KR20150107726A - 태아 헤모글로빈 재유도를 위한 bcl11a 원위 조절 요소의 표적화 - Google Patents

태아 헤모글로빈 재유도를 위한 bcl11a 원위 조절 요소의 표적화 Download PDF

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Abstract

게놈 수준에서 BCL11A 발현을 방해함으로써 세포에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키기 위한 방법 및 조성물이 여기에 제공된다. 또한 태아 헤모글로빈 수준의 재유도에 의한 혈색소병증의 치료에 관한 방법 및 조성물도 여기에 제공된다.

Description

태아 헤모글로빈 재유도를 위한 BCL11A 원위 조절 요소의 표적화{TARGETING BCL11A DISTAL REGULATORY ELEMENTS FOR FETAL HEMOGLOBIN REINDUCTION}
연관 출원의 교차 참조
본 출원은 2012년 11월 27일 출원된 미국 가출원 제61/730,323호, 2012년 11월 27일 출원된 미국 가출원 제61/730,369호, 2013년 3월 11일 출원된 미국 가출원 제61/776,144호, 및 2013년 10월 10일 출원된 미국 가출원 제61/889,174호의 35 U.S.C. §119(e) 하의 이익을 주장한다. 참조된 출원의 전체 교시는 여기에 참조에 의해 도입된다.
정부 투자
본 발명은 미합중국 내셔널 인스티튜트 오브 헬쓰(National Institute of Health)로부터 받은 승인 번호 5RO1HL032259 하의 정부 지원에 의해 이루어졌다. 미합중국 정부는 발명에 일정한 권리를 갖는다.
정상 성체 헤모글로빈은 4개의 글로빈 단백질을 포함하며, 그 중 둘은 알파(α) 단백질이고 그 중 둘은 베타(β) 단백질이다. 포유동물의 태아 발생동안, 특히 인간에서, 태아는 태아 헤모글로빈을 생산하며, 이는 두 β-글로빈 단백질 대신에 두 감마(γ)-글로빈 단백질을 포함한다. 신생아 기간 동안, 어느 시점에서, "태아 스위치(fetal switch)"라는 글로빈 스위치가 일어나며, 적혈구 전구체(erythroid precursor)는 주로 γ-글로빈을 제조하는 것으로부터 주로 β-글로빈을 제조하는 것으로 스위칭한다. 주로 태아 헤모글로빈 또는 HbF (α2γ2)의 생산으로부터 성체 헤모글로빈 또는 HbA (α2β2)의 생산으로의 발생 스위치는 임신 약 28 내지 34주에 개시되며 HbA이 우세하게 될 때까지 출생 직후에 계속된다. 이 스위치는 주로 감마-글로빈 유전자들의 감소된 전사와 베타-글로빈 유전자들의 증가된 전사에 기인한다. 건강한 성체들에 있어서 잔류 HbF 수준은 20배에 걸치는 변화를 갖고 유전적으로 조절됨에도 불구하고, 평균적으로 정상 성체의 혈액은 1% 미만의 HbF를 함유한다.
혈색소병증(Hemoglobinopathies)은 적혈구(Red Blood Cell(RBC))의 감소된 생산 및/또는 증가된 파괴(destruction)(용혈(hemolysis))가 있는, 유전적 원인의 다수의 빈혈을 포함한다. 이들은 또한 산소 농도 유지 능력의 동시적 저하를 갖는 이상(abnormal) 헤모글로빈의 생산으로 귀결되는 유전적 결함을 포함한다. 그러한 장애의 일부는 충분한 양으로 정상 β-글로빈을 생산하지 못하는 것을 포함하며, 다른 것은 정상 β-글로빈을 완전히 생산하지 못하는 것을 포함한다. 이들 β-글로빈 단백질과 연관된 장애를 일반적으로 β-혈색소병증이라 칭한다. 예를 들면, β-지중해빈혈(b-thalassemias)은, HbA 결핍 또는 부재로 이어지는, β-글로빈 유전자의 발현의 부분적 또는 전적인 결함에 기인한다. 겸상 혈구성 빈혈은 이상 (겸상) 헤모글로빈 (HbS)의 생산으로 이어지는, β-글로빈 구조 유전자 내의 점 돌연변이에 기인한다. HbS는 특히 산소제거된 조건 하에서 중합하기 쉽다. HbS RBC는 정상 RBC보다 더 손상되기 쉬우며 더 쉽게 용혈이 진행되어, 결국 빈혈에 이른다.
최근, β-혈색소병증을 갖는 환자에게서 글로빈 체인 불균형의 감소 또는 헤모글로빈 중합의 경향을 겨냥한 치료의 탐색은 태아 헤모글로빈 (α2γ2; HbF)의 약리학적 처치에 집중되어왔다. 그러한 접근방법의 치료적 잠재력은, 동형접합 β-지중해빈혈 및 유전성 고태아헤모글로빈혈증 (HPFH) 둘다의 공동 유전을 갖는 개체들의 마일드한 형질의 관찰에 의해, 뿐만 아니라, 성체 헤모글로빈을 합성하지 않지만 태아 헤모글로빈의 증가된 농도의 존재 하에 감소된 수혈 필요성이 관찰되는 동형접합 β-지중해빈혈을 갖는 환자들에 의해, 제시된다. 나아가,β 체인 이상성을 갖는 성체 환자의 어떤 집단은 태아 헤모글로빈 (HbF)을 정상 수준보다 더 높게 갖는 것이 관찰되었으며, 정상 성체 수준의 HbF를 갖는 환자보다 질환의 더 마일드한 임상적 경과를 갖는 것으로 관찰되었다. 예를 들면, 20-30% HbF를 발현하는 일 그룹의 사우디아라비아 겸상 혈구성 빈혈 환자들은 상기 질환의 마일드한 임상적 소견만 갖는다. 현재, 헤모글로빈 장애, 예컨대 겸상 혈구성 빈혈 및 β-지중해빈혈은, 증가된 HbF 생산에 의해 개선되는 것으로 받아들여지고 있다.
전술한 바와 같이, 태아 헤모글로빈으로부터 성체 헤모글로빈 (α2γ2; HbA)으로의 스위치는 통상 분만후 6개월간 진행한다. 그러나, β-혈색소병증을 갖는 대부분의 환자에서, 상류 γ-글로빈 유전자는 온전하고(intact) 완전히 기능적이며, 따라서 이들 유전자가 재활성화된다면, 기능적 헤모글로빈 합성이 성체기동안에도 유지될 수 있고, 질환 중증도가 개선될 수 있을 것이다. 불행히도, 글로빈 스위치의 기저의 생체내(in vivo) 분자 메커니즘은 잘 이해되어 있지 않다.
태아 헤모글로빈 생산의 재활성화의 실행가능성을 뒷받침하는 증거는, 클론원성 세포를 함유하는 말초 혈액이, 성장 인자들의 적절한 조합이 주어졌을 때, 적혈구 콜로니를 생산하고 반고체 배양에서 폭발(burst)하는 것으로 나타난 실험들로부터 나온다. 그러한 콜로니에서의 개별 세포는 태아 헤모글로빈 (HbF), 성체 헤모글로빈 (HbA) 또는 이들 둘의 조합을 축적할 수 있다. 성체 혈액으로부터의 배양에서, 유핵 적혈구는 HbA 단독(F-A+), 또는 HbF와 HbA의 조합(F+A+)을 축적한다. 중요하게는, 개별 콜로니는 F+ 및 F- 세포를 둘다 함유하며, 이는 두 타입 모두 같은 순환하는 줄기 세포들의 자손임을 시사한다. 따라서, 배양에서의 발생의 초기 동안, 현재 알려지지 않은 메커니즘을 통해, 세포는 HbF를 발현하거나 또는 발현하지 않는 선택지(option)를 실행한다. 배양에서 발생중인 성체 F+ 세포의 비율은 생체내에서 사전프로그램된 것으로 보이지 않고, 배양 조건에 의존하는 것으로 보인다: 조합된 HbF 및 HbA 발현 경로로의 시프트(shift)는, 예를 들면, 활성화된 챠콜(charcoal)에 흡수될 수 있는 미확인 물질의 활성에 기인한, 높은 혈청 농도에 의해 시험관내에서 달성될 수 있다.
전반적으로, 글로빈 스위치에서 역할하는 분자의 동정은, 성체 헤모글로빈에 간섭하여 태아 헤모글로빈 합성을 유도하는 신규한 치료 전략의 개발에 있어서 중요하다. 그러한 분자는 태아 헤모글로빈 합성의 재활성화가 질환 중증도와 이환율을 유의하게 개선할 다양한 혈색소병증에의 치료적 개입의 개발을 위한 새로운 타겟(target)을 제공할 것이다.
여기서는 BCL11A 발현을 유전자 수준에서 방해함(disrupting)으로써 세포에서 태아 β-글로빈 수준을 증가시키는 방법 및 조성물이 제공된다. 또한 여기서는 태아 β-글로빈 수준의 재유도에 의한 혈색소병증의 치료에 관한 방법 및 조성물이 제공된다.
여기에 기재된 일 측면은, 감소된 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현을 갖는 전구 세포를 제조하는 방법으로서, 단리된 전구 세포를 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 19 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA에 결합하는 물질과 접촉시키고, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
여기에 기재된 다른 측면은, 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 유전자 조작 인간 세포(genetic engineered human cell)를 제조하는 방법으로서, 단리된 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 여기서는 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포도 제공된다. 일 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 유전자 변형은 특정 위치에서의 게놈 DNA 내의 결실이다. 일 실시형태에서, 상기 단리된 유전자 조작 인간 세포는 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 유전자 변형을 갖지 않는 대조 세포에 비해 BCL11A의 감소된(reduced) 또는 감소된(decreased) mRNA 또는 단백질 발현을 갖는다.
여기에 기재된 다른 측면은, 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 목적을 위한, 여기에 기재된 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포의 용도에 관한 것이다.
여기에 기재된 다른 측면은, 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한, 여기에 기재된 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포의 용도에 관한 것이다.
여기에 기재된 다른 측면은, 그에 따라 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준이 상승되는, 포유동물에서 혈색소병증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 여기에 기재된 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포의 용도에 관한 것이다.
여기에 기재된 다른 측면은, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포를 포함하는 조성물이다. 일 실시형태에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다.
여기에 기재된 다른 측면은, 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 목적을 위한, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
여기에 기재된 다른 측면은, 포유동물에서 혈색소병증의 치료를 위한, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
여기에 기재된 다른 측면은, 그에 따라 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준이 상승되는, 포유동물에서 혈색소병증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
여기에 기재된 다른 측면은, 그에 따라 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 인간 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하는, 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물이다. 일 실시형태에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다.
여기에 기재된 다른 측면은, 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 목적을 위한, DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 인간 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하는, 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
여기에 기재된 다른 측면은, 포유동물에서 혈색소병증의 치료를 위한, DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 인간 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하는, 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
여기에 기재된 다른 측면은, 그에 따라 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준이 증가되는, 포유동물에서 혈색소병증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 인간 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하는, 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 여기서는 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한, 또는 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한, 또는 BCL11A의 mRNA 또는 발현을 감소시키기 위한, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 세포의 게놈 DNA에 결합하는 물질의 용도가 제공되며, 여기서는 BCC11A의 mRNA 또는 단백질 발현이 감소된다.
일 실시형태에서, 여기서는 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한, 또는 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한, 또는 BCL11A의 mRNA 또는 발현을 감소시키기 위한, 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하며, 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 여기에서 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현이 감소하는, 조성물의 유효량의 용도가 제공된다.
일 실시형태에서, 여기서는 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한, 또는 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한, 또는 BCL11A의 mRNA 또는 발현을 감소시키기 위한, 적어도 DNA-타겟팅 효소 또는 DNA-타겟팅 효소의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하며, 상기 DNA-타겟팅 효소가 염색체 2의 상기 세포의 게놈 DNA 내에 적어도 하나의 후성적 변형을 만들어서, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 발현에 영향을 미치는 조성물의 유효량의 용도가 제공된다. 일 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 후성적 변형은 위치 60,716,189-60,728,612에 있다. 다른 실시형태에서, 하나의 후성적 변형의 효과는 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것이다. 일 실시형태에서, 상기 염색체 2의 상기 세포의 게놈 DNA 내의 적어도 하나의 후성적 변형은 염색체 2의 위치 60,716,189-60,728,612에 직접 또는 간접적으로 영향을 미친다.
일 실시형태에서, 여기서는 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한, 또는 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한, 여기에 기재된 임의의 단리된 세포의 용도가 제공된다.
일 실시형태에서, 여기서는 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한, 또는 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한, 단리된 유전자 조작 인간 세포를 포함하며, 상기 세포는, 상기 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하는 과정에 의해 만들어진, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는, 조성물의 용도가 제공된다.
일 실시형태에서, 여기서는 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한, 또는 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한, 단리된 유전자 조작 인간 세포를 포함하며, 상기 세포는 염색체 2에 적어도 하나의 후성적 변형을 갖는 조성물의 용도가 제공된다. 일 실시형태에서, 상기 염색체 2의 적어도 하나의 후성적 변형은 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에 있다. 다른 실시형태에서, 염색체 2의 적어도 하나의 후성적 변형은 상기 세포를 적어도 DNA-타겟팅 효소 또는 DNA-타겟팅 효소의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 효소가, 염색체 2의 상기 세포의 게놈 DNA 내에, 그 안에 유발하는, 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에 영향을 미치는, 적어도 하나의 후성적 변형을 만드는 과정에 의해 만들어진다.
일 실시형태에서, 여기서는 태아 헤모글로빈의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한 또는 포유동물에서 혈색소병증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 여기에 기재된 임의의 단리된 세포 또는 여기에 기재된 어느 하나의 조성물의 용도가 제공된다.
여기에 기재된 다른 측면은 세포에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법으로서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 단리된 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 상기 세포에 비하여 상기 세포 또는 그 자손에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
여기에 기재된 다른 측면은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법으로서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 단리된 조혈 전구 세포를 상기 포유동물 내에서 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 상기 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
여기에 기재된 다른 측면은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법으로서, 이 방법은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포를 상기 포유동물에게 이식하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시물은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 포유동물로부터의 단리된 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포의 집단을 생체외(ex vivo)에 제공하고, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포의 집단을 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 포유동물 내에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
일 실시형태에서, 본 개시물은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 포유동물로부터 조혈 전구 또는 조혈 줄기 세포의 집단을 단리하고, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포의 집단을 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 생체외에서 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 포유동물 내에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
일 실시형태에서, 본 개시물은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 포유동물로부터 단리된 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포의 집단을 제공하고, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 결실하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 포유동물 내에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
일 실시형태에서, 본 개시물은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 포유동물로부터 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포의 집단을 단리하고, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 생체외 결실하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 포유동물 내에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
일 실시형태에서, 본 개시물은 포유동물에서 혈색소병증의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포 또는 iPSC를 제공하고; (b) 상기 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 생체외(ex vivo) 또는 시험관내(in vitro) 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 포유동물 내에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되며; (c) 포유동물에게 상기 단계(b)를 투여하는 것.
일 실시형태에서, 본 개시물은 포유동물에서 혈색소병증의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 포유동물로부터 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포를 단리하고; (b) 상기 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 생체외 또는 시험관내 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 포유동물 내에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되며; (c) 포유동물에게 상기 단계(b)를 투여하는 것.
일 실시형태에서, 본 개시물은 포유동물에서 혈색소병증의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포 또는 iPSC를 제공하고; (b) 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 포유동물 내에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되며; (c) 포유동물에게 상기 단계(b)의 세포를 투여하는 것.
일 실시형태에서, 본 개시물은 포유동물에서 혈색소병증의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 포유동물로부터 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포를 단리하고; (b) 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 생체외 결실하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 포유동물 내에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되며; (c) 포유동물에게 상기 단계(b)를 투여하는 것.
일 실시형태에서, 본 개시물은 포유동물(예, 인간)에서 혈색소병증의 치료 방법으로서, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 세포를 갖는 여기에 기재된 조성물을 도입하여 그에 따라 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 개시물은 포유동물(예, 인간)에서 혈색소병증의 치료 방법으로서, 여기에 기재된 방법에 의해 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현을 증가시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 단리된 세포 또는 단리된 세포의 집단은 인간 세포(들)이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 단리된 세포 또는 단리된 세포의 집단은 전구 세포(들)이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 인간 세포는 조혈 전구 세포이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 인간 세포는 유도 만능 줄기 세포이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 유도 만능 줄기 세포는 조혈 전구 세포이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 조혈 전구는 적혈구 계통의 세포이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 조혈 전구 세포 또는 단리된 세포는 생체외 또는 시험관내 또는 생체내에서 접촉시킨다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 유전자 변형은 결실이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 결실은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 간의 영역 전체를 제거하거나, 또는 하나 이상의 DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS)의 방해로 귀결되는 상기 영역의 부분을 제거한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 본 명세서 실시예에 기재된 DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS) +62, +58, 및 +55 중 하나 이상을 포함한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 2에 기재된 SNP 마커의 하나 이상을 포함한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 7에 나열된 절편의 하나 이상을 포함한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 간의 영역 전체를 제거하거나, 또는 하나 이상의 DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS)의 방해로 귀결되는 상기 영역의 부분을 제거한다. 일 실시형태에서, 여기에 사용된 용어 "부분(portion)"은 게놈 결실의 맥락에서 상기 특정 영역의 적어도 20%-80%이다.
임의의 치료 방법의 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 포유동물에서 내인(endogenous) 조혈 전구 또는 줄기 세포를 제거하거나 또는 감소시키는 화학치료 및/또는 방사선치료를 포함한다.
임의의 방법의 일 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 접촉시켜진 세포는 냉동보존되어 상기 세포가 포유동물에의 투여를 위해 필요할 때까지 보관될 수 있다.
임의의 기재된 방법의 일 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포 또는 단리된 세포는 여기에 기재된 iPSC로 치환될 수 있다.
임의의 기재된 방법의 일 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포 또는 iPSC 또는 단리된 세포는 상기 포유동물에 자가(autologous)이며, 이는 상기 세포가 동일한 포유동물로부터 유래한 것을 의미한다. 기재된 방법의 다른 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포 또는 iPSC 또는 단리된 세포는 상기 포유동물에 비-자가이며, 이는 상기 세포가 동일한 포유동물로부터 유래하지 않고, 같은 종의 다른 포유동물로부터 유래한 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 포유동물은 인간이다.
임의의 치료 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 필요로 하는 포유동물을 선택하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 치료 방법의 일 실시형태에서, 상기 방법은 혈색소병증의 치료를 필요로 하는 포유동물을 선택하는 것을 추가로 포함한다.
기재된 임의의 치료 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 혈색소병증은 β-혈색소병증이다.
기재된 임의의 치료 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 혈색소병증은 β-지중해빈혈이다.
기재된 임의의 치료 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 혈색소병증은 겸상 혈구성 빈혈이다.
도 1A는 이전에 반포된 636개의 SNP의 분포가 프로모터, 엑손, 인트론, 3'UTR, 및 유전자간(intergenic) 서열에 대하여 P < 5×10-8로 적혈구 형질(erythroid trait)과 연관됨(associated)을 보여준다. 비교를 위해, 이들 영역의 게놈 분포를 도시한다.
도 1B는 가장 가까운 적혈구 인핸서에 대하여 636개의 적혈구 형질-연관 SNP들의 거리의 누적 분포를 플로팅하는 그래프이다. 적혈구 인핸서는, DNA분해효소 I 과민성, H3K4me1의 존재, H3K27ac 또는 H3K9ac의 존재, 및 H3K4me3 및 H3K27me3의 부재를 갖는, Refseq-주석 붙은(annotated) 유전자의 TSS로부터 2kb 초과의 서열로 정의된다. 636개의 랜덤 치환 비-적혈구 형질-연관 SNP들(GWAS 데이터베이스로부터의), Affy 6.0 유전자형 결정 어레이로부터의 SNP들, 또는 랜덤 SNP들의 50세트의 평균±SD의 거리도 플로팅하였다.
도 2A는 H3K27me3, H3K4me3, H3K4me1, H3K27ac, GATA1, TAL1, 및 PolII 에 대한 항체에 의해 CD34+-세포-유래 적혈구 전구체로부터 행해진 대규모 병렬형 시퀀싱이 뒤따르는 ChIP을 보여준다. 적혈구 전구체, 태아 뇌, 및 B- 및 T-림프구로부터 단리된 핵에, 대규모 병렬형 시퀀싱에 의해 결정된 절단 부위에 의한 DNA분해효소 I 처리를 행한다. HbF-연관 SNP는 HbF 수준 또는 F-세포 수와 P < 5×10- 8 로 연관된 것과 주어진 GWAS에서 HbF 또는 F-세포 수와 고연관된 전초(sentinel) SNP를 포함한다. 3개의 인접한 적혈구 DHS는 BCL11A TSS로부터의 거리(kb)에 기초하여 +62, +58, 및 +55으로 표지하였다.
도 2B는 1% 인풋 염색질에 대해 정규화된 BCL11A 인트론-2에서 일차 인간 적혈구전구체의 ChIP-qPCR을 보여준다. 도 2A로부터의 DHS +62, +58, 및 +55에 그늘 표시를 하였다. 네가티브 대조 (GAPDH, OCT4) 및 포지티브 대조 (β-글로빈 LCR HS3 및 α-글로빈 HS-40) 좌에서의 농축을 비교를 위해 도시하였다.
도 2C는 앵커로서 BCL11A 프로모터를 사용하여 BCL11A 좌에 걸쳐 일차 인간 적혈구전구체에서 행해진 염색체 입체형태(conformation) 캡처(capture)를 보여준다. 상호작용 빈도는 LCR-HBB 상호작용에 대하여 정규화된다.
도 3A는 조혈 줄기/전구 세포를 준 건강한 익명의 공여자를 rs1427407에서 유전자형 결정을 행하여 이형접합 개체를 동정한 것을 보여준다. 5명의 공여자가 동정되었다. 그 조혈 줄기/전구 세포에 대하여 적혈구 분화 배양을 행하였다. 염색질을 적혈구모세포로부터 단리하고, GATA1 또는 TAL1에 의해 면역침전하였다. ChIP DNA 또는 인풋 DNA에 대하여 파이로시퀀싱 반응을 하여 rs1427407 G-대립유전자의 상대적 과다를 정량화하였다.
도 3B는 조혈 줄기/전구 세포를 준 건강한 익명의 공여자를 rs1427407, rs7606173, 및 rs7569946에서 유전자형 결정을 행하여 rs7569946뿐만 아니라 rs1427407-rs7606173 일배체형에 대해서도 이형접합인 개체를 동정한 것을 보여준다. 3명의 공여자가 동정되었다. 일배체형 결정에 의해 rs7569946 G-대립유전자가 rs1427407 G-대립유전자 및 rs7606173 C-대립유전자와 서로 동일 염색체 상에 있음이 밝혀졌다. 그 조혈 줄기/전구 세포에 대하여 적혈구 분화 배양을 행하였다. RNA 및 게놈 DNA를 단리하고, 역전사에 의해 cDNA 를 제작하였다. 짝지어진 gDNA 및 cDNA 시료에 대하여 파이로시퀀싱 반응을 행하여 7569946 G-대립유전자의 상대적 과다를 정량화하였다.
도 3C는 CSSCD 코호트에서 rs1427407-rs7606173 일배체형에 대한 평균 HbF를 보여준다. 평균 HbF 수준은 213 rs1427407-rs7606173 G-C 개체에서 4.05% (SD 3.10), 254 rs1427407-rs7606173 T-G/G-T 이형접합체에서 7.08% (SD 4.50), 그리고 60 rs1427407-rs7606173 T-G 개체에서 11.21% (SD 4.37)였다. 상기 P-값은 단측 스튜던트 t 검정에 상당한다. CSSCD에서의 일배체형 빈도는 TG 24.5%, TC 0.085%, GC 42.3%, GG 33.1%이다.
도 4A-4C는 H19 인설레이터 요소가 양 옆에 있는 Hsp68 최소 프로모터 및 lacZ 리포터 유전자의 상류에 클로닝된 DHS +62, +58 및 +55 (TSS 로부터의 +52.0-64.4 kb를 포함함)를 포함하는 BCL11A 인트론-2의 12.4-kb 절편으로부터의 데이터를 보여준다. 1세포기(one cell stage)에서 핵 주사에 의해 일시적 트랜스제닉 뮤린 배아를 생성하였다.
도 4A는 X-gal로 염색된 E12.5 일시적 트랜스제닉 배아를 보여준다.
도 4B는 안정한 트랜스제닉 E12.5 배아의 말초 혈액 및 태아 간으로부터 단리된 세포 현탁액을 보여준다. 세포원심분리물을 X-gal로 염색하고 Nuclear Red로 대비염색하였다.
도 4C는 젊은 성체 안정 트랜스제닉으로부터 단리되고 구별된(sorted) 골수 적혈구모세포 (CD71+/Ter119+) 및 비장 림프구(B-림프구에 대하여 CD19+, 및 T-림프구에 대하여 CD3+)로부터의 데이터를 보여준다. 세포에 대하여 X-gal 염색 또는 RNA 단리 및 뒤이은 RT-qPCR을 행하였다. 유전자 발현을 GAPDH에 대하여 정규화하고, T-림프구에 관하여 나타내었으며, T-림프구는 BCL11A도 lacZ도 발현하지 않는다.
도 5A-5C는 +50.4 - +60.4 kb로부터의 이종상동성 10 kb BCL11A 인트론-2 적혈구 인핸서의 어느 하나의 말단에 DSB를 생성하기 위해 각각 설계된 두 쌍의 TALEN에 의해 트랜스펙션된 마우스 적백혈병 (MEL) 세포 및 프로(pro)-B 림프구 세포를 보여준다. 10-kb 분절의 양대립유전자 결실(biallelic deletion) 에 의해 클론(Δ50.4-60.4라 함)을 단리하였다.
도 5는 인트론-2의 상류의, 인트론-2에 걸치는(spanning), 및 인트론-2의 하류의, 서열을 인식하는 프라이머 쌍에 의해 Bcl11a에 대해 행한 RT-qPCR을 보여준다.
도 5B는 항-BCL11A에 의한 Δ50.4-60.4의 면역 블롯을 보여준다.
도 5C는 Δ50.4-60.4 MEL 클론에서의 글로빈 유전자 발현을 보여준다. 공통의 프라이머쌍은 성체 β-글로빈 β2 및 β1을 인식함에 대하여, 독립적 프라이머는 배아 β-글로빈 εy 및 βH1을 인식한다.
도 6은 lacZ 리포터 구조체에 의해 전핵 주사된(pronuclei injected) 마우스 접합체를 보여준다. 트랜스제닉 배아는 E12.5에서 단리되었다. 배아를 lacZ PCR 에 의해 유전자형 결정하였다. 태아 간의 X-gal 염색을 갖는 트랜스제닉 배아의 분획이 보고된다.
도 7은 TK 최소 프로모터 및 GFP를 갖는 인핸서 구조체(enhancer construct)에 클로닝된 1~2 kb 서열 절편을 보여준다. 인핸서 리포터 구조체는 일차 인간 적혈구전구체로 렌티바이러스 벡터에 의해 전달되었다. 트랜스펙션된 세포를 퓨로마이신 내성에 의해 선택하였다. 평균 GFP 형광 강도를 측정하였다.
도 8는 Bcl11a 인트론-2에서의 이종상동성 인핸서 특징을 드러내는 마우스 적혈구 세포의 염색질 프로파일링에 관한 데이터를 보여준다. 그로부터의 히스톤 변형 및 DNA분해효소-I 절단과 그로부터의 GATA1 및 TAL1 ChIP-seq을 갖는, 이전에 반포된 글로벌 마우스 적혈구 염색질 프로파일링으로부터 얻어진 마우스 트랙(track)들. 점선의 직사각형은 TALEN-매개 결실에 대해 타겟팅된 Δ50.4-60.4 요소를 정의하는 이종상동성 인핸서 특징(orthologous enhancer signature)의 경계를 나타낸다.
도 9A는 여기서 사용된 TALEN-매개 게놈 조작 전략의 개요도이다. TALEN은 서열-특이적 뉴클레아제이다. 두 쌍의 TALEN을 조작하여, Bcl11a +50.4에 하나 그리고 +60.4에 다른 하나, 이중가닥절단(double strand breaks)을 생성하였다. 사이에 있는 10-kb 분절의 삭제와 함께 NHEJ 에 의해 2개의 DSB이 복구된(repaired) 클론을 단리하였다. 클론을 10-kb 결실의 내부 및 10-kb 결실에 걸친(spanning), 프라이머 5',3'에 의한 PCR에 의해 스크리닝하였다.
도 9B는 Δ50.4-60.4 클론으로부터의 HindIII 소화된 게놈 DNA의 서던 블로팅이, 이들 클론이 삭제 대립유전자를 예상하고(expect) 비-삭제 대립유전자를 결여하였음을 확증한 것을 보여준다.
도 10은 Δ 50.4-60.4 클론으로부터의 PCR 산물의 Sanger 시퀀싱을 보여준다. 사이에 스페이서를 갖는, 5'(+50.4) 및 3'(+60.4) 의 좌측 및 우측 TALEN 인식 서열이 나타나 있다. 일부 대립유전자는 각각 소화된 스페이서 서열로부터의 직접적인 말단 접합(end-joining)의 증거를 보여주는 한편 다른 대립유전자는 수백개의 추가의 뉴클레오티드의 상실을 보여주었다. MEL 클론 #1 및 프로(pro)-B 클론 #2로부터 각각 하나의 대립유전자만이 단리되었다.
도 11A는 BCL11A +62, +58 또는 +55 DHS내의 38개의 변이에 대한 CSSCD로부터의 1,178 개체에서 얻어진 유전자형 데이터를 나타낸다. rs1427407에 대한 조건부 분석(conditional analysis)의 전(rs1427407) 또는 후(rs7606173)의 흔한(마이너 대립유전자 빈도(minor allele frequency) (MAF) > 1%) SNP들(n = 10) 중에서 HbF 수준에 대한 가장 높은 유의한 연관. SNP 좌표 염색체 2, 빌딩19.
