JP4354814B2 - 改善された疾患治療効果を有する組換えアデノウィルス及びそれを含む薬剤学的組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、治療効能が向上した組換えアデノウィルス(recombinant adenovirus)に関するものである。より詳しくは、本発明は、アデノウィルスに水疱性口内炎(vesicular stomatitis)ウィルスの感染リガンドを導入させることを特徴として、各種の疾病に対する治療効能を向上させた組換えアデノウィルス及びこれを含む薬剤学的組成物に関するものである。
現在、分子生物学の目覚しい発達によって遺伝子水準で癌及び難治性疾患の治療剤の開発に大きい進歩があり、1990年に遺伝子治療の臨床的な試みが始められて以来、治療用遺伝物質の伝達方法に関する研究が持続的に行われてきた。疾病治療を目的とする遺伝子治療の臨床試験中の約60%以上が癌を対象疾患としている。また、治療用遺伝子を対象細胞に伝達する媒介体としては、アデノウィルスの有する多くの長所のため、レトロウィルスに代えて使用されている。
本発明の目的は、腫瘍殺傷能効果を含んで各種疾病の治療効能が向上した組換えアデノウィルスを提供することにある。
本発明は、アデノウィルスに、水疱性口内炎ウィルス由来のVSV−Gエピトープを含んだ蛋白質が連結された組換えアデノウィルスに関するものである。
アデノウィルスE1部位のうちE1B55kD遺伝子を欠失させるためにE1AとE1B19kDを含めさせることが可能なプライマーを製作してpXC1(Microbix, Ontario, Canada)をテンプレートDNAとし、重合酵素連鎖反応(PCR)を行ってウィルスの遺伝子塩基序列上343〜2270を含むPCR産物を獲得した(図10)。このため、末端にBamHI制限酵素認識部位を挿入させた5'−TTATTGGATCCTTTGTCTAGGGCCGCGGG−3'(序列番号1)をセンスプライマーとして、BamHIとBg1II認識部位及び2253(C::T)と2262(G::T)の置換で2つの終結コドンを挿入させた5'−TCTTGGATCCAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAAC−3'(序列番号2)をアンチセンスプライマーとして用いた。PCRで得られた1.9kb生成物をBamIIで切断した後、E1が完全に消失されたpCA14(Microbix, Ontario, Canada)のBg1II部位に挿入させてシャトルベクターpCA14−E1A/E1B19kDを製作し、これをXmnIで切断した後、BstBIで処理したE1及びE3遺伝子消失アデノウィルスベクターvmdl324Bst(Dr. Verca, University of Fribourgh, Switzerland)と共に大腸菌BJ5183に挿入させて遺伝子相同組換えを誘導した(図10)。大腸菌からDNAを獲得してHindIIIで処理してE1B55kDが消失されたpYKL−1であることを確認し、獲得した。pYKL−1をPacIで切断して293細胞株に添加し、E1B55kDが消失された組換えアデノウィルスを生産した。生産された組換えアデノウィルスはYKL−1と命名され、ブタペスト協約の下にKCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)に2002年9月19日付で寄託番号KCCM−10424で国際寄託した。
アデノウィルスのE1B19kDaとE1B55kDa遺伝子が欠失された組換えアデノウィルスシャトルベクターpΔE1B19/55を製作するために、まずE1A遺伝子のみを含まさせることが可能なプライマーセットを製作してアデノウィルスE1シャトルベクターのpXC1(Microbix, Ontario, Canada)をテンプレートDNAとしてPCRを行い、センスプライマーとして5'−TTATTGGATCCTTTGTCTAGGGCCGCGGG−3'(序列番号3)、アンチセンスプライマーとして5'−CCAGGATCCAGATCTCCCCATTTAACACGCCATGC−3'(序列番号4)を用いた。生成されたPCR産物をBamHIで切断した後、pCA14BalII部位にクローニングさせてpΔE1B19/55プラスミドを製作した。E1B19kDa遺伝子の塩基序列のうち開始コドンが終了コドンで置き換えられたpΔE1B19kDaシャトルベクターを製作するためには、まずpXC1をXbaIとBamHI制限酵素で切断させて得られた1.3kbDNA切片をpSP72クローニングベクター(Promega, USA)に挿入させた後、センスプライマーとして5'−GTTACATCTGACCTCCTGTAGGCTAGCGAGTGTTTGGAAG−3'(序列番号5)、アンチセンスプライマーとして5'−CTTCCAAACACTCGCTAGCCTACAGGAGGTCAGATGTAAC−3'(序列番号6)を用いて部位指定突然変異誘発(site directed mutagenesis)(stratagene, La Jolla, CA, USA)を施行した。