JP2019535298A - 単離ポリヌクレオチドおよびポリペプチドおよび関心のある発現産物を発現させるためにそれらを使用する方法 - Google Patents
単離ポリヌクレオチドおよびポリペプチドおよび関心のある発現産物を発現させるためにそれらを使用する方法 Download PDFInfo
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Abstract
関心のある発現産物を発現させる方法が提供される。したがって、関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるAimR応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入し、XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含むAimPペプチドと細胞を接触させることを含み、このAimPペプチドがAimRポリペプチドを結合させ、AimR応答配列からAimRポリペプチドを解離させることが可能である、方法が提供される。製品、単離ペプチド、ポリヌクレオチドおよび核酸コンストラクトもまた提供される。【選択図】なし
Description
本発明は、そのいくつかの実施形態において、単離ポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびに関心のある発現産物を発現させるためにそれらを使用する方法に関する。
誘導性遺伝子発現およびゲノム編集技術を含む組み換えDNA技術は、植物および動物を含む多くのタイプの生物において遺伝子発現の調節およびゲノム配列に対する正確な標的化修飾のための機会を提供してきた。一般的に合理的な遺伝子発現、および特にゲノム編集は、特定の遺伝形質を挿入または除去することによって、基礎研究、薬物探索および細胞に基づく医薬にわたり非常に大きな潜在力を有する。これには、疾患を引き起こす突然変異の補正、ゲノムにおける特異的な部位への治療遺伝子の付加、有害な遺伝子またはゲノム配列の除去および改善作物を生成させるための植物ゲノムの変更が含まれる。ゲノム編集のための既存の方法としては、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENおよびCRISPR−Cas9系の使用が挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、関心のある発現産物を発現させる方法であって、
(i)関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるAimR応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入し、ここでAimRがAimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRがヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含むこと;および
(ii)XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含むAimPペプチドと細胞を接触させ、ここでAimPペプチドが、AimRポリペプチドを結合させ、AimR応答配列からAimRポリペプチドを解離させることが可能であること
を含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
(i)関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるAimR応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入し、ここでAimRがAimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRがヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含むこと;および
(ii)XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含むAimPペプチドと細胞を接触させ、ここでAimPペプチドが、AimRポリペプチドを結合させ、AimR応答配列からAimRポリペプチドを解離させることが可能であること
を含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、関心のある発現産物を発現させる方法であって、関心のある発現産物をコードする異種核酸配列に操作可能に連結されるAimR応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、AimRがAimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRがヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、関心のある発現産物を発現させる方法であって、関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるAimR応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み;核酸コンストラクトが、AimRポリヌクレオチドおよびAimRポリヌクレオチドの発現を指示するためのAimRにとって異種のシス作用性制御エレメントを含み、
AimRが、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRが、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
AimRが、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRが、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、AimRをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、AimPペプチドまたはこれをコードする核酸配列と細胞を接触させることを含み、AimPペプチドは、XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含み、AimPペプチドは、AimRポリペプチドを結合させ、AimR応答配列からAimRポリペプチドを解離させることが可能である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、AimR応答配列の発現および/または活性を下方制御することが可能な物質と細胞を接触させることを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、関心のある発現産物は、細胞に対して内因性である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、関心のある発現産物は、細胞に対して外来性である。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、次のうち少なくとも2つ:
(i)AimR応答配列を含むポリヌクレオチドであって、AimRが、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRが、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含む、ポリヌクレオチド;
(ii)AimRをコードするポリヌクレオチド;
(iii)AimRポリペプチドを結合させ、AimR応答配列からAimRポリペプチドを解離させることが可能である、XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含むAimPペプチドまたはこれをコードする核酸配列;および/または
(iv)AimR応答配列の発現および/または活性を下方制御することが可能な物質
を包装する包装材料を含む、関心のある発現産物を発現させるために特定される製品が提供される。
(i)AimR応答配列を含むポリヌクレオチドであって、AimRが、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRが、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含む、ポリヌクレオチド;
(ii)AimRをコードするポリヌクレオチド;
(iii)AimRポリペプチドを結合させ、AimR応答配列からAimRポリペプチドを解離させることが可能である、XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含むAimPペプチドまたはこれをコードする核酸配列;および/または
(iv)AimR応答配列の発現および/または活性を下方制御することが可能な物質
を包装する包装材料を含む、関心のある発現産物を発現させるために特定される製品が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimRをコードするポリヌクレオチドは、AimRポリヌクレオチドの発現を指示するためのAimRにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクトに含まれる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本製品は、マルチクローニングサイト(MCS)を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本製品は、関心のある発現産物をコードするポリヌクレオチドを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、関心のある発現産物は、DNA編集剤である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimR応答配列は、AimRを結合させるための核酸配列およびAimXポリヌクレオチドを含み、AimXポリヌクレオチドまたはAimXポリヌクレオチドによりコードされるAimXポリペプチドは、宿主細菌においてAimRを発現する溶原ファージの溶原性を阻害可能である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、関心のある発現産物は、AimX依存性DNA編集剤である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、DNA編集剤によって細胞のゲノムに組み込もうとする核酸配列を細胞に導入することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、DNA編集剤はインテグラーゼである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、DNA編集剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、クラス2 CRISPR/Casのエフェクタータンパク質(例えばCas9、Cpf1、C2c1、C2c3)およびTALENからなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含む単離AimPペプチドが提供され、このペプチドは、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含むAimRポリペプチドを結合させることが可能であり、AimRがヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含み;AimR応答配列からAimRポリペプチドを解離させることが可能である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含む、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含む単離AimRポリペプチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、AimR応答配列を含む単離ポリヌクレオチドが提供され、AimRは、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRは、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimR応答配列は、AimRを結合させるための核酸配列およびAimXポリヌクレオチドを含み、AimXポリヌクレオチドまたはAimXポリヌクレオチドによりコードされるAimXポリペプチドは、宿主細菌においてAimRを発現する溶原ファージの溶原性を阻害可能である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドが提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドを含むアービトリウム(arbitrium)系をコードする単離ポリヌクレオチドが提供され、このアービトリウム(アービトリウム(arbitrium))系は、宿主細菌においてアービトリウム(arbitrium)系を発現するファージの溶原性を制御可能である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドおよびマルチクローニングサイト(MCS)を含む核酸コンストラクトが提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドおよびマルチクローニングサイト(MCS)を含む核酸コンストラクトが提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト、または本発明の核酸コンストラクトおよび本ポリヌクレオチドの発現を指示するための、AimP、AimR、AimR応答配列および/またはAimXにとって異種のシス作用性制御エレメントが提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の核酸コンストラクトは、ポリヌクレオチドの少なくとも1つをそれぞれ発現する少なくとも2つの核酸コンストラクトを含む核酸コンストラクト系である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、本ポリヌクレオチドを含むポリシストロニックなmRNAをコードする。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、AimR応答配列の発現および/または活性を下方制御可能な単離核酸剤が提供され、ここでAimRは、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRは、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、
(a)(i)本発明の単離ポリヌクレオチド、
(a)(ii)本発明のポリヌクレオチドおよびマルチクローニングサイト(MCS)を含む核酸コンストラクトおよびまたは
(a)(iii)本発明のポリヌクレオチドおよび本ポリヌクレオチドの発現を指示するためのAimRまたはAimXにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクト
のうち少なくとも1つと;
(b)(i)本発明の単離ペプチド、
(b)(ii)本発明の単離ポリヌクレオチド、
(b)(iii)本発明のポリヌクレオチドおよびMCSを含む核酸コンストラクト、
(b)(iv)本発明のポリヌクレオチドおよび本ポリヌクレオチドの発現を指示するためのAimPにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクトおよび/または
(b)(v)本発明の単離剤
のうち少なくとも1つと、
を包装する包装材料を含む、関心のある発現産物を発現させるために特定される製品が提供される。
(a)(i)本発明の単離ポリヌクレオチド、
(a)(ii)本発明のポリヌクレオチドおよびマルチクローニングサイト(MCS)を含む核酸コンストラクトおよびまたは
(a)(iii)本発明のポリヌクレオチドおよび本ポリヌクレオチドの発現を指示するためのAimRまたはAimXにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクト
のうち少なくとも1つと;
(b)(i)本発明の単離ペプチド、
(b)(ii)本発明の単離ポリヌクレオチド、
(b)(iii)本発明のポリヌクレオチドおよびMCSを含む核酸コンストラクト、
(b)(iv)本発明のポリヌクレオチドおよび本ポリヌクレオチドの発現を指示するためのAimPにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクトおよび/または
(b)(v)本発明の単離剤
のうち少なくとも1つと、
を包装する包装材料を含む、関心のある発現産物を発現させるために特定される製品が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の、単離ポリヌクレオチド、核酸コンストラクトまたは製品は、関心のある発現産物をコードする核酸配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、関心のある発現産物は、DNA編集剤である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimPペプチドは、宿主細菌においてAimRを発現する溶原ファージの溶原性を引き起こすことが可能である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimPは、配列番号269〜283および285〜286からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimRは、配列番号1〜113からなる群から選択される配列に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸配列および/または配列番号114〜226からなる群から選択される配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimRは、1〜113からなる群から選択される核酸配列および/または配列番号114〜226からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimR応答配列は、配列番号287〜334からなる群から選択される核酸配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimR応答配列は配列番号378を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimXは、配列番号336で示されるような核酸配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimRおよびAimPおよび/またはAimR応答配列は、それらを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に5’から3’に配置される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimPおよびAimR応答配列は、それらを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に5’から3’に配置される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimRおよびAimPおよび/またはAimR応答配列は、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に5’から3’に配置される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、AimPおよびAimR応答配列は、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に5’から3’に配置される。
別段の定めがない限り、本明細書中で使用される技術および/または科学用語は全て、本発明が属する技術分野の熟練者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものと類似または同等の方法および材料が本発明の実施形態の実際にまたは試験において使用され得るが、代表的な方法および/または材料を以下に記載する。矛盾がある場合、定義を含め、本特許の明細書が優先する。さらに、材料、方法および例は単なる例示であり、必ずしも限定するものではない。
添付の図面を参照して、本発明のいくつかの実施形態を単なる例として本明細書中に記載する。ここで詳細に図面を具体的に参照して、示される特定のものは例であり、本発明の実施形態の例示的な考察のためであることが強調される。この点に関して、図面とともに行われる説明によって、本発明の実施形態がどのように実施され得るかが当業者に明らかになる。
図面において以下のとおりである。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、単離ポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびに関心のある発現産物を発現させるためにそれらを使用する方法に関する。
本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その用途において、以下の説明に記載されるかまたは実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であるか、または様々な方法で実施または実行することが可能である。
近年発展した誘導性遺伝子発現およびゲノム編集技術を含む組み換えDNA技術によって、植物および動物を含む多くのタイプの生物において遺伝子発現の調節およびゲノム配列に対する正確で標的化された修飾が可能となる。
本発明の実施形態を想起し、実施化する一方で、発明者らは、溶菌性−溶原性決定を協調させるためにテンペレートウイルスによって利用される新たに明らかになったコミュニケーション系に基づく新規の発現ツールを考案した。
続く、本明細書中の以下で、および実施例のセクションで例示されるように、発明者らは、そのバチルス(Bacillus)宿主細胞の感染中に、ウイルス(spBetaファミリーファージ)が、培地に放出される6アミノ酸長ペプチドを産生することを示す(実施例1〜2、図1A〜Eおよび2A〜F)。このペプチドは、その感染宿主において濃度依存的にファージの溶原性を引き起こす(実施例2、図2D)。続いて、発明者らは、ファージファミリーの異なる種によりコードされるペプチド中の共有モチーフを同定することができた;5位にグリシン残基、6位にグリシンまたはアラニン、および場合によっては4位に正荷電残基(実施例3、図2Gおよび3A〜C)。発明者らは、発明者らが「アービトリウム(arbitrium)」系と呼ぶこの新規コミュニケーション系が、本明細書では以下のように呼ばれる3個のファージ遺伝子:AimP、ペプチドを産生;AimR、細胞内ペプチド受容体;およびAimX、溶原性の負の制御因子によってコードされることをさらに示す(実施例2〜4、図2A〜G、3A〜Cおよび4A〜Iおよび表3)。AimRは、ホモ二量体としては、AimXの転写活性化因子であり;ペプチドが結合すると、AimRは単量体となり、AimXの転写が抑制され、溶原性がもたらされる。理論により束縛されないが、アービトリウム(arbitrium)系により、子孫ファージ粒子がその祖先とコミュニケーションすること、すなわち少し前の先行する感染の量を推定し、ゆえに溶菌または溶原性サイクルの何れを採用するかを決定することが可能になることが示唆される(実施例4、図5A〜C)。
