ES2262163T3 - Receptor iii de fc gamma humano. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento que comprende preparar un polipéptido capaz de unirse a la porción Fc de IgG humana y que comprende la secuencia de aminoácidos (a) Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gin Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gin Leu Glu Val His Val Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220

Description

Receptor III de Fc\gamma humano.

Campo de la invención

La invención se refiere, en general, a compuestos terapéuticos, y más particularmente a formas solubles y unidas a la membrana de un receptor de baja afinidad para la inmunoglobulina G humana, a los ácidos nucleicos que codifican al mismo, y a los usos diagnósticos y terapéuticos de tales receptores.

Fundamentos

Los receptores para la porción Fc de la inmunoglobulina G (IgG) juegan un papel central en las defensas celulares inmunes. Se han identificado tres tipos de tales receptores: un receptor de 72 kilodalton (kDa), de alta afinidad hacia la IgG monomérica, se encuentra en monocitos y en algunos macrófagos; un receptor de 40 kDa, de baja afinidad hacia la IgG monomérica, se encuentra en monocitos, neutrófilos, eosinófilos, plaquetas y ciertas líneas de células tumorales humanas; y un receptor de 50 a 70 kDa, de baja afinidad hacia la IgG monomérica, se encuentra en neutrófilos, eosinófilos, células naturales mortíferas, y macrófagos. Estos tres tipos de receptores de Fc\gamma se designan como Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII, respectivamente: Unkeless et al., Ann. Rev. Immunol., Vol. 6, pg. 251-81 (1988).

Se cree que la eliminación, mediada por Fc\gammaRIII, de las plaquetas revestidas con IgG juega un papel importante en la patogénesis de la púrpura trombocitopática inmune (ITP), una afección de deficiencia de plaquetas, caracterizada por una sangría excesiva (véase von dem Borne, pg. 222-56, en "Immunohaematology", Engelfriet et al., compils., Elsevier, Amsterdam, 1984). Clarkson et al., New England J. Med., Vol. 314, pg. 1236-39 (1986) comunican que la infiltración de un anticuerpo anti-Fc\gammaRIII, bloqueador del ligando, a un paciente con una ITP resistente al tratamiento, dio como resultado un aumento transitorio en el recuento de plaquetas. Esta observación sugiere que la manifestación más nociva de ITP podría ser mejorada temporalmente por la administración de agentes que bloquean o compiten con Fc\gammaRIII por los sitios de unión en las plaquetas revestidas con IgG.

En un área distinta de la inmunología clínica, los niveles elevados en suero de agregados que constan de inmunoglobulina y antígeno (los llamados "complejos inmunes" o "inmunocomplejos"), se han correlacionado con una amplia variedad de trastornos, particularmente, enfermedades autoinmunes, tales como el lupus eritomatoso sistémico (SLE), y la artritis reumatoide. El nivel de tales complejos se ha convertido en un diagnóstico importante para señalar la presencia de trastornos autoinmunes (véase, por ejemplo, Theofilopoulos et al., Am. J. Pathol., Col. 100, pg. 531-91, 1980).

Los ensayos actuales para determinar el nivel en suero de los inmunocomplejos, incluyen ensayos en fase sólida que aprovechan la afinidad de los complejos hacia ciertas proteínas del factor reumatoide o del complemento, y ensayos celulares que aprovechan la propiedad de las células Raji de unirse preferencialmente a los inmunocomplejos (véase Theofilopoulos et al., capít. 28, y Toth et al., capít. 29, en Rose et al., compils., "Manual of Clinical Immunology", 3ª edición, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1986). Desafortunadamente, como ocurre con muchos ensayos basados en células de mamíferos, el ensayo con las células Raji es difícil de realizar, y requiere controles y estándares complicados, debido a la variabilidad intrínseca de la unión de las células Raji con los inmunocomplejos.

Nature, vol. 333, 9 de junio de 1988, págs. 568-570 describe un receptor para la región Fc de IgG humana y que tiene 283 aminoácidos de longitud.

WO 88/06733 describe formas solubles de receptores de Fc gamma de baja afinidad, sin proporcionar ninguna información de la secuencia para los receptores.

A la luz de lo que antecede, sería ventajoso para la comunidad médica disponer de métodos de ensayo alternativos para los inmunocomplejos, que utilicen líneas celulares bien caracterizadas, ampliamente disponibles y convenientemente cultivadas. Sería asimismo ventajoso que el Fc\gammaRs soluble pudiera producirse en cantidad suficiente para permitir una terapia práctica de emergencia para casos de ITP resistentes al tratamiento.

