因して、広く利用されている。ＡＡＶは、種々の細胞に効率的に感染し、その感染プロセスの間に、そのキャプシドは、ベクターゲノムが送達される核に結合して入る。

そのＡＡＶ構造粒子は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を構成する６０のタンパク質分子から構成される。各粒子は、正二十面体構造へと秩序立てられる、およそ５個のＶＰ１タンパク質、５個のＶＰ２タンパク質および５０個のＶＰ３タンパク質を含む。ＡＡＶ２粒子は、そのキャプシド構造内の種々の部位におけるペプチドおよびタンパク質の挿入を支援し得ることが示されている。特有のペプチドをそのキャプシドへと導入する能力は、向性が変化し、そのウイルスが、通常は感染に不応性であり得る細胞および組織に結合し感染することを可能にするＡＡＶ粒子の開発をもたらした。さらに、大きなペプチドおよびさらには機能的であるタンパク質は、種々の成功レベルで、ＡＡＶ２ベクターのキャプシドへと導入されている。機能的な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、３０ｋＤ ＭＷ）含有ＡＡＶキャプシドは、細胞感染を追跡するために使用される感染性ウイルスを作製および生成した。

遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに伴う制約のうちの１つは、粒子へと効率的にパッケージングされ得る遺伝子挿入物のサイズ制限である。例えば、野生型ＡＡＶ２ゲノムのサイズは、４６７９塩基の１本鎖ＤＮＡである。Ｃａｓ９（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、ＳａＣａｓ９、１３０ｋＤ ＭＷ）の新たなより小さな改変体のうちの１つをパッケージングするのですら、そのコード領域に関してだけで、およそ３２５５ｂｐを要する。遍在性または組織特異的プロモーターをその構築物に付加すると、さらに５００～８００ｂｐが付加され得る。ポリＡ付加配列およびＩＴＲに関してはさらに５００ｂｐが含められ、そのベクターは、ＡＡＶ粒子のパッケージング能力に近い。機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子修正を達成するために、標的配列に伴うガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）も含められなければならない。このＲＮＡを発現させるには、最小のｐｏｌＩＩＩプロモーターおよび終結配列がさらに必要である。まとめると、これらのエレメントは大きすぎて、効率的にパッケージされるＡＡＶベクターへと組み合わせられない。そのＣａｓ９構築物およびガイドＲＮＡ発現カセットを別個のベクターにパッケージすることが選択され得るが、それらが機能するには、両方のウイルスが同じ標的細胞に感染しなければならない。

本開示のさらなる局面は、このような改変されたＡＡＶの生成のための組換え発現系に関する。いくつかの実施形態において、その組換え発現系は、複数のプラスミドを含み；その複数のものが、ＡＡＶウイルスタンパク質－ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の全てをコードする。いくつかの実施形態において、各ウイルスタンパク質は、異なるプラスミドの中にコードされる。いくつかの実施形態において、１またはこれより多くのウイルスタンパク質は、同じプラスミドの中にコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１種のウイルスタンパク質は、Ｃａｓ９との融合タンパク質としてコードされる。

よって、本明細書で開示される実施形態は、改変されたキャプシドを含む改変されたＡＡＶの生成のための組換え発現系に関し、ここでその改変されたキャプシドは、アミノ酸置換または１～７個の間のアミノ酸の挿入によって改変された、改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含むか、または代わりにそれから本質的になるか、またはさらになおそれからなる改変されたウイルスキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、必要に応じてＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。さらなる実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０２位でアスパラギンの代わりにイソロイシンを使用することまたは等価な改変を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む。いくつかの局面において、そのペプチドにおける他のアミノ酸は改変されるが、この置換は維持される。いくつかの実施形態において、その改変は、主にサテライト細胞で、必要に応じて、筋幹細胞で見出されるレセプターを標的化する。

いくつかの局面は、本明細書で開示される組換え発現系を使用して、その改変されたＡＡＶを生成する方法に関する。

なおさらなる局面は、疾患、障害、または状態を有する被験体を処置する方法であって、本明細書で開示される改変されたＡＡＶをその被験体に投与することを包含する方法に関する。いくつかの実施形態において、その疾患、障害、または状態は、血友病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、α１アンチトリプシン、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー、脊髄性筋萎縮症、嚢胞性線維症、ＨＩＶ、サラセミア、全脈絡膜萎縮症、パーキンソン、レーバー先天性黒内障、黄斑変性、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素欠損症、色覚異常、クリグラー・ナジャー症候群、ポンペ病、Ｘ連鎖性網膜分離症、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、バッテン病、網膜変性、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、ムコ多糖症（Ｉ－ＩＸ）、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎の群から選択される。いくつかの実施形態において、その血友病は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子欠損症のうちの１またはこれより多くによって特徴づけられる。いくつかの実施形態において、その筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、および眼咽頭型筋ジストロフィーから選択される。

