CN100487125C - 含有VEGFR的截断型可溶性cDNA的重组腺相关病毒及含有上述成分的基因治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用VEGF受体蛋白质(VEGFR)的truncated solublecDNA和腺相关病毒(AAV)系统的基因治疗剂，尤其是一种包括含有VEGFR的truncated solublec DNA的rAAV载体及含有上述载体和VEGF-A反义(antisense)cDNA的rAAV载体的大肠癌、膀胱癌及/或肺癌特异性基因治疗剂。本发明的基因治疗剂通过抑制参与肿瘤的增殖及转移所必需的新生血管的生长的VEGF的表达及功能，从而减少肿瘤的生长并从基因的层面上有效治疗癌症。

Description

含有VEGFR的截断型可溶性cDNA的重组腺相关病毒及含有上述成分的基因治疗剂
技术领域
本发明涉及一种利用VEGF受体蛋白质(VEGFR)的truncated solublecDNA和利用腺相关病毒(AAV)系统的基因治疗剂，尤其是一种包括含有VEGFR的truncated solublec DNA的rAAV载体及含有上述载体和VEGF-A反义(antisense)cDNA的rAAV载体的大肠癌、膀胱癌及/或肺癌特异性基因治疗剂。
背景技术
不管在国内外，癌症死亡率呈逐年增加的趋势。在全世界，癌症与感染性疾病及心血管疾病成为人类死亡的主要原因。根据世界卫生组织(WHO)的世界健康报告(World Health Report)，在2004年，占总死亡人数的12.5％的7,121,00人死于癌症。而且因为饮食习惯，环境的变化及寿命的延长，预计在今后的25年内，致癌人数将以每年3千万的速度增加，而其中的2千万将死于癌症。
当前，用于癌症治疗的方法大致分为外科手术、放射线治疗及药物治疗，而在治疗癌症的过程中，采用一种或一种以上的治疗方法。通常，外科手术适用于癌症的各个阶段。初期阶段的癌症一般都可以采用外科手术的方法进行治疗，但如果癌症恶化或发生转移，则很难用单纯的外科手术进行治疗，因此并用放射线治疗或药物治疗。放射线治疗是利用从外部照射的放射线或射入到体内的放射性物质所产生的X-线或γ-线照射癌细胞，由此对癌症进行治疗。药物治疗是通过口服或注射的方式将抗癌剂注入体内，从而破坏或抑制癌细胞增殖所需的DNA或相关的酶的方法。比起其它的方法，药物治疗的优点是药物可以针对人体任何部位的癌症，而且能够对发生转移的癌症进行治疗。因此，现在药物治疗是转移性癌症治疗的主要方法。当然，转移的癌症不能单靠药物治疗痊愈，但可以起到缓解症状并延长寿命的重要作用。但是，成为药物疗法的主流的化学治疗剂存在副作用较多，抗癌剂耐性强等问题。
但是，随着生命科学的领域的快速发展，生物治疗剂得到了长足的发展。生物治疗剂通过恢复或增强人体自身的免疫功能来削弱癌细胞的活动能力并遏制癌症的恶化。如果人体的免疫系统正常发挥作用，则可以有效地杀灭癌细胞，反之，则癌细胞容易增殖或受到其它病原菌的攻击。为了弥补上述缺点，生物治疗剂还可配合手术疗法、放射线疗法及化学治疗剂等其他治疗方法。
当前，最受生命科学领域关注的生物治疗剂是反义抗癌剂及血管生成抑制剂。反义抗癌剂利用能够与癌细胞的特异性mRNA互补结合的DNA片断，阻碍mRNA的处理(processing)或蛋白质的表达(expression)，从而促使癌细胞死亡。因为得益于人类基因组计划的发展，可读出30,000多个基因的序列，而且掌握了100,000个mRNA的序列。因此也掌握了大量与癌细胞相关的mRNA候补群的信息，从而筛选出针对信息传递体系相关的基因和细胞死亡(apoptosis)及细胞增殖相关的基因的反义抗癌剂进行临床实验。
肿瘤的生长需要生成(angiogenesis)新的血管供应所需氧气及营养。一般而言，随着癌细胞的增殖肿瘤的内部将处于低氧状态，从而导致组织的坏死。另外，因为肿瘤自身的压力破坏血管，使上述低氧状态恶化。为了克服上述低氧状态，肿瘤将表达与新血管生成相关的因子(VEGF、bFGF、IL-8、PDGF及PD-EGF等)并由此促进新血管的生成。即，对于肿瘤的生长，新血管的生成是必需的过程。
新血管生成抑制剂通过阻碍上述肿瘤的新血管生成，抑制肿瘤的生长，从而达到治癌的目的。直接的新血管生成抑制剂阻碍血管内皮细胞的增殖及移动或抑制对新血管生成因子的反应，从而抑制新血管的生成。直接的新血管生成抑制剂具有较少诱发获得性抗药性(acquired drugresistance)的优点。间接的新血管生成抑制剂抑制活化新血管生成的肿瘤内的蛋白的表达，从而阻断上述肿瘤蛋白与血管内皮细胞表面受体之间的结合，从而抑制新血管的生成。
如上所述，从治疗方面的变化来看，是从利用人工合成的化学物质变化为利用人体内天然物质的方向发展。尤其是，通过对各种领域的基因研究，发现了成为各种疾病的病因的基因。为了将上述研究结果联系到临床治疗或预防，将可以矫正功能消失或变形的基因导入体内，从而恢复正常的基因功能或活化治疗功能的基因传递技术的研究，即对基因治疗(gene therapy)领域的研究活动展开得相当活跃。在上述基因治疗领域，随着近年来的关注和研究，其研究结果也陆续显现。
基因疗法是通过基因传递及表达治疗疾病的方法，与药物疗法不同，它是针对有缺陷的特定基因矫正基因性缺陷的疗法。基因治疗的最终目标是对存活的细胞进行基因性变形，从而取得有益的治疗效果。上述疗法因为能够准确地将基因传递至患病部位，能够在人体内完全分解，没有毒性及免疫抗原性及基因能够长时间稳定表达等优点，对于治疗疾病而言是无可厚非的最佳疗法。
