ES2884925T3 - Elementos reguladores distales de BCL11A como dianas para la reinducción de la hemoglobina fetal - Google Patents

Abstract

Un método para producir una célula progenitora hematopoyética humana que tiene disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A, comprendiendo el método poner en contacto ex vivo o in vitro una célula progenitora hematopoyética aislada con una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que codifica una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN une o escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC), y causa una deleción de uno o más sitios hipersensibles a la ADNasa 1 (DHS) + 62, +58 y +55, reduciendo así el ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

Description

DESCRIPCIÓN

Elementos reguladores distales de BCL11A como dianas para la reinducción de la hemoglobina fetal

Antecedentes de la invención

La hemoglobina del adulto normal comprende cuatro proteínas globinas, dos de las cuales son proteínas alfa (a) y dos de las cuales son proteínas beta (p). Durante el desarrollo fetal de los mamíferos, particularmente en seres humanos, el feto produce hemoglobina fetal, que comprende dos proteínas gamma (Y)-globinas en lugar de las dos proteínas pglobinas. Durante el período neonatal, se produce un cambio de globinas, denominado el "cambio fetal", punto en el cual, los precursores eritroides cambian de producir predominantemente Y-globina a producir predominantemente pglobina. El cambio en el desarrollo de la producción predominantemente de hemoglobina fetal o HbF (a2Y2) a la producción de hemoglobina del adulto o HbA (a2p2) comienza aproximadamente de las 28 a 34 semanas de gestación y continúa brevemente después del nacimiento hasta que la HbA se vuelve predominante. Este cambio es el resultado principalmente de la disminución de la transcripción de los genes de gamma-globinas y el aumento de la transcripción de los genes de beta-globinas. Como promedio, la sangre de un adulto normal contiene menos de 1 % de HbF, aunque los niveles de HbF residual tienen una variación de más de 20 veces en adultos sanos y se controlan genéticamente.

Las hemoglobinopatías abarcan una serie de anemias de origen genético en las que existe una disminución de la producción y/o un aumento de la destrucción (hemólisis) de glóbulos rojos (RBC). Estas incluyen además defectos genéticos que dan como resultado la producción de hemoglobinas anormales con una afectación concomitante de la capacidad de mantener la concentración de oxígeno. Algunos de tales trastornos involucran la incapacidad de producir p-globina normal en cantidades suficientes, mientras que otros involucran la total incapacidad de producir p-globina normal. Estos trastornos asociados con la proteína p-globina se denominan generalmente p-hemoglobinopatías. Por ejemplo, las p-talasemias son el resultado de un defecto parcial o completo en la expresión del gen de p-globina, lo que conduce a la deficiencia o ausencia de HbA. La anemia drepanocítica es el resultado de una mutación puntual en el gen estructural de la p-globina, que conduce a la producción de una hemoglobina (HbS) anormal (drepanocítica). La HbS tiene tendencia a la polimerización, particularmente en condiciones de carencia de oxígeno. Los r Bc con HbS son más frágiles que los RBC normales y experimentan hemólisis más fácilmente, lo que conduce eventualmente a la anemia.

Recientemente, la búsqueda de un tratamiento orientado a la reducción del desequilibrio de las cadenas de globinas o la predisposición a la polimerización de la hemoglobina en pacientes con p-hemoglobinopatías se ha centrado en la manipulación farmacológica de la hemoglobina fetal (a2Y2; HbF). El potencial terapéutico de tales enfoques se sugiere por las observaciones del fenotipo moderado de individuos con herencia conjunta de p-talasemia homocigótica y persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (HPFH), así como por aquellos pacientes con p-talasemia homocigótica que no sintetizan hemoglobina del adulto, pero en los que se observa una reducción de la necesidad de transfusiones en presencia de aumento de las concentraciones de hemoglobina fetal. Además, se ha observado que ciertas poblaciones de pacientes adultos con anomalías en la cadena p tienen niveles de hemoglobina fetal (HbF) mayores que los normales, y se ha observado que tienen un curso clínico de la enfermedad más moderado que los pacientes con niveles de HbF normales en el adulto. Por ejemplo, un grupo de pacientes con anemia drepanocítica de Arabia Saudita que expresan 20-30 % de HbF solo tienen manifestaciones clínicas moderadas de la enfermedad. Ahora se acepta que los trastornos de la hemoglobina, tales como la anemia drepanocítica y las p-talasemias, se alivian con el aumento de la producción de HbF.

Como se mencionó antes, el cambio de hemoglobina fetal a hemoglobina del adulto (a2Y2; HbA) se produce normalmente dentro de los seis meses después del parto. Sin embargo, en la mayoría de los pacientes con phemoglobinopatías, los genes de y globinas corriente arriba están intactos y son completamente funcionales, de manera que si estos genes se reactivaran, podría mantenerse la síntesis de hemoglobina funcional durante la adultez, y por lo tanto aliviar la gravedad de la enfermedad. Desafortunadamente, los mecanismos moleculares in vivo subyacentes al cambio de globinas no se entienden bien.

La evidencia que soporta la factibilidad de la reactivación de la producción de hemoglobina fetal proviene de experimentos en los que se demostró que la sangre periférica, que contiene células clonogénicas, cuando reciben la combinación adecuada de factores de crecimiento, producen colonias eritroides y proliferan en cultivo semisólido. Las células individuales en tales colonias pueden acumular hemoglobina fetal (HbF), hemoglobina del adulto (HbA) o una combinación de ambas. En cultivos de sangre de adulto, los glóbulos rojos nucleados acumulan HbA (F-A+) solamente, o una combinación de HbF y HbA (F+A+). Más importante aún, las colonias individuales contienen tanto células F+ como F-, lo que indica que ambos tipos son progenie de las mismas células madre circulantes. Por lo tanto, durante las etapas tempranas del desarrollo en cultivo, las células ejecutan una opción, a través de mecanismos que actualmente se desconocen, de si expresar o no HbF. La proporción de células F+ adultas que se desarrollan en cultivo no parece programarse previamente in vivo, sino que parece depender de las condiciones de cultivo: Una variación en la ruta de expresión combinada de HbF y HbA, por ejemplo, puede lograrse in vitro mediante concentraciones séricas altas, debido a la actividad de un compuesto no identificado que puede absorberse en carbón activado.

En general, la identificación de moléculas que desempeñan un papel en el cambio de globinas es importante para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que interfieren con la hemoglobina del adulto e inducen la síntesis de hemoglobina fetal. Tales moléculas proporcionarían nuevas dianas para el desarrollo de intervenciones terapéuticas para una variedad de hemoglobinopatías en las que la reactivación de la síntesis de hemoglobina fetal aliviaría significativamente la gravedad y la morbilidad de la enfermedad.

Resumen

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una célula progenitora hematopoyética humana que tiene disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A, el método comprende poner en contacto ex vivo o in vitro una célula progenitora hematopoyética aislada con una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que codifica una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN se une y escinde el a Dn genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC), y provoca una deleción de uno o más sitios hipersensibles a la ADNasa 1 (DHS) 62, 58 y 55, para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una célula progenitora hematopoyética, el método comprende las etapas de: poner en contacto ex vivo o in vitro una célula progenitora hematopoyética aislada con una cantidad eficaz de una composición que comprende una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que codifica una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula progenitora hematopoyética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, en donde la al menos una modificación genética es una deleción de uno o más sitios hipersensibles a la ADNasa 1 (DHS) 62, 58 y 55, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en dicha célula, o su progenie, con relación a dicha célula antes de dicho contacto.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una célula humana modificada genéticamente aislada que comprende al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, en donde la al menos una modificación genética es producida por una endonucleasa dirigida a ADN que se une y escinde el ADN genómico en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, y en donde la al menos una modificación genética es una deleción de uno o más sitios hipersensibles a la ADNasa 1 (DHS) 62, 58 y 55.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende la célula humana modificada genéticamente aislada descrita anteriormente.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula progenitora hematopoyética humana aislada para el uso en el aumento de los niveles de hemoglobina fetal en un humano que lo necesita, en donde la célula progenitora hematopoyética aislada se ha puesto en contacto ex vivo o in vivo con una cantidad eficaz de una composición que comprende una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que que codifica una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN une y escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189­ 60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, en donde la al menos una modificación genética es una deleción de uno o más sitios hipersensibles a la ADNasa 1 (DHS) 62, 58 y 55

En la presente descripción se proporcionan métodos y composiciones para aumentar los niveles de p-globinas fetales en una célula mediante la interrupción de la expresión de BCL11A a nivel genómico. En la presente descripción se proporcionan además métodos y composiciones relacionadas con el tratamiento de hemoglobinopatías por reinducción de los niveles de p-globinas fetales.

En la presente descripción se describe un método para producir una célula progenitora que tiene disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A, el método comprende poner en contacto una célula progenitora aislada con un agente que se une al ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC), para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

En la presente descripción se describe además un método para producir una célula humana modificada genéticamente que tiene al menos una modificación genética que comprende poner en contacto una célula aislada con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta.

En la presente descripción se proporciona además una célula humana modificada genéticamente aislada que tiene al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2. En una realización, al menos una modificación genética es una deleción en el ADN genómico en la ubicación especificada. En una realización, la célula humana modificada genéticamente aislada tiene reducción o disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A en comparación con una célula de control que no tiene una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

En la presente descripción se describe además un uso de una célula humana modificada genéticamente aislada que tiene al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 descrita en la presente descripción para el propósito de aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero.

En la presente descripción se describe además un uso de una célula humana modificada genéticamente aislada que tiene al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 descrita en la presente descripción para el tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero.

En la presente descripción se describe además un uso de una célula humana modificada genéticamente aislada que tiene al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 descrita en la presente descripción para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero de manera que los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero aumentan.

En la presente descripción se describe además una composición que comprende células humanas modificadas genéticamente aisladas que tienen al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2. En una realización, la composición comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

En la presente descripción se describe además un uso de una composición que comprende células humanas modificadas genéticamente aisladas que tienen al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189­ 60,728,612 del cromosoma 2 para el propósito de aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero.

En la presente descripción se describe además un uso de una composición que comprende células humanas modificadas genéticamente aisladas que tienen al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189­ 60,728,612 del cromosoma 2 para el tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero.

En la presente descripción se describe adicionalmente un uso de una composición que comprende células humanas modificadas genéticamente aisladas que tienen al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189­ 60,728,612 del cromosoma 2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero de manera que los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero aumentan.

En la presente descripción se describe además una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a a Dn escinde el ADN genómico de una célula humana en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta. En una realización, la composición comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

En la presente descripción se describe además un uso de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de una célula humana en la ubicación 60.716.189- 60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta para el propósito de aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero.

En la presente descripción se describe además un uso de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de una célula humana en la ubicación 60.716.189- 60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta para el tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero.

En la presente descripción se describe además un uso de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de una célula humana en la ubicación 60.716.189- 60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero de manera que los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero aumentan.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de un agente que se une al ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en el mamífero o para reducir el ARNm o la expresión de BCL11A, en donde el ARNm o la expresión proteica de BCL11A se reduce.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en el mamífero o para reducir el ARNm o la expresión de BCL11A, en donde la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en el mamífero o para reducir el ARNm o la expresión de BCL11A, en donde la enzima dirigida a ADN produce al menos una modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en el cromosoma 2, para afectar de este modo el ARNm o la expresión de BCL11A. En una realización, al menos una modificación epigenética es en la ubicación 60,716,189­ 60,728.612. En otra realización, el efecto de la una modificación epigenética es reducir el ARNm o la expresión proteica de BCL11A. En una realización, al menos una modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en el cromosoma 2 afecta directa o indirectamente la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de cualquiera de las células aisladas descritas en la presente descripción para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en el mamífero.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de una composición que comprende células humanas modificadas genéticamente aisladas para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en el mamífero, en donde las células tienen al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) producida mediante el proceso de poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificación genética en esta.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de una composición que comprende células humanas modificadas genéticamente aisladas para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en el mamífero, en donde las células tienen al menos una modificación epigenética en el cromosoma 2. En una realización, al menos una modificación epigenética en el cromosoma 2 es en la ubicación 60,716,189-60,728,612 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC). En otra realización, al menos una modificación epigenética en el cromosoma 2 se produce mediante el proceso de poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN de manera que la enzima dirigida a ADN produce al menos una modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en el cromosoma 2 que afecta la ubicación 60,716,189-60,728,612 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC).

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de cualquiera de las células aisladas descritas en la presente descripción o cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción para la fabricación de un medicamento para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero.

En la presente descripción se describe un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una célula, el método comprende las etapas de: poner en contacto una célula aislada con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a a Dn escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en dicha célula, o su progenie, con relación a la célula antes del contacto.

En la presente descripción se describe además un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende las etapas de poner en contacto una célula progenitora hematopoyética aislada en dicho mamífero con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189­ 60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de la hemoglobina fetal aumenta en dicho mamífero, con relación a la expresión antes de dicho contacto.

En la presente descripción se describe además un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende trasplantar una célula humana modificada genéticamente aislada que tiene al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 en el mamífero.

En una realización, esta descripción proporciona un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende las etapas de proporcionar una población aislada de células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas del mamífero ex vivo, y poner en contacto la población de células progenitoras o madre hematopoyéticas con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto.

En una realización, esta descripción proporciona un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende las etapas de aislar una población de células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas del mamífero, y poner en contacto ex vivo la población de células progenitoras o madre hematopoyéticas con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189­ 60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto.

En una realización, esta descripción proporciona un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende las etapas de aislar una población de células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas del mamífero y eliminar el ADN genómico de las células en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto.

En una realización, esta descripción proporciona un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende las etapas de aislar una población de células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas del mamífero y ex vivo eliminar el ADN genómico de las células en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto.

En una realización, esta descripción proporciona un método de tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero que comprende las etapas de: (a) proporcionar células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas o iPSC; (b) poner en contacto las células ex vivo o in vitro con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto; y (c) administrar las de la etapa (b) en el mamífero.

En una realización, esta descripción proporciona un método de tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero que comprende las etapas de:( a) aislar células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas del mamífero; (b) poner en contacto las células ex vivo o in vitro con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto; y (c) administrar las de la etapa (b) en el mamífero.

En una realización, esta descripción proporciona un método de tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero que comprende las etapas de: (a) proporcionar células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas o iPSC; (b) ex vivo eliminar el ADN genómico de las células en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto; y (c) administrar las células de la etapa (b) en el mamífero.

En una realización, esta descripción proporciona un método de tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero que comprende las etapas de:( a) aislar células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas del mamífero; (b) ex vivo eliminar el ADN genómico de las células en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto; y (c) administrar las de la etapa (b) en el mamífero.

En una realización, esta descripción proporciona un método de tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero (por ejemplo un ser humano) que comprende introducir una composición descrita en la presente descripción que comprende células modificadas genéticamente aisladas que tienen al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero. En una realización, esta descripción proporciona un método de tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero (por ejemplo un ser humano) que comprende aumentar la expresión de hemoglobina fetal en el mamífero mediante el método descrito en la presente descripción.

En una realización, la célula aislada o la población aislada de células es/son célula(s) humana(s).

En una realización, la célula aislada o población aislada de células es/son célula(s) progenitora(s).

En una realización, la célula humana es una célula progenitora hematopoyética.

En una realización, la célula humana es una célula madre pluripotente inducida.

En una realización, la célula madre pluripotente inducida es una célula progenitora hematopoyética.

En una realización, la progenitora hematopoyética es una célula del linaje eritroide.

En una realización, la célula progenitora hematopoyética o aislada se pone en contacto ex vivo o in vitro o in vivo. En una realización, al menos una modificación genética es una deleción.

En una realización, la deleción elimina toda la región entre la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 o elimina una porción de la región lo que da como resultado la interrupción de uno o más sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS).

En otra realización, la deleción comprende uno o más de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripción en la sección de Ejemplos.

En otra realización, la deleción comprende uno o más de los marcadores SNP descritos en la Tabla 2.

En otra realización, la deleción comprende uno o más de los fragmentos enumerados en la Tabla 7.

En otra realización, la deleción elimina toda la región entre la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 o elimina una porción de la región lo que da como resultado la interrupción de uno o más sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS). En una realización, como se usa en la presente descripción, el término "porción" en el contexto de deleción genómica es al menos 20 %-80 % de la región especificada.

En una realización adicional de cualquier método de tratamiento, el método comprende quimioterapia y/o terapia de radiación para eliminar o reducir las células progenitoras o madre hematopoyéticas endógenas en el mamífero. En una realización de cualquier método, las células en contacto que tienen al menos una modificación genética pueden crioconservarse y almacenarse hasta que las células sean necesarias para la administración a un mamífero.

En una realización de cualquier método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas o células aisladas pueden sustituirse con unas iPSC descritas en la presente descripción.

En una realización de cualquier método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas o iPSC o células aisladas son autólogas para el mamífero, lo que significa que las células se derivan del mismo mamífero. En otra de las realizaciones del método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas o iPSC o células aisladas no son autólogas para el mamífero, lo que significa que las células no se derivan del mismo mamífero, sino de otro animal de la misma especie. Por ejemplo, el mamífero es un ser humano.

En una realización de cualquier método de tratamiento, el método comprende además seleccionar un mamífero que necesita un aumento de la expresión de hemoglobina fetal.

En una realización de cualquier método de tratamiento, el método comprende además seleccionar un mamífero que necesita tratamiento de una hemoglobinopatía.

En cualquier realización de cualquier método de tratamiento descrito, la hemoglobinopatía es una p-hemoglobinopatía. En cualquier realización de cualquier método de tratamiento descrito, la hemoglobinopatía es p-talasemia.

En cualquier realización de cualquier método de tratamiento descrito, la hemoglobinopatía es anemia drepanocítica.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A muestra la distribución de 636 SNP publicados previamente asociados con rasgos eritroides a P < 5 x 10-8 con respecto a secuencias promotoras, exónicas, intrónicas, 3'UTR, e intergénicas. Para la comparación, se muestra la distribución genómica de estas regiones.

La Figura 1B es un gráfico que representa la distribución acumulada de las distancias de los 636 SNP asociados a rasgos eritroides con respecto al potenciador eritroide más cercano. Los potenciadores eritroides se definieron por las secuencias a más de 2 kb de los TSS de los genes anotados por Refseq con hipersensibilidad a DNAsa I, presencia de H3K4me1, ya sea H3K27ac o H3K9ac, y ausencia de H3K4me3 y H3K27me3. La distancia de la media ± SD de 50 conjuntos de 636 SNP asociados a rasgos no eritroides permutados aleatoriamente (de la base de datos de GWAS), SNP del arreglo de genotipificación Affy 6.0, o SNP aleatorios también se representaron gráficamente.

La Figura 2A muestra el análisis ChIP seguido de secuenciación masiva en paralelo realizado a partir de precursores eritroides derivados de células CD34+ con anticuerpos para H3K27me3, H3K4me3, H3K4me1, H3K27ac, GATA1, TAL1, y PolII. Los núcleos aislados de precursores eritroides, cerebro fetal, y linfocitos B y T se sometieron a tratamiento con DNAsa I con determinación de los sitios de escisión mediante secuenciación masiva en paralelo. Los SNP asociados a HbF incluyen los asociados con el nivel de HbF o el número de células F a P < 5 x 10-8 y los SNP centinelas son aquellos con asociación más alta a HbF o al número de células F en un análisis GWAS dado. Los tres DHS eritroides adyacentes se etiquetan como 62, 58, y 55 en base a la distancia en kb desde el TSS de BCL11A. La Figura 2B muestra el análisis ChIP-qPCR de precursores eritroides humanos primarios en el intrón 2 de BCL11A, normalizado a 1 % de cromatina inicial. Los DHS 62, 58, y 55 son de la Figura 2A sombreados. Se muestra el enriquecimiento en loci de control negativo (GAPDH, OCT4) y control positivo (LCR de p-globina HS3 y a-globina HS-40) para la comparación.

La Figura 2C muestra la captura de la conformación cromosómica realizada en precursores eritroides humanos primarios en el locus BCL11A con el uso del promotor de BCL11A como ancla. La frecuencia de interacción se normaliza respecto a la interacción LCR-HBB.

La Figura 3A muestra donantes anónimos sanos cuyas células madre/progenitoras hematopoyéticas estaban disponibles con genotipificación en rs1427407 para identificar los individuos heterocigóticos. Se identificaron cinco donantes. Las células madre/progenitoras hematopoyéticas se sometieron a cultivo de diferenciación eritroide. La cromatina se aisló a partir de eritroblastos, y se inmunoprecipitó con GATA1 o TAL1. El ADN para ChIP o ADN inicial se sometió a una reacción de pirosecuenciación para cuantificar la abundancia relativa del alelo G de rs1427407. La Figura 3B muestra los datos de donantes anónimos sanos cuyas células madre/progenitoras hematopoyéticas estaban disponibles con genotipificación en rs1427407, rs7606173, y rs7569946 para identificar los individuos heterocigóticos para el haplotipo rs1427407-rs7606173 así como rs7569946. Se identificaron tres donantes. El haplotipaje reveló que el alelo G de rs7569946 estaba en el mismo cromosoma que el alelo G de rs1427407 y el alelo C de rs7606173 en cada caso. Las células madre/progenitoras hematopoyéticas se sometieron a cultivo de diferenciación eritroide. El ARN y el ADN genómico se aislaron, y el ADNc se produjo por transcripción inversa. Las muestras de ADNg y ADNc pareadas se sometieron a una reacción de pirosecuenciación para cuantificar la abundancia relativa del alelo G de 7569946.

La Figura 3C muestra la media de HbF para los haplotipos rs1427407-rs7606173 en la cohorte CSSCD. El nivel medio de HbF fue 4,05 % (SD 3,10) en 213 individuos rs1427407-rs7606173 G-C, 7,08 % (SD 4,50) en 254 heterocigóticos rs1427407-rs7606173 T-G/G-T, y 11,21 % (SD 4,37) en 60 individuos rs1427407-rs7606173 T-G. Los valores de P corresponden a pruebas t de Student de una cola. Las frecuencias de los haplotipos en CSSCD son: TG: 24,5 %, TC 0,085 %, GC 42,3 %, GG 33,1 %.

Las figuras 4A-4C muestran los datos de un fragmento de 12,4 kb del intrón 2 de BCL11A que abarca los DHS 62, 58 y 55 (que abarcan 52,0-64,4 kb desde el TSS) clonado corriente arriba de un promotor mínimo de Hsp68 y el gen reportero lacZ flanqueado por elementos aislantes de H19. Los embriones murinos transgénicos transitorios se generaron por inyección nuclear en la etapa de una célula.

La Figura 4A muestra un embrión transgénico transitorio E12,5 teñido con X-gal.

La Figura 4B muestra suspensiones celulares aisladas a partir de la sangre periférica y el hígado fetal de embriones transgénicos estables E12,5. Los centrifugados celulares se tiñeron con X-gal y la tinción de contraste se hizo con rojo nuclear.

La Figura 4C muestra los datos de eritroblastos de médula ósea (CD71+/Ter119+) y linfocitos esplénicos (CD19+ para linfocitos B y CD3+ para linfocitos T) que se aislaron y se clasificaron a partir de transgénicos estables adultos jóvenes. Las células se sometieron a tinción con X-gal o aislamiento de ARN seguido de RT-qPCR. La expresión génica se normalizó respecto a GAPDH, y se expresó con relación a linfocitos T, que no expresan BCL11A ni lacZ.

Las figuras 5A-5C muestran células de eritroleucemia de ratón (MEL) y células linfoides pro-B transfectadas con dos pares de TALEN cada una diseñada para generar una DSB en cualquier extremo del potenciador eritroide ortólogo de 10 kb del intrón 2 de BCL11A de 50.4-+60.4 kb. Se aislaron los clones (denominados A50,4-60,4) con deleción bialélica del segmento de 10 kb.

La Figura 5A muestra la RT-qPCR de Bel11a realizada con pares de cebadores que reconocen las secuencias corriente arriba, que abarcan, y corriente abajo del intrón 2.

La Figura 5B muestra una inmunotransferencia de A50,4-60,4 con anti-BCL11A.

La Figura 5C muestra la expresión génica de globinas en clones de MEL A50,4-60,4. Un par de cebadores común reconoce las p-globinas p2 y p1 del adulto, mientras que cebadores independientes reconocen las p-globinas sy y pH1 embrionarias.

La Figura 6 muestra pronúcleos de cigotos de ratón inyectados con el constructo de reportero lacZ. Los embriones transgénicos se aislaron a E12,5. Los embriones se genotiparon por PCR de lacZ. Se informa la fracción de embriones transgénicos con tinción por X-gal de hígado fetal.

La Figura 7 muestra fragmentos de secuencia de una a dos kb clonados en el constructo de potenciador con promotor mínimo de TK y GFP. Los constructos reporteros de potenciador se suministraron mediante vectores lentivirales a precursores eritroides humanos primarios. Las células transfectadas se seleccionaron por resistencia a puromicina. Se midió la intensidad de fluorescencia media de GFP.

La Figura 8 muestra los datos relacionados con el perfil de cromatina de células eritroides de ratón que revela una firma de potenciador ortólogo en el intrón 2 de Bel11 a. Las anotaciones en un sistema de coordenadas genómicas de ratón se obtuvieron del perfil de cromatina eritroide de ratón global publicado previamente, con modificaciones de histonas y escisión por DNAsa-I y ChIP-seq de GATA1 y TAL1. El rectángulo de líneas discontinuas limita la firma de potenciador ortólogo que define el elemento A50,4-60,4 diana de la deleción mediada por TALEN.