まとめると、本教示から、アービトリウム(arbitrium)系およびその機能的断片が、例えば一般的に関心のある発現産物の発現を調節し、特に標的ゲノムへのDNA配列の組み込みを調節するために使用され得ることが示唆される。本明細書中以下および続く実施例セクションでさらに説明するように、AimRはAimR応答配列を結合させて、それによってAimR応答配列(例えばAimR結合部位)に操作可能に連結された関心のある発現産物の転写の活性化をもたらし得;一方でAimPがAimRに結合すると、関心のある発現産物の転写が抑制される。
発明者らは、AimR−AimP系が、ファージ非依存的にバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)BEST7003におけるAimR結合部位に操作可能に連結されるGFPレポーター遺伝子の発現を調節するように機能し得ることをさらに示す(実施例5、図6〜8および9A〜B)。したがって、本発明の第1の態様によれば、XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含む単離AimPペプチドが提供され、このペプチドは、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含むAimRポリペプチドを結合させることが可能であり、このAimRがヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含み;AimR応答配列からAimRポリペプチドを解離させることが可能である。
本発明の別の態様によれば、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含む、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含む単離AimRポリペプチドが提供される。
本明細書中で使用される場合、「単離」という用語は、自然環境、生理学的環境、例えば微生物または例えばファージから少なくとも部分的に分離されていることを指す。
本明細書で使用される場合、「AimR」という用語は、ポリヌクレオチドおよび発現産物、例えばAimR遺伝子のポリペプチドを指す。AimR遺伝子の産物は、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含有する。 AimR遺伝子の産物は、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含有する。
本明細書中で使用される場合、「DNA結合ドメイン(DBD)」という句は、特定の核酸配列(例えばAimR応答配列)を認識し、それに結合し得るモチーフを指す。DBDは、配列特異的に2本鎖核酸配列(例えばDNA)を認識し、それに結合し得る。典型的には、DBDはタンパク質ドメインにおける構造モチーフである。具体的な実施形態によれば、DBDはヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフを含む。
本明細書中で使用される場合、「へリックス−ターン−へリックス(HTH)モチーフ」という用語は、mfap番号IPR000047を有する、DNA主溝の形状を補完する周知のDNA結合モチーフを指す(例えばAnn Rev.ofBiochem.(1984)53:293およびBrunelleおよびSchleif J.Mol.Biol.(1989)209:607を参照)。このドメインは、配列XXXPhoAlaXXPhoGlyPhoXXXXPhoXXPhoXX(配列番号335)によって例示され得、ここでXは何らかのアミノ酸であり、Phoは疎水性アミノ酸である。
本明細書中で使用される場合、「テトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメイン」という用語は、タンパク質−タンパク質結合ファミリー:TPR_1(PF00515)を媒介すると考えられる3〜16個のモチーフのタンデムアレイにおいて見出される縮重34アミノ酸コンセンサス配列を指す。TPRドメインは、ターンによって分離される2個の逆平行α−ヘリックスを形成して、両親媒性の溝を有する構造を形成する[例えばHiranoら(1990),Cell,60:319−328を参照]。
具体的な実施形態によれば、AimRポリヌクレオチドは、配列番号1〜113からなる群から選択される核酸に対して少なくとも80%の同一性を有する。
具体的な実施形態によれば、AimRポリヌクレオチドは、配列番号1〜113からなる群から選択される核酸に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性を有する。
具体的な実施形態によれば、AimRポリペプチドは、配列番号114〜226からなる群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも80%の同一性を有する。
具体的な実施形態によれば、AimRポリペプチドは、配列番号114〜226からなる群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の同一性を有する。
具体的な実施形態によれば、AimRポリペプチドは、配列番号114に対して、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または100%の同一性を有する。
配列同一性は、Blast、ClustalW、MUSCLEおよびHHpredなどのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に基づく何らかのタンパク質アライメントアルゴリズムまたは何らかの核酸配列アライメントアルゴリズムを使用して決定され得る。
具体的な実施形態によれば、AimRアミノ酸は、配列番号114〜226からなる群から選択される。
具体的な実施形態によれば、AimR核酸配列は、配列番号1〜113からなる群から選択される。
具体的な実施形態によれば、AimRは配列番号114を含む。
発明者らは、AimRが、AimPペプチドの非存在下で、二量体としてファージDNAを結合させ、例えばAimXの転写活性化因子として機能することを明らかにした。AimPペプチドに結合すると、AimRはそのオリゴマー状態を活性二量体から不活性単量体に変化させ、これが例えばAimXの転写の低下を引き起こす。
ゆえに、いくつかの実施形態によるAimRポリペプチドは、(本明細書中で以下にさらに記載のように)XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含むAimPペプチドを結合させることが可能であり;AimP結合DNA(すなわちAimR応答配列)および活性化遺伝子発現(すなわち転写因子)の非存在下である。
転写因子(例えばAimR)のDNA(例えばAimR応答配列)への結合を決定する方法は当技術分野で周知であり、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ、DNA電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、DNAプルダウンアッセイおよびマイクロプレート捕捉および検出アッセイが挙げられるが限定されない。
特定の実施形態によれば、AimRは二量体としてDNAを結合させる。二量体化を評価する方法は当技術分野で周知であり、続く実施例セクションでさらに記載し、ゲルろ過カラム上での移動を含む。
具体的な実施形態によれば、「AimR」という用語は全長AimRを指す。他の具体的な実施形態によれば、「AimR」という用語は、本明細書中に記載のように活性を維持するAimRの断片を指す。
「AimR」という用語はまた、本明細書中に記載のように所望の活性を示す機能的AimR相同体も指す。このような相同体は、例えば、ポリペプチド配列番号114〜226に対して少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一もしくは相同であるか、またはそれをコードするポリヌクレオチドに対して、80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である(本明細書中、上記および下記にさらに記載のとおり)。相同体はまた、アミノ酸置換を含む、オルソログ、欠失、挿入または置換変異体も指し得る。
配列同一性または相同性は、Blast、ClustalW、MUSCLEおよびHHpredなどの何らかのタンパク質または核酸配列アライメントアルゴリズムを使用して決定され得る。
本明細書中で使用される場合、「操作可能に連結される」という用語は、ある核酸配列が別の核酸配列と機能的関係を有することを指す。具体的な実施形態によれば、制御配列(例えばAimR結合部位)がその核酸配列の転写および/または翻訳を調節および制御する場合、核酸配列は制御配列に「操作可能に連結」されている。一実施形態によれば、制御エレメントはそれが制御する核酸配列においてシスに作用する。別の実施形態によれば、制御エレメントはそれが制御する核酸配列においてトランスに作用する。具体的な実施形態によれば、制御配列はそれが制御する核酸配列に対して上流に配置される。具体的な実施形態によれば、「操作可能に連結される」という用語は、発現させようとする核酸配列の上流の適切な開始シグナル(例えばATG)を有すること、および正しい読み枠を維持して、制御配列の調節下での核酸配列の発現およびその核酸配列によりコードされる所望の産物の発現を可能にすることを含む。
具体的な実施形態によれば、「AimR応答配列」という用語は、全長AimR応答配列を指す。他の具体的な実施形態によれば、「AimR応答配列」という用語は、本明細書中に記載のように活性を維持するAimR応答配列の断片を指す。 具体的な実施形態によれば、AimR応答配列は、4〜100、4〜50、4〜30または4〜10核酸長である。
具体的な実施形態によれば、AimR応答配列は、AimRを結合させるための核酸配列(すなわちAimR結合部位)を含む。
具体的な実施形態によれば、AimR応答配列は、配列番号287〜334からなる群から選択される核酸配列を含む。
具体的な実施形態によれば、AimR応答配列は、配列番号287〜334からなる群から選択される核酸配列中に含まれる。
具体的な実施形態によれば、AimR応答配列は、配列番号378を含む。
具体的な実施形態によれば、AimR応答配列は、配列番号378中に含まれる。
具体的な実施形態によれば、AimR応答配列は、例えばクロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ、DNA電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、マイクロプレート捕捉および検出アッセイまたはDNAプルダウンアッセイによって決定される場合、AimRを結合させるための核酸配列(すなわちAimR結合部位)として配列番号287〜334または378の活性を維持する配列番号287〜334または378の断片を含む。
具体的な実施形態によれば、AimR応答配列は、AimRを結合させるための核酸配列(すなわちAimR結合部位)およびAimXを含む。ゆえに、本発明の具体的な実施形態は、AimRの、その結合部位への結合が、AimXの発現を調節し、それが次に関心のある発現産物の発現を調節することを開示する。
「AimR応答配列」という用語はまた、所望の活性を示す(すなわちAimRを結合させる)機能的AimR応答配列相同体も指す。このような相同体は、例えば、ポリヌクレオチド配列番号287〜334および378に対して、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であるかまたは相同であり得る。相同体はまた、アミノ酸置換を含む、オルソログ、欠失、挿入または置換変異体も指し得る。
いくつかの実施形態に従って使用し得るAimRおよびAimR応答配列を含むそれらの同族配列を本明細書中で以下の表3に列挙する。
本明細書中で使用される場合、「AimP」という用語は、XXXXGG/Aのアミノ酸配列を有するペプチドを指し、ここでXは何れかのアミノ酸またはそれをコードする核酸である。具体的な実施形態によれば、AimPは、XXXX1GG/Aのアミノ酸配列を有し、式中、Xは何れかのアミノ酸であり、X1は正荷電アミノ酸である。具体的な実施形態によれば、AimPはAimP遺伝子の産物である。
本ペプチドは、例えば50アミノ酸より長い(例えば51〜80アミノ酸、51〜100アミノ酸、100〜200アミノ酸)、または短い、例えば6〜50アミノ酸長であり得る。具体的な実施形態によれば、本ペプチドは6アミノ酸長である。
具体的な実施形態によれば、AimPは、配列番号269〜283および285〜286からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態によれば、AimPペプチドは、SAIRGA(配列番号269)またはGMPRGA(配列番号271)アミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態によれば、AimPペプチドは、SAIRGA(配列番号269)アミノ酸配列を含む。
機能的AimPペプチドは、AimRポリペプチドを結合させ得、AimRポリペプチドをDNAから、具体的にはAimR応答配列から解離させ得る。
本明細書中で使用される場合、「解離させること」および「解離させる」という用語は、当技術分野で公知のアッセイ、例えば、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ、DNA電気泳動移動シフトアッセイ(EMSA)、DNAプルダウンアッセイおよびマイクロプレート捕捉および検出アッセイによって証明されるように、AimRおよびAimR応答配列を含む複合体中の少なくとも30%の減少を指す。
具体的な実施形態によれば、機能的AimPは、宿主細菌中でAimRを発現する溶原ファージの溶原性を引き起こし得る。ファージ溶原性を分析する方法は本明細書中で以下に記載する。
「AimP」という用語はまた、本明細書中に記載のように所望の活性を示す機能的AimP相同体も指す。このような相同体は、例えば、ペプチド配列番号269〜283および285〜286に対して、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であるかまたは相同であり得る。相同体はまた、アミノ酸置換を含む、オルソログ、欠失、挿入または置換変異体も指し得る。
いくつかの実施形態に従って使用し得るAimPおよびそれらの同族AimRを本明細書中で以下の表3に列挙する。
AimRへのペプチド結合を認定するための結合アッセイは当技術分野で周知であり、例えば、ウエスタンブロット、BiaCore、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)またはフローサイトメトリーが挙げられる。
DNAからAimRを解離させるペプチドの能力を認定するための結合アッセイは当技術分野で周知であり、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ、DNA電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、DNAプルダウンアッセイおよびマイクロプレート捕捉および検出アッセイが挙げられるが限定されない。
具体的な実施形態によれば、AimPペプチドのAimRポリペプチドへの結合によって、AimRポリペプチドの二量体化が阻害される。
本明細書中で使用される場合、「阻害する」および「阻害すること」という用語は、活性(例えば二量体化、結合、溶原性)の低下を指す。具体的な実施形態によれば、低下は、AimPペプチドまたはAimXの非存在下での低下と比較した場合、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍または少なくとも20倍である。
他の具体的な実施形態によれば、低下はAimPペプチドまたはAimXの非存在下の場合と比較したとき、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または99%または100%である。
溶原ファージは溶原性経路に入ることが可能なものであり、そこでファージはその溶解サイクルの完了前に完全に細胞のゲノムの休止状態の受動部分になる。
具体的な実施形態によれば、ファージはバチルス(Bacillus)細菌に感染させることが可能である。
具体的な実施形態によれば、ファージはプロファージである。
以下の表3は、本発明の具体的な実施形態に従って使用し得るファージおよびプロファージを示す。具体的な実施形態によれば、ファージはspBetaファージである。具体的な実施形態によれば、ファージはPhi3Tである。
同じ培養条件に対して、溶原性の程度は一般に同じ種の細菌であるが、指定の物質(例えばAimP、AimX)と接触させないか、または対照とも呼ばれるビヒクル対照と接触させないものにおける溶原性と比較して表される。
ファージ溶原性を分析する方法は当技術分野で周知であり、DNA配列決定およびPCR分析が挙げられるが、限定されない。溶原ファージは溶原性経路または溶菌性経路を使用し得るので、ファージの溶原性活性は、光学密度、プラークアッセイおよび生死指示薬を含むが限定されない当技術分野で周知の方法によってファージの溶菌性活性の低下を判定することにより間接的に評価され得る。
本明細書で使用される場合、「溶原性を引き起こすこと」および「溶原性を引き起こす」という句は、溶原性の増加を指す。
具体的な実施形態によれば、増加は、AimPペプチドまたはAimX下方制御剤の非存在下の場合と比較したとき、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍または少なくとも20倍である。
他の具体的な実施形態によれば、増加はAimPペプチドまたはAimX下方制御剤の非存在下の場合と比較したとき、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または99%または100%である。
具体的な実施形態によれば、細菌は、以下の表3で示されるファージから選択される溶原ファージに感染させ得る。具体的な実施形態によれば、細菌をspBetaファージに感染させ得る。具体的な実施形態によれば、細菌はバチルス(Bacillus)細菌である。具体的な実施形態によれば、細菌は、以下の表3で列挙される細菌からなる群から選択される。
本発明はまた、本明細書中に記載のようなアービトリウム(arbitrium)系の構成成分およびその機能的断片をコードする単離ポリヌクレオチドも企図する。
したがって、本発明の一態様によれば、XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含むAimPペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供され、このペプチドは、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含むAimRポリペプチドを結合させることが可能であり、このAimRがヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含み;AimR応答配列からAimRポリペプチドを解離させることが可能である。
本発明の別の態様によれば、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含むAimRポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供され、このAimRは、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含む。
具体的な実施形態によれば、AimRポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1〜113からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%の同一性を有する配列を含む。
具体的な実施形態によれば、AimRポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1〜113からなる群から選択される配列を含む。
本発明の別の態様によれば、AimR応答配列を含む単離ポリヌクレオチドが提供され、ここでAimRは、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRは、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含む。
具体的な実施形態によれば、AimR応答配列は、AimRを結合させるための核酸配列およびAimXポリヌクレオチドを含み、AimXポリヌクレオチドまたはAimXポリヌクレオチドによりコードされるAimXポリペプチドは、宿主細菌においてAimRを発現する溶原ファージの溶原性を阻害可能である。
本発明の別の態様によれば、単離AimXポリヌクレオチドが提供される。
本発明の別の態様によれば、AimXポリヌクレオチドによりコードされる単離AimXポリペプチドが提供される。
本明細書で使用される場合、「AimX」という用語は、ポリヌクレオチドおよび発現産物、例えばAimX遺伝子のポリペプチドを指す。具体的な実施形態によれば、「AimX」は、AimX遺伝子のポリヌクレオチドを指す。具体的な実施形態によれば、AimR結合部位はAimXポリヌクレオチドに操作可能に連結される。機能的AimXは、宿主細菌中でそれぞれのAimRを発現する溶原ファージの溶原性を阻害することが可能である。具体的な実施形態によれば、AimXおよびAimR結合部位はAimR応答配列を含む。
具体的な実施形態によれば、AimXは、配列番号336で示される核酸配列を含む。
具体的な実施形態によれば、「AimX」という用語は全長AimXを指す。他の特定の実施形態によれば、「AimX」という用語は、本明細書中に記載のように活性を維持するAimXの断片を指す。
「AimX」という用語はまた、本明細書中に記載のように所望の活性を示す機能的AimX相同体も指す。このような相同体は、例えば、ポリヌクレオチド配列番号336に対して、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であるかまたは相同であり得る。相同体はまた、アミノ酸置換を含む、オルソログ、欠失、挿入または置換変異体も指し得る。
いくつかの実施形態に従って使用し得るAimRおよびそれらの同族AimXを本明細書中で以下の表3に列挙する。
本発明の別の態様によれば、AimPペプチドをコードするポリヌクレオチド、AimRポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、AimR応答配列を含むポリヌクレオチドおよび/またはAimXポリヌクレオチドおよびそれらの何れかの組み合わせを含む単離ポリヌクレオチドが提供される。
本発明の別の態様によれば、AimPペプチドをコードする核酸配列、AimRポリペプチドをコードする核酸配列、およびAimX核酸配列に操作可能に連結されるAimRを結合させるための核酸配列を含むアービトリウム(arbitrium)系をコードする単離ポリヌクレオチドが提供され、このアービトリウム(arbitrium)系は、宿主細菌においてこのアービトリウム(arbitrium)系を発現するファージの溶原性を制御可能である。