Compendio de la invención

La presente invención se dirige a polipéptidos Fc\gammaRIII humanos solubles y unidos a la membrana; a sus muteínas, a los ácidos nucleicos capaces de codificarlos, y a usos diagnósticos y terapéuticos de tales polipéptidos y muteínas.

La invención se basa en el descubrimiento de un cADN codificador de un Fc\gammaRIII humano. Un clon de cADN, pcD(SR\alpha), que contiene la inserción codificadora de Fc\gammaRIII (ilustrada en la Figura 1) se ha depositado, en la cepa MC1061 de E. coli K12, en la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, EE.UU., con el número de acceso 67707.

Por consiguiente, la invención proporciona un polipéptido capaz de unirse a la porción Fc de IgG humana y que comprende la secuencia de aminoácidos:

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1, partes A y B (en dos páginas que han de leerse uniéndolas lateralmente) ilustra la secuencia de nucleótidos de la inserción de cADN de pcD(SR\alpha)-GP5;

la Figura 2 ilustra la posición relativa del codón de parada insertado para producir un Fc\gammaRIII humano soluble, secretado como un mutante de Fc\gammaRIII; y

la Figura 3 partes A y B (en dos páginas que han de leerse uniéndolas lateralmente) ilustra la secuencia de nucleótidos de la inserción de cADN de pcD(SR\alpha)-NL10.

Descripción detallada de la invención

La presente invención incluye ácidos nucleicos codificadores de polipéptidos capaces de unirse a la porción Fc de la IgG humana. Estos polipéptidos se derivan del Fc\gammaRIII humano. La invención incluye polipéptidos solubles y unidos a la membrana para Fc\gammaRIII humano. Estas y otras versiones modificadas de los polipéptidos, se obtienen fácilmente usando técnicas estándar de ingeniería de proteínas.

Una vez que está disponible la información sobre la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos, para una proteína nativa, se dispone de una variedad de técnicas para producir virtualmente cualquier mutación en la secuencia nativa. Shortle, Science, Vol. 229, pg. 1193-201 (1985), revisa las técnicas para la mutación de ácidos nucleicos que son aplicables a la presente invención. Preferiblemente, los mutantes de la proteína de la presente invención se producen por mutagénesis dirigida al oligonucleótido del sitio específico (véase, por ejemplo: Zoller y Smith, Methods in Enzymology, Vol. 100, pg. 468-500, 1983; y Mark et al., patente de los EE.UU. Nº 4.518.584, titulada "Human Recombinant Interleukin-2 Muteins"), o por la llamada mutagénesis de "casete", descrita por Wells et al., Gene, Vol. 34, pg. 315-23 (1985), por Estell et al., Science, Vol. 233, pg. 659-63 (1986), y también esencialmente por Mullenbach et al., J. Biol. Chem., Vol. 261, pg. 719-22 (1986), y por Feretti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 83, pg. 597-603 (1986).

Los polipéptidos con modificaciones de aminoácidos (es decir, muteínas) pueden ser deseables en una variedad de circunstancias. Por ejemplo, los efectos secundarios no deseables podrían reducirse por ciertas muteínas, particularmente si el efecto secundario está asociado con una parte del polipéptido diferente de la relacionada con la actividad deseada. En algunos sistemas de expresión, el polipéptido nativo puede ser susceptible de degradación por proteasas. En tales casos, las sustituciones y/o supresiones de aminoácidos seleccionadas, que cambian las secuencias susceptibles, pueden mejorar significativamente los rendimientos (véase, por ejemplo, la solicitud de patente británica Nº 2173-804-A, en la que Arg en la posición 275 del activador de plasminógeno del tejido humano, es reemplazado por Gly ó Glu). Las muteínas pueden también aumentar los rendimientos en los procedimientos de purificación y/o aumentar los tiempos de conservación de las proteínas, por eliminación de los aminoácidos susceptibles a la oxidación, acilación, alquilación u otras modificaciones químicas. Por ejemplo, la metionina experimenta fácilmente una oxidación para formar un sulfóxido, lo que, en muchas proteínas está asociado con una pérdida de actividad biológica (véase, por ejemplo, Brot y Weissbach, Arch. Biochem. Biophys., Vol. 223, pg. 271, 1983). Las metioninas pueden a menudo reemplazarse por aminoácidos más inertes, con poca o ninguna pérdida de actividad biológica (véase, por ejemplo, la solicitud de patente australiana Nº AU-A-52451/86). En sistemas de expresión bacterianos, los rendimientos pueden a veces aumentarse por eliminación o sustitución de los residuos de cisteína que no sean esenciales desde el punto de vista de la configuración (véase, por ejemplo, Mark et al., patente de los EE.UU. Nº 4.518.584).