La Figura 9A es una representación esquemática de una estrategia de modificación del genoma mediada por TALEN usada en la presente descripción. Las TALEN son nucleasas específicas de secuencia. Se modificaron genéticamente dos pares de TALEN para generar rupturas bicatenarias, una en Bcl11a 50,4 y la otra en 60,4. Se aislaron los clones que tenían las dos d Sb reparadas por NHEJ con escisión del segmento de 10 kb intermedio. Los clones se tamizaron por PCR con cebadores 5', 3', internos y que abarcan la deleción de 10 kb.

La Figura 9B muestra la transferencia Southern de ADN genómico digerido con HindIII de clones A50,4-60,4 que corroboró que estos clones tenían el alelo con la escisión esperada y carecían de un alelo sin escisión.

La Figura 9C muestra los clones A50,4-60,4 que tienen deleción bialélica del potenciador de BCL11A producida por NHEJ mediada por TALEN en células de eritroleucemia de ratón (MEL) y células linfoides pro-B. Los histogramas muestran la amplificación por PCR producida con el uso de los cebadores 5', 3', internos y que abarcan la deleción de 10 kb (ver los amplicones en la Figura 9A). Todos los clones A50,4-60,4 carecían de la amplificación de Del-1 y Del-2, lo que indica la presencia de una deleción bialélica del potenciador eritroide de 10 kb del intrón 2 de BCL11A de 50,4-+60,4 kb.

La Figura 10 muestra la secuenciación de Sanger de los productos de PCR de los clones A50,4-60,4. Se muestra las secuencias de reconocimiento de TALEN izquierda y derecha de 5' (+50,4) y 3' (+60,4) con separadores intermedios. Algunos alelos mostraron evidencia de unión de extremos directamente de cada secuencia de separador digerida mientras que otros alelos mostraron la pérdida de cientos de nucleótidos adicionales. Solo un alelo de cada uno se aisló a partir del clon de MEL #1 y el clon de pro-B #2.

La Figura 11A muestra los datos de los genotipos obtenidos en 1.178 individuos de CSSCD para 38 variantes dentro de los DHS de BCL11A 62, 58 o 55. Asociaciones más significativas con el nivel de HbF entre SNP (n = 10) comunes (MAF > 1 %) antes (rs1427407) o después (rs7606173) del análisis condicional en rs1427407. Coordenadas de SNP cromosoma 2, construcción 19.

La Figura 11B los análisis de asociación con HbF en BCL11A. Los datos de los genotipos se obtuvieron en 1.178 individuos de CSSCD para 38 variantes dentro de los DHS de BCL11A 62, 58 o 55. Los SNP centinelas son aquellos con la asociación más alta con el nivel de HbF o con el número de células F en GWAS previos (7-12). Estos s Np se muestran con respecto al intrón 2 de BCL11A con los 3 DHS 62, 58 y 55 indicados.

Descripción detallada

Los métodos y composiciones descritos en la presente descripción se refieren, en parte, al descubrimiento de una región reguladora distal corriente arriba del gen de BCL11A que puede regular la expresión proteica BCL11A. La proteína BCL11A actúa como un regulador específico de etapa de la expresión de hemoglobina fetal mediante la represión de la inducción de Y-globina. Por consiguiente, los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción son métodos nuevos para la regulación de la expresión de Y-globina en células eritroides. Más específicamente, estas actividades pueden utilizarse en métodos para el tratamiento de p-hemoglobinopatías mediante la inducción de Y-globina por medio de la inhibición del producto del gen de BCL11A.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un método para producir una célula progenitora aislada que tiene disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A, el método comprende poner en contacto una célula progenitora aislada con un agente que se une al ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189­ 60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC), para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un método para producir una célula progenitora aislada que tiene disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A, el método comprende proporcionar una célula progenitora aislada y poner en contacto la célula progenitora aislada con un agente que se une al ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC), para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un método para producir una célula progenitora aislada que tiene disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A, comprendiendo el método poner en contacto una célula progenitora aislada con un agente que se une produce una modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en el cromosoma 2 para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A. En una realización, la modificación epigenética en el ADN genómico es en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC).

En una realización, en la presente descripción se proporciona un método para producir una célula progenitora aislada que tiene disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A, comprendiendo el método proporcionar una célula progenitora aislada y poner en contacto la célula progenitora aislada con un agente que se une produce una modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en el cromosoma 2 para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A. En una realización, la modificación epigenética en el ADN genómico es en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC).

La divulgación descrita en la presente descripción, en una realización preferida, no se refiere a un proceso para clonar seres humanos, a procesos para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos, a usos de embriones humanos para propósitos industriales o comerciales o a procesos para modificar la identidad genética de animales que probablemente les provoque sufrimiento sin ningún beneficio médico sustancial para el hombre o animal, y también animales que son el resultado de tales procesos.

En la presente descripción se describe un método para producir una célula humana modificada genéticamente aislada que tiene al menos una modificación genética que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificación genética en esta.

En la presente descripción se proporciona un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una célula aislada, el método comprende disminuir el ARNm o la expresión proteica de BCL11A en la célula. En una realización, la disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A se logra provocando al menos una modificación genética en el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC). En otra realización, la disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A se logra provocando al menos una modificación genética en el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 que da como resultado la modificación epigenética de la función genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2. En esta realización, la actividad del potenciador de BCL11A ubicado dentro de esta ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 se reduce. Mediante la disminución en esta realización, la actividad del potenciador en el aumento del ARNm o la expresión proteica de BCL11A en la célula es al menos 5 % menor es al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o más en comparación con una célula de control que no se trata en ningún método descrito en la presente descripción. Por disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A en la célula se entiende que la expresión proteica es al menos 5 % menor es al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o más en comparación con una célula de control que no se trata en ningún método descrito en la presente descripción.

En la presente descripción se proporciona un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una célula aislada, el método comprende proporcionar una célula humana o célula progenitora aislada y disminuir el ARNm o la expresión proteica de BCL11A en la célula.

En la presente descripción se proporciona un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una célula, el método comprende las etapas de: poner en contacto una célula humana aislada con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en la célula, o su progenie, con relación a la célula antes del contacto.

En la presente descripción se proporciona un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una célula, el método comprende las etapas de proporcionar una célula humana o célula progenitora aislada, poner en contacto una célula humana o célula progenitora aislada con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,18960,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en la célula, o su progenie, con relación a la célula antes del contacto.

En la presente descripción se describe un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende disminuir el ARNm o la expresión proteica de BCL11A en una célula progenitora hematopoyética en el mamífero. En una realización, la disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A se logra provocando al menos una modificación genética en el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189­ 60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC). En otra realización, la disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A se logra provocando al menos una modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en el cromosoma 2. En otra realización, la disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A se logra provocando al menos una modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

En la presente descripción se describe un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende proporcionar una célula humana o célula progenitora aislada de un mamífero y disminuir el ARNm o la expresión proteica de BCL11A en la célula. En una realización, el método comprende además seleccionar un mamífero que necesita un aumento de los niveles de hemoglobina fetal en el mismo.

En la presente descripción se describe un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende las etapas de poner en contacto una célula progenitora hematopoyética en el mamífero con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto.

En la presente descripción se describe un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende las etapas de proporcionar una célula humana o célula progenitora aislada o una población aislada de células progenitoras hematopoyéticas de un mamífero poner en contacto la célula humana o célula progenitora o célula progenitora hematopoyética con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de la hemoglobina fetal aumenta en dicho mamífero, con relación a la expresión antes del contacto.

En la presente descripción se proporciona un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende trasplantar una célula humana modificada genéticamente como se describe en la presente descripción en el mamífero.

En una realización, el método comprende además proporcionar una célula aislada o una célula progenitora aislada o una población aislada de células que puede ser una célula progenitora o célula progenitora hematopoyética.

En una realización, la célula aislada es una célula progenitora aislada.

En una realización, la célula progenitora aislada es una célula humana aislada.

En una realización, la célula humana aislada es una célula progenitora hematopoyética.

En otra realización, la célula hematopoyética es una célula del linaje eritroide. Los métodos para aislar células progenitoras hematopoyéticas se conocen bien en la técnica, por ejemplo, mediante la purificación por citometría de flujo de células CD34+ o CD133+, microesferas conjugadas con anticuerpos contra CD34 o CD133, marcadores de célula progenitora hematopoyética. Se dispone además de kits comerciales, por ejemplo, el kit de microesferas para CD34, humano, y el kit CD34 MultiSort, humano, de MACS® Technology y el kit de enriquecimiento de células progenitoras hematopoyéticas de ratón EasySep™ de STEMCELL™ Technology.

En otra realización, la célula humana es una célula madre pluripotente inducida (iPSC).

En otra realización, el contacto de cualquier célula descrita en la presente descripción puede ser ex vivo o in vitro o in vivo.

En otra realización, el contacto de cualquier célula descrita en la presente descripción comprende poner en contacto con un agente que se une al ADN genómico de la célula en el cromosoma 2 y produce una modificación epigenética en el genoma de la célula en el cromosoma 2, para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

En una realización, la modificación epigenética es en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC).

En una realización, al menos una modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en el cromosoma 2 afecta directa o indirectamente la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

Como se usa en la presente descripción, "que afecta indirectamente la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2" se refiere a efectos a larga distancia de la modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

En otra realización, el contacto de cualquier célula descrita en la presente descripción comprende el contacto con un agente que se une al ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC), y produce una modificación epigenética en el cromosoma 2, para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

En otra realización, el contacto de cualquier célula descrita en la presente descripción comprende el contacto con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN de manera que la enzima dirigida a ADN produce una modificación epigenética en el cromosoma 2, para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

En otra realización, el contacto de cualquier célula descrita en la presente descripción comprende el contacto con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN de manera que la enzima dirigida a ADN produce una modificación epigenética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A. En una realización, la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto.

En otra realización, la célula progenitora hematopoyética, la célula humana aislada, o la célula aislada se pone en contacto ex vivo o in vitro.

En otra realización, al menos una modificación genética es una deleción.

En otra realización, la deleción comprende uno o más de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripción en la sección de Ejemplos. En otra realización, la deleción consiste esencialmente en uno o más de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripción en la sección de Ejemplos. En otra realización, la deleción consiste en uno o más de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripción en la sección de Ejemplos.

En otra realización, la modificación epigenética comprende o afecta uno o más de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripción en la sección de Ejemplos. Como se usa en la presente descripción, la expresión "afecta uno o más de los sitios hipersensibles a DNAsa 1" significa que la función natural de estos sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 se reduce, por ejemplo, el acceso a factores de transcripción o enzimas de degradación del ADN tales como DNAsa I. En general, los sitios hipersensibles a DNAsa I (DHS) son regiones de la cromatina que son sensibles a la escisión por la enzima DNAsa I. En estas regiones específicas del genoma, la cromatina ha perdido su estructura condensada, lo que expone el ADN, y lo hace accesible. Esto aumenta la disponibilidad del ADN para la degradación por enzimas, como la DNAsa I. Estas zonas accesibles de la cromatina se relacionan funcionalmente con la actividad transcripcional, dado que este estado remodelado es necesario para la unión de proteínas tales como factores de transcripción. Por consiguiente, la modificación epigenética contemplada en la presente descripción da como resultado una reducción del acceso a enzimas de degradación del ADN que es al menos 5 % menor es al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o más en comparación con una célula de control que no se trata en ningún método descrito en la presente descripción.

En otra realización, la deleción comprende uno o más de los marcadores SNP descritos en la Tabla 2. En otra realización, la deleción consiste esencialmente en uno o más de los marcadores SNP descritos en la Tabla 2. En otra realización, la deleción consiste en uno o más de los marcadores SNP descritos en la Tabla 2.

En otra realización, la modificación epigenética comprende o afecta uno o más de los marcadores SNP descritos en la Tabla 2. Como se usa en la presente descripción, la expresión "afecta uno o más de los marcadores SNP" significa que la(s) función(ones) natural(es) de estos s Np se reduce(n), por ejemplo, el acceso a factores de transcripción. Por ejemplo, la metilación de estos SNP reduciría la unión de factores de transcripción, lo que conduce a una reducción del ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

En otra realización, la deleción comprende uno o más de los fragmentos enumerados en la Tabla 7. En otra realización, la deleción consiste esencialmente en uno o más de los fragmentos enumerados en la Tabla 7. En otra realización, la deleción consiste en uno o más de los fragmentos enumerados en la Tabla 7. En otra realización, la deleción es de 60,716,189 a 60,728,612, de 60,716,189 a 60,723,870, de 60,722,992 a 60,728,612, de 60,717,236 a 60,719,036, de 60,722,006 a 60,723,058, de 60,724,917 a 60,726,282, de 60,616,396 a 60,618,032, de 60,623,536 a 60,624,989, de 60,626,565 a 60,628,177, de 60,717,236 a 60,719,036, de 60,721,212 a 60,722,958, de 60,724,780 a 60,726,471, de 60,739,075 a 60,740,154, de 60,748,003 a 60,749,009, de 60,826,438 a 60,827,601, o de 60,831,589 a 60,833,556.

En otra realización, la modificación epigenética comprende o afecta uno o más de los fragmentos enumerados en la Tabla 7. Como se usa en la presente descripción, la expresión "afecta uno o más de los fragmentos enumerados en la Tabla 7" significa que la(s) función(ones) natural(es) de estos fragmentos se reduce, por ejemplo, el acceso a factores de transcripción. Por ejemplo, la metilación de estos fragmentos reduciría la unión de factores de transcripción, lo que conduce a una reducción del ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

En otra realización, la modificación epigenética es de 60,716,189 a 60,728.612, de 60,716,189 a 60,723.870, de 60,722,992 a 60,728,612, de 60,717,236 a 60,719,036, de 60,722,006 a 60,723,058, de 60,724,917 a 60,726,282, de 60,616,396 a 60,.618,032, de 60,623,536 a 60,624,989, de 60,626,565 a 60,628,177, de 60,717,236 a 60,719,036, de 60,721,212 a 60,722,958, de 60,724,780 a 60,726,471, de 60,739,075 a 60,740,154, de 60,748,003 a 60,749,009, de 60,826,438 a 60,827,601, o de 60,831,589 a 60,833,556.

En otra realización, la deleción elimina toda la región entre la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 o elimina una porción de la región lo que da como resultado la interrupción de uno o más sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS). Como se usa en la presente descripción, el término "interrupción" se refiere a una disminución en la transcripción eritroide de BCL11A en una célula que comprende una interrupción de uno o más sitios hipersensibles a DNAsa-1 en al menos 10 % (por ejemplo, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o incluso 100 % (es decir, transcripción eritroide no detectable)) en comparación con una célula que no tiene una interrupción de este tipo. En una realización, la interrupción comprende una incapacidad de un sitio hipersensible a DNAsa-1 modificado de unirse a sus factores de transcripción nativos (por ejemplo, GATA1 y TAL1).

En otra realización, la modificación epigenética que interfiere con el establecimiento y/o mantenimiento de la firma epigenética en la región potenciadora en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) conduce de este modo a una reducción del ARNm o la expresión proteica de BCL11A, y aumenta la expresión de hemoglobina fetal en el mamífero.

En una realización, la modificación epigenética que interfiere con el establecimiento y/o mantenimiento de la firma epigenética en la región potenciadora en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) incluye pero no se limita a modificaciones epigenéticas que afectan la sensibilidad a DNAsa I, modificaciones epigenéticas que afectan las modificaciones a las histonas, modificaciones epigenéticas que afectan la unión a GATA1/TAL1, y modificaciones epigenéticas que afectan la interacción promotora de largo alcance del promotor de BCL11A.

Por ejemplo, una modificación epigenética que interfiere con el establecimiento y/o mantenimiento de la firma epigenética en la región potenciadora en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 incluye pero no se limita a al menos una deleción dentro de la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 de modo que la función global de esta región se afecta de manera que el ARNm y la expresión de BCL11A se reduce o disminuye. Por ejemplo, la deleción es en las regiones de sensibilidad a DNAsaI en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, por ejemplo, 62, 58, y 55. La deleción podría ser en 62 o 58 o 55 o sus combinaciones. Por ejemplo, en 62 y 58, 58 y 55, 62 y 55, o en los tres 62, 58, y 55.

Como otro ejemplo, una modificación epigenética que interfiere con el establecimiento y/o mantenimiento de la firma epigenética en la región potenciadora en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 incluye pero no se limita a cambios en las modificaciones a las histonas en el cromosoma 2 que no están en la ubicación 60,716,189­ 60,728.612, o cambios en las modificaciones a las histonas en el cromosoma 2 en la ubicación 60,716,189-60,728.612, o tanto modificaciones a las histonas en el cromosoma 2 que no están en la ubicación 60,716,189-60,728,612 así como en la ubicación 60,716,189-60,728,612 de modo que la función global de esta región se afecta de manera que el ARNm y la expresión de BCL11A se reduce o disminuye.

En otra realización, una modificación epigenética que interfiere con el establecimiento y/o mantenimiento de la firma epigenética en la región potenciadora en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 incluye pero no se limita a una inserción de al menos una secuencia específica de represor modificada genéticamente que cambia las características epigenéticas de los elementos no codificantes en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 y por lo tanto da como resultado la represión de la expresión del gen diana. Lo primero se centra específicamente en reprimir epigenéticamente potenciadores individuales. En otras palabras, la inserción de secuencias específicas de represor modificadas genéticamente en el cromosoma 2 podría posiblemente interferir con la modificación epigenética en el potenciador eritroide de BCL11A lo que eventualmente conduce a una reducción de la expresión del gen de BCL11A.

Cualquiera de los métodos conocidos en la técnica puede usarse para producir la modificación epigenética contemplada. Por ejemplo, como se describe en Mendenhall E. M. y otros, Nat. Biotechnol. 08 de septiembre de 2013, y Maeder ML y otros, Nat Biotechnol. 09 de octubre de 20132013.

En una realización, la inserción de al menos una secuencia específica de represor modificada genéticamente en cualquier ubicación del cromosoma 2 da como resultado pero no se limita a la reducción de regiones de sensibilidad a DNAsaI en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, por ejemplo, 62, 58, y 55; el aumento de las modificaciones a las histonas en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2; la reducción de la unión de factores de transcripción al GATA1/TAL1 de la región potenciadora en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2; y reducción o debilitamiento de la interacción entre la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 con el promotor de BCL11A.

En una realización, el efecto global de la inserción de al menos una secuencia específica de represor modificada genéticamente en cualquier ubicación del cromosoma 2 es la reducción o disminución del ARNm y la expresión de BCL11A.

En algunas realizaciones, como se usa en el contexto del ARNm y la expresión de BCL11A, la interacción entre la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 o potenciador de BCL11A con el promotor de BCL11A, y factores de transcripción que se unen al GATA1/TAL1 de la región potenciadora, el término "reducción" o "disminución" se refiere a al menos 5 % menor al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o más en comparación con la situación de control que es la ausencia de la modificación epigenética o de la inserción de las secuencias modificadas genéticamente descritas en la presente descripción. Por disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A en la célula se entiende que la expresión proteica es al menos 5 % menor es al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o más en comparación con una célula de control que no tiene la modificación epigenética o la inserción de las secuencias modificadas genéticamente descritas en la presente descripción.

En una realización, la inserción de al menos una secuencia específica de represor modificada genéticamente se produce dentro de las regiones de sensibilidad a DNAsaI de la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, por ejemplo, 62, 58, y 55. La inserción podría ser en el extremo 5' de 62 o 58 o 55 o en el extremo 3' de 62 o 58 o 55, o entre 62 y 58, o entre 58 y 55, o entre 55 y 62.

En una realización, la inserción de al menos una secuencia específica de represor modificada genéticamente cambia las regiones de sensibilidad a DNAsaI de la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

En una realización, las modificaciones epigenéticas cambian las regiones de sensibilidad a DNAsaI de la ubicación 60.716.189- 60,728,612 del cromosoma 2.

En una realización, las modificaciones epigenéticas cambian las modificaciones a las histonas en la ubicación 60.716.189- 60,728,612 del cromosoma 2.

En una realización, la inserción de al menos una secuencia específica de represor modificada genéticamente cambia las modificaciones a las histonas en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

En una realización, las modificaciones epigenéticas cambian la unión a GATA1/TAL1 de la región potenciadora en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 de modo que la función global de esta región se afecta de manera que el ARNm y la expresión de BCL11A se reduce o disminuye. Por ejemplo, la unión de factores de transcripción al GATA1/TAL1.

En una realización, la inserción de al menos una secuencia específica de represor modificada genéticamente se produce dentro del GATA1/TAL1 como se describe en la presente descripción. La inserción puede ser en el extremo 5' o el extremo 3' de GATA1 o TAL1. La inserción puede ser entre GATA1 y TAL1. La inserción cambia la unión a GATA1/TAL1 de la región potenciadora en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 de modo que la función global de esta región se afecta de manera que el ARNm y la expresión de BCL11A se reduce o disminuye. Por ejemplo, la unión de factores de transcripción al GATA1/TAL1.

En una realización, la modificación epigenética cambia la interacción entre el potenciador de BCL11A y el promotor de BCL11A. En una realización, la interacción se reduce o se debilita de modo que la función global de esta región se afecta de manera que el ARNm y la expresión de BCL11A se reduce o disminuye.

En una realización, las modificaciones epigenéticas cambian la interacción entre la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 con el promotor de BCL11A. En una realización, la interacción se reduce o se debilita de modo que la función global de esta región se afecta de manera que el ARNm y la expresión de BCL11A se reduce o disminuye.

En la presente descripción se proporciona además una célula humana modificada genéticamente aislada que tiene al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) producida mediante el proceso de poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta.

En una realización, la célula humana modificada genéticamente aislada tiene al menos una modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en el cromosoma 2. En otra realización, la célula humana modificada genéticamente aislada tiene al menos una modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189­ 60,728,612 del cromosoma 2.

En algunas realizaciones de cualquiera de estas células humanas modificadas genéticamente aisladas que tienen al menos una modificación epigenética, las células se trasplantan en un mamífero para el uso en el aumento de la hemoglobina fetal en el mamífero.

En una realización, la célula humana modificada genéticamente aislada que tiene al menos una modificación genética en el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 se trasplanta en un mamífero para el uso en el aumento de la hemoglobina fetal en el mamífero.

En una realización, la célula humana modificada genéticamente aislada que tiene al menos una modificación genética en el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 se almacena para su uso posterior mediante crioconservación.

En algunas realizaciones de cualquiera de esas células humanas aisladas modificadas genéticamente que tienen al menos una modificación epigenética, las células se almacenan para su uso posterior mediante criopreservación.

En una realización, la célula humana aislada modificada genéticamente que tiene al menos una modificación genética en el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 se criopreserva, descongela y trasplanta a un mamífero para su uso en el aumento de la hemoglobina fetal en el mamífero.

En una realización, la célula humana modificada genéticamente aislada que tiene al menos una modificación genética en el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 se crioconserva,

Otra realización proporcionada en la presente descripción se refiere a una composición que comprende células humanas modificadas genéticamente aisladas, en donde las células tienen al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) producida mediante el proceso de poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificación genética en esta.

Otra realización proporcionada en la presente descripción se refiere a una composición que comprende células humanas modificadas genéticamente aisladas, en donde las células tienen al menos una modificación epigenética en el cromosoma 2. En una realización, al menos una modificación epigenética en el cromosoma 2 es en la ubicación 60,716,189-60,728,612 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC). En otra realización, al menos una modificación epigenética en el cromosoma 2 se produce mediante el proceso de poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN de manera que la enzima dirigida a ADN produce al menos una modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en el cromosoma 2 que afecta la ubicación 60,716,189-60,728,612 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC).

En una realización, la composición provoca un aumento en el ARNm o la expresión proteica de hemoglobina fetal en la célula en contacto.

En una realización, las células de cualquiera de las composiciones descritas son autólogas, para el mamífero que es el receptor de las células en un procedimiento de trasplante, es decir, las células de la composición se derivan o se cosechan del mamífero antes de cualquier modificación descrita.

En una realización, las células de cualquiera de las composiciones descritas no son autólogas para el mamífero que es el receptor de las células en un procedimiento de trasplante, es decir, las células de la composición no se derivan o se cosechan del mamífero antes de cualquier modificación descrita.

En una realización, las células de cualquiera de las composiciones descritas están en el tipo de HLA mínimo coincidente con el mamífero que es el receptor de las células en un procedimiento de trasplante.

En una realización, las células de cualquiera de las composiciones descritas son células progenitoras aisladas antes de cualquier modificación descrita.

En una realización, las células de cualquiera de las composiciones descritas son células progenitoras hematopoyéticas aisladas antes de cualquier modificación descrita.

En una realización, las células de cualquiera de las composiciones descritas son células madre pluripotentes inducidas aisladas antes de cualquier modificación descrita.

En otra realización, la deleción comprende uno o más de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripción en la sección de Ejemplos. En otra realización, la deleción consiste esencialmente en uno o más de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripción en la sección de Ejemplos. En otra realización, la deleción consiste en uno o más de los sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) 62, 58, y 55 como se describe en la presente descripción en la sección de Ejemplos. En una realización, como se usa en la presente descripción, el término "porción" en el contexto de deleción genómica es al menos 10 % a aproximadamente 100 % de la región especificada. En otras realizaciones, la porción eliminada es al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o incluso 100 % de la región especificada.

En otra realización, la deleción comprende uno o más de los marcadores SNP descritos en la Tabla 2. En otra realización, la deleción consiste esencialmente en uno o más de los marcadores SNP descritos en la Tabla 2. En otra realización, la deleción consiste en uno o más de los marcadores SNP descritos en la Tabla 2.