本明細書中で使用される場合、「アービトリウム(arbitrium)系」または「機能的アービトリウム(arbitrium)」は、本明細書中に記載のようなAimP、AimRおよびAimXを含み、その活性がその宿主ゲノムにおけるファージ溶原性を調節する多遺伝子系を指す。
いくつかの実施形態に従って使用し得るアービトリウム(arbitrium)系構成成分の組み合わせは、本明細書中の以下の表3で列挙する。
本明細書中で使用される場合、「アービトリウム(arbitrium)系の構成成分」という用語は、AimP、AimR、AimR応答配列、AimXおよび本明細書中上記のものなど、それらまたはそれらの機能的な断片の何らかの組み合わせを指す。
具体的な実施形態によれば、AimRは、溶原ファージのゲノム中のAimPおよび/またはAimR応答配列をコードする遺伝子(例えば配列番号287〜334、378)の1〜10個の遺伝子内に配置される遺伝子によってコードされる。
具体的な実施形態によれば、AimPは、溶原ファージのゲノム中のAimR応答配列をコードする遺伝子(例えば配列番号287〜334、378)の1〜10個の遺伝子内に配置される遺伝子によってコードされる。具体的な実施形態によれば、AimRおよびAimPおよび/またはAimR応答配列(例えば配列番号287〜334、378)は、それらを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimRおよびAimPおよび/またはAimR応答配列(例えば配列番号287〜334、378)は、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimRおよびAimPおよび/またはAimR応答配列(例えば配列番号287〜334、378)は、それらを発現する溶原ファージの核酸分子上で近接して5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimRおよびAimPおよび/またはAimR応答配列(例えば配列番号287〜334、378)は、溶原ファージのゲノムにおいて近接して5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimPおよびAimR応答配列(例えば配列番号287〜334、378)は、それらを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimPおよびAimR応答配列(例えば配列番号287〜334、378)は、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimPおよびAimR応答配列(例えば配列番号287〜334、378)は、それらを発現する溶原ファージの核酸分子上で近接して5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimPおよびAimR応答配列(例えば配列番号287〜334、378)は、溶原ファージのゲノムにおいて近接して5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimRは、溶原ファージのゲノム中のAimXをコードする遺伝子の1〜10個の遺伝子内に配置される遺伝子によってコードされる。
具体的な実施形態によれば、AimPは、溶原ファージのゲノム中のAimXをコードする遺伝子の1〜10個の遺伝子内に配置される遺伝子によってコードされる。
具体的な実施形態によれば、AimRおよびAimPおよび/またはAimXは、それを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimRおよびAimPおよび/またはAimXは、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimRおよびAimPおよび/またはAimXは、それを発現する溶原ファージの核酸分子上で近接して5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimRおよびAimPおよび/またはAimXは、溶原ファージのゲノムにおいて近接して5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimPおよびAimXは、それを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimPおよびAimXは、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimPおよびAimXは、それを発現する溶原ファージの核酸分子上で近接して5’から3’に配置される。
具体的な実施形態によれば、AimPおよびAimXは、溶原ファージのゲノムにおいて近接して5’から3’に配置される。
したがって、具体的な実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、
(1)AimPペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(2)AimRポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド;
(3)AimR応答配列の核酸配列を含むポリヌクレオチド;
(4)AimXポリヌクレオチド
(5)(2)および(3)を含むポリヌクレオチド;
(6)(2)および(4)を含むポリヌクレオチド;
(7)(1)、(2)および(3)を含むポリヌクレオチド;
(8)(1)、(2)および(4)を含むポリヌクレオチド;
(9)(1)および(2)を含むポリヌクレオチド;
(10)(1)および(3)を含むポリヌクレオチド;または
(11)(1)および(4)を含むポリヌクレオチド
を含む。
(1)AimPペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(2)AimRポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド;
(3)AimR応答配列の核酸配列を含むポリヌクレオチド;
(4)AimXポリヌクレオチド
(5)(2)および(3)を含むポリヌクレオチド;
(6)(2)および(4)を含むポリヌクレオチド;
(7)(1)、(2)および(3)を含むポリヌクレオチド;
(8)(1)、(2)および(4)を含むポリヌクレオチド;
(9)(1)および(2)を含むポリヌクレオチド;
(10)(1)および(3)を含むポリヌクレオチド;または
(11)(1)および(4)を含むポリヌクレオチド
を含む。
具体的な実施形態によれば、AimRポリヌクレオチドは、AimPポリヌクレオチドに対して上流にある。
具体的な実施形態によれば、AimRポリヌクレオチドは、AimR応答配列ポリヌクレオチドに対して上流にある。
具体的な実施形態によれば、AimRポリヌクレオチドは、AimXポリヌクレオチドに対して上流にある。
具体的な実施形態によれば、AimR応答配列は、AimXポリヌクレオチドに対して上流にある。
具体的な実施形態によれば、AimPポリヌクレオチドは、AimR応答配列ポリヌクレオチドに対して上流にある。
具体的な実施形態によれば、AimPポリヌクレオチドは、AimXポリヌクレオチドに対して上流にある。
本明細書で使用される場合、交換可能に使用される「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、ネイティブペプチド(分解産物、合成的合成ペプチドまたは組み換えペプチドの何れか)およびペプチド模倣物(典型的には合成的合成ペプチド)ならびに、ペプチド類似体であるペプトイドおよびセミペプトイドを包含し、これは、例えば、体内でペプチドをより安定にする、または細胞に浸透する能力をより高める修飾を有し得る。このような修飾としては、N末端修飾、C末端修飾、ペプチド結合修飾、骨格修飾および残基修飾が挙げられるが、限定されない。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、本明細書中で完全に示されるかのように参照により組み込まれる、Quantitative Drug Design,C.A.Ramsden Gd.,Chapter 17.2,F.Choplin Pergamon Press(1992)で特定される。この点でのさらなる詳細を本明細書中、以下で提供する。
本ペプチド内のペプチド結合(−CO−NH−)は、例えばN−メチル化アミド結合(−N(CH3)−CO−)、エステル結合(−C(=O)−O−)、ケトメチレン結合(−CO−CH2−)、スルフィニルメチレン結合(−S(=O)−CH2−)、α−アザ結合(−NH−N(R)−CO−)(式中、Rは、何らかのアルキル(例えばメチル)である。)、アミン結合(−CH2−NH−)、スルフィド結合(−CH2−S−)、エチレン結合(−CH2−CH2−)、ヒドロキシエチレン結合(−CH(OH)−CH2−)、チオアミド結合(−CS−NH−)、オレフィン二重結合(−CH=CH−)、フッ素化オレフィン二重結合(−CF=CH−)、レトロアミド結合(−NH−CO−)、ペプチド誘導体(−N(R)−CH2−CO−)(式中、Rは、炭素原子上に天然に存在する「通常の」側鎖である。)により置換され得る。
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の何れかにおいて、および同時にいくつかの(2〜3個の)結合においてさえも起こり得る。
天然の芳香族アミノ酸、Trp、TyrおよびPheは、1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−カルボン酸(Tic)、ナフチルアラニン、Pheの環メチル化誘導体、Pheのハロゲン化誘導体またはO−メチル−Tyrなどの非天然の芳香族アミノ酸により置換され得る。
本発明のいくつかの実施形態のペプチドはまた、1つ以上の修飾アミノ酸または1つ以上の非アミノ酸単量体(例えば脂肪酸、複合炭水化物など)も含み得る。
「アミノ酸(単数)」または「アミノ酸(複数)」という用語は、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホスレオニンを含め、インビボで翻訳後に修飾されることが多い20個の天然アミノ酸;および2−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノル−バリン、ノル−ロイシンおよびオルニチンを含むが限定されない他の通常でないアミノ酸を含むと理解される。さらに、「アミノ酸」という用語は、D−アミノ酸およびL−アミノ酸の両方を含む。
以下の表1および2は、天然アミノ酸(表1)および非従来型または修飾アミノ酸(例えば合成、表2)を列挙しており、これらは本発明のいくつかの実施形態とともに使用し得る。
本発明のいくつかの実施形態のペプチドは、好ましくは直鎖形態で利用されるが、環化がペプチド特性を著しく妨げない場合、ペプチドの環状形態も利用され得ることが理解されよう。
本発明のいくつかの実施形態のペプチドは、好ましくは、それらのヒドロキシル含有側鎖に起因してペプチド溶解度を上昇させることが可能な、セリンおよびスレオニンを含むが限定されない1個以上の非天然または天然極性アミノ酸を含む。
本発明のペプチドのアミノ酸は、保存的に、または非保存的に、の何れかで置換され得る。
本明細書で使用される場合、「保存的置換」という用語は、ペプチド中のネイティブ配列に存在するアミノ酸を、類似の立体的性質を有する天然もしくは非天然のアミノまたはペプチド模倣物と置き換えることを指す。置換しようとするネイティブアミノ酸の側鎖が極性または疎水性の何れかである場合、保存的置換は、(置換されたアミノ酸の側鎖と同じ立体的性質を有することに加えて)天然アミノ酸、非天然アミノ酸によるか、または極性もしくは疎水性でもあるペプチド模倣部分によるものであるべきである。
天然アミノ酸は典型的にはそれらの特性に従って分類されるので、本発明に従い、立体的に類似の非荷電アミノ酸による荷電アミノ酸の置換が保存的置換とみなされるという事実を踏まえれば、天然アミノ酸による保存的置換は、容易に確定され得る。
非天然アミノ酸による保存的置換を生じさせるために、当技術分野において周知のアミノ酸類似体(合成アミノ酸)を使用することも可能である。天然アミノ酸のペプチド模倣物は、当業者にとって公知の文献に十分に記述されている。
保存的置換に影響を与える場合、アミノ酸置換は、側鎖において元のアミノ酸と同じまたは類似の官能基を有するべきである。
本明細書中で使用される「非保存的置換」という句は、異なる電気化学的および/または立体的性質を有する別の天然または非天然アミノ酸による、親配列中に存在するようなアミノ酸の置換を指す。したがって、置換するアミノ酸の側鎖は、置換されるネイティブアミノ酸の側鎖よりも著しく大きい(または小さい)ものであり得、および/または置換されるアミノ酸とは著しく異なる電子特性を有する官能基を有し得る。このタイプの非保存的置換の例としては、アラニンに対するフェニルアラニンもしくはシクロヘキシルメチルグリシン、グリシンに対するイソロイシンまたは、アスパラギン酸に対するNH−CH[(−CH2)5−COOH]−CO−の置換が挙げられる。本発明の範囲下に入るこれらの非保存的置換は、依然として抗菌特性を有するペプチドを構成するものである。
本発明のペプチドのNおよびC末端は官能基によって保護され得る。適切な官能基は、Green and Wuts,”Protecting Groups in Organic Synthesis”,John Wiley and Sons,Chapters 5 and 7,1991に記載されており、その教示は参照により本明細書中に組み込まれる。好ましい保護基は、例えば化合物の親水性を低下させ、親油性を上昇させることによって、それに連結された化合物の細胞への輸送を促進するものである。
本発明のペプチドは浸透剤に(共有結合または非共有結合の何れかで)連結され得る。
本明細書中で使用される場合、「浸透剤」という句は、細胞膜を横切る連結ペプチドの何れかの移行を促進する異種物質を指す。
一実施形態によれば、浸透剤はペプチドであり、ペプチド結合を介して(直接または非直接の何れかで)ペプチドに連結される。
典型的には、ペプチド浸透剤は、リジンまたはアルギニンなどの正荷電アミノ酸の高い相対的存在量の何れかを含有するアミノ酸組成を有するか、または極性/荷電アミノ酸および非極性、疎水性アミノ酸の交互パターンを含有する配列を有する。無毒性かつ効率的に細胞に浸透し得、本発明のいくつかの実施形態に従って使用するのに適し得るCPPの非限定例としては、TAT(HIV−1由来の転写活性化因子)、pAntp(ペネトラチンとも呼ばれる、ショウジョウバエアンテナペディアホメオドメイン転写因子)およびVP22(単純ヘルペスウイルス由来)が挙げられる。CPP−カーゴ接合体を生成させるための、およびこのような接合体を細胞に感染させるためのプロトコールは、例えば、L.Theodoreら[The Journal of Neuroscience,(1995)15(11):7158−7167]、Fawell Sら[Proc Natl Acad Sci USA,(1994)91:664−668]およびJing Bianら[Circulation Research.(2007)100:1626−1633]で見られ得る。
本発明のペプチドはまた、非アミノ酸部分、例えば、ペプチドに連結される疎水性部分(様々な直鎖、分岐鎖、環状、多環式または複素環式炭化水素および炭化水素誘導体);非ペプチド浸透剤;特に化合物が直鎖状である場合、化合物の末端に連結させて分解を抑える様々な保護基も含み得る。本化合物に存在する化学(非アミノ酸)基は、分解またはクリアランスの減少;様々な細胞ポンプによる反発の減少、免疫原性活性の改善、様々な投与方式の改善(腸を通じるなど、様々な障壁を通じた浸透を可能にする様々な配列の連結など);特異性改善、親和性改善、毒性低下などの様々な生理学的特性の改善のために含まれ得る。
本発明のペプチドのアミノ酸配列構成成分を他の非アミノ酸剤に連結させることは、共有結合による、非共有コンプレクション(complexion)による、例えば分解または開裂して、持続放出可能な化合物を生成させ得る疎水性ポリマーとコンプレクション(complexion)することによる;リポソームまたはミセル中にペプチドのアミノ酸部分を封入して、本発明の最終ペプチドを生成させることによるものであり得る。会合は、他の成分(リポソーム、ミセル)内のアミノ酸配列の封入または本発明の最終ペプチドを生成させるためのポリマー内のアミノ酸配列の浸透によるものであり得る。
本発明のいくつかの実施形態のペプチドは、ペプチド合成の技術分野の熟練者にとって公知の何らかの技術、例えば、本明細書中で以下にさらに記載するものなど、固相技術および組み換え技術など(限定されない)によって合成および精製され得る。
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、単離され、RNA配列、相補的ポリヌクレオチド配列(cDNA)、ゲノムポリヌクレオチド配列および/または複合ポリヌクレオチド配列(例えば上記の組み合わせ)の形態で提供される、1本鎖または2本鎖核酸配列を指す。
新規の「アービトリウム(arbitrium)」系は、宿主のゲノムへのDNAの組み込みの調節に関与するので、本教示は、本明細書中に記載の「アービトリウム(arbitrium)」系の構成成分が、標的ゲノムへの関心のある発現産物の組み込みの調節のために使用され得ることを示唆する。
したがって、具体的な実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは関心のある発現産物をコードする核酸配列を含む。
本明細書中で使用される場合、「関心のある発現産物」という用語は、関心のあるRNAおよび/またはタンパク質を指す。
具体的な実施形態によれば、関心のある発現産物の発現および/または活性はAimXに依存し;すなわち、AimXの発現は、関心のある発現産物の発現および/または活性を調節する。
具体的な実施形態によれば、関心のある発現産物は、抗体、成長因子、サイトカインなどの治療用発現産物である。
具体的な実施形態によれば、関心のある発現産物はDNA編集剤である。
具体的な実施形態によれば、DNA編集剤発現および/または活性はAimXに依存し;すなわち、AimXの発現は、DNA編集剤の発現および/または活性を調節する。
本明細書中で使用される場合、「DNA編集剤」という用語は、細胞のゲノムにおいて配列変化を導入可能である薬剤を指す。これらの標的配列の改変は、機能喪失または機能獲得の改変を含み得る。このような改変の非限定例としては、ミスセンス突然変異、すなわちタンパク質中のあるアミノ酸残基を別のアミノ酸残基により変化させ、それによりタンパク質の活性を調整する突然変異;ナンセンス突然変異、すなわちタンパク質において停止コドン、例えばタンパク質が短縮され活性を欠くようにさせる早期停止コドン、を導入する突然変異;フレームシフト突然変異、すなわちタンパク質の読み枠を変化させ、その結果、読み枠に停止コドンを導入することによって早期の終結を引き起こし得る(例えば活性を欠く短縮タンパク質)、核酸(1つまたは複数)の突然変異、通常は欠失もしくは挿入、またはアミノ酸配列がより長くなり(例えば読み過ごしタンパク質)、タンパク質の二次または三次構造に影響を及ぼし、その結果、タンパク質の活性が調整されるもの;活性が調整される、フレームシフト突然変異または停止コドン突然変異の修飾(すなわち停止コドンがアミノ酸コドンに突然変異される場合)ゆえの読み過ごし突然変異;欠失突然変異、すなわち、遺伝子配列中でコード核酸が欠失し、その結果、フレームシフト突然変異またはインフレーム突然変異(コード配列内での1つ以上のアミノ酸コドンの欠失)が起こり得る突然変異;挿入突然変異、すなわち、遺伝子配列にコードまたは非コード核酸が挿入され、その結果、1つ以上のアミノ酸コドンのフレームシフト突然変異またはインフレーム挿入を生じさせ得る突然変異;反転、すなわち反転したコードまたは非コード配列を生じさせる突然変異;スプライシング突然変異、すなわち、異常なスプライシングまたはスプライシング不良を引き起こす突然変異;および重複突然変異、すなわち、重複コードまたは非コード配列を生じさせ、インフレームであり得るかまたはフレームシフトを引き起こし得る突然変異が挙げられる。
具体的な実施形態によれば、遺伝子のDNA配列改変は、その遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子を含み得る。
他の具体的な実施形態によれば、遺伝子配列の改変は、遺伝子の両対立遺伝子を含む。このような例において、遺伝子はホモ接合型またはヘテロ接合型であり得る。
具体的な実施形態によれば、DNA編集剤は、ゲノムへの外来核酸配列の組み込みを可能にする。
したがって、具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチドは、DNA編集剤によって細胞のゲノムに組み込もうとする核酸配列を含む。
DNAゲノム編集の方法は当技術分野で周知であり[例えば、その内容がそれらの全体において参照により組み込まれる、Francisco Martinら“New Vectors for Stable and Safe Gene Modification” in Gene Therapy−Developments and Future Perspectives(2011)DOI:10.5772/10622;Menke D.Genesis(2013)51:−618;Capecchi,Science(1989)244:1288−1292;Santiagoら、Proc Natl Acad Sci USA(2008)105:5809−5814;国際公開第2014085593号パンフレット、同第2009071334号パンフレットおよび同第2011146121号パンフレット;米国特許第8771945号明細書、同第8586526号明細書、同第6774279号明細書および米国特許出願公開第20030232410号明細書、同第20050026157号明細書、同第20060014264号明細書を参照]、インテグラーゼおよび改変ヌクレアーゼを含むが限定されない。DNAゲノム編集のための物質は、公的に利用可能な源から設計し得る(designed publically available sources)か、またはTransposagen,Addgene and Sangamo Biosciencesから購入し得る。
本発明の具体的な実施形態によれば、DNA編集剤はインテグラーゼである。
本明細書中で使用される場合、「インテグラーゼ」という用語は、核酸配列を別の核酸配列(例えば細胞のゲノム)に組み込むことが可能であるリコンビナーゼを指す。具体的な実施形態によれば、インテグラーゼは部位特異的リコンビナーゼであり、すなわち、各核酸がリコンビナーゼに対する少なくとも1個の認識部位を含む、2個の核酸間の配列の組み込みがもたらされる。このようなインテグラーゼは当技術分野で公知であり[例えば、その内容がそれらの全体において参照により組み込まれる、Francisco Martinら、Gene Therapy−Developments and Future Perspectives(2011)DOI:10.5772/10622,Recchia Aら、Curr Gene Ther.(2011)11(5):399−405,Lim KI,BMB Rep.(2015)48(1):6−12および米国特許出願公開第20070190601号明細書を参照]、例えば、レトロウイルスインテグラーゼ(HIVインテグラーゼ)およびファージインテグラーゼ(例えばphiC31インテグラーゼ、ラムダインテグラーゼ)が挙げられる。