基因治疗的主要研究领域包括导入对特定的疾病具有治疗效果的基因，为了对抗癌剂等表现抵抗性而增强正常细胞的抵抗功能或替代因各种基因性疾病而变形或消失的基因等。
基因疗法大致分为体内(in vivo)和体外(in vitro)两种。in vivo基因疗法是将治疗基因直接注入到体内的方法，而in vitro基因疗法是首先在试管内培养目标细胞(target cell)并在上述细胞内导入基因之后，将基因变形的细胞重新注入体内的方法。在现有的基因疗法中，相比invivo基因疗法，in vitro基因疗法的使用更普遍。
基因传递技术大致可分为将病毒作为载体的方法(viral vector-basedtransfer method)、利用合成磷脂或合成阳离子高分子的非病毒性方法(non-viral delivery method)以及通过对细胞膜进行瞬间的电刺激导入基因的电穿孔(electroporation)方法等物理性方法。
在上述基因传递技术中，利用病毒载体的方法因为可利用带有被治疗基因代替的基因的部分或整体复制能力缺损的载体有效传递基因，所以是基因治疗的首选方法。可用作病毒载体的病毒主要有RNA病毒载体(逆转录病毒载体及慢病毒载体等)和DNA病毒载体(腺病毒载体及腺相关病毒载体等)，此外还有单纯疱疹病毒载体(herpes simplex viralvector)和Alpha病毒载体(alpha viral vector)。其中，广泛用于研究的是逆转录病毒和腺病毒。
对宿主细胞的基因组具有整合功能的逆转录病毒(Retrovirus)的特征为虽然对人体无害，但在进行整合时抑制正常细胞的功能，能够被各种细胞感染，容易增殖，能够收容1～7kb左右的外部基因及具有生成复制缺陷型病毒的能力。但是，同时还具有难以被有丝分裂之后的细胞感染，in vivo状态下基因传递难以进行基因传递以及体细胞组织始终需要在in vitro环境中进行增殖等缺点。另外，因为逆转录病毒能够被原癌基因(proto-oncogene)整合，因此存在基因突变的危险，而且也能使细胞坏死。
另外，腺病毒(Adenovirus)作为克隆载体(cloning vector)具有各种优点，如能够在一般大小的细胞核内进行复制，临床上无毒性，插入外部基因之后状态稳定，不会发生基因的重新排序或损失现象，能够转化(transformation)真核生物，即使被宿主细胞的染色体整合其状态较稳定，而且完成高水平的表达。腺病毒的好的宿主细胞是人类的造血、淋巴及骨髓的成因。但因为是线状DNA，因此难以增殖，难以恢复被感染的病毒及病毒感染率低。另外，所传递的基因的表达在1～2周后最多，而在部分细胞中只能维持3～4周的表达时间。另外，最大的问题是具有较高的免疫抗原性。
腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)不仅能够弥补上述问题，而且还具有许多其他的优点，因此最近较为广泛使用。AAV为一株前病毒(Provirus)，因此复制时需要辅助病毒，而且AAV基因组(genome)为4,680bp，因此可插入于感染细胞染色体19号特定部位。转基因(trans-gene)可插入于通过各145bp的两个反向末端重复(invertedterminal repeat，ITR)序列部分和信号序列(signal sequence)部分相连的质粒DNA(plasmid DNA)。与表达AAV rep部分和cap部分的其他质粒DNA一起进行转染(transfection)，而腺病毒作为辅助病毒添加。AAV具有传递基因的宿主细胞的范围较广，反复注入时免疫副作用少，基因表达时间长等优点。尤其是，即使AAV基因组被宿主细胞的染色体整合也较安全，不会改变或重新排列宿主的基因表达。
1994年，含有CFTR基因的AAV载体在囊肿性纤维化(cysticfibrosis)的治疗方面得到NIH的认可之后，广泛用于各种疾病的临床治疗上。包含作为血凝因子的因子IX基因(factor IX gene)的AAV载体用于B型血友病(hemophilia B)的治疗，而且正在进行利用AAV载体的A型血友病(hemophilia A)的治疗剂的开发。另外，含有各种抗癌基因的AAV载体可用作肿瘤的疫苗。
作为利用VEGF的基因治疗法的一例，有为了治疗肺循环高压而包含能够对血管成形因子加密的核酸的重组缺损腺病毒(大韩民国申请专利：10-2001-7013633)，但上述疗法因为使用了VEGF盐基序列，因此只能用在缺血性疾病的治疗，而不能用在新血管生成疾病，尤其是癌的治疗上。而且，腺病毒因为具有较高的免疫抗原性，对宿主细胞的感染性低及表达时间短的缺点，因此不适合用在治疗上。
用在癌症治疗的多肽的研究已进行了很多，但上述大部分物质属于化学治疗剂。另外，虽然对多聚核苷酸的研究也仍在继续，但在关于通过病毒载体有效地移动到体内的方法的研究上没有大的突破。
另外，本发明的发明小组研究表明含有VEGF-A的反义cDNA的rAAV-AShVEGF-A载体(KR10-2004-54043)、VEGF-A、VEGF-B及含有VEGF-C的反义eDNA的rAAV-AShVEGF-ABC载体(PCT/KR2005/002435)为有效的基因治疗剂并对其申请了专利。与此同时，也对包括含有VEGF-A的反义cDNA的rAAV-AShVEGF-A载体、含有VEGFR-1 truncated soluble cDNA的rAAV-TShVEGFR-1载体及VEGFR-2 truncated soluble cDNA的rAAV-TShVEGFR-2载体的癌症基因治疗剂也申请过专利(KR 10-2005-67661)。