En otra realización, la deleción comprende uno o más de los fragmentos enumerados en la Tabla 7. En otra realización, la deleción consiste esencialmente en uno o más de los fragmentos enumerados en la Tabla 7. En otra realización, la deleción consiste en uno o más de los fragmentos enumerados en la Tabla 7. En otra realización, la deleción es de 60,716,189 a 60,728,612, de 60,716,189 a 60,723,870, de 60,722,992 a 60,728,612, de 60,717,236 a 60,719,036, de 60,722,006 a 60,723,058, de 60,724,917 a 60,726,282, de 60,616,396 a 60,618,032, de 60,623,536 a 60,624,989, de 60,626,565 a 60,628,177, de 60,717,236 a 60,719,036, de 60,721,212 a 60,722,958, de 60,724,780 a 60,726,471, de 60,739,075 a 60,740,154, de 60,748,003 a 60,749,009, de 60,826,438 a 60,827,601, o de 60,831,589 a 60,833,556.

En otra realización, la deleción elimina toda la región entre la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) o elimina una porción de la región lo que da como resultado la interrupción de uno o más sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS).

En una realización, el método comprende además seleccionar un mamífero que necesita un aumento de hemoglobina fetal.

En una realización, el mamífero se ha diagnosticado con una hemoglobinopatía.

En una realización, el mamífero que necesita un aumento de hemoglobina fetal se ha diagnosticado con una hemoglobinopatía.

En una realización, la hemoglobinopatía es una p-hemoglobinopatía.

En una realización, la hemoglobinopatía es la drepanocitosis.

En una realización, la hemoglobinopatía es p-talasemia.

En una realización, la célula en contacto, la célula humana, la célula progenitora hematopoyética o su progenie se administra al mamífero.

En una realización, esta divulgación proporciona un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende las etapas de proporcionar una población aislada de células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas del mamífero ex vivo, y poner en contacto la población de células progenitoras o madre hematopoyéticas con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto. En una realización adicional de este método, la población de células progenitoras o madre hematopoyéticas en contacto que tienen aumento de la expresión de hemoglobina fetal se crioconserva y se almacena o se reintroduce en el mamífero. En otra realización, la población de células progenitoras o madre hematopoyéticas crioconservadas que tienen aumento de la expresión de hemoglobina fetal se descongela y después se reintroduce en el mamífero. En una realización adicional de este método, el método comprende quimioterapia y/o terapia de radiación para eliminar o reducir las células progenitoras o madre hematopoyéticas endógenas en el mamífero. En cualquiera de las realizaciones del método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas pueden sustituirse con unas iPSC descritas en la presente descripción.

En una realización, esta divulgación proporciona un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende las etapas de aislar una población de células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas del mamífero, y poner en contacto ex vivo la población de células progenitoras o madre hematopoyéticas con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189­ 60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto. En una realización adicional de este método, la población de células progenitoras o madre hematopoyéticas en contacto ex vivo que tienen aumento de la expresión de hemoglobina fetal se crioconserva y se almacena o se reintroduce en el mamífero. En otra realización, la población de células progenitoras o madre hematopoyéticas crioconservadas que tienen aumento de la expresión de hemoglobina fetal se descongela y después se reintroduce en el mamífero. En una realización adicional de este método, el método comprende quimioterapia y/o terapia de radiación para eliminar o reducir las células progenitoras o madre hematopoyéticas endógenas en el mamífero. En cualquiera de las realizaciones del método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas pueden sustituirse con unas iPSC derivadas del mamífero. En cualquier realización del método, el método comprende además seleccionar un mamífero que necesita un aumento de la expresión de hemoglobina fetal.

En una realización, esta descripción proporciona un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende las etapas de aislar una población de células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas del mamífero y eliminar el ADN genómico de las células en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de la hemoglobina fetal aumenta en dicho mamífero, con relación a la expresión antes de dicho contacto. En una realización adicional de este método, la población de células progenitoras o madre hematopoyéticas con deleción de ADN genómico y que tienen aumento de la expresión de hemoglobina fetal se crioconserva y se almacena o se reintroduce en el mamífero. En otra realización, la población de células progenitoras o madre hematopoyéticas con deleción de ADN genómico y que tienen aumento de la expresión de hemoglobina fetal se descongela y después se reintroduce en el mamífero. En una realización adicional de este método, el método comprende quimioterapia y/o terapia de radiación para eliminar o reducir las células progenitoras o madre hematopoyéticas endógenas en el mamífero. En cualquiera de las realizaciones del método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas pueden sustituirse con unas iPSC descritas en la presente descripción. En cualquiera de las realizaciones del método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas o iPSC son análogas para el mamífero, lo que significa que las células se derivan del mismo mamífero. En otra de las realizaciones del método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas o iPSC no son análogas para el mamífero, lo que significa que las células no se derivan del mismo mamífero, sino de otro animal de la misma especie. Por ejemplo, el mamífero es un ser humano. En cualquier realización del método, el método comprende además seleccionar un mamífero que necesita un aumento de la expresión de hemoglobina fetal.

En una realización, esta divulgación proporciona un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero que lo necesita, el método comprende las etapas de aislar una población de células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas del mamífero y ex vivo eliminar el ADN genómico de las células en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de la hemoglobina fetal aumenta en dicho mamífero, con relación a la expresión antes de dicho contacto. En una realización adicional de este método, la población de células progenitoras o madre hematopoyéticas con deleción de ADN genómico y que tienen aumento de la expresión de hemoglobina fetal se crioconserva y se almacena o se reintroduce en el mamífero. En otra realización, la población de células progenitoras o madre hematopoyéticas crioconservadas que tienen aumento de la expresión de hemoglobina fetal se descongela y después se reintroduce en el mamífero. En una realización adicional de este método, el método comprende quimioterapia y/o terapia de radiación para eliminar o reducir las células progenitoras o madre hematopoyéticas endógenas en el mamífero. En cualquiera de las realizaciones del método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas pueden sustituirse con unas iPSC derivadas del mamífero. En cualquier realización del método, el método comprende además seleccionar un mamífero que necesita un aumento de la expresión de hemoglobina fetal.

En una realización de cualquier método descrito, el método comprende además seleccionar un mamífero que necesita un aumento de la expresión de hemoglobina fetal. Un mamífero ilustrativo que necesita un aumento de la expresión de hemoglobina fetal es uno que se ha diagnosticado con una hemoglobinopatía.

En una realización, esta divulgación proporciona un método de tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero que comprende las etapas de:(a) proporcionar células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas o iPSC; (b) poner en contacto las células ex vivo o in vitro con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de la hemoglobina fetal aumenta en dicho mamífero, con relación a la expresión antes de dicho contacto; y (c) administrar las de la etapa (b) en el mamífero.

En una realización de cualquier método, las células después de la etapa (b) pueden crioconservarse hasta que sean necesarias para la administración en el mamífero. En una realización adicional de este método, el método comprende quimioterapia y/o terapia de radiación para eliminar o reducir las células progenitoras o madre hematopoyéticas endógenas en el mamífero. En cualquiera de las realizaciones del método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas o iPSC son autólogas para el mamífero, lo que significa que las células se derivan del mismo mamífero. En otra de las realizaciones del método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas o iPSC no son autólogas para el mamífero, lo que significa que las células no se derivan del mismo mamífero, sino de otro animal de la misma especie. Por ejemplo, el mamífero es un ser humano.

En una realización de cualquier método descrito, el método comprende además seleccionar un mamífero que necesita tratamiento de una hemoglobinopatía.

En una realización, esta descripción proporciona un método de tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero que comprende las etapas de:(a) aislar células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas del mamífero;(b) poner en contacto las células ex vivo o in vitro con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes de dicho contacto; y (c) administrar las de la etapa (b) en el mamífero.

En una realización, las células después de la etapa (b) pueden crioconservarse hasta que sean necesarias para la administración en el mamífero. En cualquier realización del método, el método comprende además seleccionar un mamífero que necesita tratamiento de una hemoglobinopatía.

En una realización, esta descripción proporciona un método de tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero que comprende las etapas de: (a) proporcionar células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas o iPSC; (b) ex vivo eliminar el ADN genómico de las células en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de la hemoglobina fetal aumenta en dicho mamífero, con relación a la expresión antes de dicho contacto; y (c) administrar las células de la etapa (b) en el mamífero.

En una realización, las células después de la etapa (b) pueden crioconservarse hasta que sean necesarias para la administración en el mamífero. En una realización adicional de este método, el método comprende quimioterapia y/o terapia de radiación para eliminar o reducir las células progenitoras o madre hematopoyéticas endógenas en el mamífero. En cualquiera de las realizaciones del método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas o iPSC son análogas para el mamífero, lo que significa que las células se derivan del mismo mamífero. En otra de las realizaciones del método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas o iPSC no son análogas para el mamífero, lo que significa que las células no se derivan del mismo mamífero, sino de otro animal de la misma especie. Por ejemplo, el mamífero es un ser humano. En cualquier realización del método, el método comprende además seleccionar un mamífero que necesita tratamiento de una hemoglobinopatía.

En una realización, esta divulgación proporciona un método de tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero que comprende las etapas de: (a) aislar células progenitoras hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas del mamífero; (b) ex vivo eliminar el ADN genómico de las células en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes de dicho contacto; y (c) administrar las de la etapa (b) en el mamífero.

En una realización, las células después de la etapa (b) pueden crioconservarse hasta que sean necesarias para la administración en el mamífero. En una realización adicional de este método, el método comprende quimioterapia y/o terapia de radiación para eliminar o reducir las células progenitoras o madre hematopoyéticas endógenas en el mamífero. En cualquier realización del método, el método comprende además seleccionar un mamífero que necesita tratamiento de una hemoglobinopatía.

En una realización, esta descripción proporciona un método de tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero (por ejemplo un ser humano) que comprende introducir una composición descrita en la presente descripción que comprende células modificadas genéticamente aisladas que tienen al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 de manera que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero. En una realización adicional de este método, el método comprende quimioterapia y/o terapia de radiación para eliminar o reducir las células progenitoras o madre hematopoyéticas endógenas en el mamífero. En cualquier realización del método, el método comprende además seleccionar un mamífero que necesita tratamiento de una hemoglobinopatía.

En una realización, esta descripción proporciona un método de tratamiento de una hemoglobinopatía en un mamífero (por ejemplo un ser humano) que comprende aumentar la expresión de hemoglobina fetal en el mamífero mediante el método descrito en la presente descripción.

En cualquier realización de cualquier método de tratamiento descrito, la hemoglobinopatía es una p-hemoglobinopatía.

En cualquier realización de cualquier método de tratamiento descrito, la hemoglobinopatía es p-talasemia.

En cualquier realización de cualquier método de tratamiento descrito, la hemoglobinopatía es anemia drepanocítica.

En una de las realizaciones de cualquier método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas o iPSC son autólogas para el mamífero, lo que significa que las células se derivan del mismo mamífero. En otra de las realizaciones de cualquier método descrito, las células progenitoras o madre hematopoyéticas o iPSC no son autólogas para el mamífero, lo que significa que las células no se derivan del mismo mamífero, sino de otro animal de la misma especie. Por ejemplo, el mamífero es un ser humano.

En una de las realizaciones de cualquier método descrito, el contacto de cualquier célula descrita en la presente descripción puede ser ex vivo o in vitro o in vivo.

En otra realización de cualquier método descrito, el contacto de cualquier célula descrita en la presente descripción comprende el contacto con un agente que se une al ADN genómico de la célula en el cromosoma 2 y produce una modificación epigenética en el genoma de la célula en el cromosoma 2, para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A. En una realización, la modificación epigenética es en la ubicación 60,716,189­ 60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC).

En otra realización de cualquier método descrito, el contacto de cualquier célula descrita en la presente descripción comprende el contacto con un agente que se une al ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC), y produce una modificación epigenética en el cromosoma 2, para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

En otra realización de cualquier método descrito, el contacto de cualquier célula descrita en la presente descripción comprende el contacto con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN de manera que la enzima dirigida a ADN produce una modificación epigenética en el cromosoma 2, para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

En otra realización de cualquier método descrito, el contacto de cualquier célula descrita en la presente descripción comprende el contacto con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN de manera que la enzima dirigida a ADN produce una modificación epigenética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) para reducir de este modo el ARNm o la expresión proteica de BCL11A. En una realización, la expresión de hemoglobina fetal aumenta en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto.

En otra realización de cualquier método descrito, la célula progenitora hematopoyética, la célula humana aislada, o la célula aislada se pone en contacto ex vivo o in vitro.

En otra realización de cualquier método descrito, al menos una modificación genética es una deleción. En otra realización, al menos una modificación epigenética es una deleción.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de un agente que se une al ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en el mamífero o para reducir el ARNm o la expresión de BCL11A, en donde el ARNm o la expresión proteica de BCL11A se reduce.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en el mamífero o para reducir el ARNm o la expresión de BCL11A, en donde la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en el mamífero o para reducir el ARNm o la expresión de BCL11A, en donde la enzima dirigida a ADN produce al menos una modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en el cromosoma 2, para afectar de este modo el ARNm o la expresión de BCL11A. En una realización, al menos una modificación epigenética es en la ubicación 60,716,189­ 60,728.612. En otra realización, el efecto de la una modificación epigenética es reducir el ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de cualquiera de las células aisladas descritas en la presente descripción para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en el mamífero.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de una composición que comprende células humanas modificadas genéticamente aisladas para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en el mamífero, en donde las células tienen al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) producida mediante el proceso de poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC) lo que provoca al menos una modificación genética en esta.

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de una composición que comprende células humanas modificadas genéticamente aisladas para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en el mamífero, en donde las células tienen al menos una modificación epigenética en el cromosoma 2. En una realización, al menos una modificación epigenética en el cromosoma 2 es en la ubicación 60,716,189-60,728,612 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC). En otra realización, al menos una modificación epigenética en el cromosoma 2 se produce mediante el proceso de poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una enzima dirigida a ADN o un vector que porta la secuencia codificante de una enzima dirigida a ADN de manera que la enzima dirigida a ADN produce al menos una modificación epigenética en el ADN genómico de la célula en el cromosoma 2 que afecta la ubicación 60,716,189-60,728,612 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC).

En una realización, en la presente descripción se proporciona un uso de cualquiera de las células aisladas descritas en la presente descripción o cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción para la fabricación de un medicamento para aumentar la hemoglobina fetal en un mamífero o para el tratamiento de una hemoglobinopatía en el mamífero.

En una realización de uso de la composición descrita en la presente descripción, la composición provoca un aumento del ARNm o la expresión proteica de hemoglobina fetal en la célula en contacto.

En una realización de uso de la composición descrita en la presente descripción, las células de cualquiera de las composiciones descritas son autólogas, para el mamífero que es el receptor de las células en un procedimiento de trasplante, es decir, las células de la composición se derivan o se cosechan del mamífero antes de cualquier modificación descrita.

En una realización de uso de la composición descrita en la presente descripción, las células de cualquiera de las composiciones descritas no son autólogas para el mamífero que es el receptor de las células en un procedimiento de trasplante, es decir, las células de la composición no se derivan o se cosechan del mamífero antes de cualquier modificación descrita.

En una realización de uso de la composición descrita en la presente descripción, las células de cualquiera de las composiciones descritas están en el tipo de HLA mínimo coincidente con el mamífero que es el receptor de las células en un procedimiento de trasplante.

En una realización de uso de la composición descrita en la presente descripción, las células de cualquiera de las composiciones descritas son células progenitoras aisladas antes de cualquier modificación descrita.

En una realización de uso de la composición descrita en la presente descripción, las células de cualquiera de las composiciones descritas son células progenitoras hematopoyéticas aisladas antes de cualquier modificación descrita.

En una realización de uso de la composición descrita en la presente descripción, las células de cualquiera de las composiciones descritas son células madre pluripotentes inducidas aisladas antes de cualquier modificación descrita.

En una realización de uso de la composición descrita en la presente descripción, las células de cualquiera de las composiciones descritas se crioconservan antes del uso.

Se conoce que existen variaciones asociadas a HbF en BCL11A. Se han realizado seis GWAS del nivel de HbF (o el rasgo altamente correlacionado número de células F) en individuos de ascendencia europea, africana y asiática, cada uno identifica variantes asociadas al rasgo dentro de BCL11A (7-12). Las mismas variantes se asocian con la gravedad clínica de SCD y p-talasemia (9, 10, 50), consistente con HbF como modificador principal de estos trastornos. Se estima que la variación en BCL11A explica ~15 % de la variación del rasgo en el nivel de HbF (7, 12, 43). Se han identificado cuatro SNP diferentes como los más altamente asociados con el rasgo (rs1427407 (7), rs11886868 (8), rs4671393 (9) y rs766432 (10-12)); estos SNP centinelas se agrupan dentro de 3 kb entre sí en el intrón 2 de BCL11A (Figuras 2A y 11B). Los haplotipos que incluyen los SNP centinelas parecen explicar mejor la asociación con HbF que cualquier SNP individual (12, 43). Cincuenta SNP en el locus de BCL11A y veintisiete SNP dentro del intrón 2 se han asociado con el nivel de HbF con significación en el genoma completo (P < 5 x10'8). A pesar de los esfuerzos de resecuenciación a gran escala, las variantes codificantes de BCL11A no se han descrito (43).

Previamente, los inventores usaron la CSSCD para el mapeo fino de la señal de asociación con HbF en el locus de BCL11A e informaron una fuerte asociación con rs4671393 (43). En ese estudio, se imputó rs1427407. Dos SNP adicionales, rs766432 y rs11886868 también se han identificado en estudios previos como SNP centinelas más altamente asociados al rasgo (8, 10, 11, 51). En un subconjunto de individuos (n = 728) cuyos genotipos en los cuatro SNP centinelas estaban disponibles, el resultado de asociación no fue significativo en rs4671393, rs766432 o rs11886868 después del condicionamiento en los genotipos en rs1427407; por el contrario, la asociación se mantuvo altamente significativa para rs1427407 tras el condicionamiento en rs4671393, rs766432 o rs11886868 (Tabla 4). Por lo tanto, rs1427407 es el SNP más altamente asociado con el nivel de HbF dentro de los DHS eritroides y explica mejor la asociación al rasgo que otros SNP centinelas descritos previamente.

El análisis condicional demostró asociaciones que se mantuvieron significativas después del condicionamiento en rs1427407. La asociación residual más significativa fue para rs7606173 en DHS 55 (P = 9,66 x 10'11); rs7599488 en DHS 62, que se había informado previamente (43), fue solo ligeramente menos significativa (P = 2,43 x 10'10) (Tabla 1). El análisis de variantes de secuencia de ADN raras dentro de los tres DHS no produjo señales asociadas a HbF independientes adicionales (Tabla 5).

Los inventores han encontrado que la unión de factores de transcripción (TF) específica de alelo interviene en la expresión de BCL11A. Se realizaron estudios bioquímicos específicos de alelo con el uso de heterocigóticos informativos para controlar las diferencias de acción en trans entre muestras y para garantizar la misma abundancia equitativa de ambos alelos, sustentado por la misma representación de alelos en ADNg pareado (Figuras 2B y 2C). rs1427407 se encuentra directamente en el centro de un pico de unión a GATA1 y TAL1 en el DHS 62 (Figura 2B). En los ensayos ChIP realizados, la cromatina se sometió a ultrasonido hasta fragmentos de aproximadamente 500 pb. Las cinco muestras de precursores eritroides humanos primarios heterocigóticos para rs1427407 usados para el ChIP-qPCR se secuenciaron por Sanger en los DHS eritroides. El único SNP heterocigótico adicional dentro de 500 pb de rs1427407 en cualquiera de estas muestras fue rs7599488 (304 pb 3' de rs1427407) que era heterocigótico en solo dos de las cinco muestras. Este SNP no cae dentro de los motivos de unión a GATA1 o TAL1. Por lo tanto parece poco probable que otro SNP dentro del DHS 62 pudiera explicar la unión a TF específica de alelo observada.

Además, los inventores han encontrado que existe una asociación entre la expresión de BCL11A y el nivel de HbF. Los estudios de los inventores proporcionan un estimado del cambio en la expresión de BCL11A que puede dar como resultado un aumento clínicamente significativo en el nivel de HbF. Entre un conjunto limitado de líneas de células linfoblastoides humanas se informó previamente la correlación del alelo A de rs4671393 asociado a HbF alta con la reducción de la expresión de BCL11A (13). La extensión de estos experimentos a una colección más grande de líneas genotipadas no confirmó esta observación. Por tanto, los inventores han encontrado que el haplotipo rs1427407-rs7606173 asociado a HbF influye en la expresión de BCL11A en un contexto eritroide específico, una posibilidad consistente con los hallazgos de sensibilidad a DNAsa I. La expresión del ARNm de BCL11A en precursores eritroides primarios difirió en 1,7 veces entre los haplotipos rs1427407-rs7606173 T-G de HbF alta y G-C de HbF baja (Figura 3B); de la misma manera, los niveles medios de HbF fueron 10,6 % y 3,1 % en homocigóticos T-G y G-C, respectivamente (Figura 3C). Cabe señalar que, los resultados que demuestran la expresión de BCL11A específica de alelo en células eritroides humanas primarias se observaron en células heterocigóticas para el haplotipo rs1427407-rs7606173, y por lo tanto los efectos modestos sobre la expresión de BCL11A reflejan los efectos combinados de todos los SNP funcionales dentro del haplotipo. Si bien la herencia de un haplotipo de BCL11A protector es clínicamente beneficiosa sobre una base poblacional (9, 10, 50), el nivel promedio de HbF en homocigóticos T-G se mantiene por debajo del requerido para prevenir la morbilidad de SCD. La sensibilidad del nivel de HbF a la expresión de BCL11A, sin embargo, predice que el alivio de la gravedad de la enfermedad pudiera requerir solamente una reducción adicional modesta en la expresión de BCL11A.

Los inventores investigaron además la regulación por el desarrollo de los genes de globinas y BCL11A. Durante el desarrollo humano, la £-globina derivada del saco vitelino se sustituye en el primer trimestre por la Y-globina derivada del hígado fetal. Después del nacimiento, a medida que la eritropoyesis se transfiere del hígado a la médula ósea, la Y-globina se silencia gradualmente y la p-globina predomina. Solo se produce un único cambio en la expresión génica de globinas en la ontogenia del ratón. Durante esta transición, que se produce a la mitad de la gestación, los eritrocitos primitivos circulantes derivados del saco vitelino expresan las globinas £y y pH1 de la etapa embrionaria, mientras que los eritroblastos definitivos del hígado fetal expresan las globinas p1 y p2 de la etapa adulta. En concordancia con este cambio en el desarrollo, BCL11A se expresa en el linaje eritroide definitivo pero no en el de la etapa primitiva y se requiere para el cambio en la expresión génica de globinas (16, 52).

En las líneas reporteras transgénicas estables para BCL11A 52,0-64,4 a 10,5 dpc, la expresión de lacZ se observó solamente en el primordio del hígado fetal y no en la sangre circulante dentro del embrión, la placenta o el saco vitelino (Figura 6A). Estos resultados, acoplados con el hallazgo de la expresión de lacZ en los eritroblastos definitivos del hígado fetal a 12,5 dpc pero no en los eritrocitos circulantes primitivos derivados del saco vitelino (Figura 4B), demuestran que las secuencias potenciadoras compuestas de BCL11A dirigen la expresión en un patrón específico del desarrollo en concordancia con el cambio de genes de globinas endógenos.

Una serie de mutantes de deleción se generó para refinar los elementos mínimos requeridos para la actividad del potenciador eritroide. Las secuencias que contienen el DHS central 58 fueron suficientes para la actividad del potenciador eritroide. Aquellas secuencias que contienen solamente los elementos que flanquean 62 o 55 no fueron capaces de dirigir la expresión génica eritroide (Figura 6B). Para probar la capacidad de los DHS de aumentar la expresión génica en precursores eritroides humanos primarios, se usó el suministro lentiviral de un sistema reportero de GFP como se describió previamente (39). De manera similar, el DHS 58 aumentó la expresión génica en este ensayo reportero (Figura 7).

Los inventores decidieron generar líneas celulares con una deleción del potenciador de Bcl11a para investigar la necesidad del potenciador para la expresión de BCL11A. Se generaron células eritroides estables con interrupción del potenciador. Dado que no existen líneas celulares eritroides humanas de la etapa adulta adecuadas, y como prueba de principio, los inventores volvieron al sistema murino. Las células de eritroleucemia de ratón (MEL) dependen de BCL11A para un patrón de la etapa adulta de la expresión génica de globinas (14). Los inventores identificaron un potenciador compuesto eritroide ortólogo en el intrón 2 de Bcl11a de ratón. Al igual que el potenciador del intrón 2 de BCL11A humano marcado por GWAS, estas secuencias poseían una serie de DHS eritroide específicos. Además, estas secuencias estaban decoradas por H3K4me1 y H3K27ac, carecían de H3K4me3 y H3K27me3, y estaban ocupadas por GATA1 y TAL1 en la cromatina eritroide de ratón (Figura 8). Se ha demostrado que los elementos reguladores compuestos que incluyen una serie de DHS adyacentes son críticos para la expresión génica en numerosos loci, que incluyen entre otros la región de control del locus de p-globina, secuencias conservadas de aglobinas de múltiples especies, y la región reguladora de IgH (53-55). Se observaron características únicas específicas de la especie del potenciador compuesto. Por ejemplo, los inventores identificaron las secuencias de ratón conservadas para cada uno de los tres DHS 62, 58 y 55 humanos, y encontraron hipersensibilidad a DNasa I eritroide en las secuencias conservadas 62 y 55, sin embargo las secuencias conservadas 58 carecían de hipersensibilidad a DNAsa I.