製造されたプライマー内にはE1B19kDa遺伝子開始コドンを終了コドンで取り換える突然変異が誘導され、新しく生成されたpSP72/pxC1/1.3kb/Δ19mtプラスミドは序列分析によって突然変異誘発有無を確認した。突然変異させたpSP72/pXC1/1.3kb/Δ19mtプラスミドをXbaIとBamHIで更に切断し、pXC1内のXbaIとBamHI部位に再挿入させてpΔE1B19kDaシャトルベクターを製作した。製作されたpΔE1B19/55、pΔE1B19kDaシャトルベクターは、前記実施例1で製作されたE1B55kDa遺伝子が欠失されたAd−ΔE1B55kDaシャトルベクターと同様の方法でXmnI制限酵素で切断された後、BstBI制限酵素で単一本になったアデノウィルスvmdl324Bst(Dr. Verca, University of Fribourgh, Switzerland)と共にそれぞれ大腸菌BJ5183において同時形質転換させて遺伝子相同組換えを誘導した(図11)。相同組換えされたプラスミドDNAを収得し、HIndIII制限酵素で処理してE1B19kDaとE1B55kDaの2つの遺伝子が両方とも欠失されたAd−pΔE1BとE1B19kDa遺伝子に開始コドンが終結コドンで置き換えられたAd−ΔE1B19生成物を確認した。それぞれの組換えアデノウィルスプラスミドをPacIで切断した後、293細胞株に形質転換してAd−ΔE1B19/55とAd−ΔE1B19組換えアデノウィルスを生産した。E1B19kDが消失されて生産された組換えアデノウィルスはYKC−1と命名され、ブタペスト協約の下にKCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)に2002年9月19日付で寄託番号KCCM−10425で国際寄託された。
A.組換えアデノウィルスYCI−Ad−VSVGの製造
実施例1で製造された、アデノウィルスAd5のE1領域のうちE1Bの55kDa蛋白質をコーディングする遺伝子が欠失されたYKL−1アデノウィルスに水疱性口内炎ウィルスの膜蛋白質をコーディングする遺伝子のうち19個のアミノ酸からなるVSV−G蛋白質のエピトープを挿入させた形の再標的化アデノウィルスを次のように製作した(図1、図2、図3及び図4)。
GTWLNPGFPPQSCGYATVT(序列番号9)、及び5'−GGA/ACT/TGG/CTG/AAT/CCA/GGC/TTC/CCT/CCT/CAA/AGT/TGT/GGA/TAT/GCA/ACT/GTG/ACG−3'(序列番号10)。
VSV−Gエピトープによる遺伝子形質導入率の増加有無を知ることが可能な標識ウィルスであって、LacZを発現する増殖不能アデノウィルスは次のように製作した。まず、pcDNAhygroLacZプラスミド(Invitrogen, USA)をSpeIとXbaIで切断してLacZ断片を得た後、これをXbaIで切断されたアデノウィルスシャトルベクターpCA14(Microbix, Canada)に挿入させてpCA14LacZプラスミドを製作した。アデノウィルスベクターとしてE1とE3が消失されたvmdl324Bst(Heider, H. et al., Biotechniques, 28(2):260-265, 268-270, 2000)をBstBIで切断した後、前記遺伝子相同組換え方法でdl323/pCA14LacZを得た。次に、dl324/pCA14/LacZウィルスにVSV−Gエピトープをファイバーの3'末端に挿入するために、VSV−Gエピトープが挿入されているシャトルベクターの前記pSK[5510+103bp]をSacIIとKpnIで切断した後、SpeIで切断したdl324/pCA14LacZと共に大腸菌BJ5183に形質転換させて遺伝子相同組換えを誘導してウィルスを製造し、dl324−LacZ−VSVGと命名した。それぞれの組換えアデノウィルスは293細胞株で増幅させた後、限界希釈方法又は光学密度分析方法を用いてウィルスの力価を決定した。
ヒト肝癌細胞株であるHep3B(HB-8044, ATCC, 米国)にAd−ΔE1(E1領域全体が欠損されたアデノウィルス)、YKL−1、YCI−Ad−VSVG及び野生型アデノウィルスAd−wtをMOI(Multiplicity of infection)10でそれぞれ感染させ、2日経過後にゲノム分離キット(Qiagen, 米国)でウィルスゲノムを回収した。前記対照群ウィルスである増殖不能アデノウィルスAd−ΔE1はpCA14(Microbix)をシャトルベクターとして用いて実施例2と同一の方法で製作した。
本発明の組換えアデノウィルスYCI−Ad−VSVGのファイバー3'末端にVSV−Gエピトープが挿入されたか否かを確認するために、VSV−Gエピトープを増幅し得るようにセンスプライマー5'−GAA/GGG/GGA/TCC/GGC/GGG/GGC/GGT/GGA−3'(序列番号16)及びアンチセンスプライマー5'−CCC/GAG/CTC/ACG/TCA/CAG/TTG/CAT/ATC−3'(序列番号17)と前記Bで用いられたウィルスゲノム(Ad−ΔE1、YKL−1、及びYCI−Ad−VSVG)をテンプレートとしてPCRを前記条件通りに行った。VSV−GエピトープPCR産物を生成することが可能な陽性対群としては、VSV−Gエピトープが8個のグリシンリンカーで連結された103bpを含むクローニングベクターpSP72[805+103bp]を用いた。