具体的な実施形態によれば、DNA編集剤は改変インテグラーゼである。
メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFNs)、転写−活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)およびCRISPR/Cas系などの改変エンドヌクレアーゼを使用するゲノム編集は当技術分野で周知であり、例えばその内容がそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第2015/033343号パンフレットに記載されている。
他の具体的な実施形態によれば、DNA編集剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、クラス2 CRISPR/Casのエフェクタータンパク質(例えばCas9、Cpf1、C2c1、C2c3)およびTALENからなる群から選択される。
具体的な実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、(本明細書中で「発現ベクター」とも呼ばれる)核酸コンストラクトの一部である。
本明細書中で使用される場合、「核酸コンストラクト」および「発現ベクター」という用語は、宿主細胞中で関心のある具体的な発現産物(すなわち遺伝子)を導入するために設計された核酸ベクターを指す。発現は、一過性もしくは一貫性で、エピソーム性であり得るか、または宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。具体的な実施形態によれば、発現はプラスミドなどの伝染性の遺伝要素上にある。
ゆえに、本発明のいくつかの実施形態の核酸コンストラクトは、このベクターを原核生物、真核生物または好ましくはその両方における複製および組み込みに適したものにするさらなる配列を含む(例えばシャトルベクター)。 さらに、典型的なクローニングベクターは、制御エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳開始配列、転写および翻訳終結因子、ポリアデニル化シグナル転写終結シグナルなど、および関心のある発現産物のクローニングのための少なくとも1つのマルチクローニングサイト(MCS)を含有し得る。例として、このようなコンストラクトは典型的には5’LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、第2鎖DNA合成の起点および3’LTRまたはその一部を含む。
したがって、本発明の態様によれば、AimPペプチドをコードするポリヌクレオチド、AimRポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、AimR応答配列を含むポリヌクレオチドおよび/またはAimXポリヌクレオチドおよびそれらの何れかの組み合わせ;およびMCSを含む核酸コンストラクトが提供される。
本発明の別の態様によれば、AimPペプチドをコードするポリヌクレオチド、AimRポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、AimR応答配列を含むポリヌクレオチドおよび/またはAimXポリヌクレオチドおよびそれらの何れかの組み合わせ;およびポリヌクレオチドの発現を指示するための、AimP、AimR、AimR応答配列および/またはAimXにとって異種であるシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクトが提供される。
したがって、具体的な実施形態によれば、核酸コンストラクトは本明細書中、上記のポリヌクレオチド(1)〜(11)の何れかを含み得る。
本発明の教示はさらに、ポリヌクレオチドが核酸コンストラクト系の一部であり、それによってアービトリウム(arbitrium)系の構成成分が異なるコンストラクトから発現されることを企図する。
したがって、本発明の具体的な実施形態によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも1つをそれぞれ発現する少なくとも2つの核酸コンストラクトを含む核酸コンストラクト系を提供する。
したがって、具体的な実施形態によれば、核酸コンストラクト系は、本発明の各ポリヌクレオチドに対する個々の核酸コンストラクト(すなわち、AimP、AimR、AimR応答配列およびAimX)を含む。
他の具体的な実施形態によれば、単一のコンストラクトは、本明細書中、上記のように、本発明のいくつかのポリヌクレオチドを含む。
具体的な実施形態によれば、核酸コンストラクト系は、細胞の染色体へのポリヌクレオチドの組み込みを可能にする少なくとも1つのコンストラクトおよびポリヌクレオチドのエピソーム発現を可能にする少なくとも1つのコンストラクトを含む。
本明細書中で使用される場合、「マルチクローニングサイト(MCS)」という用語は、核酸配列を発現ベクターにクローニングする目的で、少なくとも1つの制限部位、およびより典型的にはいくつかの制限部位を含む核酸配列を指す。MCSは、関心のある標的発現産物を消化MCS部位に挿入し得るように、具体的な制限酵素によって認識され消化される。当技術分野で公知の何らかのMCSが、本発明の核酸コンストラクトにおいて使用され得る。これは、MCSを有する当技術分野において公知の様々な市販のベクター(例えばpUC18、pUC19など)から得られ得る。
シス作用性制御配列は、ヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、ならびにある種の条件下でのみヌクレオチド配列の誘導性発現を指示するものを含む。
本発明のシス制御配列は、本発明のポリヌクレオチド(すなわちAimP、AimR、AimR応答配列およびAimX)にとって異種である。
本明細書中で使用される場合、「異種」という用語は、異なる遺伝的位置に由来することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、遺伝子工学的手法により、異なる供給源に由来するベクターに配置され得、それは異種ポリヌクレオチドであり;そのナイーブコード配列から取り除かれ、ネイティブ配列以外のコード配列に操作可能に連結されるプロモーターは、異種プロモーターである。
具体的な実施形態によれば、核酸コンストラクトは、構成的または誘導的に細胞中のポリヌクレオチド配列の転写を指示するためのプロモーター配列を含む。
真核プロモーターは、典型的には、2種類の認識配列、TATAボックスおよび上流プロモーターエレメントを含有する。転写開始部位の上流の25〜30塩基対に位置するTATAボックスは、RNAポリメラーゼにRNA合成を開始させるよう指示することに関与すると考えられる。他の上流プロモーターエレメントは転写が開始される際の速度を決定する。
好ましくは、本発明のいくつかの実施形態の核酸コンストラクトによって利用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において活性である。細胞型特異的および/または組織特異的プロモーターの例としては、肝臓特異的なアルブミンなどのプロモーター[Pinkertら、(1987)Genes Dev.1:268〜277]、リンパ系特異的プロモーター[Calameら、(1988)Adv. Immunol.43:235〜275];特にT細胞受容体のプロモーター[Winotoら、(1989)EMBO J.8:729−733]および免疫グロブリン;[Banerjiら(1983)Cell 33729−740]、ニューロフィラメントプロモーターなどのニューロン特異的プロモーター[Byrneら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473−5477]、膵臓特異的プロモーター[Edlunchら(1985)Science 230:912−916]または乳清プロモーターなどの乳腺特異的プロモーター(米国特許第4,873,316号明細書および欧州特許出願公開第264,166号明細書)が挙げられる。
エンハンサーエレメントは、連結された相同または異種プロモーターから最大1,000倍まで転写を刺激し得る。エンハンサーは、転写開始部位から下流または上流に配置されたときに活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは、広い宿主範囲を有し、様々な組織において活性である。例えば、SV40初期遺伝子エンハンサーは多くの細胞型に適している。本発明のいくつかの実施形態に適している他のエンハンサー/プロモーターの組み合わせは、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスサイトメガロウイルス(CMV)、マウス白血病ウイルス、マウスまたはラウス肉腫ウイルスおよびHIVなどの様々なレトロウイルスからの長期反復配列(long term repeat)由来のものを含む。参照により本明細書中に組み込まれる、Enhancers and Eukaryotic Expression,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.1983を参照のこと。
具体的な実施形態によれば、プロモーターはウイルス(例えばファージ)プロモーターである。
具体的な実施形態によれば、プロモーターは細菌性プロモーターである。
発現ベクターの構築において、プロモーターは、好ましくは、異種転写開始部位から、その天然の設定における転写開始部位からである場合とほぼ同じ距離に配置される。しかし、当技術分野で公知であるように、この距離の幾分かの変動はプロモーター機能を喪失させることなく適応させ得る。
mRNA翻訳の効率を高めるために、ポリアデニル化配列も発現ベクターに付加し得る。正確かつ効率的なポリアデニル化には、2つの異なる配列エレメント:ポリアデニル化部位から下流に位置するGUまたはUに富む配列および11〜30ヌクレオチド上流に位置する6ヌクレオチドの高度に保存された配列、AAUAAAが必要である。本発明のいくつかの実施形態に適している終結およびポリアデニル化シグナルは、SV40由来のものを含む。
既に記載のエレメントに加えて、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、典型的には、クローン化核酸の発現レベルを向上させること、または組み換えDNAを保有する細胞の同定を容易にすることを目的とする他の特殊化エレメントを含有し得る。例えば、多くの動物ウイルスは、許容細胞型においてウイルスゲノムの染色体外複製を促進するDNA配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを保有するプラスミドは、適切な因子がプラスミド上に担持されているかまたは宿主細胞のゲノムとともに担持されているかの何れかの遺伝子によって提供される限り、エピソーム的に複製される。
本ベクターは真核レプリコンを含んでいてもよいし、または含まなくてもよい。真核レプリコンが存在する場合、適切な選択可能マーカーを用いて真核細胞中でベクターを増幅可能である。ベクターが真核レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅は不可能である。代わりに、組み換えDNAは、改変細胞のゲノムに組み込まれ、そこでプロモーターが所望の核酸の発現を指示する。
本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、本明細書中の上記および下記に詳細に記載のように、例えば単一mRNAからのいくつかのタンパク質の翻訳を可能にするさらなるポリヌクレオチド配列およびプロモーター−キメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列をさらに含み得る。
具体的な実施形態によれば、本コンストラクトは、本発明のポリヌクレオチドを含むポリシストロニックなmRNAをコードする。
単一の核酸コンストラクトから少数の遺伝子を発現させるために様々なコンストラクトスキームを利用し得る。具体的な実施形態によれば、本コンストラクトは本発明のポリヌクレオチドを含むポリシストロニックなmRNAをコードし;すなわち、本ポリヌクレオチドは、核酸コンストラクトの単一プロモーター配列からのポリシストロニックなメッセージとして同時転写され得る。単一のポリシストロニックなメッセージから全ての遺伝子の同時翻訳を可能にするために、IRES配列の下流のポリヌクレオチドセグメントの翻訳を可能にする内部リボソーム進入部位(IRES)配列を含むリンカー配列を介して異なるポリヌクレオチドセグメントを転写的に融合し得る。この場合、本発明のポリヌクレオチドの異なる組み合わせのコード配列を含む転写されたポリシストロニックなRNA分子は、ポリシストロニックなRNA分子のキャップ付加5’末端および内部IRES配列の両方から翻訳される。
あるいは、各2つのポリヌクレオチドセグメントは、核酸コンストラクトで形質転換しようとする細胞により発現されるプロテアーゼによって切断可能なプロテアーゼ認識部位を介して翻訳的に融合され得る。この場合、翻訳されたキメラポリペプチドは細胞により発現されたプロテアーゼによって切断される。
さらにあるいは、本発明のいくつかの実施形態の核酸コンストラクトは、各々が別個のポリヌクレオチドを個々に発現するためのものである少なくとも2つのプロモーター配列を含み得る。同一であってもよいし、または異なっていてもよいこれらの少なくとも2つのプロモーターは、1つ以上の細胞型において機能的な、構成的、組織特異的または制御可能(例えば誘導性)プロモーターであり得る。
ポリペプチドの分泌が所望される場合、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、分泌をもたらすシグナルペプチドをコードする核酸配列に対してインフレームで連結される「アービトリウム(arbitrium)」系(例えばAimP)の構成成分をコードする核酸配列を含む融合ポリペプチドとして発現され得る。具体的な実施形態によれば、シグナル配列はN末端シグナル配列である。具体的な実施形態によれば、シグナルペプチドはペプチド分泌の際に切断される。
適切なシグナル配列をコードするDNAは、E.コリ(E.coli)外膜タンパク質遺伝子(ompA)(Masuiら(1983)FEBS Lett.151(1):159−164;Ghrayebら(1984)EMBO J.3:2437−2442)およびE.コリ(E.coli)アルカリホスファターゼシグナル配列(phoA)(Okaら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82:7212)などの分泌型細菌タンパク質に対する遺伝子由来であり得る。他の原核シグナルとしては、例えば、ペニシリナーゼ、Ippまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダー由来のシグナル配列およびクオラムセンシング系のPhrファミリーのシグナル配列が挙げられる[例えば、Pottathil,M.&Lazazzera,B.A.Front.Biosci.8,d32−45(2003)に記載]。
具体的な実施形態によれば、シグナル配列は配列番号342に記載のとおりである。
細胞でのベクターの維持を確実にする選択可能マーカー遺伝子も発現ベクターに含まれ得る。好ましい選択可能マーカーとしては、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン(ネオマイシン)およびテトラサイクリンなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる(Daviesら(1978)Annu.Rev.Microbiol.32:469)。選択可能マーカーはまた、最少培地上または毒性代謝産物の存在下で細胞が増殖することも可能にし得、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路におけるものなどの生合成遺伝子も含み得る。
挿入されたコード配列の転写および翻訳に対して必要なエレメントを含有すること以外に、本発明のいくつかの実施形態の発現コンストラクトはまた、発現されるポリペプチドの安定性、産生、精製、収率または毒性を増強するために改変されている配列も含み得る。したがって、例えば、本発明のいくつかの実施形態のペプチド(例えばAimP)は、成熟ペプチドを産生するために細胞外プロテアーゼによって処理される配列を含有するプロペプチドであり得る。具体的な実施形態によれば、細胞外プロセシングのためのシグナルは、配列番号348で示されるとおりである。
または、例えば、本発明のいくつかの実施形態のタンパク質(例えばAimP)および異種タンパク質を含む融合タンパク質または切断可能な融合タンパク質の発現を操作し得る。このような融合タンパク質は、融合タンパク質がアフィニティークロマトグラフィーによって;例えば異種タンパク質に特異的なカラム上での固定化によって容易に単離され得るように設計され得る。切断部位が本発明のいくつかの実施形態のタンパク質と異種タンパク質との間で操作される場合、本発明のいくつかの実施形態のタンパク質は、切断部位を破壊する適切な酵素または薬剤での処理によってクロマトグラフィーカラムから放出され得る[例えば、Boothら(1988)Immunol.Lett.19:65〜70;およびGardellaら(1990)J.Biol.Chem.265:15854−15859]。
必要に応じて、組み換えポリペプチドの回収は培養中の適切な時間の後に行われる。「組み換えポリペプチドを回収する」という句は、ポリペプチドを含有する発酵培地全体を回収することを指し、分離または精製のさらなる段階を意味する必要はない。上記にもかかわらず、本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンAクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよびディファレンシャル・ソルビライゼーション(differential solubilization)などであるが限定されない様々な標準的タンパク質精製技術を使用して精製され得る。
適切な場合には、本ポリヌクレオチドは形質転換された生物における発現増加のために最適化され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、発現改善のために好ましいコドンを用いて合成され得る。
発現ベクター中に含まれる個々のエレメントは様々な立体配置で配置され得ることが認められよう。例えば、エンハンサーエレメント、プロモーターなど、および「アービトリウム(arbitrium)」系の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列(1つまたは複数)でさえも、「頭−尾」立体配置で配置され得、逆相補体(inverted complement)として、または相補的立体配置で、逆平行鎖として存在し得る。このような様々な立体配置が発現ベクターの非コードエレメントで生じる可能性がより高い一方で、発現ベクター内のコード配列の代替的立体配置も想定される。
哺乳動物発現ベクターに対する例としては、Invitrogenから入手可能な、pcDNA3、pcDNA3.1(+/−)、pGL3、pZeoSV2(+/−)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81、Promegaから入手可能なpCI、Strategeneから入手可能なpMbac、pPbac、pBK−RSVおよびpBK−CMV、Clontechから入手可能なpTRESおよびそれらの誘導体が挙げられるが限定されない。
細菌コンストラクトの例としては、E.コリ(E.coli)発現ベクターのpETシリーズが挙げられる[Studierら(1990)Methods in Enzymol.185:60−89)。
酵母において、米国特許出願第5,932,447号明細書に記載のように、構成的または誘導性プロモーターを含有する多数のベクターを使用し得る。あるいは、外来DNA配列の酵母染色体への組み込みを促進するベクターを使用し得る。
植物発現ベクターを使用する場合、コード配列の発現は多くのプロモーターによって駆動され得る。例えば、CaMVの35S RNAおよび19S RNAプロモーターなどのウイルスプロモーター[Brissonら(1984)Nature 310:511−514]またはTMVに対するコートタンパク質プロモーター[Takamatsuら(1987)EMBO J.6:307−311]を使用し得る。あるいは、RUBISCOの小サブユニットなどの植物プロモーター[Coruzziら(1984)EMBO J.3:1671−1680およびBrogliら(1984)Science 224:838−843]または熱ショックプロモーター、例えば、ダイズhsp17.5−Eまたはhsp17.3−B[Gurleyら(1986)Mol.Cell.Biol.6:559−565]が使用され得る。これらのコンストラクトは、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接DNA形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび当業者にとって周知の他の技術を用いて植物細胞に導入され得る。例えば、Weissbach&Weissbach,1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII,pp 421−463を参照のこと。
当技術分野で周知である昆虫および哺乳動物宿主細胞系などの他の発現系もまた、本発明のいくつかの実施形態により使用され得る。
レトロウイルスなどの真核ウイルスからの制御エレメントを含有する発現ベクターも使用され得る。SV40ベクターは、pSVT7およびpMT2を含む。ウシパピローマウイルス由来のベクターとしてはpBV−1MTHAが挙げられ、エプスタインバーウイルス由来のベクターとしてはpHEBOおよびp2O5が挙げられる。他の例示的なベクターとしては、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo−5、バキュロウイルスpDSVEおよび、SV−40初期プロモーター、SV−40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核細胞での発現に有効であることが示される他のプロモーターの指揮下でのタンパク質の発現を可能にする何らかの他のベクターが挙げられる。
上記のように、ウイルスは、多くの場合、宿主防御機序を回避するために進化した非常に特殊化された感染病原体である。典型的には、ウイルスは特定の細胞型に感染し、増殖する。ウイルスベクターの標的特異性は、その天然の特異性を利用して、所定の細胞型を特異的に標的とし、それによって感染細胞に組み換え遺伝子を導入する。したがって、本発明のいくつかの実施形態によって使用されるベクターのタイプは、形質転換される細胞のタイプに依存する。形質転換される細胞型に従い適切なベクターを選択する能力は、十分に当業者の能力の範囲内であり、したがって、選択の考慮事項の一般的な説明は本明細書中では提供しない。組み換えウイルスベクターは、側方感染(lateral infection)および標的特異性などの利点をもたらすので、本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのインビボ発現に有用である。
