CN114938647A - 去表位的α-麦醇溶蛋白及其在乳糜泻和麸质敏感性管理中的用途 - Google Patents

去表位的α-麦醇溶蛋白及其在乳糜泻和麸质敏感性管理中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114938647A
CN114938647A CN202080056793.2A CN202080056793A CN114938647A CN 114938647 A CN114938647 A CN 114938647A CN 202080056793 A CN202080056793 A CN 202080056793A CN 114938647 A CN114938647 A CN 114938647A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gln
gliadin
pro
amino acid
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080056793.2A
Other languages
English (en)
Inventor
亚奈·奥弗兰
摩西·本-大卫
阿萨夫·比兰
希里·扎金
奥利·马库加伯
安娜·丘普林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CN114938647A publication Critical patent/CN114938647A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/06—Products with modified nutritive value, e.g. with modified starch content
    • A21D13/064—Products with modified nutritive value, e.g. with modified starch content with modified protein content
    • A21D13/066—Gluten-free products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/12—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from cereals, wheat, bran, or molasses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/185—Vegetable proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Abstract

提供了一种去表位的α‑麦醇溶蛋白。还提供了生成其的方法及其用途。

Description

去表位的α-麦醇溶蛋白及其在乳糜泻和麸质敏感性管理中的 用途
相关申请
本申请要求于2019年7月4日提交的美国临时专利申请第62/870,695号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
序列表陈述
与本申请同时提交的题为83105Sequence Listing.txt的ASCII文件，创建于2020年6月30日，包含58,437个字节，通过引用并入本文。
背景技术
本发明在其一些实施例中涉及对α-麦醇溶蛋白进行去表位的方法及其在包括乳糜泻的麸质敏感性管理中的用途。
乳糜泻(CD)是一种发病于易感个体(许多个体具有HLA基因型DQ2或DQ8)的获得性慢性免疫疾病，其与环境因素麸质有关，麸质是小麦和相关谷物如黑麦和大麦的储存蛋白。据估计，在欧洲和美国，乳糜泻的患病率约站人口的1至2％。乳糜泻具有广泛的临床表现，包括潜伏性或无症状乳糜泻、仅伴有轻度胃肠紊乱的疾病、慢性胃肠症状、吸收不良和/或体重减轻。乳糜泻通常在患有孤立性缺铁性贫血的患者中诊断出来。
摄入含有麸质的谷类食品也可能会引发肠外症状，如骨质疏松症、外周和中枢神经系统受累、轻度或重度肝病、不孕不育问题，并且典型实例是麸质诱发的皮肤病、疱疹样皮炎。
对于患有乳糜泻的患者，需要严格遵守终身完全不摄入麸质，以避免显著增加发展进一步并发症的风险，如骨骼疾病、不孕不育症和癌症。乳糜泻患者的死亡率超过普通人群；然而，在食用无麸质饮食1至5年后，死亡率有下降的趋势。
然而，遵循完全不含麸质的饮食是非常具有挑战性的。即使是努力保持严格的饮食方案的高度积极性的病人，也会由于无意中或在背景下接触到麸质而受到影响。多达80％的处于临床缓解期并声称遵循无麸质饮食的乳糜泻患者在小肠活检标本中仍具有持续的异常。在临床诊断的假定无麸质饮食的患者中，无意中接触到麸质已被确定为无反应性乳糜泻的主要原因。
总之，迫切需要更多的乳糜泻饮食疗法，这些疗法既不昂贵又容易获得。
Sánchez-León,Susana等人《用CRISPR/Cas9基因工程的低麸质非转基因小麦(Low-gluten,Nontransgenic Wheat Engineered with CRISPR/Cas9)》《植物生物技术杂志(Plant Biotechnology Journal)》16.4(2018)：902-910。PMC。
其它背景技术包括美国专利申请第20160338366号。
其它背景技术包括Herpen等人，《BMC基因组学(BMC Genomics)》第7卷，文章号：1(2006)；Kumar等人，第319卷，第3期，2002年6月7日，第593至602页；Ozuna等人，《植物杂志(The Plant Journal)》(2015)82，794–805；Petersen等人，《自然结构与分子生物学(Nature Structural&Molecular Biology)》第21卷，第480至488页(2014)；Mitea等人，《公共科学图书馆期刊(PLoS One)》。2010；5(12):e15637；Qiao等人，《免疫学杂志(JImmunol)》2011；187:3064-3071
发明内容
根据本发明的一方面，提供了一种对α-麦醇溶蛋白进行去表位的方法，α-麦醇溶蛋白包含具有如QLPYPQP(SEQ ID NO：90)、QLPYSQP(SEQ ID NO：91)和/或PLPYPQP(SEQ IDNO：92)所示的氨基酸序列的抗原单元，该方法包含用选自由带正电荷的氨基酸、脯氨酸和脂肪族氨基酸组成的组的氨基酸取代抗原单元的位置1处的氨基酸残基；以及在抗原单元的位置4或5处再取代至少一个氨基酸残基，从而生成去表位的α-麦醇溶蛋白。
根据本发明的一方面，提供了一种生成去表位的α-麦醇溶蛋白的方法，该方法包含在α-麦醇溶蛋白的氨基酸57和氨基酸89之间的位置突变一个或多个氨基酸残基，其中突变中的至少一个在选自由63、64、66、68、69、70、72、73、75、76、77、78、80、81、82、83和84组成的组中的位置的氨基酸上实现，从而生成去表位的α-麦醇溶蛋白，其中突变的位置根据SEQID NO：32中所示的野生型α-麦醇溶蛋白的氨基酸序列。
根据本发明的一方面，提供了一种去表位的α-麦醇溶蛋白，其包含：
(i)用选自由带正电荷的氨基酸、脯氨酸和脂肪族氨基酸组成的组的氨基酸在野生型α-麦醇溶蛋白的抗原单元的位置1处的取代；以及
(ii)在抗原单元的位置4和/或5处的取代；
其中抗原单元具有如QLPYPQP(SEQ ID NO：90)、QLPYSQP(SEQ ID NO：91)或PLPYPQP(SEQ ID NO：92)所示的氨基酸序列。
根据本发明的一方面，提供了一种去表位的α-麦醇溶蛋白，其在α-麦醇溶蛋白的氨基酸57和氨基酸89之间的位置包含至少一个或多个突变，其中突变中的至少一个在选自由63、64、66、68、69、70、72、73、75、76、77、78、80、81、82、83和84组成的组中的位置的氨基酸上实现，其中突变的位置根据SEQ ID NO：32中所示的野生型α-麦醇溶蛋白的氨基酸序列。
根据本发明的一方面，提供了一种编码本文描述的去表位的α-麦醇溶蛋白的分离的多核苷酸。
根据本发明的一方面，提供了一种包含本文描述的分离的多核苷酸的表达载体，其可操作地连接到转录调节序列以允许α-麦醇溶蛋白在植物细胞中表达。
根据本发明的一方面，提供了一种包含本文描述的去表位的α-麦醇溶蛋白的细胞。
根据本发明的一方面，提供了一种生成去表位的α-麦醇溶蛋白的方法，其包含在允许去表位的α-麦醇溶蛋白在细胞中表达的条件下，培养包含本文所述表达载体的细胞，从而生成去表位的α-麦醇溶蛋白。
根据本发明的一方面，提供了一种源自非麸质植物的面粉，其包含本文描述的去表位α。
根据本发明的一方面，提供了一种包含本文所述面粉的面团。
根据本发明的一方面，提供了一种经基因修饰以表达本文描述的去表位的α-麦醇溶蛋白的小麦。
根据本发明的一方面，提供了一种经基因修饰以表达本文描述的去表位的α-麦醇溶蛋白的玉米植物。
根据本发明的一方面，提供了一种由本文描述的小麦生成的面粉。
根据本发明的一方面，提供了一种由本文描述的小麦生成的面团。
根据本发明的一方面，提供了一种通过加工本文描述的面团制备的加工面团产品，加工选自由以下组成的组：将面团与食品成分结合、醒发、揉捏、挤压、模制、成形、烹饪、炖煮、蒸煮、焙烤、烘焙、油炸及其任何组合。
根据本发明的一方面，提供了一种生产面粉的方法，其包含加工本文公开的小麦，从而生产面粉。
根据本发明的实施例，去表位的α-麦醇溶蛋白不包含以小于30μM的IC50与MHC类型DQ2或DQ8结合的15聚体肽。
根据本发明的实施例，去表位的α-麦醇溶蛋白包含如SEQ ID NO：60至80所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，去表位的α-麦醇溶蛋白包含如SEQ ID NO：49至58所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，取代在抗原单元的至少两个上进行。
根据本发明的实施例，取代在抗原单元的至少三个上进行。
根据本发明的实施例，该方法包含在抗原单元的位置1、4和5处取代氨基酸残基。
根据本发明的实施例，在抗原单元的位置1处的取代包含用带正电荷的氨基酸进行的替换。
根据本发明的实施例，带正电荷的氨基酸是组氨酸或赖氨酸。
根据本发明的实施例，抗原单元的位置4处的取代包含用脯氨酸、脂肪族氨基酸、极性氨基酸或甘氨酸的取代。
根据本发明的实施例，在位置4处的取代包含用脯氨酸进行的替换。
根据本发明的实施例，在抗原单元的位置5处的取代包含用小氨基酸、极性氨基酸或芳香族氨基酸进行的替换。
根据本发明的实施例，在位置5处的取代包含用小氨基酸进行的替换。
根据本发明的实施例，小氨基酸包含甘氨酸或丝氨酸。
根据本发明的实施例，该方法进一步包含用芳香族或极性氨基酸取代抗原单元的位置3处的氨基酸残基。
根据本发明的实施例，去表位不会降低α-麦醇溶蛋白的变应原性。
根据本发明的实施例，α-麦醇溶蛋白包含与SEQ ID NO：32、81、82、83、84、85、86、87、88或89所示序列至少50％相同的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，α-麦醇溶蛋白包含与SEQ ID NO：32、81、82、83、84、85、86、87、88或89所示序列至少80％相同的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，突变选自由P63D/W、Q64H、Q66R/K/H/M、P68S/R、Y69W/G、P70S、P72G、Q73W/R、P75R、Y76G、P77S、Q78H、Q80R/W、L81S、P82R、Y83G和P84T/M组成的组。
根据本发明的实施例，α－麦醇溶蛋白的至少一个谷氨酰胺突变为谷氨酸。
根据本发明的实施例，位置选自由66、73和/或80组成的组，其中突变的位置根据SEQ ID NO：32中所示的野生型α-麦醇溶蛋白的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，去表位的α-麦醇溶蛋白与源自乳糜泻患者的T细胞的结合亲和力低于对应的未突变的α-麦醇溶蛋白与源自乳糜泻患者的T细胞的结合亲和力。
根据本发明的实施例，如使用基于HLA-DQ–肽四聚体的测定或通过干扰素-γELISA测定所测量的，去表位的α-麦醇溶蛋白激活源自乳糜泻患者的T细胞的程度小于对应的未突变的α-麦醇溶蛋白激活源自乳糜泻患者的T细胞。
根据本发明的实施例，亲和力降低至少约10％。
根据本发明的实施例，去表位不破坏多肽的三维结构。
根据本发明的实施例，去表位不破坏多肽的折叠。
根据本发明的实施例，去表位的α-麦醇溶蛋白不包含以小于30μM的IC50 MHC类型DQ2或DQ8的15聚体肽。
根据本发明的实施例，去表位的α-麦醇溶蛋白包含如SEQ ID NO：60至80所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，去表位的α-麦醇溶蛋白包含SEQ ID NO：49至57所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，去表位的α-麦醇溶蛋白包含在抗原单元的至少两个上的取代。
根据本发明的实施例，去表位的α-麦醇溶蛋白包含在抗原单元的至少三个上的取代。
根据本发明的实施例，去表位的α-麦醇溶蛋白包含在抗原单元的位置1、4和5处的取代。
根据本发明的实施例，在抗原单元的位置1处的取代包含用带正电荷的氨基酸进行的替换。
根据本发明的实施例，带正电荷的氨基酸是组氨酸或赖氨酸。
根据本发明的实施例，在位置4处的取代包含用脯氨酸、脂肪族氨基酸、极性氨基酸或甘氨酸进行的替换。
根据本发明的实施例，在位置4处的取代包含用脯氨酸进行的替换。
根据本发明的实施例，在抗原单元的位置5处的取代包含用小氨基酸、极性氨基酸或芳香族氨基酸进行的替换。
根据本发明的实施例，在位置5处的取代包含用小氨基酸进行的替换。
根据本发明的实施例，小氨基酸包含甘氨酸或丝氨酸。
根据本发明的实施例，去表位的α-麦醇溶蛋白进一步包含在抗原单元的位置3处用芳香族或极性氨基酸的取代。
根据本发明的实施例，突变选自由P63D/W、Q64H、Q66R/K/H/M、P68S/R、Y69W/G、P70S、P72G、Q73W/R、P75R、Y76G、P77S、Q78H、Q80R/W、L81S、P82R、Y83G和P84T/M组成的组。
根据本发明的实施例，α-麦醇溶蛋白包含与SEQ ID NO：32、81、82、83、84、85、86、87、88或89所示序列至少50％相同的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，α-麦醇溶蛋白包含与SEQ ID NO：32、81、82、83、84、85、86、87、88或89所示序列至少80％相同的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，α－麦醇溶蛋白的至少一个谷氨酰胺突变为谷氨酸。
根据本发明的实施例，位置选自由66、73和/或80组成的组，其中突变的位置根据SEQ ID NO：32中所示的野生型α-麦醇溶蛋白的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，去表位的α-麦醇溶蛋白包含如SEQ ID NO：60至80所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，去表位的α-麦醇溶蛋白包含SEQ ID NO：49至57所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，转录调节序列包含植物启动子。
根据本发明的实施例，植物启动子包含小麦启动子。
根据本发明的实施例，面团的特征在于选自由以下组成的组中的至少一种性质：与不含去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更长的形成时间(DT)、更短的稳定时间(S)、更高的软化度(DS)、更高的稠度(C)值及其任何组合。
根据本发明的实施例，面团的特征在于选自由以下组成的组中的至少一种性质：a.与不含去表位的麦谷蛋白或麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的硬度；b.与不含去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，对机械刺激的稳定性更高；c.与不含去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的临界张力值；d.与不含去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有较低的变形能力；e.与不含去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的可塑性；以及f.与不含去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的稠度。
根据本发明的实施例，面团的特征在于选自由以下组成的组中的至少一种性质：a.与不含任何麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更低的硬度；b.与不含任何麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，对机械刺激的稳定性更高；c.与不含任何麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的临界张力值；d.与不含任何麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有较低的变形能力；e.与不含任何麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的可塑性；以及f.与不含任何麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的稠度。
根据本发明的实施例，面团还包含盐。
根据本发明的实施例，面团与至少一种另外的食品成分组合，至少一种另外的食品成分选自由调味剂、蔬菜或蔬菜部分、油、植物淀粉、维生素和橄榄组成的组。
根据本发明的实施例，面团进一步包含发酵剂，发酵剂选自由以下组成的组：未经高温消毒的啤酒、酪乳、姜汁啤酒、开菲乳、酸面团发酵剂、酵母、乳清蛋白浓缩物、酸奶、生物发酵剂、化学发酵剂、小苏打、发酵粉、面包氨、碳酸氢钾及其任何组合。
根据本发明的实施例，与野生型小麦相比，对应的非突变多肽的表达下调。
根据本发明的实施例，小麦包含针对非突变多肽的RNA沉默剂。
根据本发明的实施例，通过DNA编辑剂对小麦进行基因修饰。
根据本发明的实施例，加工面团产品为选自由平底面包、比萨面包皮、意大利面、玉米饼、帕尼尼面包、椒盐卷饼、馅饼和三明治面包产品组成的组的形式。
根据本发明的一些实施例，加工包含研磨或碾磨。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和/或科学术语都具有与本发明所涉及领域的技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等效的材料和方法可以用于本发明的实施例的实践或测试，但下文描述示范性方法和/或材料。倘若有冲突，将以包括定义的本专利说明书为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的并且不意在是必然进行限制。
附图说明
本文仅通过实例的方式参考附图描述了本发明的一些实施例。现特定详细地参考附图，强调细节通过实例的方式且出于对本发明的实施例的说明性论述的目的展示。就此而言，结合附图进行的描述使可以如何实践本发明的实施例对本领域的技术人员而言变得显而易见。
在附图中：
图1绘示了根据本发明实施例的文库设计策略。
图2A至C是面包烘焙过程(图2A)、面团(图2B)和具有分离的麸质和非小麦面粉的烘焙面包(图2C)的照片。
图3是提供了根据本发明的实施例使用的修饰的α-麦醇溶蛋白肽的序列的表格。顶行提供了如SEQ ID NO：32所示的根据野生型蛋白质的表位定位。位置66、73和80以粉色突出显示并对应于抗原单元的位置1。位置69、76和83以黄色突出显示并对应于抗原单元的位置4。位置70、77和84以绿色突出显示并对应于抗原单元的位置4。第二行提供了如SEQ IDNO：33所示的表位的野生型序列。黄色突出区域对应于第一抗原单元。绿色突出区域对应于第二抗原单元。灰色突出区域对应于第三抗原单元。所提出的α-麦醇溶蛋白肽的取代以蓝色示出。
图4提供了野生型α-麦醇溶蛋白的序列。每个突出区域包含T细胞表位。
图5A至B是绘示了对33聚体肽的修饰导致T细胞活化的消除的图。通过检测IFN-γ水平的ELISA测定来自患者活组织检查的对测试的麸质WT和TCL的修饰肽的应答。数据示为对每个样品进行的四次实验的平均值±SD。当与对照相比，测试肽的标准化IFN-γ产量显著更高时，认为TCL对麦醇溶蛋白的响应是阳性的(如通过单侧学生T检验确定的。*p-val<0.05；**p<0.01；***p<0.001)(A)或与对照相比>2倍反应(B)。小写字母表示修饰的氨基酸。da-脱酰胺化。每个序列左边的数字对应于SEQ ID NO。
具体实施方式
本发明在其一些实施例中涉及对小麦蛋白进行去表位的方法及其用于治疗乳糜泻的用途。
在详细解释本发明的至少一个实施例之前，应理解本发明在其应用中不必限于以下描述中阐述的或通过实例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施例或能够以各种方式实践或实施。
已经公开了来自小麦、大麦和黑麦的乳糜泻相关的T-细胞表位——参见例如P.R.Shewry，A.S.Tatham，《谷物科学杂志(Journal of Cereal Science)》67(2016)12e21。
本发明人现在已经揭示了小麦麸质蛋白的最重要的氨基酸，α-麦醇溶蛋白，其负责引起免疫敏感反应。本发明人提出在这些位点对α-麦醇溶蛋白进行突变以生成无毒的麸质。本文公开了设想的突变。
因此，根据本发明的第一方面，提供了一种对α-麦醇溶蛋白进行去表位的方法，α-麦醇溶蛋白包含具有如QLPYPQP(SEQ ID NO：90)、QLPYSQP(SEQ ID NO：91)或PLPYPQP(SEQID NO：92)所示的氨基酸序列的抗原单元，该方法包含用选自由带正电荷的氨基酸、脯氨酸和脂肪族氨基酸组成的组的氨基酸取代抗原单元的位置1处的氨基酸残基；以及在抗原单元的位置4或5处再取代至少一个氨基酸残基，从而生成去表位的α-麦醇溶蛋白。
本文所用的术语“α-麦醇溶蛋白”是指包含具有SEQ ID NO：90、91或92所示氨基酸序列的单元的至少一个拷贝的小麦麸质蛋白。
通常，α-麦醇溶蛋白具有至少两个或三个上述单元。应当理解，单元(本文中也称为抗原单元)在每个α-麦醇溶蛋白中不必是相同单元。因此，例如单个α-麦醇溶蛋白可以包含SEQ ID NO：90的一个拷贝和SEQ ID NO：91的另一个拷贝。替代地，单个α-麦醇溶蛋白可以包含SEQ ID NO：90的两个或三个拷贝等。
α－麦醇溶蛋白在二维电泳中具有特征性的电泳迁移率，在第一维具有等电聚焦，在第二维具有酸性pH下的淀粉凝胶电泳。
α-麦醇溶蛋白通常含有20个氨基酸的信号肽、5个残基的N-末端区域、110至130个残基的重复结构域和140至160个残基的C-末端区域。C-末端区域的区别在于含有四个半胱氨酸残基的富含半胱氨酸的区域(CI)、含有谷氨酰胺残基片段的富含谷氨酰胺的区域(CII)，和具有最后两个半胱氨酸残基的35至39个残基序列(CIII)。六个半胱氨酸残基形成三个分子内二硫键。N-末端重复结构域含有重复基序：P(F/Y)PQ3–5。在重复结构域的C-末端部分和C-末端区域的CII中存在两段聚谷氨酰胺。α－麦醇溶蛋白的质量在30至34kD之间变化，这种变化归因于重复结构域和两个聚谷氨酰胺片段长度的变化。
野生型α-麦醇溶蛋白的示范性氨基酸序列在SEQ ID NO：32和81至89中提供。
在一个实施例中，本文公开的修饰的α-麦醇溶蛋白具有与SEQ ID NO：32和81至89中所示的任一序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的序列。
两个氨基酸序列的“同一性百分比”可以使用Karlin和Altschul在《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》87:2264-68，1990的算法确定，在Karlin和Altschul，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》90:5873-77，1993进行了修改。这种算法被结合到Altschul等人在《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-10，1990的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)中。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序进行，评分＝50，字长＝3，以获得与目的蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在间隙的情况下，GappedBLAST可以如Altschul等人在《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25(17):3389-3402，1997中所述使用。当使用BLAST和apped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST核苷酸程序参数集进行，例如评分＝100，字长＝12，以获得与本文所述核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序参数集进行，例如评分为50，字长＝3，以获得与本文所述蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得间隙对准以进行比较，可以使用如Altschul S F等人，(1997)《核酸研究》25：3389 3402中所述的Gapped BLAST。替代地，PSI BLAST可用于进行检测分子间距离关系的迭代搜索(Id.)。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI Blast程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如万维网上的生物技术信息国家中心(NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用于序列比较的数学算法的另一个具体的非限制性实例是Myers和Miller的算法，1988，CABIOS 4:11 17。这种算法被结合在ALIGN程序(2.0版)中，其是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表，间隙长度罚分为12，间隙罚分为4。在允许或不允许间隙的情况下，可以使用与上述技术类似的技术两个序列之间的百分比同一性。在计算同一性百分比时，通常只计算精确的匹配。
如本文所用，术语“表位”是指由淋巴细胞识别的决定簇。表位可以是由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递并能够特异性结合T细胞受体的肽。在某些实施例中，表位是被T细胞受体特异性结合的T细胞免疫原的区域。在某些实施例中，表位可以包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基。在某些实施例中，表位可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
本发明该方面的T细胞表位通常是短肽，其与I类或II类MHC分子结合，从而形成三元复合物，该三元复合物可以由带有以适当亲和力与MHC/肽复合物结合的匹配T细胞受体的T细胞识别。与I类MHC分子结合的肽通常长约8至14个氨基酸，但也可以更长。与II类MHC分子结合的T细胞表位通常长约12至30个氨基酸，但也可以更长。在与II类MHC分子结合的肽的情况下，相同的肽和对应的T细胞表位可以共享共同的核心片段，但由于分别在核心序列的氨基末端上游和其羧基末端下游具有不同长度的侧翼序列，因此总长度不同。如果T细胞表位引发免疫应答，则可将其分类为抗原。
术语“去表位蛋白”是指在已经被鉴定为表位的位点上包含突变的蛋白，其以比其野生型对应物对其相关MHC蛋白的亲和力低的亲和力结合和/或以比其野生型对应物低的程度活化T细胞，如下文进一步所述。
优选地，去表位蛋白包含至少一种存在于其野生型对应物中的基本物理性质。因此，例如在α-麦醇溶蛋白的情况下，去表位的α-麦醇溶蛋白优选地能够有助于面包面团的流动特性。