Los análisis de PCR y transferencia Southern verificaron la escisión del segmento intrónico 50,4-60,4 kb de Bcl11a en tres clones de MEL únicos y dos clones de linfocitos pro-B únicos (Figura 9). Los puntos de ruptura secuenciados por Sanger eran característicos de la escisión mediada por TALEN con posterior reparación por NHEJ (Figura 10). Tras la deleción del segmento intrónico, se observó una reducción drástica en el transcrito de BCL11A en los clones de células MEL por RT-qPCR, con el uso de pares de cebadores que detectan las uniones de exones corriente arriba, que abarcan o corriente abajo de la deleción (Figura 5A).

Definiciones

Para conveniencia, ciertos términos empleados en toda la solicitud (que incluye la especificación, los ejemplos, y las reivindicaciones adjuntas) se recogen aquí. A menos que se especifique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que el conocido comúnmente por aquellos con experiencia en la técnica a la que pertenece esta invención.

Como se usa en la presente descripción, la expresión "agente que se une al ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2" se refiere a moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, proteínas, péptidos u oligonucleótidos que pueden unirse a la ubicación dentro del ADN genómico (por ejemplo, la ubicación 60,716,189­ 60,728,612 del cromosoma 2) y reprimen el ARNm o la expresión proteica de BCL11A en una célula en al menos 20 % en comparación con el nivel de ARNm o proteína de BCL11A en una célula no tratada con un agente de este tipo. En una realización, el agente "interfiere con las interacciones de BCL11A con parejas de unión de BCL11A," como se usa esa expresión en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término "molécula pequeña" se refiere a un agente químico que incluye, pero no se limita a, péptidos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos, aptámeros, nucleótidos, análogos de nucleótidos, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, que incluyen compuestos heteroorgánicos y organometálicos) que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 10.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 5.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 1.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 500 gramos por mol, y sales, ésteres, y otras formas farmacéuticamente aceptables de tales compuestos.

Un "ácido nucleico", como se describe en la presente descripción, puede ser ARN o ADN, y puede ser monocatenario o bicatenario, y puede seleccionarse, por ejemplo, de un grupo que incluye: ácido nucleico que codifica una proteína de interés, oligonucleótidos, análogos de ácidos nucleicos, por ejemplo ácido peptidonucleico (PNA), PNA pseudocomplementarios (pc-PNA), ácido nucleico bloqueado (LNA) etcétera. Tales secuencias de ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, secuencia de ácido nucleico que codifica proteínas, por ejemplo que actúan como represores transcripcionales, moléculas antisentido, ribozimas, secuencias de ácidos nucleicos inhibidoras pequeñas, por ejemplo pero no se limitan a ARNi, ARNihp, ARNip, microARNi (miARN), oligonucleótidos antisentido etcétera.

Por "interfiere con las interacciones de BCL11A con parejas de unión de BCL11A" se entiende que la cantidad de interacción de BCL11A con la pareja de unión de BCL11A es al menos 5 % menor en poblaciones tratadas con un inhibidor de BCL11A, que en una población de control, comparable, en donde no está presente el inhibidor de BCL11A. Se prefiere que la cantidad de interacción de BCL11A con la pareja de unión de BCL11A en una población tratada con inhibidor de BCL11A sea al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o más que en una población tratada de control comparable en la que no se añade inhibidor de BCL11A. Como mínimo, la interacción de BCL11A puede ensayarse mediante la determinación de la cantidad de BCL11A que se une a la pareja de unión de BCL11A con el uso de técnicas estándares en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, espectrometría de masas, inmunoprecipitación, o ensayos de filtración en gel. Alternativamente, o además, la actividad de BCL11A puede ensayarse mediante la medición de la expresión de hemoglobina fetal a nivel del ARNm o la proteína después del tratamiento con un inhibidor de BCL11A candidato.

En una realización, la actividad de BCL11A es la interacción de BCL11A con sus parejas de unión: GATA-1, FOG-1, componentes del complejo NuRD, matrin-3, MTA2 y RBBP7. Por consiguiente, cualquier anticuerpo o fragmento de este, molécula pequeña, sustancia química o compuesto que pueda bloquear esta interacción se considera un inhibidor de la actividad de BCL11A.

Como se usa en la presente descripción, el término "célula modificada genéticamente" se refiere a una célula que comprende al menos una modificación genética, como se usa ese término en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término "modificación genética" se refiere a una interrupción a nivel genómico que da como resultado una disminución en la expresión o la actividad de BCL11A en una célula. Las modificaciones genéticas ilustrativas pueden incluir deleciones, mutaciones de desplazamiento del marco de lectura, mutaciones puntuales, eliminación de exones, eliminación de uno o más sitios hipersensibles a DNAsa 1 (DHS) (por ejemplo, 2, 3, 4 o más regiones DHS), etcétera.

Por "inhibe la expresión de BCL11A" se entiende que la cantidad de expresión de BCL11A es al menos 5 % menor en una célula o población de células tratada con una endonucleasa dirigida a ADN, que en una célula o población de células de control, comparable, en donde no está presente la endonucleasa dirigida a ADN. Se prefiere que el porcentaje de expresión de BCL11A en una población tratada sea al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o más que en una población tratada de control comparable en la que no se añade endonucleasa dirigida a ADN.

Por "inhibe la actividad de BCL11A" se entiende que la cantidad de actividad funcional de BCL11A es al menos 5 % menor en una célula o población de células tratada con los métodos descritos en la presente descripción, que en una célula o población de control, comparable, en donde no está presente la endonucleasa dirigida a ADN. Se prefiere que el porcentaje de actividad de BCL11A en una población tratada con inhibidor de BCL11A sea al menos 10 % menor, al menos 20 % menor, al menos 30 % menor, al menos 40 % menor, al menos 50 % menor, al menos 60 % menor, al menos 70 % menor, al menos 80 % menor, al menos 90 % menor, al menos 1 vez menor, al menos 2 veces menor, al menos 5 veces menor, al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menor, al menos 1.000 veces menor, o más que en una población tratada de control comparable en la que no se añade endonucleasa dirigida a ADN. Como mínimo, la actividad de BCL11A puede ensayarse mediante la determinación de la cantidad de expresión de BCL11A a los niveles de proteína o ARNm, con el uso de técnicas estándares en la técnica. Alternativamente, o además, la actividad de BCL11A puede determinarse con el uso de un constructo reportero, en donde el constructo reportero es sensible a la actividad de BCL11A. La secuencia del locus de Y-globina es reconocible por el motivo de unión a ácido nucleico del constructo de BCL11A.

En una realización, como se usa en la presente descripción, el término "endonucleasa dirigida a ADN" se refiere a una endonucleasa que genera una ruptura bicatenaria en una posición deseada en el genoma (por ejemplo, la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2) sin producir rupturas bicatenarias no deseadas fuera de la diana. La endonucleasa dirigida a ADN puede ser una endonucleasa de origen natural (por ejemplo, una meganucleasa bacteriana) o puede generarse de manera artificial (por ejemplo, meganucleasas modificadas genéticamente, TALEN, o ZFN, entre otras).

En otra realización, como se usa en la presente descripción, el término "endonucleasa dirigida a ADN" se refiere a una endonucleasa que genera una ruptura monocatenaria o una "mella" o una ruptura en una cadena de la cadena principal de azúcar fosfato del ADN en una posición deseada en el genoma (por ejemplo, la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2) sin producir rupturas bicatenarias del ADN fuera de la diana.

Como se usa en la presente descripción, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un lazo de ADN bicatenario circular al que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde pueden ligarse segmentos de ácido nucleico adicionales en el genoma viral. Determinados vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y de este modo se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se unen operativamente. Tales vectores se denominan en la presente descripción "vectores de expresión recombinante", o de manera más simple "vectores de expresión." Generalmente, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente dado que el plásmido es la forma de vector de uso más común. Sin embargo, los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden incluir otras formas de vectores de expresión, tal como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que sirven para funciones equivalentes.

Dentro de un vector de expresión, "unido operativamente" significa que la secuencia de nucleótidos de interés se une a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula diana cuando el vector se introduce en la célula diana). El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de célula huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Además, la endonucleasa dirigida a ADN puede suministrarse por medio de un vector que comprende una secuencia reguladora para dirigir la síntesis de la endonucleasa dirigida a ADN a intervalos específicos, o durante un período de tiempo específico. Se apreciará por aquellos con experiencia en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula diana, el nivel de expresión deseado, y similares.

Como se usa en la presente descripción el término "escinde" generalmente se refiere a la generación de una ruptura bicatenaria en el genoma de ADN en una ubicación deseada.

Como se usa en la presente descripción, el término "cantidad eficaz de una composición que comprende al menos una endonucleasa dirigida a ADN" se refiere a una cantidad de una endonucleasa dirigida a a Dn que produce actividad endonucleasa suficiente para generar una ruptura bicatenaria en la ubicación deseada del genoma. En una realización, la cantidad eficaz de una endonucleasa dirigida a ADN genera una ruptura bicatenaria en el locus genético deseado en al menos 20 % de las células en una población en contacto con la composición (por ejemplo, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 %, o incluso 100 % de las células en la población comprenden una modificación genética producida por la composición de endonucleasa dirigida a ADN).

Como se usa en la presente descripción el término "que aumenta los niveles de hemoglobina fetal" en una célula indica que la hemoglobina fetal es al menos 5 % mayor en poblaciones tratadas con un agente que interrumpe el ARNm o la expresión proteica de BCL11A (por ejemplo, una endonucleasa dirigida a ADN) mediante la unión al ADN genómico en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, que en una población de control, comparable, en donde no está presente el agente. Se prefiere que el porcentaje de expresión de hemoglobina fetal en una población tratada con un agente de este tipo que se une al ADN genómico en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 sea al menos 10 % mayor, al menos 20 % mayor, al menos 30 % mayor, al menos 40 % mayor, al menos 50 % mayor, al menos 60 % mayor, al menos 70 % mayor, al menos 80 % mayor, al menos 90 % mayor, al menos 1 vez mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 100 veces mayor, al menos 1.000 veces mayor, o más que en una población tratada de control de tamaño y condiciones de cultivo comparables. El término "población tratada de control" se usa en la presente descripción para describir una población de células que se ha tratado con idénticos medios, inducción viral, secuencias de ácidos nucleicos, temperatura, confluencia, tamaño del matraz, pH, etcétera, con la excepción de la adición del agente que se une al ADN genómico en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2. En una realización, cualquier método conocido en la técnica puede usarse para medir un aumento en la expresión de hemoglobina fetal, por ejemplo el análisis de transferencia Western de la proteína Y-globina fetal y la cuantificación del ARNm de la Y-globina fetal.

El término "célula aislada" como se usa en la presente descripción se refiere a una célula que se ha extraído de un organismo en el que se encontraba originalmente, o un descendiente de una célula de este tipo. Opcionalmente la célula se ha cultivado in vitro, por ejemplo, en presencia de otras células. Opcionalmente la célula se introduce después en un segundo organismo o se reintroduce en el organismo del cual se aisló (o la célula de la cual desciende).

El término "población aislada" con respecto a una población aislada de células como se usa en la presente descripción se refiere a una población de células que se ha extraído y separado de una población mixta o heterogénea de células. En algunas realizaciones, una población aislada es una población de células sustancialmente pura en comparación con la población heterogénea a partir de la cual se aislaron o enriquecieron las células. En algunas realizaciones, la población aislada es una población aislada de células progenitoras hematopoyéticas humanas, por ejemplo, una población sustancialmente pura de células progenitoras hematopoyéticas humanas en comparación con una población heterogénea de células que comprende células progenitoras hematopoyéticas humanas y células de las que se derivan las células progenitoras hematopoyéticas humanas.

El término "sustancialmente pura," con respecto a una población de células particular, se refiere a una población de células que es al menos aproximadamente 75 %, preferentemente al menos aproximadamente 85 %, con mayor preferencia al menos aproximadamente 90 %, y con la máxima preferencia al menos aproximadamente 95 % pura, con respecto a las células que componen una población total de células. Es decir, los términos "sustancialmente pura" 0 "esencialmente purificada," con respecto a una población de células progenitoras hematopoyéticas, se refiere a una población de células que contiene menos de aproximadamente 20 %, con mayor preferencia menos de aproximadamente 15 %, 10 %, 8 %, 7 %, con la máxima preferencia menos de aproximadamente 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o menos de 1 %, de células que no son células progenitoras hematopoyéticas como se define por los términos en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término "tratar" incluye reducir o aliviar al menos un efecto adverso o síntoma de una afección, enfermedad o trastorno. Por ejemplo, el término "tratar" y "tratamiento" se refiere a administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición, por ejemplo, una cantidad eficaz de una composición que comprende una población de células progenitoras hematopoyéticas de manera que el sujeto tiene una reducción en al menos un síntoma de la enfermedad o una mejoría en la enfermedad, por ejemplo, resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los propósitos de esta descripción, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de uno o más síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estabilización de la enfermedad (por ejemplo, no empeora), demora o disminución del progreso de la enfermedad, alivio o atenuación del estado patológico, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. En algunas realizaciones, tratar puede referirse a prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada de no recibir tratamiento. Por lo tanto, el experto en la técnica se percata de que un tratamiento puede mejorar el estado de la enfermedad, pero puede no ser una cura completa de la enfermedad. En algunas realizaciones, el tratamiento puede incluir la profilaxis. Sin embargo, en realizaciones alternativas, el tratamiento no incluye la profilaxis.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente descripción para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones, y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del criterio médico sensato, adecuados para el uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, acorde con una relación razonable de beneficio/riesgo.

Como se usa en la presente descripción, los términos "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente tolerable" y sus variaciones gramaticales, en la medida que se refieran a composiciones, portadores, diluyentes y reactivos, se usan indistintamente y representan que los materiales pueden administrarse a o en un mamífero sin la producción de efectos fisiológicos no deseados tales como náuseas, mareos, malestar estomacal y similares. Un portador farmacéuticamente aceptable no promoverá el levantamiento de una respuesta inmunitaria a un agente con el que se mezcla, a menos que así se desee. La preparación de una composición farmacológica que contiene ingredientes activos disueltos o dispersos en ella se entiende bien en la técnica y no es necesario limitarla en base a la formulación. Típicamente tales composiciones se preparan como inyectables ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, sin embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución, o suspensiones, en líquido antes del uso. La preparación también puede emulsionarse o presentarse como una composición de liposomas. El ingrediente activo puede mezclarse con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para el uso en los métodos terapéuticos descritos en la presente descripción. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares o sus combinaciones. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores de pH y similares que aumentan la eficacia del ingrediente activo. La composición terapéutica de la presente invención puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de sus componentes. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, tartárico oxálico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares. Los portadores fisiológicamente tolerables se conocen bien en la técnica. Los portadores líquidos ilustrativos son soluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los ingredientes activos y agua, o contienen un amortiguador tal como fosfato de sodio a valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambos, tales como solución salina regulada por fosfato. Aún más, los portadores acuosos pueden contener más de una sal amortiguadora, así como sales tales como cloruros de sodio y potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además de y para la exclusión del agua. Ejemplos de tales fases líquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodón, y emulsiones de agua en aceite. La cantidad de un agente activo usado con los métodos descritos en la presente descripción que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección, y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándares.

Como se usa en la presente descripción, "prevención" o "prevenir," cuando se usa en referencia a una enfermedad, trastorno o sus síntomas, se refiere a una reducción en la probabilidad de que un individuo desarrolle una enfermedad o trastorno, por ejemplo, una hemoglobinopatía. La probabilidad de desarrollar una enfermedad o trastorno se reduce, por ejemplo, cuando un individuo que tiene uno o más factores de riesgo para una enfermedad o trastorno no desarrolla el trastorno o desarrolla tal enfermedad o trastorno en un momento posterior o con menos gravedad, estadísticamente hablando, con relación a una población que tiene los mismos factores de riesgo y no recibe el tratamiento como se describe en la presente descripción. El fallo en el desarrollo de síntomas de una enfermedad, o el desarrollo de síntomas reducidos (por ejemplo, en al menos 10 % en una escala clínicamente aceptada para esa enfermedad o trastorno) o demorados (por ejemplo, en días, semanas, meses o años) se considera prevención eficaz.

En relación con el contacto de una célula con una endonucleasa dirigida a ADN para disminuir la expresión de BCL11A, la expresión "que aumenta los niveles de hemoglobina fetal en una célula" indica que la hemoglobina fetal en una célula o población de células es al menos 5 % mayor en la célula o población de células tratada con la endonucleasa dirigida a ADN, que en una población de control, comparable, en donde no está presente la endonucleasa dirigida a ADN. Se prefiere que la expresión de hemoglobina fetal en una célula tratada con endonucleasa dirigida a ADN sea al menos 10 % mayor, al menos 20 % mayor, al menos 30 % mayor, al menos 40 % mayor, al menos 50 % mayor, al menos 60 % mayor, al menos 70 % mayor, al menos 80 % mayor, al menos 90 % mayor, al menos 1 vez mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 100 veces mayor, al menos 1.000 veces mayor, o más que en una población tratada de control comparable. El término "población tratada de control" se usa en la presente descripción para describir una población de células que se ha tratado con idénticos medios, inducción viral, secuencias de ácidos nucleicos, temperatura, confluencia, tamaño de matraz, pH, etcétera, con la excepción de la adición del inhibidor de BCL11A.

El término "mamífero" pretende abarcar un "mamífero" en singular y "mamíferos," en plural e incluye, pero no se limita a seres humanos; primates tales como simios, monos, orangutanes, y chimpancés; cánidos tales como perros y lobos; félidos tales como gatos, leones, y tigres; équidos tales como caballos, asnos, y cebras; animales de cría tales como vacas, cerdos, y ovejas; ungulados tales como ciervos y jirafas; roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y cobayas; y osos. En algunas realizaciones preferidas, un mamífero es un ser humano.

Por consiguiente, en una realización, el mamífero se ha diagnosticado con una hemoglobinopatía. En una realización adicional, la hemoglobinopatía es una p-hemoglobinopatía. En una realización preferida, la hemoglobinopatía es una drepanocitosis. Como se usa en la presente descripción, "drepanocitosis" puede ser anemia drepanocítica, drepanocitosis con hemoglobina C (HbSC), drepanocitosis con beta-más-talasemia (HbS/p+), o drepanocitosis con beta-cero-talasemia (HbS/p0). En otra realización preferida, la hemoglobinopatía es una p-talasemia.

Como se usa en la presente descripción, el término "hemoglobinopatía" significa cualquier defecto en la estructura o función de cualquier hemoglobina de un individuo, e incluye defectos en la estructura primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria de la hemoglobina provocados por cualquier mutación, tales como mutaciones de deleción o mutaciones de sustitución en las regiones codificantes del gen de p-globina, o mutaciones en, o deleciones de, los promotores o potenciadores de tales genes que provocan una reducción en la cantidad de hemoglobina producida en comparación con una condición normal o estándar. El término incluye además cualquier disminución en la cantidad o la eficacia de la hemoglobina, ya sea normal o anormal, provocada por factores externos tales como enfermedad, quimioterapia, toxinas, venenos, o similares.

En una realización, el término "cantidad eficaz", como se usa en la presente descripción, se refiere a la cantidad de una composición de células que es segura y suficiente para tratar, reducir la probabilidad de, o demorar el desarrollo de una hemoglobinopatía. Por lo tanto la cantidad puede curar o dar como resultado el alivio de los síntomas de la hemoglobinopatía, enlentecer el curso de la progresión de la enfermedad hemoglobinopática, enlentecer o inhibir un síntoma de una hemoglobinopatía, enlentecer o inhibir el establecimiento de síntomas secundarios de una hemoglobinopatía o inhibir el desarrollo de un síntoma secundario de una hemoglobinopatía. La cantidad eficaz para el tratamiento de la hemoglobinopatía depende del tipo de hemoglobinopatía a tratar, la gravedad de los síntomas, el sujeto que se trata, la edad y condición general del sujeto, el modo de administración etcétera. Por lo tanto, no siempre es posible o prudente especificar una "cantidad eficaz" exacta. Sin embargo, para cualquier caso dado, una "cantidad eficaz" adecuada puede determinarse por un experto en la técnica con el uso solamente de experimentación de rutina.

Como se usa en la presente descripción el término "que comprende" o "comprende" se usa en referencia a composiciones, métodos, y sus componentes respectivos, que son esenciales para la invención, aunque abiertos a la inclusión de elementos no especificados, ya sean esenciales o no.

Como se usa en la presente descripción el término "que consiste esencialmente en' se refiere a los elementos requeridos para una realización dada. El término permite la presencia de elementos adicionales que no afectan materialmente la(s) característica(s) básica(s) y nueva(s) o funcional(es) de esa realización de la invención.

El término "que consiste en' se refiere a composiciones, métodos, y sus componentes respectivos como se describe en la presente descripción, que excluyen cualquier elemento no mencionado en esa descripción de la realización.

Como se usa en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un," "una," y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así por ejemplo, las referencias a "el método" incluyen uno o más métodos, y/o etapas del tipo descrito en la presente descripción y/o que resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras leer esta descripción etcétera. Se entiende que la descripción detallada anterior y los ejemplos siguientes son solamente ilustrativos y no deben tomarse como limitaciones del alcance de la invención. Varios cambios y modificaciones a las realizaciones descritas, que resultarán evidentes para los expertos en la técnica, pueden realizarse sin apartarse del alcance de la presente invención. Además, todas las patentes, solicitudes de patente, y publicaciones identificadas tienen el propósito de describir y divulgar, por ejemplo, las metodologías descritas en dichas publicaciones que podrían usarse en relación con la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de la presente invención debe interpretarse como una aceptación de que los inventores no tienen derecho a antedatar tal descripción en virtud de invención anterior y por cualquier otra razón. Todas las declaraciones en cuanto a fecha o representación de los contenidos de estos documentos se basan en la información disponible para los solicitantes y no constituyen admisión alguna de la exactitud de las fechas o contenidos de estos documentos.

Hemoglobinopatías

La hemoglobina fetal (HbF) es un tetrámero de dos polipéptidos de a-globina del adulto y dos polipéptidos de Y-globina fetal tipo p. Durante la gestación, los genes de Y-globinas duplicados constituyen los genes predominantes transcritos a partir del locus de p-globina. Después del nacimiento, la Y-globina se reemplaza progresivamente por la p-globina del adulto, un proceso denominado el "cambio fetal" (3). Los mecanismos moleculares subyacentes a este cambio se han mantenido en gran medida sin definir y han sido objeto de una intensa investigación. El cambio en el desarrollo de la producción predominantemente de hemoglobina fetal o HbF (a2Y2) a la producción de hemoglobina del adulto o HbA (a2p2) comienza aproximadamente de las 28 a 34 semanas de gestación y continúa brevemente después del nacimiento punto en el cual la HbA se vuelve predominante. Este cambio es el resultado principalmente de la disminución de la transcripción de los genes de gamma-globinas y el aumento de la transcripción de los genes de beta-globinas. Como promedio, la sangre de un adulto normal contiene solo aproximadamente 2 % de HbF, aunque los niveles de HbF residual tienen una variación de más de 20 veces en adultos sanos (Atweh, Semin. Hematol.

38(4):367-73 (2001)).

Las hemoglobinopatías abarcan una serie de anemias de origen genético en las que existe una disminución de la producción y/o un aumento de la destrucción (hemólisis) de glóbulos rojos (RBC). Estos trastornos incluyen además defectos genéticos que dan como resultado la producción de hemoglobinas anormales con una afectación concomitante de la capacidad de mantener la concentración de oxígeno. Algunos de tales trastornos involucran la incapacidad de producir p-globina normal en cantidades suficientes, mientras que otros involucran la total incapacidad de producir p-globina normal. Estos trastornos asociados específicamente con la proteína p-globina se denominan generalmente p-hemoglobinopatías. Por ejemplo, las p-talasemias son el resultado de un defecto parcial o completo en la expresión del gen de p-globina, lo que conduce a la deficiencia o ausencia de HbA. La anemia drepanocítica es el resultado de una mutación puntual en el gen estructural de la p-globina, que conduce a la producción de una hemoglobina (HbS) anormal (falciforme). Los RBC con HbS son más frágiles que los RBC normales y experimentan hemólisis más fácilmente, lo que conduce eventualmente a la anemia (Atweh, Semin. Hematol. 38(4):367-73 (2001)). Por otra parte, la presencia de una variante genética de BCL11A, la variación HBS1L-MYB, alivia la gravedad clínica en la beta-talasemia. Se ha demostrado la asociación de esta variante con los niveles de HbF. Se ha demostrado que existe una relación de probabilidades de 5 para tener una forma menos grave de beta-talasemia con la variante de HbF alta (Galanello S. y otros, 2009, Blood, en prensa).

La búsqueda de un tratamiento orientado a la reducción del desequilibrio de las cadenas de globinas en pacientes con p-hemoglobinopatías se ha centrado en la manipulación farmacológica de la hemoglobina fetal (a2Y2; HbF). El potencial terapéutico importante de tales enfoques se sugiere por las observaciones del fenotipo moderado de individuos con herencia conjunta de p-talasemia homocigótica y persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (HPFH), así como por aquellos pacientes con p-talasemia homocigótica que no sintetizan hemoglobina del adulto, pero en los que se observa una reducción de la necesidad de transfusiones en presencia de aumento de las concentraciones de hemoglobina fetal. Además, se ha observado que ciertas poblaciones de pacientes adultos con anomalías en la cadena p tienen niveles de hemoglobina fetal (HbF) mayores que los normales, y se ha observado que tienen un curso clínico de la enfermedad más moderado que los pacientes con niveles de HbF normales en el adulto. Por ejemplo, un grupo de pacientes con anemia drepanocítica de Arabia Saudita que expresan 20-30 % de HbF solo tienen manifestaciones clínicas moderadas de la enfermedad (Pembrey, y otros, Br. J. Haematol. 40: 415-429 (1978)). Ahora se acepta que las p-hemoglobinopatías, tales como la anemia drepanocítica y las p-talasemias, se alivian con el aumento de la producción de HbF. (Reseñado en Jane y Cunningham Br. J. Haematol. 102: 415-422 (1998) y Bunn, N. Engl. J. Med. 328: 129-131 (1993)).