Preferiblemente, las formas solubles del Fc\gammaRIII de la invención se producen introduciendo un codón de parada antes (es decir, en la dirección 5' ó "aguas arriba") de la región codificadora de las porciones transmembrana e intracelular del cADN de Fc\gammaRIII. Esto se hace convenientemente por mutagénesis específica dirigida al sitio. Las regiones transmembrana se identifican fácilmente por la presencia de un segmento de aminoácidos que contiene aproximadamente 20 a 25 residuos, que poseen una elevada hidrofobidad media (véanse, por ejemplo, Wickner, Science, Vol. 210, pg. 861-68, 1980; y Greene et al., Ann. Rev. Immunol., Vol. 4, pg. 69-95, 1986).

El plásmido pcD(SR\alpha)-GP5 es similar al vector lanzadera pcD, descrito por Okayama y Berg, Mol. Cell. Biol., Vol. 2, pg. 161-70 (1983), y Vol. 3, pg. 280-89 (1983), excepto porque el promotor de SV40 se ha modificado, para mejorar la expresión, por la inserción aguas abajo de una porción del segmento repetitivo terminal largo (LTR) de un retrovirus HTLV(I), descrito por Takebe et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 8, pg. 466-72 (1988). El plásmido se propaga convenientemente en la cepa MC1061 de E. coli K12, o en un hospedante similar.

La propiedad de unirse a la inmunoglobulina G, de los Fc\gammaRIIIs de la invención, se mide por técnicas estándar, por ejemplo: (1) en el caso de Fc\gammaRIII unido a la membrana: la capacidad de las células transfectadas con el cADN de Fc\gammaRIII, para formar rosetas en presencia de glóbulos rojos de la sangre (RBCs) revestidos con IgG o para unirse preferencialmente al agregado de IgG humana por tratamiento térmico; ó (2) en el caso de Fc\gammaRIII soluble: la capacidad de eliminar preferencialmente el Fc\gammaRIII de la solución, mediante una columna inmunoadsorbente que comprende IgG humana, o para inhibir la formación de rosetas entre RBCs revestidos con IgG y células que se sabe que tienen Fc\gammaRIIIs. Las medidas del primer grupo pueden hacerse con moléculas de IgG humana marcadas fluorescentemente (véase, por ejemplo, Haugland, "Handbook of Fluorescent Probes", Molecular Probes, Inc., Junction City, OR, 1985). Las medidas del segundo grupo pueden hacerse por construcción de una columna de IgG, a partir de IgG humana aislada y una columna de sefarosa activada, comercialmente disponible, por ejemplo, en los Laboratorios Bio-Rad (Richmond, CA).

Los ensayos con rosetas son estándar en la técnica (véase, por ejemplo, Winchester et al., capít. 31, en Rose et al., compils., "Manual of Clinical Laboratory Immunology", 3ª edición, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1986).

Una vez que el cADN de la invención ha sido clonado, puede recurrirse a una amplia gama de sistemas de expresión (es decir, combinaciones de hospedante y vector de expresión) para producir las proteínas de la invención. Los tipos posibles de células hospedantes incluyen, pero sin limitarse a ellas, las de bacterias, levaduras, insectos, mamíferos y similares. La selección de un sistema de expresión, y con ello, la optimización de la producción de la proteína, implica la consideración y ponderación de muchos factores, que incluyen: (1) la naturaleza de la proteína que ha de expresarse; por ejemplo, la proteína puede ser tóxica para algunos organismos hospedantes, puede ser susceptible a la degradación por proteasas del hospedante, o puede expresarse en configuraciones inactivas o en formas insolubles en algunos hospedantes; (2) la naturaleza del ARN mensajero (mARN) correspondiente a la proteína de interés; por ejemplo, el mARN puede tener secuencias particularmente susceptibles a las endonucleasas del hospedante, que reduzcan drásticamente el tiempo de vida funcional del mARN; o el mARN puede formar estructuras secundarias que enmascaran el codón de parada o el sitio de unión al ribosoma, inhibiendo así la iniciación de la traducción en algunos hospedantes; (3) la selección, disponibilidad y disposición de las secuencias de control de la expresión compatibles con el hospedante, en las regiones 3' y 5' que flanquean la región codificadora; éstas incluyen promotores, secuencias protectoras de 5' y 3', sitios de unión al ribosoma, terminadores de la transcripción, intensificadores, sitios de adición del poliadenilato, sitios CAP, sitios de corte y empalme de los intrones, y similares; (4) si la proteína tiene una secuencia de señal de la secreción que puede ser procesada por el hospedante, o si una secuencia de control de la expresión, codificadora de una secuencia de señal endógena al hospedante, debe ser cortada y empalmada a la región codificadora de la proteína madura; (5) los modos y eficiencias disponibles de transfección o transformación del hospedante, y si se desea una expresión transitoria o estable; (6) la escala y coste del sistema de cultivo del hospedante, deseado para la expresión de la proteína; (7) si se desean modificaciones posteriores a la traducción y de qué tipo; por ejemplo, el alcance y la clase de glicosilación deseados pueden afectar a la selección del hospedante; (8) la facilidad con que la proteína expresada puede separarse de las proteínas y otros materiales de las células hospedantes y/o del medio de cultivo; por ejemplo, en algunos casos, puede ser deseable expresar una proteína de fusión con una secuencia de señal especializada, para ayudar en las etapas posteriores de purificación (véase, por ejemplo, Sassenfeld et al., Biotechnology, enero 1984); (9) la estabilidad y número de copias de un vector particular en un hospedante seleccionado (véase, por ejemplo, Hofschneider et al., compils., "Gene Cloning in Organisms Other than E. coli", Springer Verlag, Berlin, 1982); y (10) factores análogos conocidos por los expertos en la técnica.