本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチド、発現ベクターおよびポリペプチドを細胞に導入するために様々な方法を使用し得る。本明細書中に記載のポリヌクレオチドおよび核酸コンストラクトは、本明細書中で以下に詳細にさらに記載のように、当技術分野で公知の何らかの方法によって細胞に導入され得る。あるいはまたはさらに、本明細書中に記載のポリペプチドを細胞自体と接触させ得る。
細胞は特定の生物の内部、例えば哺乳動物の体内または植物の内部に含まれ得ることが認められよう。
したがって、具体的な実施形態によれば、導入および/または接触はインビボで行われる。
別の具体的な実施形態によれば、導入および/または接触はエクスビボまたはインビトロで行われる。
本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを細胞に導入するために様々な方法を使用し得る。このような方法は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989,1992)、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989),Changら、Somatic Gene Therapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995),Vegaら、Gene Targeting,CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995),Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988およびGilboaら[Biotechniques 4(6):504−512,1986]で全般的に記載され、例えば、安定的または一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組み換えウイルスベクターによる感染が挙げられる。加えて、正−負選択法については、米国特許第5,464,764号明細書および同第5,487,992号明細書を参照のこと。
ウイルス感染による核酸の導入は、ウイルスの感染性ゆえにより高い遺伝子移入効率が得られ得るので、リポフェクションおよびエレクトロポレーションなどの他の方法を超えるいくつかの長所がある。
現在好ましいインビボ核酸移入技術としては、アデノウイルス、レンチウイルス、I型単純ヘルペスウイルスまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)および脂質に基づく系など、ウイルスまたは非ウイルスコンストラクトによる遺伝子移入が挙げられる。遺伝子の脂質介在性移入に対する有用な脂質は、例えば、DOTMA、DOPEおよびDC−Cholである[Tonkinsonら、Cancer Investigation,14(1):54−65(1996)]。遺伝子治療での使用に最も好ましいコンストラクトはウイルスであり、最も好ましくはアデノウイルス、AAV、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。レトロウイルスコンストラクトなどのウイルスコンストラクトは、少なくとも1つの転写プロモーター/エンハンサーまたは遺伝子座規定エレメント(1つまたは複数)、またはオルタナティブスプライシング、核RNA輸出もしくはメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段によって遺伝子発現を調節する他のエレメントを含む。このようなベクターコンストラクトはまた、ウイルスコンストラクト中に既に存在しない限り、パッケージングシグナル、長い末端反復配列(LTR)またはその一部、ならびに使用されるウイルスに適切な正および負鎖プライマー結合部位も含む。陽イオン性脂質、ポリリジンおよびデンドリマーなどの、非ウイルス性である他のベクターが使用され得る。
導入方法にかかわらず、本教示は、本明細書中に記載のように、ポリヌクレオチド、核酸コンストラクトおよび/またはポリペプチドを含む単離細胞を提供する。
本明細書中で使用される場合、「細胞」という用語は、原核または真核細胞を指す。本発明のいくつかの実施形態において使用され得る細胞の非限定例としては、コード配列を含有する、組み換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物;コード配列を含有する組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母;組み換えウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)を感染させた、またはコード配列を含有するTiプラスミドなどの組み換え発現ベクターにより形質転換された植物細胞系が挙げられるが限定されない。
具体的な実施形態によれば、細胞は細菌である。
具体的な実施形態によれば、細胞は哺乳動物細胞である。
具体的な実施形態によれば、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、HEK293、PER.C6、HT1080、NS0、Sp2/0、BHK、ナマルバ、COS、HeLaおよびVero細胞からなる群から選択される。
別の具体的な実施形態によれば、細胞は初代細胞である。
具体的な実施形態によれば、細胞は細胞株である。
細胞は、血液、筋肉、神経、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、胸腺、食道、胃、腸、腎臓、精巣、卵巣、毛髪、皮膚、骨、乳房、子宮、膀胱、脊髄または様々な種類の体液を含むが限定されない適切な組織由来であり得る。
具体的な実施形態によれば、細胞は本発明のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドを内因的に発現しない。
具体的な実施形態によれば、細胞は内因性にAimRを発現する。
本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、その天然の位置におけるネイティブ遺伝子の発現および生物のゲノムにおける発現レベルを指す。
以下の実施例のセクションで示されるように、アービトリウム(arbitrium)系は、特定の標的部位への特定のDNAの組み込みを調節するためにペプチドを使用する遺伝学的系ある。したがって、本教示は、一般的に誘導性遺伝子発現について本明細書上記で記載される、および特にゲノム編集を調節するための、ポリヌクレオチド、核酸コンストラクトおよび/またはポリペプチドの使用を示唆する。
したがって、本発明の一態様によれば、関心のある発現産物を発現する方法であって、
(i)関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるAimR応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入し、ここでAimRがAimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRがヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含むこと;および
(ii)XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含むAimPペプチドと細胞を接触させ、ここでAimPペプチドがAimRポリペプチドを結合させ、AimR応答配列からAimRポリペプチドを解離させることが可能であること、
を含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
(i)関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるAimR応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入し、ここでAimRがAimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRがヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含むこと;および
(ii)XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含むAimPペプチドと細胞を接触させ、ここでAimPペプチドがAimRポリペプチドを結合させ、AimR応答配列からAimRポリペプチドを解離させることが可能であること、
を含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、関心のある発現産物を発現させる方法であって、関心のある発現産物をコードする異種核酸配列に操作可能に連結されるAimR応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、このAimRがAimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRがヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
具体的な実施形態によれば、本方法は、AimRをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。
本発明の別の態様によれば、関心のある発現産物を発現させる方法であって、関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるAimR応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み;核酸コンストラクトが、AimRポリヌクレオチドの発現を指示するためのAimRポリヌクレオチドおよびAimRにとって異種のシス作用性制御エレメントを含み、
AimRが、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRが、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
AimRが、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、AimRが、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
具体的な実施形態によれば、本方法は、細胞をAimPペプチドまたはそれをコードする核酸配列と接触させることを含む。
具体的な実施形態によれば、本方法は、AimR応答配列の発現および/または活性を下方制御することが可能な物質と細胞を接触させることを含む。
本明細書中で使用される場合、「発現を下方制御する」という句は、転写および/または翻訳を妨害する様々な分子を使用してゲノムレベル(例えば相同組み換えおよび部位特異的エンドヌクレアーゼ)および/または転写レベル(例えばRNAサイレンシング剤、例えばRNA干渉(RNAi)、転写遺伝子サイレンシング(TGS)、転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)、クエリング(quelling)、同時抑制および翻訳抑制)で、またはタンパク質レベル(例えばアプタマー、低分子および阻害ペプチド、アンタゴニスト、ポリペプチドを切断する酵素、抗体など)で発現を下方制御することを指す。
具体的な実施形態によれば、下方制御剤は核酸剤である。
具体的な実施形態によれば、下方制御剤は、クラス2CRISPR/Casのエフェクタータンパク質(例えばCas9、Cpf1、C2c1、C2c3)である。
具体的な実施形態によれば、下方制御剤は、CRISPR/Cas系のcrRNAまたはsgRNAである。
具体的な実施形態によれば、下方制御剤はRNAiである。
具体的な実施形態によれば、発現を下方制御することは、それぞれRT−PCRまたはウエスタンブロットによって検出される場合にmRNAおよび/またはタンパク質が存在しないことを指す。
他の具体的な実施形態によれば、発現を下方制御することは、それぞれ下方制御剤の非存在下での場合と比較したときの、RT−PCRまたはウエスタンブロットによって検出される場合のmRNAおよび/またはタンパク質のレベルの低下を指す。減少は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%減少であり得る。
以下の実施例のセクションで開示されるAimXの発現および/または活性を下方制御するために発明者らによって使用されるCRISPR/Cas系は新規であるので;本発明の一態様によれば、AimR応答配列の発現および/または活性を下方制御可能である単離核酸剤が提供される。
具体的な実施形態によれば、下方制御剤は、AimXの発現および/または活性を下方制御可能である。
本明細書中で使用される場合、「発現する」または「発現」は、核酸および/またはタンパク質レベルでの遺伝子発現を指す。発現は当技術分野で公知の方法を用いて判定し得るが、例えば選択可能マーカー遺伝子、ノーザンブロット分析、PCR分析、DNA配列決定、RNA配列決定、ウエスタンブロット分析および免疫組織化学に限定されない。
関心のある発現産物の発現の結果、活性が調整される場合、DNA組み込みの有効性の認定はまた、活性を決定することによっても判定され得る。
さらに、当業者は、ポリヌクレオチドまたはコンストラクトでのDNA組み込み事象を受けた形質転換細胞を効率的に選択するための陽性および/または陰性選択マーカーを含むノックイン/ノックアウトコンストラクトを容易に設計し得る。陽性選択は、外来DNAを取り込んだクローンの集団を濃縮するための手段を提供する。このような陽性マーカーの非限定例としては、ヒトインフルエンザヘマグルチニン(HA)タグ、グルタミンシンテターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、Hisタグ、FLAGペプチドおよび、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンおよびブラスチシジンS耐性カセットなどの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。陰性選択マーカーは、ランダムな組み込みおよび/またはマーカー配列(例えば陽性マーカー)の排除に対して選択するために必要である。このような陰性マーカーの非限定例としては、ガンシクロビル(GCV)を細胞傷害性ヌクレオシド類似体に変換する単純ヘルペス−チミジンキナーゼ(HSV−TK)、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ARPT)が挙げられる。
具体的な実施形態によれば、関心のある発現産物は細胞に対して内因性である。
他の具体的な実施形態によれば、関心のある発現産物は細胞に対して外来性である。
上記のように、関心のある発現産物はDNA編集剤であり得る。したがって、具体的な実施形態によれば、本方法は、DNA編集剤によって細胞のゲノムに組み込もうとする核酸配列を細胞に導入することを含む。
有効性を認定し、細胞のゲノムへの核酸配列の組み込みを検出するための方法は当技術分野で周知であり、これには、DNA配列決定、電気泳動、酵素に基づくミスマッチ検出アッセイおよびハイブリッド形成アッセイ、例えばPCR、RT−PCR、RNase保護、インシトゥハイブリッド形成、プライマー伸長、サザンブロット、ノーザンブロットおよびドットブロット分析が含まれるが限定されない。
別の態様によれば、
(i)AimR応答配列を含むポリヌクレオチド;
(ii)このAimRをコードするポリヌクレオチド;
(iii)AimPペプチド;および/または
(iv)このAimR応答配列の発現および/または活性を下方制御可能である物質
のうちの少なくとも2つを包装する包装材料を含む、関心のある発現産物を発現させることが特定される製品が提供される。
(i)AimR応答配列を含むポリヌクレオチド;
(ii)このAimRをコードするポリヌクレオチド;
(iii)AimPペプチド;および/または
(iv)このAimR応答配列の発現および/または活性を下方制御可能である物質
のうちの少なくとも2つを包装する包装材料を含む、関心のある発現産物を発現させることが特定される製品が提供される。
本製品は、2つ、3つまたは全て;すなわち(i)+(ii)、(i)+(iii)、(i)+(iv)、(ii)+(iii)、(ii)+(iv)、(i)+(ii)+(iii)、(ii)+(iii)+(iv)、(i)+(ii)+(iv)、(i)+(iii)+(iv)または(i)+(ii)+(iii)+(iv)を含み得る。
別の態様によれば、
(a)本発明の(2)〜(6)ポリヌクレオチドまたはその機能的断片または本明細書中の上記に記載のものを含む核酸コンストラクトのうち少なくとも1つ;および
(b)AimPペプチド、AimPポリヌクレオチド、その機能的断片、それらを含む核酸コンストラクトまたは本明細書中の上記に記載のようなAimR応答配列下方制御剤のうち少なくとも1つ
を包装する包装材料を含む、関心のある発現産物を発現させることが特定される製品が提供される。
(a)本発明の(2)〜(6)ポリヌクレオチドまたはその機能的断片または本明細書中の上記に記載のものを含む核酸コンストラクトのうち少なくとも1つ;および
(b)AimPペプチド、AimPポリヌクレオチド、その機能的断片、それらを含む核酸コンストラクトまたは本明細書中の上記に記載のようなAimR応答配列下方制御剤のうち少なくとも1つ
を包装する包装材料を含む、関心のある発現産物を発現させることが特定される製品が提供される。
具体的な実施形態によれば、AimRをコードするポリヌクレオチドは、AimRポリヌクレオチドの発現を指示するためのAimRにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクトに含まれる。
具体的な実施形態によれば、本製品はマルチクローニングサイト(MCS)を含む。
具体的な実施形態によれば、本製品は関心のある発現産物をコードするポリヌクレオチドを含む。
本発明のこれらの態様の具体的な実施形態によれば、(i)、(ii)、(iii)および/または(iv)または(a)および(b)は別個の容器に包装される。
本発明のこれらの態様のさらに他の具体的な実施形態によれば、(i)、(ii)、(iii)および/または(iv)または(a)および(b)はc−処方中にある。
本願から練られた特許の存続期間中に、多くの関連するDNA編集剤が開発されることが予想され、DNA編集剤という用語の範囲は、全てのこのような新しい技術を先験的に含むものとする。
本明細書中で使用される場合、「約」という用語は±10%を指す。
「含む(comprises)」、「含むこと(comprising)」、「含む(includes)」、「含むこと(including)」、「有すること(having)」という用語およびそれらの活用形は、「含むが限定されない」を意味する。
「からなる(consisting of)」という用語は、「含み、それに限定される」ことを意味する。
「から本質的になる(consisting essentially of)」という用語は、組成物、方法または構造がさらなる成分、段階および/または部分を含み得るが、さらなる成分、段階および/または部分が特許請求の範囲の組成物、方法または構造の基本的および新規な特徴を実質的に変えない場合に限る。
本明細書中で使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈からの明らかな別段の指示がない限り、複数形への言及を含む。例えば、「化合物」または「少なくとも1つの化合物」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
本出願を通じて、本発明の様々な実施形態は範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は単に便宜上および簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能な部分的範囲ならびにその範囲内の個々の数値全てを具体的に開示しているとみなすべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6など、ならびに例えば1、2、3、4、5および6のようなその範囲内の個々の数など、部分的範囲を具体的に開示しているとみなすべきである。これは範囲の幅に関係なく適用される。
本明細書中で数値範囲が示されるときはいつでも、それは示された範囲内の何らかの引用される数字(分数または整数)を含むことを意味する。第1の指定数と第2の指定数の「範囲にあること/その間の範囲にある」および第1の指定数から第2の指定数までの「範囲にあること/範囲にある」は、本明細書中で交換可能に使用され、第1および第2の指定数およびその間の分数および整数の数の全てを含むものとする。
本明細書中で使用される場合、「方法」という用語は、所与の課題を達成するための、方式、手段、技術および手順を指し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者により、公知であるか、または公知の方式、手段、技術および手順から容易に開発されるかの何れかの、方式、手段、技術および手順が挙げられるが限定されない。
特定の配列リストを参照するとき、このような参照は、例えば、配列決定エラー、クローニングエラーまたは、塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加をもたらす他の改変から生じる小さな配列変異を含む場合、その相補的配列に実質的に対応する配列も包含すると理解されるべきであるが、ただし、このような変異の頻度は、50ヌクレオチド中1個未満、あるいは100ヌクレオチド中1個未満、あるいは200ヌクレオチド中1個未満、あるいは500ヌクレオチドに1個未満、あるいは1000ヌクレオチド中1個未満、あるいは5,000ヌクレオチド中1個未満、あるいは10,000ヌクレオチド中1個未満であるものとする。
明確にするために、別個の実施形態の文脈で記載される本発明の特定の特性は、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできることを理解されたい。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈に記載の本発明の様々な特性は、別個にまたは何らかの適切なサブコンビネーションで、または本発明の何らかの他の記載の実施形態で適切なようにも提供され得る。様々な実施形態の文脈に記載の特定の特性は、実施形態がそれらの要素なしでは操作不能でない限り、これらの実施形態の必須の特性と見なされるべきではない。
本明細書中、上記で描かれるような、および特許請求の範囲のセクションで主張される本発明の様々な実施形態および態様は、次の実施例で実験的な裏付けを得る。
実施例
本明細書中、上記で描かれるような、および特許請求の範囲のセクションで主張される本発明の様々な実施形態および態様は、次の実施例で実験的な裏付けを得る。
実施例
ここで、上記の説明と一緒に本発明のいくつかの実施形態を非限定的に例示する以下の実施例を参照する。