도 11B는 BCL11A에서의 HbF 연관 분석을 보여준다. BCL11A +62, +58 또는 +55 DHS내의 38개의 변이에 대한 CSSCD로부터의 1,178 개체에서 얻어진 유전자형 데이터. 전초 SNP들은 이전의 GWAS(7-12)에서 HbF 수준 또는 F-세포 수에 가장 높은 연관을 갖는 것이다. 이들 SNP는 지시된 +62, +58 및 +55 세 DHS를 갖는 BCL11A 인트론-2 에 대하여 나타내어진다.
여기에 기재된 방법 및 조성물은, 부분적으로, BCL11A 단백질의 발현을 조절 가능한 BCL11A 유전자의 상류의 원위 조절 영역의 발견에 관한 것이다. BCL11A 단백질은 γ-글로빈 유도를 억제함에 의해 태아 헤모글로빈 발현의 기(stage)-특이적 조절자로 작용한다. 따라서, 여기에서 제공되는 방법 및 조성물은 적혈구의 세포에서 γ-글로빈 발현을 조절하기 위한 신규한 방법이다. 더 구체적으로 말하면, 이들 활성은 BCL11A 유전자 산물의 저해를 통한 γ-글로빈의 유도에 의한 β-혈색소병증의 치료를 위한 방법에 이용될 수 있다.
일 실시형태에서, 여기서는 감소된 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현을 갖는 단리된 전구 세포를 생산하는 방법으로서, 단리된 전구 세포를 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 19 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA에 결합하는 물질과 접촉시키고, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 여기서는 감소된 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현을 갖는 단리된 전구 세포를 생산하는 방법으로서, 단리된 전구 세포를 제공하고, 상기 단리된 전구 세포를 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 (UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA에 결합하는 물질에 접촉시키고, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 여기서는 감소된 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현을 갖는 단리된 전구 세포를 생산하는 방법으로서, 단리된 전구 세포를 염색체 2의 상기 세포의 게놈 DNA에 결합하여 후성적 변형을 만드는 물질과 접촉시키고, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 상기 게놈 DNA 내의 후성적 변형은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에 있다.
일 실시형태에서, 여기서는 감소된 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현을 갖는 단리된 전구 세포를 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 단리된 전구 세포를 제공하고, 상기 단리된 전구 세포를 염색체 2의 상기 세포의 게놈 DNA 내에 적어도 하나의 후성적 변형을 만드는 물질과 접촉시켜 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 게놈 DNA 내의 후성적 변형은 염색체 2위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에 있다.
여기에 기재된 개시물은, 바람직한 실시형태에서, 인간을 복제하는 과정, 인간의 배자계열 유전적 정체성을 변형하는 과정, 산업적 또는 상업적 목적을 위한 인간 배아의 용도 또는 인간 또는 동물에 실질적인 의학적 혜택 없이 그들에게 고통을 일으킬 수 있는 동물의 유전적 정체성의 변형 과정, 및 그러한 과정으로부터 귀결되는 동물에 관한 것이 아니다.
여기에 기재된 일 측면은 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포를 제조하는 방법으로서, 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
여기에서 제공되는 다른 측면은 단리된 세포에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법으로서, 세포에서 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 일 측면에서, BCL11A mRNA 또는 단백질 발현의 감소는 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발함에 의해 달성된다. 다른 측면에서, BCL11A mRNA 또는 단백질 발현의 감소는, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA에, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에서의 유전적 기능의 후성적 변형으로 귀결되는, 적어도 하나의 유전자 변형을 유발함에 의해 달성된다. 이 측면에서, 이 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 내에 위치한 BCL11A 인핸서 활성이 감소된다. 이 측면에서의 감소에 의해, 세포에서 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현을 증강하는 인핸서 활성은 여기에 개시된 어느 방법으로도 처리되지 않은 대조 세포에 비해 적어도 5% 낮거나, 적어도 10% 낮거나, 적어도 20% 낮거나, 적어도 30% 낮거나, 적어도 40% 낮거나, 적어도 50% 낮거나, 적어도 60% 낮거나, 적어도 70% 낮거나, 적어도 80% 낮거나, 적어도 90% 낮거나, 적어도 1배 낮거나, 적어도 2배 낮거나, 적어도 5배 낮거나, 적어도 10배 낮거나, 적어도 100배 낮거나, 적어도 1000배 낮거나, 또는 더 낮다. 세포에서 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현의 감소란 여기에 개시된 어느 방법으로도 처리되지 않은 대조 세포에 비해 단백질 발현이 적어도 5% 낮거나, 적어도 10% 낮거나, 적어도 20% 낮거나, 적어도 30% 낮거나, 적어도 40% 낮거나, 적어도 50% 낮거나, 적어도 60% 낮거나, 적어도 70% 낮거나, 적어도 80% 낮거나, 적어도 90% 낮거나, 적어도 1배 낮거나, 적어도 2배 낮거나, 적어도 5배 낮거나, 적어도 10배 낮거나, 적어도 100배 낮거나, 적어도 1000배 낮거나, 또는 더 낮은 것을 의미한다.
여기에서 제공되는 다른 측면은 단리된 세포에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 단리된 인간 세포 또는 전구 세포를 제공하고, 상기 세포에서 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함한다.
여기에서 제공되는 다른 측면은 세포에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 단리된 인간 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 상기 세포에 비하여 상기 세포 또는 그 자손에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
여기에서 제공되는 다른 측면은 세포에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 단리된 인간 세포 또는 전구 세포를 제공하고, 단리된 인간 세포 또는 전구 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 상기 세포에 비하여 상기 세포 또는 그 자손에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
여기에 기재된 다른 측면은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 포유동물에서 조혈 전구 세포에서 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함한다. 일 측면에서, BCL11A mRNA 또는 단백질 발현의 감소는 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발함에 의해 달성된다. 다른 측면에서, BCL11A mRNA 또는 단백질 발현의 감소는 염색체 2의 상기 세포의 게놈 DNA에 적어도 하나의 후성적 변형을 유발함에 의해 달성된다. 다른 측면에서, BCL11A mRNA 또는 단백질 발현의 감소는 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA에 적어도 하나의 후성적 변형을 유발함에 의해 달성된다.
여기에 기재된 다른 측면은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 포유동물로부터 단리된 인간 세포 또는 전구 세포를 제공하고, 상기 세포에서 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함한다. 일 측면에서, 상기 방법은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물을 선택하는 것을 더 포함한다.
여기에 기재된 다른 측면은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 포유 동물 내의 조혈 전구 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 포유동물 내에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
여기에 기재된 다른 측면은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 포유동물로부터 단리된 인간 세포 또는 전구 세포 또는 단리된 조혈 전구 세포의 집단을 제공하고 그 인간 세포 또는 전구 세포 또는 조혈 전구 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 상기 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
여기에서 제공되는 다른 측면은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 여기에 기재된 유전자 조작 인간 세포를 포유동물 내로 이식하는 것을 더 포함한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 방법은 단리된 세포 또는 단리된 전구 세포 또는 전구 세포 또는 조혈 전구 세포일 수 있는 단리된 세포의 집단을 제공하는 것을 더 포함한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 단리된 세포는 단리된 전구 세포이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 단리된 전구 세포는 단리된 인간 세포이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 단리된 인간 세포는 조혈 전구 세포이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 조혈 세포는 적혈구 계통의 세포이다. 조혈 전구 세포의 단리 방법은 당 기술분야에 주지이며, 예를 들면, CD34+ 또는 CD133+ 세포의 플로우 사이토메트리에 의한 정제, CD34 또는 CD133에 대한 항체와 컨쥬게이션된 마이크로비드, 조혈 전구 세포의 마커를 들 수 있다. 상업적 키트도 입수가능하며, 예를 들면, MACS® Technology CD34 MicroBead Kit, 인간, 및 CD34 MultiSort Kit, 인간, 및 STEMCELLTM Technology EasySepTM 마우스 조혈 전구 세포 농축 키트를 들 수 있다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 인간 세포는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 여기에 기재된 임의의 세포의 접촉은 생체외 또는 시험관내 또는 생체내에서 일 수 있다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 여기에 기재된 임의의 세포의 접촉은 염색체 2의 상기 세포의 게놈 DNA에 결합하여 염색체 2의 상기 세포의 게놈에 후성적 변형을 만드는 물질과 접촉시키고, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 후성적 변형은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에 있다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 염색체 2의 상기 세포의 게놈 DNA 내의 적어도 하나의 후성적 변형은 염색체 2의 위치 60,716,189-60,728,612에 직접 또는 간접적으로 영향을 미친다.
여기에 사용된 "염색체 2의 위치 60,716,189-60,728,612에 간접적으로 영향을 미침(indirectly affecting the location 60,716,189-60,728,612 of chromosome 2)"이란, 상기 세포의 게놈 DNA 내의 후성적 변형의, 염색체 2의 위치 60,716,189-60,728,612에 대한 장거리 영향(long distance effect)을 가리킨다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 여기에 기재된 임의의 세포의 접촉은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA에 결합하여 염색체 2에 후성적 변형을 만들고, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 여기에 기재된 임의의 세포의 접촉은 적어도 DNA-타겟팅 효소 또는 DNA-타겟팅 효소의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 효소가 염색체 2에 후성적 변형을 만들고, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 여기에 기재된 임의의 세포의 접촉은 적어도 DNA-타겟팅 효소 또는 DNA-타겟팅 효소의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 효소가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에 후성적 변형을 만들어 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함한다. 일 측면에서, 태아 헤모글로빈 발현은 포유동물에서 접촉 전의 발현에 비해 증가된다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 조혈 전구 세포, 상기 단리된 인간 세포, 또는 단리된 세포는 생체외 또는 시험관내에서 접촉된다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 유전자 변형은 결실이다. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 후성적 변형.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 본 명세서 실시예에 기재된 DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS) +62, +58, 및 +55 중 하나 이상을 포함한다. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 본 명세서 실시예에 기재된 DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS) +62, +58, 및 +55 중 하나 이상으로 본질적으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 상기 결실은 본 명세서 실시예에 기재된 DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS) +62, +58, 및 +55 중 하나 이상으로 이루어진다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 후성적 변형은 본 명세서 실시예에 기재된 DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS) +62, +58, 및 +55 중 하나 이상을 포함하거나 영향을 미친다. 여기에 사용된 구문 "DNA분해효소 1-과민성 부위의 하나 이상에 영향을 미친다(affects one or more of the DNAse 1-hypersensitive sites)"란 이들 DNA분해효소 1-과민성 부위 (DHS) +62, +58, 및 +55의 천연의 기능, 예를 들면, 전사 인자 또는 DNA 분해 효소 예컨대 DNA분해효소 I에의 접근이 감소되는 것을 의미한다. 일반적으로, DNA분해효소 I 과민성 부위(DHS)는 DNA분해효소 I 효소에 의한 절단에 민감한 염색질의 영역이다. 게놈의 이들 특이적 영역에서, 염색질은 그 응축된 구조를 상실하고, DNA를 노출하여, 그것에 접근 가능하게 한다. 이는 DNA분해효소 I와 같은 효소들에 의한 DNA의 분해가능성을 상승시킨다. 이들 접근가능한 염색질 존(zone)들은 전사 활성에 기능적으로 관계되는데, 왜냐하면 이 리모델링된 상태가 단백질 예컨대 전사 인자의 결합에 필수적이기 때문이다. 따라서, 여기에 고려된 후성적 변형은 여기에 개시된 어느 방법으로도 처리되지 않은 대조 세포에 비해 적어도 5% 낮거나, 적어도 10% 낮거나, 적어도 20% 낮거나, 적어도 30% 낮거나, 적어도 40% 낮거나, 적어도 50% 낮거나, 적어도 60% 낮거나, 적어도 70% 낮거나, 적어도 80% 낮거나, 적어도 90% 낮거나, 적어도 1배 낮거나, 적어도 2배 낮거나, 적어도 5배 낮거나, 적어도 10배 낮거나, 적어도 100배 낮거나, 적어도 1000배 낮거나, 또는 더 낮은, DNA 분해 효소에의 감소된 접근으로 귀결된다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 2에 기재된 SNP 마커의 하나 이상을 포함한다. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 2에 기재된 SNP 마커의 하나 이상으로 본질적으로 이루어진다. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 2에 기재된 SNP 마커의 하나 이상으로 이루어진다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 후성적 변형은 표 2에 기재된 SNP 마커의 하나 이상을 포함하거나 영향을 미친다. 여기에 사용된 구문 "SNP 마커의 하나 이상에 영향을 미친다(affects one or more of the SNP markers)"란 이들 SNP의 천연의 기능, 예를 들면, 전사 인자에의 접근이 감소되는 것을 의미한다. 예를 들면, 이들 SNP의 메틸화는 전사 인자의 결합을 감소시키고, 이는 감소된 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현으로 이어진다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 7에 나열된 절편의 하나 이상을 포함한다. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 7에 나열된 절편의 하나 이상으로 본질적으로 이루어진다. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 7에 나열된 절편의 하나 이상으로 이루어진다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 60,716,189-60,728,612, 60,716,189-60,723,870, 60,722,992-60,728,612, 60,717,236-60,719,036, 60,722,006-60,723,058, 60,724,917-60,726,282, 60,616,396-60,618,032, 60,623,536-60,624,989, 60,626,565-60,628,177, 60,717,236-60,719,036, 60,721,212-60,722,958, 60,724,780-60,726,471, 60,739,075-60,740,154, 60,748,003-60,749,009, 60,826,438-60,827,601, 또는 60,831,589-60,833,556이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 후성적 변형은 표 7에 나열된 절편의 하나 이상을 포함하거나 영향을 미친다. 여기에 사용된 구문 "표 7에 나열된 절편의 하나 이상에 영향을 미친다(affects one or more of the fragments listed in Table 7)"란 이들 절편의 천연의 기능, 예를 들면, 전사 인자에의 접근이 감소되는 것을 의미한다. 예를 들면, 이들 절편의 메틸화는 전사 인자의 결합을 감소시키고, 이는 감소된 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현으로 이어진다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 후성적 변형은 60,716,189-60,728,612, 60,716,189-60,723,870, 60,722,992-60,728,612, 60,717,236-60,719,036, 60,722,006-60,723,058, 60,724,917-60,726,282, 60,616,396-60,618,032, 60,623,536-60,624,989, 60,626,565-60,628,177, 60,717,236-60,719,036, 60,721,212-60,722,958, 60,724,780-60,726,471, 60,739,075-60,740,154, 60,748,003-60,749,009, 60,826,438-60,827,601, 또는 60,831,589-60,833,556이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 간의 영역 전체를 제거하거나, 또는 하나 이상의 DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS)의 방해로 귀결되는 상기 영역의 부분을 제거한다. 여기에 사용된 용어 "방해(disruption)"란 그러한 방해를 갖지 않는 세포에 비해, 하나 이상의 DNA분해효소 -1 과민성 부위의 적어도 10% (예를 들면, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 심지어 100%의 방해(즉, 검출불능한 적혈구 전사))를 포함하는 세포에서의 BCL11A의 적혈구 전사의 감소를 말한다. 일 실시형태에서, 상기 방해는 변형된 DNA분해효소-1과민성 부위가 그것의 천연의 전사 인자(예를 들면, GATA1 및 TAL1)에 결합할 수 없음을 포함한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 인핸서 영역에서 후성적 특징의 수립 및/또는 유지에 개입하여 그에 의해 감소된 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현, 및 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현을 증가시키는 것으로 이어지는, 후성적 변형.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 인핸서 영역에서 후성적 특징의 수립 및/또는 유지에 개입하는 후성적 변형은, DNA분해효소 I 감수성에 영향을 미치는 후성적 변형, 히스톤 변형에 영향을 미치는 후성적 변형, GATA1/TAL1 결합에 영향을 미치는 후성적 변형, 및 BCL11A의 프로모터의 긴 범위의 프로모터 상호작용에 영향을 미치는 후성적 변형을 비한정적으로 포함한다.
예를 들면, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 인핸서 영역에서 후성적 특징의 수립 및/또는 유지에 개입하는 후성적 변형은, 이 영역의 전체 기능이 영향을 받아 그에 따라 BCL11A의 mRNA 및 발현이 감소되거나(reduced) 감소되는(decreased), 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 내의 적어도 하나의 결실을 비한정적으로 포함한다. 예를 들면, 상기 결실은 DNA분해효소 I 감수성 영역 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612, 예를 들면, +62, +58, 및 +55에 있다. 상기 결실은 +62 또는 +58 또는 +55 또는 이들의 조합에 있을 수 있다. 예를 들면, +62 및 +58, +58 및 +55, +62 및 +55에, 또는 +62, +58, 및 +55 세군데 모두에 있다.
다른 예로서, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 인핸서 영역에서 후성적 특징의 수립 및/또는 유지에 개입하는 후성적 변형은, 이 영역의 전체 기능이 영향을 받아 그에 따라 BCL11A의 mRNA 및 발현이 감소되거나(reduced) 감소되는(decreased), 위치 60,716,189-60,728,612이 아닌 염색체 2의 히스톤 변형의 변경, 또는 위치 60,716,189-60,728,612에서의 염색체 2의 히스톤 변형의 변경, 또는 위치 60,716,189-60,728,612이 아닌 곳 및 위치 60,716,189-60,728,612 둘다에서 염색체 2의 히스톤 변형의 변경을 비한정적으로 포함한다.
다른 실시형태에서, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 인핸서 영역에서 후성적 특징의 수립 및/또는 유지에 개입하는 후성적 변형은, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에서 논코딩 요소의 후성적 특징을 변경하여 타겟 유전자 발현의 억제로 귀결되는 적어도 하나의 조작된 특이적-리프레서 서열의 삽입을 비한정적으로 포함한다. 그 첫번째는 개별적 인핸서를 후성적으로 억제하는 것에 특이적으로 집중된다. 달리 말하면, 염색체 2로의 조작된 특이적-리프레서 서열의 삽입은 BCL11A 적혈구 인핸서에서의 후성적 변형에 장래적으로 개입하여 결국에는 감소된 BCL11A 유전자 발현으로 이어질 것이다.
당 기술분야에 알려진 임의의 방법들이 고려된 후성적 변형을 만드는데 사용될 수 있다. 예를 들면, [Mendenhall E. M. et al., Nat. Biotechnol. 08 September 2013, 및 Maeder ML et al., Nat Biotechnol. 09 October 2013]에 기술된 바와 같다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 염색체 2의 임의의 위치의 적어도 하나의 조작된 특이적-리프레서 서열의 삽입은, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612, 예를 들면, +62, +58, 및 +55에서 감소된 DNA분해효소 I 감수성 영역; 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 증가된 히스톤 변형; 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 인핸서 영역의 GATA1/TAL1 에의 감소된 전사 인자 결합; 및 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612와 BCL11A 프로모터 간의 감소된 또는 약해진 상호작용으로, 비한정적으로 귀결된다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 염색체 2 임의의 위치의 적어도 하나의 조작된 특이적-리프레서 서열의 삽입의 전체적 효과는 감소된(reduced) 또는 감소된(decreased) BCL11A의 mRNA 및 발현이다.
일부 실시형태에서, BCL11A의 mRNA 및 발현, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 또는 BCL11A 인핸서와 BCL11A 프로모터 간의 상호작용, 및 인핸서 영역의 GATA1/TAL1 에의 전사 인자 결합의 맥락에서 사용될 때, 용어 "감소된(reduced) 또는 감소된(decreased)"은 여기 개시된 조작된 서열의 후성적 변형 또는 삽입이 부재하는 대조 상황에 비해, 적어도 5% 낮거나, 적어도 10% 낮거나, 적어도 20% 낮거나, 적어도 30% 낮거나, 적어도 40% 낮거나, 적어도 50% 낮거나, 적어도 60% 낮거나, 적어도 70% 낮거나, 적어도 80% 낮거나, 적어도 90% 낮거나, 적어도 1배 낮거나, 적어도 2배 낮거나, 적어도 5배 낮거나, 적어도 10배 낮거나, 적어도 100배 낮거나, 적어도 1000배 낮거나, 또는 그보다 더 낮은 것을 가리킨다. 세포에서 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현의 감소란 여기 개시된 조작된 서열의 후성적 변형 또는 삽입을 갖지 않는 대조 세포에 비해 단백질 발현이 적어도 5% 낮거나, 적어도 10% 낮거나, 적어도 20% 낮거나, 적어도 30% 낮거나, 적어도 40% 낮거나, 적어도 50% 낮거나, 적어도 60% 낮거나, 적어도 70% 낮거나, 적어도 80% 낮거나, 적어도 90% 낮거나, 적어도 1배 낮거나, 적어도 2배 낮거나, 적어도 5배 낮거나, 적어도 10배 낮거나, 적어도 100배 낮거나, 적어도 1000배 낮거나, 또는 더 낮은 것을 의미한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 조작된 특이적-리프레서 서열의 삽입은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 DNA분해효소 I 감수성 영역 내, 예를 들면, +62, +58, 및 +55에서 일어난다. 상기 삽입은 +62 또는 +58 또는 +55의 5' 말단에서 또는 +62 또는 +58 또는 +55의 3' 말단에서, 또는 +62 및 +58 사이에서, 또는 +58 및 +55 사이에서, 또는 +55 및 +62 사이에서일 수 있다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 조작된 특이적-리프레서 서열의 삽입은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 DNA분해효소 I 감수성 영역을 변경한다(change).
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 후성적 변형은염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 DNA분해효소 I 감수성 영역을 변경한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 후성적 변형은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 히스톤 변형을 변경한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 조작된 특이적-리프레서 서열의 삽입은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 히스톤 변형을 변경한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 후성적 변형은, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 인핸서 영역의 GATA1/TAL1 결합을, 이 영역의 전체 기능이 영향을 받아 그에 따라 BCL11A의 mRNA 및 발현이 감소되거나(reduced) 감소되도록(decreased), 변경한다. 예를 들면, GATA1/TAL1에의 전사 인자의 결합.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 조작된 특이적-리프레서 서열의 삽입은 여기에 기재된 GATA1/TAL1 내에서 일어난다. 상기 삽입은 GATA1 또는 TAL1의 5’말단 또는 3’말단에서일 수 있다. 상기 삽입은 GATA1과 TAL1 사이일 수 있다. 상기 삽입은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 인핸서 영역의 GATA1/TAL1 결합을 이 영역의 전체 기능이 영향을 받아 그에 따라 BCL11A의 mRNA 및 발현이 감소되거나(reduced) 감소되도록(decreased) 변경한다. 예를 들면, GATA1/TAL1에의 전사 인자의 결합.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 후성적 변형은 BCL11A 인핸서와 BCL11A 프로모터 간의 상호작용을 변경한다. 일 실시형태에서, 상기 상호작용은, 이 영역의 전체 기능이 영향을 받아 그에 따라 BCL11A의 mRNA 및 발현이 감소되거나(reduced) 감소되도록(decreased), 감소되거나 또는 약해진다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 후성적 변형은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612와 BCL11A 프로모터 간의 상호작용을 변경한다. 일 실시형태에서, 상기 상호작용은, 이 영역의 전체 기능이 영향을 받아 그에 따라 BCL11A의 mRNA 및 발현이 감소되거나(reduced) 감소되도록(decreased), 감소되거나 또는 약해진다.
다른 측면에서 여기서는 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하는 과정에 의해 제조된, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 (UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포도 제공된다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 염색체 2의 세포의 게놈 DNA에 적어도 하나의 후성적 변형을 갖는 상기 단리된 유전자 조작 인간 세포. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 세포의 게놈 DNA에 적어도 하나의 후성적 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포.
적어도 하나의 후성적 변형을 갖는 이들 단리된 유전자 조작 인간 세포의 어느 것의 일부 측면에서, 상기 세포는 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키는 용도를 위해 포유동물에게로 이식된다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 세포의 게놈 DNA에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포는 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키는 용도를 위해 포유동물에게로 이식된다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 세포의 게놈 DNA에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포는 냉동보존에 의해 이후의 사용을 위해 보관된다.
적어도 하나의 후성적 변형을 갖는 이들 단리된 유전자 조작 인간 세포의 어느 것의 일부 측면에서, 상기 세포는 냉동보존에 의해 이후의 사용을 위해 보관된다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 세포의 게놈 DNA에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포는 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키는 용도를 위해 냉동보존, 해동되고 포유동물로 이식된다.
적어도 하나의 후성적 변형을 갖는 이들 단리된 유전자 조작 인간 세포의 어느 것의 일부 측면에서, 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키는 용도를 위해, 냉동보존, 해동 및 포유동물로 이식된다.
여기에서 제공되는 다른 측면은, 단리된 유전자 조작 인간 세포를 포함하고, 상기 세포는, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에, 상기 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하는 과정에 의해 만들어진, 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는, 조성물에 관한 것이다.
여기에서 제공되는 다른 측면은 단리된 유전자 조작 인간 세포를 포함하고, 상기 세포는 염색체 2의 적어도 하나의 후성적 변형을 갖는 조성물에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 상기 염색체 2의 적어도 하나의 후성적 변형은, 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에 있다. 다른 실시형태에서, 염색체 2의 적어도 하나의 후성적 변형은, 상기 세포를 적어도 DNA-타겟팅 효소 또는 DNA-타겟팅 효소의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 효소가, 염색체 2의 상기 세포의 게놈 DNA 내에, 그 안에 유발하는, 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에 영향을 미치는, 적어도 하나의 후성적 변형을 만드는 과정에 의해 만들어진다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 조성물은 접촉 세포에서 태아 헤모글로빈 mRNA 또는 단백질 발현의 증가를 유발할 수 있다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 기재된 임의의 조성물의 세포는 이식 과정에서 세포의 수령자인 포유동물에 자가이며(autologous), 즉, 상기 조성물의 세포는 임의의 기재된 변형 전에 상기 포유동물로부터 유래하거나 채취된다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 기재된 임의의 조성물의 세포는 이식 과정에서 세포의 수령자인 포유동물에 비-자가이며(non-autologous), 즉, 상기 조성물의 세포는 임의의 기재된 변형 전에 상기 포유동물로부터 유래하거나 채취되지 않는다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 기재된 임의의 조성물의 세포는, 적어도, 이식 과정에서 세포의 수령자인 포유동물에 매칭되는 HLA 타입이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 기재된 임의의 조성물의 세포는 임의의 기재된 변형 전에 단리된 전구 세포이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 기재된 임의의 조성물의 세포는 임의의 기재된 변형 전에 단리된 조혈 전구 세포이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 기재된 임의의 조성물의 세포는 임의의 기재된 변형 전에 단리된 유도 만능 줄기 세포이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 실시예에서 여기에 기재된 DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS) +62, +58, 및 +55 중 하나 이상을 포함한다. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 본 명세서 실시예에 기재된 DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS) +62, +58, 및 +55 중 하나 이상으로 본질적으로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 상기 결실은 본 명세서 실시예에 기재된 DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS) +62, +58, 및 +55 중 하나 이상으로 이루어진다. 일 실시형태에서, 게놈 결실의 맥락에서 여기에 사용된 용어 "부분(portion)"은 특정 영역의 적어도 10% 내지 약 100%에서를 가리킨다. 다른 실시형태에서, 결실된 부분은 특정 영역의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 심지어 100%이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 2에 기재된 SNP 마커의 하나 이상을 포함한다. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 2에 기재된 SNP 마커의 하나 이상으로 본질적으로 이루어진다. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 2에 기재된 SNP 마커의 하나 이상으로 이루어진다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 7에 나열된 절편의 하나 이상을 포함한다. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 7에 나열된 절편의 하나 이상으로 본질적으로 이루어진다. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 표 7에 나열된 절편의 하나 이상으로 이루어진다. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 60,716,189-60,728,612, 60,716,189-60,723,870, 60,722,992-60,728,612, 60,717,236-60,719,036, 60,722,006-60,723,058, 60,724,917-60,726,282, 60,616,396-60,618,032, 60,623,536-60,624,989, 60,626,565-60,628,177, 60,717,236-60,719,036, 60,721,212-60,722,958, 60,724,780-60,726,471, 60,739,075-60,740,154, 60,748,003-60,749,009, 60,826,438-60,827,601, 또는 60,831,589-60,833,556이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 결실은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 간의 영역 전체 (UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름) 또는 하나 이상의 DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS)의 방해로 귀결되는 상기 영역의 부분을 제거한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 방법은 태아 헤모글로빈의 증가를 필요로 하는 포유동물을 선택하는 것을 더 포함한다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 포유동물은 혈색소병증으로 진단된 것이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 태아 헤모글로빈의 증가를 필요로 하는 포유동물은 혈색소병증으로 진단된 것이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 혈색소병증은 β-혈색소병증이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 혈색소병증은 겸상 혈구성 질환이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 혈색소병증은 β-지중해빈혈이다.
여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 일 실시형태에서, 상기 접촉된, 세포, 인간 세포, 조혈 전구 세포 또는 그 자손은, 상기 포유동물에게 투여된다.