Muchas revisiones hay disponibles, que ofrecen una guía para hacer selecciones y/o modificaciones de sistemas de expresión específicos, a la luz de los factores enumerados. Sirvan de ejemplo las siguientes referencias: de Boer y Shepard, "Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli", pg. 205-47, en Kroon, compil., "Genes: Structure and Expression" (John Wiley & Sons, New York, 1983) revisan varios sistemas de expresión de E. coli; Kucherlapati et al., Critical Reviews in Biochemistry, Vol. 16, Nº 4, pg. 349-79 (1984), y Banerji et al., Genetic Engineering, Vol. 5, pg. 19-31 (1983) revisan métodos para la transfección y transformación de células de mamíferos; Reznikoff y Gold, compils., "Maximizing Gene Expression" (Butterworths, Boston, 1986) revisan temas seleccionados de la expresión de genes en E. coli, levadura y células de mamíferos; y Thilly, "Mammalian Cell Technology" (Butterworths, Boston, 1986) revisa sistemas de expresión en mamíferos.

Análogamente, hay disponibles muchas revisiones que describen técnicas y condiciones para unir y/o manipular cADNs específicos y secuencias de control de la expresión, para crear y/o modificar vectores de expresión adecuados para su uso en la presente invención (véanse, por ejemplo, Maniatis et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982; Glover, "DNA Cloning: A Practical Approach", Vol. I y II, IRL Press, Oxford, 1985; y Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, N.Y., 1984).

Los sistemas de expresión adecuados para la invención incluyen los descritos por Itakura y Riggs, patente de los EE.UU. Nº 4.704.362 (expresión en bacterias); por Clark et al., patente de los EE.UU. Nº 4.675.285, y por Hamer, patente de los EE.UU. Nº 4.599.308 (expresión en mamíferos); y por Kurjan et al., patente de los EE.UU. Nº 4.546.082 (expresión en levaduras). Por consiguiente, las patentes anteriores se incorporan por referencia.

Siempre que se emplean vectores basados en SV40, por ejemplo, vectores pcD, un hospedante preferido es la línea celular COS7, descrita por Gluzman, Cell, Vol. 23, pg. 175-82 (1981) y disponible en la ATCC, con el número de acceso CRL1651.

Los Fc\gammaRIIIs solubles de la invención se administran como composición farmacéutica, para el tratamiento de la ITP. Tales composiciones contienen una cantidad eficaz del Fc\gammaRIII en un vehículo farmacéutico. Un vehículo farmacéutico puede ser cualquier sustancia no tóxica, compatible, adecuada para suministrar las composiciones de la invención a un paciente. Generalmente, las composiciones útiles para la administración parenteral de tales fármacos son bien conocidas (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Science", 15ª edición, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980). Alternativamente, las composiciones de la invención pueden introducirse en el cuerpo de un paciente por medio de un sistema de suministro de fármaco implantable (véase, por ejemplo, Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol. 24, pg. 199-236, 1984).

Cuando se administran por vía parenteral, las Fc\gammaRIIIs solubles se formularán en una forma de dosificación unitaria inyectable (solución, suspensión, emulsión), en asociación con un vehículo farmacéutico. Tales vehículos son intrínsecamente no tóxicos y no terapéuticos. Ejemplos de tales vehículos son la solución salina normal, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Pueden utilizarse también vehículos no acuosos, tales como aceites fijos y oleato de etilo. Un vehículo preferido es la dextrosa al 5% en solución salina. El vehículo puede contener cantidades pequeñas de aditivos, tales como sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química, por ejemplo, tampones y conservantes. El Fc\gammaRIII soluble se formula preferiblemente en forma purificada, sustancialmente libre de agregados y de otras proteínas, a una concentración en el intervalo de aproximadamente 5 a 30 mg/ml, y preferiblemente a una concentración en el intervalo de aproximadamente 10 a 20 mg/ml.