为了开发出更有效的癌症基因治疗剂，本发明的发明小组经过不断的努力和探索，制作出在抗癌效果较好的rAAV载体插入VEGFRtruncated soluble cDNA的rAAV-TShVEGFR-1及rAAV-TShVEGFR-2，并确认包括含有上述rAAV-hVEFGR-1和rAAV-hVEFGR-2及VEGF-A反义cDNA的rAAV载体的基因治疗剂在in vivo上具有出色的肿瘤抑制效果，从而完成了本发明。
发明内容
本发明涉及一种含有VEGFR-1 truncated soluble cDNA的rAAV载体及含有VEGFR-2 truncated soluble cDNA的rAAV载体。
本发明还涉及一种包括含有上述VEGFR-1 truncated soluble cDNA的rAAV载体、含有VEGFR-2 truncated soluble cDNA的rAAV载体及含有VEGF-A反义cDNA的rAAV载体的大肠癌、膀胱癌及/或肺癌特异性基因治疗剂。
对本发明的其他特点及实施例，将通过下述详细说明及所附权利要求书进行更详细的说明。
附图简单说明
图1为rAAV-AShVEGF-A载体的粒子滴定标准曲线；
图2为rAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP载体的粒子滴定标准曲线；
图3为rAAV-TShVEGFR-1-GFP载体的粒子滴定标准曲线；
图4为rAAV-TShVEGFR-2-GFP载体的粒子滴定标准曲线；
图5为rAAV-IRES-EGFP载体的粒子滴定标准曲线；
图6为rAAV-EGFP载体的粒子滴定标准曲线；
图7为测定rAAV-AShVEGF-A的转导效率的共焦显微镜照片；
图8为测定rAAV-TShVEGFR-1的转导效率的共焦显微镜照片；
图9为测定rAAV-TShVEGFR-2的转导效率的共焦显微镜照片；
图10为测定rAAV-IRES-GFP的转导效率的共焦显微镜照片；
图11为显示各癌细胞株中rAAV-AShVEGF-A载体的VEGF量减少效果的示意图；
图12为显示注射本发明的rAAV载体的肿瘤tumor模型裸小鼠身上肿瘤体积变化示意图。
发明的详细说明及优选实施例
本发明涉及一种通过(a)将含有SEQ ID NO：4的VEGFR-1的truncated soluble cDNA的pAAV载体、AAV rep-cap质粒DNA及腺病毒辅助质粒转染至动物细胞株的步骤；(b)培养上述被转染的动物细胞株的步骤；及(c)破碎经培养的上述细胞株并分离提纯重组rAAV粒子的步骤制作而成，并含有SEQ ID NO：4的VEGFR-1的truncated solublecDNA的rAAV载体。
另外，本发明还涉及一种通过(a)将含有SEQ ID NO：9的VEGFR-2的truncated soluble cDNA的pAAV载体、AAV rep-cap质粒DNA及腺病毒辅助质粒转染至动物细胞株的步骤；(b)培养上述被转染的动物细胞株的步骤；及(c)破碎经培养的上述细胞株并分离提纯重组rAAV粒子的步骤制作而成，并含有SEQ ID NO：9的VEGFR-2的truncated solublecDNA的rAAV载体。
在本发明中，当注入上述含有VEGFR-1的truncated soluble cDNA的rAAV载体、含有VEGFR-2的truncated soluble cDNA的rAAV载体及含有VEGF-A反义cDNA的rAAV载体之后，进行in vivo实验的结果，肿瘤的体积明显减少。
因此，本发明还涉及一种包括上述含有VEGFR-1的truncated solublecDNA的rAAV载体、含有VEGFR-2的truncated soluble cDNA的rAAV载体及含有SEQ ID NO：1的VEGF-A反义cDNA的rAAV载体的大肠癌、膀胱癌及/或肺癌特异性基因治疗剂。
实施例
下面，将对本发明的具体实施例进行说明，但一下实施例仅用以说明本发明而非限制，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明进行修改、变形或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围。
实施例1：含有抑制新生血管功能的基因的pAAV质粒克隆
根据克隆方法为了利用pAAV-FIX cis plasmid DNA(US6,093,292)向反义方向把VEGF-A(NCBI accession # NM_003376 for human)cDNA插入于pAAV-FIX cis plasmid DNA，用VEGF-A isoform的反义cDNA替代包含于pAAV-FIX cis plasmid DNA中的factor IX cDNA基因，从而制作pAAV-AShVEGF-A的trans-gene constructs。另外，制作VEGF-Aisoform反义cDNA连接于IRES-EGFP的pAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP的trans-gene constructs。