Si bien los mecanismos moleculares que controlan el cambio en el desarrollo in vivo de la expresión génica de y a pglobina actualmente se desconocen, existe evidencia acumulada de que factores externos pueden influir en la expresión génica de Y-globina. El primer grupo de compuestos descubiertos con actividad de reactivación de HbF eran fármacos citotóxicos. La capacidad de provocar la síntesis de novo de HbF mediante manipulación farmacológica se demostró primero con el uso de 5-azacitidina en animales de experimentación (DeSimone, Proc Natl Acad Sci U S A.

79(14):4428-31 (1982)). Estudios posteriores confirmaron la capacidad de la 5-azacitidina de aumentar la HbF en pacientes con p-talasemia y drepanocitosis (Ley, y otros, N. Engl. J. Medicine, 307: 1469-1475 (1982), y Ley, y otros, Blood 62: 370-380 (1983)). Experimentos adicionales demostraron que babuinos tratados con dosis citotóxicas de arabinosilcitosina (ara-C) respondían con elevaciones sorprendentes de F-reticulocitos (Papayannopoulou y otros, Science. 224(4649):617-9 (1984)), y que el tratamiento con hidroxiurea conducía a la inducción de Y-globina en monos o babuinos (Letvin y otros, N Engl J Med. 310(14):869-73 (1984)).

El segundo grupo de compuestos investigado en cuanto a la capacidad de provocar actividad de reactivación de HbF fue el de ácidos grasos de cadena corta. La observación inicial en células progenitoras de sangre de cordón umbilical fetal condujo al descubrimiento de que el ácido Y-aminobutírico puede actuar como un inductor de hemoglobina fetal (Perrine y otros, Biochem Biophys Res Commun.148(2):694-700 (1987)). Estudios posteriores demostraron que el butirato estimulaba la producción de globinas en babuinos adultos (Constantoulakis y otros, Blood. Dic; 72(6):1961-7 (1988)), e inducía la Y-globina en progenitoras eritroides en animales adultos o pacientes con anemia drepanocítica (Perrine y otros, Blood. 74(1):454-9 (1989)). Derivados de ácidos grasos de cadena corta tales como fenilbutirato (Dover y otros, Br J Haematol. 88(3):555-61 (1994)) y ácido valproico (Liakopoulou y otros, 1: Blood. 186(8):3227-35 (1995)) también han demostrado inducir HbF in vivo. Dado el gran número de análogos de ácidos grasos de cadena corta o derivados de esta familia, existe una serie de compuestos potenciales de esta familia más potentes que el butirato. Los ácidos fenilacético y fenilalquilo (Torkelson y otros, Blood Cells Mol Dis. 22(2):150-8. (1996)), que se descubrieron durante estudios posteriores, se consideraban inductores potenciales de HbF dado que pertenecían a esta familia de compuestos. En la actualidad, sin embargo, el uso de butirato o sus análogos en la anemia drepanocítica y la p-talasemia sigue siendo experimental y no puede recomendarse para el tratamiento fuera de ensayos clínicos.

Los ensayos clínicos orientados a la reactivación de la síntesis de hemoglobina fetal en la anemia drepanocítica y la p -talasemia han incluido la administración a corto plazo y a largo plazo de compuestos tales como 5-azacitidina, hidroxiurea, eritropoyetina humana recombinante, y análogos de ácido butírico, así como combinaciones de estos agentes. Siguiendo estos estudios, la hidroxiurea se usó para la inducción de HbF en seres humanos y posteriormente se convirtió en el primer y único fármaco aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) para el tratamiento de hemoglobinopatías. Sin embargo, inconvenientes variables han contraindicado el uso a largo plazo de tales agentes o terapias, que incluyen efectos secundarios no deseados y variabilidad en las respuestas de los pacientes. Por ejemplo, si bien la hidroxiurea estimula la producción de HbF y ha demostrado reducir clínicamente la crisis drepanocítica, se limita potencialmente por la mielotoxicidad y el riesgo de carcinogénesis. La carcinogenicidad a largo plazo potencial también existiría en las terapias basadas en 5-azacitidina. Las terapias basadas en eritropoyetina no han demostrado ser consistentes entre una variedad de poblaciones de pacientes. Las vidas medias cortas del ácido butírico in vivo se han percibido como un obstáculo potencial en la adaptación de estos compuestos para el uso en intervenciones terapéuticas. Además, son necesarias dosis muy altas de ácido butírico para inducir la expresión génica de Y-globina, que requieren cateterización para la infusión continua del compuesto. Por otra parte, estas dosis altas de ácido butírico pueden asociarse con neurotoxicidad y daño a múltiples órganos (Blau, y otros, Blood 81: 529-537 (1993)). Si bien aumentos mínimos en los niveles de HbF son útiles en la drepanocitosis, las ptalasemias requieren un aumento mucho mayor que no se logra de manera confiable, o segura, mediante ninguno de los agentes usados actualmente (Olivieri, Seminars in Hematology 33: 24-42 (1996)).

La identificación de los reguladores naturales de la inducción y producción de HbF podría proporcionar un medio para crear intervenciones terapéuticas que superen los diversos inconvenientes de los compuestos descritos anteriormente. Estudios recientes de asociación del genoma completo han producido conocimientos sobre la base genética de numerosas enfermedades y rasgos complejos (McCarthy y otros, Nat Rev Genet 9, 356 (2008) y Manolio y otros J Clin Invest 118, 1590 (2008)). Sin embargo, en la gran mayoría de los casos, el vínculo funcional entre una asociación genética y la fisiopatología subyacente sigue sin descubrirse. El nivel de hemoglobina fetal (HbF) se hereda como un rasgo cuantitativo y clínicamente importante, dado su papel mencionado anteriormente y bien caracterizado en el alivio de la gravedad de las principales p-hemoglobinopatías, la drepanocitosis y la p-talasemia (Nathan y otros, Nathan and Oski's hematology of infancy and childhood ed. 6ta, pp. 2 v. (xiv, 1864, xli p.) 2003)). Dos estudios de asociación del genoma completo han identificado tres loci principales que contienen un conjunto de cinco polimorfismos de nucleótido simple (SNP) comunes que explican ~20 % de la variación en los niveles de HbF (Lettre y otros, Proc Natl Acad Sci U S A (2008); Uda y otros, Proc Natl Acad Sci U S A 105, 1620 (2008); Menzel y otros, Nat Genet 39, 1197 (2007)). Por otra parte, varias de estas variantes parecen predecir la gravedad clínica de la drepanocitosis (Lettre y otros, Proc Natl Acad Sci U S A (2008)) y al menos uno de estos SNP también puede afectar el resultado clínico en la p-talasemia (Uda y otros, Proc Natl Acad Sci U S A 105, 1620 (2008)). El SNP con el tamaño de efecto más grande, que explica más de 10 % de la variación en HbF, se ubica en el segundo intrón de un gen en el cromosoma 2, BCL11A. Mientras que BCL11A, un factor de transcripción de dedos de zinc tipo C2H2, se ha investigado en cuanto a su papel en el desarrollo linfocitario (Liu y otros, Nat Immunol 4, 525 (2003) y Liu y otros, Mol Cancer 5, 18 (2006)), su papel en la producción de glóbulos rojos o la regulación de genes de globinas no se ha evaluado previamente.

Al inicio de la era del ADN recombinante, los estudios de la estructura de los genes de globinas proporcionaron una fuerte base molecular para interrogar el cambio de globinas fetal. Un esfuerzo considerable se ha centrado en delinear los elementos en cis dentro del locus de p-globina necesarios para la regulación adecuada de los genes dentro del grupo de globinas tipo p. Estos estudios se basaron en mutaciones y deleciones de origen natural que influyen drásticamente en los niveles de HbF en adultos, y se han complementado mediante la generación de ratones transgénicos que albergan porciones del grupo (Nathan y otros, Nathan and Oski's hematology of infancy and childhood ed. 6ta, pp. 2 v. (xiv, 1864, xli p.) 2003) y G. Stamatoyannopoulos, Exp Hematol 33, 259 (2005)). Aunque los elementos en cis precisos requeridos para el cambio de globinas se mantiene mal definido, los hallazgos en ratones transgénicos han indicado fuertemente que los genes de Y-globinas se silencian de manera autónoma en la etapa adulta, un hallazgo que es el más compatible con la ausencia de activadores específicos de la etapa fetal o la presencia de un represor específico de etapa. Los resultados de estudios de asociación genética recientes proporcionan genes candidatos para interrogar en cuanto a su participación en el control de los genes de Y-globinas, tales como BCL11A.

Células progenitoras hematopoyéticas

En una realización, la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto ex vivo o in vitro. En una realización específica, la célula que se pone en contacto es una célula del linaje eritroide. En una realización, la composición de células comprende células que tienen disminución de la expresión de BCL11A.

"Célula progenitora hematopoyética" como se usa el término en la presente descripción, se refiere a células de un linaje de células madre que dan lugar a todos los tipos de células sanguíneas que incluyen los linajes mieloide (monocitos y macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocitos/plaquetas, células dendríticas), y el linfoide (células T, células B, células NK). Una "célula del linaje eritroide" indica que la célula que se pone en contacto es una célula que experimenta eritropoyesis de modo que tras la diferenciación final forma un eritrocito o glóbulo rojo (RBC). Tales células pertenecen a uno de tres linajes, eritroide, linfoide, y mieloide, que se originan de las células progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea. Tras la exposición a factores de crecimiento específicos y otros componentes del microambiente hematopoyético, las células progenitoras hematopoyéticas pueden madurar a través de una serie de tipos celulares de diferenciación intermedia, todos los intermediarios del linaje eritroide, a RBC. Por lo tanto, las células del "linaje eritroide", como se usa el término en la presente descripción, comprenden células progenitoras hematopoyéticas, rubriblastos, prorrubricitos, eritroblastos, metarrubricitos, reticulocitos, y eritrocitos.

En alguna realización, la célula progenitora hematopoyética tiene al menos uno de los marcadores de superficie celular característicos de las células progenitoras hematopoyéticas: CD34+, CD59+, Thy1/CD90+,CD38lo/-, y C-kit/CD117+. Preferentemente, las células progenitoras hematopoyéticas tienen varios de estos marcadores.

En algunas realizaciones, las células progenitoras hematopoyéticas del linaje eritroide tienen los marcadores de superficie celular característicos del linaje eritroide: CD71 y Ter119.

Las células madre, tales como células progenitoras hematopoyéticas, son capaces de proliferar y dar lugar a más células progenitoras que tienen la capacidad de generar un gran número de células madre que a su vez pueden dar lugar a células hijas diferenciadas o diferenciables. Las células hijas de por sí pueden inducirse para que proliferen y produzcan progenie que posteriormente se diferencia a uno o más tipos de células maduras, mientras que también conserva una o más células con el potencial de desarrollo de la progenitora. El término "célula madre" se refiere entonces, a una célula con la capacidad o el potencial, en circunstancias particulares, de diferenciarse a un fenotipo más especializado o diferenciado, y que conserva la capacidad, en ciertas circunstancias, de proliferar sin diferenciarse sustancialmente. En una realización, el término progenitora o célula madre se refiere a una célula madre generalizada cuyos descendientes (progenie) se especializan, frecuentemente en diferentes direcciones, mediante la diferenciación, por ejemplo, por adquisición de caracteres completamente individuales, como se produce en la diversificación progresiva de células y tejidos embrionarios. La diferenciación celular es un proceso complejo que se produce típicamente a través de muchas divisiones celulares. Una célula diferenciada puede derivarse de una célula multipotente que de por sí se deriva de una célula multipotente, y así sucesivamente. Si bien cada una de estas células multipotentes puede considerarse células madre, la variedad de tipos celulares a los que cada una puede dar lugar puede variar considerablemente. Algunas células diferenciadas también tienen la capacidad de dar lugar a células de mayor potencial de desarrollo. Esta capacidad puede ser natural o puede inducirse de manera artificial tras el tratamiento con varios factores. En muchos ejemplos biológicos, las células madre también son "multipotentes" porque pueden producir progenie de más de un tipo celular distinto, pero esto no se requiere para su "carácter indiferenciado." La autorrenovación es la otra parte clásica de la definición de célula madre, y es esencial como se usa en este documento. En teoría, la autorrenovación puede producirse por cualquiera de dos mecanismos principales. Las células madre pueden dividirse asimétricamente, con una hija que conserva el estado indiferenciado y la otra hija que expresa alguna otra función y fenotipo específico distinto. Alternativamente, algunas de las células madre en una población pueden dividirse simétricamente en dos madres, lo que mantiene por lo tanto algunas células madre en la población en su conjunto, mientras que otras células en la población solo dan lugar a progenie diferenciada. Generalmente, las "células progenitoras" tienen un fenotipo celular que es más primitivo (es decir, se encuentra en una etapa más temprana en una ruta o progresión del desarrollo que una célula completamente diferenciada). Frecuentemente, las células progenitoras también tienen un potencial proliferativo significativo o muy alto. Las células progenitoras pueden dar lugar a múltiples tipos de células diferenciadas distintos o un solo tipo de célula diferenciada, en dependencia de la ruta de desarrollo y del ambiente en el que las células se desarrollan y se diferencian.

En el contexto de la ontogenia celular, el adjetivo "diferenciado", o "en diferenciación" es un término relativo. Una "célula diferenciada" es una célula que ha progresado más adelante en la ruta de desarrollo que la célula con la que se compara. Por lo tanto, las células madre pueden diferenciarse a células precursoras de linaje restringido (tales como una célula progenitora hematopoyética), que a su vez pueden diferenciarse a otros tipos de células precursoras más adelante en la ruta (tales como un precursor de eritrocitos), y después a una célula diferenciada en etapa final, tal como un eritrocito, que desempeña un papel característico en un cierto tipo de tejido, y puede o no conservar la capacidad de proliferar más.

Células madre pluripotentes inducidas

En algunas realizaciones, las células humanas modificadas genéticamente descritas en la presente descripción se derivan de células madre pluripotentes aisladas. Una ventaja de usar iPSC es que las células pueden derivarse del mismo sujeto al que las células progenitoras se administrarán. Es decir, una célula somática puede obtenerse de un sujeto, reprogramarse a una célula madre pluripotente inducida, y después rediferenciarse a una célula progenitora hematopoyética que se administrará al sujeto (por ejemplo, células autólogas). Dado que las progenitoras se derivan esencialmente de una fuente autóloga, el riesgo de rechazo al injerto o de respuestas alérgicas se reduce en comparación con el uso de células de otro sujeto o grupo de sujetos. En algunas realizaciones, las progenitoras hematopoyéticas se derivan de fuentes no autólogas. Además, el uso de iPSC invalida la necesidad de células obtenidas de una fuente embrionaria. Por lo tanto, en una realización, las células madre usadas en los métodos descritos no son células madre embrionarias.

Aunque la diferenciación es generalmente irreversible en contextos fisiológicos, recientemente se han desarrollado varios métodos para reprogramar células somáticas a células madre pluripotentes inducidas. Los métodos ilustrativos se conocen por los expertos en la técnica y se describen brevemente en la presente descripción más abajo.

Como se usa en la presente descripción, el término "reprogramación" se refiere a un proceso que altera o invierte el estado de diferenciación de una célula diferenciada (por ejemplo, una célula somática). Dicho de otra manera, la reprogramación se refiere a un proceso para dirigir la diferenciación de una célula de vuelta a un tipo de célula indiferenciada o más primitiva. Debe señalarse que colocar muchas células primarias en cultivo puede conducir a cierta pérdida de las características completamente diferenciadas. Por lo tanto, el simple cultivo de tales células incluidas en el término células diferenciadas no convierte a estas células en células no diferenciadas (por ejemplo, células indiferenciadas) o células pluripotentes. La transición de una célula diferenciada a la pluripotencia requiere un estímulo de reprogramación más allá de los estímulos que conducen a la pérdida parcial del carácter diferenciado en cultivo. Las células reprogramadas también tienen la característica de ser capaces de someterse a pases prolongados sin pérdida del potencial de crecimiento, con relación a las células primarias progenitoras, que generalmente son capaces solamente de un número limitado de divisiones en cultivo.

La célula a reprogramar puede estar parcialmente o terminalmente diferenciada antes de la reprogramación. En algunas realizaciones, la reprogramación abarca la inversión completa del estado de diferenciación de una célula diferenciada (por ejemplo, una célula somática) a un estado pluripotente o un estado multipotente. En algunas realizaciones, la reprogramación abarca la inversión completa o parcial del estado de diferenciación de una célula diferenciada (por ejemplo, una célula somática) a una célula indiferenciada (por ejemplo, una célula de tipo embrionario). La reprogramación puede dar como resultado la expresión de genes particulares por las células, cuya expresión contribuye aún más a la reprogramación. En ciertas realizaciones descritas en la presente descripción, la reprogramación de una célula diferenciada (por ejemplo, una célula somática) provoca que la célula diferenciada asuma un estado indiferenciado (por ejemplo, es una célula indiferenciada). Las células resultantes se denominan "células reprogramadas," o "células madre pluripotentes inducidas (iPSC o células iPS)."

La reprogramación puede involucrar la alteración, por ejemplo, inversión, de al menos algunos de los patrones hereditarios de modificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, metilación), condensación de la cromatina, cambios epigenéticos, impronta genómica, etcétera, que se producen durante la diferenciación celular. La reprogramación es distinta al simple mantenimiento del estado indiferenciado existente de una célula que ya es pluripotente o al mantenimiento del estado menos de completamente diferenciado existente de una célula que ya es una célula multipotente (por ejemplo, una célula madre hematopoyética). La reprogramación también es distinta a la simple promoción de la autorrenovación o la proliferación de células que ya son pluripotentes o multipotentes, aunque las composiciones y métodos descritos en la presente descripción también pueden ser útiles para tales propósitos, en algunas realizaciones.

El enfoque o método específico usado para generar células madre pluripotentes a partir de células somáticas (denominado de manera general "reprogramación") no es crítico para la invención reivindicada. Por lo tanto, cualquier método que reprograme una célula somática al fenotipo pluripotente será adecuado para el uso en los métodos descritos en la presente descripción.

Las metodologías de reprogramación para generar células pluripotentes con el uso de combinaciones definidas de factores de transcripción se ha descrito para células madre pluripotentes inducidas. Yamanaka y Takahashi convirtieron células somáticas de ratón a células del tipo células ES con potencial de desarrollo ampliado mediante la transducción directa de Oct4, Sox2, Klf4, y c-Myc (Takahashi y Yamanaka, 2006). Las iPSC se asemejan a las células ES dado que restablecen el circuito transcripcional asociado a la pluripotencia y gran parte de la arquitectura epigenética. Además, las iPSC de ratón satisfacen todos los ensayos estándares para pluripotencia: específicamente, la diferenciación in vitro a tipos celulares de las tres capas germinales, formación de teratomas, contribución a quimeras, transmisión de la línea germinal (Maherali y Hochedlinger, 2008), y complementación tetraploide (Woltjen y otros, 2009).

Estudios posteriores han demostrado que pueden obtenerse células iPS humanas con el uso de métodos de transducción similares (Lowry y otros, 2008; Park y otros, 2008; Takahashi y otros, 2007; Yu y otros, 2007b), y el trío de factores de transcripción, OCT4, SOX2, y NANOG, se ha establecido como el conjunto central de factores de transcripción que gobierna la pluripotencia (Jaenisch y Young, 2008). La producción de células iPS puede lograrse mediante la introducción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican genes asociados a células madre en una célula somática, adulta, históricamente con el uso de vectores virales.

Las células iPS pueden generarse o derivarse de células somáticas terminalmente diferenciadas, así como de células madre adultas, o células madre somáticas. Es decir, una célula progenitora no pluripotente puede volverse pluripotente o multipotente por reprogramación. En tales casos, puede no ser necesario incluir tantos factores de reprogramación como los requeridos para reprogramar una célula terminalmente diferenciada. Además, la reprogramación puede inducirse mediante la introducción no viral de factores de reprogramación, por ejemplo, mediante la introducción de las proteínas en sí, o mediante la introducción de ácidos nucleicos que codifican los factores de reprogramación, o mediante la introducción de ARN mensajeros que tras la traducción producen los factores de reprogramación (ver por ejemplo, Warren y otros, Cell Stem Cell, 2010 Nov 5;7(5):618-30). La reprogramación puede lograrse mediante la introducción de una combinación de ácidos nucleicos que codifican genes asociados a células madre que incluyen, por ejemplo Oct-4 (también conocido como Oct-3/4 o Pouf51), Sox1, Sox2, Sox3, Sox 15, Sox 18, NANo G, , Klf1, Klf2, Klf4, Klf5, NR5A2, c-Myc, l-Myc, n-Myc, Rem2, Tert, y LIN28. En una realización, la reprogramación con el uso de los métodos y composiciones descritos en la presente descripción puede comprender además introducir uno o más de Oct-3/4, un miembro de la familia Sox, un miembro de la familia Klf, y un miembro de la familia Myc a una célula somática. En una realización, los métodos y composiciones descritos en la presente descripción comprenden además introducir uno o más de cada uno de Oct 4, Sox2, Nanog, c-MYC y Klf4 para la reprogramación. Como se señaló anteriormente, el método exacto usado para la reprogramación no es necesariamente crítico para los métodos y composiciones descritos en la presente descripción. Sin embargo, cuando las células diferenciadas a partir de las células reprogramadas van a usarse, por ejemplo, en la terapia humana, en una realización la reprogramación no se efectúa mediante un método que altere el genoma. Por lo tanto, en tales realizaciones, la reprogramación se logra, por ejemplo, sin el uso de vectores virales o plasmídicos.

La eficiencia de la reprogramación (es decir, el número de células reprogramadas) derivada de una población de células de partida puede aumentarse mediante la adición de varias moléculas pequeñas como se muestra en Shi, Y., y otros (2008) Cell-Stem Cell 2:525-528, Huangfu, D., y otros (2008) Nature Biotechnology 26(7):795-797, y Marson, A., y otros (2008) Cell-Stem Cell 3:132-135. Por lo tanto, un agente o combinación de agentes que aumentan la eficiencia o la tasa de producción de células madre pluripotentes inducidas puede usarse en la producción de iPSC específicas del paciente o específicas de la enfermedad. Algunos ejemplos no limitantes de agentes que aumentan la eficiencia de la reprogramación incluyen Wnt soluble, medio acondicionado con Wnt, BIX-01294 (una histona metiltransferasa G9a), PD0325901 (un inhibidor de MEK), inhibidores de ADN metiltransferasa, inhibidores de histona deacetilasa (HDAC), ácido valproico, 5'-azacitidina, dexametasona, ácido suberoilanilidahidroxámico (SAHA), vitamina C, y tricostatina (TSA), entre otros.

Otros ejemplos no limitantes de agentes potenciadores de la reprogramación incluyen: ácido suberoilanilidahidroxámico (SAHA (por ejemplo, MK0683, vorinostat) y otros ácidos hidroxámicos), BML-210, depudecina (por ejemplo, (-)-depudecina), toxina HC, Nullscript (4-(1,3-dioxo-1H,3H-benzo[de]isoquinolin-2-il)-N-hidroxibutanamida), fenilbutirato (por ejemplo, fenilbutirato de sodio) y ácido valproico ((VPA) y otros ácidos grasos de cadena corta), scriptaid, suramina sódica, tricostatina A (TSA), APHA compuesto 8, apicidina, butirato de sodio, pivaloiloximetil butirato (Pivanex, AN-9), trapoxina B, clamidocina, depsipéptido (también conocido como FR901228 o FK228), benzamidas (por ejemplo, CI-994 (por ejemplo, N-acetil dinalina) y MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ-824, CBHA (ácido m-carboxicinámico ácido bishidroxámico), JNJ16241199, tubacina, A-161906, proxamida, oxamflatina, 3-Cl-UCHA (por ejemplo, ácido 6-(3-clorofenilureido)caproico hidroxámico), AOE (ácido 2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico), CHAP31 y CHAP 50. Otros agentes potenciadores de la reprogramación incluyen, por ejemplo, formas negativas dominantes de las HDAC (por ejemplo, formas catalíticamente inactivas), ARNip inhibidores de las HDAC, y anticuerpos que se unen específicamente a las HDAC. Tales inhibidores se comercializan, por ejemplo, por BIOMOL International, Fukasawa, Merck Biosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Aton Pharma, Titan Pharmaceuticals, Schering AG, Pharmion, MethylGene, y Sigma Aldrich.

Para confirmar la inducción de células madre pluripotentes para el uso con los métodos descritos en la presente descripción, pueden probarse clones aislados en cuanto a la expresión de un marcador de células madre. Tal expresión en una célula derivada de una célula somática identifica las células como células madre pluripotentes inducidas. Los marcadores de células madre pueden seleccionarse del grupo no limitante que incluye SSEA3, SSEA4, CD9, Nanog, Fbx15, Ecat1, Esg1, Eras, Gdf3, Fgf4, Cripto, Dax1, Zpf296, Slc2a3, Rex1, Utf1, y Natl. En una realización, una célula que expresa Oct4 o Nanog se identifica como pluripotente. Los métodos para detectar la expresión de tales marcadores pueden incluir, por ejemplo, RT-PCR y métodos inmunológicos que detectan la presencia de los polipéptidos codificados, tales como análisis de transferencia Western o de citometría de flujo. En algunas realizaciones, la detección no involucra solamente RT-PCR, sino que también incluye la detección de marcadores proteicos. Los marcadores intracelulares pueden identificarse mejor por medio de RT-PCR, mientras que los marcadores de superficie celular se identifican fácilmente, por ejemplo, por inmunocitoquímica.

