JP6535333B2 - 遺伝子発現をサイレンシングする遺伝子制御エレメントを標的とする部位特異的ヌクレアーゼ単一細胞アッセイ - Google Patents
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Description
エンハンサーは、特異的遺伝子プロモーターの活性を制御するDNAエレメントである。エンハンサーは、これが制御する遺伝子とは、長い遺伝的距離を置いて分離し得る。エンハンサーは、クロマチンループ化により標的遺伝子近傍に移動する。ゲノム規模のクロマチンインタラクトーム試験により、エンハンサー−プロモーター相互作用は浸透性であり、また長い遺伝的距離にわたる場合でもシスで、又は異なる染色体にまたがりトランスで生じ得ることが明らかになっている。
配列特異的DNA−結合タンパク質のCTCFは、遺伝子と隣接する頻度が高いコンセンサス部位(CS)と結合する。CS部位では、多重タンパク質のコヒーシン「リング様」複合体(Smc1−Smc3ヘテロ二量体、Rad21、及びScc3/SA1/SA2を含む)は、Nipblによりクロマチン上にロードされる。メディエーター複合体(30個を超えるタンパク質から構成される多重タンパク質複合体)も、ループトポロジーを安定化し、また転写開始及び伸長を制御するために、CTCF及び/又はコヒーシンが占有するクロマチンに動員することができる。
TAD内又はTAD間の界面では、染色体のループ化は、同時制御された遺伝子を近傍に移動させて染色体接触を可能にし得る。このような相互作用は、多重遺伝子複合体又は転写因子と呼ばれてきた活性高リン酸化RNA Pol IIの個々のフォーカスにおいて生ずるとの提案がなされている。
プールされたドナー(Lonza社)に由来する初期継代HUVECを、サプリメント(Lonza社)を含む血管内皮基礎培地−2(EGM−2)内で約80%のコンフルエンスまで増殖させ、EGM−2+0.5%FBS中で血清を欠乏させ(18時間)、そしてTNFα(10ng/ml;Sigma社)で最長30分間処理した。トランスフェクション前に、細胞を、抗生物質を含まないEGM−2中で増殖させた。
Bogdanove laboratoryにより開発されたソフトウェア(https://talent.cac.cornell.edu)を、TALEN候補結合部位を同定するのに用いた(Doyleら、2012年)。20bpの配列を標的とする、左側及び右側TALENを、18個の完全モノマーリピートを含むように設計したが、この場合、最初と最後の塩基は、N末端チミン及び0.5リピートによりそれぞれ規定される。FokI二量化を促進するために、左側及び右側TALEN標的部位を、16〜19bpのスペーサーを用いて選択した。pDT TALENベクターでは、SAMD4Aの左側及び右側のアームをpBI_CMV1双方向プロモーターベクター(Clontech社)にクローン化した。左側TALENを、pBI_CMV1のMCS1(Mlu及びHindIII)にクローン化し、また右側TALEを、pBI_CMV1のMCS2(EcoRI及びBg/II)にクローン化した。
SAMD4A TALEN認識配列(pcDNA及びpDTベクターの両方)は:左側TALEN 5’−TCC ACG TTT ATA AAT AGC TG−3’(配列番号:1)、及び右側TALEN 5’−CAC TGG GGT GTG GAA GCA TA−3’(配列番号:2)であり、16bpのスペーサーを含む。TNFAIP2 TALEN認識配列は:左側TALEN 5’−TTC GCG GCC CAC CTG GCC GC−3’(配列番号:3)、及び右側TALEN 5’−CTG TGC GAG CGC GAC ACC TA−3’(配列番号:4)であり、16bpのスペーサーを含む。SLC6A5 TALEN認識配列は:左側TALEN 5’−TTG TCC CTT TAA AAC TTG AA−3’(配列番号:5)、及び右側TALEN 5’−TTA TCA AAC TTG TAT TAT CA−3’(配列番号:6)であり、17bpのスペーサーを含む。BMP4 TALEN認識配列は:左側TALEN 5’−TGC AGC GCC ACA GTC CCC GG−3’(配列番号:7)、及び右側TALEN 5’−CAA CCG TTC AGA GGT CCC CAG−3’(配列番号:8)であり、19bpのスペーサーを含む。
TALENを、Sanjanaら、2012年によるプロトコールを用いて生成した。要するに、適するアダプターを付加するために、特異的プライマーを用いて4つのプラスミドそれぞれに由来するモノマーを増幅した(各プラスミドは1つのRVDに対応する;NI=A、HD=C、NG=T、及びNN=A/G)。次に、PCRにより生成したモノマーをゲル抽出により精製し、そしてモノマーライブラリを作成するためにDNA濃度を標準化した。最初のゴールデンゲート反応ステップでは、IIS型制限酵素BsmBIを用いてモノマーを同時消化し、そしてライゲートして環状化六量体を生成させた。非六量体をエキソヌクレアーゼ処理により除去した。次に、六量体をPCRにより増幅し、ゲル精製し、そしてサンプル間のDNA濃度を、Qubit高感度DNA定量キット(Life Technologies社)を用いて標準化した。第2のゴールデンゲートステップでは、BsaIを用いて六量体を同時消化し、そして適するTALENクローニング骨格にライゲートして(0.5リピートの標的となる4つの異なる塩基の1つに対応する)、最終TALEN発現構築物を生成させた。TALENクローンの成否を確認するために、コロニーPCRを大腸菌形質転換体に用いた。次に、Neon(登録商標)トランスフェクションシステム(Life Technologies社)を用いて、製造業者の説明書に従い、HUVECを各TALENと共にマイクロポレーションした。ヌクレアーゼ活性を、サーベイヤーアッセイ、及びH2A.X免疫蛍光検査法により評価されるDNA FISHと二本鎖切断との一貫した同時局在により評価した(Keoghら、2005年)。