在细胞表面转运和呈递肽的分子被称为主要组织相容性复合物(MHC)的蛋白质。MHC蛋白质分为两类，称为I类MHC和II类MHC。这两种MHC类的蛋白质的结构非常相似；然而，它们具有非常不同的功能。I类MHC蛋白质存在于几乎所有身体细胞的表面，包括大多数肿瘤细胞。I类MHC蛋白质负载有抗原，这些抗原通常来源于内源性蛋白质或来源于细胞内存在的病原体，然后呈递到幼稚T淋巴细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。II类MHC蛋白质存在于树突细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和其它抗原呈递细胞上。它们主要将从外部抗原来源，即细胞外部加工的肽呈递给辅助T细胞(Th)。T细胞受体能够识别和结合与I类或II类MHC分子复合的肽。每种细胞毒性T淋巴细胞表达能够结合特异性MHC/肽复合物的特异性T细胞受体。
抗原呈递细胞(APC)是在其细胞表面上呈递与MHC分子结合的蛋白质抗原的肽片段的细胞。一些APC可激活抗原特异性T细胞。APC的实例包括但不限于树突细胞、β细胞和巨噬细胞。
根据特定的实施例，T细胞表位是乳糜泻相关的表位——即，该表位呈递在乳糜泻患者的抗原呈递细胞(APC)上。
本教导还涉及其它形式的麸质敏感性。在某些实施例中，术语乳糜泻旨在涵盖那些形式。
乳糜泻是一种长期的自身免疫疾病，其主要影响小肠。典型症状包括胃肠道问题，如慢性腹泻、腹胀、吸收不良、食欲不振和儿童发育迟缓。这通常开始于六个月到两岁之间。非典型症状更常见，尤其是在两岁以上的人群中。可能存在轻度或无胃肠症状，涉及身体任何部位的大量症状或无明显症状。
乳糜泻是由对麸质的反应引起的，这些麸质是在小麦和在其它谷物，如大麦和黑麦中发现的各种蛋白质。接触麸质后，异常的免疫应答可能导致产生几种不同的自身抗体，其可影响许多不同的器官。在小肠中，这会引起炎症反应，并可能导致小肠内壁的绒毛缩短。
通常结合血液抗体测试和肠道活组织检查进行诊断，并辅以特异性基因检测。虽然这种疾病是由对小麦蛋白的永久性不耐受引起的，但它不是小麦过敏的形式。
如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”是指参与响应抗原呈递的T细胞活化的膜蛋白复合物。TCR负责识别与主要组织相容性复合物分子结合的抗原。TCR由α链和β链的异源二聚体组成，尽管在一些细胞中TCR由γ链和δ链组成。TCR可以以α/β和γ/δ形式存在，它们在结构上相似但具有不同的解剖学位置和功能。每条链由两个胞外结构域组成，一个可变结构域和一个恒定结构域。在一些实施例中，TCR可以在包含TCR的任何细胞上修饰，包括例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、自然杀伤性T细胞和γδT细胞。本发明的TCR可以以多种形式存在，包括具有或不具有突变的TCR的不同片段。
术语“T细胞免疫原”是指能够引发T细胞介导的免疫应答的试剂(例如蛋白质)。T细胞免疫原包含至少一个T细胞表位。在一个实施例中，T细胞免疫原是小麦蛋白，如麸质蛋白。
在一些实施例中，该方法包含在一个或多个鉴定的表位中突变小麦多肽的一个或多个氨基酸残基。在一些实施例中，该方法包含突变多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个或更多个氨基酸残基。在一些实施例中，一个或多个突变破坏多肽上的一个或多个(或全部)鉴定的表位。用于制备包含一个或多个突变的多肽的方法是本领域普通技术人员熟知的。在一些实施例中，一个或多个突变是保守突变。在一些实施例中，一个或多个突变是非保守突变。在一些实施例中，一个或多个突变是保守突变和非保守突变的混合。
本发明该方面的突变可以是取代、缺失或插入。
根据特定的实施例，突变是取代。
根据特定的实施例，突变不影响小麦多肽的功能。
将核酸改变引入感兴趣的基因的方法是本领域熟知的[参见例如MenkeD.Genesis(2013)51:-618；Capecchi，《科学杂志(Science)》(1989)244:1288-1292；Santiago等人《美国国家科学院院刊》(2008)105:5809-5814；国际专利申请号WO2014085593、WO 2009071334和WO 2011146121；美国专利号8771945、8586526、6774279和UP专利申请公开号20030232410、20050026157、US20060014264；其内容通过引用整体并入本文]并且包括靶向同源重组、位点特异性重组酶、PB转座酶和通过工程化核酸酶进行的基因组编辑。用于将核酸改变引入感兴趣的基因的试剂可由公众可获得的来源设计或从Transposagen、Addgene和Sangamo Biosciences商购获得。在一些实施例中，基因序列的改变的生成可以通过筛选现有植物的序列以寻找所需序列的现有变体来实现。然后，可以通过杂交育种或通过基因编辑将该现有序列引入靶基因组的基因组中。在其它实施例中，通过引入随机诱变，随后筛选其中发生所需突变的变体，随后进行杂交育种来引入所需的变异。
以下是用于将核酸改变引入感兴趣基因的各种示范性方法和可根据本发明的具体实施例使用的用于实施该方法的试剂的描述。
使用工程化核酸内切酶进行基因组编辑——该方法是指一种反向遗传学方法，使用人工工程化的核酸酶在基因组中的所需位置切割并产生特异性双链断裂的，然后通过细胞内源性过程进行修复，如同源定向修复(HDS)和非同源末端连接(NFfEJ)。NFfEJ在双链断裂中直接连接DNA末端，而HDR利用同源序列作为模板在断裂点再生缺失的DNA序列。为了将特定核苷酸修饰引入到基因组DNA，在HDR期间必须存在含有期望的序列的DNA修复模板。无法使用传统限制性核酸内切酶进行基因组编辑，因为大部分限制性酶将DNA上的几个碱基对识别为其靶点，并且将在跨越基因组的许多位置发现所识别碱基对组合的概率极高，产生不限于所需位置的多个切口。为了克服这一挑战并且产生位点特异性的单链或双链断裂，已经发现若干不同类别的核酸酶并且迄今为止对其进行生物工程改造。这些包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化剂(如效应子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统)。
大范围核酸酶——大范围核酸酶通常分为四个家族：LAGLIDADG(SEQ ID NO：119)家族、GIY-YIG(SEQ ID NO：118)家族、His-Cys盒家族和HNH家族。这些家族的特征在于结构基序，其影响催化活性和识别序列。例如，LAGLIDADG(SEQ ID NO：119)家族成员的特征在于具有保守LAGLIDADG(SEQ ID NO：119)基序的一个或两个拷贝。大范围核酸酶的四个家族在保守的结构元件方面彼此明显不同，并且因此，在DNA识别序列特异性和催化活性方面明显不同。在微生物物种中通常发现大范围核酸酶，并且具有极长识别序列(>14bp)的独特特性，因此使其自然地对在所要位置处切割具有特异性。这可以被采用用于以在基因组编辑中做出位点特异性的双链断裂。本领域的技术人员可以使用这些天然存在的裂解酶，然而此类天然存在的裂解酶的数目受到限制。为了克服此挑战，已经使用诱变和高通量筛选方法来产生识别独特序列的大范围核酸酶变异体。举例来说，已经融合多种大范围核酸酶以产生识别新序列的杂交酶。或者，可将大范围核酸酶的DNA相互作用氨基酸更改到设计序列特异性大范围核酸酶(参见例如美国专利8,021,867)。可使用以下所描述的方法设计大范围核酸酶：例如Certo、MT等人《自然方法(Nature Methods)》(2012)9:073-975；美国专利号8,304,222；8,021,867；8,119,381；8,124,369；8,129,134；8,133,697；8,143,015；8,143,016；8,148,098；或8,163,514，其内容以全文引用的方式并入本文中。或者，可使用市售技术(例如，Precision Biosciences的Directed Nuclease EditorTM基因组编辑技术)获得具有位点特定切割特征的大范围核酸酶。
ZFN和TALEN——两种不同类型的工程化核酸酶，锌指核酸酶(ZFN)和转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)，都已证明在产生靶向双链断裂方面是有效的(Christian等人，2010；Kim等人，1996；Li等人，2011；Mahfouz等人，2011；Miller等人，2010)。
基本上，ZFN和TALEN限制性内切核酸酶技术利用非特异性DNA切割酶，其与特异性DNA结合结构域(分别为一系列锌指结构域或TALE重复)连接。通常选择其DNA识别位点和切割位点彼此分离的限制酶。将切割部分离并且然后与DNA结合结构域连接，由此产生对于期望的序列具有非常高的特异性的核酸内切酶。具有此类性质的示范性限制酶是Fokl。另外，Fokl具有需要二聚化以具有核酸酶活性的优点，这意味着当每个核酸酶配偶体识别独特的DNA序列时特异性显著增加。为了增强此作用，已将Fokl核酸酶工程化为仅可以充当异源二聚体并具有增加的催化活性。异源二聚体功能的核酸酶避免了不希望的同源二聚体活性的可能性并且由此增加了双链断裂的特异性。
因此，例如为了靶向特定位点，ZFN和TALEN被构建为核酸酶对，其中该对的每个成员被设计为结合靶位点处的相邻序列。在细胞中瞬时表达时，核酸酶与其靶位点结合，并且FokI结构域异源二聚化以产生双链断裂。通过非同源末端连接(NHEJ)途径修复这些双链断裂通常会导致小的缺失或小的序列插入。因为通过NHEJ进行的每种修复是独特的，所以使用单个核酸酶对可以在靶位点处产生具有一系列不同缺失的等位基因系列。缺失的长度范围通常为几碱基对至几百碱基对，但通过同时使用两对核酸酶在细胞培养中成功地生成了更大的缺失(Carlson等人，2012；Lee等人，2010)。另外，当与靶区域同源的DNA片段与核酸酶对结合引入时，可以通过同源定向修复来修复双链断裂以生成特定修饰(Li等人，2011；Miller等人，2010；Urnov等人，2005)。
尽管ZFN和TALEN的核酸酶部分具有相似的性质，但是这些工程化核酸酶之间的区别在于它们的DNA识别肽。ZFN依赖于Cys2-His2锌指和TALE上的TALEN。这些DNA识别肽结构域都具有以下特征：其天然地发现于其蛋白质中的组合中。Cys2-His2锌指通常存在于隔开3bp的重复序列中，并且以不同组合的形式存在于多种核酸相互作用蛋白中。另一方面，TALE存在于氨基酸与所识别的核苷酸对之间的识别比为一比一的重复序列中。因为锌指和TALE两者都以重复模式发生，所以可以尝试不同组合以产生各种序列特异性。用于制备位点特异性锌指核酸内切酶的方法包含，例如，模块组装(其中与三联体序列相关的锌指以排的形式连接以覆盖所需的序列)、OPEN(肽结构域对核苷酸三联体的低严格性选择之后是肽组合对细菌系统中的最终靶标的高严格性选择)和锌指文库的细菌单杂交筛选等。ZFN还可以由例如Sangamo BiosciencesTM(Richmond,CA)设计和市售获得。
用于设计和获得TALEN的方法描述于例如Reyon等人《自然生物技术(NatureBiotechnology)》2012年5月；30(5):460-5；Miller等人《自然生物技术》(2011)29:143-148；Cermak等人《核酸研究》(2011)39(12)：e82和Zhang等人《自然生物技术》(2011)29(2)：149–53。通过Mayo Clinic引入命名为Mojo Hand的基于最近开发的网络的程序，以设计用于基因组编辑应用的TAL和TALEN构建体(可以通过www(点)talendesign(点)org访问)。TALEN还可以由例如Sangamo BiosciencesTM(Richmond,CA)设计和市售获得。
CRISPR-Cas系统——许多细菌和古细菌含有基于内源性RNA的适应性免疫系统，其可以降解侵入噬菌体和质粒的核酸。这些系统由产生RNA组分的成簇的、规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)基因和对蛋白质组分进行编码的CRISPR相关(Cas)基因组成。CRISPRRNA(crRNA)含有与特定病毒和质粒同源的较短延伸并且充当用于导引Cas核酸酶以使对应病原体的互补核酸降解的向导。对酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的II型CRISPR/Cas系统的研究已经表明，三种组分形成RNA/蛋白质复合物并且一起足以实现序列特异性核酸酶活性：Cas9核酸酶，含有与靶序列同源的20个碱基对的crRNA和反式激活crRNA(tracrRNA)(Jinek等人《科学(Science)》(2012)337:816–821.)。进一步证明了由crRNA与tracrRNA之间的融合物构成的合成嵌合向导RNA(gRNA)可以导引Cas9以切割在体外与crRNA互补的DNA靶标。还证实，Cas9与合成gRNA的瞬时表达可用于在多种不同物种中产生目靶向双链制动器(Cho等人，2013；Cong等人，2013；Dicarlo等人，2013；Hwang等人，2013a，b；Jinek等人，2013；Mali等人，2013)。
用于基因组编辑的CRIPSR/Cas系统含有两种不同的组分：gRNA和核酸内切酶，例如Cas9。
gRNA通常是编码靶同源序列(crRNA)和内源性细菌RNA的组合的20核苷酸序列，其将crRNA连接到单个嵌合转录物中的Cas9核酸酶(tracrRNA)。通过gRNA序列与补体基因组DNA之间的碱基配对将gRNA/Cas9复合物募集到靶向序列。为了成功结合Cas9，基因组靶向序列还必须含有紧邻靶向序列的正确的前间区序列邻近基序(PAM)序列。gRNA/Cas9复合物的结合将Cas9定位到基因组靶向序列，使得Cas9可切割DNA的两个链，引起双链断裂。正如使用ZFN和TALEN，由CRISPR/Cas产生的双链制动器可经历同源重组或NHEJ。
Cas9核酸酶具有两个功能结构域：RuvC和HNH，其各自切割不同的DNA链。当这两个结构域都具有活性时，Cas9引起基因组DNA中的双链断裂。
CRISPR/Cas的显著优点是该系统的高效率以及容易产生合成gRNA的能力使得能够同时靶向多个基因。另外，大多数携带突变的细胞在靶基因中存在双等位基因突变。
然而，gRNA序列和基因组DNA靶序列之间碱基配对相互作用的明显灵活性允许Cas9切割与靶序列的不完全匹配。
含有单个失活催化结构域(RuvC-或HNH-)的Cas9酶的修饰版本被称为“切口酶”。在仅一个活性核酸酶结构域的情况下，Cas9切口酶切割仅靶DNA的一个链，从而产生单链断裂或“切口”。单链断裂或切口通常使用完整的互补DNA链作为模板，通过HDR路径快速修复。然而，将由Cas9切口酶引入的两个邻近的相对链切口处理为双链断裂，因为其通常被称为“双切口”CRISPR系统。双切口可以通过NHEJ或HDR修复，这取决于对基因靶标的期望的作用。因此，如果特异性和减小的脱靶作用至关重要，则使用Cas9切口酶以通过将两个gRNA设计成具有紧挨着的靶序列并且位于基因组DNA的相对链上来产生双切口将降低脱靶作用，因为单独的gRNA将产生不会改变基因组DNA的切口。
含有两个非活性催化结构域的Cas9酶的经修饰版本(死Cas9或dCas9)在仍能够基于gRNA特异性与DNA结合的同时不具有核酸酶活性。可以利用dCas9作为DNA转录调节子的平台，以通过将非活性酶融合到已知调节结构域来激活或抑制基因表达。例如，单独的dCas9与基因组DNA中的靶序列的结合可能干扰基因转录。
有许多公开可用的工具可用于帮助选择和/或设计靶序列以及生物信息学确定的用于不同物种中的不同基因的独特gRNA的列表，如Feng Zhang实验室的靶探测器、MichaelBoutros实验室的靶探测器(E-CRISP)、RGEN工具：Cas-OFFinder，CasFinder：用于鉴定基因组中特定Cas9靶标的灵活算法和CRISPR最佳靶标寻找器。
为了使用CRISPR系统，gRNA和Cas9两者应在靶细胞中表达。插入载体在单个质粒上可以含有两个盒，或所述盒由两个单独质粒表达。CRISPR质粒在市场上可以买到，如Addgene公司的px330质粒。
“打了就跑(Hit and run)”或“进出(in-out)”——涉及两步重组过程。在第一步中，含有双阳性/阴性选择标记盒的插入型载体用于引入所需的序列改变。插入载体含有与靶基因座同源的单个连续区域，并经过修饰以携带感兴趣的突变。用限制酶在同源区内的一个位点将该靶向构建体线性化，电穿孔到细胞中，并进行阳性选择以分离同源重组体。这些同源重组体含有由插入载体序列分开的局部重复，包括选择盒。在第二步中，对靶克隆进行阴性选择以鉴定通过复制序列之间的染色体内重组丢失了选择盒的细胞。局部重组事件去除重复，并且根据重组位点，等位基因保留引入的突变或恢复为野生型。最终结果是在不保留任何外源序列的情况下引入所需的修饰。
“双重替换”或“标记和交换”策略——涉及类似于打了就跑方法的两步选择程序，但需要使用两种不同的靶向构建体。在第一步中，使用具有3′和5′同源臂的标准靶向载体在待引入突变的位置附近插入双阳性/阴性可选择盒。在电穿孔和阳性选择后，鉴定同源靶向克隆。接着，将含有与所需突变同源的区域的第二靶向载体电穿孔到靶向克隆中，并应用阴性选择以除去选择盒并引入突变。最终的等位基因含有所需的突变，同时消除了不需要的外源序列。
位点特异性重组酶——源自P1噬菌体的Cre重组酶和源自酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Flp重组酶是位点特异性DNA重组酶，其各自识别独特的34个碱基对的DNA序列(分别称为“Lox”和“FRT”)，并且侧接Lox位点或FRT位点的序列可以分别在表达Cre或Flp重组酶时通过位点特异性重组容易地除去。例如，Lox序列由侧接有13个碱基对反向重复序列的不对称八碱基对间隔子区域构成。通过结合到13个碱基对反向重复序列和催化间隔区域内的链分裂和重新连接，Cre使34个碱基对lox DNA序列重组。间隔区域中由Cre制得的交错DNA切割由6个碱基对分离，得到充当同源传感器的重叠区域，以确保仅具有相同重叠区域的重组位点重组。
基本上，位点特异性重组酶系统提供了在同源重组后去除选择盒的方法。该系统还允许生成条件更改的等位基因，所述条件更改的等位基因可以以时间或组织特异性方式失活或激活。值得注意的是，Cre和Flp重组酶留下34个碱基对的Lox或FRT“疤痕”。保留的Lox或FRT位点通常留在修饰的基因座的内含子或3′UTR中，并且目前的证据表明这些位点通常不会显著干扰基因功能。
因此，Cre/Lox和Flp/FRT重组涉及引入具有3′和5′同源臂的靶向载体，其含有感兴趣的突变、两个Lox或FRT序列和通常置于两个Lox或FRT序列之间的可选择盒。应用阳性选择并且鉴别含有靶向突变的同源重组物。Cre或Flp的瞬时表达结合阴性选择导致切除选择盒，并且选择其中盒已经丢失的细胞。最终靶向的等位基因含有外源序列的Lox或FRT疤痕。
转座酶——如本文所用，术语“转座酶”是指结合转座子末端并催化转座子向基因组另一部分移动的酶。
本文所用，术语“转座子”是指包含核苷酸序列的可移动遗传元件，该核苷酸序列可在单个细胞的基因组内移到不同位置。在这个过程中，转座子可以引起突变和/或改变细胞基因组中DNA的量。
已经分离或设计了许多也能够在细胞(例如脊椎动物)中转座的转座子系统，如睡美人(Sleeping Beauty)[Izsvák和Ivics的《分子治疗(Molecular Therapy)》(2004)9，147-156]、piggyBac[Wilson等人《分子治疗》(2007)15，139-145]、Tol2[Kawakami等人《美国国家科学院院刊(PNAS)》(2000)97(21)：11403-11408]或青蛙王子(Frog Prince)[Miskey等人《核酸研究》12月1日，(2003)31(23)：6873-6881]。通常，DNA转座子以简单、切割和粘贴的方式从一个DNA位点易位到另一个。这些元件中的每一个具有其自身的优点，例如，睡美人在区域特异性诱变中特别有用，而Tol2具有整合到表达的基因中的最高倾向。超活跃系统可用于睡美人和piggyBac。最重要的是，这些转座子具有不同的靶位点偏好，因此可以在重叠但不同的基因集合中引入序列改变。因此，为了实现基因的最佳可能覆盖，特别优选使用一种以上的元件。不同转座酶之间共享基本机制，因此我们将以piggyBac(PB)为例进行描述。
PB是一种2.5kb的昆虫转座子，最初从甘蓝蠖度尺蛾(Trichoplusia ni)中分离出来。PB转座子由位于转座酶PBase侧翼的不对称末端重复序列组成。PBase识别末端重复序列并通过基于“切割－粘贴”的机制诱导转座，并优先以四核苷酸序列TTAA转座到宿主基因组中。插入后，TTAA靶位点被复制，使得PB转座子的侧翼为该四核苷酸序列。当动员时，PB通常将其自身精确切除以重建单个TTAA位点，从而将宿主序列恢复到其转座子前状态。切除后，PB可以转置到新的位置或永久地从基因组中丢失。
通常，转座酶系统提供了一种类似于使用Cre/Lox或Flp/FRT在同源重组退出后除去选择盒的替代方法。因此，例如，PB转座酶系统涉及引入具有3′和5′同源臂的靶向载体，其含有感兴趣的突变、在内源性TTAA序列的位点处的两个PB末端重复序列和置于PB末端重复序列之间的选择盒。应用阳性选择并且鉴别含有靶向突变的同源重组物。PBase的瞬时表达去除结合阴性选择导致选择盒的切除并选择盒已丢失的细胞。最终的靶向等位基因含有引入的突变而没有外源序列。
为了使PB对引入序列改变有用，必须有一个天然的TTAA位点，该位点相对靠近插入特定突变的位置。
使用重组腺伴随病毒(rAAV)平台进行基因组编辑——该基因组编辑平台基于rAAV载体，其能够在活哺乳动物细胞的基因组中插入、删除或取代DNA序列。rAAV基因组是阳性或阴性感测的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)分子，其长度为约4.7kb。这些单链DNA病毒载体具有较高转导速率并且具有在基因组中不存在双链DNA断裂的情况下刺激内源性同源重组的独特特性。本领域的技术人员可以设计rAAV载体以靶向所要基因组基因座并且在细胞中进行总体和/或细微内源基因改变两种。rAAV基因组编辑具有以下优势：其靶向单一等位基因且并不产生任何脱靶基因组改变。rAAV基因组编辑技术可商购，例如来自HorizonTM(英国剑桥)的rAAV GENESISTM系统。
用于鉴定效力和检测序列改变的方法是本领域熟知的，包括但不限于DNA测序、电泳、基于酶的错配检测测定和如PCR、RT-PCR等杂交测定、RNase保护、原位杂交、引物延伸、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交和斑点印迹分析。
还可以使用例如层析、电泳方法、如ELISA和蛋白质印迹分析的免疫检测测定法和免疫组织化学在蛋白质水平上测定特定基因中的序列改变。
另外，本领域普通技术人员可以容易地设计包括阳性和/或阴性选择标记的敲入/敲除构建体，用于有效地选择经历与该构建体同源重组事件的转化细胞。阳性选择提供了用于富集已经吸收外来DNA的克隆群体的手段。此类阳性标记的非限制性实例包括谷氨酰胺合成酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)、赋予抗生素抗性的标记，如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素和杀稻瘟素S抗性盒。阴性选择标记物需要针对标记物序列(例如，阳性标记物)的随机整合和/或消除进行选择。此类阴性标记的非限制性实例包括将更昔洛韦(GCV)转化为细胞毒性核苷类似物的单纯疱疹-胸苷激酶(HSV-TK)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(ARPT)。
在一些实施例中，一个或多个突变不破坏多肽的功能(例如，相对于对应的未突变多肽的功能，不会破坏突变多肽的功能)。在一些实施例中，一个或多个突变不破坏多肽的面团增强能力。在一些实施例中，一个或多个突变不破坏多肽的面团弹性促进能力。在一些实施例中，一个或多个突变不破坏多肽的面团醒发促进能力。在一些实施例中，一个或多个突变不显著影响小麦的生长(例如种子产量、种子数、种子大小)。在一些实施例中，一个或多个突变不破坏多肽的天然蛋白质－蛋白质相互作用(例如，突变的多肽保留形成与对应的未突变多肽基本上相同的蛋白质-蛋白质相互作用的能力)。在一些实施例中，一个或多个突变不破坏多肽的三维结构(例如，突变的多肽保留与对应的未突变的多肽基本上相同的三维结构)。在一些实施例中，一个或多个突变不破坏多肽的折叠(例如，突变的多肽保留与对应的未突变的多肽基本相同的蛋白质折叠)。在一些实施例中，一个或多个突变不破坏多肽的翻译(例如，突变的多肽以与对应的未突变多肽相同的时间、相同的速率、相同的水平等翻译)。在一些实施例中，一个或多个突变不破坏多肽的正常细胞定位(例如，突变的多肽保留与对应的未突变的多肽基本上相同的细胞定位)。在一些实施例中，一个或多个突变不破坏多肽上的任何翻译后修饰(例如，突变的多肽保留与对应的未突变多肽基本上相同的翻译后修饰谱)。在又一些实施例中，一个或多个突变不破坏小麦多肽的变应原性(例如，突变的多肽保留与对应的未突变的多肽基本上相同的IgE抗体结合亲和力)。在一些实施例中，一个或多个突变不影响本文上述参数中的至少两个、三个、四个、五个或更多个。在一些实施例中，一个或多个突变不影响本文上述的任何参数。
用于检查本发明的去表位麸质的蛋白质结构/折叠/生物化学-生物物理学性质的方法包括流体动力学研究(参见例如Field，J.M.，Tatham，A.S.&Shewry,P.R.1987.《生物化学杂志(Biochem.J.)》247,215-221；Castellia,F.等人，2000.《Thermochimica Acta》346，153－160)；核磁共振波谱法(参见例如Bekkers,A.C.等人1996，在Gluten 96——第六届国际小麦麸质研讨会，悉尼，1996年9月，第190至194页。澳大利亚北墨尔本：澳大利亚皇家化学研究所；Eliezer,D.，《内在无序蛋白质的生物物理表征(Biophysicalcharacterization of intrinsically disordered proteins)》。《结构生物学评论(CurrOpin Struct Biol.)》2009；19(1):23-30)；圆二色性测量(参见例如Tatham,A.S.,Shewry,P.R.,1985.《谷物科学杂志(J.Cereal Sci.)》3，104-113)；异源表达分析(参见例如Tatham,A.S.,Shewry,P.R.,1985.《谷物科学杂志(J.Cereal Sci.)》3，104-113)；静态和动态光散射测量(参见例如Herrera,M.；Dodero,V.在《Proceedings of theF.Bioact.Process.Qual.&Nutr.》，2013年4月10－12日；科学论坛电子会议系列；T.A.Engorov，《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)》，第434卷，第1-2期，1998年，第215-217页)；小角X射线散射(参见例如Neil H.Thomson，《生物化学与生物物理学报(BBA)》——《蛋白质结构与分子酶学(Protein Structure and Molecular Enzymology)》，第1430卷，第2期，1999年，第359-366页；Eliezer,D.，《结构生物学评论》2009；19(1):23-30)；超小角中子散射(参见例如Mohsen Daheshet al.，《物理化学杂志(The Journal ofPhysical Chemistry)》B 2014 118(38)，11065－11076。DOI：10.1021/jp5047134；Gibbs,B.E.&Showalter,S.A.2015，《生物化学(Biochemistry)》54，1314-1326；荧光相关光谱学(FCS)(参见例如Eliezer,D.，《结构生物学评论》2009；19(1):23-3)；和单分子FRET(smFRET)(参见例如Gibbs,B.E.&Showalter,S.A.2015，《生物化学》54，1314－1326)。所有上述参考文献的内容通过引入并入本文。
优选地，本发明任一方面的突变(即去表位)多肽与乳糜泻相关MHCII蛋白质(例如HLA-DQ2或HLA-DQ8)或源自乳糜泻患者的T细胞的结合亲和力比对应的未突变多肽与MHCII蛋白质或源自相同乳糜泻患者的T细胞的结合亲和力差。此外，本文描述的去表位多肽优选地与DQ7.5 MHCII II蛋白质结合的亲和力比对应的未突变多肽与DQ7.5 MHCII蛋白质结合的亲和力差。