La selección de un régimen de administración para suministrar a un paciente una cantidad de Fc\gammaRIII soluble que sea eficaz para mejorar la trombopenia asociada con ITP, depende de varios factores, que incluyen la velocidad de rotación en el suero del Fc\gammaRIII soluble, el nivel en el suero del Fc\gammaRIII endógeno competidor, asociado con el trastorno inmune, la posible inmunogenicidad del Fc\gammaRIII soluble, y similares. Preferiblemente, el régimen de administración maximiza la cantidad de Fc\gammaRIII soluble suministrado al paciente, coherente con un nivel aceptable de efectos secundarios. Por consiguiente, la cantidad de Fc\gammaRIII soluble suministrado depende, en parte del Fc\gammaRIII soluble particular empleado y de la gravedad de la enfermedad que se está tratando. Una guía para seleccionar las dosis adecuadas se encuentra en la bibliografía referente a los usos terapéuticos de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, que sean polipéptidos de un tamaño más o menos igual al de los Fc\gammaRIIIs solubles (véanse, por ejemplo, Bach et al., capít. 22, en Ferrone et al., compils., "Handbook of Monoclonal Antibodies", Noges Publications, Park Ridge, NJ, 1985; y Russell, pg. 303-57, y Smith et al., pg. 365-89, en Haber et al., compils.,"Antibodies in Human Diagnosis and Therapy", Raven Press, New York, 1977). Preferiblemente, la dosis está en el intervalo de aproximadamente 1 a 20 mg/kg y por día, más preferiblemente alrededor de 1 a 10 mg/kg y por día.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención. La selección de vectores y hospedantes, así como la concentración de reactivos, temperaturas y los valores de otras variables, son sólo para ejemplificar la aplicación de la presente invención y no han de considerarse como limitativos de la misma.

Ejemplo I Construcción de transformantes estables de células de mamíferos que expresan el Fc\gammaRIII humano

Preferiblemente, las líneas de células de mamíferos capaces de realizar la expresión estable del Fc\gammaRIII, se producen por transfección conjunta de una célula de mamífero hospedante con un vector que lleva un marcador seleccionable y un vector que lleva un promotor compatible con el hospedante y la inserción de cADN de Fc\gammaRIII. Para pcD(SR\alpha)-GP5, los hospedantes adecuados incluyen células de ovario de hámster chino, células COS de mono, y células L de ratón, tales como una célula L mutante deficiente en timidina quinasa (tk^{-}), disponible en la American Type Culture Collection, con el número de acceso CCL 1.3. El marcador seleccionable permite seleccionar células hospedantes que tengan una alta probabilidad de contener el gen para Fc\gammaRIII completamente integrado en el genoma del hospedante. Típicamente, la relación de pcD(SR\alpha)-GP5 al vector que contiene el marcador en la solución de transfección, es aproximadamente 10:1. Así, si el gen marcador está integrado en el genoma del hospedante, es muy probable que pcD(SR\alpha)-GP5 esté también integrado, en virtud de su alta concentración. El marcador seleccionable también proporciona un medio de impedir que los cultivos de transformantes deseados se sobredesarrollen por las células
revertantes.

Las células L tk^{-} de ratón se transfectan conjuntamente con pcD(SR\alpha)-GP5 y pSV2tk, un plásmido pSV2 que lleva un gen para timidina quinasa, bajo el control del promotor primitivo de SV40. El plásmido pSV2 está descrito en Mulligan et al., Science, vol. 209, pg. 1422-27 (1980), y en Subramani et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 1, pg. 854-64 (1981), y está disponible en la American Type Culture Collection, con el número de acceso 37146. Ambos plásmidos se amplifican en E. coli, por ejemplo, en la cepa HB101 disponible en la ATCC, con el número de acceso 33694, y se purifican por centrifugación de equilibrio con cloruro de cesio. Una suspensión de aproximadamente 1 x 10^{5} células L tk^{-} en 10 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (DME), con suero fetal bovino al 10%, se pone en un plato Falcon 3003 y se cultiva a 37ºC, durante 20 h, en una incubadora con gas dióxido de carbono al 5%, después de lo cual, el medio se sustituye por 10 ml de DME recién preparado, con suero fetal bovino al 10%. El cultivo se incuba durante 4 h más. Después de la incubación, 0,5 ml de solución A (Hepes 50 mM, NaCl 280 mM, tampón de fosfato de sodio 1,5 mM, pH 7,22) y 0,5 ml de solución B (CaCl_{2} 2 M, 10 \mug de pcD(SR\alpha)-GP5, 1 \mug de pSV2tk) se añaden al medio de cultivo, y el cultivo se incuba a 37ºC, durante 24 h, en atmósfera de CO_{2} al 5%, después de lo cual, las células se ponen en un medio selectivo con HAT (por ejemplo, de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Al cabo de 2 semanas, las colonias supervivientes se subclonan limitando la dilución, y los clones se ensayan respecto a la expresión de Fc\gammaRIII.