作为与VEGF的三种isoform作用的受体的VEGFR-1(Flt-1；NCBIaccession#NM_002019 for human)和VEGFR-2(Kdr/Flk-1；NCBIaccession # AF063658 for human)的truncated soluble cDNA也用相同的方法插入或替代，从而制作pAAV-TShVEGFR-1及pAAV-TShVEGFR-2的trans-gene constructs。与此同时，在VEGF受体蛋白质cDNA中附加(tagging)GFP而制作pAAV-TShVEGFR-1-GFP及pAAV-TShVEGFR-2-GFP的两种trans-gene constructs，而且为了确认以上六种质粒而利用测序(sequencing)方法进行详细分析。trans-gene始终插入于通过各145bp的两个末端反向重复序列部分(ITR)和humancytomegaloVirus(CMV)immediate early promoter，SV40 early mRNApolyadenylation signal序列部分相连的质粒DNA中。
(1)pAAV-AShVEGF-A的制作
从HUVEC(Cambrex Bio Science Walkersville，Inc.，USA)细胞提取RNA来合成cDNA，而且利用下述AShVEGF-A primer通过RT-PCR方法对429bp的人类VEGF-A isoform反义cDNA(SEQ ID NO：1)进行扩增。将扩增片断利用限制酶KpnI及XhoI进行处理之后，与用相同的限制酶切断的pAAV-FIX cis质粒DNA进行连接(ligation)，从而制作pAAV-AShVEGF-A。
AShVEGF-A F2(SEQ ID NO：2)：GGGGTACCGTCTTGCTCTATCTTTC
                              KpnI
AShVEGF-A R1(SEQ ID NO：3)：
CCCTCGAGGGCCTCCGAAACCATGAACT
   XhoI
(2)pAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP的制作
将pEGFP-N1质粒DNA(Clontech，USA)利用限制酶KpnI及NotI进行处理，从而准备linearized insert之后，将上述pAAV-FIX cis plasmidDNA用限制酶KpnI及NotI进行处理并与上述insert进行连接，从而制作pAAV-EGFP。
将pIRES2-EGFP质粒DNA(Clontech，USA)利用限制酶NheI进行处理，用Klenow片断blunt之后，利用限制酶NotI进行处理，准备linearized insert，而后将上述pAAV-EGFP质粒DNA用限制酶KpnI进行处理并利用T4 DNA聚合酶blunt之后，与利用限制酶NotI进行处理的linearized载体进行连接，从而制作出pAAV-IRES-EGFP。
将上述pAAV-IRES-EGFP质粒利用限制酶BamHI进行处理并将上述所制作的pAAV-AShVEGF-A质粒DNA利用限制酶BamHI进行处理，从而连接上述两个DNA片断而制作出pAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP。
(3)pAAV-TShVEGFR-1的制作
从癌细胞株LCSC#1细胞(WO 02/061069)提取RNA而合成cDNA，并利用下述TShVEGFR-1 F1及TShVEGFR-1 R3 primer通过RT-PCR方法对1968bp的truncated soluble human VEGFR-1受体cDNA(SEQ IDNO：4)进行扩增。将扩增片断利用限制酶KpnI及XhoI进行处理之后，与用相同的限制酶切断的pAAV-FIX cis质粒DNA进行连接，从而制作出pAAV-TShVEGFR-1。
TShVEGFR-1 F1(SEQ ID NO：5)：
AAGGTACCGCCACCATGGTCAGCTACTGGGACA
   Kpn IKozak
TShVEGFR-1 R3(SEQ ID NO：6)：
CGCTCGAGCTATCTGATTGTAATTTCTTTCTTCTG
Xho I stop codon
(4)pAAV-TShVEGFR-1-GFP construct的克隆
从癌细胞株LCSC#1细胞提取RNA而合成cDNA，并利用上述TShVEGFR-1 F1及下述TShVEGFR-1 R1 primer通过RT-PCR方法对1969bp的truncated soluble human VEGFR-1受体cDNA(SEQ ID NO：7)进行扩增。将扩增片断利用限制酶KpnI及ApaI进行处理之后，与用相同的限制酶切断的pAAV-EGFP质粒进行连接，从而制作出在truncatedsoluble VEGFR-1 cDNA上标记有GFP标记蛋白的
pAAV-TShVEGFR-1-GFP。
TShVEGFR-1 R1(SEQ ID NO：8)：
CCGGGCCCCTCTGATTGTAATTTCTTTCTTCTG
   Apa I
(5)pAAV-TShVEGFR-2的制作
从癌细胞株LCSC#1细胞提取RNA而合成cDNA，并利用下述TShVEGFR-2 F1及TShVEGFR-2 R2引物(primer)通过RT-PCR方法对2402bp的truncated soluble human VEGFR-2受体cDNA(SEQ ID NO：9)进行扩增。将扩增片断利用限制酶KpnI及XhoI进行处理之后，与用相同限制酶切断的pAAV-FIX cis质粒DNA进行连接，从而制作出pAAV-TShVEGFR-2。
TShVEGFR-2F1 (SEQ ID NO：10)：
GGGGTACCGCCACCATGGAGAGCAAGGTGCT
   Kpn I Kozak
TShVEGFR-2 R2(SEQ ID NO：11)：