因此，以浓度为单位测量的去表位多肽与乳糜泻相关MHCII蛋白质(例如HLA-DQ2或HLA-DQ8)或与源自乳糜泻患者的T细胞的亲和力值比对应的未突变多肽与源自相同乳糜泻患者的T细胞的结合高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一个实施例中，消除了突变的(即去表位的)多肽与乳糜泻相关的MHCII蛋白质(例如HLA-DQ2或HLA-DQ8)或与T细胞的结合。测量肽/多肽与乳糜泻相关的MHCII蛋白质(例如HLA-DQ2或HLA-DQ8)或与T细胞的结合的方法是本领域已知的，并且包括例如：1)使用凝胶过滤和与明确定义的放射性标记的参考肽的竞争性结合的组合来检测肽/MHCII复合物(Sidney等人，《Curr.Protoc.Immunol.》2013)；2)使用与麸质肽融合的MHCII四聚体通过流式细胞仪检测和定量与麸质特异性CD4+T细胞的结合(Raki等人，PNAS 2007)；3)通过探测IFN-γ的分泌来测量麸质特异性CD4+T细胞的活化的ELISpot或ELISA测定(Anderson等人，Gut2005)；4)在相关APC(例如，表达HLA DQ8或HLA DQ2.5的细胞)和麸质肽存在下麸质特异性T细胞的增殖测定(Kooy-Winkelaar等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》2011)。
根据具体的实施例，本发明的去表位多肽不包含以小于20μM、小于30μM或甚至小于40μM的IC50与MHC类型DQ2或DQ8结合的15聚体肽——参见下文的实例5。
优选地，突变的(即去表位的)多肽激活源自乳糜泻患者的T细胞的程度(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)小于对应的非突变的激活来自相同乳糜泻患者的T细胞的程度。下文实例部分描述了示范性的T细胞活化测定。
在一个实施例中，术语“突变”是指表达相对于野生型蛋白质具有突变的重组多肽。
因此，根据特定的实施例，α-麦醇溶蛋白多肽是重组多肽。
本发明人还考虑了编码上述麦醇溶蛋白多肽的分离的多核苷酸。此类多核苷酸可用于在宿主细胞(例如细菌或植物)中表达上述去表位的麦醇溶蛋白多肽。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核酸”及其变体应通用于多聚脱氧核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)、嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的任何其它类型的多核苷酸，以及含有非核苷酸主链的其它聚合物，前提是这些聚合物含有呈允许碱基配对和碱基堆积的配置的核碱基，如在DNA和RNA中发现的那样。因此，这些术语包括已知类型的核酸序列修饰，例如，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，和核苷酸间修饰。
常用的异源蛋白生产表达系统包括细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))、真菌细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞)、植物细胞(例如烟草、玉米)、昆虫细胞(鳞翅目细胞)和其它哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞)。
在宿主细胞(例如植物)中表达本发明的外源多核苷酸可以通过用外源多核苷酸转化宿主的一个或多个细胞来实现。
优选地，通过向宿主细胞引入核酸构建体来实现转化，核酸构建体包括本发明的外源多核苷酸和至少一个能够指导外源多核苷酸在宿主细胞中转录的启动子。下文提供了合适的转化方法的进一步细节。
如本文所用，术语“启动子”是指位于RNA聚合酶结合以启动RNA转录的基因的转录起始位点上游的DNA区域。启动子控制基因在何处(例如，植物的哪个部分、动物内的哪个器官等)和/或何时(例如，生物体生命中的哪个阶段或条件)表达。
本发明的核酸构建体可以使用任何合适的启动子序列。优选地，启动子是组成型启动子、组织特异性启动子或植物特异性启动子(如小麦启动子)。
合适的组成型启动子包括，例如，CaMV 35S启动子(SEQ ID NO：19；Odell等人，《自然杂志(Nature)》313:810－812，1985)；玉米Ubi 1(Christensen等人，《Plant Sol.Biol.》18:675-689，1992)；水稻肌动蛋白(McElroy等人，《植物细胞(Plant Cell)》2:163－171，1990)；水稻谷蛋白(Qu，Leqing等人《J Exp Bot》59:9，2417－2424，2008)；pEMU(Last等人，《理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)》81:581-588，1991)；以及合成的超级MAS(Ni等人，《植物杂志(The Plant Journal)》7：661－76，1995)。其它组成型启动子包括美国专利号5,659,026，5,608,149；5.608,144；5,604,121；5.569,597:5.466,785；5,399,680；5,268,463；和5,608,142中的那些。
合适的组织特异性启动子包括但不限于叶特异性启动子，如Yamamoto等人，《植物杂志》12:255-265，1997；Kwon等人，《植物生理学(Plant Physiol.)》105:357-67，1994；Yamamoto等人，《植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)》35:773-778，1994；Gotor等人，《植物杂志》3:509-18，1993；Orozco等人，《植物分子生理学(Plant Mol.Biol.》23:1129-1138，1993；和Matsuoka等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》90:9586－9590，1993中描述的。
合适的小麦特异性启动子包括但不限于Smirnova,O.G.和Kochetov,A.V.Russ《应用遗传学研究杂志(J Genet Appl Res)》(2012)2：434中描述的那些。www(dot)doi(dot)org/10(dot)1134/S2079059712060123
本发明的核酸构建体优选地进一步包括合适的选择标记和/或复制起点。优选地，使用的核酸构建体是穿梭载体，其可以在大肠杆菌中繁殖(其中构建体包含合适的选择标记和复制起点)并且与细胞中的增殖相容。根据本发明的构建体可以是例如质粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。
如上所述，通过用带正电荷的氨基酸、脯氨酸或脂肪族氨基酸取代具有如QLPYPQP(SEQ ID NO：90)、QLPYSQP(SEQ ID NO：91)或PLPYPQP(SEQ ID NO：92)所示氨基酸序列的抗原单元的第一个氨基酸(即位置1)；以及在抗原单元的位置4或5处再取代至少一个氨基酸残基来进行α-麦醇溶蛋白的去表位。
本发明人提出，如上所述取代至少一个抗原单元的第一个氨基酸，如上所述取代至少两个抗原单元的第一个氨基酸，如上所述取代至少三个抗原单元的第一个氨基酸，或如上所述取代所有抗原单元的第一个氨基酸。
设想的带正电荷的氨基酸包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸。
在一个实施例中，该单元的第一个氨基酸被取代为组氨酸或赖氨酸。
本发明设想的在位置1的脂肪族氨基酸的实例是甲硫氨酸。脂肪族氨基酸的其它实例包括但不限于缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸。
根据特定的实施例，至少一个、至少两个、至少三个或所有抗原单元的位置1和位置4被取代。
抗原单元的第四个氨基酸可以被脯氨酸、脂肪族氨基酸、极性氨基酸或甘氨酸取代。
示范性脂肪族氨基酸已在上文描述。
极性氨基酸的实例是丝氨酸。
其它设想的极性氨基酸包括苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和酪氨酸。
根据特定的实施例，第四个氨基酸被取代为脯氨酸。
根据特定的实施例，至少一个、至少两个、至少三个或所有抗原单元的位置1和位置5被取代。
抗原单元的第五个氨基酸可以被小氨基酸、极性氨基酸或芳香族氨基酸取代。
根据特定的实施例，第五个氨基酸被小氨基酸(例如甘氨酸或丝氨酸)取代。
根据特定的实施例，至少一个、至少两个、至少三个或所有抗原单元的位置1、位置4和位置5被取代。
除了在位置1、4和/或5处取代氨基酸，本发明人设想突变(例如取代)抗原单元中的额外氨基酸。因此，例如本发明人设想用芳香族或极性氨基酸取代抗原单元的位置3处的氨基酸残基。
在一个实施例中，去表位的α-麦醇溶蛋白包含SEQ ID NO：60至80所示的氨基酸序列。
在另一实施例中，去表位的α-麦醇溶蛋白包含SEQ ID NO：49至58所示的氨基酸序列。
在另一实施例中，去表位的α-麦醇溶蛋白通常缺乏SEQ ID NO：93至112和115至117所示的氨基酸序列。
根据本发明的另一方面，提供了一种生成去表位的α-麦醇溶蛋白的方法，该方法包含在所述α-麦醇溶蛋白的氨基酸57和氨基酸89之间的位置突变一个或多个氨基酸残基，其中突变中的至少一个在选自由63、64、66、68、69、70、72、73、75、76、77、78、80、81、82、83和84的氨基酸上实现，从而生成去表位的α-麦醇溶蛋白，其中突变的位置根据SEQ ID NO：32所示的野生型α-麦醇溶蛋白的氨基酸序列。
根据本发明该方面的特定实施例，至少一个变异位于α-麦醇溶蛋白蛋白质的序列LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF-SEQ ID NO：33中(即在氨基酸57和氨基酸89之间)，其中编号是根据具有如SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列的野生型α-麦醇溶蛋白。
在一个实施例中，α-麦醇溶蛋白的突变使得蛋白质的脱酰胺氨基酸序列(即当氨基酸序列的谷氨酰胺变为谷氨酸时)包含SEQ ID NO：36、37、38、41、42、43、46、47或48所示的序列。
I在一个实施例中，本发明的去表位的α-麦醇溶蛋白包含SEQ ID NO：32所示的碱基序列和在指定位置63、64、66、68、69、70、72、73、75、76、77、78、80、81、82、83和84处的至少一个保守或非保守取代。
如本文所用的短语“非保守取代”是指亲本序列中存在的氨基酸被具有不同电化学和/或空间性质的另一种天然或非天然存在的氨基酸替换。因此，取代氨基酸的侧链可以显著大于(或小于)被取代的天然氨基酸的侧链和/或可具有与被取代的氨基酸具有显著不同的电子性质的官能团。这种类型的非保守取代的实例包括苯丙氨酸或环己基甲基甘氨酸取代丙氨酸、异亮氨酸取代甘氨酸，或-NH-CH[(-CH2)5-COOH]-CO-取代天冬氨酸。
应当理解，本文也设想了保守取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。关于哪些氨基酸改变可能是表型沉默的指导也可以在Bowie等人，1990，《科学》247：1306－1310中找到。这种保守修饰的变体是对多态性变体、种间同源物和等位基因的补充，但不排除这些变体。典型的保守取代包括但不限于：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，《蛋白质(Proteins)》(1984))。氨基酸可以基于与侧链相关的性质进行取代，例如，具有极性侧链的氨基酸可以被取代，例如，丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；基于侧链电荷的氨基酸，例如精氨酸(R)和组氨酸(H)；以及具有疏水侧链的氨基酸，例如缬氨酸(V)和亮氨酸(L)。如所指出的，变化通常具有较小的性质，例如不显著影响蛋白质的折叠或活性的保守氨基酸取代。
示范性取代包括但不限于P63D/W、Q64H、Q66R/K/H/M、P68S/R、Y69W/G、P70S、P72G、Q73W/R、P75R、Y76G、P77S、Q78H、Q80R/W、L81S、P82R、Y83G和P84T/M。
根据另一实施例，氨基酸序列的至少一个谷氨酰胺被改变为谷氨酸。
谷氨酰胺可转化成谷氨酸的示范性位置可以包括66、73和/或80。
可以使用各种方法将本发明一些实施例的表达载体引入细胞。这些方法通常描述于Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，冷泉港实验室(Cold Springs Harbor Laboratory)，纽约(1989，1992)、Ausubel等人，《分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》，约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons)，马里兰州巴尔的摩(1989)、Chang等人，《体细胞基因治疗(Somatic Gene Therapy)》，CRC出版社，密歇根州安娜堡(1995)、Vega等人，《基因打靶(Gene Targeting)》，CRC出版社，密歇根州安娜堡(1995)，《向量：分子克隆载体及其用途的综述(Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses)》，Butterworths出版社，马萨诸塞州波士顿(1988)和Gilboa等人[《生物技术(Biotechniques)》4(6):504-512,1986]并且包括例如稳定或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。另外，阳性-阴性选择方法参见美国专利号5,464,764和5,487,992。
本发明的核酸构建体可用于稳定或瞬时转化植物细胞。在稳定转化中，本发明的外源多核苷酸整合到植物基因组中，因此它代表一种稳定的遗传性状。在瞬时转化中，外源多核苷酸由转化的细胞表达，但不整合到基因组中，因此它代表一种瞬时性状。
有多种方法将外源基因导入单子叶植物和双子叶植物(Potrykus,I.，《植物生理学综述(Annu.Rev.Plant.Physiol.)》，《植物分子生物学(Plant.Mol.Biol.》(1991)42:205-225；Shimamoto等人，《自然杂志(Nature)》(1989)338:274－276)。
使外源DNA稳定整合到植物基因组DNA中的主要方法包括两种主要方法：
(i)农杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移：Klee等人(1987)《植物生理学综述(Annu.Rev.Plant Physiol.)》38:467-486；Klee和Rogers在《胞培养与植物体细胞遗传学(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants)》，第6卷，《植物核基因的分子生物学(Molecular Biology of Plant Nuclear Genes)》，编辑Schell,J.，和Vasil,L.K.，布里尔学术出版社(Academic Publishers)，加利福尼亚州圣地亚哥(1989)第2-25页；Gatenby，《植物生物技术(Plant Biotechnology)》编辑Kung,S.和Arntzen,C.J.，Butterworths出版社，马萨诸塞州波士顿(1989)第93-112页。
(ii)直接DNA摄取：Paszkowski等人，《细胞培养与植物体细胞遗传学》，第6卷，《植物核基因的分子生物学》编辑Schell,J.，和Vasil,L.K.，布里尔学术出版社(AcademicPublishers)，加利福尼亚州圣地亚哥(1989)第52-68页；包括将DNA直接摄入原生质体的方法，Toriyama,K.等人(1988)《生物/技术(Bio/Technology)》6:1072－1074。通过植物细胞的短暂电击诱导的DNA摄取：Zhang等人《植物细胞报告(Plant Cell Rep.)》(1988)7:379-384。Fromm等人《自然杂志》(1986)319:791－793。通过粒子轰击将DNA注射到植物细胞或组织中，Klein等人《生物/技术(Bio/Technology)》(1988)6:559-563；McCabe等人《生物/技术(Bio/Technology)》(1988)6:923-926；Sanford，《植物生理学(Physiol.Plant)》。(1990)79:206-209；通过微量移液管系统的使用：Neuhaus等人，《理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)》(1987)75:30-36；Neuhaus和Spangenberg，《植物生理学(Physiol.Plant)》。(1990)79:213-217；细胞培养物、胚胎或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅晶须转化，美国专利号5,464,765或通过DNA与萌发花粉的直接温育，DeWet等人《胚珠组织的实验操作(Experimental Manipulation of Ovule Tissue)》，编辑Chapman,G.P.和Mantell,S.H.和Daniels,W.Longman，伦敦，(1985)第197-209页；和Ohta，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》(1986)83:715-719。
农杆菌系统包括使用含有整合到植物基因组DNA中的特定DNA片段的质粒载体。植物组织的接种方法根据植物种类和农杆菌递送系统而变化。一种广泛使用的方法是叶盘程序，所述程序可以用任何组织外植体进行，从而为启动整个植物的分化提供了良好的来源。Horsch等人在《植物分子生物学手册》A5中，Kluwer学术出版商，多德雷赫特(1988)第1-9页。一种补充方法是将农杆菌递送系统与真空渗透组合使用。农杆菌系统在产生转基因双子叶植物中尤其可行。
有多种方法将DNA直接转移到植物细胞中。在电穿孔中，将原生质体短暂暴露于强电场。在微量注射中，使用很小的微量移液器将DNA直接机械地注入细胞中。在微粒轰击中，DNA被吸附在微粒，如硫酸镁晶体或钨颗粒上，微粒被物理加速进入细胞或植物组织。
在稳定的转化后，进行植物繁殖。最常见的植物繁殖方法是通过种子。然而，通过种子繁殖进行再生的缺点在于，由于杂合性而导致作物缺乏均匀性，因为种子是由植物根据孟德尔规则所控制的遗传变异产生的。基本上，每颗种子在基因上是不同的，并且每颗种子将以其自身的特定性状生长。因此，优选的是，产生经转化的植物，使得再生植物具有与亲本转基因植物相同的性状和特性。因此，优选的是，通过微体繁殖再生经转化的植物，所述微体繁殖可提供经转化的植物的快速、一致的繁殖。
微繁殖是从已从选定亲本植物或栽培品种切除的单片组织中培育新一代植物的过程。这个过程允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物大量繁殖。所产生的新一代植物在基因上与原始植物相同，并且具有原始植物的所有特征。微繁殖允许在短时间内大量生产优质植物材料，并在保存原始转基因或转化植物的特征中提供所选栽培品种的快速繁殖。克隆植物的优势在于植物繁殖的速度以及所生产的植物的质量和均匀性。
微繁殖是一个多阶段的过程，需要在不同阶段之间改变培养基或生长条件。因此，微繁殖过程涉及四个基本阶段：第一阶段，初始组织培养；第二阶段，组织培养增殖；第三阶段，分化和植物形成；以及第四阶段，温室栽培和硬化。在第一阶段，初始组织培养期间，组织培养物被建立并且经认证是无污染的。在第二阶段，对最初的组织培养进行增殖，直到产生足够数量的组织样品以满足生产目标。在第三阶段，在第二阶段生长的组织样品被分割并生长成单独的小植株。在第四阶段，将转化的小植株转移到温室中进行硬化，其中植物对光的耐受性逐渐增加，使得其可以在自然环境中生长。
尽管目前优选稳定转化，但本发明还设想叶细胞、分生细胞或整株植物的瞬时转化。
瞬时转化可受到上述任何直接DNA转移方法的影响，或受到使用改良植物病毒的病毒感染的影响。
已显示可用于转化植物宿主的病毒包括CaMV、TMV和BV。使用植物病毒的植物转化描述于美国专利号4,855,237(BGV)、EP-A 67,553(TMV)、日本公开申请号63-14693(TMV)、EPA 194,809(BV)、EPA 278,667(BV)；和Gluzman,Y.等人，《分子生物学通讯：病毒载体(Communications in Molecular Biology:Viral Vectors)》，冷泉港实验室，纽约，第172-189页(1988)。用于在许多宿主(包含植物)中表达外源DNA的伪病毒颗粒描述于WO 87/06261中。
优选地，本发明的病毒是无毒的，因此不能引起严重的症状，如生长速率降低、镶嵌、环斑、卷叶、黄化、条纹、痘形成、肿瘤形成和点蚀。合适的无毒病毒可以是天然存在的无毒病毒或人工减毒病毒。病毒减毒可通过使用本领域熟知的方法实现，包括但不限于亚致死加热、化学处理或通过定向诱变技术，例如Kurihara和Watanabe(《分子植物病理学》4:259-269，2003)、Gal-on等人(1992)，Atreya等人(1992)和Huet等人(1994)所述。
合适的病毒株可从可用来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)或通过从受感染植物中分离获得。从受感染的植物组织中分离病毒可通过本领域熟知的技术进行，例如Foster和Tatlor编辑《植物病毒学方案：从病毒分离到转基因抗性(分子生物学计算方法(Humana Pr)》，第81卷)，Humana出版社，1998。简言之，将被认为含有高浓度的合适病毒的感染植物的组织，优选地幼叶和花瓣在缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲溶液)中研磨以产生可用于后续接种的受病毒感染的汁液。
用于在植物中引入和表达非病毒外源多核苷酸序列的植物RNA病毒的构建在上述参考文献以及Dawson,W.O.等人，《病毒学(Virology)》(1989)172:285-292；Takamatsu等人《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》(1987)6:307-311；French等人《科学》(1986)231:1294-1297；和Takamatsu等人《欧洲生化学会联合会快报》(1990)269:73-76中得到了证明。
当病毒是DNA病毒时，可以对病毒本身进行合适的修饰。可替代地，可以先将病毒克隆到细菌质粒中，以易于用外源DNA构建期望的病毒载体。然后可以从质粒中切除病毒。如果病毒是DNA病毒，则细菌的复制起点可以附着在病毒DNA上，然后由细菌复制。所述DNA的转录和翻译将产生外壳蛋白，所述外壳蛋白将包裹病毒DNA。如果病毒是RNA病毒，则通常将病毒克隆为cDNA并插入质粒中。然后将质粒用于构建所有构建体。然后通过转录质粒的病毒序列并翻译病毒基因以产生包裹病毒RNA的一个或多个外壳蛋白来产生RNA病毒。
用于在植物中引入和表达非病毒外源多核苷酸序列(例如本发明构建体中包括的那些)的植物RNA病毒的构建由上述参考文献以及美国专利第5,316,931号证明。
将病毒接种到植物的技术可以在Foster和Taylor编辑《植物病毒学方案：从病毒分离到转基因抗性(分子生物学计算方法(Humana Pr)》，第81卷)，Humana出版社，1998；Maramorosh和Koprowski编辑《病毒学方法(Methods in Virology)》第7卷，学术出版社，纽约1967－1984；Hill,S.A.《植物病毒学方法(Methods in Plant Virology)》，牛津布莱克威尔，1984；Walkey,D.G.A.《应用植物病毒学(Applied Plant Virology)》，纽约威利，1985；以及Kado和Agrawa编辑《植物病毒学原理与技术(Principles and Techniques inPlant Virology)》，纽约Van Nostrand-Reinhold出版社的编著中找到。
然后可以在适于在成熟植物中表达外源多核苷酸的条件下培养由转化细胞生成的成熟植物。
在一个实施例中，其中转染了表达构建体的植物宿主细胞不天然表达麸质多肽(即源自非麸质植物)。因此，在一个实施例中，宿主细胞选自由苋菜、荞麦、水稻(褐色、白色、野生)、玉米黍、藜麦、高粱、蒙大拿、薏苡和苔麸组成的组。
在另一实施例中，其中转染有表达构建体的植物宿主细胞表达野生型麸质多肽。这样的宿主细胞包括但不限于小麦品种，如斯佩耳特小麦(spelt)、卡门小麦(kamut)、法罗小麦(farro)和硬粒小麦(durum)、保加利亚小麦(bulgar)、粗粒小麦(semolina)、大麦、黑麦、黑小麦、小麦(小麦品种——fielder，spelling、bobwhite、cheyenne、chinse spring和mjoelner)和燕麦。应当理解，在天然表达麸质多肽的宿主细胞中，本发明人进一步设想下调野生型麸质多肽的表达。下调野生型麸质多肽表达的方法是本领域已知的，包括例如使用RNA沉默剂和DNA编辑剂。RNA沉默剂的实例包括但不限于siRNA、miRNA、反义分子、DNAzyme、RNAzyme。一种下调麸质多肽表达的方法描述于Sánchez-León,Susana等人《用CRISPR/Cas9基因工程的低麸质非转基因小麦(Low-gluten,Nontransgenic WheatEngineered with CRISPR/Cas9)》《植物生物技术杂志(Plant Biotechnology Journal)》16.4(2018)：902-910。PMC，其全部内容通过引用并入本文。
为了生成重组多肽，本发明设想了表达构建体，其包括工程化以增强表达的蛋白质的稳定性、生产、纯化或产量的序列。例如，可以对包含本发明一些实施例的突变麸质蛋白和异源蛋白的融合蛋白或可切割融合蛋白的表达进行工程改造。可以设计这样的融合蛋白，使得融合蛋白可以容易地通过亲和层析分离；例如，通过固定在对异源蛋白质特异的柱子。当在突变的麸质蛋白和异源蛋白之间工程化切割位点时，突变的麸质蛋白可以通过用破坏切割位点的合适的酶或试剂处理而从色谱柱释放[例如，参见Booth等人(1988)《免疫学快报(Immunol.Lett.)》19:65-70；和Gardella等人，(1990)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》265:15854-15859]。
在适当的培养时间后进行重组多肽的回收。短语“回收重组多肽”是指收集含有多肽的整个发酵培养基，而不需要暗示额外的分离或纯化步骤。尽管如上所述，本发明一些实施例的多肽可以使用多种标准蛋白质纯化技术纯化，例如但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、伴刀豆球蛋白A层析、层析聚焦和差异溶解。
本发明人设想使用本文所述的去表位的α-麦醇溶蛋白多肽制备适于患有乳糜泻的受试者食用的食品。因此，去表位的α-麦醇溶蛋白可用于制备肉制品、奶酪和肉制品的素食替代品。
在一个实施例中，去表位的麸质多肽可用于制备可食用面粉。
本文使用的术语“面粉”是指通常通过碾磨获得的自由流动粉末的食品。面粉最常用于烘焙食品，如面包、蛋糕、糕点等，但也可用于其它食品，如面食、面条、早餐麦片等。
面粉的实例包括面包粉、通用面粉、未漂白面粉、自发面粉、白面粉、棕面粉和粗面粉。
因此，根据本发明的又一方面，提供了一种源于非麸质植物的面粉，其包含至少一种去表位的麦醇溶蛋白多肽。
源自面粉的植物(例如谷物)的实例包括但不限于苋菜、荞麦、水稻(褐色、白色、野生)、玉米粟、奎奴亚藜、高粱和苔麸。
在一个实施例中，用去表位的α-麦醇溶蛋白多肽转化非麸质植物并由其产生面粉(例如通过研磨、切碎、碾磨等)。
在另一实施例中，从非麸质植物生成面粉(例如通过研磨、切碎、碾磨等)，并添加至少一种重组去表位的α-麦醇溶蛋白多肽。可以调节去表位的α-麦醇溶蛋白多肽的量和种类以改变由其生成的面粉或面团的质量。因此，本发明人设想使用本发明的重组去表位的α-麦醇溶蛋白多肽作为面团改良剂。
根据又一方面，从经基因修饰以表达本发明的至少一种去表位的α-麦醇溶蛋白多肽的小麦生成面粉。优选地，基因修饰的小麦被进一步操作，使得野生型α-麦醇溶蛋白多肽的表达被下调或消除(如上文所述)。应当理解，本发明该方面的小麦可用于生成其它可食用产品，如啤酒。
本发明人进一步设想从本文描述的任何面粉生成面团。
术语“面团”应理解为具有其通常使用的含义，即包含作为最少基本成分的面粉和液体源(例如至少水)经过揉捏和成型的组合物。面团的特征在于其延展性。
术语“可延展的”应理解为限定面团适应变化而不必容易破碎的能力，并且因此限定其柔韧性、弹性和/或柔性，从而允许面团经受以下任一加工步骤：拉伸、成形、延展、压片、变形、装配、捏合、模制、成型等。面团的成形可以通过具有预定形状的任何工具或通过擀面杖或手工进行。