일 실시형태에서, 본 개시물은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 포유동물로부터의 단리된 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포의 집단을 생체외에 제공하고, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포의 집단을 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 포유동물 내에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것. 이 방법의 추가의 실시형태에서, 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 갖는 상기 접촉된 조혈 전구 또는 줄기 세포 집단은 냉동보존되거나 보존되거나 또는 상기 포유동물에게로 재도입된다. 다른 실시형태에서, 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 갖는 상기 냉동보존된 조혈 전구 또는 줄기 세포 집단은 해동되고 그리고나서 상기 포유동물에게로 재도입된다. 이 방법의 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 상기 포유동물에서 내인 조혈 전구 또는 줄기 세포를 제거 또는 감소시키기 위한 화학치료 및/또는 방사선치료를 포함한다. 기재된 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포는 여기에 기재된 iPSC로 치환될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시물은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 포유동물로부터 조혈 전구 또는 줄기 세포의 집단을 단리하고, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포의 집단을 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 생체외에서 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 포유동물 내에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것. 이 방법의 추가의 실시형태에서, 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 갖는 상기 생체외 접촉된 조혈 전구 또는 줄기 세포 집단은 냉동보존되고 보관되거나 또는 상기 포유동물에게로 재도입된다. 다른 실시형태에서, 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 갖는 상기 냉동보존된 조혈 전구 또는 줄기 세포 집단은 해동되고 그리고나서 상기 포유동물에게로 재도입된다. 이 방법의 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 상기 포유동물에서 내인 조혈 전구 또는 줄기 세포를 제거 또는 감소시키기 위한 화학치료 및/또는 방사선치료를 포함한다. 기재된 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포는 포유동물로부터 유래한 iPSC로 치환될 수 있다. 상기 방법의 임의의 실시형태에서, 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 필요로 하는 포유동물을 선택하는 것을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시물은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 포유동물로부터 조혈 전구 또는 줄기 세포의 집단의 단리를 제공하고, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 결실하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 상기 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것. 이 방법의 추가의 실시형태에서, 상기 결실된 게놈 DNA를 갖고 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 갖는 조혈 전구 또는 줄기 세포의 집단은 냉동보존되고 보관되거나 또는 상기 포유동물에게로 재도입된다. 다른 실시형태에서, 결실된 게놈 DNA를 갖고 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 갖는 조혈 전구 또는 줄기 세포의 집단은 해동되고 그리고나서 상기 포유동물에게로 재도입된다. 이 방법의 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 상기 포유동물에서 내인 조혈 전구 또는 줄기 세포를 제거 또는 감소시키기 위한 화학치료 및/또는 방사선치료를 포함한다. 기재된 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포는 여기에 기재된 iPSC로 치환될 수 있다. 기재된 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포 또는 iPSC는 상기 포유동물에 자가이며, 이는 상기 세포가 동일한 포유동물로부터 유래한 것을 의미한다. 기재된 방법의 다른 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포 또는 iPSC는 상기 포유동물에 비-자가이며, 이는 상기 세포가 동일한 포유동물로부터 유래하지 않고, 같은 종의 다른 포유동물로부터 유래한 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 포유동물은 인간이다. 상기 방법의 임의의 실시형태에서, 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 필요로 하는 포유동물을 선택하는 것을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시물은 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 포유동물로부터 조혈 전구 또는 줄기 세포의 집단을 단리하고, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 생체외 결실하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 상기 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것. 이 방법의 추가의 실시형태에서, 상기 결실된 게놈 DNA를 갖고 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 갖는 조혈 전구 또는 줄기 세포의 집단은 냉동보존되고 보관되거나 또는 상기 포유동물에게로 재도입된다. 다른 실시형태에서, 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 갖는 상기 냉동보존된 조혈 전구 또는 줄기 세포 집단은 해동되고 그리고나서 상기 포유동물에게로 재도입된다. 이 방법의 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 상기 포유동물에서 내인 조혈 전구 또는 줄기 세포를 제거 또는 감소시키기 위한 화학치료 및/또는 방사선치료를 포함한다. 기재된 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포는 포유동물로부터 유래한 iPSC로 치환될 수 있다. 상기 방법의 임의의 실시형태에서, 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 필요로 하는 포유동물을 선택하는 것을 추가로 포함한다.
기재된 임의의 방법의 일 실시형태에서, 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 필요로 하는 포유동물을 선택하는 것을 추가로 포함한다. 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 필요로 하는 포유동물의 예는 혈색소병증으로 진단된 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시물은 포유동물에서 혈색소병증의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포 또는 iPSC를 제공하고; (b) 상기 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 생체외 또는 시험관내 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 상기 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되며; (c) 포유동물에게 상기 단계(b)를 투여하는 것.
임의의 방법의 일 실시형태에서, 단계(b) 후의 세포는 포유동물에게로의 투여를 위해 필요하게 될 때까지 냉동보존될 수 있다. 이 방법의 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 상기 포유동물에서 내인 조혈 전구 또는 줄기 세포를 제거 또는 감소시키기 위한 화학치료 및/또는 방사선치료를 포함한다. 기재된 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포 또는 iPSC는 상기 포유동물에 자가이며, 이는 상기 세포가 동일한 포유동물로부터 유래한 것을 의미한다. 기재된 방법의 다른 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포 또는 iPSC는 상기 포유동물에 비-자가이며, 이는 상기 세포가 동일한 포유동물로부터 유래하지 않고, 같은 종의 다른 포유동물로부터 유래한 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 포유동물은 인간이다.
기재된 임의의 방법의 일 실시형태에서, 혈색소병증의 치료를 필요로 하는 포유동물을 선택하는 것을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시물은 포유동물에서 혈색소병증의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 포유동물로부터 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포를 단리하고 ;(b) 상기 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 생체외 또는 시험관내 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 상기 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되며 ; (c) 포유동물에게 상기 단계(b)를 투여하는 것.
일 실시형태에서, 단계(b) 후의 세포는 포유동물에게로의 투여를 위해 필요하게 될 때까지 냉동보존될 수 있다. 상기 방법의 임의의 실시형태에서, 혈색소병증의 치료를 필요로 하는 포유동물을 선택하는 것을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시물은 포유동물에서 혈색소병증의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포 또는 iPSC를 제공하고; (b) 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 생체외 결실하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 상기 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되며; (c) 포유동물에게 상기 단계(b)의 세포를 투여하는 것.
일 실시형태에서, 단계(b) 후의 세포는 포유동물에게로의 투여를 위해 필요하게 될 때까지 냉동보존될 수 있다. 이 방법의 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 상기 포유동물에서 내인 조혈 전구 또는 줄기 세포를 제거 또는 감소시키기 위한 화학치료 및/또는 방사선치료를 포함한다. 기재된 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포 또는 iPSC는 상기 포유동물에 자가이며, 이는 상기 세포가 동일한 포유동물로부터 유래한 것을 의미한다. 임의의 기재된 방법의 다른 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포 또는 iPSC는 상기 포유동물에 비-자가이며, 이는 상기 세포가 동일한 포유동물로부터 유래하지 않고, 같은 종의 다른 포유동물로부터 유래한 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 포유동물은 인간이다. 상기 방법의 임의의 실시형태에서, 혈색소병증의 치료를 필요로 하는 포유동물을 선택하는 것을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시물은 포유동물에서 혈색소병증의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 포유동물로부터 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포를 단리하고; (b) 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 생체외 결실하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 상기 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되며; (c) 포유동물에게 상기 단계(b)를 투여하는 것.
일 실시형태에서, 단계(b) 후의 세포는 포유동물에게로의 투여를 위해 필요하게 될 때까지 냉동보존될 수 있다. 이 방법의 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 상기 포유동물에서 내인 조혈 전구 또는 줄기 세포를 제거 또는 감소시키기 위한 화학치료 및/또는 방사선치료를 포함한다. 상기 방법의 임의의 실시형태에서, 혈색소병증의 치료를 필요로 하는 포유동물을 선택하는 것을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시물은 포유동물(예, 인간)에서 혈색소병증의 치료 방법으로서, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 세포를 갖는 여기에 기재된 조성물을 도입하여 그에 따라 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 방법을 제공한다. 이 방법의 추가의 실시형태에서, 상기 방법은 상기 포유동물에서 내인 조혈 전구 또는 줄기 세포를 제거 또는 감소시키기 위한 화학치료 및/또는 방사선치료를 포함한다. 상기 방법의 임의의 실시형태에서, 혈색소병증의 치료를 필요로 하는 포유동물을 선택하는 것을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시물은 포유동물(예, 인간)에서 혈색소병증의 치료 방법으로서, 여기에 기재된 방법에 의해 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현을 증가시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
기재된 임의의 치료 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 혈색소병증은 β-혈색소병증이다.
기재된 임의의 치료 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 혈색소병증은 β-지중해빈혈이다.
기재된 임의의 치료 방법의 임의의 실시형태에서, 상기 혈색소병증은 겸상 혈구성 빈혈이다.
임의의 기재된 방법의 일 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포 또는 iPSC는 상기 포유동물에 자가이며, 이는 상기 세포가 동일한 포유동물로부터 유래한 것을 의미한다. 임의의 기재된 방법의 다른 실시형태에서, 상기 조혈 전구 또는 줄기 세포 또는 iPSC는 상기 포유동물에 비-자가이며, 이는 상기 세포가 동일한 포유동물로부터 유래하지 않고, 같은 종의 다른 포유동물로부터 유래한 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 포유동물은 인간이다.
임의의 기재된 방법의 일 실시형태에서, 여기에 기재된 임의의 세포의 접촉은 생체외 또는 시험관내 또는 생체내일 수 있다.
임의의 기재된 방법의 다른 실시형태에서, 여기에 기재된 임의의 세포의 접촉은 염색체 2의 상기 세포의 게놈 DNA에 결합하여 염색체 2의 상기 세포의 게놈에 후성적 변형을 만들고, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 물질과의 접촉을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 후성적 변형은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에 있다.
임의의 기재된 방법의 다른 실시형태에서, 여기에 기재된 임의의 세포의 접촉은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA에 결합하고, 염색체 2에 후성적 변형을 만들고, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 물질과의 접촉을 포함한다.
임의의 기재된 방법의 다른 실시형태에서, 여기에 기재된 임의의 세포의 접촉은 적어도 DNA-타겟팅 효소 또는 DNA-타겟팅 효소의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 효소가 염색체 2에 후성적 변형을 만들고, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함한다.
임의의 기재된 방법의 다른 실시형태에서, 여기에 기재된 임의의 세포의 접촉은 적어도 DNA-타겟팅 효소 또는 DNA-타겟팅 효소의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 효소가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에 후성적 변형을 만들어 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함한다. 일 측면에서, 태아 헤모글로빈 발현은 상기 접촉 전의 발현에 비하여 상기 포유동물에서 증가된다.
임의의 기재된 방법의 다른 실시형태에서, 상기 조혈 전구 세포, 상기 단리된 인간 세포, 또는 단리된 세포는 생체외 또는 시험관내에서 접촉된다.
임의의 기재된 방법의 다른 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 유전자 변형은 결실이다. 여기에 기재된 이 측면 및 모든 다른 측면의 다른 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 후성적 변형.
일 실시형태에서, 여기서는 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA에 결합하는 물질의, 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한, 또는 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한 또는 BCL11A의 mRNA 또는 발현을 감소시키기 위한 용도가 제공되며, BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현이 감소된다.
일 실시형태에서, 여기서는 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량의, 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한, 또는 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한 또는 BCL11A의 mRNA 또는 발현을 감소시키기 위한 용도가 제공되며, 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변경을 유발한다.
일 실시형태에서, 여기서는 적어도 DNA-타겟팅 효소 또는 DNA-타겟팅 효소의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량의, 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한, 또는 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한 또는 BCL11A의 mRNA 또는 발현을 감소시키기 위한 용도가 제공되며, 상기 DNA-타겟팅 효소가 염색체 2의 상기 세포의 게놈 DNA 내에 적어도 하나의 후성적 변형을 만들어서, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 발현에 영향을 미친다. 일 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 후성적 변형은 위치 60,716,189-60,728,612에 있다. 다른 실시형태에서, 하나의 후성적 변형의 효과는 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것이다.
일 실시형태에서, 여기서는 여기에 기재된 임의의 단리된 세포의, 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한, 또는 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한 용도가 제공된다.
일 실시형태에서, 여기서는 단리된 유전자 조작 인간 세포를 포함하는 조성물의, 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한, 또는 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한 용도가 제공되며, 상기 세포는, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에, 상기 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하는 과정에 의해 만들어진, 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는다.
일 실시형태에서, 여기서는 단리된 유전자 조작 인간 세포를 포함하는 조성물의, 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한, 또는 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한 용도가 제공되며, 상기 세포는 염색체 2의 적어도 하나의 후성적 변형을 갖는다. 일 실시형태에서, 상기 염색체 2의 적어도 하나의 후성적 변형은 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에 있다. 다른 실시형태에서, 염색체 2의 적어도 하나의 후성적 변형은, 상기 세포를 적어도 DNA-타겟팅 효소 또는 DNA-타겟팅 효소의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 효소가, 염색체 2의 상기 세포의 게놈 DNA 내에, 그 안에 유발하는, 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 인간 게놈 어셈블리에 따름)에 영향을 미치는, 적어도 하나의 후성적 변형을 만드는 과정에 의해 만들어진다.
일 실시형태에서, 여기서는 여기에 기재된 임의의 단리된 세포 또는 여기에 기재된 어느 하나의 조성물의, 포유동물에서 태아 헤모글로빈을 증가시키기 위한, 또는 포유동물에서 혈색소병증을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 용도를 제공한다.
여기에 기재된 조성물의 용도의 일 실시형태에서, 상기 조성물은 접촉된 세포에서 태아 헤모글로빈 mRNA 또는 단백질 발현의 증가를 유발한다.
여기에 기재된 조성물의 용도의 일 실시형태에서, 기재된 임의의 조성물의 세포는 이식 과정에서 세포의 수령자인 포유동물에 자가이며, 즉, 상기 조성물의 세포는 임의의 기재된 변형 전에 상기 포유동물로부터 유래하거나 채취된다.
여기에 기재된 조성물의 용도의 일 실시형태에서, 기재된 임의의 조성물의 세포는 이식 과정에서 세포의 수령자인 포유동물에 비-자가이며, 즉, 상기 조성물의 세포는 임의의 기재된 변형 전에 상기 포유동물로부터 유래 또는 채취되지 않는다.
여기에 기재된 조성물의 용도의 일 실시형태에서, 기재된 임의의 조성물의 세포는, 적어도, 이식 과정에서 세포의 수령자인 포유동물에 매칭되는 HLA 타입이다.
여기에 기재된 조성물의 용도의 일 실시형태에서, 기재된 임의의 조성물의 세포는 임의의 기재된 변형 전에 단리된 전구 세포이다.
여기에 기재된 조성물의 용도의 일 실시형태에서, 기재된 임의의 조성물의 세포는 임의의 기재된 변형 전에 단리된 조혈 전구 세포이다.
여기에 기재된 조성물의 용도의 일 실시형태에서, 기재된 임의의 조성물의 세포는 임의의 기재된 변형 전에 단리된 유도 만능 줄기 세포이다.
여기에 기재된 조성물의 용도의 일 실시형태에서, 기재된 임의의 조성물의 세포는 사용 전에 냉동보존된다.
BCL11A 에는 HbF-연관 변이가 있는 것으로 알려져 있다. HbF 수준의 6 GWAS (또는 고 상관관계의 형질 F-세포 수)가 유럽, 아프리카 및 아시아 혈통의 개체에 행하여졌으며, 각각은 BCL11A 내의 형질-연관 변이형(variant)들을 동정한다(7-12). 동일한 변이형이 SCD 및 β-지중해빈혈의 임상적 중증도와 연관되며(9, 10, 50), 이는 이들 장애의 주요 조절자(modifier)로서의 HbF와 일치한다. BCL11A에서의 변이는 HbF 수준에서의 형질 변이의 ~15%를 설명하는 것으로 추산된다(7, 12, 43). 4개의 상이한 SNP(rs1427407 (7), rs11886868 (8), rs4671393 (9) 및 rs766432 (10-12))가 상기 형질과 가장 높게 연관된 것으로 동정되었다; 이들 전초 SNP들은 BCL11A 인트론-2 내에 서로 3kb 내에 모여 있다(도 2A 및 11B). 상기 전초 SNP들을 포함하는 일배체형들은 개별 SNP보다 HbF 연관을 더 잘 설명해 주는 것으로 보인다(12, 43). BCL11A 좌의 50개의 SNP들과 인트론-2 내의 27개의 SNP들이 전 게놈 유의성(P < 5×10-8)으로 HbF 수준과 연관되었다. 대규모 재 시퀀싱 노력에도 불구하고, BCL11A의 코딩 변이형은 기술되지 않았다(43).
이전에, 본 발명자들은 BCL11A 좌에서 HbF에 의한 연관 신호(association signal)를 정밀 지도 작성(fine mapping)하는 CSSCD를 사용하여 rs4671393와의 강한 연관을 보고했다(43). 그 연구에서는 rs1427407 에게로 전가되었다(imputed). 2개의 추가적인 SNP, rs766432 및 rs11886868도 이전의 연구에서 가장 높게 형질-연관된 전초 SNP로서 동정되었다(8, 10, 11, 51). 4개의 전초 SNP 모두에서의 유전자형이 입수 가능한 개체의 서브세트(n = 728)에서, rs1427407에서의 유전자형을 조건으로 함에 뒤따르는 연관 결과는 rs4671393, rs766432 또는 rs11886868에서 유의하지 않았다; 역으로, 연관은 rs4671393, rs766432 또는 rs11886868을 조건으로 할 때 rs1427407에 대해 매우 유의하게 잔존하였다(표 4). 따라서, rs1427407는 적혈구 DHS 내에서 HbF 수준과 가장 강하게 연관된 SNP이며 이전에 기술된 다른 전초 SNP보다 형질 연관을 더 잘 설명한다.
조건부 분석에 의해 rs1427407을 조건으로 한 후에 유의하게 잔존한 연관이 입증되었다. 가장 유의한 잔류 연관은, DHS +55에서 rs7606173에 대한 것(P = 9.66×10-11)이고; 우리가 이전에 보고한 바 있는(43), DHS +62에서 rs7599488에 대한 것은 약간 덜 유의하였다 (P = 2.43×10-10) (표 1). 세 DHS 내의 희귀 DNA 서열 변이형의 분석은 추가의 독립적인 HbF-연관 신호를 내지 않았다 (표 5).
본 발명자들은 대립유전자-특이적 전사 인자 (TF) 결합이 BCL11A 발현에 개입됨을 발견하였다. 시료들간의 트랜스-작용 차이들을 고려하여 조정하고 양 대립유전자들의 동등한 과다(abundance)를 보장하기 위해, 정보전달적인(informative) 이형접합체들을 사용하여, 대립유전자-특이적 생화학 연구가 행하여졌으며, 짝지어진 gDNA에서 대립유전자의 동등한 표현(representation)에 의해 실증되었다(도 2B 및 2C). rs1427407는 DHS +62에서 GATA1 및 TAL1 결합 피크의 중심에서 직접 발견된다 (도 2B). 행해진 ChIP 분석에서, 염색질을 소니케이션하여 약 500-bp 절편으로 하였다. ChIP-qPCR 에 사용된, rs1427407에 대해 이형접합인 5개의 일차 인간 적혈구 전구체 시료는, 적혈구 DHS에서 Sanger 시퀀싱되었다. 이들 시료의 어느 것에서도 500-bp의 rs1427407 내의 유일한 다른 이형접합 SNP는 rs7599488 (rs1427407의 304-bp 3')이었으며 이것은 5개의 시료 중 단 둘에서 이형접합이었다. 이 SNP는 GATA1 또는 TAL1 결합 모티프의 범주에 속하지 않는다. 따라서 DHS +62 내의 다른 SNP가 관찰된 대립유전자-특이적 TF 결합을 설명할 수 있다고는 보이지 않는다.
이에 더하여, 본 발명자들은 BCL11A 발현과 HbF 수준 간에 연관이 있음을 발견하였다. 본 발명자들의 연구는 HbF 수준의 임상적으로 의미 있는 증가로 귀결될 수 있는 BCL11A 발현의 변화의 추산(estimate)을 제공한다. 인간 림프아구양(lymphoblastoid) 세포주의 제한된 세트 중에서 rs4671393의 고(high) HbF-연관 A-대립유전자와 감소된 BCL11A 발현 간의 상관 관계가 이전에 보고된 바 있다(13). 이들 실험의 더 큰 컬렉션의 유전자형 결정된 세포주로의 확장은 이 관찰을 확인시켜주지 못했다. 따라서, 본 발명자들은 HbF-연관 rs1427407-rs7606173 일배체형이 적혈구-특이적 맥락에서 BCL11A 발현에 영향을 미침, DNA분해효소 I 감수성 발견과 일치하는 가능성을 발견하였다. 일차 적혈구 전구체에서 BCL11A mRNA 발현은 고-HbF rs1427407-rs7606173 T-G과 저-HbF G-C 일배체형 간에 1.7배 차이가 났으며(도 3B); 따라서, 중간(median) HbF 수준은 T-G 및 G-C 호모 접합체에서 각각 10.6% 및 3.1%였다(도 3C). 주목할 것은, 일차 인간 적혈구세포에서 BCL11A의 대립유전자-특이적 발현을 입증하는 결과가 rs1427407-rs7606173 일배체형에 대해 이형접합인 세포에서 관찰되었으며, BCL11A 발현에 대한 보통 정도의 효과는 상기 일배체형 내의 모든 기능적 SNP들의 조합된 효과를 반영한다. 보호 BCL11A 일배체형의 유전은 집단 기준으로 임상적으로 유익하나(9, 10, 50), T-G 호모 접합체 내의 HbF의 평균 수준은 겸상 혈구성 질환으로부터 이환(morbidity)을 방지하기 위해 요구되는 낮은 것으로 남아 있다. BCL11A 발현에 대한 HbF 수준의 감수성은, 그러나, 질환 중증도의 경감에 BCL11A 발현의 보통 정도의 추가적인 감소만이 필요할 지 모른다는 것을 예측한다.
본 발명자들은 글로빈 유전자 및 BCL11A의 발생 조절을 더 탐구하였다. 인간 발생 동안, 난황낭-유래 ε-글로빈은 임신 초기(제1기)에 태아 간-유래 γ-글로빈에 의해 대체된다. 출생 후, 적혈구 생성이 간으로부터 골수로 시프트함에 따라, γ-글로빈이 점진적으로 침묵하고 β-글로빈이 우세하게 된다. 글로빈 유전자 발현에서 단 한번의 스위치가 마우스 개체 발생에서 일어난다. 임신 중기에 일어나는 이 이행 중, 순환하는 난황낭-유래 원시 적혈구가 배아기 글로빈 εy 및 βH1을 발현하며, 반면 태아 간 완성(definitive) 적혈구모세포는 성체기 글로빈 β1 및 β2을 발현한다. 이 발생 스위치와 조화하여, BCL11A은 완성 적혈구 계통에서는 발현되나 원시기 적혈구 계통에서는 그렇지 않으며 글로빈 유전자 발현의 변화가 요구된다(16, 52).
10.5 dpc 에서의 안정한 트랜스제닉 BCL11A +52.0-64.4 리포터 라인에서, lacZ 발현은 태아 간 원기에서만 관찰되었으며 배아, 태반 또는 난황낭 내의 순환 혈액에서는 관찰되지 않았다(도 6A). 이들 결과는, 12.5 dpc완성 태아 간 적혈구모세포에서는 lacZ 발현이 있으나 난황낭-유래 원시 순환 적혈구에서는 그렇지 않다는 발견(도 4B)과 결합하여, BCL11A 복합 인핸서 서열이 내인 글로빈 유전자 스위칭과 조화하여 발생-특이적 패턴으로 발현을 추진함을 입증한다.
적혈구 인핸서 활성에 요구되는 최소의 요소를 정제하기 위해 일련의 결실 돌연변이형를 생성하였다. 중앙의 +58 DHS 함유 서열은 적혈구 인핸서 활성에 충분했다. 양 옆의(flanking) +62 또는 +55 요소만 함유하는 서열은 적혈구 유전자 발현을 지시할 수 없었다(도 6B). 일차 인간 적혈구전구체에서 유전자 발현을 증강하는 DHS의 능력을 테스트하기 위해, 우리는 이전에 기재된(39) GFP 리포터 시스템의 렌티바이러스 전달을 사용했다. 유사하게, +58 DHS는 이 리포터 분석에서 유전자 발현을 증강시켰다(도 7).
본 발명자들은 BCL11A 발현을 위한 인핸서의 요건을 탐구하기 위해 Bcl11a 인핸서 결실을 갖는 세포주를 생성하기로 결정하였다. 인핸서가 방해된 안정한 적혈구 세포가 생성되었다. 적절한 성체기 인간 적혈구계 세포주(adult-stage human erythroid cell line)가 없기 때문에, 또한 원리의 증명으로서, 본 발명자들은 뮤린 시스템에 의지했다. 마우스 적백혈병 (MEL) 세포는 글로빈 유전자 발현의 성체기 패턴에 대해 BCL11A에 의존한다(14). 본 발명자들은 마우스 Bcl11a 인트론-2에서 이종상동성 적혈구 복합 인핸서를 동정했다. 인간 GWAS-표지 인트론-2 BCL11A 인핸서와 같이, 이들 서열은 일련의 적혈구-특이적 DHS를 가졌다. 이에 더하여, 이들 서열은 H3K4me1 및 H3K27ac에 의해 수식되었으며(decorated), H3K4me3 및 H3K27me3을 결여하였으며, 마우스 적혈구 염색질에서 GATA1 및 TAL1 둘 다에 의해 점유되었다(도 8). 일련의 인접한 DHS를 포함하는 복합 조절 요소는 다른 것 중에서도 β-글로빈 좌 조절 영역, α-글로빈 다종(multispecies) 보존 서열, 및 IgH 조절 영역을 포함하는 다수의 좌에서 유전자 발현에 임계적인 것으로 나타났다(53-55). 우리는 상기 복합 인핸서의 종-특이적인 특유의 특징을 관찰했다. 예를 들면, 본 발명자들은 3개의 인간 DHS +62, +58 및 +55의 각각에 대한 보존 마우스 서열을 동정하여, +62 및 +55 보존 서열에서 적혈구 DNA분해효소 I 과민성을 발견하였으나, +58 보존 서열은 DNA분해효소 I 과민성을 결여하였다.
PCR 및 서던 블로팅은 3개의 특유의 MEL 클론 및 2개의 특유의 전(pre)-B 림프구 클론에서 Bcl11a의 +50.4-60.4 kb 인트론 분절의 삭제를 검증하였다(도 9). Sanger-시퀀싱된 절단점(break point)들은 후속의 NHEJ 복구와 함께 TALEN-매개 절단의 특징이었다(도 10). 인트론 분절의 결실 후에, 본 발명자들은 상기 결실의 상류의, 상기 결실에 걸치는 또는 상기 결실의 하류의 엑손 경계를 검출하는 프라이머 쌍을 사용하여, RT-qPCR에 의해, MEL 세포 클론에서 BCL11A 전사물의 극적인 감소를 관찰했다(도 5A).
정의
편의상, 전체 출원(명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위를 포함)에서 사용되는 특정 용어들을 여기에 모아 놓았다. 다르게 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
여기에 사용된 구문 "염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA에 결합하는 물질(agent that binds the genomic DNA of the cell on chromosome 2 location 60,716,189-60,728,612)"이란 게놈 DNA 내의 상기 위치(예를 들면, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612)에 결합하여 그러한 물질로 처리되지 않은 세포에서의 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 수준에 비해 세포에서 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 적어도 20% 억제할 수 있는 소분자, 핵산, 단백질, 펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 가리킨다. 일 실시형태에서, 상기 물질은 그 구문이 여기서 사용될 때 "BCL11A 결합 파트너와의 BCL11A 상호작용에 개입한다(interferes with BCL11A interactions with BCL11A binding partners)"
여기에 사용된 용어 "소분자(small molecule)"란 다음을 비제한적으로 포함하는 화학물질을 가리킨다: 분자량 약 10,000 g/몰 미만의 펩티드, 펩티드모방체, 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 앱타머, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 유기 또는 무기 화합물(즉, 헤테로오르가닉 및 오르가노메탈릭 화합물 포함), 분자량 약 5,000 g/몰 미만의 유기 또는 무기 화합물, 분자량 약 1,000 g/몰 미만의 유기 또는 무기 화합물, 분자량 약 500 g/몰 미만의 유기 또는 무기 화합물, 및 염, 에스테르, 및 그러한 화합물의 약학적으로 허용가능한 다른 형태.
여기에 기재된 "핵산(nucleic acid)"은 RNA 또는 DNA일 수 있고, 단일 또는 이중 가닥일 수 있으며, 예를 들면 다음을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다: 관심 대상의 단백질을 코딩하는 핵산, 올리고뉴클레오티드, 핵산 유사체, 예를 들면 펩티드-핵산 (PNA), 의사-상보성 PNA (pc-PNA), locked 핵산 (LNA) 등. 그러한 핵산 서열은, 예를 들면, 그러나 이에 제한됨 없이, 다음을 포함한다: 단백질, 예를 들면 전사 억제자로서 작용하는 것을 코딩하는 핵산 서열, 안티센스 분자, 리보자임, 소 억제 핵산 서열, 비한정적인 예로서 RNAi, shRNAi, siRNA, 마이크로 RNAi (mRNAi), 안티센스 올리고뉴클레오티드 등.
"BCL11A 결합 파트너와의 BCL11A 상호작용에 개입한다(interferes with BCL11A interactions with BCL11A binding partners)"는 것은 BCL11A 결합 파트너와의 BCL11A의 상호작용의 양이, BCL11A 저해제가 존재하지 않는 비교 대상의 대조 집단에 비해, BCL11A 저해제로 처리된 집단에서, 적어도 5% 낮은 것을 가리킨다. BCL11A 저해제로 처리된 집단에서 BCL11A 결합 파트너와의 BCL11A의 상호작용의 양은 BCL11A가 첨가되지 않은 비교 대상의 대조 처리된 집단보다 적어도 10% 낮거나, 적어도 20% 낮거나, 적어도 30% 낮거나, 적어도 40% 낮거나, 적어도 50% 낮거나, 적어도 60% 낮거나, 적어도 70% 낮거나, 적어도 80% 낮거나, 적어도 90% 낮거나, 적어도 1배 낮거나, 적어도 2배 낮거나, 적어도 5배 낮거나, 적어도 10배 낮거나, 적어도 100배 낮거나, 적어도 1000배 낮거나, 또는 더 낮은 것이 바람직하다. 최소한, BCL11A 상호작용은 질량분광분석, 면역 침전, 또는 젤 여과 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 당 기술분야의 표준적 기술을 사용하여 BCL11A 결합 파트너에 대한 BCL11A 결합의 양을 측정함으로써 분석될 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, BCL11A 활성은 후보 BCL11A 저해제에 의한 처리 후의 mRNA 또는 단백질 수준에서의 태아 헤모글로빈 발현을 측정함으로써 분석될 수 있다.
일 실시형태에서, BCL11A 활성은 BCL11A와 그것의 결합 파트너인 GATA-1, FOG-1, NuRD 복합체의 성분, matrin-3, MTA2 및 RBBP7와의 상호작용이다. 따라서, 이 상호작용을 차단 가능한 임의의 항체 또는 그 절편, 소분자, 화학물질 또는 화합물은 BCL11A 활성의 저해제로 간주된다.