CGCTCGAGTTAGCCTGTCTTCAGTTCCCCTCCATT
Xho I stop codon
(6)pAAV-TShVEGFR-2-GFP construct的克隆
从细胞株LCSC#1细胞提取RNA而合成cDNA，并利用上述TShVEGFR-2F1及下述TShVEGFR-2 R1 primer通过RT-PCR方法对2397bp的truncated soluble human VEGFR-2受体cDNA(SEQ ID NO：12)进行扩增。将扩增片断用限制酶KpnI及ApaI进行处理之后，与用相同限制酶切断的pAAV-EGFP质粒进行连接，从而制作出在truncated solubleVEGFR-1 cDNA上标记有GFP标记蛋白的pAAV-TShVEGFR-2-GFP。
TShVEGFR-2 R1(SEQ ID NO：13)：
CCGGGCCCGTGTCTTCAGTTCCCCTCCA
   Apa I
实施例2：制作抑制新生血管基因治疗剂的rAAV载体
为了制作用于基因治疗的重组AAV(rAAV)载体，除了实施例1中所制作的各pAAV质粒DNA之外，还需要表达AAV rep部分和cap部分的AAV rep-cap质粒DNA(pAAV-RC质粒，Stratagene Co.，USA)和腺病毒辅助质粒(pHelper质粒，Stratagene Co.，USA)。将上述三种质粒DNA全部转染至HEK293(human embryonic kidney 293；ATCCCRL-1573)细胞并培养96小时之后，搜集HEK293细胞并进行超声波破碎，对重组AAV(rAAV)particle重复三次CsCl密度梯度离心分离，而后搜集RI(Refractive Index)为1.37～1.41g/ml的部分进行提纯分离。
上述经分离的rAAV particles的滴定(titration)方法如下：制作CMV启动区(promoter)部位的PCR primer[CMV F1(SEQ ID NO：14)：5′-GGGCGT GGA TAG CGG TTT GAC TC-3′及CMV R1(SEQ ID NO：15)：5′-CGG GGC GGG GTT ATT ACG ACA TT-3′]并通过定量(Quantitative)PCR方法进行滴定。此时，将已知浓度的各pAAV质粒DNA用作标准物质，而且可以确认通过上述方法分离产生的重组rAAV载体通常含有1012～1013viral particles/ml的rAAV particle titer。
下面，说明各rAAV的粒子滴定结果。
(1)rAAV-AShVEGF-A的粒子滴定
连续稀释利用分光光度计测定浓度的pAAV-AShVEGF-A DNA并完成标准曲线PCR之后，将不同浓度的电泳结果显示在图1a的左侧面板。从左开始依次显示104～108分子数的试料，而各条的经扩增的DNA带的强度利用Imager densitometer(Alpha Innotech，USA)来测定。
连续稀释上述提纯分离的rAAV-AShVEGF-A载体并完成粒子滴定PCR之后，将不同浓度的电泳结果显示在图1a的右侧面板。从左依次显示10-3～100稀释倍数的试料，而各条的经扩增的DNA带的强度利用Imager densitometer来测定。
用上述标准曲线用PRC结果做出右侧面板上的标准曲线，而将上述粒子滴定用PCR结果适用于标准曲线而得出5×1011viral particles/ml的滴定量(titer)(图1b)。
(2)rAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP的粒子滴定
连续稀释利用分光光度计测定浓度的
pAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP DNA并完成标准曲线用PCR之后，将不同浓度的电泳结果显示在图2a的左侧面板。从右开始依次显示103～109分子数的试料，而各条经扩增的DNA带的强度用Imager densitometer(Alpha Innotech，USA)来测定。
连续稀释上述提纯分离的rAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP载体并完成粒子滴定用PCR之后，将不同浓度的电泳结果显示在图2a的右侧面板。从右依次显示10-4～100稀释倍数的试料，而各条经扩增的DNA带的强度用Imager densitometer来测定。
利用上述标准曲线用PCR结果制作右侧面板上的标准曲线，而将上述粒子滴定用PCR结果适用于标准曲线而得到1.55×1011viralparticles/ml的滴定量(titer)(图2b)。
(3)rAAV-TShVEGFR-1-GFP的粒子滴定
连续稀释利用分光光度计测定浓度的pAAV-TShVEGFR-1-GFPDNA并完成标准曲线用PCR之后，将不同浓度的电泳结果显示在图3a的左侧面板。从左开始依次显示103～108分子数的试料，而各条的经扩增的DNA带的强度用Imager densitometer(Alpha Innotech，USA)来测定。
连续稀释上述提纯分离的rAAV-TShVEGFR-1-GFP载体并完成粒子滴定用PCR之后，将不同浓度的电泳结果显示在图3a的右侧面板。从左依次显示10-4～100稀释倍数的试料，而各条经扩增的DNA带的强度用Imager densitometer来测定。
利用上述标准曲线用PRC结果作出右侧面板上的标准曲线，而将上述粒子滴定用PCR结果适用于标准曲线而得出1.36×1011viralparticles/ml的滴定量(titer)(图3b)。