面团的特征可在于选自由以下组成的组中的至少一种性质：与不含任何麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更长的形成时间(DT)、更短的稳定时间(S)、更高的软化度(DS)、更高的稠度(C)值、更低的延展性(DE)及其任何组合。可以通过将不同数量的修饰重组蛋白添加至从小麦面粉提取的麦谷蛋白和淀粉部分并且评估生物物理特性(例如使用粉质仪和肺泡仪)来进行测试。
面团的特征还可在于选自由以下组成的组中的至少一种性质：a.与不含去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的硬度；b.与不含去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，对机械刺激的稳定性更高；c.与不含去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的临界张力值；d.与不含去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有较低的变形能力；e.与不含去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的可塑性；以及f.与不含去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的稠度。
本发明该方面的面团可以包含附加组分，如盐、植物淀粉、调味剂、蔬菜或蔬菜部分、油、维生素和橄榄。
面团还可以包含发酵剂，其实例包括未经高温消毒的啤酒、酪乳、姜汁啤酒、开菲乳、酸面团发酵剂、酵母、乳清蛋白浓缩物、酸奶、生物发酵剂、化学发酵剂、小苏打、发酵粉、面包氨、碳酸氢钾及其任意组合。
从本发明该方面的面团生成的加工产品包括但不限于平底面包、比萨面包皮、意大利面、玉米饼、帕尼尼面包、椒盐卷饼、馅饼和三明治面包产品。
如本文所用，术语“约”是指±10％
术语“包括(comprises/comprising)”、“包含(includes/including)”、“具有(having)”和其同源词意指“包含但不限于”。
术语“由……组成”意指“包含并且局限于”。
术语“主要由……组成”意指组合物、方法或结构可以包含另外的成分、步骤和/或部分，但条件是这些另外的成分、步骤和/或部分不实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征。
除非上下文另外清楚地指示，否则如本文所使用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包含多种化合物，包含其混合物。
本申请中，本发明的各种实施例可以以范围格式呈现。应理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁起见，且不应被认作是对本发明的范围的不灵活的限制。因此，对范围的描述应被视为已经具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的单独数值。例如，对范围如1到6的描述应被视为已经具体地公开了如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等子范围，以及所述范围内的单独数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
每当在此指示数值范围时，这意味着包含所指示范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语第一指示数字与第二指示数字“之间的变动范围/范围”以及第一指示数字“到”第二指示数字的“变动范围/范围”在此可互换使用，并且意指包含所述第一指示数字和第二指示数字以及其之间的所有分数和整数。
如本文所使用的，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包含但不限于化学、药理学、生物学、生物化学以及医学领域的从业者已知的或容易依据已知方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
本文所用的术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床或美学症状或基本上预防病症的临床或美学症状的出现。
应当理解，出于清楚的目的，在单独实施例的上下文中描述的本发明的某些特征还可以按组合形式提供在单个实施例中。相反，本发明出于简洁的目的在单个实施例的情形中描述的各个特征还可以单独地或以任何合适的子组合提供或在本发明的任何其它描述的实施例中提供为合适的。在各种实施例的上下文中描述的某些特征并非被认为是那些实施例的基本特征，除非所述实施例在不具有那些元素的情况下不起作用。
如在上文所描绘的以及如在以下权利要求书部分中所要求保护的本发明的各个实施例和方面在以下实例中找到实验支持。
实例
现参考以下实例，所述实例与上文描述一起以非限制方式说明本发明的一些实施例。
一般来说，本文中所用的术语和本发明中所用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。所述技术在文献中有充分解释。参见例如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A laboratory Manual)》,Sambrook等人,(1989)；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,第I-III卷,Ausubel,R.M.编辑(1994)；Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南》,约翰·威利父子出版公司(Wiley andSons),巴尔的摩,马里兰州(Baltimore,Maryland)(1989)；Perbal,《分子克隆实用指南(APractical Guide to Molecular Cloning)》,约翰·威利父子出版公司,纽约(1988)；Watson等人,《重组DNA(Recombinant DNA)》,科学美国人书籍(Scientific AmericanBooks),纽约；Birren等人(编辑)《基因组分析：实验室手册系列(Genome Analysis:ALaboratory Manual Series)》,第1-4卷,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),纽约(1998)；如以下中所述的方法：美国专利第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号和第5,272,057号；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:A Laboratory Handbook)》,第I-III卷,Cellis,J.E.编辑(1994)；《动物细胞培养：基础技术手册(Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique)》,Freshney,威利-里斯公司(Wiley-Liss),纽约(1994),第三版；《当代免疫学实验手册(Current Protocols in Immunology)》,第I-III卷,Coligan J.E.编辑(1994)；Stites等人(编辑),《基础和临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)》(第8版),阿普尔顿&兰格公司(Appleton&Lange),康涅狄格州诺沃克(Norwalk,CT)(1994)；Mishell和Shigii(编辑),《细胞免疫学选定方法(Selected Methods in Cellular Immunology)》,弗里曼公司(W.H.Freeman and Co.),纽约(1980)；专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫测定，参见例如，美国专利第3,791,932号；第3,839,153号；第3,850,752号；第3,850,578号；第3,853,987号；第3,867,517号；第3,879,262号；第3,901,654号；第3,935,074号；第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；第4,098,876号；第4,879,219号；第5,011,771号和第5,281,521号；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》Gait,M.J.编辑(1984)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》Hames,B.D.和Higgins S.J.编辑(1985)；《转录和翻译(Transcription and Translation)》Hames,B.D.和Higgins S.J.编辑(1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》,Freshney,R.I.编辑(1986)；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)》IRL出版社，(1986)；《分子克隆实用指南》,Perbal B.(1984)和《酶学方法(Methods in Enzymology)》第1-317卷,学术出版社(AcademicPress)；《PCR方案：方法和应用指南(PCR Protocols:AGuide To Methods AndApplications)》,学术出版社,加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA)(1990)；Marshak等人,《蛋白质纯化和表征策略——实验过程指南(Strategies for Protein PurificationAnd Characterization-ALaboratory Course Manual)》CSHL出版社(1996)；所述文献全部如本文完全阐述的通过引用并入。贯穿本文件提供了其它的一般参考文献。据信，本文中的程序在本领域中是众所周知的，并且为读者提供了方便。其中含有的所有信息均通过引用并入本文。
实例1
乳糜泄表位的综合作图
将绘制乳糜泄表位。这项评估将基于基因序列内的肽结合特异性MHCII分子的预测能力。使用MHCII结合试验进行表位验证。
实例1的方法
文献检索。将对所有经实验验证的乳糜泄表位进行广泛而详尽的文献检索。
计算预测。使用生物信息学工具进行作图，这些工具基于免疫原性表位序列结合II类HLA基因HLA-DQ2或HLA-DQ8的能力预测免疫原性表位序列。对于每种蛋白质，所有可能的肽(每个9至13个残基)将以其未修饰形式或脱酰胺化形式(通过组织转谷氨酰胺酶(tTG2)将谷氨酰胺残基翻译后脱酰胺成肽序列中的谷氨酸，从而提高肽-MHC复合物的稳定性(Sollid L，2012))合成。分析所有肽序列作为T细胞表位的潜力，并通过MHC II结合测定进一步筛选候选物。将对具有经验鉴定的乳糜泄表位的麸质蛋白和已经鉴定为面包质量所必需的麸质蛋白进行作图的优先化。
表位验证。计算预测将使用MHC II结合测定进行经验验证。每个预测的表位与MHCII的结合将基于其抑制放射性标记的探针肽与纯化的MHC分子结合的能力进行评估。MHCII分子将通过亲和层析法进行纯化，肽将使用氯胺T法进行放射性标记。孵育一段时间后，分离结合的和未结合的放射性标记物质，并通过尺寸排阻凝胶过滤层析或MHC的单克隆抗体捕获确定它们的相对量。然后将确定结合放射性的百分比。所使用的MHC II结合测定的详细方案描述于Sidney等人(Sidney J，2013)。
实例2
在维持基因产物表达和折叠的同时消除肽免疫原性(“去表位”)
概述。对于鉴定的预测表位，我们将设计在预测结合MHC II分子HLADQ2.5或DQ8的位置引入核酸变异的文库。然后我们将使用该文库利用如噬菌体展示文库等文库筛选或选择的方法搜索消除与HLA DQ2.5或DQ8结合的突变。我们将使用深度测序来鉴定与HLADQ2.5或DQ8的结合消除(使用如实例1所述的MHC II结合测定)但具有使用酵母表面展示(YSD)文库的完整表达和折叠的变体。在这种情况下，YD文库将用于测量和评估表达和折叠，而不是结合。结合上述结合筛选，这将证实去表位蛋白表达良好、折叠良好、稳定且不结合MHC II。重要的是，大多数麦谷蛋白和一些麦醇溶蛋白是未折叠的，因此难以在酵母表面表达。对于这些蛋白质，我们将使用镍涂层板和圆二色性分析进行表达/折叠分析。
方法学：
去表位：
选择文库设计的位置：对于预测的表位和已知的表位，我们将选择预测对MHC II结合至关重要的位置。简言之，我们将预测WT和特定突变体的HLA-肽相互作用。这些预测之间的差异将有助于鉴定有希望的突变。来自毒性降低的野生小麦品系的数据也将用于确定对免疫原性具有潜在影响的位置。选择将基于组合得分，该组合得分将考虑：(i)预测评分，(ii)评估残基保守性的多序列比对。保守程度较低的残基得分较高。(iii)与蛋白质的相同区域内的其它推定取代的协同作用。这样，我们将选择要改变的位置和要在每个位置引入的变化。最终文库在每个改变的位置也包括WT残基。现有数据显示，通常单一突变足以消除肽-MHC结合。
文库设计：我们将对文库进行排序，其中肽中的每个位置(通常长度为9至13个氨基酸，但基于表位作图计算分析，可以更短或更长)被其它残基取代。基于所选位置的文库设计，通过基因重装配方法(ISOR)(Herman 2007)通过双掺入合成寡核苷酸生成在所选位置含有点突变的分析。基于基因序列的模板基因(“WT”)将被排序为来自IDT的合成基因。含有所需取代并与适当DNA区互补的合成寡核苷酸将从IDT以低纯化等级排序。文库中的所有取代将由产生预测提供的选定氨基酸的密码子选择编码，同时使终止密码子的频率最小化。策略的总结如图1所示。简言之，使用反向和正向引物扩增模板DNA以获得微克量的模板。接着，用DNaseI将DNA片段化，并分离对应于70至100bp的片段。接着，将DNA片段与不同量的寡核苷酸混合，并使用Pfu Turbo DNA聚合酶进行PCR组装反应。使用含有被特异性限制酶识别的DNA序列的适当正向和反向引物，通过“巢式”PCR进一步扩增全长组装基因。pCTCON2质粒中所需多样性的DNA文库将通过将消化的pCTCON2与消化的纯“巢式”PCR产物连接并用纯化的连接混合物转化大肠杆菌细胞来创建。接着，通过测序随机大肠杆菌菌落评估文库的复杂性。收集所有含质粒的细胞，分离并保存EBY100文库。
验证
噬菌体展示文库。噬菌体展示涉及在噬菌体F附加体的表面上展示肽文库，这允许M13噬菌体感染和繁殖。一旦引入细菌宿主，通过DNA修复和复制解析DNA，并将所得文库包装到噬菌体颗粒中。然后将由阳性噬菌体克隆(未结合HLA DQ2.5或DQ8的去表位肽序列，通过上述MHC II结合试验测量)包裹的DNA用作深度测序的模板。详细的方案可参见TonikianR等人2007。
表达和折叠评估
酵母表面展示(YSD)：对于在酵母表面上良好折叠和表达的麸质基因，将如先前所述进行YSD(Chao，G，2006)。简言之，通过用pCTCON2质粒文库转化EBY100细胞以约1x106细胞的多样性创建酵母文库。收集细胞并使酵母菌将在含有pen/strep的SDCAA培养基中生长过夜。接着，通过离心收集细胞并补充允许在酵母表面表达的SGCAA培养基。诱导将进行48小时。基于表达水平通过流式细胞术分离、分析和分选表达细胞。将从阳性克隆中分离出质粒并进行测序。
深度测序。对于YSD文库，我们将深入测序文库并鉴定正确表达和折叠的所有去表位基因变体。然后，我们将分析突变的基因序列，并评估预测表位中哪个残基的改变会降低与MHC II的结合。基于这些结果，我们将合成去表位的麦醇溶蛋白基因。对于未在酵母表面正确折叠/表达的麸质基因，将使用His6标记蛋白表达和镍涂层板纯化方法测试候选去表位基因变体的表达。圆二色性分析将提供关于蛋白质中二级结构的信息。
使用镍涂层板纯化His6标记的蛋白质。为了研究单个突变体蛋白的表达，将使用一种高通量的方法来纯化蛋白质变体。在该方法中，蛋白质纯化基于His6标记的蛋白质和Ni-NTA涂层的微孔板之间的相互作用。详细的方案可见于Lanio T等人2000。简言之，将生成携带麸质基因去表位版本的质粒载体pHis6。转录将在两个lac操作子和一个T7启动子的组合控制下进行，这样可以用IPTG进行有效的抑制或诱导。大肠杆菌细胞将在37℃下生长，并转移到LB培养基。通过添加IPTG诱导变体的表达。孵育后，通过离心收获细胞，将沉淀重悬于裂解缓冲液中。将裂解物转移到Ni-NTA HisSorb中并在室温下涡旋温育。用裂解缓冲液洗涤平板。His6标记的蛋白质将被洗脱。预培养的细胞颗粒将用于使用标准DNA质粒制剂或PCR从感兴趣的变异基因中提取DNA。
圆二色性分析。如前所述(Srinivasan B，2015)，将使用圆二色性分析对充分表达的纯化去表位蛋白质进行进一步的折叠测试。纯化的乙酸中透析纯化的蛋白质，并使用分光偏振计分析其圆二色谱。在分辨率为1nm，扫描速度为50nm/min，蛋白质浓度为0.10mg/mL的2-mm路径长度石英比色杯中记录190至260nm的远紫外圆二色光谱。将获得三次扫描的平均值。将计算在给定波长下的平均残留椭圆率(度/平方厘米/分摩尔X 103)。二级结构内容的后续计算将使用专用软件进行。保留表达和折叠的去表位基因变体(类似于未修饰的对应物)将使用T细胞活化测定进一步验证免疫原性的缺乏。
进一步验证
麸质特异性T细胞系的生成：如前所述生成麸质反应性TCL(Gianfrani C等人，《胃肠病学(Gastroenterology)》(2007))。简言之，用胶原酶A消化粘膜外植体，并将细胞以2–3×10 5个细胞/ml接种在补充有5％AB混合人血清(Biotag)和抗生素的完全培养基X-Vivo15(Lonza)中。用1.5×10 6个经照射的PBMC和TG2(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))处理的(脱酰胺基)PT-麦醇溶蛋白(50μg/ml)刺激细胞。24小时后分别以10ng/ml和20单位/ml添加IL-15和IL-2(派普泰克生物科技公司(Peprotech))。每3至4天补充细胞因子，并根据需要分离细胞。在第一次刺激后大约2周再刺激细胞。
T细胞活化分析1。将使用基于HLA-DQ肽四聚体的试验进行验证。在该测定中，将HLA(DQ2.5和DQ8)四聚体上呈递的去表位肽或未修饰对照与分离自CD患者外周血(可能在口服麸质攻击下)或分离自能够培养从炎症部位获得的活细胞的新鲜小肠活检组织的T细胞温育。如前所述(Brottveit M，2011)测量T细胞结合和/或活化。选择显示这些T细胞的结合和活化显著减少或完全消除的复合物用于进一步评估。
T细胞分析2.如前所述，通过ELISA检测IFN-γ，分析TCL对脱酰胺PT麸质蛋白质和PT麸质肽的反应(Gianfrani C.等人，《免疫学杂志》(2006)。HLA匹配的B-LCL(西格玛奥德里奇公司)用作APC。将PT麸质蛋白(100μg/ml)或麸质肽(10μM)(A&A实验室)与应答者T细胞(4×104)一起添加到APC(1×105)中，将细胞接种在圆底96孔板(Corning)中的200μl X-vivo15培养基中并孵育48小时。每个肽/蛋白质以4次重复测试。DMSO用作测试肽的阴性对照，空白培养基用作测试蛋白质的阴性对照。对于ELISA实验，用1μg/mlα-IFNγ抗体(Mabtech)包被Nunc MaxiSorp板(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))，封闭并用50μl取自TCL板的缓冲液孵育过夜。重组IFNγ(Bactlab)用于标准曲线生成。将板与生物素-α-IFNγ抗体(1μg/ml)(Mabtech)、链霉抗生物素蛋白－HRP(Bactlab)(1:5000)和TMB(赛默飞世尔公司)一起孵育。停止反应，在Elisa板读数器上以450nM读板。使用Graphpad Prism分析结果并测定IFNγ水平。将结果归一化为对照。如果与对照相比，肽/蛋白质样品中的IFNγ水平是≥2倍，或者如果IFNγ水平显著高于对照(单侧t检验)，则认为结果是阳性的(活化T细胞)。
将对每种麦醇溶蛋白鉴定的特异性改变引入该基因的完整基因序列，并作为实例3的一部分用于功能测试。
实例3
生成具有完整生物物理特性的“乳糜泻安全”麸质蛋白变体
将对去表位的麸质基因的全基因序列进行测试，以保存其生物物理特性。这可以通过任何方法重组表达去表位基因来实现，包括但不限于细菌、病毒或哺乳动物表达技术。将纯化的重组去表位麸质基因(单个基因或组合)以不同的量或组合添加到无麸质的面团或面粉或任何其它无麸质的产品中。替代地，可以使用来自除小麦以外的作物(例如大米和/或玉米粉)的面粉/面团，以尝试改善面包质量。去表位变体对面包/面粉品质的贡献表现在如面团的混合特性、醒发、弹性和强度等特性上。将去表位变体的生物物理特性与未修饰的(“WT”)对应物进行比较，以验证可比较的功能性。
方法学：
重组蛋白生产。我们将设计具有针对所选宿主优化的分子属性(例如，强启动子、有效核糖体结合位点)的表达构建体。对于细菌表达(例如大肠杆菌)，修饰和未修饰的麸质基因的转化后进行筛选研究和优化生长条件(宿主、诱导、培养基、温度、添加剂)以驱动可溶性或包涵体表达。转录是在两个lac-操作子和一个T7启动子的组合控制下进行的，这样可以用IPTG进行有效的抑制或诱导。大肠杆菌细胞在37℃下生长，并转移到基本培养基中。通过添加IPTG诱导麸质蛋白的表达。诱导后，将细胞裂解，将总细胞裂解物点在硝酸纤维素膜上。然后用脱脂乳封闭该膜。用抗His抗体探测His标记的蛋白。在纯化之前，使用限制酶去除His标签。
通过SDS-PAGE/考马斯或蛋白质印迹进行表达评估。然后从裂解物级分或包含体中纯化重组蛋白。麦醇溶蛋白的纯化根据公开的方法进行(Arentz-Hansen EH等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》(2000))。简言之，将细菌细胞颗粒重悬于70％的乙醇中，在60℃的条件下放置1小时。离心除去细胞碎片后，在上清液中添加NaCl(1.5M)以沉淀麦醇溶蛋白。通过离心收集沉淀物。然后用蒸馏水洗涤沉淀。
对于杆状病毒蛋白表达，将基因亚克隆到杆状病毒表达载体中并在昆虫细胞(例如，SF9或SF21)中表达。随后将进行病毒生成、扩增和克隆(有限稀释或噬斑纯化)。将生成高效价病毒原液。通过蛋白质印迹或ELISA进行表达评估。从细胞沉淀中纯化重组蛋白。对于哺乳动物蛋白表达，我们将使用哺乳动物细胞(例如在CHO、HEK293、HEK293E中)来重组表达我们的载体。通过分离自细胞裂解物的蛋白质印迹或ELISA测试表达。
验证。与实例1中描述的方法类似，我们将用重组蛋白进行MHCII结合测定以证实免疫原性(去表位变体)或免疫原性(WT变体)的缺乏。
去表位麸质基因组的生物物理质量评估。将测试不同组合的添加和不同重组蛋白的量以获得最佳面团和面包特性。通过将纯化的重组麸质蛋白与淀粉混合生产面团。生产面团并评估其生物物理特性，例如用粉质仪和气泡仪(测试参数：混合特性面团形成时间和峰值浓度值)。测试烘焙面包的体积、面包屑颜色和质地属性、回弹性和粘附性。测试方案将采自
Figure GDA0003691910150000381
L等人2017和Uthayakumaran等人，《谷类化学(Cereal Chemistry)》(2000)。
实例4
改造植物以表达具有完整生物物理特性的去表位麸质基因变体
我们将使用以下方法在植物中表达去表位基因：
1.使用CRISPR/Cas9方法进行基因组编辑以修饰面包小麦(Triticum aestivum)中靶麸质基因的DNA序列。
2.植物基因工程在基因的天然启动子的控制下表达去表位基因，同时用人工微RNA(amiRNA)沉默天然基因的表达。
2.1.使用RNAi方法或使用普通小麦(Triticum aestivum)的缺失品系(其中WT基因不表达)使天然基因的表达沉默的同时，在其天然启动子控制下转化去表位基因。
3.将去表位麸质基因转化到其它作物(例如，水稻、玉米等)中。
对于所有方法，基因的未修饰(WT)形式将用作基线对照。目的是确定对基因进行的修饰在植物中表达时保持非免疫原性，并且不会对面团的制备和烘烤产生负面影响(如实例3所述)。另外，对于所有方法，我们将评估植物的生长。
方法学
小麦中的WT基因沉默。我们将在基因的天然启动子的控制下表达去表位基因，同时沉默天然基因的表达。为此，将使用WMD3–web microRNA设计器(www(dot)wmd3(dot)weigelworld(dot)org/cgi-bin/webapp(dot)cgi)设计人工微RNA(amiRNA)以选择性地靶向对去表位基因“盲”的天然转录物。沉默效率将在植物转化之前通过使用瞬时表达方法在2-5个amiRNA之间筛选其沉默效率来测试；与两种不同报道基因(两种互惠可能性中的GFP或荧光素酶)融合并受强组成型启动子控制的天然和改变的基因将与每种设计的amiRNA一起在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中瞬时共表达。最有效的amiRNA将继续用于生成转基因植物的下一步骤。amiRNA的表达受强小麦特异性启动子控制。将去表位基因(包括启动子、UTR和内含子的修饰基因组片段)和选择的amiRNA克隆到相同的二元载体中。根据有效方案(IshidaY，2015)通过农杆菌介导的转化生成转基因植物。使用cDNA上的单核苷酸多态性(SNP)区分方法评价所得转基因小麦的沉默效率和改变的基因的表达水平；衍生的切割扩增多态性序列(dCAPS)或简单等位基因鉴别PCR(SAP)(Chum，PY，2012；Bui，M，2009)。将继续显示与WT相似的良好植物生长和非破坏发育表型的具有天然转录物的最大沉默的转基因系。
克隆和转化：从选择的小麦品种中克隆麸质基因。
先前报道了麦谷蛋白基因Dx5和Dy10有助于面团的粘弹性(Rooke L，1999；Popineau Y，2001；Gadaleta，A，2008)。先前已经报道，染色体6D短臂上的高免疫原性α2-麦醇溶蛋白基因座导致面团功能性的显著损失(Van den Broeck HC，2009)。基于这些数据，我们将用与α2－麦醇溶蛋白组合的Dx5和Dy10麦醇溶蛋白转化植物以生成麦醇溶蛋白复合物并用作功能性测定中的基线比较物。
小麦中的转基因表达：在条件良好的温室中生长的小麦栽培品种的健康植株的未成熟胚将根据Ishida等人。(Ishida Y，2015)描述的方案用离心法预处理并与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)共培养。
水稻中的转基因表达：通常，克隆和转化策略将遵循Jo等人2017描述的方案。将基因单独插入表达载体中，并在水稻胚乳特异性Glu-B1启动子控制下在高直链淀粉韩国水稻栽培种Koami(Oryza sativa L.)中表达。将构建的载体引入根癌农杆菌(LBA4404)中，并将感兴趣的基因插入日本型韩国水稻栽培种Koami的基因组中。
玉米中的转基因表达：将基因单独插入表达载体并在玉米(Zea mays L.)中在玉米内源启动子的控制下表达。农杆菌介导的玉米未成熟转化将基于Ishida等人(Ishida Y，1996)开发的方法进行以产生高频率的转基因事件生产。
对于所有的转基因，进行培养并将收获的转基因种子贮存在4℃下。转基因表达将通过SDS-PAGE、成像或其它用于表达和定位分析的分子技术表征。
验证。用来自转基因种子/植物的提取物进行MHCII结合测定，以验证植物中表达的变体缺乏免疫原性。
去表位麸质基因组的生物物理质量评估。
这将类似于实例3所述的方法进行。
基因组编辑：将选择在转基因小麦和免疫学测定中表现出最佳性能的去表位麸质基因用于使用CRISPR/Cas9方法进行基因组编辑。我们将使用CRISPR/cas9从小麦基因组中除去WT麸质基因，并用去表位基因的序列取代它。这将产生几个细胞，每个细胞含有不同形式的去表位基因。最近的方法使用通过粒子轰击递送CRISPR/Cas9的体外转录物或核糖核蛋白复合物对面包小麦进行无DNA编辑，并可用于此目的(Liang Z，2018)。使用CRISPR核糖核蛋白复合物对小麦的基因组编辑突变进行基因分型，将使用Liang等人(Liang Z，2018a)描述的方法进行。
实例5
显示与MHC结合减少的示范性α-麦醇溶蛋白肽
材料和方法
MHC/肽相互作用的测量：计算预测算法用于生成推定的非结合肽的列表。如Sidney J等人2013年所述，合成了这些肽并测量了其与MHC的结合。
简言之，使用不同浓度的WT和修饰的麸质肽进行竞争测定，方法是将肽稀释在NP40缓冲液中，与纯化的MHC和放射性标记的已知MHC结合肽温育2至4天。通过亲和层析纯化MHC II分子，并使用氯胺T方法放射性标记肽。孵育一段时间后，分离结合的和未结合的放射性标记物质，并通过尺寸排阻凝胶过滤层析或MHC的单克隆抗体捕获确定它们的相对量。然后确定结合放射性的百分比。对于每种修饰的肽，计算WT和修饰的肽的IC50值。分析验证的麸质肽表位的MHC结合作为阳性对照。还测试了脱酰胺形式的一些肽。数值大于天然肽的4至5倍，表明工程肽序列的结合比天然麸皮肽的结合受到影响。非结合定义为IC50≥30,000nM