トランスフェクトされた細胞のゲノムDNAを、QuickExtract DNA抽出溶液(Epicenter社)を用いて抽出した。ヒトSAMD4A、TNFAIP2、SLC6A5、又はBMP4内のヌクレアーゼ標的部位を含むゲノム領域をPCR増幅し、そしてアンプリコンをQIAquick PCR精製キット(Qiagen社)で洗浄した。SAMD4Aの場合、プライマーは、5’−TGA GGG AGA TTC CAT TGA GC−3’(配列番号:9)、及び5’−GGA AAA AGT GCT GCT CCA AC−3’(配列番号:10)であった。TNFAIP2の場合、プライマーは、5’−TGC AGG ACA GAC TCA GGA CA−3’(配列番号:11)、及び5’−ATT TGG GTT GAG CAT TCC AC−3’(配列番号:12)であった。SLC6A5の場合、プライマーは、5’−TGA TTT AAC CCC CTC CTT CC−3’(配列番号:13)、及び5’−CTT TAG GAG CCA CAG CCA AC−3’(配列番号:14)であった。BMP4の場合、プライマーは、5’−CTA GTA CCT CCG CAC GTG GT−3’(配列番号:15)、及び5’−TCC AGC ACC ACT ATT GGA AA−3’(配列番号:16)であった。次に、DNAフラグメントを、ミスマッチ感受性T7エンドヌクレアーゼI(T7E1;New England BioLabs社)で消化した。T7E1アッセイの場合、DNAを95℃で5分間変性し、室温までゆっくりと冷却してヘテロ二本鎖DNAの形成を可能にし、5UのT7E1により、37℃で1時間処理し、次に1.2%アガロースゲル電気泳動により分析した。
RNA FISHを、Rajら、2008年によるプロトコールに基づき、下記の遺伝子を標的とする48 20−merプローブ(Biosearch社)を用いて実施した:SAMD4A(プローブセットi=イントロン1に約1.5kbp、プローブセットii=イントロン1に約34kbp、TNFAIP2(イントロン2)、SLC6A5(イントロン1)、RCOR1(イントロン1)、及びeGFPを標的とする32 20−merプローブ(表1)。各20−merは、3’−アミノ−修飾因子C6−dTを露出する。アミノ基は、その後下記のNHS−エステル色素に結合させた:ATTO−488、ATTO−565、ATTO−647N(ATTO−TEC)、又はAlexa Fluor 647(Invitrogen社)。要するに、オリゴヌクレオチドプローブを、エタノール沈殿処理し、そして0.1Mテトラホウ酸ナトリウム(Sigma社)中で再懸濁した。約0.3mgのNHS−エステル色素(ATTO−TEC)を、ジメチルスルホキシド(Sigma社)に溶解した。色素溶液を、プローブ溶液に添加し、そして37℃にて、遮光、オーバーナイトでインキュベーションした。コンジュゲーション反応の後、プローブをオーバーナイトでエタノール沈殿処理し、そして0.1Mトリエチルアンモニウム(TEA、Sigma社)中で再懸濁した。色素結合したプローブに富むように、C18カラムにて、逆相HPLCにより、結合させたプローブを分離及び精製した。
実験毎に、カバーガラス上の初期継代HUVECを約80%コンフルエンスまで増殖させ、TNFαで処理し、3.7%ホルムアルデヒド内で室温にて10分間固定化し、次にPBSで3回洗浄した。細胞を、氷冷90%メタノール中で10分間、透過性化処理し、次にPBSで2回洗浄し、そしてオービタルシェーカー上、ブロッキングバッファー(1%BSA/PBS)中で30分間、室温にてインキュベーションした。次に、細胞を、1°抗体溶液(1%BSA/PBSで稀釈)中で1時間インキュベーションした。二本鎖切断を、ウサギポリクロナール抗ホスホ−ヒストンH2A/X(Ser139)(Sigma社)で検出した。ヤギポリクロナール抗SAMD4A C−15(SantaCruz社)、マウスモノクロナール抗TNFAIP2 F−6(SantaCruz社)、及びヤギポリクロナール抗−SLC6A5/GLYT2 N−20(SantaCruz社)を、SAMD4A、TNFAIP2、及びSLC6A5タンパク質をそれぞれ検出するのに用いた。次に、Atto−488又はAtto−565に結合した二次抗体と共に1時間インキュベーションした後、カバーガラスを洗浄バッファー(0.05%ツイーン−20/PBS)で5回洗浄した。次に、洗浄バッファー(0.05%ツイーン−20/PBS)でカバーガラスを5回洗浄し、そして3.7%ホルムアルデヒド/PBSで10分間、室温にて事後固定化し、その後70%エタノール中、オーバーナイトにて更に透過化処理した。RNA FISH検出の場合、カバーガラスをPBSで2回洗浄し、そして洗浄バッファー(10%ホルムアミド、2×SCC−1×SCCは、0.15M NaCl+0.015Mクエン酸ナトリウム)中で5分間インキュベーションした。次に、細胞を、加湿チャンバー内、37℃、オーバーナイトにて、単一分子FISHプローブ、50ngと混合したHybバッファー(10%デキストラン硫酸塩、1μg/μl大腸菌tRNA、2mMバナジルリボヌクレオシド複合体、0.02%RNAseを含まないBSA、10%ホルムアミド)、50μl中でハイブリダイズした。次に、カバーガラスを、洗浄バッファー(10%ホルムアミド、2×SCC)中で3回(オービタルシェーカー上で各30分間)洗浄した。次に、細胞を平衡バッファー(0.4%グルコース、2×SCC)中で5分間インキュベーションし、1μg/mlのDAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール;Life Technologies社)で対比染色した。カバーガラスをgloxバッファー(3.7μg/μlのグルコースオキシダーゼ、1Uカタラーゼ)中にマウントし、そして画像化した。