一般に、本明細書中で使用される命名法および本発明で利用される実験方法には、分子的、生化学的、微生物学的および組み換えDNA技術が含まれる。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、全て、本明細書中で完全に示されるかのように参照により組み込まれる、”Molecular Cloning:A laboratory Manual”Sambrookら(1989);”Current Protocols in Molecular Biology”Volumes I−III Ausubel,R.M.,ed.(1994);Ausubelら”Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,”A Practical Guide to Molecular Cloning”,John Wiley & Sons,New York(1988);Watsonら”Recombinant DNA”,Scientific American Books,New York;Birrenら(eds)”Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”,Vols.1−4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998);米国特許第4,666,828号明細書;同第4,683,202号明細書;同第4,801,531号明細書;同第5,192,659号明細書および同第5,272,057号明細書で示されるような方法;”Cell Biology:A Laboratory Handbook”,Volumes I−III Cellis,J.E.,ed.(1994);”Culture of Animal Cells−A Manual of Basic Technique” by Freshney,Wiley−Liss,N.Y.(1994),Third Edition;”Current Protocols in Immunology”Volumes I−III Coligan J.E.,ed.(1994);Stitesら(eds),”Basic and Clinical Immunology”(8th Edition),Appleton & Lange,Norwalk,CT(1994);MishellおよびShiigi(eds),”Selected Methods in Cellular Immunology”,W.H.Freeman and Co.,New York(1980)を参照し;利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献で広範に記載されており、例えば米国特許第3,791,932号明細書;同第3,839,153号明細書;同第3,850,752号明細書;同第3,850,578号明細書;同第3,853,987号明細書;同第3,867,517号明細書;同第3,879,262号明細書;同第3,901,654号明細書;同第3,935,074号明細書;同第3,984,533号明細書;同第3,996,345号明細書;同第4,034,074号明細書;同第4,098,876号明細書;同第4,879,219号明細書;同第5,011,771号明細書および同第5,281,521号明細書;”Oligonucleotide Synthesis”Gait,M.J.,ed.(1984);“Nucleic Acid Hybridization”Hames,B.D.,およびHiggins S.J.,eds.(1985);”Transcription and Translation”Hames,B.D.,およびHiggins S.J.,eds.(1984);”Animal Cell Culture”Freshney,R. I.,ed.(1986);”Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press,(1986);”A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal,B.,(1984)および”Methods in Enzymology”Vol.1−317,Academic Press;”PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications”,Academic Press,San Diego,CA(1990);Marshakら”Strategies for Protein Purification and Characterization−A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)を参照のこと。他の一般的な参考文献はこの文書を通じて提供する。その中の手順は当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。そこに含有される情報は全て、参照により本明細書中に組み込まれる。
材料および方法
材料および方法
オリゴおよび試薬−オリゴは全て、Sigma(St.Louis,Missouri)またはIntegrated DNA Technologies(IDT,San Jose,California)から購入した。合成ペプチドは、脱塩、純度98%で、Peptide 2.0Inc.(Chantilly,Virginia)から購入した。
馴化培地の調製−手順の概略図を図1Aで示す。具体的には、0.1mM MnCl2および5mM MgCl2を補充したLB培地中でB.スブチリス(B.subtilis)株168の一晩培養物を1:50希釈し、振盪しながら37℃で光学密度(O.D)600nm=0.5に達するまで温置した。ファージ(phi29、phi105、rho14またはphi3T)をMOI=1で細菌培養物に添加し、3時間温置した。培地を4℃にて10分間、4000rpmで遠心分離し、上清を0.2μmフィルター(GE Healthcare Life Sciences,Whatman,CAT#10462200)でろ過した。3,000NMWL(3kDa)のカットオフのAmicon Ultra遠心分離フィルター(Milipore,CAT#UFC900324)を使用することによって、ファージおよび大きい分子を培地からさらにろ過して除去した。培地中にファージが残存していないことを検証するためにプラークアッセイを行った。
プロテイナーゼK処理−トリトリアキウム・アルブム(Tritriachium album)由来のプロテイナーゼK−アガロース(Sigma,CAT#P9290)7.5mg(1回の反応あたり)を750μLの滅菌水で2回洗浄し、次いで0.1mM MnCl2および5mM MgCl2を補充した750μLのLBで再懸濁した。その後、試験管を再度遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄したプロテイナーゼKを含有する試験管に、1.5mLのphi3T由来の馴化培地または対照培地を添加した。培地をプロテイナーゼKとともに37℃で2時間温置した。培地を遠心分離し、上清を感染アッセイのために回収した。
ファージ感染培養物の増殖動態−細菌の一晩培養物をLB培地で1:100希釈し、振盪しながら37℃でO.D.600nm=0.1に達するまで温置した。細菌培養物を室温で10分間、4000rpmで遠心分離した。上清を廃棄し、初期体積の10%で0.1mM MnCl2および5mM MgCl2を補充したLB培地中でペレットを再懸濁した。馴化培地または合成アービトリウム(arbitrium)ペプチドを補充した培地に、1:9(細菌対培地)の比で濃縮細菌培養物を添加し、室温で1時間温置した。その後、培養物にMOI=0.1でファージを感染させた。96ウェルプレート中でTECAN Infinite 200プレートリーダーを使用して、600nmの波長で光学密度測定を行った。馴化培地または合成ペプチド添加を含まなかった感染実験については、希釈した一晩培養物を初期対数期まで増殖させ、次いで上記のように感染させた。
溶原性に対する半定量的PCRアッセイ−細菌の一晩培養物をO.D600nm=0.1に達するまで1:100希釈した。培地を上記のように(馴化培地または対照培地と)交換し、培養物を室温で1時間温置した。細菌にMOI=5でphi3Tを感染させた。馴化培地または対照培地の存在下で感染の0、15、30、40および60分後に細胞ペレットを回収した。DNeasy血液および組織キット(CAT#69504)を用いてDNAを抽出した。ファージphi3T DNA、B.スブチリス(B.subtilis)DNAおよび組み込まれたファージと細菌ゲノムとの間の接合部を検出するための多重PCRアッセイは、Goldfarbら29において以前記載されたように行った。
マススペクトロメトリー−3kDaのMWカットオフフィルター(Millipore)を用いて馴化培地をろ過し、Oasis HLB uElutionプレート(Waters Corp.)を用いて低分子量分画を脱塩した。試料を乾燥させ、分析まで−80℃で保存した。全てのクロマトグラフィー段階に対してULC/MSグレードの溶媒を使用した。スプリットレスnano−Ultra Performance Liquid Chromatography(10kpsi nanoAcquity;Waters,Milford,MA,USA)を用いて各試料を充填した。移動相は、A)H2O+0.1%ギ酸およびB)アセトニトリル+0.1%ギ酸であった。逆相C18トラッピングカラム(内径180μm、長さ20mm、粒径5μm、Waters)を使用して試料の脱塩をオンライン(online)で行った。続いて、0.35μL/分でT3 HSSナノカラム(内径75μm、長さ250mm、粒径1.8μm;Waters)を用いてペプチドを分離した。以下の勾配を用いて、カラムから質量分析計にペプチドを溶出させた:65分で4%から35%B、5分で35%から90%B、5分間90%で維持し、次いで初期条件に戻した。FlexIonナノスプレー装置(Proxeon)を使用して、ナノESIエミッタ(10μmチップ;New Objective;Woburn,MA,USA)を通じて四重極オービトラップ質量分析計(Q Exactive Plus,Thermo Scientific)にオンライン(online)でnanoUPLCを連結させた。前駆体質量574.33および287.67、一価および二価形態のペプチドSAIRGA(配列番号269)を標的とする並行反応モニタリング(PRM)モードでデータを取得した。MS2分解能を35,000に設定し、最大注入時間を200ミリ秒に設定し、自動ゲインコントロールを2e5に設定した。生データをSkylineソフトウェア30バージョン3.5にインポートした。生成物イオン強度を抽出し、総曲線下面積を計算した。
AimR精製−Transfer−PCR(TPCR)31を用いて、以下のプライマーを使用して、発現ベクターpET28a(Novagen)にAimR(配列番号1)をクローニングした。
続いて、C末端6xHisタグとともにE.コリ(E.coli)BL21(DE3)細胞においてAimRを発現させた。誘導剤として200μM IPTG(イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド)を用いて15℃で約〜18時間、発現を行った。細胞ペレットを溶解緩衝液[50mM Tris pH8、0.3M NaCl、20mMイミダゾール、2mM DTT、0.2mg/mLリゾチーム、1μg/mL DNAse、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Calbiochem)]中で再懸濁し、4℃で細胞破壊装置により破壊し、15,000gで30分間清澄化した。清澄化した溶解物をHisTrap_FF_5mLカラム(GE Healthcare)上に載せ、50mM Tris pH8、0.3M NaCl、20mMイミダゾールおよび2mM DTTを含有する緩衝液で洗浄した。0.5Mイミダゾールを含有する同じ緩衝液を用いてAimRを一段階でカラムから溶出させた。AimRを含有する分画をプールし、20mM Tris pH8、0.3M NaCl、2mM TCEPで平衡化したサイズ排除カラム(HiLoad_16/60_Superdex_200_prepgrade,GE_Healthcare)に注入した。純粋なAimRを含有する分画をプールし、液体窒素を使用してアリコートで瞬間凍結した。
20mM Tris pH8、0.3M NaCl、2mM TCEPを含有する緩衝液で平衡化した分析用ゲルろ過カラム(Superdex_200_Increase_10/30 GL、GE Healthcare)に純粋なAimRを注入した。純粋なAimRの移動位置を以下のモル比でAimR−ペプチド混合物の移動位置と比較した:AimRおよびSAIRGA(配列番号269)ペプチド(1:2)、AimRおよびGMPRGA(配列番号271)ペプチド(1:1)。以下の既知のタンパク質/ポリマーの移動位置を監視することによってカラムを較正した(図4Cの挿入図):ブルーデキストラン(2000kDa)、サイログロブリン(669kDa)、アポフェリチン(443kDa)、β−アミラーゼ(200kDa)、アルコールデヒドロゲナーゼ(150kDa)、アルブミン(66kDA)および炭酸脱水酵素(29kDa)。
マイクロスケール熱泳動(MST)−−80℃でTris/NaCl緩衝液(50mM Tris pH8.0、150mM NaCl、2mM TCEP)中で保存した2段階精製6xHisタグ付加AimRを氷上で融解させ、分析前に4℃で10分間、21,000gで遠心分離した。ペプチド[SAIRGA(配列番号269)およびGMPRGA(配列番号271)]を50mM Tris−HCl pH8.0、150mM NaCl中で最終濃度100μMまで可溶化した。AimRを200nMに希釈し、0.1%[v/v]プルロン酸(NanoTemper)を含有するTris/NaCl緩衝液中で調製した、9〜4000nMの間で変動する16種類の異なるペプチド濃度とともに温置した。およそ3μLをNT.LabelFree Zero−Background Premium Coated Capillaries(NanoTemper)に充填し、Monolith NT.LabelFreeデバイス(NanoTemper)に挿入した。Monolith NT.LabelFree機器(Nanotemper)を使用して、23℃で60%MST出力(赤外線レーザー)および20%LED出力でMST実験を行った。正規化した初期蛍光と温度ジャンプおよび熱泳動後との間の比を計算し、3回の独立した実験操作から平均値を求めた(実験操作物は測定前に室温で20分間温置した。)。ペプチド濃度に対する蛍光比のプロットを使用して、ファージタンパク質およびその同族ペプチドリガンドの結合能を評価した。
ChIP−Seq−ChIP−Seq実験のために、B.スブチリス(B.subtilis)細胞培養物を100mL中でLB中0.1のO.Dまで37℃で増殖させた。その後、50mLの培養物を室温で10分間、4000rpmで遠心分離した。次いで、最終濃度1μMでペプチド(SAIRGA、配列番号269)を含有するかまたはこれを欠くかの何れかの25mLのLBを用いてペレットを懸濁した。振盪しながら室温でのさらなる温置のために、培養物を置いた。次に培養物に、5x107PFU/mLファージの最終プラーク形成単位(PFU)を有するファージ(MOI=0.5)を感染させた。ファージ感染の15分後、培養物を4℃で5分間、3000gで遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを1mLの氷冷1xPBS(10mMリン酸、137mM NaCl、2.7mM KCl、pH7.4)中で再懸濁した。
DNAに対するタンパク質のホルムアルデヒド固定のために、1mLのPBS再懸濁ペレットを62.5μLのホルムアルデヒド(Thermoscientific 16%ホルムアルデヒド溶液(w/v)メタノール不含アンプル)と混合して、溶液内で1%(w/v)の最終ホルムアルデヒド濃度を得た。ホルムアルデヒド含有細胞懸濁液を穏やかに撹拌しながら室温で10分間温置した。その後、75μLの2Mグリシン(f.c.150mM)を添加して残留ホルムアルデヒドを不活性化した。グリシン含有試料をさらに10分間氷上で維持し、続いて4℃にて1分間、5500gで遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを1mLの氷冷1xPBSで洗浄した。各試料について遠心分離および洗浄を3回反復した。
50mM Tris−HCl pH7.5、150mM NaClおよびプロテアーゼ阻害剤混合物(cOmplete ULTRA Tablets Roche)を含有する600μLの溶解緩衝液中で細胞ペレットを懸濁した。溶解緩衝液含有細胞を溶解マトリックスB(MP Biomedicals)0.1mmシリカビーズ上に適用した。混合物およびビーズをFastPrep−24(MP Biomedicals)装置に入れ、4℃で20秒間、6m/秒で激しく振盪した。次いで、製造者の説明書に従って、4℃にて10,000gで1分間の遠心分離によって、溶解させた細胞からビーズを分離した。続いて、溶解させた細胞混合物を含有する300μLの上清を1.5mLのBioruptor(登録商標)Plus TPXマイクロチューブ(diagenode)に移し、(製造者の説明書に従って)10分間氷上で維持した。BioRuptor plus(Diagenode)装置を使用して、試料を4℃にて15分間フルパワーで超音波処理した(30秒オフ/オンサイクル)。超音波処理により、DNAを〜500bpの平均サイズにせん断した。超音波処理後、試料を4℃で10分間、20,000gで遠心分離した。
IP実験のために、溶解緩衝液および細胞内容物を含有する上清をTriton X−100およびデオキシコール酸塩と混合し、プロテアーゼ阻害剤(cOmplete ULTRA Tablets Roche)を補充した50mM Tris−HCl、pH7.5、150mM NaCl、1%[vol/vol]TritonX−100、0.1%[wt/vol]デオキシコール酸ナトリウムを含有する最終IP−緩衝組成物を得た。次いで、抗6xHisタグ(登録商標)ChIPグレード抗体(abcam(ab9108))を超音波処理した試料に添加し、4℃で一晩穏やかに混合した。並行して、Protein G Dynabeads(100.04D;Invitrogen)をIP緩衝液で3回洗浄した。
回転させながら室温で1時間混合することにより、100μLのDynabeadsプロテインGを用いて、DNA−タンパク質−抗体複合体(300μL)を捕捉した。0.72μLの0.5M EDTA(f.c.1mM)をその混合物に添加して、室温でDNase活性を妨げた。ビーズを磁気スタンド(Qiagen)に適用し、室温にてIP緩衝液(200μL)で3回洗浄した。ロッキングプラットフォーム上で65℃にて15分間、100μLおよび50μLの溶出緩衝液(50mM Tris−HCl、pH7.5、10mM EDTA、1%[wt/vol]SDS)を用いて2回の溶出段階を適用した。溶出液(100μL)を5μLのプロテイナーゼK(20mg mL−1)とともに50℃で1時間、続いて65℃で6時間温置した。QIAquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて免疫沈降DNAを回収した。次に、既存のプロトコール32を用いて免疫沈降DNAをNGSライブラリに変換し、75nt長の読み取りデータを生成させるNextSeq500 Illumina装置上で配列決定した。
溶原性に対する配列決定に基づくアッセイ−細菌の一晩培養物をO.D600nm=0.1に達するまで1/100希釈した。培地を上記のように交換して[SAIRGA(配列番号269)を含むかまたは含まない0.1mM MnCl2および5mM MgCl2を補充したLB]、室温で1時間温置した。感染多重度(MOI)=2で細菌にphi3Tを感染させた。培地中の最終濃度1μMのSAIRGA(配列番号269)ペプチドの存在下または非存在下で感染の5、10、20および60分後に細胞ペレットを回収した。QIAGEN DNeasy血液および組織キット(CAT#69504)を用いてDNAを抽出し、NextSeq500上でIlluminaに基づく全ゲノム配列決定に供した。各試料中の溶原菌の相対存在量は、一方の末端でプロファージDNAに、および他方の末端で細菌DNAにまたがる組み込み接合部にマッピングされた読み取りデータに対する、連続した組み込み部位にマッピングされた読み取りデータの数を用いて推定した。
CRISPRi実験−ファージ遺伝子を発現抑制する菌株の構築は、キシロースプロモーター22によって調節されるdCas9コンストラクトをB.スブチリス(B.subtilis)168ゲノムのlacA領域に挿入し、thrC領域に対する構成的プロモーター下で選択遺伝子を標的とするスペーサーとともにsgRNAを挿入することによって行った[aimRを標的とするスペーサー:ACCATTTACTTTTTCATAAC(配列番号358)、aimXを標的とするスペーサー:TTTCCGCTTCATTCTCAAGA(配列番号359)]。CRISPRi株における感染アッセイは、0.1mM MnCl2、5mM MgCl2および0.2%キシロースを補充したLB中で行った。
aimR発現抑制CRISPRi株を背景としたaimRの相補性アッセイのために、以下のプライマーを使用して、aimRをphi3Tゲノムから増幅させた。
これらのプライマーは、それから上流領域の158塩基と一緒に、そのC末端の6xHisとともに、aimRを増幅する。増幅断片をpBS1Cプラスミド(BGSCから入手)にクローニングした。続いて、点突然変異およびギブソンアセンブリを含有するプライマーセットを用いて、補完されるaimR遺伝子中のネイティブプロトスペーサー隣接モチーフを同義の点突然変異(aimR遺伝子のコドン#20でC−>A)によって変化させた。次いで、修飾遺伝子をB.スブチリス(B.subtilis)ゲノムにおいてamyE遺伝子座に組み込んだ。aimR発現抑制CRISPRi株の背景でaimX相補性を構築した。このために、以下のプライマーを使用して、aimXをphi3Tゲノムから増幅させた。
これらのプライマーはその上流領域から60塩基およびその下流領域から107塩基(遺伝子終結因子を含有)と一緒にaimXを増幅する。キシロースプロモーターを含有するように修飾されたpBS1Cプラスミドに増幅aimXをクローニングし、次にB.スブチリス(B.subtilis)ゲノム中のamyE遺伝子座に組み込んだ。
RNA−seq−ペプチドありおよびなしでの遺伝子発現の差を決定するために、1μM合成SAIRGA(配列番号269)ペプチドの存在下または非存在下で、0.1mM MnCl2および5mM MgCl2を補充したLB培地中で細菌を1時間温置した。その後、細菌にphi3Tを感染させ(MOI=0.1);感染の0、5、10および20分後に細胞ペレットを回収した。
RNA抽出およびRNA−seqは、Darら33に記載のように行った。簡単に述べると、Fastprepホモジナイザー(MP Biomedicals,Santa Ana,California)を用いてペレットを溶解させ、FastRNA PRO blueキット(MP Biomedicals,116025050)を用いて製造者の説明書に従ってRNAを抽出した。RNA試料をTURBOデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)(Life technologies、AM2238)で処理し、断片化緩衝液(Ambion)で72℃にて1:45分間断片化した。2.5xSPRIビーズを添加することによって反応物を浄化した。ビーズを80%EtOHで2回洗浄し、5分間風乾した。H2Oを用いてRNAを溶出させた。Ribo−Zero rRNA Removal Kit(epicenter、MRZB12424)を使用することによってrRNAを枯渇させた。NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit(NEB、E7420)を用いて以下の調整を行い、鎖特異的RNA−seqを実施した:全てのクリーンアップ段階はx1.8SPRIビーズを用いて行い、最終修復段階後に1回だけクリーンアップ段階を行った。