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Ejemplo II Uso de un transformante estable de células L que expresan un Fc\gammaRIII unido a la membrana para medir los niveles de inmunocomplejo en el suero

Una célula de mamífero transformada de modo estable, que expresa el Fc\gammaRIII de la invención, puede reemplazar a la línea de células Raji en los ensayos de inmunocomplejos (véase, por ejemplo, Theofilopoulos et al., capít. 28, "Manual of Clinical Laboratory Immunology", 3ª edición, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1986).

Se prepara antisuero para IgG humana en conejos, y la fracción de IgG se aísla por precipitación con sulfato de amonio, seguida de fraccionamiento en una columna de cromatografía de intercambio aniónico (DEAE-celulosa 52; Whatman Chemical Separation Ltd., Maidstone, Inglaterra). También puede utilizarse antisuero de origen comercial. La fracción de IgG del antisuero se lleva a una concentración de 5 mg/ml, y 1 ml se marca con ^{125}I. Después de la yodación y diálisis, el antisuero se diluye a 1 mg/ml con solución salina tamponada con fosfato (PBS), para dar una actividad especifica de aproximadamente 3 x 10^{5} cpm/\mug. Las células transformadas con el cADN de Fc\gammaRIII se recolectan después de 72 h de cultivo, y porciones de 2 x 10^{6} células en 200 \mul de medio, se ponen en tubos cónicos de plástico Eppendorf® de 1,5 ml (Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, N.Y.; núm. de catálogo 22-36-411-1). Se añade a cada tubo 1 ml de medio Spinner (medio mínimo Eagle, sin Ca^{2+} ni Mg^{2+}), y las células se centrifugan a 800 x g, durante 8 min. Los fluidos sobrenadantes se aspiran, y los gránulos o pelets de células se vuelven a poner en suspensión en 50 \mul de medio Spinner. El suero que ha de ensayarse se diluye a un factor 4, en NaCl 0,15 M (solución salina fisiológica), y se añaden 25 \mul a las células transformadas. Al cabo de un período de incubación de 45 min a 37ºC, con agitación manual suave cada 5 a 10 min, las células se lavan tres veces con medio Spinner. Después del lavado final, las células, agitadas suavemente cada 5 a 10 min, se dejan reaccionar durante 30 min, a 4ºC, con IgG humana anti-conejo, marcada con ^{125}I, diluida con medio Spinner que contiene 10 g de seroalbúmina humana (HSA) por litro. Después de la incubación, las células se lavan tres veces, los fluidos sobrenadantes se aspiran por completo, y la radiactividad del pelet de células se determina en un contador gamma. Todos los ensayos se hacen por duplicado. La magnitud de la incorporación, expresada como cuentas absolutas, como porcentaje de la cantidad que entra (el "input") o como microgramos de anticuerpo, se refiere a una curva estándar de incorporación de anticuerpo radiactivo por células incubadas con suero humano normal (fuente de complemento), que contiene diversas cantidades de IgG humana agregada (AHG). La cantidad de inmunocomplejo en el suero se equipara a una cantidad de AHG, después de una corrección para tener en cuenta el factor de dilución, y se expresa como microgramos de AHG equivalente por mililitro de suero. La AHG soluble se forma a partir de una solución de 6,5 mg de fracción Cohn II ó IgG humana aislada, por cada mililitro de solución salina fisiológica, se calienta a 63ºC durante 30 min, y se centrifuga (1.500 x g, 15 min), para eliminar los agregados insolubles grandes. El sobrenadante se diluye luego con tampón, para suministrar una concentración final de aproximadamente 1,6 mg/ml. Porciones (0,5 ml) de esta preparación se almacenan a -70ºC y pueden utilizarse durante un período de hasta un mes.