細胞を100×のN.A.1.49 Nikon Apochromat TIRF油浸対物レンズを用いて、特別に構成されたNikon Ti Eclipse広視野TIRF顕微鏡上で画像化した。−80℃に冷却したAndor iXion897 EMCCDカメラを用いて、照明に水銀ランプを採用し、蛍光チャンネル毎に、低カメラゲインにふさわしいフィルターセットを通して画像化を実施した。μmanagerオープンソース顕微鏡マネジメントソフトウェア(NIH及びUCSF、米国)を用いて顕微鏡を制御した。DAPIについて、露出時間20msを用いた。その他の色素の場合、露出時間は200〜500msの範囲であった。軸平面内の2〜10μmの範囲において、サンプルを通過し、多重焦点面上で取得された一連の画像として、各視野を撮影した。0.2μmピエゾステップサイズを、これらのz−スタックについて用いた。画像撮影する前に、Focal Check Fluorescent Microsphere(Molecular Probes社)のアライメントにより色収差を検証した。シグナル強度を、Fijiを用いて測定した。表示画像のコントラストは、16ビットグレースケールに当て嵌めて調整した。同一カバーガラス上の異なる視野間の比較をしやすくするために、IDV数値を、蛍光ビーズ強度と比較して標準化した。
DNA FISHプローブを、2つの方法のうちの1つを用いて構築した。第1の方法では、BACクローンRP11−299D5(SAMD4A)、RP11−1102D6(TNFAIP2)、及びRP11−207A15(SLC6A5)(Empire Genomics社)からプローブを構築した。FISH Tag DNA Multicolorキット(Molecular Probes社)を用い、これらのクローンをニックトランスレーションしてアミノアリル−dUTPを組み込み、その後、アミン修飾DNAの色素標識を行った。Alexa Fluor 488、555、又は647色素を組み込んだ。あるいは、「高精細」FISHプローブを構築するのに、PCRに基づくプロトコールに従った(Bienkoら、2012年)。van Oudenaarden FISHプローブデータベースから得られた20組のPCRプライマーを用いて、ゲノムDNAから各遺伝子座を増幅した(表2;www.hdfish.eu)。増幅したDNAをプール、精製し、そしてFISHBright核酸標識キット(Kreatech社)を用いて、蛍光色素(FISHBright 495、550、又は647)で標識した。
免疫蛍光検査法を上記の通り実施し、また3.7%ホルムアルデヒド/PBSで20分間、室温にて細胞を事後固定化した。DNA FISHハイブリダイゼーションを、以下の通り実施した。細胞を、PBS中で2回、各5分間洗浄し、そして0.5%トリトンX−100中で10分間透過化処理した。2×SCCに溶解した10UのRNAseAにより、37℃にて、1時間細胞を処理した。次に、細胞を2×SSCで2回洗浄し、そして70%、85%、及び100%エタノール中で各2分間脱水した。空気乾燥後、70%ホルムアミド、2×SCC中で、3分間、73℃にて細胞を変性し、そして氷冷した70%、85%、及び100%エタノール中で各2分間脱水した。次に、加湿チャンバー内で、72℃にて5分間新たに変性し、氷上で冷却したDNA FISHプローブ、30ngと混合したHybバッファー(10%デキストラン硫酸、50%ホルムアミド、4×SSC)、10μl中、オーバーナイト、37℃にて細胞をハイブリダイズした。次に、カバーガラスを以下の3つの洗浄バッファーそれぞれで3回洗浄した(オービタルシェーカー上で各5分間)−1)50%ホルムアミド、2×SCC、2)1×SSC、及び3)4×SSC、0.01%ツイーン20。細胞をDAPIで対比染色し、gloxバッファー(3.7μg/μlのグルコースオキシダーゼ、1Uカタラーゼ)中にマウントし、そして画像化した。
修復構築物pCR−SAMD4A−IRES−GFPは、それぞれ564bp及び563bpからなるSAMD4Aの5’側イントロン1、及びSAMD4Aの3’側イントロン1の2つのセグメントを含み、同セグメントは、SAMD4Aイントロン1 TALEN切断部位のいずれかの側の領域と相同である。セグメントSAMD4Aの5’側イントロン1は、3’スプライスアクセプター部位、及び哺乳動物発現ベクターpCI−neo(Promega社、WI、米国)で用いられる修飾型キメライントロンに由来する52bpの3’イントロン配列を含む。同様に、セグメントSAMD4Aの3’側イントロン1は、5’スプライスドナー部位、及び哺乳動物発現ベクターpCI−neo(Promega社、WI、米国)で用いられる修飾型キメライントロンに由来する52bpの5’イントロン配列を含む。得られた人工的なエクソンはIRES−GFPカセットを含み、修復(相同組換え)及びスプライシングの後に、SAMD4Aプロモーターの独立したin situ GFP発現を可能にする。564bpの5’側SAMD4Aフラグメントを増幅するのに用いられるプライマーは、以下の通りである:SAMD4Aの5’側イントロンF:5’−TGC TGC TGC AGG AGG GTG−3’(配列番号:17);SAMD4Aの5’側イントロンR:5’−GAT CGC TAG CAC CTG TGG AGA GAA AGG CAA AGT GGA TGT CAG TAA GAC CAA TAG GTG CCT ATC ATG GCC CTC CAG CTA TTT ATA AAC GTG−3’(配列番号:18)(太字(下線部最初の2文字CT)=スプライスアクセプター部位;下線部=pCI−neoに由来する修飾されたキメライントロン[Promega社]からのイントロン伸長)。