KR20060015468A

KR20060015468A - ＩｇＡ1 침착 질환 치료

Info

Publication number: KR20060015468A
Application number: KR1020057016464A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 쥐. 플라우스; 지아자우 퀴우
Original assignee: 뉴 잉글랜드 메디컬 센터 호스피털스 인코퍼레이티드
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2004-03-05
Publication date: 2006-02-17
Also published as: US20090041746A1; CN1777673A; JP2011101645A; US8216568B2; US20050136062A1; WO2004096157A3; WO2004096157A2; DE602004031199D1; EP1603511A2; KR20130026513A; US7407653B2; CA2558873C; EP1603511A4; ATE496992T1; JP2013230157A; CN1777673B; JP5438886B2; HK1090950A1; EP1603511B1; JP2006519619A

Abstract

본 발명은 조직 과 기관에 IgA 침착을 치료하기 위한 박테리아성 IgA1 프로테아제를 이용하는 방법에 대해 설명한다. 박테리아성 IgA1 프로테아제는 IgA1 분자를 특이적으로 절단하고, IgA1 침착을 제거하는 수단을 제공한다. 따라서, IgA1 침착과 연관된 질환 치료용 치료제를 제공한다. 특히, IgA 신증, 포진상 피부염(DH), 헨노흐-쉔라인 자반증(Henoch-Schoenlein purpura (HS)) 치료에 대해 설명한다.

Description

ＩｇＡ1 침착 질환 치료{TREATMENT OF IgA1 DEPOSITION DISEASES}

본 발명은 NIH, NIDCR에서 NIH RO1 DE 09677 인가에 의해 일부 또는 전부를 지원받았다.

사람의 조직 및 기관에 이뮤글로빈 A1 (IgA1) 침착되면 IgA 신증, 포진상 피부염(DH), 및 헨노흐-쉔라인 자반증( Henoch-Schoenlein purpura (HS))을 포함하는 많은 질병이 유발되는 특징이 있다. IgA1 침착은 신부전, 피부 물집, 발신, 관절염, 위장내 출혈, 및 복부 통증등과 같은 다양한 임상적인 징후의 원인이 된다.

복부 IgA 침착이 있는 환자들을 치료하는데 몇 가지 이용 가능한 치료 방법이 있다. 여기는 면역억제성 및 항-염증 성질을 가지는 코르티코이드 투여 및 신장 염증을 감소시키는 식용 생선 기름 보조제, 진행성 신장 질환 및 신부전 위험을 감소시키는 안지오텐신( angiotensin) 전환 효소 등을 투여하는 것들이 포함된다. 이와 같은 치료 방법들은 조직 또는 기관에서 IgA1 침착에 직접적으로 작용하지는 않는다.

IgA1 침착 제거 문제를 해결하기 위해, IgA1 침착된 동물 모델에서 외생 단백질 분해 효소를 테스트하였다(Gesualdo L. et al, (1990) J. Clin. Invest. 86: 715-722 and Nakazawa M. et al. (1986) J. Exp. Med 164: 1973-1987). 키모파파인( chymopapain) 및 서브틸리신(subtilisin)과 같은 단백질 분해효소는 신장에 침착된 IgA1 침착을 단백질 절단시키는 작용을 하지만, IgA1 분자에 특이적이지 않기 때문에, 다른 다양한 단백질도 절단할 수 있다.

따라서, 이 분야에 발전에도 불구하고, IgA1 침착 질환를 치료하는데 이용할 수 있는 치료요법적 물질이 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 IgA1 침착 조직 및 기관을 치료하기 위해 세균성 IgA1 프로테아제를 이용하는 내용을 설명한다. 세균성 IgA1 프로테아제는 특이적으로 IgA1 분자를 절단하여, IgA1 침착을 특이적으로 절단 및 제거하는 수단을 제공한다. 따라서, IgA 침착에 의한 발병되는 특징을 가지는 질환을 치료하는 치료요법제를 제공한다. 특히, IgA 신증, 포진상 피부염(DH), 및 헨노흐-쉔라인 자반증 (HS)를 치료하는 치료요법제를 설명한다.

본 명세서에서는 IgA1 프로테아제 자가-촉매 절단 부위의 상류(upstream)에 위치한 아미노산 태그에 융합된 IgA1 프로테아제를 인코드하는 핵산 분자를 설명한다.

한 구체예에서, IgA1 프로테아제에 융합된 테그는 항체 또는 펩티드와 같은 단백질 리간드에 특이적으로 결합되는 테그(tag)이다. 테그는 c-Myc, HA, VSV-G, HSV, FLAG, V5, HIS 등이 될 수 있다.

한 구체예에서, IgA1 침착 치료용 약학 조성물을 제공하는데, 그 구성은 항 체에 복합된 IgA1 프로테아제, 즉 항-IgA1 프로테아제 항체를 포함한다.

다른 측면에서 IgA1 침착 치료용 약학 조성물을 제공하는데, 테그의 리간드와 복합된 테그된 IgA 1 프로테아제로 구성된다. IgA1 프로테아제에 융합된 테그는 c-Myc, HA, VSV-G, HSV, FLAG, V5, HIS가 될 수 있다. 따라서, 리간드는 항-FLAG, 항-MYC, 항-VSV, 항-HA, 항-V5와 같은 항-테그 항체가 될 수 있다. 또는, 리간드는 펩티드 또는 킬레이트 분자와 같이 비-펩티드 리간드가 될 수도 있다.

또 다른 측면에서, IgA1 침착을 특징으로 하는 질환 치료 방법을 제공한다. 이 방법은 치료요법적으로 효과량의 IgA1 프로테아제를 환자에 투여하는 것이다.

한 구체예에서, 치료 방법은 테그의 리간드와 복합되어, 테그에 융합된 IgA1 프로테아제, 예를 들면, 항-테그 항체를 이용하는 것이다.

IgA1 프로테아제에 융합되는 테그는 c-Myc, Flag, HA, VSV-G, HSV, FLAG, V5, HIS가 될 수 있다. 따라서, 항-테그 항체는 항-FLAG, 항-MYC, 항-VSV, 항-HA, 항-V5이 될 수 있다.

또 다른 구체예에서, IgA1 침착에 의한 질환은 IgA 신증, 포진상 피부염(DH), 및 헨노흐-쉔라인 자반증 (HS)등이 된다.

도 1은 IgA1의 힌지(hinge)를 나타낸 것(SEQ ID NO:1).으로, 힌지 부분내에 몇 가지 IgA1 프로테아제 절단 부위가 포함된다.

도 2a는 자가-촉매 절단를 하는 IgA1 프로테아제 전구물질을 설명하는 것으로, 자가-촉매 절단에 의해 완전한 가용성 IgA1 프로테아제를 방출한다.

도 2b는 IgA1 프로테아제를 설명하는데, His 테그가 IgA1 프로테아제에 융합되어, His 테그는 완전한 IgA 1 프로테아제의 카르복시 말단 부근에 위치한다. 가용성 IgA1 프로테아제는 치료목적으로 항-His 항체와 복합될 수도 있다.

도 3은 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) Rd IgA1 프로테아제 전구물질 단백질을 도시한 것으로써, 고유 서열(SEQ ID NO:2) 자가-촉매 절단 부위(부위 a)로부터 상류에 있는 아미노산 서열을 나타낸다. 돌연변이 된 서열(SEQ ID NO:3) 는 프레임내에 His 테그가 절단부위로부터 2개 아미노산 상류에 있는 IgA1 프로테아제에 융합된 것이다. 고유 서열(SEQ ID NO:2)에 상응하는 아미노산 서열 및 돌연변이된 서열(SEQ ID NO:26)도 나타내었다.

도 4는 통상적인 리게이션(ligation) 기술을 이용하여, 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) Rd IgA1 프로테아제내로 His 테그를 삽입함으로써 생성된 PCR 부위 직접적인 돌연변이 단편들을 나타 낸 것이다.

도 5는 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) Rd의 단백질 서열(SEQ ID NO:4)을 나타낸 것이다.

도 6은 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) Rd의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:5)을 나타낸 것이다.

본 발명은 IgA1 침착에 의한 질환을 치료하기 위해 세균성 이뮤글로빈A1 프로테아제(IgA 프로테아제)를 이용한다.

정의

여기에서 사용된 바와 같이, "IgA1 프로테아제"는 사람의 IgA1 분자를 특이적으로 절단하는 세균성 효소를 말한다. "특이적으로 절단"한다는 의미는 사람의 IgA1 분자의 힌지 부분을 절단하나, 사람의 IgA2 분자는 절단하지 않는다는 것이다. IgA1 프로테아제는 그램 음성 및 양성 박테리아에서 단일 쇄 전구물질로 발현되어, 세균 막을 통과합니다. 그램 음성 박테리아의 IgA1 프로테아제는 자가-촉매 절단을 하여, 완전한 N-단부 가용성 IgA1 프로테아제를 방출한다.

여기에서 사용된 바와 같이, "상류에 위치한"이란 의미는 테그의 공간적 변수를 말하는 것으로써, 아미노산 서열이 IgA1 프로테아제의 자가-촉매 절단에 대해 아미노산 말단에 적어도 2개 아미노산, 또는 1개 아미노산 또는 아미노산이 없이 위치하거나 아미노단부에 최고 50개 아미노산 위치에 있다는 것을 말하며, 즉, 테그는 분비된 가용성 IgA1 프로테아제의 카르복시 말단의 상류에서 2개, 1개 또는 아미노산 이 없거나 또는 최고 50개 아미노산 위치에 있게 된다.

여기에서 언급된 바와 같이, “테그”는 아미노산 길이가 3 내지 40개인 폴리펩티드서열을 말한다. 테그는 펩티드, 단백질 리간드 또는 비-펩티드 리간드에 대해 결합 특이적 친화력을 가진다. 특이적 결합 친화력으로 인하여, IgA1 프로테아제가 리간드에 복합될 수 있도록, 프로테아제에 융합되어, IgA1 프로테아제를 감지하거나 분리 또는 복합형으로 크게 만들거나 또는 치료 목적에 이용할 수 있다. 이때, 테그에는 또한 형광 테그, 발광 테그 또는 발색 테그등이 포함될 수 있다. 테그에는 c-Myc, HA, and VSV-G, HSV, FLAG, V5, HIS등이 포함될 수 있으나, 이에 국한시키지 않는다.

“리간드에 복합된”이란 IgA1 프로테아제가 항체 또는 킬레이트 분자와 같은 결합 짝에 특이적으로 결합된다는 것을 말한다. 특이적 결합 짝이 비드와 같은 매트릭스에 부착될 수 있다. “특이적으로 결합”한다는 의미는 항체, 단백질, 펩티드 또는 킬레이트 물질과 같은 두개 분자의 상호작용을 말한다. 이때 상호작용은 각 분자 상에 특정 구조가 존재하는지에 따라 달라진다. 예를 들면, 두개 분자가 단백질 분자인 경우에, 제 1 분자의 구조가 제 2 분자를 인지하고, 일반적인 다른 단백질에 결합하는 것이 아니라 인지한 제2 분자에 결합한다는 것을 의미한다. 여기에서 사용된 바와 같이 "특이적 결합"이란 비-특이적 분자에 결합하는 것에 비하여 적어도 2배 이상의 친화력으로 특정 결합 짝에 결합한다는 것을 의미하고, 적절하게는 10배, 20배, 50배, 100배 또는 그 이상의 결합 친화력을 가진다는 것을 의미한다.

"감지된"이란 의미는 테그의 유무에 따라 달라진다는 의미로써, 테그 자체가 형광을 가지는 경우에, 면역 형광에 의한 감지, 항-테그 단클론 항체로 웨스턴 블랏에 의한 감지되는 방식을 말한다. 본 발명에 따른 적절한 테그에는 c-Myc, Flag, HA, and VSV-G, HSV, FLAG, V5, HIS 등이 될 수 있으나 이에 국한되지는 않는다.

"분리된"이란 의미는 박테리아 생장 배지에 있는 임의 단백질 또는 핵산 및 세포 막과 같은 박테리아 세포 물질들로부터 IgA1 프로테아제를 분리한다는 것을 의미한다. 분리하는 방법으로는 금속-킬레이트 수지 또는 비드, 면역 침전법, 항-테그 항체를 이용한 친화력 컬럼 정제 등을 이용한 폴리-히스티딘 테그를 가지는 항체를 분리할 수 있는데, 이에 국한시키지는 않는다.

여기에서 언급된 바와 같이, “항체”는 항원 예를 들면, 테그 또는 IgA1 와 같은 항원에 결합할 수 있는 이뮤글로빈 분자 또는 이의 단편을 말한다. “항체”는 임의 이소타입(IgG, IgA, IgM, IgE, 등)의 전체 항체 또는 포유류와 같은 척추 동물 단백질과 특이적으로 반응하는 반응성을 가진 단편을 포함한다. 통상적인 기술을 이용하여, 항체를 분절화시킬 수도 있다. 따라서, 이 용어는 특정 단백질과 선택적으로 반응할 수 있는 항체의 단백질 분해효소에 의해 절단된 또는 제조합에 의해 만들어진 단편이 포함된다. 이와 같은 단백질 분해에 의해 또는 재조합에 의해 만들어진 단편으로는 Fab, F(ab')2, Fab', Fv, dAbs 및 펩티드 링커에 의해 결합된 V_L 및 V_H 도메인을 포함하는 단일 쇄 항체가 포함되나 이에 국한되지는 않는다. scFv's는 두개 또는 그이상의 결합 부위를 가지는 항체를 만들기 위해 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결될 수도 있다. 따라서, 항체는 단클론성, 다클론성 또는 항체의 다른 정제물 또는 제조합 항체가 포함된다. 여기에서, “항-테그 항체”란 테그에 특이적으로 결합되는 항체를 말한다.

여기에서 사용된 바와 같이, "IgA1 침착"이란 사람의 조직 또는 기관에서 응집된 또는 응집안된 형태로 IgA1 이뮤글로빈이 축적되는 것을 말한다.

여기에서, “IgA1 침착에 의한 질병”이란 IgA1 침착에 의해 발생되는 임의 질병을 말하는 것으로써, IgA 신증, 포진상 피부염(DH), 및 헨노흐-쉔라인 자반증(HS) 등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.

여기에서 사용된 바와 같이, "IgA 신증"이란 신장내에 IgA1 침착으로 인한 신장 질환을 의미한다.

여기에서 사용된 바와 같이, "포진상 피부염"이란 피부 또는 다른 조직에 IgA1 침착과 연관된 만성 포진형성 질환을 말한다.

여기에서 사용된 바와 같이, “헨노흐-쉔라인 자반증”은 피부 조직 및 신장 조직에 IgA 침착에 의한 피부 및 신장 질환을 의미한다.

여기에서 사용된 바와 같이, "약학 조성물"은 약학적으로 효과량의 활성 물질과 약학적으로 수용가능한 캐리어로 구성된다. 여기에서 사용된 바와 같이, “약학적으로 효과량” 또는 단순하게 “효과량”은 의도한 바의 약리학적, 치료요법적 또는 예방 결과를 낳는 물질의 효과량을 의미한다. 예를 들면, 질병 또는 질환과 연관된 측정 변수들이 적어도 25% 감소된 경우에, 주어진 임상 치료는 효과가 있는 것으로 간주한다.

I. IgA1 프로테아제

여기에서, IgA1 프로테아제는 IgA1 침작에 의한 질환을 치료하는데 이용된다. IgA1 프로테아제는 사람의 IgA1 분자를 특이적으로 절단하는 박테리아 효소이다. 사람의 IgA2는 거의 모든 공지된 IgA1 프로테아제에 대해 저항성이 있는데, 그 이유는 IgA2 분자는 모든 IgA1 분자에 있는 힌지 부분이 부족하기 때문이다. IgA1 분자의 힌지 부분은 도 1에서 설명하는 바와 같이 다양한 IgA1 프로테아제에 의한 절단 부위를 포함하는 아미노산 스트링으로 구성된다. IgA1 프로테아제는 박테리아의 내막을 가로 지르는 단일 쇄 전구물질로써 그램 음성 박테리아에서 발현된다. 그 다음 전구물질 단백질 자체가 박테리아의 외측 막으로 들어가, 자가-촉매 절단을 하여, 완전한 가용성 IgA1 프로테아제를 방출한다한다(도. 2a). 그램 -양성 박테리아의 IgA 전구물질은 자가-촉매 방출 기전을 가지고 있지는 않지만, 본 발명에서 또한 유용하다. 이와 같은 프로테아제의 경우에, 에피토프 테그가 효소 단백질에 추가된다.

본 발명의 한 구체예에서, 테그 서열은 IgA1 프로테아제에 프레임내에서 융합되는데, 테그 서열은 분리된 IgA1 프로테아제의 카르복시 단부 근처에 위치하게 된다 (도 2b). 도 3은 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) Rd IgA1 프로테아제 전구물질 단백질을 도시한 것으로, 테그 서열(e.g. His tag)이 자가-촉매 절단 부위 a, b, c의 상류 IgA 프로테아제에 융합된 것이다.

다양한 박테리아가 IgA1 프로테아제를 생산하는데, 이들 박테리아가 본 발명에서 유용하다. 여기에는 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 타입 1과 2, 나이제리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 타입 1과 2, 나이제리아 고노르호이에(Nissseria gonorrhoeae), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae ), 스트렙토코커스 산구이스(Streptococcus sanguis ), 글로스트리디움 라모섬(Clostridium ramosum ), 프레보텔라 멜라니노게니카(Prevotella melaninogenica), 우레아플라즈마 우레아타이티쿰(Ureaplasma ureatyticum)등이 포함된다.

본 발명의 IgA1 프로테아제 뉴클레오티드 서열은 IgA1 프로테아제 서열이 사람의 IgA1 분자를 절단할 수 있는 한, IgA1 프로테아제를 발현하는 임의 박테리아로부터 구할 수 있다. 상당수의 박테리아 균주로부터 IgA1 프로테아제를 인코드하는 뉴클레오티드가 이미 확인되었는데: 클로스트리디움 라모슘(Clostridium ramosum )(Genebank Accession, AY028440); 우레아플라즈마 우레아타이티쿰(Ureaplasma urealyticum)(Genebank Accession, NC_002162); 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae )(Genebank Accession, X59800), 박테리아 균주 Rd (Genebank Accession, NC-000907), 7768 (Genebank Accession, AF274862), 6338 (Genebank Accession, AF27486), 2509 (Genebank Accession, AF274859), 아지티투스(aegyptius)(Genebank Accession, AF369907), 8625 (GenebankAccession, AJ001741), HK284 (Genebank Accession, X82487), Da66 (Genebank Accession, X82467), HK635 (Genebank Accession, X82488), 미확인된 균주에서 얻은 기탁된 서열(Genebank Accession numbers, X59800, X82488, X64357, M87492, M87491, M87490, and M87489);나이제리아 메닝지티디스(Neisseria memingitidis )(Genebank Accession number AF235032), 박테리아 균주, Z2491 (Genebank Accession, NC-03316), B40 (Genebank Accession, AF012211), Z4099 (Genebank Accession, AF012210), Z4018 (Genebank Accession, AF012209), Z4400 (Genebank Accession, AF012208), Z3524 (Genebank Accession, AF012207), Z4024 (Genebank Accession, AF012206), Z3910 (Genebank Accession, AF012205), Z3906 (Genebank Accession, AF012204), Z2491 (Genebank Accession, AF012203), IHN341 (Genebank Accession, AJ001740), NL3327 (Genebank Accession, AJ001739), NL823 (Genebank Accession, AJ001737), NL3293 (Genebank Accession, AJ001738), HK284 (Genebank Accession, X82487), ETH2 (Genbank Accession, X82469), NGO93 (Genbank Accession, X82482), NCG80 (Genbank Accession, X82479), NG117 (Genbank Accession, X82483), HF96 (Genbank Accession, X82475), HF54 (Genbank Accession, X82473), HF48 (Genbank Accession, X82480), HF13 (Genbank Accession, X82474), NGC65 (Genbank Accession, X82484), NCG16 (Genbank Accession, X82485), SM1894 (Genbank Accession, X82476), EN3771 (Genbank Accession, X82468), NG44/76 (Genbank Accession, X82481), SM1166 (Genbank Accession, X82486), HF159 (Genbank Accession, X82471), 81139 (Genbank Accession, X82477), HF117 (Genbank Accession, X82470), SM1027 (Genbank Accession, X82472) and Genebank Accession number, AF235032; 나이제리아 고노르호이에(Nissseria gonorrhoeae )(Genebank Accession number, A12416), 박테리아 균주, MS11 (Genebank Accession, S75490); 스트렙토코커스 뉴모니에(treptococcus pneumoniae )Genebank Accession number, X94909) , 박테리아 균주 MGAS315 (Genebank Accession, NC-004070), R6 (Genebank Accession, NC-003098); 스트렙토코커스 산구이스(Streptococcus Sanguis )(Genebank Accession, NC-003098), 그리고 박테리아 균주 SK85 (Genebank Accession, Y13461), SK49 (Genebank Accession, Y13460), SK4 (Genebank Accession, Y13459), SK162 (Genebank Accession, Y13458), SK161 (Genebank Accession, Y13457), SK115 (Genebank Accession, Y13456, and Sk112 (Genebank Accession, Y13455) 등이 포함된다.

벡터 구조

본 발명에서, IgA1 프로테아제을 인코드하는 서열을 단백질 발현에 적절한 벡터내로 클론시켜, 가용성 IgA1 프로테아제를 생산 분리한다. 벡터는 표준 방법을 이용하여, 하기에서 설명하는 원리에 따라 작제한다 (Sambrook et al., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989; Ausubel, et al., Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1995). 간략하게 설명하면, 통상적인 리게이션 기술을 이용하여 IgA1 프로테아제를 인코드하는 DNA 서열을 박테리아 클로닝 또는 발현 벡터 안으로 삽입시킨다.

IgA1 프로테아제를 인코드하는 핵산을 준비하기 위해, IgA1 프로테아제를 인코드하는 유전자 소스가 필요하다. 유전자는 자연 또는 합성 소스로부터 얻을 수 있다. 박테리아 균주로부터 신규한 IgA1 프로테아제를 클로닝하는 방법은 다음에서 설명하고 있으며, 이들은 참고문헌으로 전문 첨부한다; Lomholt H., et al., Mol. Microbiol. (1995) 15(3), 495-508; Fishman, Y. et al., (1985), p. 164-168 in G. K. Schoolink (ed.), The Pathogenic Neisseria, Am. Soc. Microbiol., Washington DC; Koomey, J. et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA, (1982) 79: 7881-7885; Halter, R, et al., EMBO J., (1984) 3: 1595-1601; Bricker, J. et. al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, (1983), 80:2681-2685; Koomey, J. M. and Falkow, S., supra; Grundy, J. F. et al., J. Bacteriol, (1987) 169:4442-4450; and Gilbert, J.V. et al., Infect. Immun., (1988) 56:1961-1966.

또는, 공지의 IgA 프로테아제를 인코드하는 DNA를 박테리아 게놈 DNA에서 분리할 수 있는데, 이때는 폴리메라제 연쇄 반응(PCR) 증폭 기술로 원하는 IgA1 프로테아제 유전자에 대한 프라이머를 사용하면 된다. 간략하게 설명하면, 박테리아 게놈 DNA는 당업자에 공지된 방법을 이용하여 분리할 수 있는데, 예를 들면, QIAGEN에서 제공하는 박테리아 게놈 DNA 분리 키트를 이용하거나 Sambrook et al., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and Ausubel, et al., Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, (1995)에서 설명하는 방법을 이용한다. 이 문헌의 전문은 참고문헌으로 첨부한다.

PCR은 당분야에 공지된 것이다 (Mullis and Faloona, Methods Enzymol., (1987), 155: 335, herein incorporated by reference). 일반적으로, 본 발명에 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 제2 핵산 가닥을 효소적으로 합성시킬 수 있고, IgA 프로테아제를 인코드하는 핵산 주형에 선택적으로 하이브리드하는 단일 가닥의 DNA 또는 RNA 분자이다. 프라이머는 박테리아 게놈에 복합 핵산 분자에 존재하는 표적 분자의 일부에 상보적이다. 프라이머는 화학적 또는 효소적 방법으로 합성하여 만들 수 있다. 또는, 이와 같은 분자 또는 이의 단편은 자연 발생적인 것도 있는데, 자연 소스에서 분리하거나 시판업자에게서 구입할 수도 있다. 돌연변이 올리고뉴클레오티드 프라이머는 길이가 15 내지 100개 뉴클레오티드, 이상적으로는 20 내지 40개 뉴클레오티드 정도가 되며, 이와는 다른 길이를 가진 뉴클레오티드도 이용할 수는 있다. 적절하게는 프라이머는 제한효소 특이적 절단 서열이 포함될 수도 있다.

일반적으로, 두개 핵산 서열이 실질적으로 상보적인 경우에(14 내지 25개 뉴클레오티드 서열 스트레치에 대해 적어도 약 65%, 적절하게는 약 75%, 바람직하게는 적어도 약 90% 상보적), 선택적 하이브리드 반응이 일어난다 Kanehisa, Nucleic Acids Res., (1984), 12: 203,문헌은 첨부한다). 그 결과, 프라이밍 부위에서 어느 정도의 미스매치가 허용된다는 것을 예측할 수 있다. 이와 같은 미스매치는 모노, 디, 트리-뉴클레오티드와 같은 작다. 또는 미스매치가 4개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 된 연결된 것을 포함하는 경우에 이 부분을 뉴클레오티드 루프라고 하는데, 루프로 구성될 수도 있다.

전반적으로, 5가지 인자가 제2 핵산 분자에 프라이머의 하이브리드에 효과 및 선택성에 영향을 준다. 이들 인자는 (i) 프라이머 길이, (ii) 핵산 서열 및 조성물, (iii) 하이브리드 온도, (iv) 완충물 화학조성 (v) 프라이머가 하이브리드되는 부분에 공간적 방해 정도;이며, 비-무작위 프라이밍 서열을 고려할 때 매우 중요하게 고려되는 부분이다.

프라이머가 표적 서열에 어닐(anneal)될 때 정확성 및 효과와 프라이머 길이에는 포지티브 상관관계가 있는데, 짧은 서열과 비교할 때 서열이 길수록 더 높은 용융 온도(TM)를 요구하고, 주어진 표적 서열내에 반복되지 않는 것으로 보인다. 따라서, 무차별적인 하이브리드반응을 최소화할 수 있다. G-C 부분이 많은 또는 팔린드롬서열(palindromic sequences)로 구성된 프라이머 서열은 자가-하이브리드 성향이 있는데 그 이유는 이중분자(bimolecular)보다는 단일 분자(unimolecular) 하이브리드 반응 역학이 용액에서 더 선호되기 때문이고, 동시에 표적 서열에 더 단단히 결합될 수 있도록 프라이머를 고안하는데 있어서, G-C 뉴클레오티드 쌍이 충분히 포함되도록 하는 것이 중요하다. 그 이유는 A와 T염기가 쌍을 이룰 때는 2개 수소결합이 관여하는데 비하여, G와 C는 세 개의 수소결합에 의해 결합되어 더 단단하기 때문이다. 하이브리드 반응 온도는 프라이머 어닐링 효과와 역관계로써, 하이브리드반응의 혼합물에 포함될 수도 있는 포름알데히드와 같은 유기 용매의 농도에 따라 달라지고, 염 농도가 증가하면 결합이 실행된다. 스트린젼트 하이브리드 반응 조건하에서, 허용 조건하에서도 충분한 길이의 짧은 프로브와 비교하였을 때, 프로브가 길수록 하이브리드 효과가 더 좋다. 스트린젼트 하이브리드 반응 조건에는 일반적으로 1M 미만의 염 농도가 포함되는데, 좀더 일반적으로는 약 500mM미만, 좀더 적절하게는 약 200mM 미만의 염 농도가 포함된다. 하이브리드 반응 온도 범위는 0℃만큼 낮은 것부터 22℃, 30℃이상 그리고 가장 흔한 경우로는 약 37℃이상의 범위이다. 단편의 길이가 길수록 특이적 하이브리드 반응을 위해 더 높은 하이브리드 반응 온도를 요구할 수 있다. 몇 가지 인자들이 하이브리드 반응의 스트린젼트 조건에 영향을 주기 때문에, 단일 변수만을 절대적으로 측정하는 것보다는 변수를 복합하는 것이 더 중요하다.

프라이머는 프라이머 서열의 생성 및 최적화를 지원하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 고안하는 것이 적절하다. 이와 같은 프로그램으로는 DNAStar 소프트웨어 패키지의 “PrimerSelect"(DNAStar. Inc.; Madison, WI); OLIGO 4.0 (National Biosciences. Inc.) 등이 포함된다. 일단 고안한 후에는 적절한 방법을 이용하여 적당한 올리고뉴클레오티드를 만드는데, 이용될 수 있는 방법으로는 포스포라미디트 방법(phosphoramidite method)(Beaucage and Carruthers (1981) Tetrahedron Lett., 22: 1859) 또는 트리에스테르 방법(Matteucci and Caruthers (1981) J. Am. Chem. Soc., 103: 3185) 등이 될 수 있으며, 이들 문헌은 참고자료로 첨부한다. 또한 시판되는 자동화 올리고뉴클레오티드 합성기 또는 VLSIPS 기술을 이용한 화학적 방법에 의해서도 만들 수 있다.

PCR은 주형으로 박테리아 DNA (적어도 l fg: 좀더 적절하게는 1-1000 ng), 그리고 최소 25 pmol의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 실시할 수 있다. 프라이머 복합물의 이형성성 큰 경우에는 더 많은 양의 프라이머를 이용하는 것이 유익하다. 그 이유는 각 서열이 복합물의 분자에 소량만 있고, 그 양이 나중에 증폭 과정에서 제한되기 때문이다. 일반적인 반응 혼합물에는 2㎕ DNA, 25pmol 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2.5ℓl0X PCR 완충액 1 (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0.4μ 1.25 mM dNTP, 0.15㎕ (또는 2.5 units) Taq DNA 폴리메라제(Perkin Elmer, Foster City, CA)가 포함되고, 탈이온수로 총 부피를 25㎕로 만든다. 미네랄 오일을 덮고, 프로그햄된 열 사이클을 이용하여 PCR를 실행한다.

PCR 사이클의 각 단계 길이 및 온도, 사이클의 횟수는 스트린젼트 효과 요구조건에 적합하도록 조정한다. 어닐링 온도 및 타이밍은 프라이머가 주형에 어닐링될 때 기대 효과 및 수용해야할 미스매치 정도에 따라 결정되고, 분명한 것은 핵산 분자가 동시에 증폭되고, 돌연변이되는 경우에, 합성 제 1 단계에서 적어도 미스매치가 필요하다는 것이다. 30℃ 내지 72℃ 범위 온도가 이용된다. 주형 분자의 초기 변성은 일반적으로 92℃ 내지 99℃ 범위에서, 4 분간, 그 다음 변성 과정을 20-40회 실시하는데, 이 과정은 다음과 같이 구성된다 : 변성 (94-99℃에서 15초 내지 1분간), 어닐링 (상기에서 언급된 온도: 1-2 분간), 연장 (72℃에서 1-5 분간- 증폭된 생성물의 길이에 따라 달라짐) . 최종 연장은 일반적으로 72℃에서 4분간 실시되며, 이어서 4℃에서 부정(indefinite) 단계(0-24시간)가 이어진다.

PCR 증폭에 이어서, 표준 방법 예를 들면, 겔 전기영동 또는 컬럼 정제와 같은 수단을 이용하여, DNA를 분리시킬 수 있다. 박테리아성 IgA1 프로테아제를 인코드하는 DNA를 적절한 제한효소를 이용하여 절단시킨 후에, 적절한 클로닝 또는 발현 벡터에 결찰시킬 수 있다.

벡터 및 숙주 세포

본 발명에서는 임의 벡터를 이용할 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, 발현 또는 이의 복제를 목적으로 박테리아 세포내로 이형성 DNA를 도입시키는데 이용되는 별개 효소를 벡터라고 한다. 본 발명에 적절한 수많은 벡터들이 공지되어 있는데, 예를 들면, 박테리아 플라스미드 및 박테리아 파아지 등이 포함된다. 각 벡터에는 다양한 기능 성분들이 포함되는데, 일반적으로 클로닝(또는 “폴리링커”) 부위, 복제 원점, 적어도 한 가지 선택성 마커 유전자등을 포함한다. 주어진 벡터가 발현 벡터인 경우에, 추가적으로 벡터에는 인헨서 요소, 프로모터, 전사 종료 시그날 및 시그날 서열이 하나 이상 포함되는데, 이들은 클로닝 부위에 인접하게 위치하여, 본 발명에 따른 IgA1 프로테아제를 인코드하는 유전자에 연결된다.