여기에 사용된 용어 "유전자 조작 세포(genetic engineered cell)"는 그 용어가 여기에서 사용될 때 적어도 하나의 유전자 변형을 포함하는 세포를 가리킨다.
여기에 사용된 용어 "유전자 변형(genetic modification)"은 세포에서 BCL11A 발현 또는 활성의 감소로 귀결되는 유전자 수준에서의 방해(disruption)를 가리킨다. 예시적 유전자 변형은 결실, 프레임 시프트 돌연변이, 점 돌연변이, 엑손 제거, 하나 이상의 DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS) (예를 들면, 2, 3, 4 또는 그 이상의 DHS 영역들)의 제거 등을 포함할 수 있다.
"BCL11A 발현을 저해한다(inhibits BCL11A expression)"는 것은 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 존재하지 않는 비교 대상의 대조 세포 또는 세포 집단보다 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제로 처리된 세포 또는 세포 집단에서 BCL11A의 발현량이 적어도 5% 낮은 것을 의미한다. 처리된 집단에서의 BCL11A 발현의 백분율이 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 첨가되지 않은 비교 대상의 대조 처리된 집단보다 적어도 10% 낮거나, 적어도 20% 낮거나, 적어도 30% 낮거나, 적어도 40% 낮거나, 적어도 50% 낮거나, 적어도 60% 낮거나, 적어도 70% 낮거나, 적어도 80% 낮거나, 적어도 90% 낮거나, 적어도 1배 낮거나, 적어도 2배 낮거나, 적어도 5배 낮거나, 적어도 10배 낮거나, 적어도 100배 낮거나, 적어도 1000배 낮거나, 또는 더 낮은 것이 바람직하다.
"BCL11A 활성을 저해한다(inhibits BCL11A activity)"는 것은 처리된 집단에서의 BCL11A의 기능적 활성의 양이 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 존재하지 않는 비교 대상의 대조 세포 또는 집단보다 여기에 기재된 방법으로 처리된 세포 또는 세포 집단에서 적어도 5% 낮은 것을 의미한다. BCL11A-저해제로 처리된 집단에서의 BCL11A의 활성의 백분율이 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 첨가되지 않은 비교 대상의 대조 처리된 집단보다 적어도 10% 낮거나, 적어도 20% 낮거나, 적어도 30% 낮거나, 적어도 40% 낮거나, 적어도 50% 낮거나, 적어도 60% 낮거나, 적어도 70% 낮거나, 적어도 80% 낮거나, 적어도 90% 낮거나, 적어도 1배 낮거나, 적어도 2배 낮거나, 적어도 5배 낮거나, 적어도 10배 낮거나, 적어도 100배 낮거나, 적어도 1000배 낮거나, 또는 더 낮은 것이 바람직하다. 최소한, BCL11A 활성은 당 기술분야의 표준적 기술을 사용하여 단백질 또는 mRNA 수준에서 BCL11A 발현량을 측정함으로써 분석될 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, BCL11A 활성은 BCL11A 활성에 민감한 리포터 구조체를 사용하여 측정될 수 있다. 상기 γ-글로빈 좌 서열은 BCL11A 구조체의 핵산-결합 모티프에 의해 인식 가능하다.
일 실시형태에서, 여기에 사용된 용어 "DNA 타겟팅 엔도뉴클레아제(DNA targeting endonuclease)"란 원치 않는 타겟 외 이중가닥절단을 생성하지 않고 게놈의 원하는 위치(예를 들면, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612) 에 이중가닥절단을 생성하는 엔도뉴클레아제를 가리킨다. 상기 DNA 타겟팅 엔도뉴클레아제는 천연적으로 발생하는 엔도뉴클레아제(예를 들면, 박테리아 메가뉴클레아제)일 수 있으며 또는 인공적으로 생성될 수도 있다(예를 들면, 특히 조작 메가뉴클레아제, TALEN, 또는 ZFN).
다른 실시형태에서, 여기에 사용된 용어 "DNA 타겟팅 엔도뉴클레아제(DNA targeting endonuclease)"는 원치 않는 타겟 외 DNA 가닥 절단을 생성하지 않고 게놈의 원하는 위치(예를 들면, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612) 에서 단일 가닥 절단(single-stranded break) 또는 단일 가닥의 DNA 포스페이트 당 골격에 "틈(nick)" 또는 절단(break)을 생성하는 엔도뉴클레아제를 가리킨다.
여기에 사용된 용어 "벡터(vector)"는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 가리킨다. 벡터의 일 유형은 "플라스미드(plasmid)"로서, 이는 거기에 추가의 핵산 분절이 연결될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 가리킨다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 벡터로서, 추가의 핵산 분절이 바이러스 게놈에 연결될 수 있는 것이다. 어떤 벡터는 그 벡터가 도입되는 숙주 세포 내에서 자가 복제를 할 수 있다(예를 들면 박테리아성 복제원점을 갖는 박테리아 벡터와 에피좀성 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들면, 비-에피좀성 포유동물 벡터)는 숙주 세포에의 도입시에 숙주 세포의 게놈에 통합되며, 그에 의해 숙주 게놈을 따라 복제된다. 게다가, 어떤 벡터는 그들이 작동적으로 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터는 여기서 "재조합 발현 벡터(recombinant expression vector)" 또는 더 간단하게 "발현 벡터(expression vector)"라 한다. 일반적으로 재조합 DNA 기술에서 유용한 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 플라스미드가 벡터의 가장 흔히 사용되는 형태이기 때문에, 본 명세서에서 "플라스미드"와 "벡터"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나 여기에 기재된 방법 및 조성물은 동등한 기능을 제공하는, 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터(예를 들면, 복제 결함 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함할 수 있다.
발현 벡터 내에서, "작동적으로 연결된(operably linked)"은, 관심 대상의 뉴클레오티드 서열이 조절 서열(들)에 그 뉴클레오티드 서열의 발현(예를 들면, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 그 벡터가 타겟 세포로 도입될 때 타겟 세포에서)을 가능하게 하는 방식으로 연결된 것을 의미하는 것으로 의도되어 있다. 용어 "조절 서열(regulatory sequence)"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 대조 요소 (예를 들면, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것이 의도되어 있다. 그러한 조절 서열은, 예를 들면, [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구조적 발현을 지시(direct)하는 것과 어떤 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것(예를 들면, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 나아가, DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제는 특정 간격, 또는 특정 기간에 걸쳐 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 합성을 지시하는 조절 서열을 포함하는 벡터에 의해 전달될 수 있다. 발현 벡터의 설계는 타겟 세포의 선택, 원하는 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있음은 당 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 이해될 것이다.
여기에 사용된 용어 "절단하다(cleave)"란 일반적으로 원하는 위치에서의 DNA 게놈에서의 이중가닥절단의 생성을 가리킨다.
여기에 사용된 용어 "적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물의 유효량(effective amount of a composition comprising at least a DNA-targeting endonuclease)"이란 그 게놈의 원하는 위치에 이중가닥절단을 생성하기에 충분한 엔도뉴클레아제 활성을 생기게 하는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 양을 가리킨다. 일 실시형태에서, DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 유효량은, 원하는 유전자 좌에, 이중가닥절단을, 그 조성물에 접촉된 집단의 세포의 적어도 20%에(예를 들면, 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 조성물에 의해 만들어진 유전자 변형을 포함하는 집단의 세포의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 심지어 100%에) 생성한다.
여기에 사용된 용어 세포에서 "태아 헤모글로빈 수준을 증가시킴(increasing the fetal hemoglobin levels)"이란, 태아 헤모글로빈이, 물질이 존재하지 않는 비교 대상의 대조 집단보다, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 게놈 DNA에 결합함으로써 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현을 방해하는 물질(예를 들면, DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제)로 처리된 집단에서, 적어도 5% 높은 것을 가리킨다. 그러한 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 게놈 DNA에 결합하는 물질로 처리된 집단에서 태아 헤모글로빈 발현의 백분율은, 비교 대상의 크기 및 배양 조건의 대조 처리된 집단보다 적어도 10% 높은, 적어도 20% 높은, 적어도 30% 높은, 적어도 40% 높은, 적어도 50% 높은, 적어도 60% 높은, 적어도 70% 높은, 적어도 80% 높은, 적어도 90% 높은, 적어도 1배 높은, 적어도 2배 높은, 적어도 5배 높은, 적어도 10배 높은, 적어도 100배 높은, 적어도 1000배 높은, 또는 더 높은 것이 바람직하다. 용어 "대조 처리된 집단"(control treated population)"은 여기에서 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 게놈 DNA에 결합하는 물질의 첨가를 제외하면 동등한 미디어(media), 바이러스 유도, 핵산 서열, 온도, 밀집도(confluency), 플라스크 크기, pH, 등으로 처리된 세포의 집단을 기술하는데 사용된다. 일 실시형태에서, 당 기술분야에 알려진 임의의 방법, 예를 들면 태아 γ-글로빈 단백질의 웨스턴 블롯 분석 및 태아 γ-글로빈의 mRNA 정량화가 태아 헤모글로빈 발현의 증가를 측정하기 위해 사용될 수 있다.
여기에 사용된 용어 "단리된 세포(isolated cell)"는 그것이 원래 발견된 유기체로부터 꺼내어진 세포, 또는 그러한 세포의 후손을 가리킨다. 경우에 따라(optionally) 세포는 시험관내에서, 예를 들면, 다른 세포의 존재 하에 배양된 것이다. 경우에 따라 상기 세포는 후에 제2의 유기체로 도입되거나 상기 세포가 단리되었던(또는 그로부터 상기 세포가 자손인) 유기체로 재도입된다.
여기에 사용된 단리된 세포의 집단에 대한 용어 "단리된 집단(isolated population)"은 꺼내어지고, 혼합되거나 이종의 세포 집단으로부터 분리된, 세포의 집단을 가리킨다. 일부 실시형태에서, 단리된 집단은 그로부터 상기 세포가 단리되거나 농축된 이종 집단에 비해 실질적으로 순수한 세포의 집단이다. 일부 실시형태에서, 상기 단리된 집단은 인간 단리된 조혈 전구 세포의 집단, 예를 들면 인간 조혈 전구 세포 및 그 인간 조혈 전구 세포가 유래한 세포를 포함하는 이종 집단에 비해 실질적으로 순수한 인간 조혈 전구 세포의 집단이다.
특정 세포 집단에 대하여 용어 "실질적으로 순수한(substantially pure)"은 총 세포 집단을 구성하는 세포에 대하여 적어도 약 75%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 순수한 세포의 집단을 가리킨다. 즉, 조혈 전구 세포 집단에 관하여 용어 "실질적으로 순수한(substantially pure)" 또는 "본질적으로 정제된(essentially purified)"은 여기서 그 용어에 의해 정의되는 조혈 전구 세포가 아닌 세포를, 약 20%보다 적게, 더 바람직하게는 약 15%, 10%, 8%, 7%보다 적게, 가장 바람직하게는 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 1% 미만보다 더 적게 함유하는 세포의 집단을 가리킨다.
여기에 사용된 용어 "치료함(treating)"은 적어도 하나의 부작용 또는 상태, 질환 또는 장애의 증상을 감소시키거나 또는 경감시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 용어 "치료함(treating)" 및 "치료(treatment)"는, 대상체가 그 질환의 적어도 하나의 증상의 감소 또는 그 질환의 개선, 예를 들면 유익하거나 또는 원하는 임상적 결과를 갖도록, 조성물의 유효량, 예를 들면 조혈 전구 세포의 집단을 포함하는 조성물의 유효량을 그 대상체에 투여하는 것을 가리킨다. 개시된 목적을 위해, 유익하거나 또는 원하는 임상적 결과는, 검출 가능하거나 검출 불능한, 하나 이상의 증상의 경감, 질환의 정도의 감소, 질환 안정화(예를 들면, 악화하지 않음), 질환의 진척의 지연 또는 늦춤, 질환의 상태의 개선 또는 일시적 완화, 및 차도(부분적이거나 또는 전체적)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 치료함은 그 치료를 받지 않을 때 기대되는 생존률에 비해 생존율을 연장하는 것을 가리킬 수 있다. 따라서, 당 기술분야의 숙련자는 그 치료가 그 질환 상태를 개선할 수 있으나 그 질환의 완전한 치유는 아닐 수 있음을 인식한다. 일부 실시형태에서, 치료는 예방을 포함할 수 있다. 그러나 대안적 실시형태에서 치료는 예방을 포함하지 않을 수 있다.
구문 "약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 여기서, 건전한 의학적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제나 합병증 없이 인간과 동물의 조직에 접촉시켜 사용하기에 적절하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는, 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 제형을 가리키기 위해 채용된다.
여기에 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)", "생리적으로 견딜 수 있는(physiologically tolerable)" 및 그것의 문법적 변형은, 그 용어들이 조성물, 담체, 희석제 및 시약을 가리킬 때, 상호 교환적으로 사용되며 그 물질이 바람직하지 않은 생리적 효과 예컨대 구역, 어지럼, 급성위연동이상항진 등을 일으킴 없이 포유동물에게 투여될 수 있는 것을 나타낸다. 약학적으로 허용가능한 담체는 원하지 않는 한, 그것이 혼합될 물질에 대한 면역 반응의 상승을 촉진하지 않을 것이다. 그 안에 용해 또는 분산된 활성 성분을 함유하는 약학적 조성물의 제제화는 당 기술분야에서 잘 이해되어 있으며 포뮬레이션에 기초하여 제한될 필요는 없다. 전형적으로 그러한 조성물은 액상 용액 또는 현탁액 중 어느 하나로 주사 가능하게 제제화되지만, 용액, 또는 현탁액에 적절한 고형, 사용 전에 리퀴드, 로 제제화될 수도 있다. 상기 제제는 에멀젼화되거나 리포좀 조성물로서 제공될 수도 있다. 활성 성분은 약학적으로 허용가능하고 활성 성분과 양립 가능하며 여기에 기재된 치료 방법에 사용하기에 적절한 양의 부형제와 혼합될 수 있다. 적절한 부형제는 예를 들면 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 또는 기타와 그들의 조합이다. 이에 더하여, 요망된다면, 조성물은 활성 성분의 유효성을 증진시키는 소량의 보조 물질 예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제, pH완충제 등을 함유할 수 있다. 본 발명의 치료 조성물은 그 안에 상기 성분의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 무기산 예컨대, 염산 또는 인산, 또는 유기산 예컨대 아세트산, 타르타르산, 만델산 등에 의해 형성된 산 부가 염(폴리펩티드의 자유 아미노기에 의해 형성된)을 포함한다. 자유 카복시기에 의해 형성된 염은 무기염기 예컨대 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘 또는 철의 수산화물 및 유기염기 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인(procaine) 등으로부터 유래할 수도 있다. 생리적으로 견딜 수 있는 담체는 당 기술분야에 주지이다. 예시적 액상 담체는 활성 성분과 물에 더하여 다른 물질을 함유하지 않거나 또는 완충액 예컨대 생리적 pH값의 소듐 포스페이트, 생리식염수 또는 이들 둘다, 예컨대 포스페이트-완충된 식염수를 함유하는 멸균 수용액이다. 나아가, 수성 담체는 염 예컨대 소듐 및 포타슘 클로라이드, 덱스트로즈, 폴리에틸렌 글리콜 및 다른 용질뿐만 아니라 하나 이상의 완충염을 함유할 수 있다. 액체 조성물은 또한 물에 추가하여 또는 물을 배제하고 액상을 함유할 수 있다. 그러한 추가적 액상의 예는 글리세린, 식물성 오일 예컨대 면실유, 및 워터-오일 에멀젼이다. 특정 장애 또는 상태의 치료에 유효할 여기에 기재된 방법과 함께 사용되는 활성 물질의 양은 그 장애 또는 상태의 성격에 의존할 것이며 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다.
여기에 사용된 "예방(prevention)" 또는 "예방함(preventing)"은 질환, 장애 또는 그 증상에 대하여 사용될 때, 개체가 질환 또는 장애, 예를 들면 혈색소병증을 발병할 가능성의 감소를 가리킨다. 질환 또는 장애를 발병할 가능성은, 예를 들면, 질환 또는 장애에 대한 하나 이상의 위험 인자를 갖는 개체가 그 장애를 발병하지 않거나 더 늦은 시간에 또는 덜한 중증도로 그러한 질환 또는 장애를 발병할 때, 같은 위험 인자를 가지나 여기에 기재된 치료를 받지 않은 집단에 비해, 통계학적으로 말하면, 감소된다. 질환의 증상을 발병하지 않거나, 감소되거나(예를 들면 그 질환 또는 장애에 대해 임상적으로 허용된 스케일로 적어도 10%) 또는 지연된(예를 들면, 일, 주, 월 또는 년) 증상의 발병은 유효한 예방으로 간주된다.
세포를 BCL11A 발현을 감소시키기 위해 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 것과 관련하여, 구문 "세포에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시킴(increasing fetal hemoglobin levels in a cell)"이란 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 존재하지 않는 비교 대상의 대조 집단보다 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제로 처리된 세포 또는 세포 집단에서, 세포 또는 세포 집단에서의 태아 헤모글로빈이 적어도 5% 높은 것을 가리킨다. 비교 대상의 대조 처리된 집단보다 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제로 처리된 세포에서 태아 헤모글로빈 발현이 적어도 10% 높은, 적어도 20% 높은, 적어도 30% 높은, 적어도 40% 높은, 적어도 50% 높은, 적어도 60% 높은, 적어도 70% 높은, 적어도 80% 높은, 적어도 90% 높은, 적어도 1배 높은, 적어도 2배 높은, 적어도 5배 높은, 적어도 10배 높은, 적어도 100배 높은, 적어도 1000배 높은, 또는 더 높은 것이 바람직하다. 용어 "대조 처리된 집단(control treated population)"은 여기서 BCL11A 저해제의 첨가를 예외로 하고 동등한 미디어, 바이러스 유도, 핵산 서열, 온도, 밀집도, 플라스크 크기, pH, 등으로 처리된 세포의 집단을 기술하는데 사용된다.
용어 "포유동물(mammal)"은 단수인 "포유동물(mammal)"과 복수인 "포유동물들(mammals)"을 포괄하는 것을 의도하며, 인간; 영장류 예컨대 유인원, 멍키, 오랑우탄, 및 침팬지; 개과의 동물 예컨대 개 및 늑대; 고양이과의 동물 예컨대 고양이, 사자, 및 호랑이; 말과의 동물 예컨대 말, 당나귀, 및 얼룩말; 식용 동물 예컨대 소, 돼지, 및 양; 유제류(ungulate) 예컨대 사슴 및 기린; 설치류 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 기니아픽; 및 곰을 포함하나 여기에 제한되는 것은 아니다. 일부 바람직한 실시형태에서, 포유동물은 인간이다.
따라서, 일 실시형태에서, 상기 포유동물은 혈색소병증으로 진단된 것이다. 추가의 실시형태에서, 상기 혈색소병증은 β-혈색소병증이다. 바람직한 일 실시형태에서, 상기 혈색소병증은 겸상 혈구성 질환이다. 여기에 사용된 "겸상 혈구성 질환(sickle cell disease)"이란 겸상 혈구성 빈혈, 겸상-헤모글로빈 C 질환 (HbSC), 겸상-베타-플러스(plus)-지중해빈혈(HbS/β+), 또는 겸상-베타-제로(zero)-지중해빈혈 (HbS/β0)일 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 혈색소병증은 β-지중해빈혈이다.
여기에 사용된 용어 "혈색소병증(hemoglobinopathy)"은, 개체의 임의의 헤모글로빈의 구조나 기능상의 임의의 결함을 의미하며, β-글로빈 유전자의 코딩 영역에서의 임의의 돌연변이, 예컨대 결실 돌연변이 또는 치환 돌연변이, 또는 정상 또는 표준 상태에 비해 생산되는 헤모글로빈의 양의 감소를 일으키는 그러한 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 내의 돌연변이, 또는, 의 결실에 의해 유발되는 헤모글로빈의 일차, 2차, 3차 또는 4차 구조에 있어서의 결함을 포함한다. 상기 용어는 외부 인자 예컨대 질환, 화학치료, 독소, 독약 또는 기타에 의해 유발되는, 정상적인 또는 이상적인, 헤모글로빈의 양 또는 유효성에 있어서의 감소를 더 포함한다.
일 실시형태에서, 여기에 사용된 용어 "유효량(effective amount)"은, 혈색소병증을 치료, 가능성을 경감, 또는 발병을 지연하기에 안전하며 충분한 세포 조성물의 양을 가리킨다. 따라서 그 양은 혈색소병증을 치유하거나 또는 증상의 개선에 이르거나, 혈색소병증 질환 진척의 과정을 느리게 하거나, 혈색소병증의 증상을 느리게 하거나 또는 저해하거나, 혈색소병증의 2차 증상의 수립을 느리게 하거나 또는 저해하거나 또는 혈색소병증의 2차 증상의 발병을 저해할 수 있다. 혈색소병증의 치료를 위한 유효량은 치료될 혈색소병증의 유형, 그 증상의 중증도, 치료될 대상체, 그 대상체의 연령 및 일반적 상태, 투여의 모드 등에 의존한다. 따라서, 정확한 "유효량"을 특정한다는 것은 가능하거나 신중하지 않다. 그러나, 임의의 주어진 케이스에서, 적합한 "유효량"은 일상적인 실험만을 사용하여 당 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
여기에 사용된 용어 "포함함(comprising)" 또는 "포함한다(comprises)"는, 본 발명에 필수적이지만, 필수적이든 그렇지 않든 불특정 요소의 포함에 대하여 개방적인, 조성물, 방법, 및 그것의 각 성분(들)에 관하여 사용된다.
여기에 사용된 용어 "로 본질적으로 이루어짐(consisting essentially of)" 는 주어진 실시형태에 요구되는 요소를 가리킨다. 상기 용어는 본 발명의 실시형태의 기초적이고 신규한 또는 기능적인 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 부가적 요소의 존재를 허용한다.
용어 "로 이루어짐(consisting of)"은 그 실시형태의 기재에 있어서 인용되지 않은 임의의 요소를 배제하는, 여기에 기재된 조성물, 방법, 및 그것의 각각의 성분을 가리킨다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 명백히 다르게 기술하지 않는 한 복수의 지칭을 포함한다. 따라서 예를 들면 "방법"이라는 지칭은 여기에 기재되거나 또는 본 개시물 등을 읽는 당 기술분야의 숙련자에게 명백한 유형의 하나 이상의 방법, 및/또는 단계를 포함한다. 이상의 상세한 설명과 후속하는 실시예는 예시일 뿐이고 본 발명의 범위에 대한 제한으로 받아들여지지 않는 것으로 이해된다. 개시된 실시형태에 대한 다양한 변화와 변형은 당 기술분야의 숙련자에게 명백하며 본 발명의 사상과 범주를 벗어남 없이 이루어질 수 있다. 확인된 모든 특허 및 다른 공개물은 예를 들어 본 발명과 연관하여 사용될 수 있는 그러한 공개물에 나타난 방법론을 기술하고 개시하기 위한 목적을 위해 참조로 명확하게 포함된다. 이 공개물은 오로지 본 출원의 출원일 이전에서의 그것의 공개에 대해서 제공된다. 이와 연관하여 어느 것도 발명자가 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 그러한 개시물에 선행하지 않음의 인정으로 해석되어서는 안된다. 이 문헌의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 관한 모든 언급은 출원인이 이용가능한 정보에 기초하며, 이 문헌의 날짜 또는 내용의 정확도에 관하여 인정하는 것은 전혀 아니다.
혈색소병증
태아 헤모글로빈 (HbF)은 2개의 성체 α-글로빈 폴리펩티드 및 2개의 태아 β-유사 γ-글로빈 폴리펩티드의 테트라머이다. 임신 동안, 복제된 γ-글로빈 유전자는 β-글로빈 좌로부터 전사된 우세한 유전자를 구성한다. 출생 후, γ-글로빈은 성체 β-글로빈에 의해 점진적으로 대체되며, 이 과정은 "태아 스위치(fetal switch)"라고 불리운다(3). 이 스위치의 기저의 분자 메커니즘은 대부분 불명확하게 남아 있고 치열한 연구의 대상이었다. 주로 태아 헤모글로빈 또는 HbF (α2γ2)의 생산으로부터 성체 헤모글로빈 또는 HbA (α2β2)의 생산으로의 발생 스위치는 임신 약 28 내지 34 주에 개시되어 HbA이 우세하게 되는 때인 출생 직후에 계속한다. 이 스위치는 감마-글로빈 유전자의 감소된 전사와 베타-글로빈 유전자의 증가된 전사에 주로 기인한다. 잔류 HbF 수준은 건강한 성체에 있어서 20배에 걸친 차이를 갖기는 하지만, 평균적으로, 정상 성체의 혈액은 약 2% HbF만을 함유한다[Atweh, Semin. Hematol. 38(4):367-73 (2001)].
혈색소병증은 적혈구(Red Blood Cell(RBC))의 감소된 생산 및/또는 증가된 파괴(용혈)가 있는, 유전적 원인의 다수의 빈혈을 포함한다. 이들 장애는 또한 산소 농도 유지 능력의 동시적 저하를 갖는 이상(abnormal) 헤모글로빈의 생산으로 귀결되는 유전적 결함을 포함한다. 그러한 장애의 일부는 충분한 양으로 정상 β-글로빈을 생산하지 못하는 것을 포함하며, 다른 것은 정상 β-글로빈을 완전하게(entirely) 생산하지 못하는 것을 포함한다. 이들 β-글로빈 단백질과 연관된 장애를 일반적으로 β-혈색소병증이라 칭한다. 예를 들면, β-지중해빈혈은, HbA 결핍 또는 부재로 이어지는, β-글로빈 유전자의 발현의 부분적 또는 전적인 결함에 기인한다. 겸상 혈구성 빈혈은 β-글로빈 구조 유전자 내의 점 돌연변이에 기인하며, 이는 이상 (겸상) 헤모글로빈 (HbS)의 생산으로 이어진다. HbS RBC는 정상 RBC보다 더 손상되기 쉬우며 더 용이하게 용혈이 진행되어, 결국 빈혈로 이어진다[Atweh, Semin. Hematol. 38(4): 367-73 (2001)]. 게다가, BCL11A 유전자 변이형, HBS1L-MYB 변이의 존재는, 베타-지중해빈혈에서 임상적 중증도를 개선한다. 이 변이형은 HbF 수준과 연관된 것으로 나타났다. 고-HbF 변이형과 함께 덜 중증인 형태의 베타-지중해빈혈을 갖는 것에 대하여 5의 교차비(odd ratio)가 있는 것으로 밝혀졌다[Galanello S. et al., 2009, Blood, in press].
β-혈색소병증을 갖는 환자에게서 글로빈 체인 불균형의 감소를 겨냥한 치료의 탐색은 태아 헤모글로빈 (α2γ2; HbF)의 약리학적 처치에 집중되어왔다. 그러한 접근방법의 중요한 치료적 잠재력은, 동형접합 β-지중해빈혈 및 유전성 고태아헤모글로빈혈증 (HPFH) 둘다의 공동 유전을 갖는 개체들의 마일드한 형질의 관찰에 의해, 뿐만 아니라, 성체 헤모글로빈을 합성하지 않지만 태아 헤모글로빈의 증가된 농도의 존재 하에 감소된 수혈 필요성이 관찰되는 동형접합 β-지중해빈혈을 갖는 환자들에 의해, 제시된다. 나아가,β 체인 이상성을 갖는 성체 환자의 어떤 집단은 태아 헤모글로빈 (HbF)을 정상 수준보다 더 높게 갖는 것이 관찰되었으며, 정상 성체 수준의 HbF를 갖는 환자보다 질환의 더 마일드한 임상적 경과를 갖는 것으로 관찰되었다. 예를 들면, 20-30% HbF를 발현하는 일 그룹의 사우디아라비아 겸상 혈구성 빈혈 환자들은 상기 질환의 마일드한 임상적 소견만 갖는다 [Pembrey, et al., Br. J. Haematol. 40: 415-429 (1978)]. 현재, β-혈색소병증, 예컨대 겸상 혈구성 빈혈 및 β-지중해빈혈은, 증가된 HbF 생산에 의해 개선되는 것으로 받아들여지고 있다 [Reviewed in Jane and Cunningham Br. J. Haematol. 102: 415-422 (1998) and Bunn, n. Engl. J. Med. 328: 129-131 (1993)].
γ-로부터 β-글로빈 유전자 발현의 생체내 발생 스위치를 제어하는 분자 메커니즘은 현재 알려져 있지 않으나, 외부 인자가 γ-글로빈 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다는 축적 중인 증거가 있다. HbF 재활성화 활성을 갖는 것으로 발견된 제1군의 화합물은 세포독성 약(cytotoxic drug)이었다. 약리적 조작(pharmacological manipulation)에 의한 HbF의 새로운(de novo) 합성을 유발하는 능력은 처음에 실험 동물에서 5-아자시티딘을 사용하여 밝혀졌다 [DeSimone, Proc Natl Acad Sci U S A. 79(14):4428-31 (1982)]. 후속의 연구들은 β-지중해빈혈과 겸상 혈구성 질환을 갖는 환자에 있어서 HbF를 증가시키는 5-아자시티딘의 능력을 확인하였다 [Ley, et al., n. Engl. J. Medicine, 307: 1469-1475 (1982), 및 Ley, et al., Blood 62: 370-380 (1983)]. 추가의 실험들은 세포독성용량의 아라비노실시토신 (ara-C)으로 처리된 개코원숭이가 F-망상적혈구의 현저한 상승으로 응답하는 것을 증명하였으며 [Papayannopoulou et al., Science. 224(4649):617-9 (1984)], 히드록시우레아에 의한 처리는 멍키 또는 개코원숭이에 있어서 γ-글로빈의 유도로 이어졌다 [Letvin et. al., N Engl J Med. 310(14):869-73 (1984)].