563bpの3’側SAMD4Aフラグメントを増幅するのに用いられるプライマーは以下の通りである:SAMD4Aの3’側イントロンF:5’−GAT CGC TAG CAG GTA AGT ATC AAG GTT ACA AGA CAG GTT TAA GGA GAC CAA TAG AAA CTG GGG CCT CCT TCA CTG GGG TGT G−3’(配列番号:19)(太字(下線部最初の2文字GT)=スプライスドナー部位;下線部=pCI−neo[Promega社]に由来する修飾されたキメライントロンからのイントロン伸長);SAMD4Aの3’側イントロンR:5’−CTT TTG TAT ATC TAC ATC ATT TAG CAG CAT G−3’(配列番号:20)。両方のアンプリコンをNheI(NEB)で消化し、そしてライゲートした。完全長ライゲート後産物を、プライマー、SAMD4Aの5’側イントロンF及びSAMD4Aの3’側イントロンRを用いてPCRにより選択し、そしてTAベクターpCR.2.1(Invitrogen社)にクローン化して、pCR−SAMD4A−5/3を生成した。(HCV)IRES−GFP配列をpHIV7−IRES−GFPから増幅し(John Rossiから贈与)、そしてpCR−SAMD4A−5/3のNheI部位にクローン化して、pCR−SAMD4A−IRES−GFPを生成した。増幅で用いたプライマーは以下を含む:IRES F:5’−GAT CGC TAG CCC CCC TAA CGT TAC TGG CCG−3’(配列番号:21)、及びGFP R:5’−GAT CGC TAG CGG ATC CTC ACT TGT ACA GCT CGT CCA TGC C−3’(配列番号NO:22)。20及び18bpの相同アームを内包する二本鎖PCR産物を生成するために、下記のプライマーを用いた:5’−CCA CAC CCC AGT GAA GGA G−3’(配列番号:23)、及び5’−TAA ATA GCT GGA GGG CCA TG−3’(配列番号:24)。PCR産物を、トランスフェクション前に、QIAquick PCR精製キット(Qiagen社)により精製した。
TNFαは、初期継代のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)において、幅広く異なる多重遺伝子複合体の形成を系統的に誘発することにより、急速かつ同期的に転写応答を形作ることが明らかにされている(Papantonisら、2012年)。TNFα誘発型多重遺伝子複合体内の相互作用性遺伝子は、NF−κBにより活性化される(Papantonisら、2010年)。SAMD4A、TNFAIP2、及びSLC6A5遺伝子は、NF−κB依存性多重遺伝子複合体内で連携しているが(図4)、同複合体は、3C、4C(3C capture−on−chip)により、マイクロアレイ及びFISHを駆使して幅広く特徴付けられており、したがって染色体接触が同時転写において単一細胞レベルで演ずる役割を調べるのに理想的なモデルである(Papantonisら、2010年;Papantonisら、2012年)。血清を枯渇させることにより、HUVECを細胞周期のG0相において捕捉した。重要なこととして、SAMD4A、TNFAIP2、及びSLC6A5の転写は、TNFα刺激後10分間で急速に誘発される(図5;Papantonisら、2010年)。10分におけるそれらの発現と同時に、本発明者ら独自のデータ(データは示さない)を含む3C前のデータ(Papantonisら、2010年)は、このような遺伝子間の染色体接触が、TSSの下流約1.5kbpの部位において生ずることを示唆する(図5)。このような接触の形成が、同時転写と関連するか調べる目的で、本発明者らは、このような接触がTNFα処理後10分で生ずるイントロン部位を標的とするRNA FISHプローブを設計した(図5)。このイントロンは一般的にスプライスされ、また同時転写的に分解されるので、このようなプローブは、転写開始部位(TSS)を標識する。一連の遺伝子特異的RNA FISHイントロンプローブそれぞれを、スペクトル的に異なる蛍光体に結合させた。3つのNF−κB制御型遺伝子についてRNA FISHを同時に実施することにより、本発明者らは、細胞母集団全体にわたり、このような相互作用の頻度を調査することができた。過去の試験成績(Papantonisら、2010年、Papantonisら、2012年)と一致して、RNA FISHフォーカスの重なりに関する解析により、同時局在化したフォーカスは、全母集団に含まれるすべての対立遺伝子の一部(約5%)にしか認められないことが判明した(図5)。転写された遺伝子間の染色体相互作用は、活性なRNA Pol IIの個々のフォーカス、並びに核スペックルにおいて生ずることが明らかとなった。SAMD4A、TNFAIP2、及び/又はSLC6A5 RNA FISHのフォーカスを重ね合わせると、活性な、不安定形態のRNA Pol II(セリン5でリン酸化されている)と一様に同時局在している(図6)。全体として、これらのデータから、RNA pol IIフォーカスにおけるこのような遺伝子の同時転写は、HUVEC母集団のごく一部で生ずるに過ぎない可能性があることが示唆される。初代細胞内の染色体は、核内で異なるテリトリーを占める。HUVECは初代細胞なので、これは、TNFα処理前後のいずれにおいても、2つの空間的に異なるDNA FISHフォーカスを常に示す(図7)。テリトリー内では、染色体はトポロジー関連ドメイン(TAD)に更に分割される。この区分化の結果、多重遺伝子複合体内の相互作用性遺伝子は、かなり小さなゲノム的に近接した部位内に閉じ込められ得る。これら3つの同時制御された遺伝子についてDNA FISHを同時に実施することにより、本発明者らは、これら3つの遺伝子のDNAが、TNFαによる活性化前に近接した状態にあるか調査することができた。興味深いことに、DNA FISHフォーカスを重ね合わせ、これを解析すると、TNFαで刺激されない、及びTNFαで処理されたHUVEC母集団の両方において、フォーカスの近接が明らかになった(図8)。このデータから、HUVEC母集団の一部分においては、SAMD4A、TNFAIP2、及びSLC6A5遺伝子のDNAは、TNFα誘発前はTAD内に閉じ込められ得ることが示唆される。