La curva estándar de incorporación de anticuerpo radiactivo se construye como sigue. Porciones de 50 \mul de AHG (80 \mug de proteína) se diluyen en serie (11 porciones diluidas a un factor 2) en solución salina. A continuación, 50 \mul de una porción diluida, a un factor 2, de suero humano normal (fuente de complemento), recién obtenida o almacenada a -70ºC, se añaden a cada porción diluida de AHG, se mezcla cuidadosamente y se incuba a 37ºC, durante 30 min. Seguidamente, 25 \mul de cada mezcla se añaden a 2 x 10^{6} células, por duplicado (porciones diluidas finales, a un factor 4, de suero que contiene de 20 \mug a aproximadamente 20 ng de AHG); la mezcla se incuba, se lava, y se hace reaccionar con anticuerpo radiomarcado. La radiactividad se cuenta luego como en los sueros de ensayo. Se establece también una línea base de incorporación de anticuerpo radiactivo (fondo) por células incubadas con 25 \mul de una porción diluida, a un factor 4, de suero humano normal, utilizado como fuente de complemento en la curva de referencia.

Las preparaciones estándar de agregados de IgG y de inmunocomplejos toxoides anti-tétanos humano se han desarrollado recientemente, bajo los auspicios de la Unión Internacional de Inmunologistas, y están disponibles en el Swiss Red Cross Blood Transfusion Service (véase, por ejemplo, Nydegger et al., Clin. Exp. Immunol., Vol. 58, pg. 502-09, 1984).

Ejemplo III Construcción de un Fc\gammaRIII humano soluble

El Fc\gammaRIII soluble se construyó usando mutagénesis, dirigida al oligonucleótido específico del sitio, de la inserción de cADN de Fc\gammaRIII de pcD(SR\alpha)-GP5. La inserción completa de cADN de pcD(SR\alpha)-GP5 se subclonó como fragmento BamHI, de 2,4 kilobases, en el plásmido Bluescript KS (Stratagene, San Diego, CA), y se preparó seguidamente el ADN de cadena simple.

Un oligonucleótido sintético (tamaño mínimo aproximado 18 nucleótidos), codificador de un codón de parada TAA y un sitio BamHI (con las mutaciones mostradas en negritas en la Figura 2) se utilizó como cebador para la síntesis de la cadena complementaria, usando el fragmento grande de ADN polimerasa I (Amersham, Arlington Heights, IL). La Figura 2 indica la posición del codón de parada y del sitio BamHI relativo a los dominios principales codificados por el cADN de Fc\gammaRIII: S representa la región codificadora del péptido de señal, EC representa la región codificadora del dominio extracelular de Fc\gammaRIII, H representa la región codificadora del dominio hidrófobo, o transmembrana, de Fc\gammaRIII, y C representa la región codificadora del dominio citoplásmico. La introducción del codón de parada como se indica en la Figura 2, produce un Fc\gammaRIII mutante que carece de ambos dominios, el citoplásmico y el de transmembrana; es soluble, como se indica por la notación "sFc\gammaRIII" junto a la secuencia de ADN modificada. Después de confirmar la identidad del mutante por análisis de la secuencia de ADN, se subclonó en el sitio BamHI del vector pcD(SR\alpha), se amplificó en E. coli, y se utilizó para transfectar células COS7 por electroporación. Un día antes de la transfección, aproximadamente (1,5-2,0) x 10^{6} células COS7 de mono se sembraron, sobre placas individuales de 100 mm, en medio Eagle modificado de Dulbecco (DME), que contiene suero fetal de ternera al 6% y glutamina 2 mM. Para realizar la transfección, las células se recolectaron por tripsinación y se contaron, se lavaron dos veces en DME libre de suero, y se pusieron en suspensión, a razón de (1-7) x 10^{6} células por ml, en DME libre de suero. Se añadió ADN a razón de 25 \mug/ml y la mezcla se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 10 min, después de lo cual, una porción de 0,8 ml se sometió a pulsación, en una cubeta estéril de 0,4 cm, con un pulsador de genes Bio Rad® (Richmond, CA), a 250 V y 960 \muF. Después de la pulsación, las células se dejaron en reposo durante 10 min, y luego se dispusieron en placas, a razón de (1,5-2,0) x 10^{6} por cada placa de 100 mm, en DME que contiene suero fetal de
ternera al 6%. Los sobrenadantes se recolectaron y se ensayaron para determinar el Fc\gammaRIII soluble, después de 72 h.