HbF 재활성화 활성을 유발하는 능력이 탐구된 제2의 화합물 군은 단쇄 지방산이었다. 태아 제대혈 전구 세포에서의 초기 관찰은 γ-아미노부티르산이 태아 헤모글로빈 유도자로 작용할 수 있다는 발견으로 이어졌다 [Perrine et al., Biochem Biophys Res Commun.148(2):694-700 (1987)]. 후속의 연구들은 성체 개코원숭이에서 부티레이트가 글로빈 생산을 자극하고 [Constantoulakis et al., Blood. Dec; 72(6):1961-7 (1988)], 겸상 혈구성 빈혈을 갖는 성체 동물 또는 환자에서 적혈구 전구에서 γ-글로빈을 유도한 것을 나타내었다[Perrine et al., Blood. 74(1):454-9 (1989)]. 단쇄 지방산 예컨대 페닐부티레이트 [Dover et al., Br J Haematol. 88(3):555-61 (1994)] 및 발프로산 [Liakopoulou et al., 1: Blood. 186(8):3227-35 (1995)]의 유도체도 생체내에서 HbF를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이 패밀리의 단쇄 지방산 유사체 또는 유도체들이 다수임을 고려하면, 부티레이트보다 더 강력한 이 패밀리의 잠재적인 화합물은 다수 있다. 후속의 연구들 동안 발견된, 페닐아세트산 및 페닐알킬산은[Torkelson et al., Blood Cell Mol DiS. 22(2):150-8. (1996)], 이 화합물 패밀리에 속하므로 잠재적인 HbF 유도자로 간주되었다. 그러나, 현재, 겸상 혈구성 빈혈 및 β-지중해빈혈에서 부티레이트 또는 그 유사체의 사용은 실험에 머물러 있으며, 임상적 시도 외의 치료로서 추천될 수 없다.
겸상 혈구성 빈혈 및 β-지중해빈혈에서 태아 헤모글로빈 합성의 재활성화를 겨냥한 임상적 시도는 5-아자시티딘, 하이드록시우레아, 재조합 인간 에리트로포이에틴, 및 부티르산 유사체, 및 이들 물질의 조합과 같은 화합물의 단기 및 장기 투여를 포함하였다. 이들 연구들에 이어, 하이드록시우레아가 인간에서 HbF 의 유도에 사용되었으며 이는 혈색소병증의 치료에 대하여 미국 FDA에 의해 승인된 최초이자 유일한 약이 되었다. 그러나 원하지 않은 부작용 및 환자 반응의 변동성을 포함하는 갖가지 결함이 그러한 물질 또는 치료의 장기 사용을 금지시켰다. 예를 들면, 하이드록시우레아는 HbF 생산을 자극하고 겸상화 위기를 임상적으로 감소시키는 것으로 나타났음에 대하여, 그것은 골수독성 및 발암 위험에 의해 잠재적으로 제한된다. 잠재적인 장기 발암성도 5-아자시티딘 기반 치료에 존재할 것이다. 에리트로포이에틴 기반 치료는 여러 환자 집단 간에 일치하지 않는 것으로 입증되었다. 생체내 부티르산의 짧은 반감기는 이들 화합물을 치료적 개입에 사용하기 위해 적응시킴에 있어 잠재적인 장애인 것으로 보였다. 나아가, 매우 고용량의 부티르산이 γ-글로빈 유전자 발현의 유도에 필요하여, 이 화합물의 계속적 주입을 위해 카테터 설치가 요구된다. 나아가, 이들 고용량의 부티르산은 신경독성 및 다기관 손상과 연관될 수 있다 [Blau, et al., Blood 81: 529-537 (1993)]. 겸상 혈구성 질환에서는 HbF 수준의 최소 증가조차도 도움이 됨에 대하여, β-지중해빈혈은 현재 사용되는 물질들 중 어느 것에 의해서도 신뢰성 있게, 또는 안전하게 달성되지 않는 보다 높은 증가를 요한다 [Olivieri, Seminars in Hematology 33: 24-42 (1996)].
HbF 유도의 천연 조절자의 동정 및 생산은 상술한 화합물들의 다양한 결함을 극복하는 치료적 개입을 고안하는 수단을 제공할 수 있을 것이다. 최근의 전 게놈 연관 연구들은 다수의 복합 질환 및 형질의 유전적 기초에의 통찰을 낳았다 [McCarthy et al., Nat Rev Genet 9, 356 (2008) 및 Manolio et. al. J Clin Invest 118, 1590 (2008)]. 그러나 대부분의 예에서 유전적 연관과 기저의 병태생리학 간의 기능적 연계는 밝혀지지 않은 채로 남아 있다. 태아 헤모글로빈 (HbF) 수준은 정량적 형질로서 유전되며, 주요 β-혈색소병증인, 겸상 혈구성 질환 및 β-지중해빈혈의 중증도를 개선함에 있어서의 그것의 상술한 그리고 잘 규명된 역할을 고려하면, 임상적으로 중요하다 [Nathan et. al., Nathan and Oski's hematology of infancy and childhood ed. 6th, pp. 2 v. (xiv, 1864, xli p.) 2003)]. 2건의 전 게놈 연관 연구들은 HbF 수준의 변이의 ~20%의 주원인인 5개의 흔한 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)으로 된 1 세트를 함유하는 3개의 주요 좌를 동정했다 [Lettre et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2008); Uda et al., Proc Natl Acad Sci U S A 105, 1620 (2008); Menzel et al., Nat Genet 39, 1197 (2007)]. 게다가, 이들 변이형의 몇몇은 겸상 혈구성 질환의 임상적 중증도를 예측하는 것으로 보이며 [Lettre et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2008)] 이들 SNP 중의 적어도 하나는 β-지중해빈혈의 임상적 결과에도 영향을 미칠 수 있다[Uda et al., Proc Natl Acad Sci U S A 105, 1620 (2008)]. HbF의 변이의 10% 이상을 설명하는, 가장 큰 효과 크기를 갖는 SNP는, 염색체 2, BCL11A의 유전자의 제2 인트론에 위치한다. C2H2-형 징크 핑거 전사 인자인 BCL11A가 림프구 발생에 있어서의 그것의 역할에 대해 탐구되었지만 [Liu et al., Nat Immunol 4, 525 (2003) 및 Liu et al., Mol Cancer 5, 18 (2006)], 그것의 적혈구 생산 또는 글로빈 유전자 조절에서의 역할은 이전에 평가되지 않았다.
재조합 DNA 시대의 시초에, 글로빈 유전자 구조의 연구들은 태아 글로빈 스위치에 대한 정보를 얻는 강력한 분자적 토대를 제공하였다. 상당한 노력이 β-유사 글로빈 클러스터 내의 유전자의 적합한 조절에 필요한 β-글로빈 좌 내의 시스(cis)-요소들을 기술하는데 집중되어 왔다. 이들 연구들은 성체에서 HbF 수준에 극적으로 영향을 미치는 천연 발생의 돌연변이 및 결실에 의존하였으며, 상기 클러스터의 부분을 갖는(harboring) 트랜스제닉 마우스의 생성에 의해 보완되었다 [Nathan et. al., Nathan and Oski's hematology of infancy and childhood ed. 6th, pp. 2 v. (xiv, 1864, xli p.) 2003) 및 G. Stamatoyannopoulos, Exp Hematol 33, 259 (2005)]. 글로빈 스위칭에 요구되는 정확한 시스-요소들은 잘 정의되지 않은 채로 남아있지만, 트랜스제닉 마우스에서의 발견은 γ-글로빈 유전자가 성체기에 자체적으로 침묵한다는 것을 강하게 시사하였으며, 태아기 특이적 활성제의 부재 또는 기(stage)-특이적 억제자의 존재와 가장 양립 가능한 발견이다. 최근의 유전자 연관 연구들은 γ-글로빈 유전자, 예컨대 BCL11A의 조절에 있어서 그들의 개입에 대한 정보를 얻기 위한 후보 유전자들을 제공한다.
조혈 전구 세포
일 실시형태에서, 조혈 전구 세포는 생체외 또는 시험관내에서 접촉된다. 특정 실시형태에서, 상기 접촉되는 세포는 적혈구 계통의 세포이다. 일 실시형태에서, 상기 세포 조성물은 감소된 BCL11A 발현을 갖는 세포를 포함한다.
여기서 사용되는 용어 "조혈 전구 세포(Hematopoietic progenitor cell)"는 골수 (단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포), 및 림프구 계통 (T-세포, B-세포, NK-세포)을 포함하는 모든 혈세포 유형을 낳는 줄기 세포계통의 세포를 말한다. "적혈구 계통의 세포(cell of the erythroid lineage)"는 접촉되는 세포가, 최종 분화시에 적혈구(erythrocyte) 또는 적혈구 (RBC)를 형성하도록 적혈구생성을 겪는 세포임을 가리킨다. 그러한 세포는 골수 조혈 전구 세포로부터 기원하는, 세 계통, 적혈구, 림프구, 및 골수 중 하나에 속한다. 특이적 성장 인자 및 조혈 마이크로환경의 다른 성분에 노출시, 조혈 전구 세포는 일련의 중간 분화 세포 유형, 적혈구 계통의 모든 중간체를 통해, RBC로 성숙할 수 있다. 따라서, 여기서 사용되는 용어 "적혈구 계통(erythroid lineage)"의 세포는 조혈 전구 세포, 전적아구(rubriblast), 염기호성적아구(prorubricyte), 적혈구모세포, 후적혈구, 망상적혈구, 및 적혈구를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 조혈 전구 세포는 조혈 전구 세포에 특징적인 세포 표면 마커 CD34+, CD59+, Thy1/CD90+,CD38lo/-, 및 C-kit/CD117+를 적어도 하나 갖는다. 바람직하게는, 상기 조혈 전구 세포는 이들 마커를 수 개 갖는다.
일부 실시형태에서, 상기 적혈구 계통의 조혈 전구 세포는 적혈구 계통에 특징적인 세포 표면 마커를 갖는다: CD71 및 Ter119
줄기 세포, 예컨대 조혈 전구 세포는, 증식하여, 결과적으로 분화된 또는 분화 가능한 딸세포를 발생시킬 다수의 모세포를 생성하는 능력을 갖는 더 많은 전구 세포를 발생시킬 수 있다. 상기 딸세포 자신은 부모의 발생 잠재력을 갖는 하나 이상의 세포를 유지하면서, 증식하여 하나 이상의 성숙한 세포 유형들로 이후에 분화할 자손을 생산하도록 유도될 수 있다. 용어 "줄기 세포(stem cell)"는, 이때, 특별한 환경 하에서, 더 특이적인 또는 분화된 형질로 분화하고, 어떤 환경 하에서, 실질적으로 분화함 없이 증식하는 능력을 유지하는 능력 또는 잠재력을 갖는 세포를 가리킨다. 일 실시형태에서, 용어 전구 또는 줄기 세포는, 그 자손이, 분화에 의해, 예를 들면, 배아 세포 및 조직의 점진적 다양화에서 일어나는 바와 같이, 완전히 개별적인 특징을 획득함에 의해, 종종 다른 방향으로, 특이화하는, 범용의 모세포를 가리킨다. 세포의 분화는 많은 세포 분열을 통해 전형적으로 발생하는 복잡한 과정이다. 분화된 세포는 그 자신이 다능(multipotent) 세포로부터 유래한 다능 세포 등으로부터 유래할 수 있다. 이들 다능 세포의 각각이 줄기 세포로 간주될 수 있음에 대하여, 그들 각각이 낳을 수 있는 세포 유형들의 범위는 상당히 변할 수 있다. 어떤 분화된 세포는 또한 더 큰 발생 잠재력의 세포를 생기게 하는 능력을 갖는다. 그러한 능력은 천연적이거나 또는 다양한 인자들에 의한 처리로 인공적으로 유도될 수도 있다. 많은 생물적 예에서, 줄기 세포는 또한 하나 이상의 뚜렷한 세포 유형의 자손을 생산할 수 있기 때문에 "다능(multipotent)이지만 이것이 "줄기성(stem-ness)"에 요구되는 것은 아니다. 자기 갱신은 줄기 세포 정의의 다른 고전적인 부분이며, 이 문헌에서 사용될 때 그것은 필수적이다. 학설상, 자기-갱신(self-renewal )은 2개의 주요 메커니즘 중의 어느 하나에 의해 일어날 수 있다. 줄기 세포는, 하나의 딸은 줄기 상태를 유지하고 다른 하나의 딸은 일부 뚜렷한 다른 특이적 기능과 형질을 발현하도록 비대칭적으로 분열할 수 있다. 대안으로, 하나의 집단에서 줄기 세포의 일부는 2개의 줄기로 대칭적으로 분열하여, 전체로서 그 집단 내에 일부 줄기 세포를 유지하면서, 그 집단의 다른 세포는 분화된 자손만 낳을 수 있다. 일반적으로, "전구 세포(progenitor cell)"는 보다 원시적인 세포의 형질을 갖는다(즉, 완전 분화 세포보다 발생 경로 또는 진행을 따른 초기 단계에 있다). 종종, 전구 세포는 또한 유의한 또는 매우 고 증식적인 잠재력을 갖는다. 전구 세포는 발생 경로에 따라 그리고 세포가 발생 및 분화하는 환경에 따라, 다수의 뚜렷한 분화된 세포 유형들 또는 단일의 분화된 세포 유형을 낳을 수 있다.
세포 개체 발생의 맥락에서, 형용사 "분화된(defferentiated)", 또는 "분화함(differentiating)"은, 상대적인 용어이다. "분화된 세포"는 그것이 비교되는 세포보다 발생 경로의 더 아래로 진행한 세포이다. 따라서, 줄기 세포는, 계통-제한된 전구체 세포(예컨대 조혈 전구 세포)로 분화할 수 있으며, 이는 차례로 상기 경로의 더 아래의 전구체 세포의 다른 유형들(예컨대 적혈구 전구체)로, 그리고 나서 어떤 조직 유형에서 특징적 역할을 하며, 더 증식하는 능력을 유지하거나 유지하지 않는, 말기 분화 세포, 예컨대 적혈구로 분화할 수 있다.
유도 만능 줄기 세포
일부 실시형태에서 여기에 기재된 유전자 조작 인간 세포는 단리된 만능 줄기 세포에 유래한다. iPSC를 사용하는 이점은 상기 세포가 그 전구 세포가 투여될 대상체와 동일한 대상체로부터 유래할 수 있다는 것이다. 즉, 대상체로부터 체세포를 얻고, 유도 만능 줄기 세포로 리프로그래밍하고, 그리고나서 대상체에게 투여될 조혈 전구 세포로 재분화될 수 있다(예를 들면, 자가 세포). 상기 전구는 자가 공급원으로부터 본질적으로 유래하기 때문에, 생착 거부 또는 알러지 반응의 위험이 다른 대상체 또는 대상체군으로부터의 세포의 사용에 비해 감소된다. 일부 실시형태에서, 상기 조혈 전구는 비-자가 공급원으로부터 유래한다. 이에 더하여, iPSC의 사용은 배아 공급원으로부터 얻어진 세포에 대한 필요성을 없앤다. 따라서, 일 실시형태에서, 개시된 방법에 사용되는 줄기 세포는 배아 줄기 세포가 아니다.
분화는 생리학적 맥락 하에서 일반적으로 비가역적이지만, 최근 몇몇의 방법들이 체세포를 유도 만능 줄기 세포로 리프로그래밍하기 위해 개발되었다. 예시적 방법들은 당 기술분야의 숙련자에게 알려져 있으며 이하에 간략히 기술한다.
여기에 사용된 용어 "리프로그래밍(reprogramming)"은 분화된 세포(예를 들면 체세포)의 분화 상태를 변경하거나 거스르는 과정을 가리킨다. 다른 식으로 말하면, 리프로그래밍이란, 세포를, 덜 분화된 또는 더 원시적인 세포 유형으로, 뒤쪽으로 분화를 몰아가는 과정이다. 많은 일차 세포를 배양에 두면 완전히 분화된 특징의 일부 상실로 이어질 수 있음이 주목되어야 한다. 따라서, 용어 분화된 세포에 포함되는 그러한 세포를 단순히 배양하는 것은 이들 세포를 비-분화된 세포 (예를 들면, 미분화 세포) 또는 만능 세포로 만들지 않는다. 분화된 세포의 만능성으로의 이행은 배양에서의 분화된 특징의 부분적 상실로 이어지는 자극을 뛰어넘는 리프로그래밍 자극을 요한다. 리프로그래밍된 세포는 또한 일반적으로 배양에서 단지 제한된 횟수의 분열 능력만 갖는 일차 세포 부모에 비해, 성장 잠재력의 상실 없이 연장된 계대 능력의 특징을 갖는다.
리프로그래밍될 세포는 리프로그래밍 전에 부분적으로 또는 영구적으로 분화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 리프로그래밍은 분화된 세포(예를 들면, 체세포)의 분화 상태로부터 만능 상태 또는 다능 상태로의 완전한 회귀를 포함한다. 일부 실시형태에서, 리프로그래밍은 분화된 세포(예를 들면, 체세포)의 분화 상태로부터 미분화 세포 (예를 들면, 배아-유사 세포)로의 완전한 또는 부분적인 회귀를 포함한다. 리프로그래밍은 세포에 의한 특정 유전자의 발현으로 귀결될 수 있으며, 상기 발현은 리프로그래밍에 더욱 기여한다. 여기에 기재된 어떤 실시형태에서, 분화된 세포(예를 들면, 체세포)의 리프로그래밍은, 그 분화된 세포가 미분화 상태를 나타내도록(예를 들면, 미분화 세포이다) 유발한다. 그로부터 귀결하는 세포는 "리프로그래밍된 세포(reprogrammed cell)" 또는 "유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell)(iPSC 또는 iPS 세포)"라고 불리운다.
리프로그래밍은 세포의 분화 동안 발생하는, 핵산 변형 (예를 들면, 메틸화), 염색질 응축, 후성적 변화, 유전체 각인, 등의 유전 가능한 패턴의 적어도 일부의, 변경, 예를 들면, 역행을 포함할 수 있다. 리프로그래밍은 단순히 이미 만능인 세포의 기존 미분화 상태를 유지하거나 또는 이미 다능인 세포(예를 들면, 조혈 줄기 세포)의 완전보다는 덜 분화된 상태를 유지하는 것과는 구별된다. 일부 실시형태에서는 여기에 기재된 조성물 및 방법도 그러한 목적을 위해 사용될 수 있기는 하지만, 리프로그래밍은 또한 이미 만능 또는 다능인 세포가 자기-갱신 또는 증식을 촉진하는 것과는 구별된다.
체세포로부터 만능 줄기 세포를 생성하는데 사용되는 특정의 접근방법 또는 방법(광의로 "리프로그래밍"이라 함)은 청구된 발명에 임계적이지 않다. 따라서 체세포를 만능 형질로 리프로그래밍하는 임의의 방법은 여기에 기재된 방법에 사용하기에 적합할 것이다.
전사 인자의 정의된 조합을 사용하여 만능 세포를 생성하는 리프로그래밍 방법론은 유도 만능 줄기 세포로 기술되어 있다. 야마나카(Yamanaka)와 다카하시(Takahashi)는 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc의 직접적 트랜스덕션에 의해 마우스 체세포를 확장된 발생 잠재력을 갖는 ES 세포-유사 세포로 변환시켰다 [Takahashi and Yamanaka, 2006]. iPSC는 그들이 만능성 연관 전사 회로와 후성적 전망의 muc를 복원하기 때문에 ES 세포를 닮아있다. 이에 더하여, 마우스 iPSC는 만능성을 위한 모든 표준적 분석법을 만족한다: 특히, 3배엽층의 세포 유형들로의 시험관내 분화, 기형종(teratoma) 형성, 키메라에의 기여, 생식세포계 전달(germline transmission) [Maherali and Hochedlinger, 2008], 및 4배체 상보성 [Woltjen et al., 2009].
후속의 연구들은 인간 iPS 세포가 유사한 트랜스덕션 방법을 사용하여 얻어질 수 있음을 보여주었으며 [Lowry et al., 2008; Park et al., 2008; Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007b], 전사 인자 트리오, OCT4, SOX2, 및 NANOG는 만능성을 지배하는 전사 인자들의 핵심 세트(core set)로서 확립되었다 [Jaenisch and Young, 2008]. iPS 세포의 생산은 줄기 세포-연관 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 성체, 체세포에, 역사적으로 바이러스 벡터를 사용하여, 도입함으로써 달성될 수 있다.
iPS 세포는 성체 줄기 세포, 또는 체 줄기 세포로부터만 아니라, 영구 분화된 체세포로부터도 생성 또는 유래할 수 있다. 즉, 비-만능 전구 세포는, 리프로그래밍에 의해 만능 또는 다능으로 될 수 있다. 그러한 예들에서는, 영구 분화된 세포를 리프로그래밍하는데 요구되는 것만큼 많은 리프로그래밍 인자를 포함하는 것이 필요하지 않을 수 있다. 나아가, 리프로그래밍은 리프로그래밍 인자의 비-바이러스성 도입에 의해, 예를 들면, 단백질 그 자체를 도입함으로써, 또는 그 리프로그래밍 인자를 코딩하는 핵산을 도입함으로써, 또는 번역 시에 그 리프로그래밍 인자를 생산하는 메신저 RNA를 도입함으로써, 유도될 수 있다 [참조: 예를 들면, Warren et al., Cell Stem Cell , 2010 Nov 5;7(5):618-30)]. 리프로그래밍은 예를 들어 Oct-4 (Oct-3/4 또는 Pouf51로도 알려져 있음), Sox1, Sox2, Sox3, Sox 15, Sox 18, NANOG, Klf1, Klf2, Klf4, Klf5, NR5A2, c-Myc, l-Myc, n-Myc, Rem2, Tert, 및 LIN28를 포함하는 줄기 세포-연관 유전자를 코딩하는 핵산들의 조합을 도입함으로써 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 여기에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 리프로그래밍은 Oct-3/4, Sox 패밀리의 구성원, Klf 패밀리의 구성원, 및 Myc 패밀리의 구성원의 하나 이상을 체세포에 도입하는 것을 더 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 여기에 기재된 방법 및 조성물은 Oct 4, Sox2, Nanog, c-MYC 및 Klf4의 각각의 하나 이상을 리프로그래밍을 위해 도입하는 것을 더 포함할 수 있다. 상술한 바와 같이, 리프로그래밍에 사용되는 정확한 방법은 여기에 기재된 방법 및 조성물에 반드시 임계적인 것은 아니다. 그러나, 리프로그래밍된 세포로부터 분화된 세포가 예를 들어 인간 치료에 사용되는 경우, 일 실시형태에서 리프로그래밍은 게놈을 변경하는 방법에 의해 달성되지 않는다. 따라서, 그러한 실시형태에서, 리프로그래밍은, 예를 들면 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터의 사용 없이 달성된다.
출발 세포의 집단에 유래한 리프로그래밍의 효율(즉, 리프로그래밍된 세포의 수)는 [Shi, Y., et al (2008) Cell - Stem Cell 2:525-528, Huangfu, D., et al (2008) Nature Biotechnology 26(7):795-797, 및 Marson, A., et al (2008) Cell - Stem Cell 3:132-135]에 알려진 바와 같은 다양한 소분자의 첨가에 의해 증진될 수 있다. 따라서, 유도 만능 줄기 세포 생산의 효율 또는 속도를 증진시키는 물질 또는 물질의 조합이 환자-특이적 또는 질환-특이적 iPSC의 생산에 사용될 수 있다. 리프로그래밍 효율을 증진시키는 물질의 일부 비 제한적인 예는 특히 가용성 Wnt, Wnt 순화 배지, BIX-01294 (G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라아제), PD0325901 (MEK 저해제), DNA 메틸트랜스퍼라아제 저해제, 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC) 저해제, 발프로산, 5'-아자시티딘, 덱사메타존, 수베로일아닐리드, 히드록삼산 (SAHA), 비타민 C, 및 트리코스타틴(TSA)을 포함한다.
리프로그래밍 증강제의 다른 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA (예를 들면, MK0683, 보리노스타트(vorinostat)) 및 다른 히드록삼산), BML-210, 데퓨데신 (예를 들면, (-)-데퓨데신), HC 독소, 널스크립트(Nullscript) (4-(1,3-디옥소-1H,3H-벤조[de]이소퀴놀린-2-일)-N-히드록시부탄아미드), 페닐부티레이트 (예를 들면, 소듐 페닐부티레이트) 및 발프로산 ((VPA) 및 다른 단쇄 지방산), 스크립타이드, 수라민 소듐, 트리코스타틴 A (TSA), APHA 화합물 8, 아피시딘, 소듐 뷰티레이트, 피발로일옥시메틸 뷰티레이트 (Pivanex, AN-9), 트라폭신 B, 클라마이도신, 뎁시펩티드 (FR901228 또는 FK228로도 알려져 있음), 벤즈아미드 (예를 들면, CI-994 (예를 들면, N-아세틸 디날린) 및 MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ-824, CBHA (m-카복시시나민산 비스히드록삼산), JNJ16241199, 튜바신, A-161906, 프록사미드, 옥삼플라틴, 3-Cl-UCHA (예를 들면, 6-(3-클로로페닐우레이도)카프로익 히드록삼산), AOE (2-아미노-8-옥소-9,10-에폭시데칸산), CHAP31 및 CHAP 50. 다른 리프로그래밍 증강제는, 예를 들면, HDAC의 우성 네가티브형 (예를 들면, 촉매적으로 불활성인 형태), HDAC의 siRNA 저해제, 및 HDAC에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 그러한 저해제는, 예를 들면, [BIOMOL International, Fukasawa, Merck Biosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Aton Pharma, Titan Pharmaceuticals, Schering AG, Pharmion, MethylGene, 및 Sigma Aldrich] 사로부터 입수 가능하다.
여기에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 만능 줄기 세포의 유도를 확인하기 위해, 단리된 클론은 줄기 세포 마커의 발현에 대해 테스트될 수 있다. 체세포에 유래하는 세포에서의 그러한 발현은 상기 세포를 유도 만능 줄기 세포로서 동정한다. 줄기 세포 마커는 SSEA3, SSEA4, CD9, Nanog, Fbx15, Ecat1, Esg1, Eras, Gdf3, Fgf4, Cripto, Dax1, Zpf296, Slc2a3, Rex1, Utf1, 및 Nat1을 포함하는 비제한적인 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, Oct4 또는 Nanog를 발현하는 세포는 만능성으로 동정된다. 그러한 마커의 발현을 검출하는 방법으로는, 예를 들면, RT-PCR 및 코딩된 폴리펩티드의 존재를 검출하는 면역학적 방법, 예컨대 웨스턴 블랏 또는 유세포분석을 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출은 RT-PCR만 포함하는 것이 아니라, 단백질 마커의 검출도 포함한다. 세포 표면 마커는 예를 들면 면역세포화학에 의해 용이하게 동정됨에 대하여, 세포내 마커는 RT-PCR을 통해 가장 잘 동정될 수 있다.
단리된 세포의 만능 줄기 세포 특징은 iPSC가 3배엽층의 각각의 세포로 분화하는 능력을 평가하는 테스트에 의해 확인될 수 있다. 일례로서, 누드 마우스에서 기형종 형성은 그 단리된 클론의 만능 특징을 평가하는데 사용될 수 있다. 상기 세포는 누드 마우스에 도입되며 상기 세포로부터 발생하는 종양에 대하여 조직학 및/또는 면역조직화학이 행하여진다. 3배엽층 모두로부터의 세포를 포함하는 종양의 성장은, 예를 들면, 상기 세포가 만능 줄기 세포임을 더 가리킨다.
리프로그래밍을 위한 체세포
그 용어가 여기에서 사용될 때, 체세포는, 생물체의 신체를 형성하며 생식 계열 세포를 제외하는 임의의 세포를 가리킨다. 포유동물 신체 내의 모든 세포 유형 -정자와 난자, 그들이 유래한 세포(생식모세포) 및 미분화 줄기 세포가 아닌- 은 분화된 체세포이다. 예를 들면, 내부 기관, 피부, 뼈, 혈액 및 연결 조직은 모두 분화된 체세포로 이루어져 있다.
여기에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 추가의 체세포 유형들은 다음을 포함한다: 섬유모세포 (예를 들면, 일차 섬유모세포), 근육 세포 (예를 들면, 근육세포(myocyte)), 작은 더미(cumulus) 세포, 신경 세포, 유(mammary)세포, 간세포 및 췌장 소도 세포. 일부 실시형태에서, 상기 체세포는 일차 세포주이거나 또는 일차 또는 이차 세포주의 자손이다. 일부 실시형태에서, 상기 체세포는 인간 시료, 예를 들면, 모발 소포, 혈액 시료, 생검 (예를 들면, 피부 생검 또는 지방 생검), 스왑 시료 (예를 들면, 구강 스왑 시료)로부터 얻어지며, 따라서 인간 체세포이다.
분화된 체세포의 일부 비제한적인 예는 상피, 내피, 뉴우런, 지방, 심장, 골격 근육, 면역 세포, 간, 비장, 폐, 순환 혈액 세포, 위창자, 신장, 골수, 및 췌장 세포를 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 체세포는 뇌, 간, 창자 (gut), 위, 장 (intestine), 지방, 근육, 자궁, 피부, 비장, 내분비 기관, 뼈, 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 임의의 신체 조직으로부터 단리된 일차 세포일 수 있다. 나아가, 상기 체세포는 뮤린, 소, 원숭이, 돼지, 말, 양, 또는 인간 세포를 포함하는 비제한적인 예와 함께, 임의의 포유동물 종으로부터의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 체세포는 인간 체세포이다.
질환의 치료에 사용될 조혈 전구 세포의 생성을 위해 리프로그래밍된 세포가 사용될 때, 치료될 환자로부터 단리된 체세포를 사용하는 것이 필수적인 것은 아니지만 바람직하다. 예를 들면, 질환에 연관된 체세포, 질환의 치료에 참여하는 체세포 등이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 리프로그래밍된 세포 및 그 리프로그래밍된 세포가 그로부터 유래하거나 생성된 체세포를 포함하는 이질 집단으로부터, 리프로그래밍된 세포를 선택하는 방법은 임의의 알려진 수단에 의해 행하여질 수 있다. 예를 들면, 약 내성 유전자 등, 예컨대 선택가능한 마커 유전자는 그 선택가능한 마커를 지표로서 사용하여 리프로그래밍된 세포를 단리하는데 사용될 수 있다.