染色体接触に依存する階層的制御は、GREB1多重遺伝子複合体において判明した(Liら、2012年)。qPCR解析から、ERαを標的とするsiRNAは、GREB1転写を破綻させただけでなく、相互作用性メンバーの転写を2〜4分の1以下に低下させるのに十分であることが明らかにされた。これら3遺伝子はNF−κBにより転写的に活性化されるので、siRNAアプローチは、TNFα誘発型の多重遺伝子複合体に適用できない(Papantonisら、2010年)。このような目的で、本発明者らは、染色体接触部位において個々の遺伝子ループを個別に破断できるようにする単一細胞アッセイを開発した(図5)。並行して、同一の多重遺伝子複合体における同時転写について、個々の単一遺伝子ループの役割を解読するために、本発明者らは、多重遺伝子複合体内のその他の遺伝子の転写活性を、高感度RNA FISHを用いて可視化した(図5)。本発明者らは、ザントモナス種(Xanthomonas sp.)のTALエフェクターに由来する直交型及び強化型の、十分に立証されたゲノム編集ツールである、TALENに基づく独自の顕微鏡検査式アッセイを構築した(Christianら、2010年、Liら、2011年)。TALE構造内では、セントラルリピートドメインが、高度に特異的なDNA認識を媒介する(Bochら、2009年;Christianら、2010年)。このドメインをFokIエンドヌクレアーゼに融合させると、TALENが部位特異的二本鎖切断(DSB)を誘発できるようになる(Christianら、2010年、Liら、2011年)。この試験で用いられるTALENは、TNFα処理後10分で生ずる染色体接触の推定部位においてDSBを誘発するので(図11)、本発明者らは、ループ媒介型の接触が同時転写に必要とされるのであれば、DSBは、これら遺伝子間の染色体接触を破綻させるように働くはずである、と推論した。TALENが遺伝子ループ破綻に成功したか確認するために、本発明者らは、ヒストン変異体H2A.Xを用いて、DSBの誘発について染色を行った(図12及び13)。DNA破断後数分以内に、Ser139において迅速にリン酸化すると、このような修飾は、DNA修復プロセスの全体を通じて持続する。本発明者らのTALENシステム、及びその単一遺伝子ループを破断させる能力、及び同時に生ずる多重遺伝子複合体のアセンブリについて、最初に試験するために、本発明者らは、多重遺伝子複合体SAMD4A中で最長遺伝子の遺伝子ループを破断することが可能であった本発明者らのTALENベクターを、高効率マイクロポレーションにより、HUVECに導入した。TALEN活性のタイムコースを(またトランスフェクション有効性の指標も)、慎重に設定するために、本発明者らはDSBのH2A.X染色を用いたが、但しヌクレアーゼ活性は約6時間後に初めて明白となり、約48時間まで持続したことに留意されたい(図14)。本発明者らは、24時間後にヌクレアーゼ活性をアッセイする方法を選択するが、それはこの時点では高レベルのDSBが存在し、また細胞毒性レベルも低いためである。トランスフェクション後24時間で、個々のH2A.Xリン酸化部位は、細胞の約60%において明白であったが、これらの細胞のより多くの割合が単一対立遺伝子DSBを示し、二重対立遺伝子DSBを示した細胞はより少なかった(図13)。SAMD4A TALENの特異性が高いことは、DNA FISHにより可視化されるSAMD4A DNAとDSBとの一貫した同時局在により実証された(図15)。TALEN切断の有効性は、「サーベイヤーアッセイ」の結果により更に裏付けられた(図16、21、32、及び42)。したがって、本発明者らは、単一細胞レベルで、その本来の環境において、SAMD4A遺伝子ループの破断について一義的にアッセイすることができた。
TNFαにより刺激を与えると、RNA pol IIはSAMD4Aプロモーターと関係するようになり、遺伝子下流に伝播する転写の波を引き起こす契機となる。アレイ解析法を駆使するRNA FISHでは、転写サイクルには約85分かかることが判明した(Papantonisら、2010年)。したがって、TSSの下流約1.5kbpが転写されたRNAは、TNFα刺激後10分以内(プローブセットi、図17)、及びイントロン1への約34kbpは、30分後に現れる(プローブセットii、図18)。重要なこととして、SAMD4A TALENにより誘発されたDSBは、異なるセットのイントロンRNA FISHプローブが結合するこれら2つの領域の間の部位において生ずる。HUVECを、SAMD4A TALENで24時間二重トランスフェクトし、そしてTNFαに10分間曝露した。この反復性のSAMD4A転写活性は、SAMD4Aの最初の約1.5kbについて転写を可能にする。TNFα刺激後10分で生ずるイントロンRNA転写をモニタリングするRNA FISHを用いることにより、SAMD4A転写は重複部又はDSB近傍において高頻度に検出された(約42%)(図17)。したがって、これらのデータから、SAMD4A遺伝子ループを破綻させたにもかかわらず、DSBは、RNA Pol IIがSAMD4Aプロモーターにアクセスし、転写開始及びDSBまでの伸長を可能にする能力に影響を及ぼすようには見えないことが示唆される。10分の時点で転写されたSAMD4AイントロンRNA転写物の半減期は、3〜6分である。したがって、10分の時点でTSSの下流において転写されたRNA転写物は、30分経過時点までに分解された。異なる実験では、SAMD4Aの最初の約34kbpについて転写が可能となるように、二重トランスフェクトされたHUVECをTNFαで30分間刺激した(図18)。特に、SAMD4Aのイントロン領域の転写は、DSBより先では明白ではなかったので、TALEN誘発型の撹乱は、この領域におけるSAMD4Aの転写を抑制することができる(図18)。