以下の実施例は、非限定的であり、本開示を実施するにあたって種々の場合に使用され得る手順を例証する。さらに、本明細書中以下で開示される全ての参考文献は、それらの全体において参考として援用される。

ＡＡＶｒｈ７４は、神経筋疾患の処置に関する臨床試験において広範に使用されている、ＮＣＨの研究者によって同定されたＡＡＶの血清型である。それは、ヒト心筋および骨格筋に効率的に感染し、ヒト集団において既存の中和抗体の保有率が低い。

実施例１－血管送達によって最大の筋芽細胞およびサテライト細胞の生体内分布に最適な、改変された血清型を決定する
筋サテライト細胞は、骨格筋における筋線維細胞より６０倍豊富にある［２］。それらは、骨格筋の長期の再生能力を容易にする、自己再生する幹細胞集団である［１２］。近年、いくつかのＦＡＣＳソート可能なマーカーが、筋幹細胞の単離のために同定されている［１３］（図２）。α７β１インテグリンは、陽性の筋幹細胞選択マーカーとして同定されており、骨格筋芽細胞および成体筋線維上の主なラミニンレセプターでもある。発現試験から、α７β１インテグリンは心臓および骨格筋組織上で豊富に発現され、肝臓組織においてはごく低レベルが見出されることが示されている。出願人は、そのＡＡＶｒｈ７４キャプシドを改変して、α７β１インテグリンタンパク質に高親和性で結合することが示されているペプチドを発現させた。出願人は、そのペプチドを、α７β１インテグリンを結合レセプターとして利用するために、正常なＡＡＶｒｈ７４レセプター結合モチーフを変化させる可能性がある領域に配置した。肝臓特異的結合および進入に必要であると仮説を立てたＡＡＶｒｈ７４の他のアミノ酸における２つのさらなる変異も同定され、ベクターの静脈内注射後に、レポーター遺伝子の増加した全体的および／または筋特異的送達を可能にすることが示された（図３～５）。

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、以前に示されるように、同じルシフェラーゼ－ＥＹＦＰ融合タンパク質を発現する、その新たに作製した、改変したキャプシドウイルスまたはコントロールＡＡＶｒｈ７４（ＡＡＶｍｕｔ４、ＡＡＶｍｕｔ５およびＡＡＶＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ５９１）を静脈内注射し、３週間後に、そのマウスをＰＢＳ／パラホルムアルデヒド灌流で屠殺し、続いて、その切片化した筋および器官の免疫組織化学的染色を行って、形質導入された特定の細胞集団を決定した。最初に、そのマウスを、ＩＶＩＳイメージングシステムを使用してルシフェラーゼ発現について毎週イメージングして、遺伝子発現を確認する。注射の３週間後に、そのマウスを灌流し、組織を採取し、パラホルムアルデヒド中で固定し、続いて、切片化し、免疫蛍光によってＧＦＰ発現について染色し、同定のために細胞タイプ特異的抗原の発現について対比染色する。このアプローチは、出願人が、その異なるキャプシド変異ベクターによって形質導入された特定の細胞集団を同定して、どれが標的化される筋疾患に対して最も利益のある可能性があるかを決定することを可能にした。

ＡＡＶｒｈ７４は、骨格筋および心筋において高レベル遺伝子発現の現在の標準であり、キャプシド改変の骨格として使用した。ＣＤ－１マウスの静脈内注射後のベクター生体内分布を、そのコントロールおよび３種のキャプシド改変したウイルスの注射の３週間後に、ｑＰＣＲによって決定した（図３）。そのｍｕｔ４ベクターは、四頭筋、横隔膜および心筋において有意な増加を有するベクターの増加した全体的生体内分布を示した。それに対して、ｍｕｔ５およびＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ５９１は、ＡＡＶｒｈ７４に対して、心臓の有意に増加したベクター形質導入を示した。