(4)rAAV-TShVEGFR-2-GFP的粒子滴定
连续稀释利用分光光度计测定浓度的pAAV-TShVEGFR-2-GFPDNA并完成标准曲线用PCR之后，将不同浓度的电泳结果显示在图4a的左侧面板。从左开始依次显示103～108分子数的试料，而各条经扩增的DNA带的强度用Imager densitometer(Alpha Innotech，USA)来测定。
连续稀释上述提纯分离的rAAV-TShVEGFR-2-GFP载体并完成粒子滴定用PCR之后，将不同浓度的电泳结果显示在图4a的右侧面板。从左依次显示10-4～100稀释倍数的试料，而各条经扩增的DNA带的强度用Imager densitometer来测定。
利用上述标准曲线用PRC结果作出右侧面板上的标准曲线，而将上述粒子滴定用PCR结果适用于标准曲线而得出1.12×1012viralparticles/ml的滴定量(titer)(图4b)。
(5)rAAV-IRES-EGFP的粒子滴定
连续稀释利用分光光度计测定浓度的pAAV-IRES-EGFP DNA并完成标准曲线用PCR之后，将不同浓度的电泳结果显示在图5a的左侧面板。从右开始依次显示103～108分子数的试料，而各条经扩增的DNA带的强度用Imager densitometer(Alpha Innotech，USA)来测定。
连续稀释上述提纯分离的rAAV-IRES-EGFP载体并完成粒子滴定用PCR之后，将不同浓度的电泳结果显示在图5a的右侧面板。从右依次显示10-4～100稀释倍数的试料，而各条经扩增的DNA带的强度用Imagerdensitometer来测定。
利用上述标准曲线用PRC结果作出右侧面板上的标准曲线，而将上述粒子滴定用PCR结果适用于标准曲线而得出8.91×1011viralparticles/ml的滴定量(titer)(图5b)。
(6)rAAV-EGFP
Figure C200610000071D0018114834QIETU
粒子滴定
连续稀释利用分光光度计测定浓度的pAAV-EGFP DNA并完成标准曲线用PCR之后，将不同浓度的电泳结果显示在图6a的左侧面板。从右开始依次显示105～109分子数的试料，而各条经扩增的DNA带的强度用Imager densitometer(Alpha Innotech，USA)来测定。
连续稀释上述提纯分离的rAAV-EGFP载体并完成粒子滴定用PCR之后，将不同浓度的电泳结果显示在图6a的右侧面板。从右依次显示10-3～100稀释倍数的试料，而各条经扩增的DNA带的强度用Imagerdensitometer来测定。
利用上述标准曲线用PRC结果作出右侧面板上的标准曲线，而将上述粒子滴定用PCR结果适用于标准曲线而得出5.36×109viralparticles/ml的滴定量(titer)(图6b)。
实施例3：癌细胞株培养及rAAV载体基因治疗剂的处理
为了研究in vitro状态下防止癌转移性的抗癌效果，在各细胞株的生长的最佳条件下培养人体大肠癌细胞株(T84：ATCC CCL-248)、人体肺癌细胞株(LCSC#1：WO 02/061069)及人体胃癌细胞株(NUGC3、MKN45、MKN74)等五种癌细胞株。为了实验对上述癌细胞株的重组rAAV的抗癌治疗效果，将上述癌细胞株在6 well plate上各分株105cells/well培养24小时之后，添加总M.O.I.为105的各种组合的新生血管抑制rAAV载体并培养24小时。在本实施例中负控制(negative control)选用未对rAAV进行处理的相同细胞群及未插入VEGF反义并只表达GFP的rAAV载体(rAAV-EGFP)，并在与实施例2的重组rAAV相同的条件下进行处理之后使用。对rAAV载体进行过处理的细胞，则用1xPBS进行两次清洗之后重新添加最佳条件的新的培纸并培养72小时。
实施例4：测定癌细胞株的转导作用效率
经培养的细胞的转导作用(transduction)的效率是利用共焦显微镜(confocal microscopy)监控GFP蛋白的表达来进行测定的。
在实施例2中制造出的rAAV载体中，将表达GFP的rAAV向实施例3的五种癌细胞株(T84、LCSC#1、MKN45、MKN74及NUGC3)以其总M.O.I.为105的条件进行24小时的处理，并在经过48小时之后通过共焦显微镜方法(excitation 488nm；emission>500nm)监控GFP蛋白的表达，从而测定转导作用效率。预计rAAV-AShVEGF-A-IRES-EGFP能够Bicistronic地独立表达GFP蛋白，而且因为rAAV-TShVEGFR-1-GFP及rAAV-TShVEGFR-2-GFP载体能够表达附着有GFP蛋白的fusion蛋白，从而可通过监控GFP蛋白的表达测定infection效率。另外，使用未对rAAV载体进行任何处理的阴性对照群细胞核经rAAV-IRES-EGFP处理的细胞对照群，一并监控GFP蛋白的表达。
结果，如FIGs.7～10所示，将上述四种rAAV载体感染至五种癌细胞株的结果，转导作用效率将近100％，因此表明rAAV非常适合做基因治疗用载体。
实施例5：利用ELISA的癌细胞株内的rAAV载体的新生血管抑制效果
(1)测定rAAV-AShVEGF-A载体的VEGF量减少效果