结果
表1示出了对预测与MHC结合受损的几种变体测定的IC50。大于天然肽的值意味着工程化肽链的结合相对于天然麸质受到影响。对于每种肽，列出了关于WT天然肽的修饰数目。
表1
Figure GDA0003691910150000411
Figure GDA0003691910150000421
实例6
显示消除T细胞活化的示范性α-麦醇溶蛋白肽
通过检测IFN-γ水平的ELISA测定对来自患者活检组织的WTα-麦醇溶蛋白肽和TCL的修饰肽的应答。结果如图5A至B所示。
参考文献
Brottveit M,Ráki M,Bergseng E,Fallang LE,Simonsen B,
Figure GDA0003691910150000431
A,Larsen S,
Figure GDA0003691910150000432
EM,Jahnsen FL,Sollid LM,Lundin KE.《通过HLA-DQ2-麦醇溶蛋白四聚体测试评估可能的乳糜泻(Assessing possible celiac disease by an HLA-DQ2-gliadin TetramerTest)》《美国胃肠病学杂志(Am J Gastroenterol.)》2011；106(7):1318-24。
Bui M,Liu Z.，《用于成本有效且快速的基因分型和作图的简单的等位基因鉴别PCR(Simple allele-discriminating PCR for cost-effective and rapid genotypingand mapping)》《植物方法(Plant Methods)》2009；5:1。
Chao G,Lau WL,Hackel BJ,Sazinsky SL,Lippow SM,Wittrup KD.《使用酵母表面展示分离和工程化人抗体(Isolating and engineering human antibodies usingyeast surface display)》《自然实验手册(Nat Protoc.)》2006；1(2):755-68。
Chum PY,Haimes JD,André CP,Kuusisto PK,Kelley ML.《未经DNA纯化的植物和动物样品的基因分型(Genotyping of plant and animal samples without prior DNApurification)》《视频实验期刊(J Vis Exp.)》2012；(67)。
Gadaleta,A.；Blechl，A.E.；Nguyen，S.；Cardone，M.F.；Ventura，M.；Quick,J.S.；Blanco,A.，《转化到不同硬粒小麦基因型中的稳定表达的D-基因组衍生的HMW麦谷蛋白亚基基因改变了面团混合特性》《分子育种(Mol.Breed.)》2008，22，267-279。
Herman A,Tawfik DS.《通过基因重组(ISOR)掺入合成的寡核苷酸：用于生成目标库的通用工具》《蛋白质工程设计与选择(Protein Eng Des Sel.)》2007；20(5):219-26。
Ishida Y,Saito H,Ohta S,Hiei Y,Komari T,Kumashiro T.，《通过根癌农杆菌介导的玉米(Zea mays L.)的高效转化》《自然生物技术》1996；14(6):745-50。
Ishida Y,Tsunashima M,Hiei Y,Komari T.，《使用未成熟胚转化小麦(Triticumaestivum L.)》《分子生物学方法(Methods Mol Biol.)》2015；1223:189-98。
Jo YM,Cho K,Lee HJ,Lim SH,Kim JS,Kim YM,Lee JY.《小麦高分子量麦谷蛋白亚基在转基因蛋白亚基的细胞定位(Cellular Localization of Wheat High MolecularWeight Glutenin Subunits in Transgenic Rice Grain)》《国际分子科学杂志(Int JMol Sci.)》2017年11月18日；18(11)。
Lanio T,Jeltsch A,Pingoud A.，《His6标记蛋白的自动纯化允许彻底筛选通过随机诱变生成的文库(Automated purification of His6-tagged proteins allowsexhaustive screening of libraries generated by random mutagenesis)》《生物技术(Biotechniques.)》2000；29(2):338-42。
Liang Z,Chen K,Zhang Y,Liu J,Yin K,Qiu JL,Gao C.，《使用CRISPR/Cas9体外转录物或核糖核蛋白的基因枪递送进行面包小麦的基因组编辑(Genome editing ofbread wheat using biolistic delivery of CRISPR/Cas9 in vitro transcripts orribonucleoproteins)》《自然实验手册(Nat Protoc.)》2018；13(3):413-430。
Liang Z,Chen K,Yan Y,Zhang Y,Gao C.，《使用CRISPR核糖核蛋白复合物在植物中基因分型基因组编辑的突变(Genotyping genome-edited mutations in plants usingCRISPR ribonucleoprotein complexes)》《植物生物技术杂志(Plant Biotechnol J.)》2018.doi:10.1111/pbi.12938。[打印前的电子版]。
Molberg O,Kett K,Scott H,Thorsby E,Sollid LM,Lundin KE.《麦醇溶蛋白特异性、HLA DQ2-限制的T细胞通常在乳糜泻患者的小肠活检中发现，但在对照组中未发现》《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand J Immunol.)》1997；46(3):103-109。
Figure GDA0003691910150000441
L,Banu I,Vasilean I,Aprodu I.，《麸质、蛋和大豆蛋白对全粒米粉流变和热机械性能的影响(Effect of gluten,egg and soy proteins on the rheologicaland thermo-mechanical properties of wholegrain rice flour)》《国际食品科学与技术(Food Sci Technol Int.)》2017；23(2):142-155。
Popineau，Y.；Deshayes,G.；lefebvre，J.；Fido，R.；Tatham，A.S.；Shewry,P.R.《表达1Ax和1Dx高分子量麦谷蛋白亚基转基因的转基因小麦品系的谷醇溶蛋白聚集、麸质粘弹性和混合特性》《农业与食品化学(J.Agric.Food Chem.)》2001，49，395-401。
Rooke,L.；Bekes,F.；Fido，R.；Barro，F.；Gras,P.；Tatham，A.S.；Barcelo,P.；Lazzeri，P.；Shewry,P.R.《转基因小麦中麸质蛋白的过量表达导致面团强度大大增加(Overexpression of a gluten protein in transgenic wheat results in greatlyincreased dough strength)》《谷物科学杂志(J.Cereal Sci.)》1999，30，115-120。
Sidney J,Southwood S,Moore C,Oseroff C,Pinilla C,Grey HM,Sette A.，《通过凝胶过滤或单克隆抗体捕获测量MHC/肽相互作用(Measurement of MHC/peptideinteractions by gel filtration or monoclonal antibody capture)》《免疫学实验指南(Curr Protoc Immunol.)》2013；第18章：第18.3单元。
Sollid LM,Qiao SW,Anderson RP,Gianfrani C,Koning F.，《由HLA-DQ分子限制的乳糜泻相关麸质T细胞表位的命名和列表》《免疫遗传学(Immunogenetics.)》2012；64(6):455-60。
Srinivasan B,Focke-Tejkl M,Weber M,Pahr S,Baar A,Atreya R,Neurath MF,Vogelsang H,Huber WD,Valenta R.，《重组γ-麦醇溶蛋白1用于鉴定乳糜泻患者和监测对无麸质饮食的依从性的用途》《过敏临床免疫学杂志(J Allergy Clin Immunol.)》2015；136(6):1607－1618.e3。
Tonikian R,Zhang Y,Boone C,Sidhu SS.《从噬菌体展示的肽文库中鉴定肽识别模块的特异性图谱(Identifying specificity profiles for peptide recognitionmodules from phage-displayed peptide libraries)》《自然实验手册(Nat Protoc.)》2007；2(6):1368-86。
Van den Broeck HC,van Herpen TW,Schuit C,Salentijn EM,Dekking L,BoschD,Hamer RJ,Smulders MJ,Gilissen LJ,van der Meer IM.《从面包小麦中去除乳糜泻相关的麸质蛋白，同时保留工艺特性：用中国春秋的缺失品系进行研究(Removing celiacdisease-related gluten proteins from bread wheat while retainingtechnological properties:a study with Chinese Spring deletion lines)》《BMC植物生物学(BMC Plant Biol.)》2009APR 7；9:41。
尽管已结合本发明的具体实施例描述本发明，但显而易见的是，对于本领域的技术人员而言许多替代方案、修改以及变化将是清楚的。因此，意图涵盖落入所附权利要求书的精神和广泛范围内的所有此类替代方案、修改以及变化。
本说明书中所提及的所有公开、专利以及专利申请在此通过引用以其整体并入到本说明书中，达到如同每一个单独的公开、专利或专利申请被专门地并且单独地指示通过引用并入本文的相同的程度。此外，本申请案中对任何参考文件的引用或鉴别不应理解为承认所述参考文件是作为本发明的现有技术可获得的。在使用章节标题的意义上，其不应被解释为必要地限制。另外，本申请的任何优先权文件通过引用以其整体并入本文。
序列表
<110> 乌科公司
亚奈·奥弗兰
摩西·本-大卫
阿萨夫·比兰
希里·扎金
奥利·马库加伯
安娜·丘普林
<120> 去表位的α-麦醇溶蛋白及其在乳糜泻和麸质敏感性管理中的用途
<130> 83105
<150> US 62/870,695
<151> 2019-07-04
<160> 119
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 1
Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 2
Pro Tyr Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 3
Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 4
Phe Arg Pro Glu Gln Pro Tyr Pro Gln
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 5
Pro Gln Gln Ser Phe Pro Glu Gln Gln
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 6
Ile Gln Pro Glu Gln Pro Ala Gln Leu
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 7
Gln Gln Pro Glu Gln Pro Tyr Pro Gln
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 8
Ser Gln Pro Glu Gln Glu Phe Pro Gln
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 9
Pro Gln Pro Glu Gln Glu Phe Pro Gln
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 10
Gln Gln Pro Glu Gln Pro Phe Pro Gln
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 11
Pro Gln Pro Glu Gln Pro Phe Cys Gln
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 12
Gln Gln Pro Phe Pro Glu Gln Pro Gln
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 13
Pro Phe Pro Gln Pro Glu Gln Pro Phe
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 14
Pro Gln Pro Glu Gln Pro Phe Pro Trp
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 15
Pro Phe Ser Glu Gln Glu Gln Pro Val
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 16
Phe Ser Gln Gln Gln Glu Ser Pro Phe
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 17
Pro Phe Pro Gln Pro Glu Gln Pro Phe
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 18
Pro Gln Pro Glu Gln Pro Phe Pro Gln
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 19
Pro Ile Pro Glu Gln Pro Gln Pro Tyr
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 20
Pro Phe Pro Gln Pro Glu Gln Pro Phe
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 21
Pro Gln Pro Glu Gln Pro Phe Pro Gln
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 22
Pro Tyr Pro Glu Gln Glu Glu Pro Phe
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 23
Pro Tyr Pro Glu Gln Glu Gln Pro Phe
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 24
Pro Phe Ser Glu Gln Glu Gln Pro Val
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 25
Glu Gly Ser Phe Gln Pro Ser Gln Glu
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 26
Glu Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Gln
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 27
Glu Gln Pro Gln Gln Pro Tyr Pro Glu
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 28
Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 29
Glu Gly Ser Phe Gln Pro Ser Gln Glu
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 30
Pro Gln Gln Ser Phe Pro Glu Gln Glu
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳糜泻相关T细胞表位氨基酸序列
<400> 31
Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln
1 5
<210> 32
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α-麦醇溶蛋白多肽氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> 可能被脱酰胺化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> 可能被脱酰胺化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> 可能被脱酰胺化
<400> 32
Met Val Arg Val Pro Val Pro Gln Leu Gln Pro Gln Asn Pro Ser Gln
1 5 10 15
Gln Gln Pro Gln Glu Gln Val Pro Leu Val Gln Gln Gln Gln Phe Pro
20 25 30
Gly Gln Gln Gln Pro Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Pro Gln
35 40 45
Pro Phe Pro Ser Gln Gln Pro Tyr Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln
50 55 60
Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln
65 70 75 80
Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro Phe Arg Pro Gln Gln Pro Tyr Pro
85 90 95
Gln Ser Gln Pro Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Gln Pro Ile Ser Gln Gln
100 105 110
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Gln Gln Gln Gln Gln
115 120 125
Gln Gln Gln Ile Leu Gln Gln Ile Leu Gln Gln Gln Leu Ile Pro Cys
130 135 140
Arg Asp Val Val Leu Gln Gln His Ser Ile Ala Tyr Gly Ser Ser Gln
145 150 155 160
Val Leu Gln Gln Ser Thr Tyr Gln Leu Val Gln Gln Leu Cys Cys Gln
165 170 175
Gln Leu Trp Gln Ile Pro Glu Gln Ser Arg Cys Gln Ala Ile His Asn
180 185 190
Val Val His Ala Ile Ile Leu His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
195 200 205
Gln Gln Gln Gln Pro Leu Ser Gln Val Ser Phe Gln Gln Pro Gln Gln
210 215 220
Gln Tyr Pro Ser Gly Gln Gly Ser Phe Gln Pro Ser Gln Gln Asn Pro
225 230 235 240
Gln Ala Gln Gly Ser Val Gln Pro Gln Gln Leu Pro Gln Phe Glu Glu
245 250 255
Ile Arg Asn Leu Ala Leu Glu Thr Leu Pro Ala Met Cys Asn Val Tyr
260 265 270
Ile Pro Pro Tyr Cys Thr Ile Ala Pro Val Gly Ile Phe Gly Thr Asn
275 280 285
Tyr Arg
290
<210> 33
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型表位氨基酸序列
<400> 33
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro
1 5 10 15
Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro
20 25 30
Phe
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 34
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 35
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 36
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro His Pro Glu Leu Ser Tyr Ser Gln
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 37
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Asp Gln Pro Arg Leu Pro Trp Pro Gln
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 38
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Trp Gln Pro Lys Leu Pro Gly Pro Gln
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 39
Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 40
Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 41
His Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Glu Leu Arg Tyr Ser Gln Pro Gln
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 42
Met Leu Arg Tyr Pro Gln Pro Trp Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 43
Lys Leu Pro Tyr Pro Gln Gly Arg Leu Pro Gly Pro Gln Pro Gln
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 44
Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro Phe
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 45
Pro Tyr Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro Phe
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 46
Pro Tyr Pro His Pro Arg Leu Pro Tyr Thr Gln Pro Gln Pro Phe
1 5 10 15
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 47
Pro Tyr Ser Gln Pro Glu Ser Pro Tyr Met Gln Pro Gln Pro Phe
1 5 10 15
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 48
Pro Tyr Pro His Pro Trp Leu Arg Gly Pro Gln Pro Gln Pro Phe
1 5 10 15
<210> 49
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 49
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro His Leu Phe Pro Pro Gln Pro
1 5 10 15
Met Leu Asn Tyr Thr Gln Pro His Leu Pro Gly Pro Gln Pro Gln Pro
20 25 30
Phe
<210> 50
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 50
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Pro Leu Pro Tyr Gly Gln Pro
1 5 10 15
Pro Leu Pro Tyr Gly Gln Ala Pro Leu Pro Tyr Gly Gln Ala Pro Pro
20 25 30
Phe
<210> 51
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 51
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro His Leu Phe Pro Ser Gln Pro
1 5 10 15
His Leu Ser Tyr Ser Gln Pro His Leu Pro Gly Pro Gln Pro Gln Pro
20 25 30
Phe
<210> 52
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 52
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Pro Leu Pro Ser Gly Gln Pro
1 5 10 15
Met Leu Asn Tyr Thr Gln Pro Pro Leu Pro Tyr Gly Gln Ala Pro Pro
20 25 30
Phe
<210> 53
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 53
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Pro Leu Pro Ile Gly Gln Pro
1 5 10 15
Lys Leu Phe Tyr Ser Gln Pro Pro Leu Pro Tyr Gly Gln Ala Pro Pro
20 25 30
Phe
<210> 54
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 54
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Pro Leu Pro Ile Gly Gln Pro
1 5 10 15