アデノウィルスのファイバーにVSV−Gエピトープを挿入して誘導される対象細胞への増加した感染効率を究明するために、標識遺伝子としてLacZが発現されるdl324−LacZ−VSVGウィルスを用いていろいろの癌細胞への遺伝子伝達効率を評価した。ヒトの脳癌細胞株であるU343、U118MG(HTB-15, ATCC, 米国)、U251N及びU87MG(HTB−14, ATCC, 米国)、そしてCARの発現が低い細胞株CHO−K1(CCL-61, ATCC)、MCF−7(HTB-22, ATCC)、Pro5(CRL-1781, ATCC)及びLec2(CRL-1736, ATCC)を対象として、対照群アデノウィルスdl324−LacZ、及びVSV−Gエピトープ付きが付着されたアデノウィルスdl324−LacZ−VSVGをそれぞれいろいろの異なるMOIで感染させた後、2日後にX−gal染色を行った(図7a、図7b、図7c、図7d、図7e、図7f、図7g及び図7h)。図7aは細胞株がU343の場合を示す写真であり、図7bは細胞株がU118MGの場合を示す写真であり、図7cは細胞株がU251Nの場合を示す写真、図7dは細胞株がU87MGの場合を示す写真、図7eは細胞株がCHO−K1の場合を示す写真、図7fは細胞株がLec2の場合を示す写真、図7gは細胞株がMCF−7の場合を示す写真、図7hは細胞株がPro5の場合を示す写真である。図7a〜図7hから確認できるように、上述した全ての細胞株において、dl324−LacZ−VSVGは増加した感染効率によるLacZ遺伝子発現効率が向上したことが分かる。特に、アデノウィルスの天然受容体であるCARの発現が低くて正常的なアデノウィルスによってよく感染されないCHO−K1、MCF−7、Pro5、及びLec2細胞株においてもCARとの結合に依存せず、細胞膜に広く発現されているホスファチジルセリンによる感染で遺伝子伝達効率が著しく増加したことが分かった。
YCI−Ad−VSVGの増加した腫瘍細胞殺傷能力を究明するために腫瘍細胞株Hep3B、Hep1、HepG2、C33A、U343、U87MG、U251−N、及びMCF−7を用いた。前記細胞株を増殖不能アデノウィルスdl324/LacZ、YKL−1、及びYCI−Ad−VSVGにMOI10、1又は0.1となるように感染させた後、細胞の死滅程度を観察した。殺傷能力を可視化するために感染細胞を殆ど死滅させた視点に残っている細胞を1%クリスタルバイオレット(50%メタノール)で20分間固定し染色した後、写真を取った(図9a、図9b、図9c、図9d、図9e、図9f、図9g及び図9h)。図9aは細胞株Hep3Bに対するYCI−Ad−VSVGの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図9bは細胞株C33Aに対するYCI−Ad−VSVGの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図9cは細胞株U343に対するYCI−Ad−VSVGの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図9dは細胞株U87MGに対するYCI−Ad−VSVGの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図9eは細胞株Hep1に対するYCI−Ad−VSVGの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図9fは細胞株U251−Nに対するYCI−Ad−VSVGの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図9gは細胞株HepG2に対するYCI−Ad−VSVGの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図9hは細胞株MCF−7に対するYCI−Ad−VSVGの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真である。図9a〜図9hにおいて、1番レインはアデノウィルスdl324/LacZの場合を示し、2番レインはアデノウィルスYKL−1の場合を示し、3番レインはアデノウィルスYCI−Ad−VSVGの場合を示す。図9a〜図9hから分かるように、YCI−Ad−VSVGの殺傷能力はHep3BとU343でYKL−1に比べて約100倍程度増加し、他のいろいろの細胞株においても約10倍程度増加した殺傷能力を示した。