本発明のTALENアッセイが、染色体接触に関与する部位において、SAMD4Aを個別に破断可能であったことに満足して、本発明者らは重要な修正を加えてこれまでの実験を繰り返した:本発明者らは、破断したSAMD4Aの領域と共に、染色体内及び染色体間において関与する2つのその他の相互作用性遺伝子の転写を視覚化するために、RNA FISHを用いた。SAMD4A遺伝子ループの破断、並びにこの多重遺伝子複合体の追加メンバーに関する転写を同時にモニタリングすることにより、本発明者らは、複合体の2つのその他のメンバーの転写状態に対する破断したSAMD4A遺伝子ループの効果を個別に調べることができた。
遺伝子ループトポロジー及び染色体接触の完全性が、同時転写にとって不可欠であるならば、染色体接触を復元すれば、多重遺伝子複合体内の相互作用性遺伝子の転写が修復されると、本発明者らは仮定した。DSBは、2つの高度に保存された機構によりほとんどの細胞で一般的に修復される:迅速であるが間違いを起こしやすい非相同末端結合(NHEJ)、又はより低速であるが、極めて正確な相同性指向型修復(HDR)。エクソンeGFP配列をSAMD4Aのイントロン1に挿入することにより、HDRを利用してSAMD4A遺伝子ループの完全性を修復するために、本発明者らは、SAMD4A TALENの標的部位に及ぶように設計された修復構築物を作製した(図44)。本発明者らは、修復構築物の同時転写スプライシング及び独立した翻訳を促進するために、内部リボソームエントリー配列(IRES)、並びにIRES−eGFPに隣接するスプライス部位を含めた(図44)。修復されたら、SAMD4Aの活性化を通じて、TNFαによる刺激はSAMD4A/IRES−eGFP転写を誘発することができる。本発明者らは、TNFα処理に関するタイムコースを設定するために、eGFP陽性細胞の同定を利用した。HDRは稀なため、またIRES−eGFPは、内因性のSAMD4Aプロモーターの制御下にあるので、本発明者らは修復の効率を高める努力を行った。DSB誘発プロセス全体を通じて、左側及び右側の両方について等モル量のTALENが同一細胞内で合成されることを保証するために、本発明者らは、TALENの両標的化アームを単一の双方向プロモータープラスミドと合体させることができる新規の双方向TALENシステムを構築した(pDT;図45)。eGFPシグナルが欠損していることから立証されるように、pDT及び修復プラスミドで二重トランスフェクトしたHUVECでは、トランスフェクトされた細胞内の修復効率は不十分であることが実証された(データは示さない)。修復構築物を改変するために、本発明者らは、IRES−eGFP配列を関連する隣接スプライス部位と共に増幅し、また短尺の5’側20bp及び3’側18bpの相同伸長をSAMD4A DSBのいずれかの側に含めて、効率的なHDRを誘発した(図45)。特に、eGFPタンパク質シグナルが、pDTプラスミド及びPCR産物で72時間二重トランスフェクトし、TNFαで24時間刺激したHUVECの約1%に認められた(図45)。しかし、HDRが奏功した後に限り生じ得るeGFP mRNA転写物は、母集団に含まれる細胞の約10%に認められた(図46及び47)。特に、eGFP陽性又は「緑色」細胞は、多数のRNA FISHフォーカスと一致した(図46及び47)。SAMD4Aプロモーターは、IRES−eGFP mRNAを恒常的に発現しないので、母集団に含まれるごく少数の細胞が十分量のIRES−eGFP mRNAを転写して、「緑色」細胞の検出を可能にするというのは合理的である。したがって、IRES−eGFP mRNAの検出は、奏功性のHDRを同定するより高感度のアプローチであり、また修復された遺伝子ループの影響を調べるのに用いられた。
修復実験は十分に機能的であったことに満足して、本発明者らは、接触の再構築が、相互作用性遺伝子の転写を修復するのに十分であったか調査する努力を行った。本発明者らは、HUVECをTNFαで20分間刺激し、SAMD4A及びIRESeGFPの最初の約1.5kbpの転写を繰り返した。本発明者らは、eGFPのRNAに結合するRNA FISHプローブを用いてeGFPの転写を検出し(図46及び47)、またeGFP転写位置を多重遺伝子複合体のメンバーと関連付けた。顕著なeGFPフォーカスが、トランスフェクトされた細胞の約10%で明白であり、またこれらのフォーカスは、SAMD4AイントロンmRNAと重複した(図48)。本発明者らがHDR媒介型修復に成功した事例では、正常なTNFα誘発型転写応答と比較して、TNFAIP2及びSLC6A5のいずれかの転写について何ら変化を認めなかった(図49)。更に、修復された細胞及び模擬的なトランスフェクト細胞において、eGFP/SAMD4A、TNFAIP2、及びSLC6A5の間の同時局在頻度に有意差は認められなかった(図49)。この結果から、インタクトなSAMD4Aループを配列に依存しない様式で再構築すれば、このような多重遺伝子複合体内の染色体接触並びにTNFAIP2及びSLC6A5の転写が修復されることが示唆される。