Lys Leu Ser Tyr Pro Gln Pro His Leu Pro Gly Pro Gln Pro Gln Pro
20 25 30
Phe
<210> 55
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 55
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro His Leu Phe Ile Pro Gln Pro
1 5 10 15
Lys Leu Phe Tyr Ser Gln Pro His Leu Pro Gly Pro Gln Pro Gln Pro
20 25 30
Phe
<210> 56
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 56
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro His Leu Phe Pro Met Gln Pro
1 5 10 15
His Leu Ser Tyr Ser Gln Pro His Leu Pro Gly Pro Gln Pro Gln Pro
20 25 30
Phe
<210> 57
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 57
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Pro Leu Pro Tyr Met Gln Pro
1 5 10 15
His Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Pro Leu Pro Tyr Gly Gln Ala Pro Pro
20 25 30
Phe
<210> 58
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 58
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Pro Leu Pro Tyr Ser Gln Pro
1 5 10 15
His Arg Pro Tyr His Gln Pro His Arg Pro Tyr His Gln Pro Gln Pro
20 25 30
Phe
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 59
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro His Leu Phe Pro Pro Gln
1 5 10 15
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 60
Gln Lys Pro Tyr Arg Gln Pro Lys Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln
1 5 10 15
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 61
Gln Leu Pro Tyr Ser Gln Pro His Arg Pro Tyr His Gln Pro Gln
1 5 10 15
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 62
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro His Leu Phe Pro Pro Gln
1 5 10 15
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 63
Leu Gln Leu Gln Ser Phe Pro Gln Pro His Leu Pro Gly Pro Gln
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 64
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Pro Leu Pro Tyr Gly Gln
1 5 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 65
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro His Leu Pro Gly Gly Gln
1 5 10 15
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 66
Pro Gln Pro Gln Leu Phe Pro Gln Pro His Pro Phe Pro Pro Gln
1 5 10 15
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 67
Gln Lys Pro Tyr Arg Gln Pro Lys Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln
1 5 10 15
<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 68
Gln Leu Pro Tyr Ser Gln Pro His Arg Pro Tyr His Gln Pro Gln
1 5 10 15
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 69
His Leu Pro Gly Pro Gln Pro His Leu Ser Tyr Pro Gln Pro His
1 5 10 15
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 70
His Leu Pro Gly Gly Gln Pro His Leu Pro Gly Gly Gln Pro His
1 5 10 15
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 71
His Pro Phe Pro Pro Gln Pro His Pro Phe Pro Pro Gln Pro His
1 5 10 15
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 72
Thr Leu Pro Ser Pro Gln Pro Thr Leu Gly Tyr Gly Gln Pro Thr
1 5 10 15
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 73
Ser Leu Pro Met Pro Gln Pro Ser Leu Arg Tyr Arg Gln Pro Ser
1 5 10 15
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 74
Ser Tyr Pro Gln Pro His Leu Pro Gly Pro Gln Pro Glu Pro Phe
1 5 10 15
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 75
Pro Tyr Pro Gln Pro Pro Leu Pro Tyr Gly Gln Ala Pro Pro Phe
1 5 10 15
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 76
Pro Tyr Ser Gln Pro His Arg Pro Tyr His Gln Pro Gln Pro Phe
1 5 10 15
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 77
Pro Tyr Arg Gln Pro Lys Leu Pro Tyr Arg Gln Pro Gln Pro Phe
1 5 10 15
<210> 78
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 78
Pro Gly Gly Gln Pro His Leu Pro Gly Gly Gln Pro Gln Pro Phe
1 5 10 15
<210> 79
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 79
Phe Pro Pro Gln Pro His Pro Phe Pro Pro Gln Pro Gln Pro Phe
1 5 10 15
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 80
Pro Gln Pro Phe Pro Pro Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Ser Phe
1 5 10 15
<210> 81
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自小麦品种Chinese Spring的α-麦醇溶蛋白
<400> 81
Met Lys Thr Phe Leu Ile Leu Ala Leu Val Ala Thr Thr Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ala Val Arg Val Pro Val Pro Gln Leu Gln Pro Lys Asn Pro Ser Gln
20 25 30
Gln Gln Pro Gln Glu Gln Val Pro Leu Val Gln Gln Gln Gln Phe Pro
35 40 45
Gly Gln Gln Gln Gln Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Pro Gln
50 55 60
Pro Phe Pro Ser Gln Gln Pro Tyr Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln
65 70 75 80
Pro Gln Pro Phe Leu Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Ser Phe
85 90 95
Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Gln Arg Pro Lys Tyr Leu Gln Pro
100 105 110
Gln Gln Pro Ile Ser Gln Gln Gln Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
115 120 125
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Arg Gln Gln Ile Leu Gln
130 135 140
Gln Ile Leu Gln Gln Gln Leu Ile Pro Cys Arg Asp Val Val Leu Gln
145 150 155 160
Gln His Asn Ile Ala His Ala Ser Ser Gln Val Leu Gln Gln Ser Thr
165 170 175
Tyr Gln Leu Leu Gln Gln Leu Cys Cys Gln Gln Leu Leu Gln Ile Pro
180 185 190
Glu Gln Ser Arg Cys Gln Ala Ile His Asn Val Val His Ala Ile Ile
195 200 205
Met His Gln Gln Glu Gln Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln
210 215 220
Gln Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Ser
225 230 235 240
Ser Gln Val Ser Phe Gln Gln Pro Gln Arg Gln Tyr Pro Ser Ser Gln
245 250 255
Val Ser Phe Gln Pro Ser Gln Leu Asn Pro Gln Ala Gln Gly Ser Val
260 265 270
Gln Pro Gln Gln Leu Pro Gln Phe Ala Glu Ile Arg Asn Leu Ala Leu
275 280 285
Gln Thr Leu Pro Ala Met Cys Asn Val Tyr Ile Pro Pro His Cys Ser
290 295 300
Thr Thr Ile Ala Pro Phe Gly Ile Phe Gly Thr Asn Tyr Arg
305 310 315
<210> 82
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自小麦品种Cheyenne的α-麦醇溶蛋白
<400> 82
Met Lys Thr Phe Leu Ile Leu Ala Leu Leu Ala Ile Val Ala Thr Thr
1 5 10 15
Ala Thr Thr Ala Val Arg Val Pro Val Pro Gln Leu Gln Pro Gln Asn
20 25 30
Pro Ser Gln Gln Gln Pro Gln Glu Gln Val Pro Leu Val Gln Gln Gln
35 40 45
Gln Phe Pro Gly Gln Gln Gln Gln Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro
50 55 60
Gln Pro Gln Pro Phe Pro Ser Gln Gln Pro Tyr Leu Gln Leu Gln Pro
65 70 75 80
Phe Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln
85 90 95
Ser Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Gln Gln Pro Gln Tyr Leu
100 105 110
Gln Pro Gln Gln Pro Ile Ser Gln Gln Gln Ala Gln Gln Gln Gln Gln
115 120 125
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ile Leu Gln Gln Ile Leu
130 135 140
Gln Gln Gln Leu Ile Pro Cys Arg Asp Val Val Leu Gln Gln His Asn
145 150 155 160
Ile Ala His Ala Ser Ser Gln Val Leu Gln Gln Ser Thr Tyr Gln Leu
165 170 175
Leu Gln Gln Leu Cys Cys Gln Gln Leu Leu Gln Ile Pro Glu Gln Ser
180 185 190
Gln Cys Gln Ala Ile His Asn Val Ala His Ala Ile Ile Met His Gln
195 200 205
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Gln Lys Gln Gln Leu Gln Gln Gln Gln
210 215 220
Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
225 230 235 240
Pro Ser Ser Gln Val Ser Phe Gln Gln Pro Gln Gln Gln Tyr Pro Ser
245 250 255
Ser Gln Val Ser Phe Gln Pro Ser Gln Leu Asn Pro Gln Ala Gln Gly
260 265 270
Ser Val Gln Pro Gln Gln Leu Pro Gln Phe Ala Glu Ile Arg Asn Leu
275 280 285
Ala Leu Gln Thr Leu Pro Ala Met Cys Asn Val Tyr Ile Pro Pro His
290 295 300
Cys Ser Thr Thr Ile Ala Pro Phe Gly Ile Ser Gly Thr Asn
305 310 315
<210> 83
<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α-麦醇溶蛋白CS-2分离物
<400> 83
Val Arg Val Pro Val Pro Gln Leu Gln Pro Gln Asn Pro Ser Gln Gln
1 5 10 15
Gln Pro Gln Glu Gln Val Pro Leu Val Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gly
20 25 30
Gln Gln Gln Gln Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro
35 40 45
Phe Pro Ser Gln Gln Pro Tyr Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro
50 55 60
Gln Pro Phe Pro Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Ser Phe Pro
65 70 75 80
Pro Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Gln Gln Pro Gln Tyr Leu Gln Pro Gln
85 90 95
Gln Pro Ile Ser Gln Gln Gln Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
100 105 110
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ile Leu Gln Gln Ile Leu Gln Gln Gln
115 120 125
Leu Ile Pro Cys Arg Asp Val Val Leu Gln Gln His Asn Ile Ala His
130 135 140
Ala Ser Ser Gln Val Leu Gln Gln Ser Thr Tyr Gln Leu Leu Gln Gln
145 150 155 160
Leu Cys Cys Gln Gln Leu Leu Gln Ile Pro Glu Gln Ser Arg Cys Gln
165 170 175
Ala Ile His Asn Val Ala His Ala Ile Ile Met His Gln Gln Gln Gln
180 185 190
Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
195 200 205
Leu His Gln Gln Arg Gln Gln Pro Ser Ser Gln Val Ser Phe Gln Gln
210 215 220
Pro Gln Gln Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Val Ser Phe Gln Pro Ser Gln
225 230 235 240
Leu Asn Pro Gln Ala Gln Gly Ser Val Gln Pro Gln Gln Leu Pro Gln
245 250 255
Phe Ala Glu Ile Arg Asn Leu Ala Leu Gln Thr Leu Pro Ala Met Cys
260 265 270
Asn Val Tyr Ile Pro Pro His Cys Ser Thr Thr Ile Ala Pro Phe Gly
275 280 285
Ile Phe Gly Thr Asn
290
<210> 84
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自小麦品种Chinese Spring的α-麦醇溶蛋白
<400> 84
Met Lys Thr Phe Leu Ile Leu Ala Leu Leu Ala Ile Val Ala Thr Thr
1 5 10 15
Ala Thr Thr Ala Val Arg Val Pro Val Pro Gln Leu Gln Pro Gln Asn
20 25 30
Pro Ser Lys Gln Gln Ser Gln Glu Gln Val Pro Leu Val Gln Gln Gln
35 40 45
Gln Phe Leu Gly Gln Gln Gln Pro Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro
50 55 60
Gln Pro Gln Pro Phe Pro Ser Gln Gln Pro Tyr Leu Gln Leu Gln Pro
65 70 75 80
Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Gln Pro Phe Arg Pro
85 90 95
Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Glu
100 105 110
Pro Ile Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ile Leu
115 120 125
Gln Gln Ile Leu Gln Gln Gln Leu Ile Pro Cys Met Asp Val Val Leu
130 135 140
Gln Gln His Asn Ile Ala His Gly Arg Ser Gln Val Leu Gln Gln Ser
145 150 155 160
Thr Tyr Gln Leu Leu Gln Glu Leu Cys Cys Gln His Leu Trp Gln Ile
165 170 175
Pro Glu Gln Ser Gln Cys Gln Ala Ile Gln Asn Val Val Asn Ala Ile
180 185 190
Ile Leu His Gln Gln Gln Lys Gln Gln Gln Gln Pro Ser Ser Gln Val
195 200 205
Ser Phe Gln Gln Pro Leu Gln Gln Tyr Pro Leu Gly Gln Gly Ser Phe
210 215 220
Arg Pro Ser Gln Gln Asn Pro Gln Asp Gln Gly Ser Val Gln Pro Gln
225 230 235 240
Gln Leu Pro Gln Phe Glu Glu Ile Arg Asn Leu Ala Leu Gln Thr Leu
245 250 255
Pro Ala Met Cys Asn Val Tyr Ile Pro Pro Tyr Cys Thr Ile Ala Pro
260 265 270
Phe Gly Ile Phe Gly Thr Asn
275
<210> 85
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自小麦品种Chinese Spring的α-麦醇溶蛋白
<400> 85
Met Lys Thr Phe Leu Ile Leu Ala Leu Leu Ala Ile Val Ala Thr Thr
1 5 10 15
Ala Thr Thr Ala Val Arg Val Pro Val Pro Gln Leu Gln Pro Gln Asn
20 25 30
Pro Ser Gln Gln Gln Pro Gln Glu Gln Val Pro Leu Val Gln Gln Gln
35 40 45
Gln Phe Leu Gly Gln Gln Gln Pro Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro
50 55 60
Gln Pro Gln Pro Phe Pro Ser Gln Gln Pro Tyr Leu Gln Leu Gln Pro
65 70 75 80
Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Gln Pro Phe Arg Pro
85 90 95
Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro Gln Tyr Ser Gln Leu Gln Gln
100 105 110
Pro Ile Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
115 120 125
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
130 135 140
Gln Gln Gln Gln Gln Glu Gln Gln Ile Leu Gln Gln Ile Leu Gln Gln
145 150 155 160
Gln Leu Ile Pro Cys Met Asp Val Val Leu Gln Gln His Asn Ile Ala
165 170 175
His Gly Arg Ser Gln Val Leu Gln Gln Ser Thr Tyr Gln Leu Leu Gln
180 185 190
Glu Leu Cys Cys Gln His Leu Trp Gln Ile Pro Glu Gln Ser Gln Cys
195 200 205
Gln Ala Ile His Asn Val Val His Ala Ile Ile Leu His Gln Gln Gln
210 215 220
Lys Gln Gln Gln Gln Gln Pro Ser Ser Gln Val Ser Phe Gln Gln Pro
225 230 235 240
Gln Gln Gln Tyr Pro Leu Gly Gln Gly Ser Phe Arg Pro Ser Gln Gln
245 250 255
Asn Pro Gln Ala Gln Gly Ser Val Gln Pro Gln Gln Leu Pro Gln Phe
260 265 270
Glu Glu Ile Arg Asn Leu Ala Leu Gln Thr Leu Pro Ala Met Cys Asn
275 280 285
Val Tyr Ile Pro Pro Tyr Cys Thr Ile Val Pro Phe Gly Ile Phe Gly
290 295 300
Thr Asn
305
<210> 86
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自小麦品种Chinese Spring的α-麦醇溶蛋白
<400> 86
Met Lys Thr Phe Leu Ile Leu Val Leu Leu Ala Ile Val Ala Thr Thr
1 5 10 15
Ala Pro Thr Ala Val Arg Phe Pro Val Pro Gln Leu Gln Pro Gln Asn
20 25 30
Pro Ser Gln Gln Leu Pro Gln Glu Gln Val Pro Leu Val Gln Gln Gln
35 40 45
Gln Phe Leu Gly Gln Gln Gln Pro Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro
50 55 60
Gln Pro Gln Phe Pro Ser Gln Leu Pro Tyr Leu Gln Leu Gln Pro Phe
65 70 75 80
Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Gln Pro Phe Arg Pro Gln
85 90 95
Gln Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Gln Pro
100 105 110