図４および図５は、親ＡＡＶｒｈ７４に対して、ルシフェラーゼ遺伝子を送達したｍｕｔ４およびＹＩＧまたはＹＩＧＳＲ５９１の増強されたインビボ発現を示す。図４は、頭部領域または体幹下部のいずれかにおいて増加した光子数を括弧で囲んで示して、形質導入におけるｍｕｔ４ウイルスの有効性および広く種々の組織における遺伝子発現を示す。

近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６匹／ウイルス群、雄性３匹および雌性３匹）を使用して、非近交系（ｏｕｔｂｒｅｄ）ＣＤ－１マウスの以前の生体内分布プロフィールを確認する。その４種のウイルスを調製し、到着時にマウスに注射できる準備をする。

均等物
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本技術が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。

本明細書で例証的に記載された本技術は、本明細書で具体的に開示されないいかなる要素、限定がなくても、適切に実施され得る。従って、例えば、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、発展的におよび限定なく、読んで理解されるものとする。さらに、本明細書で使用される用語および表現は、説明の用語として使用されているのであって、限定の用語として使用されているのではなく、このような用語および表現の使用において、示されかつ記載される特徴の任意の等価物またはその一部を排除するという意図は全くないが、種々の改変が、請求項に記載される本技術の範囲内で可能であることは認識される。

従って、ここで提供される材料、方法、および例が、好ましい局面の代表であり、例示であり、本技術の範囲に対する限定として意図されないことは、理解されるべきである。

本技術は、本明細書で広くかつ包括的に記載されてきた。その包括的な開示の範囲内に入る、より狭い種および下位の包括的グループの各々はまた、本技術の一部を形成する。これは、その切り取られた材料が本明細書で具体的に記載されているか否かにかかわらず、その属から任意の主題を除去する但し書きまたは消極的限定とともに、本技術の包括的説明を含む。

さらに、本技術の特徴または局面がマーカッシュグループのことばで記載される場合、当業者は、本技術が、それによって、そのマーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位群に関しても記載されることを認識する。

本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、各々が個々に参考として援用されるのと同程度まで、それらの全体において明示的に援用される。矛盾する場合、定義を含め、本明細書が優先する。

他の局面は、以下の特許請求の範囲内に示される。
参考文献

配列
配列番号１ ＮＭ＿０００２３１．２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ サルコグリカンγ（ＳＧＣＧ）、ｍＲＮＡ

キャプシド遺伝子の野生型ＡＡＶ ｒｈ７４ヌクレオチド配列（配列番号３）：

野生型ＡＡＶ ｒｈ７４アミノ酸配列（配列番号４）：

改変されたキャプシド－ＡＡ配列（配列番号５）

Claims (15)

1. ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンからアルギニンへの置換を含む、改変されたＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１キャプシドタンパク質。
2. 請求項１に記載の改変されたＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１を含む組換えウイルス粒子。
3. 前記組換えウイルス粒子は、改変されたＡＡＶｒｈ７４である、請求項２に記載の組換えウイルス粒子。
4. 導入遺伝子またはＣＲＩＳＰＲシステムをさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載の組換えウイルス粒子。
5. 必要に応じて、ベクター内に含まれる、請求項１に記載の改変されたＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１および／または請求項２もしくは３に記載の組換えウイルス粒子をコードする、ポリヌクレオチド。
6. 必要に応じて請求項５に記載のベクターを含む、請求項３に記載の組換えウイルス粒子を生成するための組換え発現系。
7. 請求項５に記載のポリヌクレオチドまたはベクターを含む、宿主細胞。
8. 細胞においてポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質を改変するための方法において使用するための組成物であって、請求項１もしくは４に記載の改変されたキャプシドタンパク質を含む組換えウイルス粒子、または請求項２に記載のウイルス粒子を含み、前記方法は、前記細胞に、前記組換えウイルス粒子を送達することを包含するものである、組成物。
9. 前記細胞は、哺乳動物細胞である、請求項８に記載の組成物。
10. 前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項９に記載の組成物。
11. 被験体においてポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質を改変するための組成物であって、請求項１もしくは４に記載の改変されたキャプシドタンパク質を含む組換えウイルス粒子、または請求項２に記載のウイルス粒子を含む、組成物。
12. 前記被験体は、哺乳動物である、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記哺乳動物はヒトである、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記組成物の投与は、局所または全身である、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
15. 請求項１もしくは４に記載の改変されたキャプシドタンパク質を含む組換えウイルス粒子、または請求項２に記載のウイルス粒子を含むキット。