여기에 개시된 리프로그래밍된 체세포는 하기를 포함하는 만능 세포 마커들의 임의의 개수를 발현할 수 있다: 알칼린 포스파타아제 (AP); ABCG2; 기(stage)-특이적 배아 항원-1 (SSEA-1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49/6E; ERas/ECAT5, E-카드헤린; β-III-튜뷸린; α-평활근 액틴 (α-SMA); 섬유모세포 성장 인자 4 (Fgf4), Cripto, Dax1; 징크 핑거 단백질 296 (Zfp296); N-아세틸트랜스퍼라아제-1 (Nat1); (ES 세포 연관 전사물 1 (ECAT1); ESG1/DPPA5/ECAT2; ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; ECAT15-1; ECAT15-2; Fthl17; Sal14; 미분화 배아 세포 전사 인자 (Utf1); Rex1; p53; G3PDH; TERT 를 포함하는 텔로머라아제; 침묵 X 염색체 유전자; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; 단백질 15 함유 F-박스 (Fbx15); Nanog/ECAT4; Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, FoxD3; GDF3; CYP25A1; 발생 만능성-연관 2 (DPPA2); T-세포 림프종 절단점(breakpoint) 1 (Tcl1); DPPA3/Stella; DPPA4; 만능성에 대한 다른 일반 마커, 등. 다른 마커는 Dnmt3L; Sox15; Stat3; Grb2; b-카테닌, 및 Bmi1를 포함할 수 있다. 그러한 세포는 또한 그 유도 만능 줄기 세포가 유래한 체세포의 특징인 마커의 하향 조절을 특징으로 한다.
게놈 에디팅과 DNA -타겟팅 엔도 뉴클레아제
여기에 사용된 용어 "게놈 에디팅(genome editing)"은 인공적으로 조작된 뉴클레아제를 사용하여 게놈 내에 원하는 위치(들)에 절단 및 특이적 이중가닥절단을 생성하는 역유전학적 방법을 가리키며, 그리고나서 상기 특이적 이중가닥절단은 세포의 내인 과정 예컨대 상동재조합(homologous recombination (HR)), 상동성 지향 복구 (homology directed repair (HDR)) 및 비-상동성 말단 접합(non-homologous end-joining (NHEJ))에 의해 복구된다. NHEJ는 이중가닥절단에서 DNA 말단을 직접 접합하며, 한편 HDR은 절단점에서 없어진 DNA 서열을 재생하기 위한 템플릿으로서 상동 서열을 이용한다.
게놈 에디팅은 전통적 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 행하여질 수 없는데, 왜냐하면 대부분의 제한 효소는 그들의 타겟으로서 DNA의 소수의 염기쌍을 인식하며 인식되는 염기쌍 조합이 게놈에 걸쳐 많은 위치에서 발견됨으로써 다수의(즉, 원하는 위치에 한정되지 않는) 절단이 일어날 확률이 매우 높기 때문이다. 이 도전을 극복하고 부위-특이적 이중가닥절단을 생성하기 위해, 현재까지 몇몇 특징적인 클래스의 뉴클레아제가 발견되고 바이오 조작되었다. 이들은 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 (Zinc finger nuclease (ZFN)), Cas9/CRISPR 시스템, 및 전사-활성제 유사 이펙터 뉴클레아제 (transcription-activator like effector nuclease (TALEN))이다.
메가뉴클레아제는 통상 4개의 패밀리로 그룹지어진다: LAGLIDADG 패밀리, GIY-YIG 패밀리, His-Cys 박스 패밀리 및 HNH 패밀리. 이들 패밀리는 촉매 활성 및 인식 서열에 영향을 미치는 구조적 모티프를 특징으로 한다. 예를 들면, LAGLIDADG 패밀리의 구성원은 보존 LAGLIDADG 모티프의 1개 또는 2개의 복제본을 갖는 것을 특징으로 한다 [참조: Chevalier et al. (2001), Nucleic Acids ReS. 29(18): 3757-3774]. LAGLIDADG 모티프의 복제본을 1개 갖는 LAGLIDADG 메가뉴클레아제는 호모 다이머를 형성하는 한편, LAGLIDADG의 복제본을 2개 갖는 구성원은 모노머로서 발견된다. 유사하게, GIY-YIG 패밀리 구성원은 GIY-YIG 모듈을 가지며, 그것은 길이가 70-100 잔기이고 4개의 불변 잔기를 갖는 보존 서열 모티프를 4개 또는 5개 포함하며, 4개의 불변 잔기 중 2개는 활성에 필요하다(참조: Van Roey et al. (2002), Nature Struct. Biol. 9: 806-811). His-Cys 박스 메가뉴클레아제는 수백개의 아미노산 잔기를 포함하는 영역에 걸치는 히스티딘들과 시스테인들의 고보존 시리즈를 특징으로 한다 [참조: Chevalier et al. (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774]. NHN 패밀리의 경우에 있어서, 구성원들은 아스파라긴 잔기들에 의해 둘러싸인 2쌍의 보존 히스티딘들을 함유하는 모티프들에 의해 정의된다[참조: Chevalier et al. (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774]. 메가뉴클레아제의 4개의 패밀리는, 보존 구조적 요소, 및 그 결과 DNA 인식 서열 특이성 및 촉매 활성에 대하여, 다른 것들과 상당히 떨어져 있다.
메가뉴클레아제는 미생물종에서 흔히 발견되며 매우 긴 인식 서열(>14bp)을 가져서 그들을 원하는 위치에서의 절단에 대하여 천연적으로 매우 특이적으로 만드는 특유의 특성을 갖는다. 이것은 게놈 에디팅에서 부위-특이적 이중가닥절단을 만드는데 이용될 수 있다. 당 기술분야의 숙련자는 이들 천연 발생 메가뉴클레아제를 사용할 수 있지만, 그러나 그러한 천연 발생 메가뉴클레아제의 수는 제한된다. 이 도전을 극복하기 위해, 특유의 서열을 인식하는 메가뉴클레아제 변이형을 생성하기 위해 돌연변이유발 및 고출력스크리닝 방법이 사용되어 왔다. 예를 들면, 다양한 메가뉴클레아제가 새로운 서열을 인식하는 하이브리드 효소를 생성하기 위해 융합되었다. 대안으로, 메가뉴클레아제의 아미노산들과 상호작용하는 DNA는 서열 특이적 메가뉴클레아제를 설계하기 위해 변경될 수 있다 [참조: 예를 들면, 미국 특허 8,021,867]. 메가뉴클레아제는 예를 들면 [Certo, MT et al. Nature Methods (2012) 9:073-975; 미국 특허 8,304,222; 8,021,867; 8,119,381; 8,124,369; 8,129,134; 8,133,697; 8,143,015; 8,143,016; 8,148,098; 또는 8,163,514] (이들 참조문헌의 내용은 이로써 그들 전체로 참조에 의해 도입됨)에 기재된 방법을 사용하여 설계될 수 있다. 대안으로, 부위 특이적 절단 특징을 갖는 메가뉴클레아제는 상업적으로 이용가능한 기술들 예를 들면, Precision BioSciences' Directed Nuclease EditorTM 게놈 에디팅 기술을 이용하여 얻어질 수 있다.
ZFN 및 TALEN 제한 엔도뉴클레아제 기술은 펩티드(들) 예컨대 징크 핑거 및 전사 활성제-유사 이펙터 (transcription activator-like effector (TALE))를 인식하는 특이적 DNA 서열에 연결된 비-특이적 DNA 절단 효소를 이용한다. 전형적으로 그것의 DNA 인식 부위와 절단 부위가 서로 분리되어 있는 엔도뉴클레아제를 선택하여 그것의 절단 부분을 분리하고 그리고나서 펩티드를 인식하는 서열에 연결하며, 그에 의해 원하는 서열에 대한 매우 높은 특이성을 갖는 엔도뉴클레아제를 산출한다. 그러한 특성들을 갖는 예시적 제한 효소는 FokI이다. 추가적으로 FokI은 뉴클레아제 활성을 갖기 위해 다이머화를 요하는 이점을 가지며, 이는, 뉴클레아제 파트너의 각각이 특유의 DNA 서열을 인식함에 따라 특이성이 극적으로 증가함을 의미한다. 이 효과를 증강하기 위해, FokI 뉴클레아제는 헤테로다이머로서만 기능하여 증가된 촉매 활성을 갖도록 조작되었다. 헤테로다이머 기능 뉴클레아제는 원하지 않은 호모 다이머 활성의 가능성을 회피하며 따라서 이중가닥절단의 특이성을 증가시킨다.
ZFN 및 TALEN 양방의 뉴클레아제 부분이 유사한 특성들을 갖지만, 이들 조작된 뉴클레아제 간의 차이점은 그들의 DNA 인식 펩티드에 있다. ZFN는 Cys2-His2 징크 핑거에 의존하고 TALEN은 TALE에 의존한다. 이들 DNA 인식 펩티드 도메인은 둘다 이들의 단백질에 있어서 조합으로 천연적으로 발견된다는 특징을 갖는다. Cys2-His2 징크 핑거는 전형적으로 3 bp 떨어져 반복하여 일어나며 단백질 예컨대 전사 인자와 상호 작용하는 각종 핵산에서 다양한 조합으로 발견된다. 한편 TALE는 아미노산과 인식된 뉴클레오티드 쌍 간에서 일대일 인식 비율로 반복하여 발견된다. 징크 핑거와 TALE은 둘다 반복된 패턴으로 일어나므로, 광범위한 서열 특이성을 생성하기 위해 상이한 조합들이 시도될 수 있다. 부위-특이적 징크 핑거 엔도뉴클레아제를 만드는 접근방식은 특히 예를 들면, 모듈 조립 (여기서 트리플렛 서열과 상관되는 징크 핑거들은 요구되는 서열을 커버하기 위해 일렬로 부착됨(Zinc fingers correlated with a triplet sequence are attached in a row to cover the required sequence)), OPEN (펩티드 도메인의 저-엄격성 선택 vs. 펩티드 조합의 고-엄격성 선택이 뒤따르는 트리플렛 뉴클레오티드 vs. 박테리아 시스템 내의 최종 타겟), 및 징크 핑거 라이브러리의 박테리아 일잡종 스크리닝을 포함한다. 여기에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 ZFN는 예를 들면, Sangamo BiosciencesTM(Richmond, CA)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
여기서는 게놈 에디팅의 Cas9/CRISPR 시스템이 여기에 기재된 방법 및 조성물에 채용되는 것으로 고려된다. 클러스터링된 일정한 간격으로 떨어진 짧은 팔린드로믹 반복 (CRISPR)/CRISPR-연관 (Cas) 시스템이 RNA-프로그래밍 가능 게놈 에디팅에 유용하다 [참조: 예를 들면, Jinek, M. et al. Science (2012) 337(6096):816-821].
대안으로, 게놈 에디팅은 게놈 조작에 기초한 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 사용하여 행하여질 수 있으며, 이는 살아있는 포유동물 세포의 게놈에의 DNA 서열의 삽입, 결실 또는 치환을 가능하게 하는 rAAV 벡터의 사용을 중심으로 하는 게놈-에디팅 플랫폼이다. rAAV 게놈은 포지티브- 또는 네가티브-센스의 단일 가닥 데옥시리보핵산 (ssDNA) 분자이며 길이 약 4.7 kb이다. 이들 단일 가닥 DNA 바이러스 벡터는 높은 트랜스덕션율을 갖고 게놈에서 이중 가닥 DNA 절단의 유발의 부재 하에 내인 상동재조합을 자극하는 특유의 특성을 갖는다. 당 기술분야의 숙련자는 원하는 유전자 좌를 타겟으로 하는 rAAV 벡터를 설계하여 세포에서 중대한(gross) 및/또는 감지하기 힘든(subtle) 내인 유전자 변경, 예컨대 결실, 을 행할 수 있다. rAAV 게놈 에디팅은 단일의 대립유전자를 타겟으로 하며 타겟을 벗어난 게놈 변경으로 귀결되지 않는다는 점에서 이점을 갖는다. rAAV 게놈 에디팅 기술은 상업적으로 이용 가능하며, 예를 들면, HorizonTM(Cambridge, UK)로부터의 rAAV GENESISTM 시스템이 있다.
약학적으로 허용가능한 담체
여기에 기재된 대상체에 인간 조혈 전구를 투여하는 방법은 조혈 전구 세포를 포함하는 치료 조성물의 용도를 포함한다. 치료 조성물은 세포 조성물과 함께 생리적으로 견딜 수 있는 담체를 함유하며 임의로 활성 성분으로서 그 안에 용해되거나 분산된, 여기에 기재된 적어도 하나의 추가 생활성 물질을 함유한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 치료 조성물은 그것을 원하지 않는 한 치료적 목적을 위해 포유동물 또는 인간 환자에게 투여될 때 실질적으로 면역원성이 아니다.
일반적으로, 여기에 기재된 조혈 전구 세포는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 현탁액으로서 투여된다. 당 기술분야의 숙련자는 세포 조성물에 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체가 그 대상체에게 전달되는 세포의 생존력에 실질적으로 간섭하는 양으로 완충액, 화합물, 냉동보존 물질, 보존제, 또는 다른 물질을 포함하지 않을 것을 인식할 것이다. 세포를 포함하는 제제는 예를 들면 세포막의 온전함(integrity)이 유지되도록 하는 삼투 완충액, 및 임의로, 세포 생존력을 유지하거나 투여시 생착을 증강시키기 위한 영양분을 포함할 수 있다. 그러한 제제와 현탁액은 당 기술분야의 숙련자에게 공지이며 및/또는 일상적인 실험을 사용하여 여기에 기재된 조혈 전구 세포와 함께 사용하도록 적응될 수 있다.
에멀젼화 과정이 세포 생존력에 역효과를 미치지 않는다는 전제하에 세포 조성물은 에멀젼화되거나 또는 리포좀 조성물로서 제시될 수 있다. 세포 및 임의의 다른 활성 성분은 약학적으로 허용가능하며 활성 성분과 상용 가능하며 여기에 기재된 치료 방법에 사용하기에 적절한 양인 부형제와 혼합될 수 있다.
여기에 기재된 세포 조성물에 포함되는 추가의 물질은 그 안의 성분들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은, 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 타르타르산, 만델산과 같은 유기산에 의해 형성된 산부가염(폴리펩티드의 유리 아미노기들에 의해 형성됨)을 포함한다. 유리 카복시기들에 의해 형성된 염은 예를 들면, 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘 또는 제이철의 수산화물과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래할 수 있다. 생리적으로 견딜 수 있는 담체들은 당 기술분야에 주지이다. 예시적 액체 담체는 활성 성분과 물 이외에 물질들을 함유하지 않는 멸균 수성 용액, 또는 생리적 pH값의 소듐 포스페이트와 같은 완충액, 생리식염수 또는 이들 둘다, 예컨대 포스페이트-완충 식염수이다. 나아가, 수성 담체는 완충염, 뿐만 아니라 염 예컨대 소듐 및 포타슘 클로라이드, 덱스트로즈, 폴리에틸렌글리콜 및 다른 용질을 하나 이상 함유할 수 있다. 액체 조성물은 물에 추가한 또는 물을 배제한 액상을 함유할 수도 있다. 그러한 추가의 액상의 예는 글리세린, 식물성 오일 예컨대 면실유, 및 물-오일 에멀젼이다. 특정 장애 또는 상태의 치료에 유효한 여기에 기재된 세포 조성물에 사용되는 활성 화합물의 양은 그 장애 또는 상태의 성질에 의존하며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있을 것이다.
투여 & 효능
여기에 사용된 용어 "투여함(administering)", "도입함(introducing)" 및 "이식함(transplanting)" 은, 세포, 예를 들면 여기에 기재된 조혈 전구 세포를, 대상체에게, 원하는 효과가 얻어지도록, 원하는 부위, 예컨대 손상 또는 복구 부위에서, 도입된 세포의 적어도 부분적 국소화로 귀결되는 방법 또는 경로에 의해 배치하는 맥락에서, 상호 교환적으로 사용된다. 세포, 예를 들면 조혈 전구 세포, 또는 그들의 분화된 자손은, 이식된 세포 또는 세포의 성분의 적어도 일부가 생존을 유지하는 대상체 내의 원하는 위치로의 전달로 귀결하는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상체에의 투여 후의 세포의 생존 기간은 몇 시간, 예를 들면 20 내지 4시간에서 몇일만큼 짧을 수도 있고, 몇년, 즉, 장기 생착만큼 길 수도 있다. 예를 들면, 여기에 기재된 측면의 일부 실시형태에서, 조혈 전구 세포의 유효량은 투여의 전신적 경로, 예컨대 복강내 또는 정맥내 경로를 통해 투여된다.
예방적으로 제공될 때, 여기에 기재된 조혈 전구 세포는 혈색소병증의 어떤 증상에 앞서서, 예를 들면, 태아 γ-글로빈으로부터 주로 β-글로빈으로의 스위치의 전에, 대상체에게 투여될 수 있다. 따라서, 조혈 전구 세포 집단의 예방적 투여는 여기에 개시된 바와 같이 혈색소병증을 방지하는 작용을 한다.
치료적으로 제공될 때, 조혈 전구 세포는 혈색소병증의 증상 또는 지표의 시작시에(또는 그 후에), 예를 들면, 겸상 혈구성 질환의 시작시에 제공된다.
여기에 기재된 측면의 일부 실시형태에서, 여기에 기재된 방법에 따라 투여되는 상기 조혈 전구 세포 집단은 하나 이상의 공여자로부터 얻어진 동종 이형 조혈 전구 세포를 포함한다. 여기에 사용된 "동종 이형(allogeneic)"은 동일 종의 하나 이상의 다른 공여자로부터 얻어진 조혈 전구 세포를 포함하는 조혈 전구 세포 또는 생물 시료를 가리키며, 여기서는 하나 이상의 좌에서 유전자들이 동일하지 않다. 예를 들면, 대상체에게 투여되는 조혈 전구 세포 집단은 1 이상의 비관련 공여자 대상체, 또는 1 이상의 비-동일 형제자매로부터 얻어진 제대혈로부터 유래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 동계(syngeneic) 조혈 전구 세포 집단은, 예컨대 유전적으로 동일한 동물들, 또는 동일한 쌍둥이로부터 얻어진 것이 사용될 수 있다. 이 측면의 다른 실시형태에서, 상기 조혈 전구 세포는 자가 세포이다; 즉 상기 조혈 전구 세포는 대상체로부터 얻어지거나 단리되어 동일한 대상체에게 투여된다, 즉, 공여자와 수용자가 동일하다.
여기에 기재된 다양한 측면에서의 용도를 위해, 조혈 전구 세포의 유효량은, 적어도 102 조혈 전구 세포, 적어도 5×102 조혈 전구 세포, 적어도 103 조혈 전구 세포, 적어도 5×103 조혈 전구 세포, 적어도 104 조혈 전구 세포, 적어도 5×104 조혈 전구 세포, 적어도 105 조혈 전구 세포, 적어도 2×105 조혈 전구 세포, 적어도 3×105 조혈 전구 세포, 적어도 4×105 조혈 전구 세포, 적어도 5×105 조혈 전구 세포, 적어도 6×105 조혈 전구 세포, 적어도 7×105 조혈 전구 세포, 적어도 8×105 조혈 전구 세포, 적어도 9×105 조혈 전구 세포, 적어도 1×106 조혈 전구 세포, 적어도 2×106 조혈 전구 세포, 적어도 3×106 조혈 전구 세포, 적어도 4×106 조혈 전구 세포, 적어도 5×106 조혈 전구 세포, 적어도 6×106 조혈 전구 세포, 적어도 7×106 조혈 전구 세포, 적어도 8×106 조혈 전구 세포, 적어도 9×106 조혈 전구 세포, 또는 그것의 배수를 포함한다. 조혈 전구 세포는 하나 이상의 공여자에 유래할 수 있으며, 또는 자가 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 여기에 기재된 측면의 일부 실시형태에서, 상기 조혈 전구 세포는 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여되기 전에 배양에서 확장된다(expanded).
일 실시형태에서, 용어 "유효량(effective amount)"은, 혈색소병증의 적어도 하나 이상의 증상을 경감하는데 필요한 인간 조혈 전구 세포 또는 그들의 자손의 집단의 양을 가리키며, 원하는 효과를 제공하기에, 예를 들면 혈색소병증을 가진 대상체를 치료하기에 충분한 양에 관련된다. 용어 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은, 따라서 예컨대 혈색소병증을 갖거나 위험이 있는 전형적인 대상체에게 투여될 때 특정의 효과를 촉진하기에 충분한, 조혈 전구 세포 또는 조혈 전구 세포를 포함하는 조성물의 양을 가리킨다. 여기에 사용된 유효량은 또한 질환의 증상의 발생을 방지 또는 지연하거나, 증상 질환의 경과를 변경하거나(예를 들어 질환의 증상의 진행을 늦추는 것을 들 수 있으나 이에 제한되지 않음), 또는 질환의 증상을 역전시키기에 충분한 양을 포함한다. 임의의 주어진 경우에 적합한 "유효량"은 일상적인 실험을 사용하여 당 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
여기에 사용된 "투여됨(administered)"은 원하는 부위에서의 상기 세포 조성물의 적어도 부분적 국소화로 귀결되는 방법 또는 경로에 의한, 대상체에의 여기에 기재된 조혈 줄기 세포 조성물의 전달을 가리킨다. 세포 조성물은 대상체에서 유효한 치료로 귀결되는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있으며, 즉, 일정 기간 동안 원하는 부위에 전달되는 조성물의 적어도 일부, 즉, 투여는, 적어도 1×104 세포가 전달되는, 대상체 내의 원하는 위치로의 전달로 귀결된다. 투여의 모드는 주사, 주입, 점적 주입, 또는 섭취를 포함한다. "주사(injection)"는 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 뇌실내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 기관을 통한, 피하(subcutaneous), 피하(subcuticular), 관절내, 관절내, 피막하, 거미막하, 척추관내, 뇌실 척수 내, 및 흉골내를 포함한다. 세포의 전달을 위해, 주사 또는 주입에 의한 투여가 일반적으로 선호된다.
일 실시형태에서, 여기에 기재된 세포는 전신적으로 투여된다. 여기에 사용된 구문 "전신적 투여(systemic administration)," "전식적으로 투여됨(administered systemically)", "말초 투여(peripheral administration)" 및 "말초적으로 투여됨(administered peripherally)"은, 타겟 부위, 조직, 또는 기관에 직접적으로가 아니라, 그 대신, 대상체의 순환계로 들어가서 대사 및 다른 유사한 과정이 행하여지도록 하는, 조혈 전구 세포 집단의 투여를 말한다.
혈색소병증의 치료를 위한 여기에 기재된 조성물을 포함하는 치료의 효능은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 징후 또는 증상의 어느 하나 또는 전부, 일 예를 들면, 태아 β-글로빈 수준이 유익한 방식으로 변경된다면, 예를 들면 저해제에 의한 치료 후에 질환의 다른 임상적으로 허용되는 증상이나 마커가 예를 들면 적어도 10% 개선된다면, 치료는 여기서 사용되는 용어로 "유효한 치료(effective treatment)"로 간주된다. 효능은 또한 개체가 입원 또는 의료적 개입에 대한 필요성에 의해 평가될 때 더 악화되지 않는 것(예를 들면 그 질환의 진행이 멈추거나 또는 적어도 늦추어짐)에 의해 측정될 수 있다. 이들 지표의 측정 방법은 당 기술분야의 숙련자에게 알려지고/알려지거나 여기에 기재되어 있다. 치료는 개체 또는 동물(일부 비제한적인 예는 인간, 또는 포유동물을 포함한다)에서 질환의 임의의 치료를 포함하며 다음을 포함한다: (1) 질환의 저해, 예를 들면, 패혈증의 진행의 정지, 또는 늦춤; 또는 (2) 질환을 없앰(relieving), 예를 들면 증상들의 후퇴를 유발; 및 (3) 감염 또는 패혈증의 발생 가능성을 예방 또는 경감.
본 발명에 따른 치료는 개체에서 태아 헤모글로빈의 양을 증가시킴에 의해 β-글로빈 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 개선한다. 혈색소병증과 전형적으로 연관된 증상들은, 예를 들어 다음을 포함한다: 빈혈, 조직 저산소증, 기관 기능이상, 이상 적혈구용적율값, 비효과적 적혈구 생성, 이상 망상적혈구 (적혈구) 계수, 이상 철 부하, 환상철적혈모구, 비장 비대, 간 비대, 말초 혈액 흐름 부전, 호흡곤란, 증가된 용혈, 황달, 빈혈성 통증 위기(anemic pain crises), 급성 흉부 증후군, 비장 분리증, 지속발기증, 뇌졸중, 손발증후군, 및 통증 예컨대 협심증의 존재.
일 실시형태에서, 조혈 전구 세포는 생체외 또는 시험관내에서 DNA 타겟팅 엔도뉴클레아제와 접촉되며, 상기 세포 또는 그 자손은 포유동물(예를 들면, 인간)에게 투여된다. 추가의 실시형태에서, 상기 조혈 전구 세포는 적혈구 계통의 세포이다. 일 실시형태에서는, DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 및 약학적으로 허용가능한 담체와 미리 접촉된 조혈 전구 세포를 포함하는 조성물이 포유동물에게 투여된다.
일 실시형태에서, 당 기술분야에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 태아 헤모글로빈 단백질의 웨스턴 블롯 분석 및 태아 γ-글로빈의 mRNA의 정량화가 태아 헤모글로빈 발현의 증가를 측정하는데 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 조혈 전구 세포는 시험관내, 또는 생체외에서 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제와 접촉된다. 일 실시형태에서, 상기 세포는 인간을 기원으로 한다(예를 들면, 자가 또는 이종 세포). 일 실시형태에서, 상기 조성물은 태아 헤모글로빈 발현의 증가를 유발한다.
본 발명은 다음의 알파벳 붙인 단락들 중 어느 것에 의해 정의될 수 있다.
[A] 감소된 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현을 갖는 전구 세포를 제조하는 방법으로서, 단리된 전구 세포를 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612(UCSC 게놈 브라우저 hg 19 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA에 결합하는 물질과 접촉시키고, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
[B] 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포를 제조하는 방법으로서, 단리된 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하는 것을 포함하는 방법.
[C] 단락 [A] 또는 [B]의 방법으로서, 상기 단리된 전구 세포 또는 단리된 세포는 조혈 전구 세포인 방법.
[D] 단락 [C]의 방법으로서, 상기 조혈 전구 세포는 적혈구 계통의 세포인 방법.
[E] 단락 [A] 또는 [B]의 방법으로서, 상기 단리된 전구 세포 또는 단리된 세포는 유도 만능 줄기 세포인 방법.
[F] 단락 [C]의 방법으로서, 상기 조혈 전구 세포는 생체외 또는 시험관내에서 접촉시키는 방법.
[G] 단락 [A]-[F] 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 적어도 하나의 유전자 변형은 결실인 방법.
[H] 단락 [G]의 방법으로서, 상기 결실은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 간의 영역 전체를 제거하거나, 또는 하나 이상의 DNA분해효소 1-과민부위 (DNA분해효소 1-과민성 부위(DHS))의 방해로 귀결되는 상기 영역의 부분을 제거하는 방법.
[I] 단락 [B]-[H]에 따른, 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포.
[J] 단락 [I]의 단리된 유전자 조작 인간 세포를 포함하는 조성물.
[K] 세포에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법으로서, 다음의 단계들을 포함하는 방법: 단리된 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 상기 세포에 비하여 상기 세포 또는 그 자손에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
[L] 단락 [K]의 방법으로서, 상기 단리된 세포는 조혈 전구 세포인 방법.
[M] 단락 [K] 또는 [L]의 방법으로서, 상기 조혈 전구 세포는 적혈구 계통의 세포인 방법.
[N] 단락 [K]의 방법으로서, 상기 단리된 세포는 유도 만능 줄기 세포인 방법.
[O] 단락 [L] 또는 [M]의 방법으로서, 상기 조혈 전구 세포는 생체외 또는 시험관내에서 접촉시키는 방법.
[P] 단락 [K]-[O] 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 적어도 하나의 유전자 변형은 결실인 방법.
[Q] 단락 [P]의 방법으로서, 상기 결실은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 간의 영역 전체를 제거하거나, 또는 하나 이상의 DNA분해효소 1-과민부위 (DHS)의 방해로 귀결되는 상기 영역의 부분을 제거하는 방법.
[R] 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법으로서, 다음의 단계들을 포함하는 방법: 단리된 조혈 전구 세포를 상기 포유동물 내에서 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 상기 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
본 발명은 제한적인 것으로 해석되어서는 안 될 다음의 실시예에 의해 더 설명된다. 본원 전체를 통해 인용된 모든 참고문헌의 내용, 도면, 표는 여기에 참조에 의해 편입된다.
실시예
본 발명자들은 적혈구 계통 세포에서의 그것의 발현에 임계적인 BCL11A 유전자의 조절 요소들을 발견하고 특징을 규명하였다. 이들 서열 내의 흔한 유전자 변이형들은 태아 헤모글로빈 수준 및 베타-글로빈 장애 중증도와 연관되어 있다. 이들 서열은, 접근가능한 염색질, 활성 히스톤 마크, 및 적혈구 전사 인자에 의한 점유를 갖는, 인핸서 염색질 특징을 갖는 원위 조절 요소를 포함한다. 이들 요소는 BCL11A 프로모터와 상호 작용하여 적혈구 세포에서 유전자 발현을 촉진하나 BCL11A을 발현하는 다른 계통 예컨대 B-림프구에서는 그렇지 아니하다. 이들 조절 요소는 BCL11A 저해 및 태아 헤모글로빈 재유도를 달성하기 위한 치료적 목적을 위해 타겟팅될 수 있다. 이것은 게놈 에디팅, 핵산 또는 단백질 결합, 및 후성적 변형에 제한되지 않는 메커니즘에 의해 달성될 수 있다. 이 방법의 이점은 다음을 포함한다: 증가된 감마-글로빈 생산 및 감소된 베타-글로빈 생산으로 귀결되는 태아 헤모글로빈 수준의 생리적 조절자의 방해; 전체 글로빈 아웃풋 또는 적혈구 생산 또는 기능에 대한 최소 효과; 적혈구 계통의 외부의 세포에 대한 영향의 제한 및 이에 따른 잠재적인 독성의 감소.