Ile Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
115 120 125
Gln Gln Gln Gln Gln Ile Leu Gln Gln Ile Leu Gln Gln Gln Leu Ile
130 135 140
Pro Cys Met Asp Val Val Leu Gln Gln His Asn Lys Ala His Gly Arg
145 150 155 160
Ser Gln Val Leu Gln Gln Ser Thr Tyr Gln Leu Leu Arg Glu Leu Cys
165 170 175
Cys Gln His Leu Trp Gln Ile Pro Glu Gln Ser Gln Cys Gln Ala Ile
180 185 190
His Asn Val Val His Ala Ile Ile Leu His Gln Gln Gln Lys Gln Gln
195 200 205
Gln Gln Gln Pro Ser Ser Gln Val Ser Phe Gln Gln Pro Leu Gln Gln
210 215 220
Tyr Pro Leu Gly Gln Gly Ser Phe Arg Pro Ser Gln Gln Asn Pro Gln
225 230 235 240
Thr Gln Gly Ser Val Gln Pro Gln Gln Leu Pro Gln Phe Glu Glu Ile
245 250 255
Arg Asn Leu Ala Leu Gln Thr Leu Pro Ser Met Cys Asn Val Tyr Ile
260 265 270
Pro Pro Tyr Cys Thr Ile Ala Pro Phe Gly Ile Phe Gly Thr Asn
275 280 285
<210> 87
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自小麦品种Cheyenne的α-麦醇溶蛋白
<400> 87
Met Lys Thr Phe Leu Ile Leu Ala Leu Leu Ala Ile Val Ala Thr Thr
1 5 10 15
Ala Thr Ile Ala Val Arg Val Pro Val Pro Gln Leu Gln Pro Gln Asn
20 25 30
Pro Ser Gln Gln Gln Pro Gln Glu Gln Val Pro Leu Val Gln Gln Gln
35 40 45
Gln Phe Pro Gly Gln Gln Gln Pro Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro
50 55 60
Gln Pro Gln Pro Phe Pro Ser Gln Gln Pro Tyr Leu Gln Leu Gln Pro
65 70 75 80
Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro
85 90 95
Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Gln Pro Phe Arg Pro Gln Gln
100 105 110
Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Gln Pro Ile
115 120 125
Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
130 135 140
Gln Ile Leu Gln Gln Ile Leu Gln Gln Gln Leu Ile Pro Cys Met Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Gln Gln His Asn Ile Ala His Gly Arg Ser Gln Val Leu
165 170 175
Gln Gln Ser Thr Tyr Gln Leu Leu Gln Glu Leu Cys Cys Gln His Leu
180 185 190
Trp Gln Ile Pro Glu Gln Ser Gln Cys Gln Ala Ile His Asn Val Val
195 200 205
His Ala Ile Ile Leu His Gln Gln Gln Lys Pro Gln Gln Gln Pro Ser
210 215 220
Ser Gln Val Ser Phe Gln Gln Pro Leu Gln Gln Tyr Pro Leu Gly Gln
225 230 235 240
Gly Ser Phe Arg Pro Ser Gln Gln Asn Pro Gln Ala Arg Gly Ser Val
245 250 255
Gln Pro Gln Gln Leu Pro Gln Phe Glu Glu Ile Arg Asn Leu Ala Leu
260 265 270
Gln Thr Leu Pro Ala Met Cys Asn Val Tyr Ile Pro Pro Tyr Cys Thr
275 280 285
Ile Ala Pro Phe Gly Ile Phe Gly Thr Asn
290 295
<210> 88
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自小麦品种Conil的α-麦醇溶蛋白
<400> 88
Met Lys Thr Phe Leu Ile Leu Ala Leu Leu Ala Ile Val Ala Thr Thr
1 5 10 15
Ala Thr Ile Ala Val Arg Val Pro Val Pro Gln Leu Gln Pro Gln Asn
20 25 30
Pro Ser Gln Gln Gln Pro Gln Glu Gln Val Pro Leu Val Gln Gln Gln
35 40 45
Gln Phe Pro Gly Gln Gln Gln Pro Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro
50 55 60
Gln Leu Gln Pro Phe Pro Ser Gln Gln Pro Tyr Met Gln Leu Gln Pro
65 70 75 80
Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro
85 90 95
Gln Pro Gln Pro Phe Arg Pro Gln Gln Ser Tyr Pro Gln Pro Gln Pro
100 105 110
Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Gln Pro Ile Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln
115 120 125
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ile Leu Gln Gln Ile Leu Gln
130 135 140
Gln Gln Leu Ile Pro Cys Arg Asp Val Val Leu Gln Gln His Asn Ile
145 150 155 160
Ala His Gly Ser Ser Gln Val Leu Gln Glu Ser Thr Tyr Gln Leu Val
165 170 175
Gln Gln Leu Arg Cys Gln Gln Leu Trp Gln Ile Pro Glu Gln Ser Arg
180 185 190
Cys Gln Ala Ile His Asn Val Val His Ala Ile Ile Leu His Gln Gln
195 200 205
His His His His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Leu
210 215 220
Ser Gln Val Ser Phe Gln Gln Pro Gln Gln Gln Tyr Pro Ser Gly Gln
225 230 235 240
Gly Phe Phe Gln Pro Ser Gln Gln Asn Pro Gln Ala Gln Gly Ser Val
245 250 255
Gln Pro Gln Gln Leu Pro Gln Phe Glu Glu Ile Arg Asn Leu Ala Leu
260 265 270
Gln Met Leu Pro Ala Met Cys Asn Val Tyr Ile Pro Pro Tyr Cys Thr
275 280 285
Ile Ala Pro Phe Gly Ile Phe Gly Thr Asn
290 295
<210> 89
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自小麦品种Conil的α-麦醇溶蛋白
<400> 89
Met Lys Thr Phe Leu Ile Leu Ala Leu Leu Ala Ile Val Ala Thr Thr
1 5 10 15
Ala Thr Ile Ala Val Arg Val Pro Val Pro Gln Leu Gln Pro Gln Asn
20 25 30
Pro Ser Gln Gln Gln Pro Gln Glu Gln Val Pro Leu Val Gln Gln Gln
35 40 45
Gln Phe Pro Gly Gln Gln Gln Pro Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro
50 55 60
Gln Leu Gln Pro Phe Pro Ser Gln Gln Pro Tyr Met Gln Leu Gln Pro
65 70 75 80
Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro
85 90 95
Gln Pro Gln Pro Phe Arg Pro Gln Gln Ser Tyr Pro Gln Pro Gln Pro
100 105 110
Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Gln Pro Ile Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln
115 120 125
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ile Leu Gln Gln Ile Leu Gln Gln Gln
130 135 140
Leu Thr Pro Cys Arg Asp Val Val Leu Gln Gln His Ser Ile Ala His
145 150 155 160
Gly Ser Ser Gln Val Leu Gln Gln Ser Thr Tyr Gln Leu Val Gln Gln
165 170 175
Leu Cys Cys Gln Gln Leu Trp Gln Ile Pro Glu Gln Ser Arg Cys Gln
180 185 190
Ala Ile His Asn Val Val His Ala Ile Ile Leu His Gln Gln Gln Gln
195 200 205
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro
210 215 220
Leu Ser Gln Val Cys Ser Gln Gln Ser Gln Gln Gln Tyr Pro Ser Gly
225 230 235 240
Gln Gly Ser Phe Gln Pro Ser Gln Gln Asn Pro Gln Ala Gln Gly Ser
245 250 255
Val Gln Pro Gln Gln Leu Pro Gln Phe Glu Glu Ile Arg Asn Leu Ala
260 265 270
Leu Glu Thr Leu Pro Ala Met Cys Asn Val Tyr Ile Pro Pro Tyr Cys
275 280 285
Thr Ile Ala Pro Val Gly Ile Phe Gly Thr Asn
290 295
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单个α-麦醇溶蛋白氨基酸序列
<400> 90
Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro
1 5
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单个α-麦醇溶蛋白氨基酸序列
<400> 91
Gln Leu Pro Tyr Ser Gln Pro
1 5
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单个α-麦醇溶蛋白氨基酸序列
<400> 92
Pro Leu Pro Tyr Pro Gln Pro
1 5
<210> 93
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 93
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Ser Gln Pro
1 5 10 15
Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro
20 25 30
Phe
<210> 94
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 94
Pro Gln Pro Gln Gln Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro
1 5 10 15
Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro
20 25 30
Phe
<210> 95
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 95
Pro Gln Pro Gln Pro Phe Leu Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln
1 5 10 15
Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro Phe
20 25 30
<210> 96
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 96
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Ser Tyr Ser Gln Pro
1 5 10 15
Glu Leu Ser Tyr Ser Gln Pro Glu Leu Ser Tyr Ser Gln Pro Gln Pro
20 25 30
Phe
<210> 97
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 97
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Pro
1 5 10 15
Gln Leu Leu Tyr Pro Gln
20
<210> 98
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 98
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro His Pro
1 5 10 15
Gln Leu Pro Tyr Pro Gln
20
<210> 99
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 99
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro
1 5 10 15
Gln Leu Leu Tyr Pro Gln
20
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 100
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Leu Gln Leu Pro Tyr Pro Gln
1 5 10 15
<210> 101
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 101
Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Ser Tyr Pro Gln Pro Gln
1 5 10 15
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 102
Gln Pro Gln Glu Phe Pro Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Glu
1 5 10 15
<210> 103
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 103
Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Thr Gln Pro
1 5 10 15
<210> 104
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 104
Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Ala Glu Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Gln
1 5 10 15
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 105
Gln Pro Gln Pro Phe Leu Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Glu
1 5 10 15
<210> 106
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 106
Gln Leu Gln Pro Phe Ser Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Gln
1 5 10 15
<210> 107
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 107
Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Ala Pro Gln
1 5 10
<210> 108
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 108
Gln Pro Gln Pro Gln Leu Pro Glu Gln Gln
1 5 10
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 109
Gln Pro Gln Gln Gln Leu Pro Glu Gln Gln
1 5 10
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 110
Gln Pro Gln Pro Ser Leu Pro Glu Gln Gln
1 5 10
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 111
Gln Pro Gln Pro Gln Phe Pro Glu Gln Gln
1 5 10
<210> 112
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 112
Pro Gln Pro Lys Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Glu
1 5 10
<210> 113
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 113
Leu Gln Leu Gln Ser Phe Pro Gln Pro His Leu Pro Gly Pro Gln Pro
1 5 10 15
Gln Leu Ser Tyr Pro Gln Pro His Leu Pro Gly Pro Gln Pro Gln Pro
20 25 30
Phe
<210> 114
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 114
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro
1 5 10 15
Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro
20 25 30
Phe
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 115
Gln Leu Arg Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro
1 5 10 15
<210> 116
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 116
Gln Leu Gln Pro Phe Pro His Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Trp Pro
1 5 10 15
<210> 117
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的α-麦醇溶蛋白肽氨基酸序列
<400> 117
Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Ala Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro
1 5 10 15
<210> 118
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大范围核酸酶识别序列
<400> 118
Gly Ile Tyr Tyr Ile Gly
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大范围核酸酶识别序列
<400> 119
Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly
1 5

Claims (75)

1.一种对α-麦醇溶蛋白进行去表位的方法，所述α-麦醇溶蛋白包含具有如QLPYPQP(SEQ ID NO：90)、QLPYSQP(SEQ ID NO：91)和/或PLPYPQP(SEQ ID NO：92)所示的氨基酸序列的抗原单元，所述方法包含用选自由带正电荷的氨基酸、脯氨酸和脂肪族氨基酸组成的组的氨基酸取代所述抗原单元的位置1处的氨基酸残基；以及在所述抗原单元的位置4或5处再取代至少一个氨基酸残基，从而生成去表位的α-麦醇溶蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述去表位的α-麦醇溶蛋白不包含以小于30μM的IC50与MHC类型DQ2或DQ8结合的15聚体肽。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述去表位的α-麦醇溶蛋白包含如SEQ ID NO：60至80所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述去表位的α-麦醇溶蛋白包含如SEQ ID NO：49至58所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述取代在所述抗原单元的至少两个上进行。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述取代在所述抗原单元的至少三个上进行。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法包含在所述抗原单元的位置1、4和5处取代所述氨基酸残基。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在所述抗原单元的位置1处的所述取代包含用带正电荷的氨基酸进行的替换。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述带正电荷的氨基酸是组氨酸或赖氨酸。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在所述抗原单元的位置4处的所述取代包含用脯氨酸、脂肪族氨基酸、极性氨基酸或甘氨酸的取代。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在位置4处的所述取代包含用脯氨酸进行的替换。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在所述抗原单元的位置5处的所述取代包含用小氨基酸、极性氨基酸或芳香族氨基酸进行的替换。
13.根据权利要求12所述的方法，其中在位置5处的所述取代包含用小氨基酸进行的替换。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述小氨基酸包含甘氨酸或丝氨酸。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其进一步包含用芳香族或极性氨基酸取代所述抗原单元的位置3处的所述氨基酸残基。
16.一种生成去表位的α-麦醇溶蛋白的方法，所述方法包含在所述α-麦醇溶蛋白的氨基酸57和氨基酸89之间的位置突变一个或多个氨基酸残基，其中突变中的至少一个在选自由63、64、66、68、69、70、72、73、75、76、77、78、80、81、82、83和84组成的组中的位置的氨基酸上实现，从而生成所述去表位的α-麦醇溶蛋白，其中所述突变的位置根据SEQ ID NO：32中所示的野生型α-麦醇溶蛋白的氨基酸序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述去表位不降低所述α-麦醇溶蛋白的变应原性。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述α-麦醇溶蛋白包含与SEQ IDNO：32、81、82、83、84、85、86、87、88或89所示的序列至少50％相同的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述α-麦醇溶蛋白包含与SEQ IDNO：32、81、82、83、84、85、86、87、88或89所示的序列至少80％相同的氨基酸序列。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述突变选自由P63D/W、Q64H、Q66R/K/H/M、P68S/R、Y69W/G、P70S、P72G、Q73W/R、P75R、Y76G、P77S、Q78H、Q80R/W、L81S、P82R、Y83G和P84T/M组成的组。
21.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述α-麦醇溶蛋白的至少一个谷氨酰胺突变为谷氨酸。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述位置选自由66、73和/或80组成的组，其中所述突变的所述位置根据SEQ ID NO：32所示的野生型α-麦醇溶蛋白的氨基酸序列。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述去表位的α-麦醇溶蛋白与源自乳糜泻患者的T细胞的结合亲和力低于对应的未突变α-麦醇溶蛋白与源自所述乳糜泻患者的T细胞的结合亲和力。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中如使用基于HLA-DQ-肽四聚体的测定或通过干扰素-γELISA测定所测量的，所述去表位的α-麦醇溶蛋白激活源自乳糜泻患者的T细胞的程度小于对应的未突变α-麦醇溶蛋白激活源自所述乳糜泻患者的T细胞。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述亲和力降低至少约10％。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述去表位不破坏多肽的三维结构。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述去表位不破坏所述多肽的折叠。