El carácter de célula madre pluripotente de las células aisladas puede confirmarse por pruebas que evalúan la capacidad de las iPSC de diferenciarse a células de cada una de las tres capas germinales. Como un ejemplo, la formación de teratomas en ratones desnudos puede usarse para evaluar el carácter pluripotente de los clones aislados. Las células se introducen en ratones desnudos y se realiza la histología y/o inmunohistoquímica de un tumor que surge de las células. El crecimiento de un tumor que comprende células de las tres capas germinales, por ejemplo, indica además que las células son células madre pluripotentes.

Células somáticas para la reprogramación

Las células somáticas, como se usa ese término en la presente descripción, se refiere a cualquiera de las células que forman el cuerpo de un organismo, con exclusión de las células de la línea germinal. Cada tipo celular en el cuerpo de los mamíferos-aparte del esperma y los óvulos, las células a partir de las que se producen (gametocitos) y las células madre indiferenciadas-es una célula somática diferenciada. Por ejemplo, los órganos internos, la piel, huesos, sangre, y tejido conectivo están formados por células somáticas diferenciadas.

Los tipos de células somáticas para el uso con las composiciones y métodos descritos en la presente descripción incluyen: un fibroblasto (por ejemplo, un fibroblasto primario), una célula muscular (por ejemplo, un miocito), una célula del cúmulo, una célula neuronal, una célula mamaria, un hepatocito y una célula de los islotes pancreáticos. En algunas realizaciones, la célula somática es una línea celular primaria o es la progenie de una línea celular primaria o secundaria. En algunas realizaciones, la célula somática se obtiene de una muestra humana, por ejemplo, un folículo piloso, una muestra de sangre, una biopsia (por ejemplo, una biopsia de piel o una biopsia adiposa), una muestra de frotis (por ejemplo, una muestra de frotis oral), y por lo tanto es una célula somática humana.

Algunos ejemplos no limitantes de células somáticas diferenciadas incluyen, pero no se limitan a, células epiteliales, endoteliales, neuronales, adiposas, cardíacas, de músculo esquelético, células inmunitarias, hepáticas, esplénicas, de pulmón, células sanguíneas circulantes, gastrointestinales, renales, de médula ósea, y pancreáticas. En algunas realizaciones, una célula somática puede ser una célula primaria aislada a partir de cualquier tejido somático que incluye, pero no se limita a cerebro, hígado, intestino, estómago, intestino, grasa, músculo, útero, piel, bazo, órgano endocrino, hueso, etcétera. Además, la célula somática puede ser de cualquier especie de mamífero, con ejemplos no limitantes que incluyen una célula murina, bovina, de simio, porcina, equina, ovina, o humana. En algunas realizaciones, la célula somática es una célula somática humana.

Cuando las células reprogramadas se usan para la generación de células progenitoras hematopoyéticas a usar en el tratamiento terapéutico de una enfermedad, es conveniente, pero no se requiere, usar células somáticas aisladas del paciente a tratar. Por ejemplo, pueden usarse las células somáticas involucradas en enfermedades, y células somáticas que participan en el tratamiento terapéutico de enfermedades y similares. En algunas realizaciones, un método para seleccionar las células reprogramadas a partir de una población heterogénea que comprende células reprogramadas y células somáticas de las que se derivaron o generaron puede realizarse por cualquiera de los medios conocidos. Por ejemplo, un gen de resistencia a fármaco o similar, tal como un gen marcador de selección puede usarse para aislar las células reprogramadas con el uso del marcador de selección como índice.

Las células somáticas reprogramadas como se describe en la presente descripción pueden expresar cualquier número de marcadores de células pluripotentes, que incluyen: fosfatasa alcalina (AP); ABCG2; antígeno embrionario-1 específico de etapa (SSEA-1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49/6E; ERas/ECAT5, E-caderina; p-III-tubulina; a-actina de músculo liso (a-SMA); factor de crecimiento de fibroblastos 4 (Fgf4), Cripto, Dax1; proteína de dedos de zinc 296 (Zfp296); N-acetiltransferasa-1 (Natl); (transcrito 1 asociado a células ES (ECAT1); ESG1/DPPA5/ECAT2; ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; ECAT15-1; ECAT15-2; Fthl17; Sal14; factor de transcripción de células embrionarias indiferenciadas (Utf1); Rex1; p53; G3PDH; telomerasa, que incluye TERT; genes del cromosoma X silente; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; proteína 15 que contiene caja F (Fbx15); Nanog/ECAT4; Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, FoxD3; GDF3; CYP25A1; proteína 2 del desarrollo asociada a la pluripotencia (DPPA2); punto de ruptura de linfoma de células T 1 (Tel1); DPPA3/Stella; DPPA4; otros marcadores generales de pluripotencia, etcétera. Otros marcadores pueden incluir Dnmt3L; Sox15; Stat3; Grb2; p-catenina, y Bmi1. Tales células pueden caracterizarse además por la regulación negativa de marcadores característicos de la célula somática de la que se deriva la célula madre pluripotente inducida.

Edición del genoma y endonucleasas dirigidas a ADN

Como se usa en la presente descripción, el término "edición del genoma" se refiere a un método de genética inversa que usa nucleasas modificadas genéticamente de manera artificial para cortar y crear rupturas bicatenarias específicas en una(s) ubicación(ones) deseada(s) en el genoma, que después se reparan por procesos celulares endógenos tales como, recombinación homóloga (HR), reparación dirigida por homología (HDR) y unión de extremos no homólogos (NHEJ). La NHEJ une directamente los extremos de ADN en una ruptura bicatenaria, mientras que la HDR utiliza una secuencia homóloga como plantilla para regenerar la secuencia de ADN que falta en el punto de ruptura.

La edición del genoma no puede realizarse con el uso de endonucleasas de restricción tradicionales dado que la mayoría de las enzimas de restricción reconocen unos pocos pares de bases en el ADN como su diana y es muy alta la probabilidad de que la combinación de pares de bases reconocida se encuentre en muchas ubicaciones en el genoma lo que da como resultado múltiples cortes (es decir, no se limita a una ubicación deseada). Para superar este reto y crear rupturas bicatenarias sitio específicas, varias clases distintas de nucleasas se han encontrado y biomodificado hasta la fecha. Estas son las meganucleasas, nucleasas de dedos de zinc (ZFN), el sistema Cas9/CRISPR, y las nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción (TALEN).

Las meganucleasas se agrupan comúnmente en cuatro familias: la familia LAGLIDADG, la familia GIY-YIG, la familia de caja His-Cys y la familia HNH. Estas familias se caracterizan por motivos estructurales, que afectan la actividad catalítica y la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, los miembros de la familia LAGLIDADG se caracterizan por tener una o dos copias del motivo conservado LAGLIDADG (ver Chevalier y otros (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774). Las meganucleasas LAGLIDADG con una sola copia del motivo LAGLIDADG forman homodímeros, mientras que los miembros con dos copias del LAGLIDADG se encuentran como monómeros. De manera similar, los miembros de la familia GIY-YIG tienen un módulo GIY-YIG, que tiene 70-100 residuos de longitud e incluye cuatro o cinco motivos de secuencia conservados con cuatro residuos invariantes, dos de los cuales se requieren para la actividad (ver Van Roey y otros (2002), Nature Struct. Biol. 9: 806-811). Las meganucleasas de caja His-Cys se caracterizan por una serie altamente conservada de histidinas y cisteínas en una región que abarca varios cientos de residuos de aminoácidos (ver Chevalier y otros (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774). En el caso de la familia NHN, los miembros se definen por motivos que contienen dos pares de histidinas conservadas rodeadas por residuos de asparagina (ver Chevalier y otros (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774). Las cuatro familias de meganucleasas se diferencian mucho entre sí con respecto a elementos estructurales conservados y, en consecuencia, a la especificidad de la secuencia de reconocimiento de ADN y la actividad catalítica.

Las meganucleasas se encuentran comúnmente en especies microbianas y tienen la propiedad única de tener secuencias de reconocimiento muy largas (>14 pb) lo que las hace por lo tanto naturalmente muy específicas para el corte en una ubicación deseada. Esto puede explotarse para producir rupturas bicatenarias sitio específicas en la edición del genoma. El experto en la técnica puede usar estas meganucleasas de origen natural, sin embargo el número de tales meganucleasas de origen natural es limitado. Para superar este reto, se han usado métodos de mutagénesis y tamizaje de alta productividad para crear variantes de meganucleasas que reconocen secuencias únicas. Por ejemplo, varias meganucleasas se han fusionado para crear enzimas híbridas que reconocen una secuencia nueva. Alternativamente, los aminoácidos de la meganucleasa que interactúan con el a Dn pueden alterarse para diseñar meganucleasas específicas de secuencias (ver por ejemplo, la patente de Estados Unidos 8,021,867). Las meganucleasas pueden diseñarse con el uso de los métodos descritos por ejemplo, en Certo, MT y otros Nature Methods (2012) 9:073-975; las patentes de Estados Unidos núms. 8,304,222; 8,021,867; 8,119,381; 8,124,369; 8,129,134; 8,133,697; 8,143,015; 8,143,016; 8,148,098; o 8,163,514. Alternativamente, las meganucleasas con características de corte sitio específico pueden obtenerse con el uso de tecnologías disponibles en el mercado por ejemplo, la tecnología de edición del genoma Directed Nuclease Editor™ de Precision BioSciences.

La tecnología de endonucleasas de restricción ZFN y TALEN utiliza una enzima de corte de ADN no específica unida a un(os) péptido(s) que reconoce(n) una secuencia de ADN específica tal(es) como dedos de zinc y efectores tipo activador de la transcripción (TALE). Típicamente se selecciona una endonucleasa cuyo sitio de reconocimiento y su sitio de escisión del ADN están separados entre sí y su porción de escisión se separa y después se une a un péptido de reconocimiento de secuencia, para producir de este modo una endonucleasa con una especificidad muy alta por una secuencia deseada. Una enzima de restricción ilustrativa con tales propiedades es FokI. Adicionalmente FokI tiene la ventaja de requerir dimerización para tener actividad nucleasa y esto significa que la especificidad aumenta drásticamente dado que cada pareja de la nucleasa reconoce una secuencia de ADN única. Para aumentar este efecto, se han modificado genéticamente nucleasas FokI que solo pueden funcionar como heterodímeros y tienen mayor actividad catalítica. Las nucleasas que funcionan como heterodímeros evitan la posibilidad de actividad de homodímeros no deseada y por lo tanto aumenta la especificidad de la ruptura bicatenaria.

Aunque las porciones nucleasas tanto de ZFN como de TALEN tienen propiedades similares, la diferencia entre estas nucleasas modificadas genéticamente está en su péptido de reconocimiento del ADN. Las ZFN se basan en dedos de zinc Cys2-His2 y las TALEN en los TALE. Ambos de estos dominios de péptido de reconocimiento del ADN tienen la característica de encontrarse naturalmente en combinaciones en sus proteínas. Los dedos de zinc Cys2-His2 aparecen típicamente en repeticiones separadas por 3 pb y se encuentran en diversas combinaciones en una variedad de proteínas que interactúan con ácidos nucleicos tales como factores de transcripción. Los TALE por otra parte se encuentran en repeticiones con una relación de reconocimiento uno a uno entre los aminoácidos y los pares de nucleótidos reconocidos. Dado que tanto los dedos de zinc como los TALE aparecen en patrones repetidos, pueden probarse diferentes combinaciones para crear una gran variedad de especificidades de secuencia. Los enfoques para producir endonucleasas con dedos de zinc sitio específicas incluyen, por ejemplo, ensamblaje modular (donde los dedos de zinc correlacionados con una secuencia de triplete se unen consecutivamente para cubrir la secuencia requerida), OPEN (selección de bajo rigor de dominios peptídicos vs. tripletes de nucleótidos seguido de selecciones de alto rigor de combinación de péptidos vs. la diana final en sistemas bacterianos), y tamizaje en un híbrido bacteriano de bibliotecas de dedos de zinc, entre otros. Las ZFN para el uso con los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden obtenerse comercialmente de por ejemplo, Sangamo Biosciences™ (Richmond, CA).

Se contempla en la presente descripción que el sistema Cas9/CRISPR de edición del genoma se emplee con los métodos y composiciones descritos en la presente descripción. Los sistemas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)/asociado a CRISPR (Cas) son útiles para la edición del genoma programable por ARN (ver por ejemplo, Jinek, M. y otros Science (2012) 337(6096):816-821).

Alternativamente, la edición del genoma puede realizarse con el uso de modificación del genoma basada en virus adenoasociado recombinante (rAAV), que es una plataforma de edición del genoma centrada alrededor del uso de vectores rAAV que hace posible la inserción, deleción o sustitución de secuencias de ADN en los genomas de células de mamífero vivos. El genoma de rAAV es una molécula de ácido desoxirribonucleico monocatenario (ADNmc), con sentido positivo o negativo, que tiene aproximadamente 4,7 kilobases de longitud. Estos vectores virales de ADN monocatenario tienen tasas de transducción altas y tienen una propiedad única de estimular la recombinación homóloga endógena en ausencia de rupturas bicatenarias del ADN en el genoma. El experto en la técnica puede diseñar un vector rAAV para dirigirlo a un locus genómico deseado y realizar alteraciones grandes y/o sutiles a los genes endógenos en una célula, tales como una deleción. La edición del genoma por rAAV tiene la ventaja de que se dirige a un solo alelo y no da como resultado alteraciones genómicas fuera de la diana. La tecnología de edición del genoma por rAAV está disponible en el mercado, por ejemplo, el sistema rAAV GENESIS™ de Horizon™ (Cambridge, Reino Unido).

Portadores farmacéuticamente aceptables

Los métodos para administrar progenitoras hematopoyéticas humanas a un sujeto como se describe en la presente descripción involucran el uso de composiciones terapéuticas que comprenden células progenitoras hematopoyéticas. Las composiciones terapéuticas contienen un portador fisiológicamente tolerable junto con la composición de células y opcionalmente al menos un agente bioactivo adicional como se describe en la presente descripción, disuelto o disperso en esta como un ingrediente activo. En una realización preferida, la composición terapéutica no es sustancialmente inmunogénica cuando se administra a un mamífero o un paciente humano para propósitos terapéuticos, a menos que así se desee.

En general, las células progenitoras hematopoyéticas descritas en la presente descripción se administran como una suspensión con un portador farmacéuticamente aceptable. El experto en la técnica reconocerá que un portador farmacéuticamente aceptable a usar en una composición de células no incluirá amortiguadores, compuestos, agentes de crioconservación, conservantes, u otros agentes en cantidades que interfieren sustancialmente con la viabilidad de las células a suministrar al sujeto. Una formulación que comprende células puede incluir por ejemplo, amortiguadores osmóticos que permiten mantener la integridad de la membrana celular, y opcionalmente, nutrientes para mantener la viabilidad celular o aumentar el injerto tras la administración. Tales formulaciones y suspensiones se conocen por los expertos en la técnica y/o pueden adaptarse para el uso con las células progenitoras hematopoyéticas como se describe en la presente descripción con el uso de experimentación de rutina.

Una composición de células también puede emulsionarse o presentarse como una composición de liposomas, siempre y cuando el procedimiento de emulsificación no afecte negativamente la viabilidad celular. Las células y cualquier otro ingrediente activo pueden mezclarse con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para el uso en los métodos terapéuticos descritos en la presente descripción.

Los agentes adicionales incluidos en una composición de células como se describe en la presente descripción pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables de sus componentes. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, tartárico oxálico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares. Los portadores fisiológicamente tolerables se conocen bien en la técnica. Los portadores líquidos ilustrativos son soluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los ingredientes activos y agua, o contienen un amortiguador tal como fosfato de sodio a valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambos, tales como solución salina regulada por fosfato. Aún más, los portadores acuosos pueden contener más de una sal amortiguadora, así como sales tales como cloruros de sodio y potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además de y para la exclusión del agua. Ejemplos de tales fases líquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodón, y emulsiones de agua en aceite. La cantidad de un compuesto activo usado en las composiciones celulares como se describe en la presente descripción que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección, y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándares.

Administración & Eficacia

Como se usa en la presente descripción, los términos "administrar," "introducir" y "trasplantar" se usan indistintamente en el contexto de la colocación de células, por ejemplo células progenitoras hematopoyéticas, como se describe en la presente descripción en un sujeto, mediante un método o vía que da como resultado la localización al menos parcial de las células introducidas en un sitio deseado, tal como un sitio de lesión o reparación, de modo que se produce(n) un(os) efecto(s) deseado(s). Las células por ejemplo células progenitoras hematopoyéticas, o su progenie diferenciada pueden administrarse por cualquier vía adecuada que dé como resultado el suministro a una ubicación deseada en el sujeto donde al menos una porción de las células implantadas o componentes de las células se mantiene viable. El período de viabilidad de las células después de la administración a un sujeto puede ser tan corto como unas pocas horas, por ejemplo, veinticuatro horas, hasta algunos días, hasta tan largo como varios años, es decir, injerto a largo plazo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una cantidad eficaz de células progenitoras hematopoyéticas se administra por medio de una vía de administración sistémica, tal como una vía intraperitoneal o intravenosa.

Cuando se proporcionan profilácticamente, las células progenitoras hematopoyéticas descritas en la presente descripción pueden administrarse a un sujeto antes de cualquier síntoma de una hemoglobinopatía, por ejemplo, antes del cambio de Y-globina fetal a predominantemente p-globina. Por consiguiente, la administración profiláctica de una población de células progenitoras hematopoyéticas sirve para prevenir una hemoglobinopatía, como se describe en la presente descripción.

Cuando se proporcionan terapéuticamente, las células progenitoras hematopoyéticas se proporcionan en (o después de) la aparición de un síntoma o indicio de una hemoglobinopatía, por ejemplo, tras la aparición de la drepanocitosis.

En algunas realizaciones, la población de células progenitoras hematopoyéticas que se administra de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción comprende células progenitoras hematopoyéticas alogénicas obtenidas de uno o más donantes. Como se usa en la presente descripción, "alogénica" se refiere a una célula progenitora hematopoyética o muestras biológicas que comprenden células progenitoras hematopoyéticas obtenidas de uno o más donantes diferentes de la misma especie, donde los genes en uno o más loci no son idénticos. Por ejemplo, una población de células progenitoras hematopoyéticas que se administra a un sujeto puede derivarse de sangre del cordón umbilical obtenida de uno o más sujetos donantes no relacionados, o de uno o más hermanos no idénticos. En algunas realizaciones, pueden usarse poblaciones de células progenitoras hematopoyéticas singénicas, tales como las obtenidas de animales genéticamente idénticos, o de gemelos idénticos. En otras realizaciones, las células progenitoras hematopoyéticas son células autólogas; es decir, las células progenitoras hematopoyéticas se obtienen o se aíslan de un sujeto y se administran al mismo sujeto, es decir, el donante y el receptor son iguales.

Para el uso en las diversas realizaciones descritas en la presente descripción, una cantidad eficaz de células progenitoras hematopoyéticas, comprende al menos 102 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 5 X 102 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 103 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 5 X 103 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 104 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 5 X 104 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 105células progenitoras hematopoyéticas, al menos 2 X 105 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 3 X 105 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 4 X 105células progenitoras hematopoyéticas, al menos 5 X 105 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 6 X 105 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 7 X 105células progenitoras hematopoyéticas, al menos 8 X 105 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 9 X 105 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 1 X 106células progenitoras hematopoyéticas, al menos 2 X 106 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 3 X 106 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 4 X 106células progenitoras hematopoyéticas, al menos 5 X 106 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 6 X 106 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 7 X 106células progenitoras hematopoyéticas, al menos 8 X 106 células progenitoras hematopoyéticas, al menos 9 X 106 células progenitoras hematopoyéticas, o múltiplos de estos. Las células progenitoras hematopoyéticas pueden derivarse de uno o más donantes, o pueden obtenerse de una fuente autóloga. En algunas realizaciones, las células progenitoras hematopoyéticas se expanden en cultivo antes de la administración a un sujeto que lo necesita.

En una realización, el término "cantidad eficaz" como se usa en la presente descripción se refiere a la cantidad de una población de células progenitoras hematopoyéticas humanas o su progenie necesaria para aliviar al menos uno o más síntomas de una hemoglobinopatía, y se refiere a una cantidad suficiente de una composición para proporcionar el efecto deseado, por ejemplo, tratar a un sujeto que tiene una hemoglobinopatía. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" por lo tanto se refiere a un número de células progenitoras hematopoyéticas o una composición que comprende células progenitoras hematopoyéticas que es suficiente para promover un efecto particular cuando se administra a un sujeto típico, tal como uno que tiene o con riesgo de tener una hemoglobinopatía. Una cantidad eficaz como se usa en la presente descripción también incluirá una cantidad suficiente para prevenir o demorar el desarrollo de un síntoma de la enfermedad, alterar el curso de una enfermedad sintomática (por ejemplo pero no se limita a, enlentecer la progresión de un síntoma de la enfermedad), o revertir un síntoma de la enfermedad. Se entiende que para cualquier caso dado, una "cantidad eficaz" adecuada puede determinarse por un experto en la técnica con el uso de experimentación de rutina.

Como se usa en la presente descripción, "administrado" se refiere al suministro de una composición de células madre hematopoyéticas como se describe en la presente descripción a un sujeto mediante un método o vía que da como resultado la localización al menos parcial de la composición de células en un sitio deseado. Una composición de células puede administrarse mediante cualquier vía adecuada que dé como resultado el tratamiento eficaz en el sujeto, es decir la administración da como resultado el suministro a una ubicación deseada en el sujeto donde al menos una porción de la composición suministrada, es decir al menos 1 x 104 células se suministra al sitio deseado durante un período de tiempo. Los modos de administración incluyen inyección, infusión, instilación, o ingestión. "Inyección" incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intrarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal, e intraesternal. Para el suministro de células, generalmente se prefiere la administración por inyección o infusión.

En una realización, las células como se describe en la presente descripción se administran por vía sistémica. Las expresións "administración sistémica," "administrado por vía sistémica", "administración periférica" y "administrado por vía periférica" como se usa en la presente descripción se refiere a la administración de una población de células progenitoras hematopoyéticas que no es directamente en un sitio, tejido, u órgano diana, de modo que se introduce, en lugar de esto, en el sistema circulatorio del sujeto y, por lo tanto, está sujeta al metabolismo y otros procesos similares.

La eficacia de un tratamiento que comprende una composición como se describe en la presente descripción para el tratamiento de una hemoglobinopatía puede determinarse por el profesional médico de experiencia. Sin embargo, un tratamiento se considera "tratamiento eficaz," como se usa el término en la presente descripción, si cualquiera de uno o todos los signos o síntomas de, como un ejemplo, los niveles de p-globina fetal se alteran de manera beneficiosa, otros síntomas o marcadores de enfermedad clínicamente aceptados mejoran o se alivian, por ejemplo, en al menos 10 % después del tratamiento con un inhibidor. La eficacia también puede medirse por el no agravamiento de un individuo evaluado por hospitalización o necesidad de intervenciones médicas (por ejemplo, la progresión de la enfermedad se detiene o al menos se enlentece). Los métodos para medir estos indicadores se conocen por los expertos en la técnica y/o se describen en la presente descripción. El tratamiento incluye cualquier tratamiento de una enfermedad en un individuo o un animal (algunos ejemplos no limitantes incluyen un ser humano, o un mamífero) e incluye: (1) inhibir la enfermedad, por ejemplo, detener, o enlentecer la progresión de la sepsis; o (2) aliviar la enfermedad, por ejemplo, provocar la regresión de los síntomas; y (3) prevenir o reducir la probabilidad del desarrollo de infección o sepsis.

El tratamiento descrito en la presente descripción alivia uno o más síntomas asociados con un trastorno de p-globina mediante el aumento de la cantidad de hemoglobina fetal en el individuo. Los síntomas asociados típicamente con una hemoglobinopatía, incluyen por ejemplo, anemia, hipoxia tisular, disfunción de órganos, valores de hematocrito anormales, eritropoyesis ineficaz, recuento anormal de reticulocitos (eritrocitos), carga anormal de hierro, la presencia de sideroblastos anillados, esplenomegalia, hepatomegalia, afectación del flujo de sangre periférica, disnea, aumento de la hemolisis, ictericia, crisis de dolor anémico, síndrome de pecho agudo, secuestro esplénico, priapismo, ictus, síndrome de mano-pie, y dolor tal como angina de pecho.

En una realización, la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto ex vivo o in vitro con una endonucleasa dirigida a ADN, y la célula o su progenie se administra al mamífero (por ejemplo, un ser humano). En una realización adicional, la célula progenitora hematopoyética es una célula del linaje eritroide. En una realización, una composición comprende una célula progenitora hematopoyética que se puso en contacto previamente con una endonucleasa dirigida a ADN y un portador farmacéuticamente aceptable y se administra a un mamífero.

En una realización, cualquier método conocido en la técnica puede usarse para medir un aumento en la expresión de hemoglobina fetal, por ejemplo, análisis de transferencia Western de la proteína hemoglobina fetal y cuantificación del ARNm de la Y-globina fetal.

En una realización, la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto con una endonucleasa dirigida a ADN in vitro, o ex vivo. En una realización, la célula es de origen humano (por ejemplo, una célula autóloga o heteróloga). En una realización, la composición provoca un aumento de la expresión de hemoglobina fetal.

Esta invención se ilustra además por el siguiente ejemplo, el cual no debe interpretarse como limitante.