最近、Hi−C試験により、炎症促進性ケモカインCC Chr.17(CCL2、CCL7、CCL11)、及びCXC Chr.4(IL8、CXCL1、CXCL3、CXCL2)は、TADに組織化され、また染色体接触に関与することが明らかにされた。
主要な炎症促進性サイトカインであるTNFαは、NF−κB依存性多重遺伝子複合体内の同時制御された遺伝子の協調的なアセンブリを誘発する刺激剤である(Papantonisら、2012年)。14番染色体上の約221Kbの遺伝子、SAMD4Aは、主要なヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)において、TNFαにより急速にスイッチオンとなる。4C解析より、TNFα刺激前には、SAMD4Aは、その他の遺伝子とほとんど相互作用しないことが明白である。
CTCFは、遺伝子と隣接する頻度が高いコンセンサス部位と結合する。TNFAIP2は、14番染色体上の約11Kbの遺伝子であり、これにCTCFコンセンサス結合部位が隣接する。本発明者らは、CRISPRを用いて、CTCFコンセンサス結合部位内の部位を個別に撹乱した(図53)。本発明者らは、DSBで3’CTCF結合部位を撹乱すると、TNFAIP2の発現がサイレンシングされることを認めた。
ここで、本発明者らは、染色体接触に関与する遺伝子ループ内の部位を破綻させると、多重遺伝子複合体内の相互作用性遺伝子の転写に有意な影響を及ぼすことを明らかにする。本発明者らは、クロマチンループ内で個別に撹乱できるようにする新規の単一細胞戦略を実行することにより、このレベルの遺伝子制御を明らかにした。この制御に関する最初のエビデンスは、TNFα誘発に対するこれら3遺伝子の階層的転写応答に関する本発明者らの単一細胞に基づく観察所見であった(図9)。非対称性の転写応答が明確であるにも関わらず、RNA FISHフォーカスの同時局在は、母集団のサブセットにのみ認められた(図5)。染色体接触と多重遺伝子複合の相互作用性メンバーにおける同時転写との間の機能的関連性が不透明のままである。しかし、ループ媒介型接触が、確かに同時転写の前提条件であるならば、RNA FISHの同時局在データは、母集団内の特定の細胞のみが、その染色体について正しい空間的配置を有し、かかる制御を可能にし得ることを示唆する(図5)。かかる多様な遺伝子発現は、哺乳動物染色体テリトリー内の高度に保存されたコンパートメントであるTADで生ずることが示唆される(Dixonら、2012年)。本発明者らは、TADは、ロングレンジの相互作用を可能にするエリアに、SAMD4A、TNFAIP2、及びSLC6A5の遺伝子を閉じ込めることにより、これらの強固な遺伝子の制御を保証し得ると推測する(図50)。確かに、刺激を受けないHUVECにおけるDNAの解析により、遺伝子の遠位側の位置を占めるにもかかわらず、一部のHUVEC母集団においては、SAMD4A、TNFAIP2、及びSLC6A5のDNAは、TNFαによる誘発前では近接していることが判明した(図8)。これらの「ジャックポット」細胞における染色体相互作用の富化は、SAMD4A、TNFAIP2、及びSLC6A5遺伝子の階層的発現に寄与する可能性がある。しかし、現在の生化学的技法及び画像化技術は、これら遺伝子間のループ媒介型同時転写は、このような「ジャックポット」細胞においてのみ生じ得るか、あるいは、もっと時間が経てば、これらの染色体相互作用は、母集団全体にわたりほとんどの細胞で生じ得るのか、それを調べるための時間的及び空間的な分解能を欠いている。
参考文献
Claims (22)
- 単一細胞レベルでの遺伝子発現をサイレンシングする方法であって、
(i)染色体接触に関与するDNAの領域において部位特異的な二本鎖切断を誘発することにより、細胞内の少なくとも1つの染色体接触を撹乱するステップと、
(ii)少なくとも1つの二本鎖切断部位を検出するステップと、
(iii)少なくとも1つの対象遺伝子の転写活性に対する少なくとも1つの撹乱の効果を検出するステップと
を含み、
前記撹乱の効果が、対象遺伝子の転写活性の抑制であり、前記部位特異的な二本鎖切断は、対象遺伝子、或いは、対象遺伝子のエンハンサー又はプロモーターに含まれない、方法。 - 少なくとも1つの対象遺伝子の転写活性が、
(i)DNAの領域に結合したときに少なくとも1つの染色体接触を妨害する、二本鎖切断の修復プロセスに関わるタンパク質の動員、
(ii)染色体接触に関与する遺伝子ループの能力低下を引き起こす、二本鎖切断を含有するDNAの領域の移動性の増強、及び
(iii)染色体接触の抑制を引き起こす、遺伝子ループの構造的完全性の喪失
からなる群から選択される機構により抑制され得る、請求項1に記載の方法。 - 少なくとも1つの染色体接触が、遺伝子間接触、遺伝子内接触、又は両方であり得る、請求項1又は2に記載の方法。
- 撹乱されたDNAの領域が、(i)染色体内又は染色体間の接触に関与するDNAループ内の部位、並びに(ii)ループ構造を決定するDNAループ内の制御部位からなる群から選択される遺伝子又は制御エレメントを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの染色体接触が、染色体間、染色体内、又は両方に位置するDNAの間にある、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖切断が、部位特異的ヌクレアーゼにより誘発される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 部位特異的ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼ、BUD1ヌクレアーゼ、及びCrispRヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 部位特異的ヌクレアーゼが、部位特異的ヌクレアーゼをコードするベクターを用いた細胞のトランスフェクションにより細胞に送達され、部位特異的ヌクレアーゼが細胞内で内因的に発現され、又は部位特異的ヌクレアーゼが外因的に発現され、その結果細胞に送達される、請求項6又は7に記載の方法。