28.一种去表位的α-麦醇溶蛋白，其包含：
(i)用选自由带正电荷的氨基酸、脯氨酸和脂肪族氨基酸组成的组的氨基酸在野生型α-麦醇溶蛋白的抗原单元的位置1处的取代；以及
(ii)在所述抗原单元的位置4和/或5处的取代；
其中所述抗原单元具有如QLPYPQP(SEQ ID NO：90)、QLPYSQP(SEQ ID NO：
91)或PLPYPQP(SEQ ID NO：92)所示的氨基酸序列。
29.根据权利要求28所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其不包含以小于30μM的IC50与MHC类型DQ2或DQ8结合的15聚体肽。
30.根据权利要求28或29所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其包含如SEQ ID NO：60至80所示的氨基酸序列。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其包含如SEQ IDNO：49至57所示的氨基酸序列。
32.根据权利要求28至30中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其包含在所述抗原单元的至少两个上的取代。
33.根据权利要求28至30中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其包含在所述抗原单元的至少三个上的取代。
34.根据权利要求28至29中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其包含在所述抗原单元的位置1、4和5处的取代。
35.根据权利要求28至29中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其中所述抗原单元的位置1处的所述取代包含用带正电荷的氨基酸进行的替换。
36.根据权利要求28或29所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其中所述带正电荷的氨基酸是组氨酸或赖氨酸。
37.根据权利要求28或29中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其中在位置4处的所述取代包含用脯氨酸、脂肪族氨基酸、极性氨基酸或甘氨酸进行的替换。
38.根据权利要求37所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其中在位置4处的所述取代包含用脯氨酸进行的替换。
39.根据权利要求28或29中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其中所述抗原单元的位置5处的所述取代包含用小氨基酸、极性氨基酸或芳香族氨基酸进行的替换。
40.根据权利要求39所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其中在位置5处的所述取代包含用小氨基酸进行的替换。
41.根据权利要求40所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其中所述小氨基酸包含甘氨酸或丝氨酸。
42.根据权利要求28至41中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其进一步包含在所述抗原单元的位置3处用芳香族或极性氨基酸的取代。
43.一种去表位的α-麦醇溶蛋白，其在所述α-麦醇溶蛋白的氨基酸57和氨基酸89之间的位置包含至少一个或多个突变，其中所述突变中的至少一个在选自由63、64、66、68、69、70、72、73、75、76、77、78、80、81、82、83和84组成的组中的位置的氨基酸上实现，其中所述突变的位置根据SEQ ID NO：32中所示的野生型α-麦醇溶蛋白的氨基酸序列。
44.根据权利要求43所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其中所述突变选自由P63D/W、Q64H、Q66R/K/H/M、P68S/R、Y69W/G、P70S、P72G、Q73W/R、P75R、Y76G、P77S、Q78H、Q80R/W、L81S、P82R、Y83G和P84T/M组成的组。
45.根据权利要求43或44所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其中所述α麦醇溶蛋白包含与SEQ ID NO：32、81、82、83、84、85、86、87、88或89所示的序列至少50％相同的氨基酸序列。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其中所述α-麦醇溶蛋白包含与SEQ ID NO：32、81、82、83、84、85、86、87、88或89所示的序列至少80％相同的氨基酸序列。
47.根据权利要求43或44所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其中所述α-麦醇溶蛋白的至少一个谷氨酰胺突变为谷氨酸。
48.根据权利要求47所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其中所述位置选自由66、73和/或80组成的组，其中所述突变的所述位置根据SEQ ID NO：32所示的野生型α-麦醇溶蛋白的氨基酸序列。
49.根据权利要求43至48中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其包含如SEQ IDNO：60至80所示的氨基酸序列。
50.根据权利要求43至48中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白，其包含如SEQ IDNO：49至57所示的氨基酸序列。
51.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求28至47和49至50中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白。
52.一种包含根据权利要求51所述的分离的多核苷酸的表达载体，其可操作地连接到转录调节序列以允许所述α-麦醇溶蛋白在植物细胞中表达。
53.根据权利要求52所述的表达载体，其中所述转录调节序列包含植物启动子。
54.根据权利要求53所述的表达载体，其中所述植物启动子包含小麦启动子。
55.一种细胞，其包含根据权利要求28至47和49至50中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白。
56.一种生成去表位的α-麦醇溶蛋白的方法，其包含在允许所述去表位的α-麦醇溶蛋白在细胞中表达的条件下，培养包含根据权利要求52至54中任一项所述的表达载体的细胞，从而生成去表位的α-麦醇溶蛋白。
57.一种源自非麸质植物的面粉，其包含根据权利要求28至47和49至50中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白。
58.一种面团，其包含根据权利要求57所述的面粉。
59.根据权利要求58所述的面团，其特征在于选自由以下组成的组中的至少一种性质：与不含去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更长的形成时间(developmenttime，DT)、更短的稳定时间(S)、更高的软化度(DS)、更高的稠度(C)值及其任何组合。
60.根据权利要求58所述的面团，其特征在于选自由以下组成的组的至少一种性质：a.与不含去表位的麦谷蛋白或麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的硬度；b.与不含所述去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，对机械刺激的稳定性更高；c.与不含所述去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的临界张力值；d.与不含所述去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有较低的变形能力；e.与不含所述去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的可塑性；以及f.与不含所述去表位的麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的稠度。
61.根据权利要求58所述的面团，其特征在于选自由以下组成的组的至少一种性质：a.与不含任何麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更低的硬度；b.与不含任何麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，对机械刺激的稳定性更高；c.与不含任何麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的临界张力值；d.与不含任何麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有较低的变形能力；e.与不含任何麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的可塑性；以及f.与不含任何麦醇溶蛋白多肽的对应面团相比，具有更高的稠度。
62.根据权利要求58所述的面团，其中所述面团还包含盐。
63.根据权利要求58所述的面团，其中所述面团与至少一种另外的食物成分组合，所述至少一种另外的食物成分选自由调味剂、蔬菜或蔬菜部分、油、植物淀粉、维生素和橄榄组成的组。
64.根据权利要求58所述的面团，其进一步包含发酵剂，所述发酵剂选自由以下组成的组：未经高温消毒的啤酒、酪乳、姜汁啤酒、开菲乳、酸面团发酵剂、酵母、乳清蛋白浓缩物、酸奶、生物发酵剂、化学发酵剂、小苏打、发酵粉、面包氨、碳酸氢钾及其任何组合。
65.一种经基因修饰以表达根据权利要求28至47和49至50中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白的小麦。
66.根据权利要求65所述的小麦，其中与野生型小麦相比，所述对应的非突变多肽的表达下调。
67.根据权利要求66所述的小麦，其包含针对所述非突变多肽的RNA沉默剂。
68.根据权利要求65所述的小麦，其通过DNA编辑剂进行基因修饰。
69.一种玉米植物，其经基因修饰以表达根据权利要求28至47和49至50中任一项所述的去表位的α-麦醇溶蛋白。
70.一种由根据权利要求65至68中任一项所述的小麦生成的面粉。
71.一种由根据权利要求65至68中任一项所述的小麦生成的面团。
72.一种通过加工根据权利要求58或71所述的面团制备的加工面团产品，所述加工选自由以下组成的组：将所述面团与食物成分组合、醒发、揉捏、挤压、模制、成形、烹饪、炖煮、蒸煮、焙烤、烘焙、油炸及其任何组合。
73.根据权利要求72所述的加工面团产品，其为选自由平底面包、比萨面包皮、意大利面、玉米饼、帕尼尼面包、椒盐卷饼、馅饼和三明治面包产品组成的组的形式。
74.一种生产面粉的方法，其包含加工根据权利要求65至68中任一项所述的小麦，从而生产所述面粉。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述加工包含研磨或碾磨。
CN202080056793.2A 2019-07-04 2020-07-02 去表位的α-麦醇溶蛋白及其在乳糜泻和麸质敏感性管理中的用途 Pending CN114938647A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962870695P 2019-07-04 2019-07-04
US62/870,695 2019-07-04
PCT/IB2020/056263 WO2021001784A1 (en) 2019-07-04 2020-07-02 De-epitoped alpha gliadin and use of same for the management of celiac disease and gluten sensitivity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114938647A true CN114938647A (zh) 2022-08-23

Family

ID=71950681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080056793.2A Pending CN114938647A (zh) 2019-07-04 2020-07-02 去表位的α-麦醇溶蛋白及其在乳糜泻和麸质敏感性管理中的用途

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220251148A1 (zh)
EP (1) EP3994268A1 (zh)
JP (1) JP2022538647A (zh)
KR (1) KR20220042139A (zh)
CN (1) CN114938647A (zh)
AU (1) AU2020300101A1 (zh)
CA (1) CA3145972A1 (zh)
IL (1) IL289604A (zh)
WO (1) WO2021001784A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230416314A1 (en) * 2020-11-26 2023-12-28 Ukko Inc. Modified high molecular weight glutenin subunit and uses thereof
IT202100021194A1 (it) 2021-08-04 2023-02-04 Agenzia Naz Per Le Nuove Tecnologie Lenergia E Lo Sviluppo Economico Sostenibile Enea Proteina del glutine detossificata per la formulazione di alimenti a fini medici speciali

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060178299A1 (en) * 2002-06-05 2006-08-10 Anderson Robert P Therapeutic epitopes and uses thereof
WO2011157806A1 (en) * 2010-06-16 2011-12-22 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N Lumc Modified alpha-gliadins
US20140248251A1 (en) * 2011-07-25 2014-09-04 Daniel C. Adelman Methods and Pharmaceutical Compositions for Treating Celiac Disease and Gluten Intolerance
CN107176974A (zh) * 2017-06-06 2017-09-19 中国医学科学院北京协和医院 ω‑5‑醇溶蛋白特异的CD4+T细胞表位及其应用

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
CA1192510A (en) 1981-05-27 1985-08-27 Lawrence E. Pelcher Rna plant virus vector or portion thereof, a method of construction thereof, and a method of producing a gene derived product therefrom
JPS6054684A (ja) 1983-09-05 1985-03-29 Teijin Ltd 新規ｄνａ及びハイブリツドｄνａ
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
CA1288073C (en) 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
GB8608850D0 (en) 1986-04-11 1986-05-14 Diatech Ltd Packaging system
JPS6314693A (ja) 1986-07-04 1988-01-21 Sumitomo Chem Co Ltd 植物ウイルスｒｎａベクタ−
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
DE3850683T2 (de) 1987-02-09 1994-10-27 Lubrizol Genetics Inc Hybrides RNS-Virus.
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
ES2187497T3 (es) 1990-04-12 2003-06-16 Syngenta Participations Ag Promotores preferentemente en tejidos.
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
JPH06510187A (ja) 1991-08-27 1994-11-17 ノバルティス　アクチエンゲゼルシャフト 同翅類昆虫に対する殺虫性質を有したタンパク質及び植物保護におけるそれらの用法
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
EP2368982A3 (en) 2002-03-21 2011-10-12 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
EP2806025B1 (en) 2002-09-05 2019-04-03 California Institute of Technology Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting
US20060014264A1 (en) 2004-07-13 2006-01-19 Stowers Institute For Medical Research Cre/lox system with lox sites having an extended spacer region
EP2650365B1 (en) 2005-10-18 2016-09-14 Precision Biosciences Rationally designed meganucleases with altered sequence specificity and DNA-binding affinity
EP2067402A1 (en) 2007-12-07 2009-06-10 Max Delbrück Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Berlin-Buch; Transponson-mediated mutagenesis in spermatogonial stem cells
AU2011256838B2 (en) 2010-05-17 2014-10-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel DNA-binding proteins and uses thereof
ES2884925T3 (es) 2012-11-27 2021-12-13 Childrens Medical Ct Corp Elementos reguladores distales de BCL11A como dianas para la reinducción de la hemoglobina fetal
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
SG11201605961PA (en) 2014-01-27 2016-08-30 Hinoman Ltd Using wolffia genus plant material for preparing dough
EP3563159A1 (en) * 2016-12-29 2019-11-06 Ukko Inc. Methods for identifying and de-epitoping allergenic polypeptides
AU2019297677A1 (en) * 2018-07-04 2021-02-25 Ukko Inc. Methods of de-epitoping wheat proteins and use of same for the treatment of celiac disease

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060178299A1 (en) * 2002-06-05 2006-08-10 Anderson Robert P Therapeutic epitopes and uses thereof
WO2011157806A1 (en) * 2010-06-16 2011-12-22 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N Lumc Modified alpha-gliadins
US20140248251A1 (en) * 2011-07-25 2014-09-04 Daniel C. Adelman Methods and Pharmaceutical Compositions for Treating Celiac Disease and Gluten Intolerance
CN107176974A (zh) * 2017-06-06 2017-09-19 中国医学科学院北京协和医院 ω‑5‑醇溶蛋白特异的CD4+T细胞表位及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020300101A1 (en) 2022-02-17
WO2021001784A1 (en) 2021-01-07
EP3994268A1 (en) 2022-05-11
CA3145972A1 (en) 2021-01-07
JP2022538647A (ja) 2022-09-05
IL289604A (en) 2022-03-01
KR20220042139A (ko) 2022-04-04
US20220251148A1 (en) 2022-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sánchez‐León et al. Low‐gluten, nontransgenic wheat engineered with CRISPR/Cas9
EP3374501B1 (en) Crispr-associated (cas) proteins with reduced immunogenicity
Camerlengo et al. CRISPR-Cas9 multiplex editing of the α-amylase/trypsin inhibitor genes to reduce allergen proteins in durum wheat
US20210292381A1 (en) Methods of de-epitoping wheat proteins and use of same for the treatment of celiac disease
Altenbach et al. Transformation of the US bread wheat ‘Butte 86’and silencing of omega-5 gliadin genes
CN111566121A (zh) 小麦7a染色体上决定每穗小穗数QTL的基因
CN114938647A (zh) 去表位的α-麦醇溶蛋白及其在乳糜泻和麸质敏感性管理中的用途
JP7001586B2 (ja) グルテン減少穀粒及びその組成物
Guo et al. Molecular characterization of two novel Glu-D1-encoded subunits from Chinese wheat (Triticum aestivum L.) landrace and functional properties of flours possessing the two novel subunits
Liu et al. Comprehensive identification and bread-making quality evaluation of common wheat somatic variation line AS208 on glutenin composition
Feng et al. Two quality-associated HMW glutenin subunits in a somatic hybrid line between Triticum aestivum and Agropyron elongatum
Wen et al. Targeting induced local lesions in the wheat DEMETER and DRE2 genes, responsible for transcriptional derepression of wheat gluten proteins in the developing endosperm
Wang et al. Expression of the 1Ax1 transgene in an elite Chinese wheat variety and its effect on functional properties
US11879128B2 (en) Targeting of gluten by genome editing
WO2016202805A2 (en) Targeting of prolamin by rnai in bread wheat
US20230416314A1 (en) Modified high molecular weight glutenin subunit and uses thereof
US20160145636A1 (en) Compositions and methods for the production of gluten free food products
WO2023133570A2 (en) Modified low molecular weight glutenin subunit and uses thereof
ES2905768T3 (es) Plantas transgénicas
CN115843314B (zh) 获得具有增加的白粉病抗性的小麦的方法
Von Wettstein Mutants pave the way to wheat and barley for celiac patients and dietary health
Rustgi et al. Celiac-safe wheat genotypes: A dietary solution to the gluten-induced disorders
De Groot Genotyping South African wheat germplasm for hardness alleles
von Wettstein et al. A multipronged approach to develop nutritionally improved, celiac safe, wheat cultivars

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination