ES2360291T3 - TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES POR DEPOSICIÓN DE IgA1. - Google Patents

Abstract

IgA1 proteasa para su utilización en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la deposición de IgA1 en un paciente.

Description

Apoyo gubernamental

La invención fue financiada, en parte o en su totalidad, mediante una subvención NIH RO1 DE 09677 de NIH, NIDCR. El gobierno estadounidense tiene determinados derechos sobre la invención.

Antecedentes

La deposición de inmunoglobulina A1 (IgA1) en tejidos y órganos humanos es una característica de muchas enfermedades humanas incluyendo la neuropatía por IgA, la dermatitis herpetiforme (DH) y la púrpura de Henoch-Schoenlein (HS). La deposición de IgA1 es responsable de una variedad de manifestaciones clínicas tales como insuficiencia renal, formación de ampollas cutáneas, exantema, artritis, hemorragia gastrointestinal y dolor abdominal.

Existen varias opciones de tratamiento disponibles para pacientes que presentan deposición anómala de IgA1. Éstas incluyen la administración de corticosteroides que presentan propiedades inmunosupresoras y antiinflamatorias, aportes complementarios de aceite de pescado en la dieta que reducen la inflación renal, e inhibidores de la enzima conversora de angiotensina que reducen el riesgo de enfermedad renal progresiva e insuficiencia renal. Dichos tratamientos no actúan directamente sobre los depósitos de IgA1 en tejido u órganos.

Para tratar este problema de la eliminación de depósitos de IgA1, se han sometido a prueba enzimas proteolíticas exógenas en modelos animales de deposición de IgA1 (Gesualdo L. et al, (1990) J. Clin. Invest. 86: 715-722 y Nakazawa M. et al. (1986) J. Exp. Med 164: 1973-1987). Las proteasas, quimopapaína y subtilisina, actúan mediante escisión proteolítica de los depósitos de IgA1 en el riñón, pero no son específicas para las moléculas de IgA1 y digerirán una variedad de otras proteínas.

Así, pese a los avances en el campo, existe una necesidad en la materia de agentes terapéuticos que puedan utilizarse para tratar las enfermedades por deposición de IgA1.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una IgA1 proteasa para su utilización en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la deposición de IgA1 en un paciente. En la presente memoria se da a conocer la utilización de IgA1 proteasa bacteriana para tratar la deposición de IgA1 en tejido y órganos. Las IgA1 proteasas bacterianas escinden específicamente las moléculas de IgA1 y proporcionan así un medio para escindir y eliminar específicamente las deposiciones de IgA1. Por consiguiente, se dan a conocer agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades caracterizada por la deposición de IgA. En particular, se dan a conocer agentes terapéuticos para tratar la nefropatía por IgA, dermatitis herpetiforme (DH) y púrpura de Henoch-Schoenlein (HS).

En la presente memoria se da a conocer una molécula de ácido nucleico que codifica para una IgA1 proteasa que se fusiona a un marcador de aminoácido ubicado en sentido amino-terminal de un sitio de escisión autocatalítica de la IgA1 proteasa.

En un aspecto, el marcador, que se fusiona a las IgA1 proteasas, es un marcador que se une específicamente a un ligando de proteína, tal como un anticuerpo o péptido. El marcador puede ser c-Myc, HA, VSV-G, HSV, FLAG, V5, o HIS.

En un aspecto, se da a conocer una composición farmacéutica para el tratamiento de la deposición de IgA1 que comprende una IgA1 proteasa complejada con un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-IgA1 proteasa.

En otro aspecto, se da a conocer una composición farmacéutica para el tratamiento de la deposición de IgA1 que comprende una IgA1 proteasa marcada que está complejada con un ligando del marcador. El marcador fusionado a la IgA1 proteasa puede ser c-Myc, HA, VSV-G, HSV, FLAG, V5 o HIS. Por consiguiente, el ligando puede ser un anticuerpo antimarcador, tal como anti-FLAG, antimYC, anti-VSV, anti-HA o anti-V5. Alternativamente, el ligando puede ser un péptido o un ligando no peptídico, tal como una molécula quelante.