재료 및 방법
세포 배양
건강한 공여자의 가동화된(mobilized) 말초 혈액으로부터의 인간 CD34+ 세포를 미합중국 코네티컷주 뉴 헤이븐의 예일 유니버시티의 Centers of Excellence in Molecular Hematology 및 워싱턴주 시애틀시의 Fred Hutchinson Cancer Research Center로부터 얻었다. 상기 세포에 대하여 이전에 기술된 2상(two phase) 무혈청 액체 배양 프로토콜에 따라(39) 생체외 적혈구 성숙화를 행하였다. 말초 혈액 단핵 세포(Peripheral blood mononuclear cell (PBMC))를 Boston Children's Hospital으로부터의 건강한 공여자로부터 얻었다. PBMC로부터의 적혈구 분화를 이전에 기술된 바와 같이(40) 행하였다. 마우스 적백혈병 (MEL) 세포와 293T 세포를 이전에 기술된 바와 같이(39) 배양하였다. 안정하게 v-Abl 트랜스포메이션된 전(pre)-B 림프구 뮤린 세포 ((41)에 기재된 바와 같이 유래함)을 RPMI 플러스 2% 페니실린-스트렙토마이신, 15% FCS, 2% HEPES, 1% 비-필수 아미노산, 1% 소듐 피류베이트, 1% L-글루타민 및 100 μM β-머캅토에탄올 중에서 배양하였다.
ChIP 및 DNA분해효소 I 감수성
염색질 면역침전 및 대규모 병렬형 시퀀싱을 기재된 바와 같이(39) 행하였다. 다음의 항체가 사용되었다: H3K27me3 (Millipore, 07-449), H3K4me3 (Millipore, 04-745), H3K4me1 (Abcam, ab8895), H3K27ac (Abcam, ab4729), RNA 폴리머라제 II (PolII, Santa Cruz, sc-899), GATA1 (Abcam, ab11852) 및 TAL1 (Santa Cruz, sc-12984). 이전에 기술된 바와 같이(42) DNA분해효소 I 절단 밀도를 행하고 분석하였다. ChIP-qPCR에 대하여, ΔCt법에 의해 ChIP 재료의 증폭을 1% 인풋(input) 염색질에 비교함으로써 상대적 농축(enrichment)을 결정하였다. 이전에 GATA1 및 TAL1에 의해 점유된 및 비점유된 것으로 보고된(39) 좌들을 포지티브 및 네가티브 대조로 각각 사용하였다.
염색체 입체형태 캡처( Chromosome conformation capture ) (3C)
3C 분석을 아래에 기재한 것을 제외하고 이전에 기술된 바와 같이(39) 행하였다. 연결(ligation) 및 가교 결합의 역전(reversal of cross-links)에 앞서, 포름알데히드 가교 일차 인간 적혈구전구체로부터의 핵을 HindIII로 소화(digest) 하였다. iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 170-8880)을 사용하여 정량적 실시간 PCR을 행하였다. BCL11A 프로모터를 함유하는 절편을 앵커 영역으로서 사용하였다. 서로 다른 프라이머들의 증폭 효율을 보정하기 위해, 완전 인간 BCL11A 좌 (RP11-606L8 및 RP11-139C22) 및 하나의 인간 β-글로빈 클러스터 (CTD-3055E11)를 포함하는 2개의 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome (BAC))의 등몰 혼합물을 소화(digestion)) 및 연결(ligation)하여 대조 템플릿을 제조하였다. 인간 13-글로빈 좌 조절 영역 (locus control region (LCR))의 HS1/HS2 및 HS3 내의 절편들 간의 상호 작용이 포지티브 대조로서 기능하였다. 상호작용 빈도를 알려진 LCR 상호작용에 대한 증폭으로서 표현하고 BAC 대조 템플릿에 대하여 정규화하였다.
BCL11A 좌의 정밀-지도 작성 ( Fine - mapping BCL11A locus )
BCL11A 인트론-2 DHS +62 (chr2:60,717,492-60,718,860), +58 (chr2:60,721,411-60,722,674) 및 +55 (chr2:60,724,802-60,726,084) 셋 중에서 마커들 (모두 좌표 hg19)을 선택하였다. 북유럽 (CEU), 나이지리아 (YRI) 및 아프리카-아메리카 (ASW) 기준 집단을 사용하는 1000개의 게놈 프로젝트 데이터베이스로부터 21개의 마커가 동정되었다(표 S1). 38개의 추가의 변이형이 dbSNP135에 존재하였다(표 2). 본 발명자들은 각각 고(> 8%) 및 저(< 2%) HbF 수준을 갖는 CSSCD 코호트로부터의 52명 및 36명의 겸상 혈구성 질환 (sickle cell disease (SCD)) 환자의 DNA내의 세 DHS 간격을 생어 화학(Sanger chemistry)에 의해 시퀀싱하였다. 이 시퀀싱 노력으로부터, 7개의 신규한 서열 변이형이 동정되었다(표 3). 대부분의 마커들은 작은 게놈 간격으로 클러스터링하기 때문에, 그들 중 일부를 위한 유전자형 결정 분석법(genotyping assay)을 설계하는 것은 가능하지 않았다. 세 DHS에서 동정된 66개의 비-과잉 변이형 중에서, 40개의 마커에 대한 유전자형 결정 분석법을, 게놈 DNA (gDNA)가 입수 가능하고 HbF 수준이 알려져 있는(21) 아프리카-아메리카 SCD 코호트인 CSSCD로부터의 1,263명의 참가자들에 있어서 행하였다. 마커들은 Sequenom iPLEX platform을 사용하여 유전자형 결정하였다. 유전자형 결정 성공율< 90%인 개체 및 DNA 서열 변이형은 제외되었다. 세번으로부터 어림산된 전체 유전자형 일치는 100%였다. SNP 통과 퀄리티 컨트롤(SNP passing quality control)(QC; n = 38)은 표 2 및 표 3에 게재되며, 세 DHS 하단에 도 11A 및 11B에 개략적으로 나타내어진다. 유전자형 결정된 SNP의 실질적 분획은 기준 집단에서 드물고 CSSCD(n = 18)에서 놀랍지 않게 단일형이다. QC 후에, 분석을 위해 1,178 개체 및 20개의 다형성 SNP가 남겨졌다. 이전에 기술된 바와 같이(9, 43), HbF 수준을 모델링하였다. 추가의 유전 모델 하의 선형 회귀를 이용한 PLINK(44)에 의해 단일 변이형의 연관 및 조건부 분석(MAF (마이너 대립유전자 빈도) > 1%)을 행하였다. 흔한 변이형(MAF> 1%)의 분석은 DHS +62에서의 rs1427407이 HbF 수준에 강한 연관을 가짐을 드러내었다(P = 7.23×10-50; 도 11A 및 3B). 조건부 분석은 rs1427407 및 rs7606173을 조건으로 한 후 더이상의 SNP가 유의하지 않음을 입증하였다(도 3B). 혼합물 및 다른 교란요인을 설명하기 위해 전 게놈 유전자형 결정 데이터가 입수 가능한 855 개체에 대하여 주성분들(principal components (PC))을 조정하자 유사한 결과가 얻어졌다.
희귀 및 저-빈도 변이형 (MAF < 5%)에 대하여, 본 발명자들은 테스트 단위로서 세 DHS +62, +58 및 +55의 각각을 사용한 세트 기반 분석을 행하였다. 이들 분석을 위해, 본 발명자들은 디폴트 파라미터에 의해 서열 커넬 연관 시험(Sequence Kernel Association Test) (SKAT-O) 프로그램 (45)을 이용하였다. 본 발명자들은 주어진 우리의 한정된 샘플 크기를 고려하여 통계력을 최대화하기 위해 MAF에 대하여 5% 문턱치를 선택하였으나, 1%와 5% 사이의 MAF를 갖는 마커도 상술한 바와 같은 단일 변이형 분석으로 분석되었음에 유의해야 한다. 이 변이형 오버랩은 HbF 수준과 독립적으로 연관된 흔한 변이형에 의한 조건부 분석을 사용하여 설명된다. 2개의 세트가 통계적으로 유의한 것으로 나타났는데, 즉 DHS +62 및 DHS +55이 그러하지만, rs1427407 및 rs7606173을 조건으로 한 후, 결과는 더 이상 통계적으로 유의하지 않았으며, 이는 희귀/저-빈도 변이형과 흔한 SNP 간의 약한 LD(표 5)를 시사한다. 극단적인 HbF 형질을 갖는 88명의 대상체에서의 이들 DHS의 Sanger 재 시퀀싱에도 불구하고, BCL11A DHS내의 희귀 및 저-빈도 서열 변이형이 SCD 대상체에서의 HbF 수준에 영향을 미친다는 증거를 발견하지 못했다.
CSSCD 내의 rs1427407-rs7606173 일배체형 빈도는 T-G 24.5%, T-C 0.085%, G-C 42.3%, G-G 33.1%이다. 평균 HbF 수준은 213 rs1427407-rs7606173 G-C 개체에서 4.05% (SD 3.10), 254 rs1427407-rs7606173 T-G/G-T 이형접합체에서 7.08% (SD 4.50), 60 rs1427407-rs7606173 T-G 개체에서 11.21% (SD 4.37)이다(도 3C). 유전자형들 간에 HbF 수준을 비교하기 위해, 단측 스튜던트 t 검정에 의해 P-값을 결정하였다.
분자 일배체형 결정( Molecular haplotyping )
동일 염색체상의 2개의 이형접합 SNP에 대하여, 2개의 가능한 상(phase)이 있다: A-B/a-b (모델 1) 및 A-b/a-B (모델 2). 12-kb BCL11A 인트론-2 절편 +52.0-64.4 kb 내의 SNP에 대하여, PCR 산물을 클로닝하고 SNP 대립유전자의 공동 분포를 결정함으로써 상(phase)을 결정하였다. rs7569946 및 rs1427407 대립유전자 (염색체 2 상에서 30.1 kb 떨어져 있음)의 상을 결정하기 위해, 약간의 변형을 가하여 이전에 기술된 바와 같이 (24, 25) 에멀젼 융합 PCR을 행하였다. 융합 PCR은 동일 염색체의 떨어진 부분들로부터의 관심 대상의 2개의 영역을, 함께 단일 산물에 이르게 한다. 오일에 둘러싸인 수성의 마이크로액적에 의해 에멀젼에서 반응을 수행함으로써, 압도적 다수의 앰플리콘(amplicon)들이 단일의 템플릿 분자에서 유래한다. rs7569946 및 rs1427407에 대하여 이중으로 이형접합인 것으로 알려진 개체로부터의 게놈 DNA가 다음의 100 i&l 반응(기재된 최종 농도를 가짐)에서 템플릿으로서 작용하였다: KOD 핫 스타트 DNA 폴리머라아제 (14 U, Novagen, 71086), KOD 완충액 (1X), MgSO4 (1.5 mM), dNTP (0.2 mM each), rs7569946-F 및 rs1427407-R 프라이머(각각 1 i&M), rs7569946-R 프라이머 (30 nM), rs7569946-R-revcomp-rs1427407-F 가교(bridging) 이너 프라이머(inner primer)(30 nM), gDNA (200 ng). 100 i&l 수성 반응에 교반과 함께 200 i&l 오일상을 적하하여 에멀젼을 생성하였다. 에멀젼의 2개의 125 i&l 분획량을 다음 조건 하에 증폭하였다: 95도 2분; 95도 20초, 60도 10초, 70도 30초의 45사이클; 70도 2분. 헥산 추출된 융합 PCR 산물에 대해 다음과 같이 25 i&l에서의 내포 PCR(nested PCR)을 행하였다: KOD 핫 스타트 DNA 폴리머라제(0.5 U), KOD 완충액 (1X), MgSO4 (1.5 mM), dNTP (각각 0.2 mM), rs7569946-내포(nested)-F 및 rs1427407-내포-R 프라이머(각각 300 nM), 추출된 융합 PCR 산물 (75 nl); 95도 2분; 95도 20초, 60도 10초, 70도 30초의 35사이클; 70도 2분. 내포 산물(nested product)을 예측된 사이즈의 단일 밴드를 이루는 아가로오즈 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 정제된 산물을 Zero Blunt PCR Cloning kit (Life Technologies, K2700-20)에 의해 클로닝하였다. 융합 앰플리콘(amplicon)의 Sanger 시퀀싱은 4개의 가능한 서열 A-B, a-b, A-b 및 a-B의 클론들을 열거하였다. 각 상의 우도(likelihood)를 다항 분포 가정(multinomial distribution assumption)에 기하여 계산하였다(표 6). 두 입체형태(configuration)에 대한 우도비(likelihood ratio)를 일배체형 모델 1 에 들어맞는(모델 2에 비해) 데이터의 통계적 유의성의 측정으로서 계산하였다. 무한값에 접근하는 비율은 모델 1을 시사하며, 1인 비율은 균형(equipoise)을 시사하며 0에 접근하는 비율은 모델 2를 시사한다.
파이로시퀀싱( Pyrosequencing )
건강한 CD34+ 세포 공여자들을 스크리닝하여 rs1427407에 이형접합인 5명의 공여자를 동정하였다. 이들 CD34+ 세포에 대하여 생체외 적혈구 분화를 행하였다. 염색질을 단리하고 GATA1 및 TAL1 항체에 의해 ChIP를 행하였다. GATA1 또는 TAL1 침전물질에 비교한 인풋 염색질에 대하여 파이로시퀀싱을 행하여 rs1427407의 대립유전자 밸런스를 측정하였다. 건강한 CD34+ 세포 공여자들을 스크리닝하여 rs1427407-rs7606173 G-C/T-G 일배체형에 이형접합인 3명의 공여자를 동정하였다. 이들 CD34+ 세포에 대하여 생체외 적혈구 분화를 행하였다. 상보적 DNA (cDNA) 및 gDNA에 대하여 파이로시퀀싱을 행하여 rs7569946의 대립유전자 밸런스를 측정하였다.
PCR 조건은 다음과 같다: 2X HotStarTaq master mix (QIAGEN, 203443), MgCl2 (최종 농도 3 mM), 템플릿 DNA (0.1-1 ng) 및 SNP-특이적 포워드 및 리버스-비오틴화 프라이머(각각 200 nM). PCR 사이클링 조건은 다음과 같았다: 941/4C 15분; 45 사이클의 94℃ 30초; 60℃ 30초; 72℃ 30초; 72℃ 5분. 각 쌍의 하나의 프라이머는 비오틴화되었다. 비오틴화 프라이머를 함유하는 PCR 산물 가닥이 스트렙타비딘 비즈에 결합되고 특이적 시퀀싱 프라이머와 조합되었다. primed 단일 가닥 DNA를 시퀀싱하고 제조자의 지시를 따라 Pyrosequencing PSQ96 HS System (QIAGEN Pyrosequencing)을 사용하여 유전자형 분석하였다.
트랜스제닉 마우스( Transgenic mice )
닥터 윌리엄 푸(William Pu)로부터 인핸서 리포터 구조체(construct) pWHERE-Dest를 얻었다. 이전에 기술된 바와 같이 pWHERE (Invitrogen, pwhere)로부터 변형되어(46), 상기 구조체는, 상류 MCS에 게이트웨이 데스티네이션 카셋(Gateway destination cassette)을 갖는 최소 Hsp68 최소 프로모터에 의해 구동되는 CpG-프리(free) lacZ 변이형의 양 옆에 있는 뮤린 H19 인설레이터를 갖는다. 인핸서 절편은, 마우스 gDNA로부터 증폭되고, BP 클로나아제 (Invitrogen, 11789020)에 의해 pDONR221 벡터 (Invitrogen, 12536-017)로 재조합되고, LR 클로나아제 (Invitrogen, 11791020)에 의해 pWHERE-Dest 벡터로 재조합되었다. 플라스미드는 PacI으로 소화하여 벡터 골격을 제거하였다. lacZ 인핸서 리포터 절편을 겔 전기용출에 의해 정제하고나서 Wizard DNA Clean-Up System (Promega, A7280)을 사용하여 농축하였다. FVB 수정란에의 전핵 주사(pronuclear injection)에 의해 트랜스제닉 마우스를 생성하였다. 대략 10 ng/㎕의 DNA 용액을 일련의 주사에 사용하였다. 주사된 배아의 수용체로서 CD-1 암컷을 사용하였다. 이전에 기술된 바와 같이(47) 온조직 표본고정(whole-mount) 및 조직 X-gal 염색된(47) 대리모로부터 10.5~14.5 dpc 배아를 해부하였다. X-gal 염색된 세포원심분리(cytospin)를 Nuclear Fast Red (Vector Laboratories, H-3403)에 의해 대비염색하였다. PCR 유전자형 결정을 위해 꼬리를 사용하였다. 동물 과정은 칠드런스 하스피틀 기관 동물 케어 및 사용 위원회로부터 승인받았다.
인간 적혈구 전구체 인핸서 분석법 ( Human erythroid precursor enhancer assay )
추정상의(putative) 인핸서 요소를 함유하는 게놈 DNA 절편을, 기술된 바와 같이(39), pLVX-Puro (Clontech, 632164) 내로, 최소 TK 프로모터 및 GFP 리포터 유전자의 상류에 클로닝하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 FuGene 6 시약 (Promega, E2691)에 의해 293T 세포를 트랜스펙션 하였다. 24시간 후 2% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 SFEM 미디어로 미디어를 교환하고, 36시간 후 상징액을 모아 여과하였다. 이전에 기술된 바와 같이(39) spin-감염에 의해 증식일(expansion day) 4 및 5에 렌티바이러스로 CD34+ 세포-유래 적혈구 배양을 트랜스덕션하였다. 2차 감염의 24시간 후 적혈구 분화 미디어에 세포를 재현탁하였다. 감염의 48시간 후 퓨로마이신 1 ㎍/ml에 의한 선택이 개시되었다. GFP 평균 형광 강도에 대한 유세포분석에 의해 분화 미디어에서 5일 후 트랜스덕션된 세포를 분석하였다.
유세포분석( Flow cytometry )
7-아미노액티노마이신 D (7-AAD, BD Pharmingen, 559925)의 배제에 의해 살아있는 세포를 게이트(gate)하였다. 젊은 성체 트랜스제닉 마우스로부터 골수 (적혈구모세포를 위해) 및 비장 (림프구를 위해) 현탁액을 단리하였다. 성숙한 적혈구의 저장용균(hypotonic lysis)에 이어, CD71-비오틴 (BD, 557416), 스트렙타비딘-APC (BD, 554067), Ter-119-PE (BD, 553673), CD19-APC (BD, 550992) 또는 CD3-PE (BD, 100308)에 의한 염색에 기초하여 살아있는 세포 (7-AAD-)를 구분하였다. CD71+Ter119+, CD19+ 및 CD3+ 구분된 집단을 세포원심분리 및 RNA 단리에 사용하였다.
TALEN -매개 염색체 결실( TALEN - mediated chromosomal deletion )
전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)는, 마우스 Bcl11a 인트론-2에, TSS에 대하여 +50.4 kb (5'부위라 함) 및 +60.4 kb (3'부위)의 부위에 절단을 생성하기 위해 설계되었다. TALEN은 다음 서열을 인식한다: CTTAAGGCAAGAATCACT (5’좌측), CCATGCCTTTCCCCCCCT (5'우측), GAGTTAAAATCAGAAATCT (3'좌측), CTGACTAATTGATCAT (3'우측). TALEN은 G를 인식하도록 NN RVD를 사용하여 Golden Gate 클로닝 (48)에 의해 합성되었다. 합성된 DNA 결합 도메인을, 이전에 기술된(49) FokI 뉴클레아제 도메인, A152 N-말단 도메인 및 +63 C-말단 도메인을 갖는 pcDNA3.1 (Invitrogen, V790-20) 내로 클로닝하였다. 0.5 &g pmaxGFP (Lonza)를 갖는 4개의 TALEN 플라스미드의 각각의 2.5 &g을 제조자의 프로토콜에 따른 전기천공에 의해(Lonza, VCA-1005) 2×106 MEL 또는 전(pre)-B 세포로 전달하였다. 48시간 후 유세포분석에 의해 GFP-포지티브 세포를 구분하였다. 개별 클론을 단리하기 위해 96-웰 플레이트에 제한 희석에 의해 세포를 씨딩하였다. 분절 사이의 결실을 가리키는 5’부위의 상류 및 3’부위의 하류로부터의 짧은 산물의 증폭을 검출하기 위해 gDNA의 PCR에 의해 클론을 스크리닝하였다. 모노대립유전자 결실된 클론에 대해 제2 라운드의 TALEN-매개 결실을 행하여 양대립유전자(biallelic) 결실된 클론을 얻었다. 결실된 절편 내로부터의 증폭의 부재를 검출함으로써 양대립유전자 결실을 갖는 클론을 동정하였다. 결실 빈도는 대략 50 대립유전자당 1이었다. 결실은 서던 블로팅에 의해 입증되었다. BmtI 에 의해 게놈 DNA 를 소화하였다: 561-bp 프로브는(5’부위의 상류의 gDNA로부터 증폭됨) 야생형 대립유전자로부터의 3.6 kb 절편과 A50.4-60.4 결실된 대립유전자로부터의 8.9 kb 절편에 하이브리다이제이션한다.
RT - qPCR 및 면역블로팅 ( RT - qPCR and immunoblotting )
RNeasy 칼럼 (QIAGEN, 74106)으로 RNA 단리, iScript cDNA 합성 키트 (Bio-Rad, 170-8890)에 의해 역전사, iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 170-8880)에 의해 qPCR, 그리고 기술된 바와 같이(39) 면역블로팅을 행하였다. 마우스 13-글로빈 클러스터 유전자에 대하여, 공통 프라이머쌍은 성체 13-글로빈 132 및 131을 인식하며 한편 독립 프라이머는 배아 13-글로빈 εy 및 13H1를 인식한다. 다음 항체를 면역블로팅에 사용하였다: BCL11A (Abcam, ab19487), GAPDH (Santa Cruz, sc-25778).
결과
전 게놈 연관 연구(GWAS)들은, 빈번하게 조절 DNA에 국재된 형질과 연관된 다수의 공통 유전자 변이형들을 확인하였다. 조절적 변이가 실질적 유전력을 설명해 줄지 모른다는 가설은, 드문 실험적 평가를 받아왔다. 여기서 본 발명자들은, 태아 헤모글로빈 (HbF) 수준과 연관된 BCL11A에서의 흔한 유전자 변이가, 적혈구 인핸서 염색질 특징에 의해 수식된 논코딩 서열을 시사함을 보여준다. 이 추정상의 조절 DNA 내에서의 정밀 지도 작성은, 감소된 전사 인자 결합, 감소된 BCL11A 발현, 및 상승된 HbF과 연관된 모티프를 방해하는(motif-disrupting) 흔한 변이형을 밝혀낸다. 주위(surrounding) 서열은 생체내에서 발생 기(stage)-특이적 계통-제한 인핸서로서 기능한다. 이 인핸서는, 게놈 엔지니어링에 의해, 적혈구 BCL11A 발현을 위해 요구되지만 적혈구 계통 밖에서는 없어도 됨이 밝혀졌다. 이들 결과는, 전 게놈 연관 연구(GWAS)가, 적절한 유전자 발현에 필수인 원인 요소들(causal elements) 내에서, 보통 정도의 영향의 기능적 변이형(functional variants of modest impact)을, 어떻게 강조(highlight)하는지를 설명한다. GWAS-표지 BCL11A 인핸서는 β-글로빈 장애를 위한 유망한 치료 타겟을 대표한다.
인간의 형질 및 질환과 연관된 수천개의 흔한 단일염기다형성 (SNP)을 동정함에 있어서 GWAS는 대단히 성공적이었다. 그러나 유전적 연관으로부터 인과 관계의 생물적 과정으로의 전진은 종종 곤란했다. 도전은, 개별적 형질(연관불균형 (LD) 탓의), 많은 변이형-형질 연관의 보통 정도의 효과 크기, 및 논코딩 게놈에서의 많은 연관 변이형들의 위치와 연관될 수 있는, 다수의 상관성이 있는 변이형들을 포함한다. 최근의 게놈-스케일 염색질 지도 작성 연구들은 조절 DNA 요소에 있어서 GWAS 변이형의 농축(enrichment)을 강조(highlight)하였으며, 이는 많은 원인 변이형가 유전자 조절에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 원인 변이형 또는 요소의 유의성을 확인시켜주는 소수의 예만이 실험적으로 입증되었다.
HbF 수준의 GWAS는 특히 현저했다. 단지 3개의 좌(HBB, HBS1L - MYB, 및 BCL11A)에서의 유전자 변이가 HbF 수준의 유전 가능한 변이의 50%까지의 원인이 된다. 동일한 변이형가 또한 주요 β-글로빈증 겸상 혈구성 질환 및 β-지중해빈혈의 임상적 중증도와 연관되며, 아마도 놀랄 것 없이 HbF가 이들 장애의 주요 변형자(modifier)이기 때문일 것이다. 발명자의 실험실로부터의 작업, 및 다른 것들에 의해, BCL11A가 HbF 수준의 직접적 조절자임이 입증되었다. BCL11A은 β-글로빈 유전자 클러스터를 점유하는 멀티 단백질 복합체 내에 있는 전사 억제자이다. 구성적 BCL11A 결함은 배아 치사율 및 림프구 발생 부전으로 귀결되는 한편, BCL11A의 적혈구-특이적 결함은 배아 및 태아 글로빈 유전자의 발생 침묵(developmental silencing)에 반작용하며, 마우스 모델에서 겸상 혈구성 질환의 혈액학적 및 병리학적 특징을 구제하기에 충분하다. 따라서 BCL11A는 β-글로빈 장애에 대한 신규한 치료 타겟으로 밝혀졌다. BCL11A의 부전의 결과를 이해하는 것은 반드시 해야 한다. 대규모 재 시퀀싱 노력에도 불구하고 BCL11A의 인간 코딩 변이형은 기술되지 않았다. HbF 수준과 연관된 BCL11A 변이형은 BCL11A의 논코딩 영역에 있다. 흔한 유전자 변이가 BCL11A, HbF 수준, 및 β -글로빈 장애 중증도에 어떻게 영향을 미치는지를 더 이해하기 위해, HbF-연관 변이형의 역할을 상세히 탐구하였다.
적혈구 인핸서 근처의 형질-연관 변이형 ( Trait - associated variants near erythroid enhancers )
후속의 정밀 지도 작성 연구들뿐만 아니라, 다수의 GWAS가, 적혈구 형질(예컨대 적혈구 수 및 부피, 헤모글로빈 농도, 및 HbF 수준을 포함하는 형질들)에 관해 행하여졌으며, 전 게놈 유의성(p<5e-8)으로 636개의 형질-연관 SNP를 동정하였다. 이들 SNP는 랜덤 SNP에 비해 프로모터 및 코딩 영역에 농축되어 있다(enriched)(도 1). 여전히 대부분의 SNP는 게놈 내 어딘가 다른 곳에 존재한다. 일차 인간 적혈구전구체의 글로벌 염색질 프로파일링이 행하여졌으며, 이에 의해 특징적인 히스톤 변형 및 DNA분해효소 I 과민성으로 정의되는 원위 적혈구 인핸서의 대규모 세트가 동정되었다. 비-적혈구 형질-연관 SNP, 흔한 유전자형 결정 어레이에서 발견된 SNP, 또는 랜덤 치환(randomly permuted) SNP에 비교한, 적혈구 GWAS SNP와 인핸서의 강한 공동 국재화(colocalization)가 관찰되었다. 1.4배 농축을 나타내는(P = 0.0013) 비-적혈구 형질-연관 SNP의 1.4%에 비해, 적혈구 형질-연관 SNP는 13.5%가 적혈구 인핸서에 해당했으며 랜덤 치환 SNP에 대해 11.4배의 농축이다((P < 1×10-4). 많은 적혈구 형질-연관 SNP가 적혈구 인핸서에 최 근방에서 발견되었다(도 1B). 적혈구 인핸서까지의 중간(median) 거리는, 비-적혈구 형질-연관된, 유전자형 결정 어레이, 및 랜덤 치환 SNP에 대한 각각 238.0, 392.6, 및 482.4 kb에 비해, 적혈구 형질-연관 SNP에 대해서는 16.0 킬로베이스(kb)였다. 이들 결과는 적혈구 형질과 연관된 흔한 변이형의 실질적 분획이 적혈구 인핸서에 또는 그 근처에 있음을 시사하며, 원인 변이형(causal variant)이 문맥 의존적(context-dependent) 유전자 조절에 종종 영향을 미친다는 가설과 일치한다.
HbF GWAS 는 적혈구 인핸서 특징을 표시함( HbF GWAS mark an erythroid enhancer signature )
유럽, 아프리카, 및 아시아 혈통의 집단을 포함하여, 6건의 전 게놈 연관 연구(GWAS)가 HbF 수준 (또는 고상관성의 형질 F-세포 수(number))에 대하여 행하여졌다. 각각은 BCL11A 내에서 형질-연관 변이형를 동정하였다. BCL11A에서의 변이는 형질 변이의 15%를 설명하는 것으로 추산된다. 4개의 다른 SNP가 형질과 가장 높게 연관된 것으로 동정되었다(rs1427407, rs11886868, rs4671393, 및 rs766432; 이들 소위 "전초(sentinel)" SNP는 BCL11A 인트론-2에서 서로 3 kb 내에 클러스터링함)(도 2A). 상기 전초 SNP들을 포함하는 일배체형은 어떤 개별적 SNP보다도 HbF 연관을 더 잘 설명하는 것으로 보인다. BCL11A 좌에서의 50개의 SNP 및 인트론-2 내의 27개의 SNP가 적어도 전 게놈 유의성으로(P < 5×10-8) HbF 수준과 연관되어 있었다.