将rAAV-AShVEGF-A载体向三种胃癌细胞株(NUGC3、MKN74及MKN45)、一种肺癌细胞株(LCSC#1)及一种大肠癌细胞株(T84)以总M.O.I为105的条件进行24小时处理，经72小时之后破碎细胞准备细胞lysate。作为对照群使用了未对rAAV载体进行任何处理的细胞群和对rAAV-EGFP载体进行处理的细胞群。对各细胞lysates的蛋白进行定量，利用10μg的总蛋白的lysates进行ELISA(RPN2779，AmershamBiosciences，USA)，而根据rAAV-AShVEGF-A载体处理的VEGF的量的变化繁复测定了三次。
结果，如图11及表1所示，在大肠癌细胞株T84上，比起对rAAV-EGFP载体进行处理的control群，对rAAV-AShVEGF-A载体进行处理的细胞群的VEGF的量减少了55％以上。而在肺癌细胞株LCSC#1上，比起control细胞群，VEGF的量减少了45％左右。相反，在三种胃癌细胞株上，几乎看不到VEGF的量的变化。
表1：根据rAAV-AShVEGF-A处理的癌细胞株的VEGF的量的变化
 
T84 MKN74 MKN45 NUGC3 LCSC#1
negative 20.32±0.28 2.95±0.37 19.13±0.67 16.13±0.95 4.78±0.18
GFP 26.62±0.71 3.69±0.31 11.92±0.72 13.55±0.55 5.27±0.24
AShVEGF-A 11.62±1.74 2.65±0.10 12.5±0.37 12.91±0.09 2.92±0.36
实施例6：新生血管抑制in vivo抗癌效果研究
向BABL/c裸小鼠(BABL/c nu/nu mouse，(株)中央实验动物，JapanSLC，Inc.)的皮下注射NCI-H460人体肺癌细胞株(ATCC HTB-177)5 x 106个而制作出tumor model。
当上述注入癌细胞的BABL/c裸小鼠的肿瘤体积达到200～300mm3，则利用尾静脉注射(tail vein injection)的方法转导1011～1012viralparticles/l个体的各种组合的rAAV载体(rAAV-AShVEGF-A、
rAAV-TShVEGFR-1、rAAV-TShVEGFR-2、
[rAAV-TShVEGFR-1+rAAV-TShVEGFR-2]及
[rAAV-TShVEGFR-1+rAAV-TShVEGFR-2+rAAV-AShVEGF-A])。在转导作用之后的四周内，对动物的一般症状(一般状态、活动性、外观、自律神经及死亡与否)进行观察，检测体重并利用电子测径器(Absolutedigimatic，Mitutoyo Corp.，Japan)测定肿瘤体积。转导作用之后的第28天对老鼠进行尸体解剖并从中分离出实体癌(solid cancer)之后，利用Digital Plethysmometer(LE7500，Letica，Spain)测定肿瘤体积。切除各脏器(肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺、睾丸及副睾丸)和肿瘤之后，用10％中性福尔马林及Bouin Solution(对于肿瘤、睾丸及副睾丸的情况)固定脏器并制作成石蜡包埋切片，以供进行免疫组织化学及组织学分析。为了测定内皮细胞的细胞密度，利用anti-CD34抗体进行免疫组织化学分析，并通过苏木精/曙红的染色进行组织学分析。
结果，如图12所示，比起注射HEPES的阴性对照组，注射rAAV-AShVEGF-A、rAAV-TShVEGFR-1、rAAV-TShVEGFR-2、[rAAV-TShVEGFR-1+rAAV-TShVEGFR-2]及[rAAV-TShVEGFR-1+rAAV-TShVEGFR-2+rAAV-AShVEGF-A]的群，其肿瘤体积变得更小，尤其是，注射[rAAV-TShVEGFR-1+rAAV-TShVEGFR-2+rAAV-AShVEGF-A]的群的肿瘤体积明显减少。
以上实施例仅用以说明本发明而非限制，尽管参照以上较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明进行修改、变形或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
产业利用性
如上所述，本发明具有提供基因治疗用的含有VEGFR-1的truncatedsoluble cDNA或VEGFR-2的truncated soluble cDNA的rAAV载体的效果。另外，本发明还具有提供包括含有VEGFR的truncated soluble cDNA的rAAV载体和含有上述VEGFR的truncated soluble cDNA的rAAV载体及VEGF-A反义cDNA的rAAV载体的大肠癌、膀胱癌及/或肺癌特异性基因治疗剂的效果。
本发明的基因治疗剂通过抑制参与肿瘤的增殖及转移所必需的新生血管的生长的VEGF的表达及功能，从而减少肿瘤的生长并从基因的层面上治疗癌症。
FP05KR065.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>忠清北道(CHUNG CH0UNG BUK DO)
<120>含有VEGFR的Truncated Soluble
     cDNA的重组腺相关病毒及含有上述成分的大肠癌、膀胱癌及/或肺癌特异性基因治疗剂
<130>FP05KR065
<150>KR10-2005-0067661
<151>2005-07-26
<160>15
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>429