En otro aspecto, se da a conocer un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la deposición de IgA1. El procedimiento implica administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una IgA1 proteasa.

En un aspecto, el procedimiento para el tratamiento utiliza una IgA1 proteasa fusionada a un marcador complejada con un ligando del marcador, tal como un anticuerpo antimarcador. El marcador fusionado a la IgA1 proteasa puede ser c-Myc, Flag, HA, VSV-G, HSV, FLAG, V5 o HIS. Por lo tanto, el anticuerpo antimarcador puede ser anti-FLAG, antimYC, anti-VSV, anti-HA o anti-V5.

En otro aspecto, la enfermedad caracterizada por la deposición de IgA1 es nefropatía por IgA, dermatitis herpetiforme o púrpura de Henoch-Schoenlein.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa la región bisagra de IgA1 y los sitios de escisión para varias IgA1 proteasas dentro de la región bisagra (SEC ID nº: 1).

La figura 2a ilustra el precursor de IgA1 proteasa que se somete a escisión autocatalítica y libera una IgA1 proteasa madura soluble mediante la escisión autocatalítica.

La figura 2b representa una IgA1 proteasa en la que se ha fusionado una cola de His a la IgA1 proteasa de manera que la cola de His está dispuesta próxima al extremo carboxilo terminal de la IgA1 proteasa madura. La IgA1 proteasa soluble puede complejarse entonces con un anticuerpo anti-His para fines terapéuticos.

La figura 3 representa una representación esquemática de la proteína precursora de IgA1 proteasa de Haemophilus influenzae Rd y representa una secuencia de aminoácidos que está en sentido amino-terminal del sitio de escisión autocatalítica (sitio a), secuencia original (SEC ID nº: 2). La secuencia mutada (SEC ID nº: 3) representa dónde se ha fusionado una cola de His en marco a una IgA1 proteasa, 2 aminoácidos en sentido amino-terminal del sitio de escisión proteolítica. También se representan las secuencias de ácido nucleico correspondientes de la secuencia original (SEC ID nº: 25) y la secuencia mutada (SEC ID nº: 26).

La figura 4 representa los fragmentos de mutagénesis dirigida al sitio por PCR que se generaron para la inserción de una cola de HIS en la IgA1 proteasa de H. influenzae Rd mediante técnicas de ligamiento convencionales.

La figura 5 representa la secuencia de proteína de Haemophilus influenzae Rd (SEC ID nº: 4).

La figura 6 representa la secuencia de nucleótido de Haemophilus influenzae Rd (SEC ID nº: 5).

Descripción detallada

La presente invención se refiere a la utilización de inmunoglobulina A1 proteasas (IgA1 proteasas) bacterianas para tratar enfermedades que están caracterizadas por la deposición de IgA1.

Definiciones

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “IgA1 proteasa” se refiere a una enzima bacteriana que escinde específicamente moléculas de IgA1 humana. Mediante “escinde específicamente” se hace referencia a que la proteasa escinde en la región bisagra de moléculas de IgA1 humana y no escinde moléculas de IgA2 humana. Las IgA1 proteasas se expresan en bacterias Gram negativas y Gram positivas como un precursor monocatenario que atraviesa la membrana bacteriana. Las IgA1 proteasas de las bacterias Gram negativas se someten a escisión autocatalítica liberando una IgA1 proteasa madura soluble del extremo N-terminal.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ubicado en sentido amino-terminal” se refiere al parámetro espacial de un marcador en el que la secuencia de aminoácidos del marcador está ubicada por lo menos 2 aminoácidos, o 1, o ninguno, en sentido amino-terminal con respecto a, y hasta 50 aminoácidos en sentido aminoterminal con respecto a, el sitio de escisión autocatalítica de la IgA1 proteasa de manera que el marcador está ubicado de 2 ó 1, o ninguno, a 50 aminoácidos en sentido amino-terminal del extremo carboxilo-terminal de la IgA1 proteasa secretada, soluble.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un “marcador” se refiere a una secuencia de polipéptido de 3 a 40 aminoácidos de longitud. Un marcador puede poseer una afinidad de unión específica por un péptido, ligando de proteína, o un ligando no peptídico. La afinidad de unión específica permite que la IgA1 proteasa a la que se fusiona se compleje con un ligando con el fin de que la IgA1 proteasa pueda detectarse, aislarse, aumentarse en una forma compleja, o utilizarse para fines terapéuticos. En la presente memoria, un marcador también comprende un marcador fluorescente, un marcador luminescente o un marcador cromogénico. Los ejemplos no limitativos de marcadores incluyen c-Myc, HA, y VSV-G, HSV, FLAG, V5 y HIS.

Mediante “complejada con un ligando” se hace referencia a que la IgA1 proteasa se une específicamente a una pareja de unión, tal como un anticuerpo, o molécula quelante. La pareja de unión específica puede estar unida a una matriz, tal como una perla. La expresión “se une específicamente” se refiere a la interacción de dos moléculas, por ejemplo, un anticuerpo o una proteína o péptido o un agente quelante, en la que la interacción depende de la presencia de estructuras particulares en las moléculas respectivas. Por ejemplo, cuando las dos moléculas son moléculas de proteína, una estructura en la primera molécula reconoce y se une a una estructura en la segunda molécula, en lugar de proteínas en general. “Unión específica”, tal como se utiliza la expresión en la presente memoria, significa que una molécula se une a su pareja de unión específica con por lo menos una afinidad dos veces mayor, y preferentemente por lo menos una afinidad 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces o superior de lo que se une a una molécula no específica.

Mediante “detectado” se hace referencia a una manera de determinar la presencia o ausencia del marcador, tal como “detección” mediante inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpo monoclonal antimarcador, detección mediante inmunofluorescencia, o detección debida a que el propio marcador fluórese. Los ejemplos no limitativos de marcadores adecuados incluyen c-Myc, Flag, HA, y VSV-G, HSV, FLAG, V5 y HIS.

Mediante “aislada” se hace referencia a que la IgA1 proteasa se separa de los materiales celulares bacterianos, tal como la membrana celular o cualquier proteína o ácido nucleico presente en los medios de crecimiento bacteriano. Los ejemplos de procedimientos no limitativos de aislamiento incluyen el aislamiento de una IgA1 proteasa que presenta una cola de poli-histidinas utilizando perlas o una resina de quelato de metal, inmunoprecipitación, y purificación en columna de afinidad utilizando anticuerpos antimarcador.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “anticuerpo” se refiere a una molécula de inmunoglobulina, o fragmento de la misma, que puede unirse a un antígeno, tal como un marcador o IgA1 proteasa. Se pretende que el término “anticuerpo” incluya anticuerpos completos, por ejemplo, de cualquier isotipo (IgG, IgA, IgM, IgB, etc.), y que incluya fragmentos de los mismos que también son específicamente reactivos con una proteína de vertebrado, por ejemplo, de mamífero. Los anticuerpos pueden fragmentarse utilizando técnicas convencionales. Así, el término incluye segmentos de partes escindidas proteolíticamente o preparadas de manera recombinante de una molécula de anticuerpo que pueden reaccionar selectivamente con una proteína determinada. Los ejemplos no limitativos de tales fragmentos proteolíticos y/o recombinantes incluyen Fab, F(ab’)2, Fab’, Fv, dAc y anticuerpos de cadena sencilla (scFv) que contienen un dominio VL y VH unido mediante un ligador peptídico. Los scFv pueden unirse covalente o no covalentemente para formar anticuerpos que presentan dos o más sitios de unión. Así, los anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, u otras preparaciones purificadas de anticuerpos y anticuerpos recombinantes. En la presente memoria, la expresión “anticuerpo antimarcador” se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a un marcador.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “deposición de IgA1” se refiere a la acumulación de inmunoglobulina IgA1 en forma agregada o no agregada en tejido u órganos humanos.

En la presente memoria, una “enfermedad caracterizada por la deposición de IgA1” se refiere a cualquier enfermedad en la que se produce deposición de IgA1, tal como, pero sin limitarse a nefropatía por IgA, dermatitis herpetiforme y púrpura de Henoch-Schoenlein.

Tal como se utiliza en la presente memoria, “nefropatía por IgA” se refiere a una enfermedad renal caracterizada por depósitos de IgA1 dentro del riñón.

Tal como se utiliza en la presente memoria, “dermatitis herpetiforme” se refiere a una enfermedad de formación de ampollas crónica asociada con depósitos de IgA1 en la piel y otros tejidos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, “púrpura de Henoch-Schoenlein” se refiere a una enfermedad cutánea y renal caracterizada por deposición de IgA1 en tejido cutáneo y tejido renal.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una “composición farmacéutica” comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un principio activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en la presente memoria, “cantidad farmacológicamente eficaz,” o simplemente “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad de un agente eficaz para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo deseado. Por ejemplo, si un tratamiento clínico dado se considera eficaz cuando se produce por lo menos una reducción del 25% en un parámetro medible asociado con una enfermedad o trastorno.

I. IgA1 proteasas

En la presente memoria, se utilizan IgA1 proteasas para tratar enfermedades caracterizadas por la deposición de IgA1. Las IgA1 proteasas son enzimas bacterianas que escinden específicamente moléculas de IgA1 humana. La IgA2 humana es resistente a casi todas las IgA1 proteasas conocidas porque las moléculas de IgA2 carecen de una región bisagra que está presente en todas las moléculas de IgA1. La región bisagra de las moléculas de IgA1 consiste en una hebra de aminoácidos, que contiene sitios de escisión para una variedad de IgA1 proteasas, tal como se ilustra en la figura 1. Las IgA1 proteasas se expresan en bacterias Gram negativas como un precursor monocatenario que atraviesa la membrana interna de la bacteria. La proteína precursora se inserta entonces por sí misma en la membrana externa bacteriana y se somete a escisión autocatalítica, liberando una IgA1 proteasa madura soluble (figura 2a). Las IgA proteasas de las bacterias Gram positivas también son útiles en esta invención, aunque no presentan un mecanismo de secreción autocatalítico. Para tales proteasas, se añade un marcador de epítopo en la proteína enzimática.

En un aspecto, una secuencia de marcador se fusiona en marco a una IgA1 proteasa, de manera que la secuencia de marcador esté ubicada próxima al extremo carboxilo-terminal de la IgA1 proteasa secretada (figura 2b). La figura 3 muestra una representación esquemática de la proteína precursora de IgA1 proteasa de Haemophilus influenzae Rd que ilustra que una secuencia de marcador (por ejemplo, cola de His) se fusiona en marco a una IgA1 proteasa en sentido amino-terminal de los sitios de escisión autocatalítca a, b y c.

Una variedad de bacterias producen IgA1 proteasa y son útiles en la presente invención. Éstas comprenden de manera no limitativa Haemophilus influenzae de tipo 1 y 2, Neisseria meningitidis de tipo 1 y 2, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sanguis, Clostridium ramosum, Prevotella melaninogenica y Ureaplasma ureatyticum,