aimR遺伝子のCRISPRi発現抑制の効果を判定するために、初期対数期の細菌にphi3Tを感染させ(MOI=0.1)、感染の20分後に細胞ペレットを回収した。RNA−seqライブラリを上記のように準備した。
Illumina NextSeq500プラットフォームを用いてRNA−seqライブラリの配列決定を行った。配列決定した読み取りデータをデマルチプレックス化し、アダプタは初期設定のパラメータでfastx_clipperを使用してトリミングした。初期設定パラメータとともにNovo Align(Novocraft)V3.02.02を用いて、読み取りデータを参照ゲノムにマッピングした(遺伝子アノテーションおよび配列は、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)str.168に対してはGenbank:NC_000964、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)BEST7003に対してはAP012496からダウンロードした。)。下流の分析および正規化されたゲノムワイドRNA−seqを包含するマップは全て、Darら33に記載のとおりに作製した。
示差的発現分析−合成ペプチドありおよびなしで感染の20分後に各バイオロジカルレプリケートについて遺伝子あたりの読み取りデータを計算し、各レプリケートにおいてファージゲノムにヒットする全マッピング読み取りデータに対して正規化した。各条件における1遺伝子あたり平均3個のレプリケートのlog10変換を使用して、図4Iをプロットし、遺伝子AimXの倍率変化を計算した。
AimR相同体およびアービトリウム(arbitrium)ペプチドコードの同定−Integrated Microbial Genomes(IMG)ウェブサーバ(img(dot)jgi(dot)doe(dot)gov/cgi−bin/mer/main(dot)cgi)でBLASTオプションを用いてphi3T AimR受容体に対する相同体を検索した。phi3T AimR(配列番号114)をクエリ配列として提供し、1e−35のe値閾値を有する全ての単離ゲノムに対して検索した。各AimR相同体の遺伝子近隣は、IMG「遺伝子近隣」という表示を介して目視で検査し、ファージタンパク質としてアノテーションされたタンパク質の隣に位置することが分かった遺伝子はプロファージで見られるものと見なした。各AimR相同体に対してすぐ下流の遺伝子は、それがIMGウェブサーバによって予測されるようにシグナルペプチドを含有した場合、それぞれのAimP遺伝子と見なした。すぐ下流の遺伝子にアノテーションされなかった場合、Expasy Translate Tool(web(dot)expasy(dot)org/translate/)を使用してAimR相同体のすぐ下流の遺伝子間領域を翻訳し、短い翻訳ORFをAimPシグネチャについて調べた。この分析の結果を上記の表3で示す。
プラスミド構築−以下のプライマーおよびオリゴヌクレオチドを用いてベクターを構築した。
コンストラクト#1は、2つの構成成分:バクテリオファージPhi3TウイルスaimR−aimP−aimX遺伝子座および本明細書中でGFPと表記する蛍光レポーター遺伝子(Superfolder Green Fluorescent Protein(sfGFP(sp))を含む。E.コリ(E.coli)中でプラスミドを増殖させ、続いてバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)BEST7003ゲノムに形質転換することを可能にする標的シャトルプラスミド(pDR111)に、両構成成分を挿入した。pDR111は2つの配列を含有し、それぞれが、相同組み換えを通じてコンストラクト#1の挿入を可能にする標的遺伝子(amyE)の5’末端または3’末端の何れかに適合する。さらに、pDR111は、所望の挿入物、すなわちコンストラクト#1、の選択を可能にするスペクチノマイシン抗生物質耐性(spec)遺伝子も含む。
具体的には、aimR、aimPおよびaimXコード遺伝子の遺伝子間スペースを含む、aimR、aimPおよびaimXコード遺伝子を含有するバクテリオファージPhi3Tゲノムから、プライマーA+Bを用いて、aimR−aimP−aimX遺伝子座(配列番号372)を直接増幅させた(Erez Zら、Nature.2017;541(7638):488−493)。
バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)最適化スーパーフォルダ−GFPを含有するプラスミドpDR111−sfGFP(sp)から、プライマーC+Dを用いてレポーターGFP遺伝子(配列番号373)を増幅させた(Overkamp Wら、Appl Environ Microbiol.2013 Oct;79(20):6481−90)。
aimXの37bp長の3’UTRのすぐ下流に、3個の停止コドン、続いてリボソーム結合部位(本明細書中でrbsとして表示)を挿入することによって、Phi3T aimR−aimP−aimX遺伝子座にレポーター遺伝子GFPを遺伝子融合させた(図6参照)。転写終結因子エレメント(rrnB)をGFP遺伝子に対して下流に配置した。aimR−aimP−aimX遺伝子座とGFPレポーター遺伝子との遺伝子融合により、コンストラクト#1(図6、配列番号374)が得られた。
NEBビルダーHIFI DNAアセンブリ反応キット(NEB、MA、USA)を用いて制限部位EcoRIとBamHIとの間でシャトルプラスミドpDR111にこのコンストラクトを挿入し、その結果、プラスミドpDR111−コンストラクト#1(図6、配列番号375)が得られた。
pDR111−コンストラクト#1プラスミドをエシェリキア・コリ(Escherichia coli)中で増殖させ、次にRPXオペロンの上流の逆鎖上のspec遺伝子と一緒にamyE遺伝子内でバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)ゲノムにコンストラクト#1オペロンを挿入するためのシャトルベクターとして使用した(図7)。ハイスループットIllumina NextSeq配列決定装置を用いた全ゲノム配列決定を適用して、コンストラクト#1オペロンの配列および細菌ゲノム内のその正確な位置を検証した。
最小化発現系を作製するために、プライマーE+Fを用いてpDR111−コンストラクト#1プラスミドを増幅させ、続いてNEB builder HIFI DNAアセンブリ反応キット(NEB,MA,USA)を用いてDNAアセンブリを行い、その結果、aimP遺伝子を欠くプラスミドpDR111−コンストラクト#1を得た。プライマーG+Hを使用してこのコンストラクトをさらに増幅させ、続いて同様にaimX遺伝子の欠失をもたらすDNAアセンブリを行った。最終産物であるpDR111−コンストラクト#2(配列番号377)は、コンストラクト#1の二重遺伝子欠失ΔaimP/ΔaimX変異体[すなわちコンストラクト#2(配列番号376)]を含有した。pDR111−コンストラクト#2をpDR111−コンストラクト#1と同様にシャトルプラスミドとして使用した。これにより、コンストラクト#1について上述したように、細菌ゲノムにコンストラクト#2が挿入された(図8)。
プラスミド含有培養物の増殖動態−野生型(WT)バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)BEST7003株およびコンストラクト#1またはコンストラクト#2を含有するバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)BEST7003株のスターター増殖物を増殖曲線が定常相を示すまで3mLのルリア−ベルターニ(LB)ブロス中で培養した。続いて、LBブロスまたは、62.5nM〜1000nMの濃度範囲でSAIRGA(配列番号269)ペプチドを補充したLBブロス中で1/100の比で細菌細胞を希釈した。TECAN Infinite 200プレートリーダーを使用して、96ウェルプレート中で光学密度(600nmでのO.D.)およびGFP蛍光レベル(488nm励起/518nm発光)を経時的に測定した。
溶菌/溶原性決定に影響するPHI3Tファージ感染後に短いペプチドが培地に放出される。
対照培地中で、およびファージ由来馴化培地中で、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)str.168の培養物に4つの異なるファージ:phi29(ポドウイルス科、絶対溶菌型(obligatory lytic))、phi105(シフォウイルス科、テンペレート、ラムダ様)、rho14(シフォウイルス科、テンペレート、ラムダ様)またはphi3T(シフォウイルス科、テンペレート、spBeta様)のうちの1つを感染させた(図1A参照)。驚くべきことに、試験したファージの1つ、phi3Tに対して、細菌増殖曲線から推測されるように、馴化培地中の感染動態が対照培地中の動態と劇的に異なっていた。図1Bで示されるように、感染の2時間後に、phi3T感染細菌培養物のかなりの割合が対照培地中で溶菌した一方で、馴化培地中で増殖させた培養物は大部分が溶菌から保護されていると思われた。この効果は、試験した他の3つのファージの何れについても検出されず、対照培地と馴化培地との間の感染動態の差は観察されなかった。さらに、phi3T感染から調製された馴化培地は、他のファージの感染動態に影響を及ぼさず、逆もまた同じく、他のファージから調製された馴化培地はphi3Tの感染動態に影響を及ぼさなかった。
まとめると、これらの結果から、phi3TによるB.スブチリス(B.subtilis)の感染中に小分子が培地に放出され、この分子がこのファージの下流感染の感染動態に影響を及ぼし得ることが示唆される。
バチルス属および他のフィルミクテス門におけるクオラムセンシング(QS)は、典型的には培地に分泌され、細胞内または膜結合受容体によって感知される短いペプチドに基づくことが知られている1−3。したがって、培地中の活性物質がタンパク質性であるか否かを試験するために、馴化培地をプロテイナーゼKで処理した。図1Eで示されるように、プロテイナーゼ処理した馴化培地中の感染動態は、対照培地中の動態と同様であり、このことから、培地中の活性構成成分が実際にタンパク質性であることが示唆された。バチルス属クオラムセンシング系におけるコミュニケーションペプチドは頻繁にオリゴペプチドパーミアーゼトランスポーター(OPP)によって細胞に取り込まれるので、OPPトランスポーターの必須サブユニットであるoppDが欠失した細菌においてファージ感染動態を試験した(図1C)。機能的OPPを欠く細菌にphi3Tを感染させた場合、ファージ由来の馴化培地はその効果を失い、このことから、馴化培地中の活性物質が3aa〜20aa長ペプチドであることが示唆されたが、これは、グラム陽性細菌のOPPトランスポーターによりインポートされ得るペプチドのサイズ範囲である4。
oppD突然変異体におけるファージ感染動態の綿密な試験から、野生型細菌の感染と比較した場合、対照培地および馴化培地の両方において培養物溶菌の増大が示された(図1B−C)。ファージphi3Tは、溶菌性または溶原性サイクルの何れかを通じて感染することを選択し得る溶原ファージである6,7。溶菌サイクルが細菌細胞の溶菌につながる一方で、溶原性サイクルではファージゲノムが細菌ゲノムに組み込まれ、溶原化された細菌は同じファージによるさらなる感染から防御されるようになる7。したがって、対照培地中でphi3Tを感染させた細菌の増殖曲線は、培養物の部分的な、しかし完全ではない溶菌、続いて溶原化細菌の増殖ゆえの培養物の回復を示す。oppD突然変異体の感染動態曲線が培養物の完全な溶菌を示すという観察から、培地に放出された活性ペプチドがファージの溶原性を促進し得ることが示唆される。したがって、ファージ由来馴化培地中での感染中に観察された溶菌の減少が、溶原性向上ゆえであるか否かを試験するために、半定量的PCRアッセイを使用して、感染中のB.スブチリス(B.subtilis)ゲノムへのファージphi3Tの組み込みを調べた。実際、図1Dで示されるように、細菌培養物を馴化培地中で感染させると、溶原性の向上が観察された。
まとめると、これらの結果から、phi3T感染中に短いペプチドが培地に放出され、このペプチドが蓄積するにつれて、それがファージ子孫の後の世代の溶菌/溶原性の決定に影響を及ぼすコミュニケーション物質として作用することが示唆される。この新たに発見された推定上のコミュニケーション分子は、本明細書中で「アービトリウム(arbitrium)」(ラテン語の「決定」)として示される。
溶菌/溶原性決定に影響を与えるペプチドは、aimP遺伝子によってコードされる。
phi3Tは40年前に単離され、ファージのspBetaファミリーに属すると位置付けられたが、今日までそのゲノムは配列決定されていなかった6。アービトリウム(arbitrium)ペプチドをコードする、可能性のある遺伝子系を探索するために、phi3Tのゲノムを配列決定し、分析した。このゲノムは、185個の予測遺伝子を含有する単一の128kbpコンティグになった。培地に分泌されると思われるタンパク質を探索するために、signalPソフトウェアを使用して、phi3T中のオープンリーディングフレーム(ORF)の全てをN末端シグナルペプチドの有無についてスクリーニングした8。3つのORFがシグナルペプチドを有すると予測され、このことから、それらが分泌されるかまたは膜局在することが示唆される。これらの遺伝子のうち2つは無関係に見えたが(一方は複合的な膜タンパク質であり、他方は大きなヌクレアーゼであった。)、第3の遺伝子はバチルス属クオラムセンシングペプチドを連想させる特性を示した(図2A〜B)。B.スブチリス(B.subtilis)におけるクオラムセンシング系のPhrファミリーに属するペプチドは、典型的にはN末端シグナル配列を含有するプレプロペプチドからプロセシングされ、これはSec系によって認識され、分泌時に切断される1。細胞外に出ると、プロペプチドはさらにB.スブチリス(B.subtilis)細胞外プロテアーゼによってプロセシングされ、プロペプチドのC末端で通常見られる成熟短鎖(5〜6アミノ酸)ペプチドが生成される1。選択された候補遺伝子は短いORF(43アミノ酸、配列番号227)をコードし、N末端シグナル配列およびそのC末端のペプチド成熟のための共通切断部位の両方を示した(図2A〜B)。このphi3Tコードタンパク質が分泌され、細胞外で成熟させられる場合、プロペプチド切断後の予測成熟コミュニケーションペプチドは、Ser−Ala−Ile−Arg−Gly−Ala(SAIRGA、配列番号269)である。実際、マススペクトロメトリー分析により、馴化培地中にSAIRGAペプチドが存在するが、対照培地中には存在しないことが確認された(図2C)。
予測された成熟ペプチドが実際にファージ溶原性決定に影響を与えるアービトリウム(arbitrium)分子であるか否かを試験するために、合成SAIRGA(配列番号269)ペプチドの量を増加させながら補充したLB培地中で細菌にphi3Tを感染させた。培地がより高濃度の合成ペプチドを含有していた場合、培養物溶菌の減少が明らかであったように、ファージ感染動態に対する明確な濃度依存的効果が観察された(図2D)。これらの効果はそのペプチドに特異的であり、ペプチドのより短い5アミノ酸型(SAIRGまたはAIRGA、それぞれ配列番号355および354)に対しても、PhrC(配列番号350)、B.スブチリス(B.subtilis)の既知のクオラムセンシングペプチド、に対しても、これらの効果は観察されなかった(図2D〜E)。培養増殖曲線に対する最大効果は500nMのSAIRGA(配列番号269)ペプチド濃度で観察され、それを超えると効果は飽和したように見えた(図2D)。
感染培養物の動態に対する観察されたSAIRGAペプチドの効果が溶原性向上の結果であることを検証するために、本ペプチドありまたはなしで、phi3T感染中の経時実験から回収した細菌の全DNAを直接配列決定した。細菌ゲノム中のインタクトなファージ組み込み部位を通過する配列決定読み取りデータの割合をその部位でのファージ組み込みを示す読み取りデータと比較することによって、各時点での溶原化細菌の割合を直接定量した。注目すべきことに、SAIRGA(配列番号269)ペプチドの存在下で一貫した溶原性の上昇が観察され、ペプチドなしで増殖させた細菌の18%(±3.3%)と比較したとき、48%(±7.9%)の細菌が感染後60分で溶原化された(図2F)。これらの結果から、同定されたファージコード遺伝子が分泌され、ファージ溶菌/溶原性決定にさらに影響を与える成熟アービトリウム(arbitrium)コミュニケーションペプチドにプロセシングされることが示唆される。この遺伝子を本明細書ではaimPと表示した。
aimP遺伝子は、378アミノ酸長のオープンリーディングフレーム(配列番号114)をコードする遺伝子(配列番号1)のすぐ下流に位置し、これら2つの遺伝子がファージゲノムからポリシストロンとして同時転写され得ることが示唆される。この上流遺伝子は、グラム陽性細菌のQS系におけるRRNPPファミリーの細胞内ペプチド受容体に典型的な、予測テトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインをコードする9−11(図2A)。したがって、aimRと表示されたこの上流遺伝子が、AimP由来のアービトリウム(arbitrium)ペプチドの受容体であるという仮説を立てた。この仮説を試験するために、C末端Hisタグ付加AimRを精製し、マイクロスケール熱泳動(MST)を使用して、精製受容体と合成アービトリウム(arbitrium)ペプチドとの間の結合を測定した。この分析から、phi3T AimR受容体と同族SAIRGA(配列番号269)ペプチドとの間の、EC50=138nMの有効ペプチド濃度(95%の信頼区間で118〜162nM)で高親和性結合を示し(図2G)、このことから、AimRがほぼ、アービトリウム(arbitrium)SAIRGAペプチドの細胞内受容体として機能することが確認された。
バチルス属ファージにおいて溶原性をもたらす保存ペプチドコミュニケーションコード
この系の存在度を本質的に理解するため、利用可能な配列決定されたゲノムにおいてaimR遺伝子の相同体を見つけるために相同性検索を行った。この検索を使用して、AimR相同体の112個の実例が検出され、バチルス属ファージにおけるか、またはプロファージにおけるそれらの全てが事実上、バチルスゲノム内に組み込まれていることが分かり、このことから、この遺伝子が主にファージ関連機能を果たすことが示唆される(図3Aおよび上の表3)。全ての場合において、aimR相同体は、aimP候補遺伝子、すなわちN末端シグナルペプチドをコードする短いポリペプチド、続いてバチルス属細胞外プロテアーゼのプロセシング成熟シグナルと一致するプロペプチド、の上流で見られた(上の表3;図2B)。予想される成熟ペプチドの配列は多様であったが、それらは全て、それらの配列組成について厳密な規則を維持し、5番目の位置に必須のグリシン残基、6番目の位置にグリシンまたはアラニン、および4番目の位置では正荷電残基が優先された(図3B〜C)。
ファージにコードされるコミュニケーションペプチドが配列特異的にファージ溶原性を導くという仮説を試験するために、AimR−AimP系の相同体が同定されたspBetaファージの感染動態を評価した。spBetaの予想成熟AimP由来アービトリウム(arbitrium)ペプチドはGMPRGA(配列番号271)であり、これはphi3TのSAIRGA(配列番号269)ペプチドとは3個のN末端アミノ酸が異なる配列であった。図3D〜Fで示されるように、GMPRGA(配列番号271)ペプチドはspBetaの溶原性を促進した一方で、それはphi3Tの溶原性プロファイルに影響を及ぼさず;同様にphi3T由来のSAIRGA(配列番号269)ペプチドはspBetaの感染動態に影響を及ぼさなかった。したがって、spBeta由来GMPRGA(配列番号271)ペプチドは、phi3T AimR受容体への特異的結合を示さなかった(図2G)。
まとめると、これらの結果から、ファージ種特異的にファージ溶原性を導く配列特異的ペプチドコードが実証される。
AimPペプチエ(PEPTIE)はそのAimRのオリゴマー状態を変化させ、AimXの発現を変化させる。
グラム陽性細菌のコミュニケーション系において、コミュニケーションペプチドのその受容体への結合は通常、転写反応の再プログラム化につながる。これは、受容体が腸球菌におけるPrgX12,13、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)群のPlcR14−16および他の系17,18の場合など、転写制御因子である場合に、直接;または受容体が脱リン酸化によって下流の転写制御因子を制御するホスファターゼ19,20であるバチルス属のRap/Phr系の場合のように、または立体障害21の場合にように、間接的に、の何れかで起こり得る。AimRのN末端における予測されるヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフの存在から、アービトリウム(arbitrium)系の受容体が直接DNAを結合させることが示唆される。AimRがインビボでファージDNAを結合させるか否かを試験するために、dCas9(CRISPRi)技術22を使用してファージAimR遺伝子の発現を抑制するがクローニングされたHisタグ付加AimRを抑制しないようにしたB.スブチリス(B.subtilis)168菌株へとHisタグ付加aimR遺伝子を操作した(本明細書中、上記の材料および方法を参照のこと)。続いて、ファージ感染の15分後に、アービトリウム(arbitrium)ペプチドの存在下および非存在下で、ChIP−seqアッセイを行った。AimRに結合したDNAの配列決定から、AimRが、aimP遺伝子のすぐ下流で、ファージゲノム中の単一部位を結合させることが明らかに示された(図4A−B)。さらに、この結合は、アービトリウム(arbitrium)ペプチドが培地中に存在しない場合にのみ起こり、このことから、アービトリウム(arbitrium)ペプチドのそのAimR受容体への結合が、ファージDNA上のその結合部位からの受容体の解離につながることが示唆された。
AimR精製の工程中、タンパク質がゲルろ過カラムにおいてホモ二量体として移動することが注目された。しかし、phi3T由来のSAIRGA(配列番号269)ペプチドを添加すると、タンパク質は単量体として忠実に移動した(図4C)。これらの結果から、アービトリウム(arbitrium)ペプチドが、DNA結合二量体からペプチド結合解離単量体への、そのAimR受容体のオリゴマー状態の変化を介して、シグナルを伝達することが示唆される。spBeta GMPRGA(配列番号271)ペプチドを添加しても、AimRオリゴマー状態の変化にはつながらず、これによってもまた、アービトリウム(arbitrium)系におけるペプチドとその受容体との間の高い特異性が指摘された(図4C)。
そのAimR受容体へのアービトリウム(arbitrium)ペプチドの結合がファージゲノムにおける転写反応につながるか否かを調べるために、ペプチドありおよびなしで、感染の時間経過中に細菌から抽出されたRNAに対してRNA−seqを適用した。図4D〜Iで示されるように、発現における最も劇的な変化が単一の遺伝子について観察されたが、これは本明細書中でaimXと呼ばれ、AimR DNA結合部位のすぐ下流にあった。この遺伝子は、感染後10分で開始して、アービトリウム(arbitrium)ペプチドの非存在下で実質的な発現を示したが、培地に1μMのSAIRGA(配列番号269)ペプチドを補充した場合、その発現は20倍超、減少した(図4D〜G)。