BCL11A에서 HbF-연관 SNP들의 분포를, 조절 잠재력을 시사하는 염색질 상태의 지표인 DNA분해효소 I 감수성과 비교하였다. 인간 적혈구 전구체에서, DNA분해효소 I 과민성의 피크 3개가, 인트론-2, HbF-연관 변이형의 인접 및 HbF-연관 변이형 상에서(overlying) 관찰되었으며 (도 2A), BCL11A 의 TSS로부터의 거리(kb)에 기초하여 DNA분해효소 I 과민성 부위(DHS) +62, +58, 및 +55로 명명되었다. BCL11A를 고수준으로 발현하는 2개의 조직인 뇌 및 B-림프구와, 주목할 만큼 BCL11A를 발현하지 않는 T-림프구는, 형질-연관 SNP 상의 DNA분해효소 I 과민성의 부족과 함께, BCL11A 좌에서 특유의 패턴의 DNA분해효소 I 감수성을 나타낸다(도 2A).
BCL11A 좌를 둘러싼 염색질 특징을 대규모 병렬형 시퀀싱(ChIP-seq)과 함께 염색질 면역침전에 의해 더 분석하였다. 일차 인간 적혈구전구체로부터의 ChIP-seq의 결과, H3K4me1 및 H3K27ac의 존재 및 H3K4me3 및 H3K27me3 표지(mark)의 부재를 포함하여, BCL11A 인트론-2에서의 형질-연관 SNP 상의 인핸서 특징을 갖는 히스톤 변형이 밝혀졌다(도 2A). 주(master) 적혈구 전사 인자 GATA1 및 TAL1는 이 인핸서 영역을 점유한다(도 2A). ChIP-qPCR 실험에 의해 BCL11A 인트론-2 내에, 각각 적혈구 DHS에 속하는, GATA1 및 TAL1 결합의 3개의 뚜렷한 피크가 입증되었다(도 2B).
원위 조절 요소들의 공통적 특징의 하나는 그들이 발현을 조절하는 프로모터와의 긴 범위의(long range) 상호작용이다. BCL11A 프로모터와, 상류, 하류, 및 유전자 내의 서열을 포함하는, BCL11A 좌의 250 kb에 걸친 절편들 간의 상호작용을 평가하였다. 가장 큰 프로모터 상호작용은 적혈구 DHS 및 형질-연관 SNP를 함유하는 인트론-2의 영역 내에서 관찰되었다(도 2C). 이들 결과는 이들 서열이 조절 잠재력을 가짐을 가리킨다.
조절적 변이형( Regulatory variants )
원인 형질-연관 SNP(causal trait-associated SNP)는 임계적인(critical)시스-조절 요소들을 변조함(modulating)으로써 기능할 수 있을 것이라고 가정되었다. 따라서, 게놈 DNA가 입수 가능하며 HbF 수준이 알려진 아프리카-아메리카 겸상 혈구성 질환 코호트인, 겸상 혈구성 질환의 협력 연구(Cooperative Study of Sickle Cell Disease (CSSCD))로부터의 1263개의 DNA 시료에서, 3곳의 적혈구 DHS +62, +58, 및 +55 내에서의 SNP의 대규모 유전자형 결정을 행하였다. 1000 게놈 프로젝트 내의 기준 집단 CEU, YRI, 및 ASW로부터, 그리고 극단적 HbF 형질을 갖는 CSSCD로부터의 88 개체를 Sanger 시퀀싱함으로써, dbSNP로부터의 세 DHS 내에 위치한 DNA 서열 변이형 66개를 동정하였다. 26개의 마커는 유전자형 결정 분석법 설계에 실패하였으며 18개는 단일형이었다(표 1 및 표 2). 퀄리티 컨트롤 후, 1178 개체 및 20개의 다형성 SNP가 연관 시험을 위해 남겨졌다. 흔한 변이형(마이너 대립유전자 빈도 (MAF) > 1%)의 분석 결과 DHS +62 내의 rs1427407가 HbF 수준에 가장 강한 연관을 가졌음이 밝혀졌다(P = 7.23×10-50; 표 1).
이전에, 본 발명자들은 CSSCD를 이용하여 BCL11A 좌에서 HbF와의 연관 신호를 정밀 지도 작성하고 rs4671393와의 강한 연관을 보고하였으며, 그 연구에서는 rs1427407에게로 전가되었다. 2개의 추가의 SNP, rs766432 및 rs11886868도 선행의 연구들에서 HbF 수준 (또는 F-세포 수)와 가장 강하게 연관된 전초 SNP들로서 동정되었다. 4개의 전초 SNP 모두에서의 유전자형이 알려진 개체들의 서브세트(N = 728) 에서, rs1427407에서의 유전자형을 조건으로 할 때, 연관 결과는 rs4671393, rs766432, 또는 rs11886868에서는 유의하지 않았으며, 역으로, rs4671393, rs766432, 또는 rs11886868을 조건으로 할 때, 연관은 rs1427407에 대 하여 매우 유의한 채로 있었다(표 3). 따라서 rs1427407는 적혈구 DHS 내에서 HbF와 가장 연관된 SNP이며 이전에 기술된 전초 SNP들보다 상기 형질 연관을 더 잘 설명한다.
rs1427407을 조건으로 할 때, HbF 수준에의 다른 연관이 완전히 없어지지 않은 세 DHS 내에서 발견되었다(표 1). 남아 있는 가장 유의한 연관은 DHS +55에서의 rs7606173(P = 5.11×10-10)에 대한 것이었고; 이전에 보고되었던 DHS +58에서의 rs7599488는 이 조건부 분석에서 약간 덜 유의하였다(P = 1.71×10-9). rs1427407 및 rs7606173을 조건으로 한 후, 더 이상의 유의한 SNP는 없었다(표 1). 혼합물 및 다른 교란요인을 설명하기 위해, 전 게놈 유전자형 결정 데이터를 입수 가능한 855 개체 상에서 주성분(principle component(PC))들을 조정하자, 유사한 결과가 얻어졌다(데이터를 나타내지 않음). HbF 수준과 가장 높게 연관된 것으로서 rs1427407-rs7606173 T-G 일배체형이 정의되었다.
희귀 및 저-빈도 변이형들 (MAF < 5%)에 대해서도 시험 세트로서 세 DHS +62, +58, 및 +55의 각각을 사용하여 그들의 HbF 수준과의 연관을 분석하였다. 2개의 세트, 즉, DHS +62 및 DHS +55는 유의한 것으로 발견되었지만, rs1427407 및 rs7606173을 조건으로 한 후, 결과는 더 이상 유의하지 않았으며, 이는 희귀/저-빈도 변이형 및 흔한 SNP 간의 약한 LD(연관불균형)를 시사한다(표 4). 따라서, 극단적 HbF 형질을 갖는 CSSCD로부터의 88개체의 Sanger 재 시퀀싱에도 불구하고, BCL11A DHS 내의 희귀 및 저-빈도 서열 변이형이 SCD 환자에서의 HbF 수준에 영향을 미친다는 증거는 발견되지 않았다.
SNP rs1427407는 ChIP-seq 및 ChIP-qPCR에 의해 측정된 GATA1 및 TAL1 결합의 피크 내에 속한다(도 2A 및 2B). 마이너 T-대립유전자는 반(half)-E-박스/GATA 복합체 모티프를 매우 닮은 서열 요소[CTG(n 9 )GATA]의 G-뉴클레오티드를 방해한다. ChIP-seq 실험에 의해, 이 모티프는 적혈구 세포 내에서 GATA1 및 TAL1 복합체에 의해 매우 농축된 것으로 밝혀졌다. rs1427407에서의 메이저 G-대립유전자 및 마이너 T-대립유전자에 이형접합인 개체로부터 일차 적혈구 시료를 동정하고 이들 시료에 대해 ChIP 및 후속의 파이로시퀀싱을 행하였다. 본 발명자들은 인풋 DNA에서 대립유전자들의 대등한 균형을 확인하였다. 그러나 GATA1 및 TAL1 면역침전된 염색질 시료 둘다에서 약 60:40인 T-대립유전자에 비해, G-대립유전자에 대한 더 빈번한 결합이 관찰되었다.
rs4671393의 고-HbF 연관 A-대립유전자가 인간 림프아구양(lymphoblastoid) 세포주에서의 BCL11A 발현과 연관되었음이 이전에 보고된 바 있다. 본 발명자들은 더 큰 세트의 림프아구양 세포주를 분석하는 BCL11A 유전자형 및 발현 수준 간의 유의한 연관을 재현할 수 없었다(데이터를 나타내지 않음). 고-HbF-연관 rs1427407-rs7606173 일배체형이 적혈구-특이적 맥락으로 BCL11A 발현에 영향을 미친다고 추정되었다. 흔한 동의의(synonymous) SNP rs7569946는 BCL11A의 엑손-4 내에 있으며 대립유전자 발현의 마커로서 기능할 수 있다. 3개의 일차 인간 적혈구 시료들이 rs1427407-rs7606173 일배체형 및 rs7569946에 대하여 이중으로 이형접합인 것으로 동정되었다. 그 시료들에 대하여 에멀젼 융합 PCR에 의한 분자 일배체형 결정을 행하였다. 그 일배체형 결정의 결과 각 시료에 대하여 메이저 rs7569946 G-대립유전자가 저-HbF-연관 rs1427407-rs7606173 G-C 일배체형과 하나의 상(phase)에 있음이 입증되었다. rs7569946의 파이로시퀀싱에 의해 게놈 DNA 및 cDNA를 분석하여 대립유전자 밸런스를 측정하였다. 게놈 DNA 내에서 대립유전자들은 균형을 이루었지만, rs7569946의 저-HbF 연관 G-대립유전자의 발현 증가를 돕는, cDNA에서의 유의한 불균형이 관찰되었다(도 3B). 이들 결과는 반(half)- E-박스/GATA 모티프를 방해하는 고-HbF rs1427407 T-대립유전자가, GATA1 및 TAL1의 감소된 결합과 적혈구 전구체에서의 BCL11A의 감소된 발현과 연관되어 있음을 가리킨다. 60 고-HbF rs1427407-rs7606173 T-G 일배체형 동형접합 개체에서의 평균 HbF 수준은, 213 저-HbF rs1427407-rs7606173 G-C 일배체형 동형접합 개체의 4.05%에 비해, 11.21%였다(P = 2.5×10-19) (도 3C). 즉, 다음의 증거들은 rs1427407이 HbF 수준에 대한 원인 SNP임을 가리킨다: 그것은 임의의 알려진 변이형의 형질에 대하여 가장 높은 연관을 갖고, 이전에 기술된 전초 SNP들에서 관찰된 연관을 설명하며, GATA1 및 TAL1 결합에 요구되는 모티프에 영향을 미치며, 그리고 BCL11A 발현뿐만 아니라 GATA1 및 TAL1 결합과도 연관되어 있다. 그러나, 흔한 일배체형의 세팅에서 이 위치에서의 변이는, BCL11A 발현의 단지 보통 정도의 동요(modest perturbation)와 연관되어 있다.
적혈구 발현을 위한 인핸서 충분량
이들 겉보기 조절 형질-연관 SNP들이 그들의 역할을 하는 맥락을 이해하기 위해, 내부에 갖는(harboring) 시스-조절 요소의 기능을 탐구하였다. 본 발명자들은 3개의 적혈구 DHS를 함유한 ~12-kb (TSS 로부터의 +52.0-64.4 kb)를 클로닝하고, 트랜스제닉 리포터 분석법으로 인핸서 잠재력을 분석하였다. 이 분석법에서, 추정상의 인핸서 서열은, 인설레이터 서열이 경계를 이룬 최소 프로모터 (Hsp68) 및 리포터 유전자 (lacZ)의 상류에 위치하였다. 구조체를 뮤린 접합체에 도입하고 발생 동안 리포터 유전자 발현을 모니터링하였다. 내인 마우스 BCL11A는, 태아 간에서 관찰된 더 낮은 발현과 함께, 발생중의 중추 신경계에 걸쳐 풍부한 발현을 나타내었다. 대조적으로, 트랜스제닉 배아에서의 리포터 유전자 발현은 완성 적혈구 생성의 부위인 태아 간에 크게 한정된 것으로 관찰되었으며, 중추신경계에서는 더 적은 발현이 주목되었다(도 4A)
글로빈 유전자의 특색은 그들의 발생 조절이다. 인간 발생 동안, 난황낭-유래 ε-글로빈은 임신 초기(제1기)에 태아 간-유래 γ-글로빈에 의해 대체된다. 출생 즈음에, γ -글로빈이 점진적으로 침묵하고 β-글로빈이 활성화된다. 마우스의 개체 발생 동안 유전자 발현에는 단일의 스위치만 존재한다. 임신 중기에 일어나는 이 이행 동안, 순환하는 난황낭-유래 원시 적혈구가 배아기 글로빈 εy 및 βH1을 발현함에 대하여 태아 간 완성 적혈구모세포는 성체기 글로빈 β1 및 β2를 발현한다. 이 발생 스위치와 조화하여, BCL11A 발현은 완성기 적혈구 계통에서는 발현되지만 원시기 적혈구 계통에서는 발현되지 않는다. 안정한 트랜스제닉 세포주는 BCL11A +52.0-64.4 리포터 마우스로부터 유래하였다. E12.5에서의 이들 마우스에서 순환하는 적혈구는 X-gal 염색되지 않음에 대하여 간 적혈구모세포는 확실히 포지티브 염색된다(도 4B). E10.5에서 lacZ 발현은 태아 간 원기에서만 관찰되고 배아, 태반, 또는 난황낭 내의 순환하는 혈액에서는 관찰되지 않는다(도 6A). 이들 결과는 GWAS-표지 BCL11A 인트론-2 조절 서열이 발생으로 적합한 유전자 발현을 특정하기에 충분함을 가리킨다.
조혈 구획 내에서, BCL11A 발현은 적혈구 전구체 및 B-림프구에서 발견된다. 트랜스제닉 젊은 성체 동물로부터 적혈구 전구체 및 B-림프구를 단리하고 lacZ 리포터 유전자의 발현을 평가하였다. 내인 BCL11A는 골수 적혈구 전구체에 비해 비장 B-림프구에서 10.4배 높은 수준으로 발현되었다. 그러나, lacZ 발현은 적혈구 전구체에 한정되었으며 B-림프구에서는 관찰되지 않았다(도 4C). 이들 결과는 이들 조절 서열의 적혈구-특이성을 가리킨다.
적혈구 인핸서 활성에 요구되는 최소의 요소를 정제하기 위해 일련의 결실 돌연변이형를 생성하였다. 중앙의 +58 DHS 함유 서열은 적혈구 인핸서 활성에 충분했다. 양 옆의 +62 또는 +55 요소만 함유하는 서열은 적혈구 유전자 발현을 지령할 수 없었다(도 6B). 이들 DHS를 일차 인간 적혈구전구체에서의 유전자 발현을 증진하는 그들의 능력에 대해 테스트했다. 본 발명자들은 이전에 기술된 바와 같이 최소 TK 프로모터를 갖는 GFP 리포터 시스템의 렌티바이러스 전달을 사용했다. 유사하게, +58 DHS만 이 리포터 분석법에서 유전자 발현을 증진할 수 있었으며 +55 또는 +62 DHS는 그렇지 않았다(도 7).
적혈구 발현을 위한 인핸서 요건
다음으로 본 발명자들은 BCL11A 및 글로빈 유전자의 적합한 발현을 위한 이들 조절 서열의 요건을 결정하는 것을 택했다. 이전에 반포된 마우스 적혈구 세포의 글로벌 염색질 프로파일링에 있어서의 Bcl11a 좌의 검사에 의해, 인트론-2의 이 영역이 H3K4me1 및 H3K27ac의 존재, H3K4me3 및 H3K27me3의 부재, 및 GATA1 및 TAL1에 의한 점유를 갖는 이종상동성 인핸서 특징을 가짐이 밝혀졌다(도 8). 게다가, 적혈구-특이적 DNA분해효소 I 과민성이 이들 서열에서 관찰되었다. 인간 적혈구 DHS +62, +58, 및 +55의 각각에서, 진화적 서열 보존의 증거가, 특히 +62 및 +55에서 관찰되었다. BCL11A 발현을 위한 이들 이종상동성 조절 서열의 요건을 결정하기 위해, 마우스 적백혈병 세포주 (MEL)를 사용했다. 이들 세포는 적합한 성체기 패턴 글로빈 유전자 발현을 위해 BCL11A 발현에 의존한다. 서열-특이적 뉴클레아제는 작은 염색체 결실의 생산으로 귀결할 수 있다. TALEN을 조작하여 적혈구 인핸서 염색질 특징을 지닌 이종상동성 10-kb Bcl11a 인트론-2 서열의 양 옆에 이중가닥절단을 도입하였다. 클론을 NHEJ-매개 복구에 대해 스크리닝하고 양대립유전자 삭제(biallelic excision) 가 일어난 3개의 특유의 클론을 단리하였다. PCR 및 서던 블로팅에 의해 클론 내 인트론 분절의 삭제가 검증되었다(도 9). Sanger-시퀀싱된 절단점은 후속의 NHEJ 복구를 갖는 TALEN-매개 절단의 특징이었다(도 10).
양대립유전자(biallelic) 10-kb 인트론 결실을 갖는 MEL 세포에서 BCL11A의 발현을 분석했다. BCL11A 발현의 베이스라인 수준의 ~3%로의 극적인 감소가 관찰되었다(도 5A). 그 결실의 상류의, 그 결실에 걸치는, 그 결실의 하류의 엑손 경계(exon junction)를 검출하는 프라이머 쌍에 의해서도 유사한 감소가 주목되었다. 웨스턴 블로팅에 의해, BCL11A 발현은 10-kb 인핸서 결실된 클론에서는 검출 할 수 없었다(도 5B). MEL 세포는 전형적으로 고수준의 성체 글로빈 유전자 β1 및 β2와 저수준의 배아 글로빈 유전자 εy 및 βH1를 발현한다. BCL11A에 대한 10-kb 인핸서의 부재 하에, 성체 글로빈 유전자의 발현은 ~2-5배 감소하였으며, 한편 배아 글로빈 유전자는 상당히 탈억제되었다. 배아 εy와 성체 β1/2의 비율은 이종상동성 BCL11A 적혈구 인핸서를 결여하는 3개의 클론에서 평균 364배 증가되었다(도 5C).
+50.4-60.4 kb 인트론 서열이 BCL11A 발현에 보편적으로(universally) 요구되는지를 결정하기 위해, 비-적혈구 맥락에서 그들의 상실을 평가하였다. NHEJ-매개 Δ50.4-60.4 결실을 갖는 클론을 얻기 위해 두 쌍의 TALEN을 도입하는 동일한 전략을 프로(pro)-B 림프구 세포주에 채용하였다. 2개의 특유의 Δ50.4-60.4 클론을 단리하고, PCR, 서던 블로팅, 및 Sanger 시퀀싱에 의해 검증하였다(도 9 및 10). 적혈구 세포와는 대조적으로, BCL11A 발현은 RNA 및 단백질 수준 모두에서 Δ50.4-60.4kb 인핸서 결실된 프로(pro)-B 세포 클론에서 유지되었다(도 5A 및 5B). 이들 결과는 이종상동성 적혈구 인핸서 서열이 Bcl11a 좌로부터의 전사의 완전성에는 요구되지 않고 적혈구 유전자 발현에만 필수적임을 가리킨다.
HbF-연관 SNP의 직접 위에 있는, BCL11A의 인트론-2에서, 인핸서 염색질 특징이 발견되었다. 이 영역은 H3K4me3 및 H3K27me3의 부재 하에 히스톤 표지 H3K4me1 및 H3K27ac에 의한 점유, 적혈구 TF GATA1와 TAL1의 결합, 적혈구-특이적 DNA분해효소-I 과민성 부위, 및 3C에 의한 긴 범위의 프로모터 상호작용을 포함한, 다수의 인핸서의 생화학적 특징을 가졌다. 나아가, 본 발명자들은, 가이드로서 상기 DHS들을 사용하여, 이 좌를 정밀 지도 작성하여, SNP rs1424707를, 상기 형질과 가장 높게 연관된 것으로 동정할 수 있었으며, 이전에 기술된 고연관 전초 SNP들의 형질 연관을 완전히 설명할 수 있었다. 이에 더하여, rs1427407가 적혈구 전구체 내의 전사 인자 GATA1 및 TAL1에 의해 점유된 반(half)-E-박스/GATA 모티프를 방해함이 여기에 나타나 있다. 그러나, rs1427407를 조건으로 한 후에도 연관은 일배체형 효과를 가리키는 인접한 DHS들의 몇몇 다른 SNP들에 남아 있다. 각각 조절 기능을 변조하는 인접한 요소들 내에 SNP 유전자형들의 조합을 갖는 일배체형들은 BCL11A 발현의 궁극적인 형질을 부여하는데 있어서 협력함이 발견되었다. 이형접합 공여자를 사용하여, 고-HbF 관련 일배체형의 보통 정도의 영향이 TF 결합 및 BCL11A 발현 모두에서 입증되었다.
이들 연구들은 β-글로빈 장애를 갖는 환자에서의 HbF 수준의 임상적으로 의미있는 증가로 귀결할 것이 요구되는 BCL11A 발현에 있어서의 변화를 추정하는데 도움이 된다. 고-HbF rs1427407-rs7606173 T-G와 저-HbF G-C 일배체형 간의 BCL11A 발현의 차이는 1.7배이고 T-G 및 G-C 호모 접합체의 HbF 수준은 11.2% 및 4.1%였다 (도 3B 및 3C). >20%의 HbF 수준이 SCD의 악영향을 방지하는 것으로 예측되었다. BCL11A 발현에 있어서의 몇배의 감소는 아마 이 HbF 목표에 접근할 것이다.
본 연구는 적혈구 인핸서에 영향을 미치는 BCL11A에서의 조절적 변이를 동정한다. 많은 형질-연관 SNP들은 논코딩이고 비교적 작은 효과 크기를 갖는다. 이들 특징에 기인하여, 이들 SNP는 때때로 그 임상적 중요성이 무시해도 좋은 것으로 간주된다. 본 연구는 개별적 논코딩 변이형에 의해 발생하는 작은 효과 크기가 기저의 조절 요소의 큰 효과 크기를 불가능하게 하지 않음을 설명한다. 예를 들면, 기저의 유전자 타겟팅 BCL11A의 발현에 대한 기능적 SNP의 비교적 보통 정도의 영향에도 불구하고, 원인 조절 요소는 성체기 적혈구 전구체에서 BCL11A 및 글로빈 유전자의 발현에 필수적이다. 같은 조절 요소가 비-적혈구 계통에서의 BCL11A 발현에서는 없어도 된다. 보호 대립유전자(protective allele)를 연구하는 것의 목표는 위험에 빠진 개체에 있어서 이 생물 효과를 재현하려는 노력 속에서 그들의 기저의 분자 메커니즘을 이해하는 것이다. 따라서, 많은 형질-연관 다형성이, 그 기능이 단지 조절된 유전자를 동정하는 것을 넘어서 형질의 기저의 생물학을 더 조명할 수 있는, 문맥 특이적인 임계적 조절 요소에 있을 것이다(reside). 예를 들면 BCL11A의 상실은 헤모글로빈 스위칭 부전으로 귀결하면서도 신경생성(neurogeneis) 및 림프구형성 부전으로 귀결하고 배아 치사로 귀결한다. 궁극적으로는 형질의 기저의 원인 조절 요소 및 연관된 조절 네트워크를 더 잘 이해함으로써 신규한 치료 타겟을 동정할 수 있을 것이다. BCL11A의 적혈구 인핸서는, 그것을 제거하면, 비-적혈구 계통에서 BCL11A 발현을 보존하면서, 결과로서 얻어지는 HbF 탈억제에 의해 적혈구 전구체에서 BCL11A 발현을 저해할 수 있다는 점에서, 그 자체가 치료적 게놈 에디팅의 유망한 타겟이 될 수 있다.
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[표 1] DHS +62, +58, 또는 +55에서의 흔한 SNP의 연관 분석
Figure pct00001
분석에 이용가능한 CSSCD로부터의 1178개체로부터의 BCL11A DHS +62, +58, 또는 +55에서의 흔한 (MAF > 1%) SNP들의 연관 분석. DHS: DNA분해효소 1-과민성 부위, MAF: 마이너 대립유전자 빈도
[표 2] BCL11A DHS +62, +58, 또는 +55 내의 SNP들
Figure pct00002
[표 2-계속]
Figure pct00003
BCL11A DHS +62, +58, 또는 +55 내에 해당되고 dbSNP 또는 기준 집단 YRI, CEU 및 ASW에 대한 1000 게놈 데이터에 있는 SNP들. 유전자형 결정된 SNP들이 동정되고 CSSCD 내의 MAF가 기재됨. 게놈 좌표 hg19
[표 3] Sanger 재 시퀀싱에 의해 발견된 추가의 마커들
Figure pct00004
극단적 HbF 형질을 갖는 CSSCD로부터의 88 개체에 대하여 BCL11A 내의 세 DHS들의 Sanger 재 시퀀싱을 행함. 동정된 신규한 마커들을 기재함. 유전자형 결정된 SNP들이 동정되고 CSSCD 내의 MAF가 기재됨. 게놈 좌표 hg19
[표 4] 4개의 전초 SNP들의 조건부 분석
Figure pct00005
이전에 HbF 수준과 연관된 4개의 흔한 전초 SNP들{{44;20;19;36;37;515}}의 조건부 분석. CSSCD로부터의 728 개체에서 4개 모두를 유전자형 결정함. rs4671393 를 조건으로 할 때 rs766432에 대한 P를 계산할 수 없었으며(그 역도 마찬가지), 왜냐하면 이들 2개의 마커는 너무 강한 상관관계에 있기 때문임(r 2 = 0.997). rs1427407 과 rs766432 간에서 r 2 = 0.848; rs1427407 과 rs11886868 간에서 r 2 = 0.709; rs1427407 과 rs4671393 간에서 r 2 = 0.850; rs766432 과 rs11886868 간에서 r 2 = 0.761; rs11886868 과 rs4671393 간에서 r 2 = 0.758.
[표 5] 희귀 및 저-빈도 변이형 분석
Figure pct00006
희귀 및 저-빈도 변이형 분석 결과(MAF < 5%). 상기 분석은 3개의 상이한 세트로서 개별적인 DHS +62, +58, 및 +55를 사용하여 세트-기반 SKAT-O 알고리듬을 사용하여 행하였음. 맨 밑의 "all"은 3개 영역 모두가 다같이 붕괴되었을 때의 이 실험들의 결과를 나타냄.
[표 6] 에멀젼 융합 일배체형 결정 PCR 시퀀싱
Figure pct00007

rs7569946-rs1427407 일배체형의 에멀젼 융합 PCR 분석. rs7569946 과 rs1427407에 대하여 이중으로 이종접합인 세 개별적 공여자들로부터의 에멀젼에서 행한 융합 PCR로, 양 SNP 모두를 포괄하는 융합 앰플리콘을 생성함. 그 융합 앰플리콘을 클로닝하고, 개별 클론을 Sanger 시퀀싱하였음. 각 유전자형의 클론의 수를 기재함. G-T/A-G 상(phase)에 비교한 G-G/A-T에 대한 우도비를 계산함.
[표 7] 리포터 분석법을 위한 절편의 좌표
Figure pct00008

인핸서 리포터 분석법에서 클로닝된 추정 인핸서 절편들의 좌표. BCL11A TSS에 대한, 뿐만 아니라 hg19에 기재된 염색체 2 좌표.
[표 8] 올리고뉴클레오티드 서열
Figure pct00009
[표 8-계속]
Figure pct00010
[표 8-계속]
Figure pct00011
[표 8-계속]
Figure pct00012
나타낸 실험에서 사용된 올리고뉴클레오티드

Claims (19)

  1. 감소된 BCL11A mRNA 또는 단백질 발현을 갖는 전구 세포를 제조하는 방법으로서, 단리된 전구 세포를 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 (UCSC 게놈 브라우저 hg 19 인간 게놈 어셈블리에 따름)의 상기 세포의 게놈 DNA에 결합하는 물질과 접촉시키고, 그에 의해 BCL11A의 mRNA 또는 단백질 발현을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  2. 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포를 제조하는 방법으로서, 단리된 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단리된 전구 세포 또는 단리된 세포는 조혈 전구 세포인 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 조혈 전구 세포는 적혈구계통의 세포인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단리된 전구 세포 또는 단리된 세포는 유도 만능 줄기 세포인 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 조혈 전구 세포는 생체외 또는 시험관내에서 접촉시키는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 유전자 변형은 결실인 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 결실은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 간의 영역 전체를 제거하거나, 또는 하나 이상의 DNA분해효소 1-과민부위 (DNAse 1-hypersensitive site(DHS))의 방해로 귀결되는 상기 영역의 부분을 제거하는 방법.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따라 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612에 적어도 하나의 유전자 변형을 갖는 단리된 유전자 조작 인간 세포.
  10. 제9항 기재의 단리된 유전자 조작 인간 세포를 포함하는 조성물.
  11. 세포에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법으로서, 다음의 단계들을 포함하는 방법: 단리된 세포를 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 상기 세포에 비하여 상기 세포 또는 그 자손에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 단리된 세포는 조혈 전구 세포인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 조혈 전구 세포는 적혈구계통의 세포인 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 단리된 세포는 유도 만능 줄기 세포인 방법.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 조혈 전구 세포는 생체외 또는 시험관내에서 접촉시키는 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 유전자 변형은 결실인 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 결실은 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612 간의 영역 전체를 제거하거나, 또는 하나 이상의 DNA분해효소 1-과민부위 (DHS)의 방해로 귀결되는 상기 영역의 부분을 제거하는 방법.
  18. 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법으로서, 다음의 단계들을 포함하는 방법: 단리된 조혈 전구 세포를 상기 포유동물 내에서 적어도 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제 또는 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제의 코딩 서열을 운반하는 벡터를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 그에 따라 상기 DNA-타겟팅 엔도뉴클레아제가 염색체 2 위치 60,716,189-60,728,612의 상기 세포의 게놈 DNA를 절단하여 그 안에 적어도 하나의 유전자 변형을 유발하고, 그에 따라 상기 접촉 전의 발현에 비하여 상기 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것.
  19. 태아 헤모글로빈 수준의 증가를 필요로 하는 포유동물에서 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법으로서, 제9항 기재의 단리된 유전자 조작 인간 세포 또는 제10항 기재의 조성물을 상기 포유동물에게 이식하는 것을 포함하는 방법.
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