Ejemplo

Los inventores han encontrado y caracterizado elementos reguladores del gen de BCL11A que son críticos para su expresión en células de linaje eritroide. Las variantes genéticas comunes dentro de estas secuencias se asocian con el nivel de hemoglobina fetal y la gravedad del trastorno de beta-globina. Estas secuencias comprenden elementos reguladores distales con una firma de cromatina de potenciador, que posee cromatina accesible, marcas de histonas activas, y ocupación por factores de transcripción eritroides. Estos elementos interactúan con el promotor de BCL11A y promueven la expresión génica en células eritroides pero no en otros linajes que expresan BCL11A tales como linfocitos B. Estos elementos reguladores pueden utilizarse como dianas para propósitos terapéuticos para lograr la inhibición de BCL11A y la reinducción de la hemoglobina fetal. Esto puede lograrse por mecanismos que no se limitan a la edición del genoma, la unión a ácidos nucleicos o proteínas, y la modificación epigenética. Las ventajas de este método incluyen: interrupción de un regulador fisiológico del nivel de hemoglobina fetal que da como resultado el aumento de la producción de gamma-globina y reducción de la producción de beta-globina; efecto mínimo sobre la producción de globina global o sobre la producción o función de glóbulos rojos; limitación del impacto sobre células fuera del linaje eritroide lo que reduce por lo tanto la toxicidad potencial.

Materiales y Métodos

Cultivo de células

Las células CD34+ humanas de sangre periférica movilizada de donantes sanos se obtuvieron de Centros de Excelencia en Hematología Molecular de la Universidad de Yale, New Haven, Connecticut y el Centro de Investigaciones del Cáncer Fred Hutchinson, Seattle, Washington. Las células se sometieron a maduración eritroide ex vivo con un protocolo de cultivo líquido libre de suero en dos fases como se describió previamente (39). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se obtuvieron de donantes sanos de1Hospital Pediátrico de Boston. La diferenciación eritroide a partir de las PBMC se realizó como se describió previamente (40). Las células de eritroleucemia de ratón (MEL) y las células 293T se cultivaron como se describió previamente (39). Las células murinas de linfocitos pre-B con transformación estable de v-Abl (obtenidas como se describió (41)) se cultivaron en RPMI más 2 % de penicilina-estreptomicina, 15 % de FCS, 2 % de HEPES, 1 % de aminoácidos no esenciales, 1 % de piruvato de sodio, 1 % de L-glutamina y 100 pM de p-mercaptoetanol.

ChIP y sensibilidad a DNAsa I

La inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación masiva en paralelo se realizaron como se describió (39). Se usaron los siguientes anticuerpos: H3K27me3 (Millipore, 07-449), H3K4me3 (Millipore, 04-745), H3K4me1 (Abcam, ab8895), H3K27ac (Abcam, ab4729), ARN Polimerasa II (PollI, Santa Cruz, sc-899), GATA1 (Abcam, ab11852) y TAL1 (Santa Cruz, sc-12984). La densidad de escisión por DNAsa I se realizó y se analizó como se describió previamente (42). Para el ChIP-qPCR, el enriquecimiento relativo se determinó mediante la comparación de la amplificación del material de ChIP con 1 % de cromatina inicial por el método de ACt. Los loci previamente informados como ocupados y no ocupados por GATA1 y TAL1 se usaron como controles positivos y negativos respectivamente (39).

Captura de la conformación cromosómica (3C)

El ensayo 3C se realizó como se describió previamente (39) excepto por lo siguiente. Los núcleos de los precursores eritroides humanos primarios reticulados con formaldehído se digirieron con HindIII antes de la ligación y la inversión de las reticulaciones. La PCR en tiempo real cuantitativa se realizó con el uso de la mezcla iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 170-8880). Un fragmento que contiene el promotor de BCL11A se usó como la región de anclaje. Para corregir la eficiencia de amplificación de diferentes cebadores, se preparó una plantilla de control mediante digestión y ligación de una mezcla equimolar de dos cromosomas artificiales bacterianos (BAC) que comprenden el locus de BCL11A humano completo (RP11-606L8 y RP11-139C22) y uno el grupo de p-globinas humanas (CTD-3055E11). Una interacción entre fragmentos en HS1/HS2 y HS3 de la región de control del locus (LCR) de p-globina humana sirvió como control positivo. La frecuencia de interacción se expresó como la amplificación con relación a la interacción de LCR conocida, normalizada respecto a la plantilla BAC de control.

Mapeo fino del locus de BCL11A

Los marcadores (todas las coordenadas son de hg 19) se seleccionaron dentro de los tres DHS del intrón 2 de BCL11A 62 (cro2:60,717.492-60,718.860), 58 (cro2:60,721.411-60,722.674) y 55 (cro2:60,724.802-60,726,084). Se identificaron 21 marcadores a partir de la base de datos del Proyecto 1000 Genomas con el uso de las poblaciones de referencia del norte europeo (CEU), nigeriana (YRI) y afroamericana (ASW) (Tabla S1). 38 variantes adicionales estaban presentes en dbSNP135 (Tabla 2). Los inventores secuenciaron mediante la química de Sanger los tres intervalos de DHS en el ADN de 52 y 36 pacientes con drepanocitosis (SCD) de la cohorte CSSCD con niveles de HbF altos (> 8 %) y bajos (< 2 %), respectivamente. A partir de este esfuerzo de secuenciación, se identificaron siete variantes de secuencia nuevas (Tabla 3). Debido a que la mayoría de los marcadores se agrupan en intervalos genómicos pequeños, no fue posible diseñar ensayos de genotipificación para algunos de ellos. De las 66 variantes no redundantes identificadas en los tres DHS, se realizaron ensayos de genotipificación de 40 marcadores en 1.263 participantes de la CSSCD, una cohorte de SCD en afroamericanos cuyo ADN genómico (ADNg) está disponible y los niveles de HbF se conocen (21). Los marcadores se genotiparon con el uso de la plataforma Sequenom iPLEX. Los individuos y las variantes de secuencia de ADN con una tasa de éxito de genotipificación < 90 % se excluyeron. La concordancia global de los genotipos estimada a partir de muestras triplicadas fue 100 %. Los SNP que pasan el control de calidad (QC; n = 38) se enumeran en las Tablas 2 y 3, y se muestran esquemáticamente en las Figuras 11A y 11B debajo de los tres DHS. Una fracción sustancial de los SNP genotipados son raros en las poblaciones de referencia así que no es sorprendente que sean monomórficos en la CSSCD (n = 18). Después del QC, se mantuvieron 1.178 individuos y 20 SNP polimórficos para el análisis. Los niveles de HbF se modelaron como se describió previamente (9, 43). Los análisis de asociación y condicionales de variantes individuales (MAF > 1 %) se realizaron con PLINK (44) con el uso de regresión lineal bajo un modelo genético aditivo. El análisis de las variantes comunes (MAF > 1 %) reveló que rs 1427407 en DHS 62 tenía la asociación más fuerte con el nivel de HbF (P = 7,23 x 10-50; Figuras 11A y 3B). El análisis condicional demostró que después del condicionamiento en rs1427407 y rs7606173, no más SNP fueron significativos (Figura 3B). El ajuste para los componentes principales (PC) en 855 individuos, cuyos datos de genotipificación del genoma completo estaban disponibles, para explicar la mezcla y otros factores de confusión produjo resultados similares.

Para variantes raras y de baja frecuencia (MAF < 5 %), los inventores realizaron análisis basados en conjuntos con el uso de cada uno de los tres DHS 62, 58 y 55 como la unidad de prueba. Para estos análisis, se usó el programa de prueba de asociación de secuencia kernel (SKAT-O) (45) con los parámetros predeterminados. Los inventores seleccionaron el umbral de 5 % para MAF para maximizar la potencia estadística dado el tamaño de muestra limitado, pero nótese que los marcadores con una MAF entre 1 % y 5 % también se analizaron en el análisis de variantes individuales presentado anteriormente. Esta superposición de variantes se explica con el uso de análisis condicional con las variantes comunes asociadas independientemente con los niveles de HbF. Se encontraron dos conjuntos estadísticamente significativos, específicamente DHS 62 y DHS 55, pero después del condicionamiento en rs1427407 y rs7606173, los resultados ya no fueron estadísticamente significativos, lo que sugiere un LD débil entre las variantes raras/de baja frecuencia y los SNP comunes (Tabla 5). Los inventores no encontraron evidencia de que las variantes de secuencia raras y de baja frecuencia dentro de los DHS de BCL11A influyan en los niveles de HbF en sujetos con SCD, a pesar de la resecuenciación de Sanger de estos DHS en 88 sujetos con fenotipo de HbF extremo.

Las frecuencias de los haplotipos rs1427407-rs7606173 en CSSCD son: T-G 24,5 %, T- C 0,085 %, G-C 42,3 %, G-G 33,1 %. El nivel medio de HbF es 4,05 % (SD 3,10) en 213 individuos rs1427407-rs7606173 G-C, 7,08 % (SD 4,50) en 254 rs1427407-rs7606173 T-G/G-T heterocigóticos y 11,21 % (SD 4,37) en 60 individuos rs1427407-rs7606173 T-G (Figura 3C). Para las comparaciones de los niveles de HbF entre genotipos, los valores de P se determinaron mediante pruebas t de Student de una cola.

Haplotipaje molecular

Para dos SNP heterocigóticos en el mismo cromosoma, existen dos fases posibles: A-B/a-b (modelo 1) y A-b/a-B (modelo 2). Para los SNP dentro del fragmento de 12 kb del intrón 2 de BCL11A 52,0-64,4 kb, la fase se determinó mediante clonación de los productos de PCR y determinación de la codistribución de los alelos de SNP. Para determinar la fase de los alelos de rs7569946 y rs1427407 (separados por 30,1 kb en el cromosoma 2), se realizó PCR de fusión en emulsión como se describió previamente (24, 25) con una modificación menor. La PCR de fusión une dos regiones de interés, de partes separadas del mismo cromosoma, en un solo producto. Al llevar a cabo la reacción en emulsión con microgotas acuosas rodeadas de aceite, la mayoría de los amplicones se derivan de una sola molécula plantilla. El ADN genómico de individuos conocidos por ser heterocigóticos dobles para rs7569946 y rs1427407 sirvió como plantilla en la siguiente reacción de 100 pl (con las concentraciones finales enumeradas): ADN polimerasa KOD Hot Start (14 U, Novagen, 71086), amortiguador KOD (1X), MgSO4 (1,5 mM), dNTP (0,2 mM cada uno), cebadores rs7569946-F y rs1427407-R (1 pM cada uno), cebador rs7569946-R (30 nM), cebador interno conector rs7569946-R-revcomp-rs1427407-F (30 nM), ADNg (200 ng). La reacción acuosa de 100 pl se añadió en forma de gotas con agitación a 200 pl de fase oleosa para crear una emulsión. Dos alícuotas de 125 pl de emulsión se amplificaron en las siguientes condiciones: 95 grados 2 minutos; 45 ciclos de 95 grados 20 segundos, 60 grados 10 segundos, 70 grados 30 segundos; 70 grados 2 minutos. El producto de PCR de fusión extraído con hexano se sometió a PCR anidada en 25 pl de la manera siguiente: ADN polimerasa KOD Hot Start (0,5 U), amortiguador KOD (1X), MgSO4 (1,5 mM), dNTP (0,2 mM cada uno), cebadores rs7569946-nested-F y rs1427407-nested-R (300 nM cada uno), producto de PCR de fusión extraído (75 nl); 95 grados 2 minutos; 35 ciclos de 95 grados 20 segundos, 60 grados 10 segundos, 70 grados 30 segundos; 70 grados 2 minutos. Mediante electroforesis en gel de agarosa se confirmó que el producto anidado constituye una sola banda del tamaño esperado. El producto purificado se clonó con el kit Zero Blunt PCR Cloning (Life Technologies, K2700-20). La secuenciación de Sanger de los amplicones de fusión enumeró clones de 4 secuencias posibles: A-B, a-b, A-b y a-B. La probabilidad de cada fase se calculó en base a una suposición de distribución multinomial (Tabla 6). La relación de probabilidades para las dos configuraciones se calculó como una medida de la significación estadística del ajuste de los datos del modelo de haplotipo 1 (en comparación con el modelo 2). Una relación que se aproxima al infinito sugiere el modelo 1, una relación de 1 sugiere indeterminación y una relación que se aproxima a cero sugiere el modelo 2.

Pirosecuenciación

Los donantes sanos de células CD34+ se tamizaron para identificar cinco donantes heterocigóticos para rs1427407. Estas células CD34+ se sometieron a diferenciación eritroide ex vivo. Se aisló la cromatina y se realizó ChIP con anticuerpos contra GATA1 y TAL1. La cromatina inicial en comparación con el material precipitado con GATA1 o TAL1 se sometió a pirosecuenciación para determinar el equilibrio alélico de rs1427407. Los donantes sanos de CD34+ se tamizaron para identificar tres donantes heterocigóticos para el haplotipo rs1427407-rs7606173 G-C/T-G. Estas células CD34+ se sometieron a diferenciación eritroide ex vivo. El ADN complementario (ADNc) y el ADNg se sometieron a pirosecuenciación para determinar el equilibrio alélico de rs7569946.

Las condiciones de PCR fueron las siguientes: mezcla maestra HotStarTaq 2X (QIAGEN, 203443), MgCh (concentración final 3 mM), ADN plantilla (0,1-1 ng) y cebadores biotinilados directos e inversos específicos de SNP (200 nM cada uno). Las condiciones de termociclado de la PCR fueron: 94 °C 15 min; 45 ciclos de 94 °C 30 s; 60 °C 30 s; 72 °C 30 s; 72 °C 5 min. Un cebador de cada par estaba biotinilado. La cadena del producto de PCR que contiene el cebador biotinilado se unió a perlas de estreptavidina y se combinó con un cebador de secuenciación específico. El ADN monocatenario cebado se secuenció y el genotipo se analizó con el uso del sistema de pirosecuenciación PSQ96 HS (pirosecuenciación de QIAGEN) según las instrucciones del fabricante.

Ratones transgénicos

El constructo reportero de potenciador pWHERE-Dest se obtuvo del Dr. William Pu. Modificado a partir de pWHERE (Invitrogen, pwhere) como se describió previamente (46), el constructo tiene elementos aislantes de H19 murino que flanquean una variante de lacZ libre de CpG dirigida por un promotor mínimo de Hsp68 mínimo con un casete de destino Gateway en el MCS corriente arriba. Los fragmentos de potenciador se amplificaron a partir de ADNg de ratón, se recombinaron en el vector pDONR221 (Invitrogen, 12536-017) mediante BP clonasa (Invitrogen, 11789020) y se recombinaron en el vector pWHERE-Dest con LR clonasa (Invitrogen, 11791020). Los plásmidos se digirieron con PacI para eliminar la cadena principal del vector. Los fragmentos reporteros del potenciador de lacZ se purificaron por electroelución en gel y después se concentraron con el uso del sistema Wizard DNA Clean-Up (Promega, A7280). Los ratones transgénicos se generaron por inyección pronuclear a óvulos fertilizados FVB. Se usó aproximadamente 10 ng/pl de solución de ADN para series de inyecciones. Las hembras CD-1 se usaron como receptores de los embriones inyectados. Los embriones de 10,5 a 14,5 dpc se diseccionaron de las madres sustitutas con montaje completo y tinción de tejidos con X-gal realizados como se describió previamente (47). Los centrifugados celulares teñidos con X-gal se sometieron a tinción de contraste con rojo nuclear rápido (Vector Laboratories, H-3403). Las colas se usaron para la genotipificación por PCR. Los procedimientos en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio del Hospital Pediátrico.

Ensayo de potenciador de precursor eritroide humano

Los fragmentos de ADN genómico que contienen elementos potenciadores putativos se clonaron en pLVX-Puro (Clontech, 632164) corriente arriba de un promotor mínimo de t K y el gen reportero GFP como se describió (39). Las células 293T se transfectaron con el reactivo FuGene 6 (Promega, E2691) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El medio se cambió después de 24 horas a medio SFEM complementado con 2 % de penicilina-estreptomicina, y después de 36 horas, el sobrenadante se recogió y se filtró. Los cultivos eritroides derivados de células CD34+ se transdujeron con lentivirus en los días 4 y 5 de la expansión por infección por centrifugación como se describió previamente (39). Las células se resuspendieron en medio de diferenciación eritroide 24 horas después de la segunda infección. La selección con puromicina a 1 pg/ml comenzó 48 horas después de la infección. Las células transducidas se analizaron por citometría de flujo después de cinco días en medio de diferenciación en cuanto a la intensidad de fluorescencia media de GFP.

Citometría de flujo

Las células vivas se separaron en portales por exclusión de 7-aminoactinomicina D (7-AAD, BD Pharmingen, 559925). Se aislaron suspensiones de médula ósea (para eritroblasto) y bazo (para linfocito) de ratones transgénicos adultos jóvenes. Después de la lisis hipotónica de los glóbulos rojos maduros, las células vivas (7-AAD-) se clasificaron en base a la tinción con CD71-biotina (BD, 557416), estreptavidina-APC (BD, 554067), Ter-119-PE (BD, 553673), CD19-APC (BD, 550992) o CD3-PE (BD, 100308). Las poblaciones CD71+Ter119+, CD19+ y CD3+ clasificadas se usaron para obtener centrifugados celulares y el aislamiento de ARN.

Deleción cromosómica mediada por TALEN

Las nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción (TALEN) se diseñaron para generar escisiones en el intrón 2 de Bcl11a de ratón en los sitios 50,4 kb (denominado sitio 5') y 60,4 kb (sitio 3') con relación al TSS. Las TALEN reconocen las siguientes secuencias: CTTAAGGCAAGAATCACT (5' izquierda), CCATGCCTTTCCCCCCCT (5' derecha), GAGTTAAAATCAGAAATCT (3' izquierda), CTGACTAATTGATCAT (3' derecha). Las TALEN se sintetizaron con clonación Golden Gate (48) con el uso de la NN RVD para reconocer G. Los dominios de unión a ADN sintetizados se clonaron en pcDNA3.1 (Invitrogen, V790-20) con el dominio nucleasa de FokI, el dominio A152 N-terminal y el dominio 63 C-terminal previamente descritos (49). Se suministraron 2,5 |jg de cada uno de los cuatro plásmidos con TALEN con 0,5 jg de pmaxGFP (Lonza) a 2 x 106 células MEL o pre-B mediante electroporación según el protocolo del fabricante (Lonza, VCA-1005). Las células positivas para GFP se clasificaron por citometría de flujo después de 48 horas. Las células se sembraron por dilución limitante en placas de 96 pocillos para aislar clones individuales. Los clones se tamizaron por PCR de ADNg para detectar la amplificación de un producto corto de corriente arriba del sitio 5' y corriente abajo del sitio 3' que indica deleción del segmento intermedio. Los clones con deleción monoalélica se sometieron a una segunda ronda de deleción mediada por TALEN para obtener clones con deleción bialélica. Los clones con deleción bialélica se identificaron mediante la detección de la ausencia de amplificación dentro del fragmento eliminado. La frecuencia de deleción fue aproximadamente uno en 50 alelos. La deleción se validó con transferencia Southern. El ADN genómico se digirió con Bmtl; una sonda de 561 pb (amplificada a partir del ADNg corriente arriba del sitio 5') se hibrida a un fragmento de 3,6 kb del alelo de tipo silvestre y un fragmento de 8,9 kb del alelo con deleción de A50,4-60,4.

RT-qPCR e inmunotransferencia

El aislamiento de ARN con columnas RNeasy (Qiagen, 74106), la transcripción inversa con el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad, 170-8890), la qPCR con la mezcla iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 170-8880) y la inmunotransferencia se realizaron como se describió (39). Para los genes del grupo de p-globinas, un par de cebadores común reconoce las p-globinas p2 y p1 del adulto mientras que cebadores independientes reconocen las p-globinas sy y pH1 embrionarias. Los siguientes anticuerpos se usaron para la inmunotransferencia: BCL11A (Abcam, ab19487), GAPDH (Santa Cruz, sc-25778).

Resultados

Los estudios de asociación del genoma completo (GWAS) han determinado numerosas variantes genéticas comunes asociadas con rasgos, frecuentemente localizadas en el ADN regulador. La hipótesis de que la variación de la regulación puede explicar la heredabilidad sustancial se ha sometido a poca evaluación experimental. Aquí los inventores demuestran que una variación genética común en BCL11A asociada con el nivel de hemoglobina fetal (HbF) indica secuencias no codificantes decoradas por una firma de cromatina de potenciador eritroide. El mapeo fino dentro de este ADN regulador putativo revela una variante común de interrupción de motivo asociada con la reducción de la unión de factores de transcripción, la disminución de la expresión de BCL11A, y la elevación de HbF. Las secuencias circundantes funcionan in vivo como un potenciador de linaje restringido específico de la etapa del desarrollo. Mediante la modificación del genoma, se demostró que este potenciador se requiere para la expresión eritroide de BCL11A no obstante es prescindible fuera del linaje eritroide. Estos resultados ilustran cómo GWAS puede resaltar variantes funcionales de impacto modesto dentro de elementos causales esenciales para la expresión génica adecuada. El potenciador de BCL11A marcado por GWAS representa una diana terapéutica favorable para los trastornos de las p-globinas.

El GWAS ha tenido un éxito enorme en la identificación de muchos cientos de polimorfismos de nucleótido simple (SNP) comunes asociados con rasgos y enfermedades humanas. Sin embargo el paso de la asociación genética a procesos biológicos causales frecuentemente ha sido difícil. Los retos incluyen el gran número de variantes correlacionadas que pueden asociarse con rasgos individuales (debido al desequilibrio de ligamiento (LD)), el tamaño de efecto modesto de muchas asociaciones entre variante y rasgo, y la ubicación de muchas variantes asociadas en el genoma no codificante. Estudios recientes de mapeo de la cromatina a escala genómica han resaltado el enriquecimiento de variantes de GWAS en elementos reguladores de ADN, lo que sugiere que muchas variantes causales pueden afectar la regulación génica. No obstante, pocos ejemplos que confirman la significación de variantes o elementos causales se han demostrado experimentalmente.

El GWAS del nivel de HbF ha sido particularmente sorprendente. La variación genética en solo tres loci (HBB, HBS1L-MYB, y BCL11A) explica hasta 50 % de la variación hereditaria en el nivel de HbF. Las mismas variantes se asocian también con la gravedad clínica de las principales p-globinopatías, la drepanocitosis y la p-talasemia, quizás no es sorprendente dado que la HbF es el principal modificador de estos trastornos. El trabajo del laboratorio de los inventores y de otros han validado que BCL11A es un regulador directo de los niveles de HbF. BCL11A es un represor transcripcional que reside dentro de complejos multiproteicos que ocupan el grupo de genes de p-globinas. Si bien la deficiencia constitutiva de BCL11A da como resultado la letalidad embrionaria y la afectación del desarrollo linfocitario, la deficiencia eritroide específica de BCL11A contrarresta el silenciamiento durante el desarrollo de genes de globinas embrionarias y fetales y es suficiente para rescatar las características hematológicas y patológicas de la drepanocitosis en modelos de ratón. Por lo tanto BCL11A ha surgido como una nueva diana terapéutica para los trastornos de las pglobinas. Es imperativo entender las consecuencias de la afectación de BCL11A. Las variantes codificantes humanas de BCL11A no se han descrito a pesar de los esfuerzos de resecuenciación a gran escala. Las variantes de BCL11A asociadas con los niveles de HbF residen en regiones no codificantes de BCL11A. Para entender más aún cómo la variación genética común impacta a BCL11A, al nivel de HbF, y a la gravedad de los trastornos de las p-globinas, el papel de las variantes asociadas a HbF se investigó en detalle.

Variantes asociadas a rasgos cercanas a potenciadores eritroides

Se han realizado numerosos GWAS así como estudios de seguimiento de mapeo fino de rasgos eritroides (que incluyen fenotipos tales como número y volumen de eritrocitos, concentración de hemoglobina, y nivel de HbF), con la identificación de 636 SNP asociados a rasgos de significación en el genoma completo (p<5e-8). Estos SNP están enriquecidos en promotores y regiones codificantes en comparación con SNP aleatorios (Figura 1). Aún así la mayoría de los SNP residen en otra parte en el genoma. Se realizó un perfil de cromatina global de precursores eritroides humanos primarios, que identificó un conjunto amplio de potenciadores eritroides distales definidos por modificaciones características a las histonas e hipersensibilidad a DNAsa I. Se observó una fuerte colocalización de SNP de GWAS eritroides con potenciadores en comparación con SNP asociados a rasgos no eritroides, SNP encontrados en un arreglo de genotipificación común, o SNP permutados aleatoriamente. El 13,5 % de los SNP asociados a rasgos eritroides caen directamente en potenciadores eritroides, un enriquecimiento de 11,4 veces respecto a potenciadores permutados aleatoriamente (P < 1 x 10'4), en comparación con 1,4 % de SNP asociados a rasgos no eritroides, que representan un enriquecimiento de 1,4 veces (P = 0,0013). Muchos de los SNP asociados a rasgos eritroides se encontraron en estrecha proximidad a potenciadores eritroides (Figura 1B). La distancia media al potenciador eritroide fue 16,0 kilobases (kb) para SNP asociados a rasgos eritroides, en comparación con 238,0, 392,6, y 482,4 kb respectivamente para SNP asociados a rasgos no eritroides, de arreglo de genotipificación, y permutados aleatoriamente. Estos resultados indican que una fracción sustancial de variantes comunes asociadas con rasgos eritroides reside en o cerca de potenciadores eritroides, y son consistentes con la hipótesis de que las variantes causales frecuentemente influyen en la regulación génica dependiente del contexto.