これらの結果から、AimRが、アービトリウム(arbitrium)ペプチドの非存在下で二量体としてファージDNAに結合した場合、AimXの転写活性化因子となることが示唆される。実際、AimRがdCas9を用いて発現抑制されたとき、AimXの発現が劇的に減少した(図4D)。さらに、AimRの発現抑制の結果、溶原性が上昇したが、このことから、おそらくAimXの発現を活性化することによって、ファージDNAへのAimRの結合により溶原性が阻害される(または溶菌が促進される)ことが示唆された(図4H)。
AimRノックダウンは感染の20分後にAimX以外の何れの遺伝子に対しても劇的な転写効果をもたらさなかったので(図4I)、AimRの主な機能がaimX遺伝子の発現を調節することであり、AimX遺伝子産物が、AimR−AimPコミュニケーション系に対して下流で働き、溶菌−溶原性決定を実行するという仮説を立てた。この仮説と一致して、dCas9を用いたAimXのノックダウンの結果、溶原性向上が起こった(図4H)。さらに、AimRノックダウンの背景において異所性AimXで補完すると(AimX発現は自然に抑制される、図4D)、その結果、培養物溶菌が起こり、AimXがAimRに対して下流で機能し、溶原性の阻害剤または溶菌サイクルの促進剤として働くことが実証された(図4H)。
まとめると、発明者らは、溶菌サイクルに入るかまたは感染細菌を溶原化するかを決定するために、ファージの大きなファミリーがコミュニケーションペプチドを使用することを示した。ある意味で、記載されるコミュニケーション機序は、子孫ファージ粒子がその祖先とコミュニケーションをとること、すなわち前のサイクルで良好な感染を完了した先行ファージの量を測定することを可能にする。このストラテジーの背後にある生物学的論理は明らかである:1個のファージが細菌コロニーに遭遇すると、感染の最初のサイクルから産生される子孫ファージのための十二分なプレイがあり、それゆえに溶菌サイクルが好ましい。感染動態の後期段階において、細菌細胞の数は、子孫ファージをもはや新たな宿主に感染させられなくなるリスクがある点まで減少する。次いで、実行可能な複製に対する機会を保つために溶原性に切り替わることはファージにとって理に適っている。
アービトリウム(arbitrium)系によって、少し前の先行する感染の量を推定し、それによって溶菌サイクルを使用するかまたは溶菌サイクルを使用するかを決定するための洗練された機序がファージ粒子に対して提供される。理論により縛られることなく、この結果から、以下のモデルが指摘される(図5A〜C):細菌培養物の初期感染時に、phi3Tは初期オペロンAimR−AimPを発現する。二量体としてのAimRは、AimXの発現を活性化し、次に、溶原性への経路を遮断し、溶菌サイクルを促進する。同時に、AimPは培地に分泌され、成熟アービトリウム(arbitrium)ペプチドにプロセシングされる。感染の数サイクル後、アービトリウム(arbitrium)ペプチドは培地中で蓄積する。この段階で、ファージ粒子が、まだ感染していない細菌に感染する場合、OPPトランスポーターによって細菌に内部移行させられるアービトリウム(arbitrium)ペプチドの濃度はAimR受容体を結合させるのに十分に高くなる。結合時に、AimR受容体はそのオリゴマー状態を活性二量体から不活性単量体に変化させ、AimX溶原性阻害剤を発現抑制し、溶原性に導く。
関心のある発現産物を発現させるための系としてのアービトリウム(arbitrium)系
AimR−AimP系がファージ非依存的状況で異種発現系として機能し得ることを実証するため、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)BEST7003におけるGFPレポーター遺伝子の発現を調節するためにそれを利用した。
この目的で、アービトリウム(arbitrium)遺伝子座(AimR−AimP−AimR結合部位−AimX)を改変し、AimX遺伝子がGFPレポーター遺伝子に融合されるようにした(コンストラクト#1、図6)。このコンストラクトをAmyE遺伝子座でバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)BEST7003のゲノムに組み込んだ(図7)。図9Aで示されるように、コンストラクト#1の組み込みの結果、おそらくコンストラクトによってコードされるAimPペプチドの発現ゆえに、細菌の液体培養物中でGFPの顕著な発現が起こり、約6時間の培養後にプラトーに達した。さらに、様々な濃度のアービトリウム(arbitrium)ペプチド(SAIRGA、配列番号269)の存在下において液体培地中で細菌を増殖させた場合、GFP蛍光の濃度依存性発現が観察され、ペプチドの非存在下で最大蛍光が検出され;増殖培地中のペプチド濃度に比例して蛍光が徐々に抑制されるようになった。
続いて、AimR遺伝子と、AimR結合部位と、AimR結合部位に対して下流のGFPと、のみを含有する最小化発現系を改変し(コンストラクト#2、図8)、AmyE遺伝子座でバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)BEST7003のゲノムに組み込んだ(すなわちこの系はAimPおよびAimX遺伝子を含有しなかった。)。コンストラクト#1を含有する細菌と同様に、最小化コンストラクト#2の組み込みの結果、細菌の液体培養物中でGFPの顕著な発現が起こり;様々な濃度のアービトリウム(arbitrium)ペプチド(SAIRGA、配列番号269)の存在下で細菌を増殖させると、培地中のペプチドの濃度に依存したGFPの異なる発現が観察された(図9B)。
重要なこととして、SAIRGA(配列番号269)ペプチド濃度またはGFP発現は細菌の増殖速度に影響を及ぼさなかった(図9A〜B)。
本発明をその具体的な実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替形態、変更形態および変形形態が当業者にとって明らかであろうことは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内に含まれる全てのこのような代替形態、変更形態および変形形態を包含するものとする。
本願で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書中に組み込まれることが示されるのと同程度にその全体において参照により本明細書中に組み込まれる。さらに、本願におけるあらゆる参考文献の引用または特定は、このような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。セクションの見出しが使用される範囲で、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
Claims (48)
- 関心のある発現産物を発現させる方法であって、
(i)前記関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるAimR応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入し、ここで前記AimRが、前記AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、前記AimRがヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含むこと;および
(ii)XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含むAimPペプチドと前記細胞を接触させ、ここで前記AimPペプチドが前記AimRポリペプチドを結合させ、前記AimR応答配列から前記AimRポリペプチドを解離させることが可能であること、
を含み、
それにより前記関心のある発現産物を発現させる、方法。 - 関心のある発現産物を発現させる方法であって、前記関心のある発現産物をコードする異種核酸配列に操作可能に連結されるAimR応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、前記AimRが、前記AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、前記AimRがヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含み、それにより前記関心のある発現産物を発現させる、方法。
- 関心のある発現産物を発現させる方法であって、前記関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるAimR応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み;核酸コンストラクトが、AimRポリヌクレオチドおよび前記AimRポリヌクレオチドの発現を指示するための前記AimRにとって異種のシス作用性制御エレメントを含み、
前記AimRが、前記AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、前記AimRが、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含み、それにより前記関心のある発現産物を発現させる、方法。 - 前記AimRをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含む、請求項1〜2の何れか1項に記載の方法。
- AimPペプチドまたはこれをコードする核酸配列と前記細胞を接触させることを含み、前記AimPペプチドが、XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含み、前記AimPペプチドが前記AimRポリペプチドを結合させ、前記AimR応答配列から前記AimRポリペプチドを解離させることが可能である、請求項2〜3の何れか1項に記載の方法。
- 前記AimR応答配列の発現および/または活性を下方制御することが可能な物質と前記細胞を接触させることを含む、請求項2〜3の何れか1項に記載の方法。
- 前記関心のある発現産物が前記細胞にとって内因性である、請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
- 前記関心のある発現産物が前記細胞にとって外来性である、請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
- 関心のある発現産物を発現させるために特定される製品であって、
(i)AimR応答配列を含むポリヌクレオチドであって、前記AimRが、前記AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、前記AimRが、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含む、ポリヌクレオチド;
(ii)前記AimRをコードするポリヌクレオチド;
(iii)前記AimRポリペプチドを結合させ、前記AimR応答配列から前記AimRポリペプチドを解離させることが可能である、XXXXGG/Aのアミノ酸配列含むAimPペプチドまたはこれをコードする核酸配列;および/または
(iv)前記AimR応答配列の発現および/または活性を下方制御することが可能な物質
のうち少なくとも2つを包装する包装材料を含む、製品。 - 請求項9に記載の製品であって、前記AimRをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記AimRポリヌクレオチドの発現を指示するための前記AimRにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクトに含まれる、製品。
- マルチクローニングサイト(MCS)を含む、請求項9〜10の何れか1項に記載の製品。
- 前記関心のある発現産物をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項9〜11の何れか1項に記載の製品。
- 前記関心のある発現産物がDNA編集剤である、請求項1〜8の何れか1項に記載の方法または請求項9〜12の何れか1項に記載の製品。
- 前記AimR応答配列が、前記AimRを結合させるための核酸配列およびAimXポリヌクレオチドを含み、前記AimXポリヌクレオチドまたは前記AimXポリヌクレオチドによりコードされるAimXポリペプチドが、宿主細菌において前記AimRを発現する溶原ファージの溶原性を阻害可能である、請求項1〜8の何れか1項に記載の方法または請求項9〜12の何れか1項に記載の製品。
- 前記関心のある発現産物がAimX依存性DNA編集剤である、請求項14に記載の方法または製品。
- 前記DNA編集剤によって前記細胞のゲノムに組み込もうとする核酸配列を前記細胞に導入することを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記DNA編集剤がインテグラーゼである、請求項13または15の何れか1項に記載の方法または製品。
- 前記DNA編集剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、クラス2 CRISPR/Casのエフェクタータンパク質(例えばCas9、Cpf1、C2c1、C2c3)およびTALENからなる群から選択される、請求項13または15の何れか1項に記載の方法または製品。
- XXXXGG/Aのアミノ酸配列を含む単離AimPペプチドであって、AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含むAimRポリペプチドを結合させることが可能であり、前記AimRが、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含み;前記AimR応答配列からAimRポリペプチドを解離させることが可能である、単離AimPペプチド。
- 請求項19に記載のペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
- AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含む単離AimRポリペプチドであって、前記AimRが、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含む、単離AimPペプチド。
- 請求項21に記載のペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
- AimR応答配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記AimRが、前記AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、前記AimRが、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含む、単離ポリヌクレオチド。
- 前記AimR応答配列が、前記AimRを結合させるための核酸配列およびAimXポリヌクレオチドを含み、前記AimXポリヌクレオチドまたは前記AimXポリヌクレオチドによりコードされるAimXポリペプチドが、宿主細菌において前記AimRを発現する溶原ファージの溶原性を阻害可能である、請求項23に記載の単離ポリヌクレオチド。
- 請求項24に記載のポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリヌクレオチド。
- 請求項22および23または22および24に記載のポリヌクレオチドを含む、単離ポリヌクレオチド。
- 請求項20、22および24に記載のポリヌクレオチドを含むアービトリウム(arbitrium)系をコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記アービトリウム(arbitrium)系が、宿主細菌において前記アービトリウム(arbitrium)系を発現するファージの溶原性を調節可能である、単離ポリヌクレオチド。
- 請求項20、22、23または24の何れか1項に記載のポリヌクレオチドおよびマルチクローニングサイト(MCS)を含む、核酸コンストラクト。
- 請求項26〜27の何れか1項に記載のポリヌクレオチドおよびマルチクローニングサイト(MCS)を含む、核酸コンストラクト。
- 請求項20、22、23または24の何れか1項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項28に記載の核酸コンストラクトと、前記ポリヌクレオチドの発現を指示するための、前記AimP、前記AimR、前記AimR応答配列および/または前記AimXにとって異種であるシス作用制御エレメントと、を含む、核酸コンストラクト。
- 請求項26〜27の何れか1項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項29に記載の核酸コンストラクトと、前記ポリヌクレオチドの発現を指示するための、前記AimP、前記AimR、前記AimR応答配列および/または前記AimXにとって異種であるシス作用制御エレメントと、を含む、核酸コンストラクト。
- 前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つをそれぞれ発現する少なくとも2つの核酸コンストラクトを含む核酸コンストラクト系である、請求項29または31の何れか1項に記載の核酸コンストラクト。
- 前記ポリヌクレオチドを含むポリシストロニックmRNAをコードする、請求項28〜32の何れか1項に記載の核酸コンストラクト。
- AimR応答配列の発現および/または活性を下方制御可能である単離核酸物質であって、前記AimRが、前記AimR応答配列を結合させるためのDNA結合ドメインを含み、前記AimRが、ヘリックス−ターン−ヘリックス(HTH)モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを含む、単離核酸物質。
- 関心のある発現産物を発現させるために特定される製品であって、
(a)(i)請求項22〜24または26の何れか1項に記載の単離ポリヌクレオチド、
(a)(ii)請求項22〜24または26の何れか1項に記載のポリヌクレオチドおよびマルチクローニングサイト(MCS)を含む核酸コンストラクトおよびまたは
(a)(iii)請求項22〜24または26の何れか1項に記載のポリヌクレオチドおよび、前記ポリヌクレオチドの発現を指示するための前記AimRまたは前記AimXにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクト
のうち少なくとも1つと;
(b)(i)請求項19に記載の単離ペプチド、
(b)(ii)請求項20に記載の単離ポリヌクレオチド、
(b)(iii)請求項20に記載のポリヌクレオチドおよびMCSを含む核酸コンストラクト、
(b)(iv)請求項20に記載のポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドの発現を指示するための前記AimPにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクトおよび/または
(b)(v)請求項34に記載の単離物質
のうち少なくとも1つと、
を包装する包装材料を含む、製品。 - 関心のある発現産物をコードする核酸配列を含む、請求項22、23〜24または26〜27の何れか1項に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項28〜33の何れか1項に記載の核酸コンストラクトまたは請求項35に記載の製品。
- 前記関心のある発現産物がDNA編集剤である、請求項35または36の何れか1項に記載の、単離ポリヌクレオチド、核酸コンストラクトまたは製品。
- 前記AimPが、宿主細菌において前記AimRを発現する溶原ファージの溶原性をもたらすことが可能である、請求項1、4〜5、7〜20または27〜33または35〜37の何れか1項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
- 前記AimPが、配列番号269〜283または285〜286からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1、4〜5、7〜20または27〜33または35〜38の何れか1項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
- 前記AimRが、配列番号1〜113からなる群から選択される配列に対して少なくとも80%の同一性を有する核酸配列および/または配列番号114〜226からなる群から選択される配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜39の何れか1項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
- 前記AimRが、1〜113からなる群から選択される核酸配列および/または配列番号114〜226からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜39の何れか1項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
- 前記AimR応答配列が、配列番号287〜334からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項1〜18または23〜41の何れか1項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
- 前記AimR応答配列が配列番号378を含む、請求項1〜18または23〜41の何れか1項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
- 前記AimXが、配列番号336で示されるような核酸配列を含む、請求項14〜18または24〜33または35〜43の何れか1項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
- 前記AimRおよび前記AimPおよび/または前記AimR応答配列が、それを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に5’から3’に配置される、請求項1〜44の何れか1項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
- 前記AimPおよび前記AimR応答配列が、それを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に5’から3’に配置される、請求項1〜45の何れか1項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
- 前記AimRおよび前記AimPおよび/または前記AimR応答配列が、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に5’から3’に配置される、請求項1〜44の何れか1項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
- 前記AimPおよび前記AimR応答配列が、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に5’から3’に配置される、請求項1〜45の何れか1項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
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