클로닝 및 발현 벡터에는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 선별된 숙주 세포에서 복제할 수 있는 핵산 서열을 포함하고 있다. 클로닝 벡터에서 일반적으로, 이 서열은 숙주 염색체 DNA와는 독립적으로 벡터가 복제될 수 있도록 하고, 벡터에는 복제 원점 또는 자가 복제 서열을 가진다. 다양한 박테리아에서 이와 같은 서열들이 공지되어 있다. 예를 들면, 플라스미드 pBR322의 복제 원점은 대부분의 그램-음성 박테리아에 사용할 수 있다.

유익하게는 클로닝 또는 발현 벡터에는 선택 마커라고 하는 선별 유전자를 가지고 있다. 이들 유전자는 선택성 배양 배지에서 생장된 형질전환된 숙주 세포의 생장 또는 생존에 필요한 단백질을 인코드한다. 선택성 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주 세포는 이들 배양 배지에서 생존할 수 없다. 일반적으로 선택 유전자는 항생제에 대해 저항성을 부여하는 단백질 및 다른 독소를 인코드하는데, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 테트라사이클린이거나 생장 배지에서 이용되지 않은 주요 영양분이 공급될 수도 있다.

본 발명에 따른 벡터 복제는 대장균(E. coli)에서 통상적으로 이루어지기 때문에, 대장균 선택 마커(예를 들면 암피실린 항생제 저항성을 부여하는 락타마제 유전자)를 이용한다. 이런 것들은 대장균 플라스미드 예를 들면, pBR322 또는 pUC 플라스미드(pUC18 또는 pUC19)에서 얻을 수 있다.

발현 벡터에는 통상 숙주 유기체에 의해 인지되는 프로모터를 포함하고, 이들은 원하는 코딩 서열에 연결된다. 이와 같은 프로모터는 유도성 또는 구성 프로모터가 될 수 있다. "작용 가능하도록 연결된"이란 나란하게 위치한다는 의미로써, 여기에서 설명된 성분이 원하는 방식으로 기능하도록 한다는 것을 의미한다. 코딩 서열에 컨트롤 서열이 “작용 가능하도록 연결”되어 있다는 것은 콘트롤 서열과 필적하는 조건하에서 코딩서열이 발현되는 방식으로 결찰된다는 것을 말하는 것이다.

원핵 숙주 세포에 이용할 수 있는 적절한 프로모터에는 락타마제, 락토즈 프로모터 시스템, 알칼리 포스포타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터등이 포함된다. 박테리아 시스템에 이용될 수 있는 프로모터에는 코딩 서열에 작용 가능하도록 연결된 샤인-달가노 서열( Shine-Delgarno sequence)이 일반적으로 포함된다. 본 발명에 적절한 타입의 프로모터는 이소프로필티오갈락토시드 (IPTG)- 조절 프로모터이다.

본 발명의 IgA1 프로테아제의 발현 및 클로닝에 대해 임의 박테리아 균주도 이용될 수 있는 것으로 본다. 예시적인 숙주가 대장균( E. coli)이다.

숙주 세포로 벡터 유도

당분야에 공지된 적절한 방법 중 임의 방법을 이용하여 벡터를 숙주 세포내로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 벡터 구조를 람다 또는 M13과 같은 박테리오파아지 벡터 입자를 이용한 감염 또는 플라스미드 벡터 또는 박테리오파아지에 적절한 형질 변환 방법을 이용하여, 적절한 숙주 세포내로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 표준 염화칼슘-중개된 박테리아 형질변환이 네이키드 DNA를 박테리아내로 도입시키는데 가장 흔히 사용되는 방법이나 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), 전기 천공(electroporation)과 같은 방법도 이용될 수 있다 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1988), (John Wiley & Sons, Inc., NY, NY)).

가용성 IgA1 프로테아제 정제

IgA1 프로테아제를 인코드하는 발현 벡터를 적절한 박테리아 숙주 세포내로 도입시킨 후에, 박테리아는 표준 방법에 의해 가용성 IgA1 프로테아제를 과다 생산할 수 있도록 증폭시켰다 (Sambrook et al., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and Ausubel, et al., Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, (1995) 참고문헌을 첨부한다). 간략하게 설명하면, IgA1 프로테아제를 인코드하는 발현벡터가 있는 대장균(E. Coli ) 또는 박테리아 게놈으로 결합된 IgA1 프로테아제를 인코드하는 DNA를 가진 박테리아를 37℃에서 박테리아 배양 배지에서 생장시킨다. 박테리아 배양이 log 상태에 다다르면, 가용성 IgA1 프로테아제를 당분야에 공지된 수단을 이용하여 배양 배지로부터 정제해낸다.

예를 들면, 6x His-IgA1 프로테아제를 발현시키는 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) Rd 박테리아를 NAD 및 헤민이 보충된 브레인-하트 주입 브로스가 충전된 배양기에서 20L (10L 2개)로 배양하였다. 세포를 정지상(stationary phase)에 도달할 때까지(16-20시간) 37℃에서 생장시킨다. 박테리아 물질을 Pellicon 시스템을 이용하여 제거하고, 활성 효소를 포함하는 배양 상층액 각 10 L를 400 ml로 농축시킨다. 완충액을 조절하여 단백질이 25 mM Tris/HCl 완충액, pH 7.5, + 0.05% NaN₃에 포함되도록 한다. 원하지 않는 단백질을 제거하기 위해, 이 농축액 80 ml 배치를 25mM 트리스 완충액으로 균형을 이룬 40 ml bed-volume DE-52 음이온-교환 컬럼에 적하시킨다. IgA 프로테아제는 이 컬럼에 결합하지 않고, 500 ml 트리스 완충액을 흘려보내 수집한다. 그 다음 암모늄 설페이트를 이용하여 효소를 침전시킨다 ( 암모늄 설페이트에서 60% 포화, 390 gm per L). 침전물은 다음의 완충액으로 용해시킨다:( 50 mM 인산나트륨, 12.5 mM Tris/HCl, 0.3 M NaCl, 0.025% 아지드 나트륨, pH는 7.5로 조절), 그리고 효소를 몇 일간 이 완충액에 대해 투석시킨다. 효소 용액의 최종 용적은 10ℓ 시작 배양물에 대해 200㎖정도가 된다.

친화력 정제의 경우에, 40㎖ 효소 용액을 Ni-NTA-아가로즈 컬럼(40㎖ 베드 볼륨)에 얹는다. 결합된 효소는 50mM 인산나트륨, 12.5 mM Tris/HCl, 0.3 M NaCl, 0.025% 아지드 나트륨를 포함하는 완충액 500㎖로 3회 세척한다. 이들 완충액의 pH는 단계별로 감소시키는데, 시작할 때 7.5에서 6.0으로 감소시켜, 약하게 흡착된 비-효소 단백질을 니켈 리로부터 제거한다. 최종 세척에는 다시 pH 7.5의 완충액 200 ml을 이용한다. 6xHis-IgA 프로테아제를 Ni-NTA 아가로즈 컬럼으로부터 50 ml 0.1 M 이미다졸/50 mM Tris/HCl, pH 7.5 용액을 이용하여 용출해낸다. 회수된 효소는 100 kDa cut-off Centricon 막을 통하여 포지티브 압력 여과에 의해 농축시키고, 25 mM Hepes, pH 7.15로 3회 세척한 후에, Hepes 완충액에 보관한다.

IgA1 프로테아제 활성 검사

Plaut, AG and Bachovchin WW, IgA-specific prolyl endopeptidases: serine type. Methods Enzymol. 1994;244:137-51,에서 설명하는 것과 같이 표준 방법을 이용하여 효소 활성에 대해 IgA1 프로테아제를 테스트하였다. 검사는 박테리아 생장 배지에 있는 정제된 프로테아제 또는 IgA1 프로테아제를 이용하여 실시한다. IgA1 프로테아제는 37℃에서 분당 1㎍의 사람 IgA1을 절단하는 것이 단위로 정의할 때 1 단위 활성을 가지면 본 발명에서 이용할 수 있을 정도의 충분한 활성을 가진다.

II. 테그된 IgA1 프로테아제

한 구체예에서, IgA1 프로테아제를 테그에 융합하였다. 테그를 본 발명의 IgA1 프로테아제에 융합하는 것은 프로테아제의 정제 및 감지에 도움이 되고, 치료요법적 목적으로 항-테그 항체와 같이 리간드에 IgA1 프로테아제가 리간드와 융합할 수 있는 수단을 제공한다.

테그를 포함하는 IgA 프로테아제를 만들기 위해, 통상적인 분자생물학적 기술을 이용하여 IgA1 프로테아제를 인코드하는 서열에 테그 서열을 결찰시킬 수 있다. 테그 서열은 IgA1 프로테아제 자가-촉매 절단 부위의 상류에 결찰되어, IgA1 프로테아제 전구물질 단백질 절단시에, 테그를 포함하는 가용성 IgA1 프로테아제가 박테리아 생장 배지로 분비된다.

또는, 테그를 포함하는 IgA1 프로테아제는 PCR-을 이용한 부위 직접적인 돌연변이 형성을 통하여 만들 수 있다. 당분야에는 여러 가지 부위-직접적인 돌연변이 형성 방법이 공지되어 있는데, 이 방법은 단백질내에 특정 부위를 돌연변이 시키는 것이다. 통상적인 그리고 PCR 이용한 방법을 포함하여, 부위-직접적인 돌연변이를 실행하기 위해 시판되는 여러 키트를 이용할 수 있다. Stratagene사에서 시판되는 EXSITE PCR- 부위 직접적인 돌연변이 형성 키트(Catalog No. 200502; PCR based); QUIKCHANGE 부위 직접적인 돌연변이 형성 키트(Catalog No. 200518; PCR based); CHAMELEON 이중-가닥 부위 직접적인 돌연변이 형성 키트 (Catalog No. 200509) 등이 예가 될 수 있다. 간략하게 설명하면, PCR 프라어머 중 하나의 5‘ 또는 3’ 단부 부근에 테그를 인코드하는 서열을 포함시켜, PCR 단편으로 테그 서열을 도입시킬 수 있다. PCR 단편을 만들 때 적당한 제한 효소 부위가 있도록 하여, 단편을 절단한 후 특정 아미노산 코돈으로 대체하기 위해 모(parental) 벡터로 결찰시켰다.

한 구체예에서, 본 발명의 테그는 항체에 대해 특이적인 결합 친화력을 가지는데, 프로테아제는 리간드에 결합 시에 면역-복합체를 형성한다. 예를 들면, 테그는 항체가 바로 이용할 수 있는 독특한 에피토프를 포함한다. 또는, 테그에는 금속-킬레이트 아미노산 (가령, His)를 포함하여, IgA 프로테아제가 금속-켈레이트 수지 또는 비드와 복합체(예를 들면, 니켈-NTA 비드)를 형성할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 테그에는 효소와 같은 감지가 능한 마커를 포함하거나 또는 감지가능한 마커로 라벨할 수 있는 아미노산 으로 구성된다. 감지가 능한 마커에는 방사능 동위원소, 형광 분자, 발색 분자, 발광 분자, 효소등이 포함될 수 있다. 본 발명에서 유용한 감지가 능한 마커에는 라벨된 스트렙타아비딘 콘쥬게이트로 착색할 수 있는 바이오틴, 형광 염료(플로레신, 텍사스 레드, 로다민, 그린 형광 단백질 등), 방사능라벨(예를 들면., ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, ³²P), 효소(예를 들면, 서양고추냉이 과산화효소(horse radish peroxidase), 알칼리 포스포타제, ELISA에서 흔히 사용되는 효소), 콜로이드성 골드와 같은 발색 라벨등이 있다. 이와 같은 적절한 마커 사용에 관한 특허에는 U.S. Pat. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; 4,366,241(전문은 참고문헌으로 첨부됨)가 있다.

본 발명에 따른 적절한 테그에는 c-Myc, HA,VSV-G, HSV, FLAG, V5, HIS등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 각 테그의 아미노산 및 핵산 서열은 다음과 같다;

테그 펩티드 및 핵산 서열

HIS

단백질: HHHHHH (SEQ ID NO:6)

DNA: CAC CAT CAC CAT CAC CAT (SEQ ID NO:7)

c-Myc

단백질: EQKLISEEDL (SEQ ID NO:8)

DNA: GAG CAA AAG CTC ATT TCT GAA GAG GAC TTG (SEQ ID NO:9)

HA

단백질: YPYDVPDYA (SEQ ID NO:10)

DNA: TAC CCT TAT GAT GTG CCA GAT TAT GCC (SEQ ID NO:11)

VSV-G

단백질: YTDIEMNRLGK (SEQ ID NO:12)

DNA: TAT ACA GAC ATA GAG ATG AAC CGA CTT GGA AAG (SEQ ID NO:13)

HSV

단백질: QPELAPEDPED (SEQ ID NO:14)

DNA: CAG CCA GAA CTC GCC CCG GAA GAC CCC GAG GAT (SEQ ID NO:15)

V5

단백질: GKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO:16)

DNA: GGC AAA CCA ATC CCA AAC CCA CTG CTG GGC CTG GAT AGT ACT (SEQ ID NO:17)

FLAG

단백질: DYKDDDDKG (SEQ ID NO:18)

DNA: GAT TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA GGA (SEQ ID NO:19)

IgA1 펩티드에 테그를 위치시키면 in vivo 및 in vitro 모두에서 IgA1 프로테아제를 용이하게 감지할 수 있는 장점이 있다. 항체에 대한 에피토프로 구성된 테그는 항-테그 항체 또는 감지가 능한 마커에 콘쥬게이트된 항체를 이용하여 감지할 수 있다. 감지가 능한 마커는 자연발생적 아미노산 또는 방사능라벨(예를 들면, ¹²⁵I, ³⁵S), 형광 또는 발광기, 바이오틴, 합텐, 항원 및 효소를 가지는 비-자연발생적 아미노산 이 될 수도 있다. c-myc, HA, VSV-G, HSV, V5, His, FLAG와 같은 테그에 이용할 수 있는 시판되는 항체들이 있다. 또한, 본 발명에 이용된 테그에 대한 항체는 항체를 만드는데 이용되는 표준 방법을 이용하여 만들 수 있는데, 예를 들면 면역단클론 항체 생산(Campbell, A.M., Monoclonal Antibodies Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, the Netherlands (1984); St. Groth et al., J. Immunology, (1990) 35: 1-21; and Kozbor et al., ImmunologyToday (1983) 4:72) 방법을 이용할 수 있다. 그 다음 항-테그 항체는 방사능동위원소, 친화력 라벨(예를 들면, 바이오틴, 아비딘 등), 효소 라벨(예를 들면, 서양고추냉이 과산화효소, 알칼리 포스포타제 등)을 통하여, 공지의 방법(국제 공재 출원 WO 00/70023 and (Harlour and Lane (1989) Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 1-726; 전문을 참고문헌으로 첨부한다)에 의해 감지가 능하도록 라벨링할 수 있다.

테그를 감지하는 방법에는 Western Blot 분석, 면역조직화학적 검사( Immunohistochemistry), Elisa, FACS 분석, 효소를 이용한 검사, 자가방사선 사진등이 있으나 이에 국한시키지는 않는다. 이들 검사를 실행하는 수단은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 방사능라벨은 사진 필름 또는 신틸레이션 카운터를 이용하여 감지되거나, 형광 마커는 광감지기를 이용하여 감지하거나 또는 방출되는 광을 감지하여 감지될 수 있다. 기질에 효소를 제공하고, 기질상에 효소 작용을 통하여 생성되는 반응 생성물 감지하여 효소 라벨을 일반적으로 감지할 수 있으며, 색을 띈 라벨을 간단히 눈으로 확인하여 발색 라벨을 감지할 수 있다.

테그는 또한 다른 세포 물질로부터 IgA1 프로테아제를 분리해내는데 이용할 수도 있다. 예를 들면, 면역침전 또는 항-테그 항체 친화력 컬럼 또는 항-테그 항체 콘쥬게이트된 비드를 이용할 수 있다. HIS 테그를 이용하는 경우에, 금속-킬레이트 컬럼을 이용하여 분리할 수 있다(Hochuli in Genetic Engineering: Principles and Methods ed. JK Setlow, Plenum Press, NY, chp 18, pp 87-96). 이와 같은 형태의 정제 수단은 당업자에 공지되어 있다.

적절한 구체예에서, 항-테그 항체를 이용하여 IgA1 프로테아제 면역-복합체를 만드는데, 일반 복합되면 IgA1 프로테아제는 효소 활성을 보유한다. 이와 같은 면역-복합체를 IgA1 침착 질환 치료를 위한 약학 조성물로 이용할 수도 있다. 예를 들면, 환자에게 IgA1 면역-복합체를 투여하면, 이 복합체가 환자의 신장의 사구체에 포집되는 것으로 보인다. 이때 사구체는 IgA 신증, 포진상 피부염(DH), 및 헨노흐-쉔라인 자반증 질환에서 IgA1이 침착되는 부위이다.

III. IgA1 침착 질환 치료

여기에서, IgA1 프로테아제를 IgA1 침착 질환 치료용 치료요법제로 이용한다. IgA1 분자가 비정상적으로 침착되면 신부전, 피부 수포, 발진, 관절염, 위장 출혈, 복부 통증을 일으키는 것으로 알려져 있다.

IgA 신증

한 구체예에서, 본 발명은 IgA1 프로테아제 치료를 요하는 환자에 투여하여 IgA 신증을 치료하는 방법을 제공한다. IgA 신증은 신장 질환이다. 이 질환은 면역-복합체-조절된 사구체신염으로, 사구체 맥관막(mesangial) 부위에 과립 IgA1이 축척되는 것을 특징으로 한다. 사구체 맥관막(mesangial) 세포의 증식성이 변화되어 신증이 발생된다.

IgA 신증은 만성 사구체신염의 가장 흔한 형태로써, 신장 질환의 마지막 단계에 나타나는 원인이 된다.

포진상 피부염

본 발명은 치료를 요하는 환자에 IgA1 프로테아제를 투여함으로써 포진상 피부염(DH)를 치료하는 방법을 제공한다. 포진상 피부염은 피부-상피 졍션(junction)부위에 IgA1이 침착되어 생기는 만성 피부 포진 질환이다(Hall, RP & T.J. Lawley, J. Immunol. (1985) 135(3): 1760-5). DH 환자는 과립 IgA1 침착물을 가지고 있어, 글루텐-감응성 장질환(GSE)이 있다.

헨노흐-쉔라인 자반증

또 다른 구체예에서, 본 발명은 치료를 요하는 환자에 IgA1 프로테아제를 투여하여 헨노흐-쉔라인 자반증을 치료하는 방법을 제공한다. 헨노흐-쉔라인 자반증은 피부 및 신장 질환이다. 조직에 IgA를 포함하는 면역 복합체가 침착되는 것이 특징이다. 이 질환은 면역형광 현미경을 통하여 피부 조직 또는 신장에 IgA1 침착 증거를 관찰함으로써 진단된다. 임상적 특징은 일반적으로 발진, 관절통, 복부통증, 신장 질환이 포함된다.

동물 모델

본 발명의 IgA1 프로테아제의 치료요법적 효과는 당분야에 공지된 임의 적절한 동물 모델에서 테스트한다. 일부 예시적인 동물을 아래에서 설명한다.

1. IgA 신증

IgA 신증을 앓는 다수의 들쥐 및 생쥐 모델이 있어, 본원 발명에 이용할 수 있다. 이들 모델들은 Emancipator, S. N. et al., (1987) Animal models of IgA Nephropathy In IgA Nephropathy. A. R. Clarkson, editor. Martinus Nijhoff publishing, Boston. 188-203에서 설명되고 있는데, 전문을 참고문헌으로 첨부한다. 예시적인 모델은 Gesualdo L. et al, (1990) J. Clin. Invest. 86: 715-722,에서 설명하고 있으며, 전문을 참고문헌으로 첨부한다. 간략하게 설명하면, 생쥐에 IgA 항체/덱스트란 설페이트 복합체를 주사한다. 면역-복합체는 신장에 머무르게 되고, 사구체신염을 가진 생쥐는 사람의 IgA 신증의 전형적인 경우를 닮는다. 이동물을 어떻게 만드는지, 그리고, 치료요법제를 테스트에 어떻게 이용하는 지에 대해서는 하기에서 상세하게 설명한다.

덱스트란 설페이트의 가용성 복합체(500 kD, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 및 단클론 IgA anti-b1-6 글리코시드 (J558: Litton Bionetics, Kensington, MD)를 3배 과량으로 준비한다 (26.5 mg 덱스트란/mg J558 (Nephropathy model); 22.0 mg 덱스트란/mg MOPC 104 E (정상 기준)). 3mg 항체를 포함하는 복합체를 Swiss-Webster 생쥐의 꼬리 정맥으로 주사하였다. 1시간 후에, 신장에 IgA 복합체가 최대로 축척되면, 생쥐에 주어진 간격(10분)으로 염 또는 치료요법제를 복막으로 주사한다. 마지막 주사후 1시간에 생쥐를 죽인다.

각 생쥐로부터 신장을 분리하여, 광, 면역형광, 전자현미경을 이용하여 IgA1 침착 및 형태를 관찰하였다.

간략하게 설명하면, IgA1 침착을 모니터하기 위해, 신장 피질의 스넵냉동(snap-frozen) 샘플을 4um크기로 저온유지장치에서 잘라낸 후, 생쥐 IgA(US Biochemical Corp)에 특이적인 염소 항혈청의 형광물질 결합된 IgG 분취물로 직접 면역 형광법을 이용하여 착색시켜, IgA1 침착에 대해 세미-정량화하였다(Nakazawa, M. et al., (1986) Lab. Invest. 55:551-556, and Nakazawa, M. et al., (1986) J. Exp. Med. 164:1973-1987). 정상 신장에서 관찰되는 IgA1 침착 수에 비하여 IgA1 침착 수가 감소된 경우에, 치료요법제로써 효과 물질이라고 간주한다.