Las secuencias de nucleótidos de la IgA1 proteasa pueden obtenerse a partir de cualquier bacteria en la que se exprese una IgA1 proteasa, siempre que la IgA1 proteasa pueda escindir moléculas de IgA1 humana. Ya se han identificado las secuencias de nucleótidos que codifican para IgA1 proteasas de numerosas cepas bacterianas e incluyen: Clostridium ramosum (registro de Genbank, AY028440); Ureaplasma urealyticum (registro de Genbank, NC_002162); Haemophilus influenzae (registro de Genbank, X59800) y cepas bacterianas Rd (registro de Genbank, NC-000907), 7768 (registro de Genbank, AF274862), 6338 (registro de Genbank, AF27486), 2509 (registro de Genbank, AF274859), aegyptius (registro de Genbank, AF369907), 8625 (registro de Genbank, AJ001741), HE284 (registro de Genbank, X82487), Da66 (registro de Genbank, X82467), HK635 (registro de Genbank, X82488), y otras secuencias depositadas de cepas no identificadas (números de registro de Genbank, X59800, X82488, X64357, M87492, M87491, M87490, y M87489); Neisseria memingitidis (número de registro de Genbank AF235032) y cepas bacterianas, Z2491 (registro de Genbank, NC-03316), B40 (registro de Genbank, AF012211), Z4099 (registro de Genbank, AF012210), Z4018 (registro de Genbank, AF012209), Z4400 (registro de Genbank, AF012208), Z3524 (registro de Genbank, AF012207), Z4024 (registro de Genbank, AF012206), Z3910 (registro de Genbank, AF012205), Z3906 (registro de Genbank, AF012204), Z2491 (registro de Genbank, AF012203), IHN341 (registro de Genbank, AJ001740), NL3327 (registro de Genbank, AJ001739), NL823 (registro de Genbank, AJ001737), NL3293 (registro de Genbank, AJ001738), HK284 (registro de Genbank, X82487), ETH2 (registro de Genbank, X82469), NGO93 (registro de Genbank, X82482), NCG80 (registro de Genbank, X82479), NG117 (registro de Genbank, X82483), HF96 (registro de Genbank, X82475), HF54 (registro de Genbank, X82473), HF48 (registro de Genbank, X82480), HF13 (registro de Genbank, X82474), NGC65(registro de Genbank, X82484), NCG16 (registro de Genbank, X82485), SM1894 (registro de Genbank, X82476), EN3771 (registro de Genbank, X82468), NG44/76 (registro de Genbank, X82481), SM1166 (registro de Genbank, X82486), HF159 (registro de Genbank, X82471), 81139 (registro de Genbank, X82477), HF117 (registro de Genbank, X82470), SM1027 (registro de Genbank, X82472) y número de registro de Genbank, AF235032; Neisseria gonorrhoeae (número de registro de Genbank, A12416) y cepa bacteriana MS11 (registro de Genbank, S75490); Streptococcus pneumoniae (número de registro de Genbank, X94909) y cepas bacterianas MGAS315 (registro de Genbank, NC-004070), R6 (registro de Genbank, NC-003098); y Streptococcus sanguis (registro de Genbank, NC-003098) y cepas bacterianas SK85 (registro de Genbank, Y13461), SK49 (registro de Genbank, Y13460), SK4 (registro de Genbank, Y13459), SK162 (registro de Genbank, Y13458), SK161 (registro de Genbank, Y13457), SK115 (registro de Genbank, Y13456, y Sk112 (registro de Genbank, Y13455).

Construcción de vectores

Las secuencias que codifican para IgA1 proteasas pueden clonarse en vectores adecuados para la expresión de la proteína, de manera que puede producirse y aislarse la IgA1 proteasa soluble. Los vectores pueden construirse utilizando procedimientos convencionales (Sambrook et al., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989; Ausubel, et al., Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1995), guiados por los principios tratados más adelante: en resumen, se usan técnicas de ligamiento convencionales para insertar secuencias de ADN que codifican para IgA1 proteasa en vectores bacterianos de clonación y/o expresión.

Para preparar ácidos nucleicos que codifican para IgA1 proteasa, se requiere una fuente de genes que codifican para IgA1 proteasas. Los genes pueden obtenerse de fuentes naturales o sintéticas. Los procedimientos para clonar genes de IgA1 proteasa novedosos de cepas bacterianas se describen en Lomholt H., et al., Mol. Microbiol. (1995) 15(3), 495-508; Fishman, Y. et al., (1985), págs. 164-168 en G. K. Schoolink (ed.), The Pathogenic Neisseria, Am. Soc. Microbiol., Washington DC; Koomey, J. et al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA, (1982) 79: 7881-7885; Halter, R, et al., EMBO J., (1984) 3:1595-1601; Bricker, J. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1983), 80:26812685; Koomey, J. M. y Falkow, S., citado anteriormente; Grundy, J. F. et al., J. Bacteriol, (1987) 169:4442-4450; y Gilbert, J.V. et al, Infect. Immun., (1988) 56:1961-1966.

Alternativamente, puede aislarse ADN que codifica para una IgA1 proteasa conocida de ADN genómico bacteriano mediante amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos para el gen de IgA1 de interés. En resumen, el ADN genómico bacteriano se aísla utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando kits de aislamiento de ADN genómico bacteriano proporcionados por QIAGEN o procedimientos convencionales descritos en Sambrook et al., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel, et al., Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, (1995).

La PCR es bien conocida en la técnica (Mullis y Faloona, Methods Enzymol., (1987), 155: 335. En general, los cebadores de oligonucleótido son moléculas de ADN o ARN monocatenarias que se hibridan selectivamente con un molde de ácido nucleico que codifica para IgA1 proteasa para cebar la síntesis enzimática de una segunda cadena de ácido nucleico. El cebador es complementario a una parte de una molécula diana presente en un conjunto de moléculas de ácido nucleico del genoma bacteriano. Se contempla que los cebadores se preparen mediante procedimientos sintéticos, o bien químicos o bien enzimáticos. Alternativamente, una molécula de este tipo o fragmento de la misma se produce de manera natural y se aísla de su fuente natural o se adquiere de un proveedor comercial. Los cebadores de oligonucleótido mutagénicos tienen de 15 a 100 nucleótidos de longitud, idealmente desde 20 hasta 40 nucleótidos, aunque pueden utilizarse oligonucleótidos de diferente longitud. Preferentemente, los cebadores también comprenden una secuencia de enzima de restricción única.

Normalmente, la hibridación enzimática se produce cuando dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente complementarias (por lo menos complementarias en aproximadamente el 65% en un tramo de por lo menos 14 a 25 nucleótidos, preferentemente por lo menos en aproximadamente el 75%, más preferentemente por lo menos complementarias en aproximadamente el 90%). Véase Kanehisa, Nucleic Acids Res., (1984), 12:203.

Como resultado, se espera que se tolere un cierto grado de apareamiento erróneo en el sitio de cebado. Un apareamiento erróneo de este tipo puede ser pequeño, tal como un mono, di o trinucleótido. Alternativamente, puede comprender bucles de nucleótidos, que se definen como regiones en las que el apareamiento erróneo engloba una serie ininterrumpida de cuatro o más nucleótidos.

En general, cinco factores influyen en la eficacia y la selectividad de la hibridación del cebador con una segunda molécula de ácido nucleico. Estos factores que son (i) la longitud del cebador, (ii) la composición y/o la secuencia de nucleótidos, (iii) la temperatura de hibridación, (iv) la composición química del tampón y (v) la posibilidad de impedimento estérico en la región en la que se requiere que hibride el cebador, son consideraciones importantes cuando se diseñan secuencias de cebado no aleatorio.

Existe una correlación positiva entre la longitud del cebador y tanto la eficacia como la exactitud con la que se apareará un cebador con una secuencia diana: las secuencias más largas presentan una temperatura de fusión (TM) superior que las más cortas, y es menos probable que se repitan dentro de una secuencia diana dada, minimizándose de este modo la hibridación imprecisa. Las secuencias de cebador con un alto contenido en G-C o que comprenden secuencias palindrómicas tienden a hibridarse consigo mismas, como lo hacen sus sitios diana previstos, puesto que la cinética de hibridación unimolecular, en lugar de la bimolecular, está favorecida generalmente en disolución: al mismo tiempo, es importante diseñar un cebador que contenga números suficientes de emparejamientos de nucleótidos G-C para unirse estrechamente a la secuencia diana, puesto que cada uno de tales pares se une mediante tres puentes de hidrógeno, en lugar de los dos que se encuentran cuando hay pares de bases de A y T. La temperatura de hibridación varía inversamente con la eficacia de apareamiento del cebador, al igual que la concentración de disolventes orgánicos, por ejemplo formamida, que podría incluirse en una mezcla de hibridación, mientras que los aumentos en la concentración salina facilitan la unión. En condiciones de hibridación rigurosas, las sondas más largas se hibridan de manera más eficaz que las más cortas, que son suficientes en condiciones más permisivas. Las condiciones de hibridación rigurosas normalmente incluyen concentraciones salinas inferiores a aproximadamente 1 M, más normalmente inferiores a aproximadamente 500 mM y preferentemente inferiores a aproximadamente 200 mM. Las temperaturas de hibridación oscilan desde tan solo 0ºC hasta más de 22ºC, más de aproximadamente 30ºC, y (con menos frecuencia) superiores a aproximadamente 37ºC. Los fragmentos más largos pueden requerir temperaturas de hibridación superiores para la hibridación específica. Puesto que varios factores afectan a la rigurosidad de la hibridación, la combinación de parámetros es más importante que la medición absoluta de cualquiera de ellas sola.