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Figure C200610000071D00231
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>2
Figure C200610000071D00232
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>3
Figure C200610000071D00241
<210>4
<211>1967
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Figure C200610000071D00242
Figure C200610000071D00251
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>5
Figure C200610000071D00252
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<211>35
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
Figure C200610000071D00253
<210>7
<211>1968
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
<210>8
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>8
Figure C200610000071D00272
<210>9
<211>2402
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>9
Figure C200610000071D00273
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<211>31
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>10
Figure C200610000071D00291
<210>11
<211>35
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
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Figure C200610000071D00292
<210>12
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<213>智人(Homo sapiens)
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Figure C200610000071D00301
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<212>DNA
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<220>
<223>primer
<400>13
Figure C200610000071D00311
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
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Figure C200610000071D00312
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>15
Figure C200610000071D00313

Claims (3)

1.一种rAAV载体，其特征在于其含有SEQ ID NO：4所示的VEGFR-1截断型可溶性cDNA，并通过以下步骤制造，即
(a)将含有SEQ ID NO：4所示的VEGFR-1截断型可溶性cDNA的pAAV载体、AAV rep-cap质粒DNA及腺病毒辅助质粒转染至动物细胞株的步骤；
(b)培养上述被转染的动物细胞株的步骤；
(c)破碎经培养的上述细胞株并分离提纯重组rAAV粒子的步骤。
2.一种rAAV载体，其特征在于其含有SEQ ID NO：9所示的VEGFR-2截断型可溶性cDNA，并通过以下步骤制作，即
(a)将含有SEQ ID NO：9所示的VEGFR-2截断型可溶性cDNA的pAAV载体、AAV rep-cap质粒DNA及腺病毒辅助质粒转染至动物细胞株的步骤；
(b)培养上述被转染的动物细胞株的步骤；
(c)破碎经培养的上述细胞株并分离提纯重组rAAV粒子的步骤。
3.一种大肠癌、膀胱癌及/或肺癌特异性基因治疗剂，其特征在于包括权利要求1所述的rAAV载体、权利要求2所述的rAAV载体及含有SEQ ID NO：1所示的VEGF-A反义cDNA的rAAV载体。
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重组腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子165 基因对缺血心肌血管新生的影响. 黄志军等.中国动脉硬化杂志，第12卷第6期. 2004
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