- 二本鎖切断が、細胞の修復プロセスに関わるタンパク質の免疫蛍光染色により、又は細胞の修復プロセスに関わる、蛍光標識を発現する組換えタンパク質の場所を検出することにより検出される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 対象遺伝子の転写活性に対する二本鎖切断の効果が、RNA蛍光in situハイブリダイゼーション、生RNA蛍光in situハイブリダイゼーション、免疫金標識、分子ビーコン、及びMS2タギングからなる群から選択される方法を用いて検出される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、真核細胞又は原核細胞である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞内の少なくとも1つの対象遺伝子の転写活性に対する染色体接触の効果を決定する単一細胞アッセイキットであって、
(i)細胞内の染色体接触に関わるDNAの少なくとも1つの領域内に二本鎖切断を誘発する少なくとも1つの部位特異的ヌクレアーゼであって、前記部位特異的な二本鎖切断は、対象遺伝子、或いは、対象遺伝子のエンハンサー又はプロモーターに含まれない、前記部位特異的ヌクレアーゼと、
(ii)二本鎖切断部位を検出するための免疫蛍光プローブ又は蛍光標識を発現する組換えタンパク質と、
(iii)少なくとも1つの対象遺伝子の転写により生成した少なくとも1つの標的mRNA配列にハイブリダイズする能力がある少なくとも1つの蛍光オリゴヌクレオチドプローブと
を含み、標的mRNA配列にハイブリダイズした少なくとも1つの蛍光オリゴヌクレオチドプローブの蛍光の有無及び蛍光の相対強度が、少なくとも1つの対象遺伝子の転写活性に対する染色体接触の効果を示す、単一細胞アッセイキット。 - 少なくとも1つの対象遺伝子の転写活性が、
(i)DNAに結合したときに染色体接触を妨害する、二本鎖切断の修復プロセスに関与するタンパク質の動員、
(ii)染色体接触に関与するDNAループの能力低下を引き起こす、二本鎖切断を含有するDNAの領域の移動性の増強、及び
(iii)染色体接触の抑制を引き起こす、DNAループの構造的完全性の喪失
からなる群から選択される機構により抑制され得る、請求項12に記載の単一細胞アッセイキット。 - 染色体接触が、遺伝子間接触、遺伝子内接触、又は遺伝子間及び遺伝子内接触の両方であり得る、請求項12又は13に記載の単一細胞アッセイキット。
- 二本鎖切断が、染色体接触に関与するDNAを撹乱し、その結果、少なくとも1つの対象遺伝子の転写活性を撹乱する、請求項12から14のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。
- 撹乱されたDNAの領域が、(i)染色体内又は染色体間の接触に関与するDNAループ内の部位、及び(ii)ループ構造を決定するDNAループ内の制御部位からなる群から選択される遺伝子又は制御エレメントを含む、請求項15に記載の単一細胞アッセイキット。
- 部位特異的ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼ、BUD1ヌクレアーゼ、及びCrispR/Cas9ヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項12から16のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。
- 部位特異的ヌクレアーゼが、部位特異的ヌクレアーゼをコードするベクターを用いた細胞のトランスフェクションにより細胞に送達され、部位特異的ヌクレアーゼが細胞内で内因的に発現され、又は部位特異的ヌクレアーゼが外因的に発現され、その結果細胞に送達される、請求項12から17のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。
- 免疫蛍光プローブが、細胞内の二本鎖切断の細胞修復プロセスに関わる少なくとも1つのタンパク質と結合する抗体である、請求項12から18のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。
- 細胞内のハイブリダイズした蛍光オリゴヌクレオチドプローブの場所が、標的mRNA配列に対応する遺伝子発現に関する染色体の場所を示し、ハイブリダイズした免疫蛍光プローブの場所が、二本鎖切断の場所を示す、請求項12から19のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。
- 細胞内のハイブリダイズした蛍光オリゴヌクレオチドプローブの場所が、
回折限界型画像化技法、サブ回折限界画像分解能、及び三次元画像化法からなる群から選択される技法により観測可能であり、
標的mRNA配列についての遺伝子発現の染色体上の場所、及びハイブリダイズした免疫蛍光プローブの回折限界又はサブ回折による場所の検出が、二本鎖切断の場所を示す、
請求項12から20のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。 - 細胞が、真核細胞又は原核細胞である、請求項12から21のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。
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