El Fc\gammaRIII soluble de los sobrenadantes del cultivo de COS7 se analizó ulteriormente por electroforesis en gel, y se inmunoprecipitó. Los resultados de esto se describirán ahora. Las calles 1, 3 y 6 contienen, cada una, proteínas procedentes de sobrenadantes del cultivo de células COS7 transfectadas con el pcD que lleva el cADN de Fc\gammaRIII soluble. Las proteínas de la calle 1 se inmunoprecipitaron con un anticuerpo IgG_{2} de ratón no específico; las proteínas de la calle 3 se inmunoprecipitaron con IgG humana, presumiblemente por la unión de la porción Fc del anticuerpo con el Fc\gammaRIII soluble; y las proteínas de la calle 6 se inmunoprecipitaron con el anticuerpo monoclonal 3G8, que es específico para el dominio extracelular de Fc\gammaRIII. Dichos marcadores adyacentes a la calle del control (calle 1) están en Kilodaltons. El Fc\gammaRIII soluble corresponde a la banda ancha a aproximadamente 40 kDa. Las calles 4 y 7 contienen proteínas procedentes de sobrenadantes de cultivo de células COS7 transfectadas con el pcD que lleva el cADN de Fc\gammaRIII soluble y cultivadas en presencia de tunicamicina. La tunicamicina inhibe la ligación posterior a la traducción, de los carbohidratos N-enlazados a proteínas. Se aplicó en un intento de determinar la naturaleza de la heterogeneidad aparente de la banda de 40 kDa. La tunicamicina origina la aparición de dos bandas de peso molecular más bajo, lo que es coherente con la desglicosilación del Fc\gammaRIII soluble. La tunicamicina se añadió a los cultivos como se describe en Martens et al., PNAS 84, 809-13 (1987). Las calles 2 y 5 contienen proteínas procedentes del cultivo de sobrenadantes de células COS7, que habían sufrido las mismas manipulaciones que las células COS de las calles 3 y 4 y de las calles 6 y 7, respectivamente, con la excepción de que ningún ADN de plásmido se incluyó en el protocolo de transfección.

Ejemplo IV Aislamiento de una variante de Fc\gammaRIII humano procedente de células mortíferas naturales

Una genoteca de cADN se construyó a partir de mARN extraído de una línea celular mortífera natural (NK) humana, utilizando el vector de expresión pcD(SR\alpha). La genoteca se escrutó con una sonda construida a partir de la inserción de cADN de pcD(SR\alpha)-GP5, que se radiomarcó con ^{31}P por marcaje del ADN cebado al azar (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Se obtuvo un clon pcD(SR\alpha)-NL10, que presentaba actividad de unión con IgB humana. La secuencia de la inserción de dADN de pcD(SR\alpha)-NL10 se ilustra en la Figura 3. Puede verse que la secuencia de aminoácidos de este Fc\gammaRIII y la del codificado por pcD(SR\alpha)-GP5 son muy similares, diferenciándose en el dominio extracelular en sólo seis aminoácidos.

La descripción de las realizaciones precedentes de la invención se ha presentado con fines de ilustración y descripción. No pretenden ser exhaustivas, ni limitar la invención a las propias formas descritas; obviamente, muchas modificaciones y variaciones son posibles, a la luz de la exposición anterior. Las realizaciones se han elegido y descrito con la finalidad de explicar del mejor modo los principios de la invención y su aplicación práctica, para hacer así posible que otros expertos en la técnica utilicen de la mejor forma la invención en diversas realizaciones, y con modificaciones tales que sean adecuadas al uso particular contemplado. Lo que se desea es que el alcance de la invención esté definido por las reivindicaciones anexas a la presente memoria descriptiva.

Los solicitantes han depositado el pcD(SR\alpha)-GP5 en la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, EE.UU., con el número de acceso 67707. Este depósito se hace en el marco del Tratado de Budapest para el depósito de microorganismos; y también bajo las condiciones provistas en el acuerdo ATCC para el depósito de microorganismos con fines de patentes, lo que garantiza que el depósito estará disponible para el Comisario de Patentes y Marcas en los EE.UU. según 35 U.S.C. 122 y 37 C.F.R. 1.14, y estará disponible para el público cuando lo esté una patente UU.UU., lo que requiere que el depósito se mantenga. La disponibilidad de la cepa depositada no se interpretará como una licencia para poner en práctica la invención contraviniendo los derechos otorgados en el marco de la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

Claims (7)

1. Un procedimiento que comprende preparar un polipéptido capaz de unirse a la porción Fc de IgG humana y que comprende la secuencia de aminoácidos

5

6

7

8

9

10

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es glicosilado.

3. Un procedimiento que comprende preparar una composición farmacéutica que comprende el polipéptido definido en la reivindicación 1 o 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha composición farmacéutica está destinada al tratamiento de la púrpura trombocitopénica inmunitaria (PTI).

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha composición farmacéutica comprende 5-30 mg/ml de dicho polipéptido.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicha composición farmacéutica comprende 10-20 mg/ml de dicho polipéptido.

7. Uso de un polipéptido definido en la reivindicación 1 o 2 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de ITP.