El GWAS de HbF marca una firma de potenciador eritroide

Se han realizado seis GWAS del nivel de HbF (o el rasgo altamente correlacionado número de células F), que incluyen poblaciones de ascendencia europea, africana, y asiática. Cada uno ha identificado variantes asociadas al rasgo dentro de BCL11A. Se estima que la variación en BCL11A explica ~15 % de la variación del rasgo. Cuatro SNP diferentes se han identificado como los más altamente asociados con el rasgo (rs1427407, rs11886868, rs4671393, y rs766432; estos denominados SNP "centinelas" se agrupan dentro de 3 kb entre sí en el intrón 2 de BCL11A (Figura 2A). Los haplotipos que incluyen los SNP centinelas parecen explicar mejor la asociación con HbF que cualquier SNP individual. Cincuenta SNP en el locus BCL11A y veintisiete SNP dentro del intrón 2 se han asociado con el nivel de HbF con significación al menos en el genoma completo (P < 5 x 10'8).

La distribución de los SNP asociados a HbF en BCL11A se comparó con la sensibilidad a DNAsa I, un indicador del estado de la cromatina que sugiere el potencial regulador. En precursores eritroides humanos, se observaron tres picos de hipersensibilidad a DNAsa I en el intrón 2, adyacentes a y superpuestos con las variantes asociadas a HbF (Figura 2A), denominados sitios hipersensibles a DNAsa I (DHS) 62, 58, y 55 en base a la distancia en kb del TSS de BCL11A. Cerebro y linfocitos B, dos tejidos que expresan altos niveles de BCL11A, y linfocitos T, que no expresan BCL11A apreciable, muestran patrones únicos de sensibilidad a DNAsa I en el locus BCL11A, con una escasez de superposición de hipersensibilidad a DNAsa I con los SNP asociados a rasgos (Figura 2A).

La firma de cromatina alrededor del locus BCL11A se analizó además por inmunoprecipitación de la cromatina con secuenciación masiva en paralelo (ChIP-seq). El análisis ChIP-seq de precursores eritroides humanos primarios reveló modificaciones a las histonas con una firma de potenciador que se superpone con los SNP asociados a rasgos en el intrón 2 de BCL11A, que incluye la presencia de las marcas H3K4me1 y H3K27ac y la ausencia de H3K4me3 y H3K27me3 (Figura 2A). Los factores de transcripción eritroides maestros GATA1 y TAL1 ocupan esta región potenciadora (Figura 2A). Los experimentos de ChIP-qPCR demostraron tres picos discretos de unión a GATA1 y TAL1 dentro del intrón 2 de BCL11A, cada uno cae dentro de un DHS eritroide (Figura 2B).

Una característica común de los elementos reguladores distales es la interacción de largo alcance con los promotores cuya expresión regulan. Se evaluaron las interacciones entre el promotor de BCL11A y fragmentos a 250 kb del locus BCL11A, que incluyen secuencias corriente arriba, corriente abajo, e intragénicas. La mayor interacción con el promotor se observó dentro de la región del intrón 2 que contiene el DHS eritroide y SNP asociados a rasgos (Figura 2C). Estos resultados indican que estas secuencias tienen potencial regulador.

Variantes reguladoras

Se planteó la hipótesis de que los SNP asociados a rasgos causales podrían funcionar mediante la modulación de elementos reguladores en cis críticos. Por lo tanto, se realizó la genotipificación extensiva de SNP dentro de los tres DHS eritroides 62, 58, y 55 en 1.263 muestras de ADN del Estudio cooperativo de drepanocitosis (CSSCD), una cohorte de drepanocitosis en afroamericanos cuyo ADN genómico estaba disponible y los niveles de HbF se conocen. A partir de la dbSNP se identificaron 66 variantes de secuencia de ADN ubicadas en los tres DHS de las poblaciones de referencia CEU, YRI, y ASW dentro del Proyecto 1000 Genomas, y por secuenciación de Sanger 88 individuos de la CSSCD con fenotipo de HbF extremo. No se pudo diseñar el ensayo de genotipificación de 26 marcadores y 18 eran monomórficos (Tablas 1 y 2). Después del control de calidad, se mantuvieron 1.178 individuos y 20 SNP polimórficos para la prueba de asociación. El análisis de variantes comunes (frecuencia del alelo menos común (MAF) > 1 %) reveló que rs1427407 en DHS 62 tenía la asociación más fuerte con el nivel de HbF (P = 7,23 x 10-50; Tabla 1).

Previamente, los inventores habían usado la CSSCD para el mapeo fino de la señal de asociación con HbF en el locus BCL11A e informaron una fuerte asociación con rs4671393; en ese estudio, se imputó rs1427407. Dos SNP adicionales, rs766432 y rs11886868 también se habían identificado en estudios previos como los SNP centinelas más altamente asociados con el nivel de HbF (o número de células F). En un subconjunto de individuos (N = 728) cuyos genotipos en los cuatro SNP centinelas se conocen, cuando se condicionaron en los genotipos a rs1427407, el resultado de asociación no fue significativo en rs4671393, rs766432, o rs11886868; por el contrario, la asociación se mantuvo altamente significativa para rs1427407 cuando se condicionó en rs4671393, rs766432, o rs11886868 (Tabla 3). Por lo tanto, rs1427407 es el SNP más asociado con HbF dentro de los DHS eritroides y explica mejor la asociación al rasgo que otros SNP centinelas descritos previamente.

Cuando se condicionó en rs1427407, se encontraron otras asociaciones con el nivel de HbF dentro de los tres DHS que no se perdieron completamente (Tabla 1). La asociación más significativa restante fue para rs7606173 en DHS 55 (P = 5,11 x 10-10); rs7599488 en DHS 58, que se informó previamente, solo fue ligeramente menos significativa (P = 1,71 x 10-9) en este análisis condicional. Después del condicionamiento en rs1427407 y rs7606173, no más SNP fueron significativos (Tabla 1). El ajuste para los componentes principales (PC) en 855 individuos, cuyos datos de genotipificación del genoma completo estaban disponibles, para explicar la mezcla y otros factores de confusión produjo resultados similares (no se muestran los datos). El haplotipo rs1427407-rs7606173 T-G se definió como el más altamente asociado con el nivel de HbF.

Las variantes raras y de baja frecuencia (MAF < 5 %) también se analizaron en cuanto a su asociación con los niveles de HbF con el uso de cada uno de los tres DHS 62, 58, y 55 como conjunto de prueba. Se encontraron dos conjuntos significativos, específicamente DHS 62 y DHS 55, pero después del condicionamiento en rs1427407 y rs7606173, los resultados ya no fueron significativos, lo que indica un LD débil entre las variantes raras/de baja frecuencia y los SNP comunes (Tabla 4). Por lo tanto, no se encontró evidencia de que las variantes de secuencia raras y de baja frecuencia dentro de los DHS de BCL11A influyan en los niveles de HbF en pacientes con SCD, a pesar de la resecuenciación de Sanger de 88 individuos de CSSCD con fenotipo HbF extremo.

El SNP rs1427407 cae dentro de un pico de unión a GATA1 y TAL1 como se determina por ChIP-seq y ChIP-qPCR (Figuras 2A y 2B). El alelo T menos frecuente interrumpe el nucleótido G de un elemento de secuencia que se asemeja mucho a un motivo compuesto media-caja-E/GATA [CTG(n9)GATA]. Se ha descubierto por experimentos de ChIP-seq que este motivo se encuentra altamente enriquecido en complejos de GATA1 y TAL1 en células eritroides. Se identificaron muestras de células eritroides primarias de individuos heterocigóticos en cuanto al alelo G más frecuente y el alelo T menos frecuente en rs1427407 y estas muestras se sometieron a ChIP seguido de pirosecuenciación. Los inventores identificaron un equilibrio uniforme de alelos en el ADN inicial. Sin embargo se observó unión más frecuente al alelo G en comparación con el alelo T de aproximadamente 60:40 en las muestras de cromatina inmunoprecipitada con GATA1 y Ta L1 (Figura 3A).

Se informó previamente que el alelo A de rs4671393 asociado a HbF alta se asoció con la expresión de BCL11A en líneas de células linfoblastoides humanas. Los inventores no pudieron reproducir una asociación significativa entre el genotipo de BCL11A y el nivel de expresión mediante el análisis de un conjunto grande de líneas de células linfoblastoides (no se muestran los datos). Se especuló que el haplotipo rs1427407-rs7606173 asociado a HbF alta influye en la expresión de BCL11A en un contexto eritroide específico. El SNP sinónimo común rs7569946 cae dentro del exón 4 de BCL11A y puede servir como un marcador de expresión alélica. Se identificaron tres muestras de células eritroides humanas primarias heterocigóticas dobles para el haplotipo rs1427407-rs7606173 y rs7569946. Las muestras se sometieron a haplotipaje molecular mediante PCR de fusión en emulsión. El haplotipaje demostró que para cada muestra el alelo G de rs7569946 más frecuente estaba en fase con el haplotipo rs1427407-rs7606173 G-C asociado a HbF baja. El ADN genómico y el ADNc se ensayaron por pirosecuenciación de rs7569946 para determinar el equilibrio alélico. Mientras que los alelos estaban equilibrados en el ADN genómico, se observó un desequilibrio significativo en el ADNc que favorece el aumento de la expresión del alelo G de rs7569946 ligado a HbF baja (Figura 3B). Estos resultados indican que el alelo T de rs1427407 de HbF alta, que interrumpe el motivo media-caja-E/GATA, se asocia con la reducción de la unión de GATA1 y TAL1 y la reducción de la expresión de BCL11A en precursores eritroides. El nivel medio de HbF en 60 individuos homocigóticos con haplotipo rs1427407-rs7606173 T-G de HbF alta fue 11,21 % en comparación con 4,05 % en 213 individuos homocigóticos con haplotipo rs1427407-rs7606173 G-C de HbF baja (P = 2,5 x 10'19) (Figura 3C). En resumen, la evidencia siguiente indica que rs1427407 es un SNP causal para el nivel de HbF: tiene la asociación más alta con el fenotipo de cualquier variante conocida, explica las asociaciones observadas con SNP centinelas descritos previamente, impacta un motivo requerido para la unión a GATA1 y TAL1, y se asocia con la unión a GATA1 y TAL1 así como con la expresión de BCL11A. Sin embargo, la variación en esta posición en el entorno de haplotipos comunes se asocia con una perturbación solo modesta de la expresión de BCL11A.

Suficiencia del potenciador para la expresión eritroide

Para entender el contexto dentro del cual estos SNP asociados a rasgos reguladores aparentes desempeñan su papel, se exploró la función de los elementos reguladores en cis que los albergan. Los inventores clonaron ~12 kb (+52,0­ 64,4 kb de TSS) que contenían los tres DHS eritroides, y se ensayó el potencial potenciador en un ensayo reportero transgénico. En este ensayo las secuencias potenciadoras putativas se posicionan corriente arriba de un promotor mínimo (Hsp68) y un gen reportero (lacZ) delimitado por secuencias aislantes. Los constructos se introdujeron a cigotos murinos con control de la expresión del gen reportero en el desarrollo. El BCL11A endógeno de ratón mostró expresión abundante en el desarrollo del sistema nervioso central con una expresión mucho menor observada en el hígado fetal. En contraste, se observó que la expresión del gen reportero en los embriones transgénicos se confina en gran medida al hígado fetal, el sitio de eritropoyesis definitiva, con menor expresión observada en el sistema nervioso central (Figura 4A).

Un elemento característico de los genes de globinas es su regulación por el desarrollo. Durante el desarrollo humano, la s-globina derivada del saco vitelino se sustituye en el primer trimestre por la Y-globina derivada del hígado fetal. Cerca del nacimiento, la Y-globina se silencia gradualmente y la p-globina se activa. Existe solamente un único cambio en la expresión génica durante la ontogenia del ratón. Durante esta transición, que se produce a mitad de la gestación, los eritrocitos primitivos circulantes derivados del saco vitelino expresan las globinas sy y pH1 de la etapa embrionaria mientras que los eritroblastos definitivos del hígado fetal expresan las globinas p1 y p2 de la etapa adulta. En concordancia con este cambio en el desarrollo, la expresión de BCL11A se expresa en el linaje eritroide definitivo pero no en etapa primitiva. Se obtuvieron líneas transgénicas estables de los ratones reporteros de BCL11A+52,0-64,4. En estos ratones a E12,5 los eritrocitos circulantes no se tiñen para X-gal mientras que los eritroblastos hepáticos se tiñen positivos de manera robusta (Figura 4B). A E10,5 la expresión de lacZ se observa solamente en el primordio del hígado fetal y no en la sangre circulante dentro del embrión, la placenta, o el saco vitelino (Figura 6A). Estos resultados indican que las secuencias reguladoras del intrón 2 de BCL11A marcadas por GWAS son suficientes para especificar la expresión génica adecuada durante el desarrollo.

Dentro del compartimento hematopoyético, la expresión de BCL11A se encuentra en precursores eritroides y linfocitos B. Se aislaron precursores eritroides y linfocitos B de animales transgénicos adultos jóvenes y se evaluó la expresión del reportero lacZ. El BCL11A endógeno se expresó a niveles 10,4 veces más altos en linfocitos B esplénicos en comparación con los precursores eritroides de médula ósea. Sin embargo, la expresión de lacZ se restringió a los precursores eritroides y no se observó en linfocitos B (Figura 4C). Estos resultados indican la especificidad eritroide de estas secuencias reguladoras.

Una serie de mutantes de deleción se generó para refinar los elementos mínimos requeridos para la actividad del potenciador eritroide. Las secuencias que contienen el DHS central 58 fueron suficientes para la actividad del potenciador eritroide. Las secuencias que contienen solamente los elementos flanqueantes 62 o 55 no fueron capaces de dirigir la expresión génica eritroide (Figura 6B). Estos DHS también se probaron en cuanto a su capacidad de aumentar la expresión génica en precursores eritroides humanos primarios. Los inventores usaron el suministro lentiviral de un sistema reportero de GFP con un promotor mínimo de Tk como se describió previamente. De manera similar, solamente el DHS 58 pero no el 55 o 62 fue capaz de aumentar la expresión génica en este ensayo reportero (Figura 7).

Necesidad del potenciador para la expresión eritroide

A continuación los inventores eligieron determinar la necesidad de estas secuencias reguladoras para la expresión adecuada de los genes de BCL11A y globinas. La inspección del locus Bel11a en el perfil de cromatina global publicado previamente de células eritroides de ratón reveló que esta región de intrón 2 posee una firma de potenciador ortólogo con presencia de H3K4me1 y H3K27ac, ausencia de H3K4me3 y H3K27me3, y ocupación por GATA1 y TAL1 (Figura 8). Por otra parte, se observó hipersensibilidad a DNAsa I eritroide específica en estas secuencias. En cada uno de los DHS eritroides humanos 62, 58, y 55, se observó evidencia de conservación evolutiva de las secuencias, particularmente dentro de 62 y 55. Para determinar la necesidad de estas secuencias reguladoras ortólogas para la expresión de BCL11A, se usó la línea de células de eritroleucemia de ratón (MEL). Estas células dependen de la expresión de BCL11A para un patrón de expresión génica de globinas de la etapa adulta adecuado. Las nucleasas específicas de secuencia pueden dar como resultado la producción de pequeñas deleciones cromosómicas. Las TALEN se modificaron genéticamente para introducir rupturas bicatenarias para flanquear las secuencias ortólogas de 10 kb del intrón 2 de Bcl11a que portan la firma de cromatina de potenciador eritroide. Los clones se tamizaron en cuanto a la reparación mediada por NHEJ y se aislaron tres clones únicos que habían experimentado escisión bialélica. La PCR y la transferencia Southern verificaron la escisión del segmento intrónico dentro de los clones (Figura 9). Los puntos de ruptura secuenciados por Sanger eran característicos de la escisión mediada por TALEN con posterior reparación por NHEJ (Figura 10).

La expresión de BCL11A se analizó en las células MEL con deleción intrónica bialélica de 10 kb. Se observó una reducción drástica de la expresión de BCL11A a ~3 % de los niveles basales (Figura 5A). Se observaron reducciones similares con pares de cebadores que detectan uniones de exones corriente arriba, que abarcan, o corriente abajo de la deleción. Por transferencia Western, la expresión de BCL11A no fue detectable en los clones con deleción del potenciador de 10 kb (Figura 5B). Las células MEL expresan típicamente niveles altos de los genes de globinas p1 y p2 del adulto y niveles bajos de los genes de globinas sy y pH1 embrionarias. En ausencia del potenciador de 10 kb para BCL11A, la expresión de genes de globinas del adulto disminuyó en ~2-5 veces, mientras que los genes de globinas embrionarias se desreprimieron considerablemente. La relación de sy embrionaria respecto a p1/2 del adulto aumentó en un promedio de 364 veces en los tres clones que carecen del potenciador eritroide ortólogo de BCL11A (Figura 5C).

Para determinar si las secuencias intrónicas 50,4-60,4 kb se requerían universalmente para la expresión de BCL11A, se evaluó su pérdida en un contexto no eritroide. La misma estrategia de introducción de dos pares de TALEN para obtener clones con la deleción de A50,4-60,4 mediada por NHEJ se empleó en una línea celular de linfocitos pro-B. Se aislaron dos clones únicos A50,4-60,4, y se verificaron por PCR, transferencia Southern, y secuenciación de Sanger (Figuras 9 y 10). A diferencia de las células eritroides, la expresión de BCL11A se conservó en los clones de células pro-B con deleción del potenciador A50,4-60,4 kb a ambos niveles de ARN y proteína (Figuras 5A y 5B). Estos resultados indican que las secuencias potenciadoras eritroides ortólogas no se requieren para la integridad de la transcripción del locus Bcl11a sino que solo son esenciales para la expresión génica eritroide.

Una firma de cromatina de potenciador se encontró en el intrón 2 de BCL11A, en superposición directa con los SNP asociados a HbF. Esta región tenía numerosas características bioquímicas de un potenciador, que incluyen ocupación por las marcas de histonas H3K4me1 y H3K27ac en ausencia de H3K4me3 y H3K27me3, unión de los TF eritroides GATA1 y TAL1, sitios de hipersensibilidad a DNAsa-I eritroide específicos, e interacción promotora de largo alcance por 3C. Por otra parte, los inventores fueron capaces de realizar el mapeo fino de este locus, con el uso de los DHS como guía, para identificar el SNP rs1424707 como el más altamente asociado con el rasgo, y explicar totalmente la asociación al rasgo de los SNP centinelas descritos previamente y altamente ligados. Además, en la presente descripción se demuestra que rs1427407 interrumpe un motivo media-caja-E/GATA ocupado por los factores de transcripción GATA1 y TAL1 en precursores eritroides. Sin embargo, incluso después del condicionamiento en rs1427407 se mantiene una asociación con varios otros SNP en DHS adyacentes lo que indica un efecto del haplotipo. Se descubrió que los haplotipos que poseen una combinación de genotipos de SNP en elementos adyacentes que modulan cada uno la función reguladora cooperan para proporcionar el fenotipo final de expresión de BCL11A. Con el uso de donantes heterocigóticos, se demostró un impacto modesto del haplotipo asociado a HbF alta sobre la unión a TF y la expresión de BCL11A.

Estos estudios ayudan a estimar el cambio en la expresión de BCL11A requerido para dar como resultado un aumento clínicamente significativo en el nivel de HbF en pacientes con trastornos de las p-globinas. La diferencia en la expresión de BCL11A entre los haplotipos rs1427407-rs7606173 T-G de HbF alta y G-C de HbF baja fue 1,7 veces y los niveles de HbF de homocigóticos T-G y G-C fueron 11,2 % y 4,1 % (Figuras 3B y 3C). Se ha predicho que niveles de HbF de >20 % previenen las consecuencias adversas de la SCD. Una reducción en la expresión de BCL11A de varias veces posiblemente se aproximaría a este objetivo de HbF.

Este estudio identifica la variación reguladora en BCL11A que impacta a un potenciador eritroide. Muchos SNP asociados a rasgos son no codificantes y tienen un tamaño de efecto relativamente pequeño. Debido a estas características, estos SNP en ocasiones se consideran de importancia clínica insignificante. Este estudio ilustra que un tamaño de efecto pequeño engendrado por una variante no codificante individual no descarta un tamaño de efecto grande del elemento regulador subyacente. Por ejemplo, a pesar de un impacto relativamente modesto de los SNP funcionales sobre la expresión del gen diana BCL11A subyacente, los elementos reguladores causales son esenciales para la expresión de BCL11A y los genes de globinas en precursores eritroides de la etapa adulta. El mismo elemento regulador es prescindible para la expresión de BCL11A en un linaje no eritroide. Un objetivo del estudio de los alelos protectores es entender sus mecanismos moleculares subyacentes en un esfuerzo para reproducir su efecto biológico en individuos de alto riesgo. Por lo tanto, muchos polimorfismos asociados a rasgos residirán en elementos reguladores críticos específicos del contexto cuya función puede iluminar aún más la biología subyacente del rasgo más allá de la simple identificación del gen regulado. Por ejemplo, la pérdida de BCL11A si bien da como resultado la afectación del cambio de hemoglobinas también da como resultado la afectación de la neurogénesis y la linfopoyesis y da como resultado la letalidad embrionaria. En última instancia una mejor comprensión de los elementos reguladores causales y de las redes de regulación asociadas subyacentes a estos rasgos podría identificar nuevas diana terapéuticas. El potenciador eritroide de BCL11A podría en sí mismo constituir una diana favorable para la edición del genoma con fines terapéuticos dado que la ablación podría impedir la expresión de BCL11A en precursores eritroides con la desrepresión de HbF resultante mientras se mantiene la expresión de BCL11A en linajes no eritroides.

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38. Agradecimientos a A. Woo, A. Cantor, M. Kowalczyk, S. Burns, J. Wright, J. Snow, J. Trowbridge y los miembros del laboratorio Orkin, particularmente a C. Peng, P. Das, G. Guo, M. Kerenyi, y E. Baena, por los debates. C. Guo y F. Alt proporcionaron la línea celular pre-B, A. He y W. Pu el constructo reportero pWHERE lacZ, C. Currie y M. Nguyen asistencia técnica, D. Bates y T. Kutyavin su experticia con el análisis de secuencias, R.

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Tabla 1 Análisis de asociación de SNP comunes en los DHS de BCL11A 62, 58, o 55

Tabla 2 SNP dentro de los DHS de BCL11A 62, 58, o 55

Tabla 3 | Marcadores adicionales encontrados por resecuenciación de Sanger

Tabla 5 Análisis de variantes raras de baa frecuencia

T l n i i n l P R f i n n m li n r h l i

T l 7 r n l fr m n r n r r r

Tabla 8. Secuencias de oligonucleótidos.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una célula progenitora hematopoyética humana que tiene disminución del ARNm o la expresión proteica de BCL11A, comprendiendo el método poner en contacto ex vivo o in vitro una célula progenitora hematopoyética aislada con una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que codifica una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN une o escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 (de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano hg 19 del navegador genómico de la UCSC), y causa una deleción de uno o más sitios hipersensibles a la ADNasa 1 (DHS) 62, 58 y 55, reduciendo así el ARNm o la expresión proteica de BCL11A.

2. Un método para aumentar los niveles de hemoglobina fetal en una célula progenitora hematopoyética, comprendiendo el método las etapas de: poner en contacto ex vivo o in vitro una célula progenitora hematopoyética aislada con una cantidad eficaz de una composición que comprende una endonucleasa dirigida al ADN o un vector que codifica una endonucleasa dirigida al ADN mediante la cual la endonucleasa dirigida al ADN se une y escinde el ADN genómico de la célula progenitora hematopoyética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 causando al menos una modificación genética en el mismo, en donde la al menos una modificación genética es una deleción de uno o más sitios hipersensibles a la ADNasa 1 (DHS) 62, 58 y 55, por lo que la expresión de hemoglobina fetal aumenta en dicha célula, o su progenie, en relación con dicha célula antes de dicho contacto.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el progenitor hematopoyético es una célula del linaje eritroide.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la deleción elimina la región completa entre la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la endonucleasa dirigida al ADN es una nucleasa con dedos de zinc.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la endonucleasa dirigida al ADN comprende un dominio de unión al ADN de TAL.

7. Una célula humana aislada modificada genéticamente que comprende al menos una modificación genética en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, en la que la al menos una modificación genética es producida por una endonucleasa dirigida al ADN que se une y escinde el ADN genómico en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2, y en la que la al menos una modificación genética es una deleción de uno o más sitios hipersensibles a la ADNasa 1 (DHS) 62, 58 y 55.

8. La célula humana aislada modificada genéticamente de la reivindicación 7, en la que la endonucleasa dirigida al ADN es una nucleasa con dedos de zinc.

9. La célula humana aislada modificada genéticamente de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en la que la endonucleasa dirigida al ADN comprende un dominio de unión al ADN de TAL.

10. Una composición que comprende una célula humana aislada modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9.

11. Una célula progenitora hematopoyética humana aislada para el uso en el aumento de los niveles de hemoglobina fetal en un humano que lo necesita, en donde la célula progenitora hematopoyética aislada se ha puesto en contacto ex vivo o in vivo con una cantidad eficaz de una composición que comprende una endonucleasa dirigida a ADN o un vector que codifica una endonucleasa dirigida a ADN de manera que la endonucleasa dirigida a ADN une y escinde el ADN genómico de la célula en la ubicación 60,716,189-60,728,612 del cromosoma 2 lo que provoca al menos una modificación genética en esta, en donde la al menos una modificación genética es una deleción de uno o más sitios hipersensibles a la ADNasa 1 (DHS) 62, 58 y 55.

12. La célula progenitora hematopoyética humana aislada de la reivindicación 11, en la que la endonucleasa dirigida al ADN es una nucleasa con dedos de zinc.

13. La célula progenitora hematopoyética humana aislada de la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en la que la endonucleasa dirigida al ADN comprende un dominio de unión al ADN de TAL.