PAS 시약 (Gesualdo, L. et al, (1990) J. Clin. Invest. 86: 715-722)을 이용하여 신장 피질 부분을 착색시킴으로써, 맥관막 매트릭스의 확장 및 맥관막 과다-다세포성(hypercellularity)과 같은 형태학적 변화를 기록한다. 간략하게 설명하면, 신장 피질을 100% 포르말린으로 고정시키고, 파라핀에 박아서, 착색시킨다. Nakazawa, M. et al. (1986) Lab. Invest. 55:551-556, and Nakazawa, M. et al. (1986) J. Exp. Med. 164:1973-1987,(전문은 참고문헌으로 첨부한다)에서 설명하는 방법에 따라, 맥관막 팽창 및 맥관막 과다 -다세포성을 기록한다.

정상 맥관막 매트릭스를 0으로 한다. 맥관막 매트릭스 팽창은 확장된 맥관막 축이 관찰되는 경우에 +1로 기록하고; 모세관 관강상에 매트릭스 침식이 관찰되는 경우에 +2로 기록하고; 맥관막 축이 눈에 띄게 관찰되면서 동시에 모세관 관강이 감소된 경우에 +3으로 기록한다. 정상 신장에서 관찰되는 매트릭스의 형태에 대해 맥관막 매트릭스의 확장이 감소된 경우, 예를 들면, +2, or +1, 0으로 기록되는 경우에, 치료요법제가 효과가 있다고 간주한다.

정상적인 맥관막 세포성을 0으로 하고, 맥관막 부위당 3개 또는 그 이하의 세포 핵을 가지는 것을 정상으로 정의한다. 맥관막 부위당 4 내지 6개 세포 핵이 관찰되는 경우에, 과다세포성을 +1로 하고; 일부 지역에서는 7개 또는 그이상의 핵을 가질 수도 있는데, 이경우에, 맥관막 부위당 7개이상 세포 핵이 관찰되는 경우에, 과다세포성을 +3로 한다. 정상 신장에서 관찰되는 매트릭스의 형태에 대해 맥관막 과다세포성이 감소된 경우, 예를 들면, +2, or +1, 0으로 기록되는 경우에, 치료요법제가 효과가 있다고 간주한다.

컴퓨터를 이용한 형태계측을 통하여(Cue image analysis system, Olympus Corp., Columbia, MD.) (Gesualdo L. et al, (1990) J. Clin. Invest. 86: 715-722), 각 생쥐에서 무작위로 선정된 사구체에서 전체 사구체 면역, 매트릭스 면적, 사구체 세포성을 정량화한다. 간략하게 설명하면, 피질 조각을 2.5% 글루타알데히드/0.1 M 카코딜레이트나트륨염(sodium cacodylate)에 고정시키고, 후에 1% OsO₄에 고정시키고, Spurr's 에폭시(Polysciences, Inc. Warrington, PA)에 끼워 넣는다. 50-70 nm 조각을 우라닐 아세테이드 및 하이드록시 납으로 착색시켰다. JEOL JEM 100 EX 현미경에서 코드화된 눈검을 검사하고, Nakazawa, M. et al., (1986) J. Exp. Med. 164:1973-1987,(전문을 참고문헌으로 첨부)에서 설명하는 것과 같은 방법으로 매트릭스, 세포성 및 면역 침착에 대해 반-정량화한다.

혈뇨증 (뇨에 적혈구 세포가 존재하는 경우) 및 단백뇨 (뇨에 단백질이 존재하는 경우)도 IGA 신증의 유무를 측정하는 적절한 가늠자가 된다. 간략하게 설명하면, 생쥐를 대사성 우리(metabolic cages)에 두고, 24시간동안 뇨를 수거한다. 그 다음 뇨를 원심분리하여, 3% 살리실산(sulfalicylic acid)에서 탁도를 측정하여 단백질 검사를 하고, Nakazawa, M. et al., (1986) J. Exp. Med. 164:1973-1987(전문은 참고문헌으로 첨부함)에서 설명하는 방법을 이용하여, 현미경을 통하여 혈뇨를 검사한다. 일반적으로 IgA 신증이 없는 정상적인 생쥐에서는 고배율현미경시야상(high power field 40X)에서 3개 미만의 적혈구 세포를 가지나, IgA 신증이 있는 생쥐의 경우는 고배율현미경시야상(high power field 40X)에서 10개 이상의 적혈구 세포를 가질 것이다. 고배율현미경시야상(high power field 40X)에서 적혈구의 세포 수가 감소되었다는 것은 IgA 신증에 치료요법제가 효과가 있다는 것을 의미한다. 혈뇨증 및 단백뇨에 대해 생쥐를 사전 테스트한 후에, 질병의 관련 치료 지수를 결정한다. 치료전에 수득한 단백뇨 및 혈뇨 수치와 비교하였을 때, 관련 수치가 감소되었다면, 예를 들면, 치료후에 수치가 5%, 10%, 30%, 40% 적절하게는 50%, 그리고 가장 적절하게는 50% 이상 감소되었다면, IgA 신증 치료에 치료요법제가 효과가 있다는 것을 의미한다 .

IV 약량 , 조성, 투여

여기에서 박테리아성 IgA 프로테아제를 이용하여 IgA 침착 질환을 치료한다. 본 발명의 IgA1 프로테아제를 약학적으로 수용 가능한 캐리어에 복합시켜 조성물로 사용한다. 이와 같은 조성물에는 희석제, 충진제, 염, 완충액, 안정화제, 가용제 및 당분야에 공지된 다른 물질들이 포함될 수도 있다. 한 측면에서 IgA1 프로테아제를 항체와 복합시켜, 치료요법적 면역-복합체를 만들 수도 있다. 이와 같은 치료요법적 면역-복합체는 특히 신장에 IgA 1 침착으로 인한 질병을 치료하는데 유용한데, 그 이유는 큰 면역 복합체를 투여시에 신장 사구체에 안착하기 때문인 것으로 본다.

"약학적으로 수용가능한"이란 활성 성분(들)의 생물학적 활성을 간섭하지 않는 비-독성 물질을 의미한다. 캐리어의 특징은 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 이와 같은 캐리어에는 염, 완충염, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 복합물이 될 수 있다. 경구를 통하여 약물을 투여하는 경우에, 약학적으로 수용가능한 캐리어에는 비활성 희석제, 분해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 첨향제, 발색제, 방부제와 같은 약학적으로 수용가능한 부형제를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 적절한 비활성 희석제에는 탄산나트륨 및 탄산칼슘염, 인산나트륨 및 인산칼슘염, 락토즈등이 포함될 수 있고, 옥수수 전분 및 알긴산이 적절한 분해제가 될 수 있다. 결합제에는 전분 및 젤라틴이 포함될 수 있고, 윤활제에는 스테아레이트 마그네슘, 스테아린산 또는 활석이 일반적이다. 원하는 경우에, 정제에 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트 등으로 피복시킴으로써 위장에서 흡수를 지연시킬 수 있다.

약학적으로 수용가능한 염은 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 아스파라테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 비스설페이트 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포로셀포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 펩파노이에트, 하이드로클로라이드 하이드로브로미드, 하이드로요오드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 티오시네이트, 토실레이트, 운데카노에이트 등과 같은 무기산에 의해 만들 수 있다. 염기성염에는 암모늄 염, 나트륨, 칼륨염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘 및 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속염, 디사이클로헥실아민, N0메틸-D-글루카민과 같은 유기염기 염, 아르기닌, 리신과 같은 아미노산이 결합된 염등이 포함된다. 또한, 염기성 질소를 포함하는 군은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 염화부틸, 브롬, 요오드와 같은 저가 알킬 할로겐에 의해; 디메틸, 디에틸, 디부틸, 디아밀 설페이트와 같은 디알킬 설페이트에 의해; 염화 데실, 염화 라우릴, 염화 미리스틸, 염화 스테아릴과 같은 긴 쇄를 가진 할로겐화물에 의해; 브롬화 벤질, 브롬화 페닐에틸과 같은 아랄킬 할로겐화물에 의해 4차화(quarternized)될 수도 있다. 따라서, 물 또는 오일에 가용성 또는 분산되는 산물을 수득하게 된다.

조성물에는 조성물의 활성을 강화시키거나 치료에 이용되거나 활성을 보강할 수 있는 또는 저장동안에 치료요법제의 활성을 유지시킬 수 있는 다른 물질이 포함될 수도 있다. 이와 같은 추가 인자/물질이 조성물에 포함되어, 시너지 효과를 얻거나 부작용을 최소화시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 다른 치료요법제와 동시에 투여할 수도 있다.

본 발명의 치료요법제 투여는 다양한 방식으로 이루어질 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 흡입, 국소 투여 또는 피부, 피하, 복막, 장관외 또는 정맥 등으로 투여될 수 있다.

본 발명의 치료요법제를 포함하는 조성물의 단위 약량을 정맥 주사할 수 있다. “단위 약량”이란 개체에 물리적으로 개체에 투여되는 별개의 단위 약량을 말하는 것으로써, 각 단위 약량에는 요구되는 희석제 예를 들면, 캐리어 또는 비이클(vehicle)과 연합하여 소요의 치료요법 효과를 창출하기 위해 계산된 활성 물질의 예측 량을 포함하고 있다.

본 발명의 치료요법제의 투여 방법에는 정맥, 근육내, 복막내, 흉골내, 피하내, 동맥 주사 및 주입등이 포함된다. 장관외 주사를 위한 약학 조성물에는 약학적으로 수용가능한 멸균 수용액 또는 비수용액, 분산액, 현탁액, 에멸젼 뿐만 아니라 멸균 분말로 구성되어, 사용하기 직전에 멸균 주사용액 또는 분산액에 멸균 분말을 녹여 재구성하는 것도 포함된다. 적절한 수용성 또는 비수용성 캐리어, 희석액, 용매 또는 비이클에는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카르복시메틸셀룰로오즈, 이의 적절한 혼합물, 식물성 오일 (예를 들면, 올리브 오일), 에틸 올레이트와 같은 주사용 유기 에스트르 등이 포함된다. 레시틴과 같은 코팅 물질을 이용하거나, 분산 경우에 요구되는 입자 크기를 유지시키거나, 계면활성제를 이용하여 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다. 이와 같은 조성물에는 보존제, 가습제, 유화제, 분산제와 같은 어쥬번트를 포함할 수도 있고, 치료요법제의 면역학적 결정부위를 보호하기 위한 화합물이 포함될 수도 있다. 미생물의 작용을 방지하기 위해 다양한 항균 및 항곰팡이제, 예를 들면, 파라빈, 클로로부탄올, 페놀 소르빈산 등을 포함시킬 수도 있다. 당, 염화나트륨과 같은 등장성 물질을 포함시키는 것도 바람직하다. 주사용 약령의 흡수를 연장시키기 위해, 흡수를 지연시키는 모노스테아레이트 알루미늄, 젤라틴과 같은 물질을 포함시킬 수 있다. 생분해가능한 폴리머 예를 들면, 폴리락티드-폴리글리콜리드, 폴리(오르소에스테르), 폴리(안하이드리드)에 치료요법제의 미소캡슐 매트릭스를 만들어 주사용 데포우 형를 만든다. 이용되는 특정 폴리머의 성질 및, 폴리머에 대한 치료요법제의 비율에 따라 치료요법제 방출 속도를 조절할 수 있다. 신체 조직에 적합한 리포좀 또는 마이크로에멸젼에 치료요법제를 포집시켜, 데포우(Depot) 주사용 조성물을 만들 수도 있다.