YCI−Ad−VSVGによる癌細胞殺傷効果の増加を定量化するために、いろいろの癌細胞を複製不可能なアデノウィルスdl324−LacZ、複製可能なアデノウィルスYKL−1、及びVSV−Gエピトープが付着された複製可能なアデノウィルスYCI−Ad−VSVGで感染させてから一定時間の経過後に細胞生存率(cell viability)を測定することが可能なMTT検定を行った。図13及び図14はヒト脳癌細胞株のU251とU343細胞株をそれぞれ5MOIのアデノウィルスで感染させた後、MTT検定を行ったものであり、図15はヒト子宮癌細胞株のHeLa細胞株を10MOIのアデノウィルスで感染させた後、MTT検定を行ったものであり、図16はヒト乳房癌細胞株のMCF−7を100MOIのアデノウィルスで感染させた後、MTT検定を行ったものである。
本実施例はヌードマウスをモデルとして、本発明の組換えアデノウィルスYCI−Ad−VSVGが生体内水準においても抗腫瘍効果に優れるかを確認するためのものである。まず、5〜6週齢のヌードマウス(Charles River Japan Inc., Japan)の腹部皮下にヒト肝癌細胞株Hep3B(HB-8044, ATCC, 米国)、ヒト脳癌細胞株U343、又はヒト脳癌細胞株U87MG(HTB-14, ATCC, 米国)を注射して腫瘍のサイズが5×5mm程度に到達したとき、本発明の組換えアデノウィルスYCI−Ad−VSVG(超遠心分離で回収してPBSで投石したウィルス)5×108pfu/50μlを腫瘍内に注射した後、2〜3日に1回ずつカリパスで腫瘍のサイズを測定した。その結果は図17、図18及び図19に示されている。
293細胞株を増殖不可能なアデノウィルスdl324−LacZ及びVSV−Gエピトープが付着されたアデノウィルスdl324−LacZ−VSVGをそれぞれ10MOIで感染させた後、24時間、48時間、72時間に上澄液と細胞ペレットを収穫し、これらの中にあるアデノウィルスの総生産量(viral titer)を測定した。その結果は表1に示す。また、その結果は図20のグラフで示される。
以上説明したように、本発明は、アデノウィルスに水疱性口内炎ウィルスの感染リガンドの一部のみを導入させて治療効能を向上させた組換えアデノウィルス及びこれを含む薬剤学的組成物に関するものである。本発明によれば、低調な感染効率を有するいろいろの細胞に対する感染効率を増加させることにより、これによる遺伝子形質導入の増加と細胞内ウィルスの複製量が増加して治療効果を向上させることができるうえ、既に治療効果のある細胞では増加した感染効率によって治療に必要なウィルスの投与量を減少させて人体組織における免役反応を最少化させることにより、放射線治療と薬物治療のような既存の治療法との並行療法によって治療効果を極大化するなど、新しい治療法の開発に活用できるであろう。
Claims (16)
- アデノウィルスに、配列番号9に記載されたアミノ酸配列からなるVSV−Gエピトープを含んだ蛋白質が連結されている組換えアデノウィルスであって、該アデノウィルスのファイバー蛋白質に該VSV−Gエピトープを含んだ蛋白質が連結されていることを特徴とする組換えアデノウィルス。
- 前記アデノウィルスが複製能を保有することを特徴とする請求項1記載の組換えアデノウィルス。
- 前記アデノウィルスは複製不可能であり、治療遺伝子を含有することを特徴とする請求項1記載の組換えアデノウィルス。
- 前記アデノウィルスはE1B55kDa、E1B19kDa又はE1B19kDa/E1B55kDaが消失されたものであることを特徴とする請求項1記載の組換えアデノウィルス。
- 前記アデノウィルスのファイバーがノブ(knob)部位であることを特徴とする請求項1記載の組換えアデノウィルス。
- 前記アデノウィルスのファイバーノブ部位がHIループ、ペントンベース又はファイバー末端部位であることを特徴とする請求項5記載の組換えアデノウィルス。
- 前記アデノウィルスのファイバーとVSV−Gエピトープとの間にリンカーが連結されていることを特徴とする請求項1記載の組換えアデノウィルス。
- 前記リンカーが5個〜15個のアミノ酸から構成されることを特徴とする請求項7記載の組換えアデノウィルス。
- 前記アミノ酸がグリシン又はアラニンであることを特徴とする請求項8記載の組換えアデノウィルス。
- 前記組換えアデノウィルスがKCCM−10423であることを特徴とする請求項1記載の組換えアデノウィルス。
- (a)アデノウィルスのファイバー蛋白質に、配列番号9に記載されたアミノ酸配列からなるVSV−Gエピトープを含んだ蛋白質が連結されている組換えアデノウィルスの治療学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物。
- 前記アデノウィルスが、E1A遺伝子を含んだアデノウィルスである、請求項11記載の薬剤学的組成物。
- 前記アデノウィルスが、E1A遺伝子が欠失もしくは変異され治療遺伝子を含んだアデノウィルスである、請求項11記載の薬剤学的組成物。
- 前記組換えアデノウィルスがKCCM−10423であることを特徴とする請求項11記載の薬剤学的組成物。
- 請求項1記載の組換えアデノウィルスを発現する組換えプラスミド。
- 請求項15記載の組換えプラスミドで形質転換又は形質感染された宿主細胞。
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