박테리아를 걸러내는 필터를 통과시켜 멸균하거나 또는 사용하기 직전에 물 또는 다른 매체에 분산 또는 용해시킬 수 있는 멸균 고형 조성물 형태로 멸균 주사용 조성물을 만들 수 있다.

조성물에는 경구, 직장, 안구(intravitreal or intracameral), 비강, 국소(볼, 혀), 자궁내, 질내, 장관외(피하, 복막, 근육, 정맥, 경피, 두개골, 기관내(intratracheal), 경막내(epidural)) 투여에 적합해야 한다. 조성물은 단위 약형으로 통상 제공되며, 통상의 약리학적 기술을 이용하여 만들 수 있다. 이와 같은 기술에는 활성 성분, 약리학적 캐리어 또는 부형제를 연합시키는 단계가 포함된다. 일반적으로 조성물은 액체 캐리어 또는 미세하게 분배된 고형 캐리어에 활성 성분을 우선 연합시키고, 필요한 경우에 최종 상품 모양으로 만든다.

장관외 투여에 적절한 조성물에는 수용성 및 비-수용성 멸균 주사 용액이 포함되는데, 이들 용액에는 항산화제, 완충액, 정균제, 개체의 혈액과 조성물이 등장성이 되도록 도와주는 용질이 포함될 수 있다; 현탁 물질 및 농후 물질이 포함될 수 있는 수용성 및 비-수용성 멸균 현탁액이 될 수도 있다. 조성물은 단위 약령 또는 멀티도즈(multi-dose) 용기로 제공될 수 있다. 이미 설명된 바와 같이, 멸균 분말, 과립, 정제로부터 일시적 주사 용액 및 현탁액으로 만들 수도 있다.

여기에서 사용한 바와 같이, “제약학적으로 효과적인 약량”이란 약학 조성물의 각 활성 성분의 총량을 의미하거나, 의미있는 잇점을 환자에서 얻을 수 있는 방법, 즉, 관련 의학적 증상의 치료, 처치, 예방 또는 경감이 되거나 또는 이와 같은 증상의 치료, 처치, 예방 또는 경감 속도가 증가되는 것을 말한다. 개별 활성 성분을 단독으로 투여할 때, 활성 성분만의 양을 의미한다. 다른 성분과 연속 또는 동시에 복합 투여시에, 치료요법적 효과를 얻은 활성 성분의 복합 량을 의미한다. 일반적으로, 조성물을 체중 ㎏당 100㎍ 내지 10㎎ 범위의 단일 약량으로 투여될 수 있고, 적절하게는 체중 ㎏당 1㎍ 내지 100㎍의 양으로 투여할 수 있다. 이와 같은 약량을 매일, 매주, 매월, 매년 또는 치료의사가 정한 적절한 주기로 투여할 수 있다.

본 발명의 치료요법적의 효과량을 구강으로 투여할 때, 본 발명의 조성물을 액상형태로 제공할 수 있으며, 조성물에는 본 발명의 단백질을 중량당 약 0.5 내지 90% 포함하고, 적절하게는 본 발명의 단백질을 약 1 내지 50%포함한다.

본 발명의 치료요법제의 효과량을 정맥, 피부 또는 피하 주사를 이용하여 투여하였을 경우에, 단백질은 발열물질이 포함 안된 장관외 수용가능한 수용액으로 제공될 수 있다. 이와 같은 장관외 수용가능한 단백질 용액의 pH, 등장성, 안정성등은 당업자가 정할 수 있는 범위가 된다. 정맥, 피부 또는 피하 주사용액의 적절한 조성물에는 본 발명의 단백질이외에도 염화나트륨 주사액, 링거주사액, 덱스트로즈 주사액, 덱스트로즈 및 염화나트륨 주사액, 락테이트화된 링거 주사액과 같은 등장성 비이클(vehicle) 또는 당분야에 공지된 다른 비이클이 포함되어야 한다. 본 발명의 조성물에는 또한 안정화제, 보존제, 완충액, 항산화제 또는 당분야에 공지된 다른 첨가제가 포함될 수 있다.

포진상 피부염 치료에는 조성물을 조직과 접촉시켜 국소 투여가 적절한 수 있다. “접촉”이란 의미는 국소적으로 사용하는 경우 뿐만 아니라 조직 또는 조직의 세포로 조성물을 도입시키는 운반 방식을 의미하기도 한다.

본 발명에는 또한 예정된 방출 또는 서방(sustained release delivery) 시스템도 포함된다. 이와 같은 시스템은 나이가 많거나 질병으로 인하여 쇠약해진 환자에서 수술이 어렵거나 불가능한 경우 또는 위험 효용 분석( risk-benefit analysis)에서 치료가능한 경우에 에 매우 바람직하다.

여기에서 사용된 바와 같이, 서방형 매트릭스는 효소 또는 산/염기 가수분해 또는 용해에 의해 분해될 수 있는 폴리머와 같은 물질로 만들어진 매트릭스이다. 체내로 일단 삽입되면, 매트릭스는 효소 및 체내 유체에 의해 작용을 시작한다. 서방형 매트릭스는 리포좀, 폴리락티드(폴리라틱산), 폴리글리코리드(글리콜산 폴리머), 폴리락티드 co-글리코리드(락트산과 글리콜산의 공동폴리머), 폴리안하이드리드, 폴리(오르소)에스테르, 폴리프로테인, 하일루론산, 콜라겐, 콘트로이틴 설페이트, 카르복실산, 지방산, 포스포리피드, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산(페닐알라닌, 티로신, 이소루이신), 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 실리콘 등의 생분해성 물질에서 선택된다. 적절한 생분해성 매트릭스는 폴리락티드, 폴리락티드 co-글리코리드(락트산과 글리콜산의 공동 폴리머) 로 된 매트릭스이다.

본 발명의 제약학적 조성물의 양은 치료할 질병의 성질 및 심각성, 환자가 받았던 이전 치료의 성질에 따라 달라진다. 궁극적으로 본 발명의 치료요법제의 양은 환자를 치료하게 되는 의사가 결정한다. 우선, 의사는 낮은 약량의 치료요법제를 투여하고, 환자의 반응을 관찰할 수 있다. 환자에서 최적의 치료효과를 얻을 때 까지 약량을 증가시켜 투여할 수 있고, 최적의 시점에부터는 약량을 더 이상 증가시키지 않는다.

본 발명의 약학 조성물을 이용하여 정맥 치료하는 기간은 치료될 질병의 상태 및 각 개별 환자의 특징적인 반응에 따라 다양해질 수 있다. 본 발명의 치료요법제의 사용 기간은 연속 정맥 투여의 경우(시간당 약 30㎎으로), 12 내지 72시간 범위가 될 수 있다. 결국 본 발명의 조성물을 이용하여 정맥 투여할 경우 시간은 의사가 결정할 수 있다.

실시예 1. 테그된 IgA1 프로테아제 작제

Haemophilus influenzae IgA1 프로테아제를 인코드하는 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 pFG26을 이용하여 PCR- 부위 돌연변이 형성을 통하여, Haemophilus influenzae IgA1 프로테아제내로 His 테그를 in frame 융합시켰다. 도 4에서 설명하는 것과 같이, pFG26에서 2개 PCR 단편을 만들었다. 제 1 단편인 XbA 1 및 pml 1 단편(새로 삽입된 HIS 테그 및 pml 1 부위가 포함됨)은 하기에서 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머 "HFD6His1"(프라이머 1) 및 "HFD6His2"(프라이머 2)를 이용하여 만들었다. 2번째 단편인, pmL I 및 Acc I 단편은 하기에서 나타낸 프라이머 3 및 4를 이용하여 만들었다.

프라이머 1: HFD-5 XbaI: 5' GATCCGCTTACCAATTATGC 3' (SEQ ID NO:20)

프라이머2:HFD6His1:

5'CTTGGTACGCTAGGCACGTGATGATGATGATGATGAGGTGTTGTGATATTTGTCG-3

(SEQ ID NO:21)

프라이머 3: HFD6His2:

5'-CCTAATAATATTCAAGCTCACGTGCCTAGCGTACC-3' (SEQ ID NO:22)

프라미머 4: HFD-F-ACCI: 5'-TTCAGCAGAAGTCTCTTGC-3' (SEQ ID NO:23)

PCR을 이용하여 두개 단편을 증폭시킨 후에, 단편은 Xba I 및 Pml I 또는 Pml I 및 Acc I으로 절단하고, 통상적인 방법을 이용하여 모체 pFG26의 Xba I 및 Acc I 부위에 결찰시킨다. DNA 서열로 돌연변이를 확인하고, 새로운 플라스미드는 pJQ/Rd6His로 명명한다. 단편은 6개 히스티딘을 인코드하는 DNA가 IgA1 프로테아제의 1007-1012의 고유 코돈을 대체할 수 있도록 고안한다 ; asn-asn-ile-gln-ala-asp (SEQ ID NO:24).

실시예 2. 테그된 IgA1 프로테아제를 발현시키는 세균 균주 작제.

효소적 활성을 가지는 테그된 IgA1 프로테아제만을 발현시키는 Haemophilus influenzae 박테리아 균주를 표준 재조합 기술을 이용하여 만든다. 간단하게 설명하면, 실시예 1에서 만든 플라스미드 pJQ/Rd6His를 제한효소 Cla I 및 Nde I으로 절단한다. 유전자를 분리시키고, 효소 활성 없는 IgA1 프로테아제 생산하는 Haemophilus influenzae 박테리아 Rd 균주(Rd 3-13)로 형질도입시켜(Plaut AG, Qiu, J, Grundy, F. and Wright, A. J Infect Dis. (1992) Jul;1 66(1):43-52), 재조합에 의해 박테리아 게놈에 His-테그된 IgA1 프로테아제를 삽입시킨다. 그 다음 기질로 사람의 IgA1을 이용하여 활성 프로테아제 존재에 대해 선택된 콜로니의 박테이라 생장 배지를 테스트함으로써 효소 활성 복원된 형질변환된 박테리아를 선별한다.

활성 효소에 6-His 돌연변이 도입은 게놈 DNA의 PCR 단편을 이용하여, Pml I 부위가 존재하는 것을 증명하여 확인한다.

Rd 6His 균주는 야생형 균주 Rd와 동일한 생장 속도 및 콜로니 형태를 가진다. IgA 프로테아제 활성 및 활성의 크기는 야생형과는 구별할 수 없다. 6개 His 돌연변이가 자가-단백질 분해성 a 부위로부터 2개 아미노산 떨어진 위치에 도입되었지만, 박테리아 세포에서 효소 분비 또는 자가-프로세싱에 대해 감지될 정도의 문제는 없다.

웨스턴 블랏 분석을 통하여, 단클론 항-5His 항체(Qiagen, Inc)가 프로테아제에 결합된 것을 측정한다. 용액내 단클론 항체와 복합되는 경우에, Rd 6His IgA 프로테아제는 완전한 활성을 가진다.

실시예 3.

IgA 신증 치료를 위한 IgA1 프로테아제의 치료요법적 효과는 IgA 신증이 있는 생쥐 모델에서 연구될 수 있다.

Multiple Swiss-Webster mice (Charles River Laboratories)를 실험에 이용하는데, 이를 그룹으로 나눈다(일반적으로 1그룹에 10마리). 우선 생쥐를 대사실에 두고, 24시간 동안 소변을 모아서, 혈뇨 (노에 혈액세포가 존재) 및 단백뇨 (뇨에 단백질이 존재)가 있는 지를 결정한다. 이것은 정상적인 건강한 생쥐에서의 혈뇨 및 단백뇨의 기초 값이 된다. 그 다음 IgA 신증을 생쥐에 도입시킨다(Gesualdo L. et al, (1990) J. Clin. Invest. 86: 715-722).

신증을 유도한 후에, 생쥐에 염(기준), 비활성 IgA1 프로테아제(기준), 활성 IgA1 프로테아제, IgA1 프로테아제+이뮤노글로블린(항-테그 항체와 복합, 또는 anti-IgA1 프로테아제 항체와 복합)을 복막으로 주사하였다. 약량 범위는 5일간 1일 2회씩 프로테아제를 0.1-0.5 mg 량으로 복막으로 주사하는 것이다. 단일 생쥐에서 파일롯 실험(pilot experiments)에서 관찰된 치료효과에 따라 약량 및 섭생은 다양하게 변할 수 있다. 일반적으로, 조직학적 임상 독성학 효과를 유도하지 않는 최대 약량을 선택한다. IgA1 프로테아제가 리간드와 복합되면, 리간드의 농도를 다양하여 이용하여 가장 효과적인 프로테아제/리간드 비율을 결정할 수 있다. 투여 방법을 다양하게 할 수도 있는데, 예를 들면 정맥 주사를 할 수도 있다.

치료요법제를 마지막으로 투여 후 1-24시간에, 생쥐에서 IgA 신증 완화에 대해 테스트하는데, 이때 치료요법제를 제공받지 않은 생쥐에서 혈뇨와 단백뇨를 측정하여 테스트한다. 치료요법제를 투여받지 않은 생쥐의 것과 비교하였을 때 혈뇨 및 단백뇨의 양이 건강한 생쥐에서 관찰된 값에 근접하게 감소한 경우에 치료제가 성공적이라는 것을 나타낸다.

IgA 신증의 형태학적 변화를 측정하여 평가할 수도 있다. 뇨를 받은 후 생쥐를 죽이고, 신장을 떼내어 i) IgA1이 침착된 양을 측정하고, ii) 맥관막 매트릭스의 확장을 측정하고; iii) 상기에서 설명한 바와 같이 맥관막 과다세포성을 측정한다. 치료요법제를 제공받지 않은 생쥐의 것과 비교하였을 때, 변수 i)-iii)이 감소된 경우에 치료요법제가 성공적임을 나타내는 것이다.

실시예 4.

포진상 피부염 치료에 IgA1 프로테아제의 치료요법적 효과는 포진상 피부염 생쥐 모델에서 테스트할 수 있다.

실시예 5.

헨노흐-쉔라인 자반증에 IgA1 프로테아제의 치료요법적 효과는 헨노흐-쉔라인 자반증 생쥐 모델에서 테스트할 수 있다.

여기에서 언급한 모든 특허, 특허 출원, 공개 문헌은 전문을 참고문헌으로 첨부한다. 적절한 구체예를 통하여 본 발명을 특별히 설명하였으나, 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 변화가 가능하며, 이 또한 본 발명의 범주에 속함을 인지할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> New England Medical Center Hospitals, Inc. Plaut, Andrew G Qiu, Jiazhou <120> Treatment of IgA1 Deposition Diseases <130> 28154/2068 <140> Not yet assigned <141> 2004-03-05 <150> US 60/453055 <151> 2003-03-07 <160> 26 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser 1 5 10 15 Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys 20 25 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 2 Ile Thr Thr Pro Asn Asn Ile Gln Ala Asp Val Pro Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated Protease Sequence <400> 3 Ile Thr Thr Pro His His His His His His Val Pro Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 1694 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 4 Met Leu Asn Lys Lys Phe Lys Leu Asn Phe Ile Ala Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Tyr Ala Leu Thr Pro Tyr Thr Glu Ala Ala Leu Val Arg Asp Asp Val 20 25 30 Asp Tyr Gln Ile Phe Arg Asp Phe Ala Glu Asn Lys Gly Arg Phe Ser 35 40 45 Val Gly Ala Thr Asn Val Glu Val Arg Asp Lys Asn Asn His Ser 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tatctcaaga tccgcttacc 840 aattatgctg ttttaggcga cagtggctcc ccattatttg tatatgatag agaaaaagga 900 aaatggcttt ttcttgggtc ttatgatttt tgggcaggtt ataacaaaaa atcttggcaa 960 gaatggaata tttataaacc tgaatttgca aaaactgttc tagataaaga tactgcaggt 1020 tctttaactg gttctaacac ccaatacaat tggaatccta ctggcaaaac aagcgttatt 1080 tctaatggtt ctgaatctct aaatgttgat ttattcgata gtagtcagga tactgactct 1140 aagaagaaca atcacggaaa aagtgtgact cttagaggaa gtggaacgct taccttaaat 1200 aataatatcg atcaaggcgc aggcggcttg ttctttgaag gagattatga agttaaaggc 1260 acttctgata gtaccacttg gaaaggagct ggcgtttctg ttgctgatgg aaaaacagta 1320 acgtggaaag tacataaccc gaaatctgat cgtttagcta aaatcggcaa aggaacatta 1380 attgtagaag gaaagggaga aaataaaggt tcgctaaaag tgggcgatgg tactgttatc 1440 ttaaaacaac aagctgatgc caataataaa gttaaagcct tttcacaagt aggtatagta 1500 agtggtcgct caactgttgt acttaatgat gataagcaag tagatccaaa ttccatttac 1560 tttggcttta gaggtggtcg attagatgcc aatggcaata atctcacttt tgaacatatc 1620 cgtaatattg atgatggcgc aagactagta aatcacaata ccagcaaaac ctctactgta 1680 acaattactg gggaaagtct aattacagat ccaaatacaa ttactccata taatatagac 1740 gcaccagatg aagataatcc ttatgccttt cgacggatta aagatggagg acagctctat 1800 ttaaatttgg aaaattacac ttattatgcg ttaagaaaag gtgcgagcac tcgttcagaa 1860 ttacctaaaa atagtggcga aagcaatgaa aattggctat atatgggtaa aacttccgat 1920 gaagccaaaa gaaatgtaat gaaccatatc aacaacgagc gtatgaatgg ctttaacggt 1980 tattttggcg aggaagaggg taaaaataac ggtaatctaa atgtgacttt taaaggcaaa 2040 agtgagcaaa atcgcttttt attaacaggc ggaacaaacc ttaatggcga tttaaaggtt 2100 gaaaaaggca cattattcct ttctggcaga ccaacaccgc acgcaagaga tattgcaggt 2160 atttcttcga caaaaaaaga tcaacacttt gctgaaaata atgaagtggt agtagaagat 2220 gactggatta accgcaattt taaagcaaca aatattaatg taaccaataa cgcaaccctt 2280 tattcaggtc gcaatgttgc aaacattact tcaaatatca cagcttctga taatgcaaaa 2340 gtacatattg gctataaagc aggcgatacc gtttgtgtac gttctgacta tacgggctat 2400 gtgacttgca ctactgacaa gttatccgat aaagccctta atagctttaa cgccaccaat 2460 gtatctggca atgtaaattt atcaggtaat gcaaactttg 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taacaaaagc gaaacaagcg 5040 gaaaaacaaa aaactgcaga attaaaacta agttttagtt tttaa 5085 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterologous peptide tag sequence <400> 6 His His His His His His 1 5 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide encoding heterologous peptide tag sequence <400> 7 caccatcacc atcaccat 18 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterologous peptide tag sequence <400> 8 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide encoding heterologous peptide tag sequence <400> 9 gagcaaaagc tcatttctga agaggacttg 30 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterologous peptide tag sequence <400> 10 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide encoding heterologous peptide tag sequence <400> 11 tacccttatg atgtgccaga 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tcccaaaccc actgctgggc ctggatagta ct 42 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterologous peptide tag sequence <400> 18 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly 1 5 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide encoding heterologous peptide tag sequence <400> 19 gattacaaag acgatgacga taaagga 27 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide for site directed mutagenesis <400> 20 gatccgctta ccaattatgc 20 <210> 21 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide for site directed mutagenesis <400> 21 cttggtacgc taggcacgtg atgatgatga tgatgaggtg ttgtgatatt tgtcg 55 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide for site directed mutagenesis <400> 22 cctaataata ttcaagctca cgtgcctagc gtac 34 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide for site directed mutagenesis <400> 23 ttcagcagaa gtctcttgc 19 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 24 Asn Asn Ile Gln Ala Asp 1 5 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide encoding heterologous peptide tag sequence <400> 25 atcacaacac ctaataatat tcaagctgat gtgcctagc 39 <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> Haemophilus influenzae <400> 26 atcacaacac ctcatcatca tcatcatcac gtgcctagc 39 ?? ?? ?? ?? 2 1

Claims

IgA1 프로테아제를 인코드하는 제1 DNA 서열과 테그를 인코드하는 제 2 DNA 서열로 구성되고, 이때 제2 DNA 서열은 IgA1 프로테아제를 인코드하는 DNA 서열의 상류에 위치하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
IgA1 프로테아제로 구성된 제 1 아미노산과 테그로 구성된 제 2 아미노산으로 구성된 분리된 폴리펩티드 분자.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 테그는 단백질 리간드에 특이적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 분자.
제 3 항에 있어서, 단백질 리간드는 항체인 것을 특징으로 하는 분자.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 테그는 c-Myc; HA; VSV-G; HSV; FLAG; V5; HIS에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분자.
IgA 프로테아제를 활성 성분으로 하고, 약학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 IgA 침착 질환 치료용 약학 조성물.
제 6 항에 있어서, IgA1 프로테아제에는 테그가 포함된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 7 항에 있어서, 테그는 리간드에 특이적으로 결합된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 8 항에 있어서, 리간드는 항체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 7 항에 있어서, 테그는c-Myc; HA; VSV-G; HSV; FLAG; V5; HIS에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 6 항에 있어서, 항체는 항-테그 항체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 11 항에 있어서, 항-테그 항체는 anti-HIS; anti-FLAG; anti-MYC; anti-VSV; anti-HA; anti-V5에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
IgA1 프로테아제의 치료요법적 효과량을 환자에 투여하는 것으로 구성된 IgA1 침착으로 인한 질병을 치료하는 방법.
제 2 항에 따른 폴리펩티드 또는 제6항내제 제12항중 어느 한항에 따른 약 학 조성물을 환자에게 투여하는 것으로 구성된 IgA1 침착으로 인한 질병을 치료하는 방법.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 질환은 IgA 신증인 방법.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 질환은 포진상 피부염인 방법.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 질환은 헨노흐-쉔라인 자반증(Henoch-Schoenlein purpura)인 방법.