Los cebadores se diseñan preferentemente utilizando programas informáticos que ayudan en la generación y optimización de secuencias de cebador. Los ejemplos de dichos programas son “PrimerSelect” del paquete de software DNAStar™ (DNAStar. Inc.; Madison, WI) y OLIGO 4.0 (National Biosciences. Inc.). Una vez diseñado, se preparan oligonucleótidos adecuados mediante un procedimiento adecuado, por ejemplo el procedimiento de fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tetrahedron Lett., 22: 1859) o el procedimiento de triéster según Matteucci y Caruthers (1981) J. Arm. Chem. Soc., 103:3185, o mediante otros procedimientos químicos utilizando cualquier sintetizador de oligonucleótidos automatizado comercial de tecnología VLSIPS™.

La PCR se realiza utilizando ADN bacteriano de molde (por lo menos 1 fg: más normalmente, 1-1000 ng) y por lo menos 25 pmol de cebadores de oligonucleótido; puede ser ventajoso utilizar una cantidad mayor de cebador cuando el conjunto de cebadores es muy heterogéneo, ya que cada secuencia está representada sólo por una pequeña fracción de las moléculas del conjunto, y las cantidades resultan limitativas en los últimos ciclos de amplificación. Una mezcla de reacción típica incluye: 2 l de ADN, 25 pmol de cebador de oligonucleótido, 2,5 l de 10X tampón de PCR 1 (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0,4  de dNTP 1,25 mM, 0,15 l (o 2,5 unidades) de Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer, Foster City, CA) y agua desionizada hasta un volumen total de 25 l. Se recubre con aceite mineral y se realiza la PCR utilizando un ciclador térmico programable.

La duración y la temperatura de cada etapa de un ciclo de PCR, así como el número de ciclos, se ajustan según las necesidades de rigurosidad vigentes. La temperatura y el momento del apareamiento se determinan tanto mediante la eficacia con la que se espera que el cebador se aparee con un molde como mediante el grado de apareamiento erróneo que va a tolerarse; obviamente cuando se amplifican y mutagenizan simultáneamente moléculas de ácido nucleico, se requiere apareamiento erróneo, por lo menos en la primera ronda de síntesis. Se utiliza una temperatura de apareamiento de entre 30ºC y 72ºC. La desnaturalización inicial de las moléculas de molde se produce normalmente a entre 92ºC y 99ºC durante 4 minutos, seguido por 20-40 ciclos que consisten en desnaturalización (94-99ºC durante de 15 segundos a 1 minuto), apareamiento (temperatura determinada tal como se trató anteriormente: 1-2 minutos), y extensión (72ºC durante 1-5 minutos, dependiendo de la longitud del producto amplificado). La extensión final se realiza generalmente durante 4 minutos a 72ºC, y puede ir seguida por una etapa indefinida (0-24 horas) a 4ºC.

Tras la amplificación por PCR, el ADN puede aislarse mediante medios convencionales, tales como electroforesis en gel, o purificación en columna. El ADN que codifica para la IgA1 proteasa bacteriana puede digerirse con enzimas de restricción apropiadas y ligarse en un vector de clonación y/o expresión adecuado.

Vectores y células huésped

En la presente invención puede utilizarse cualquier vector. Tal como se utiliza en la presente memoria, vector se refiere a un elemento diferenciado que se utiliza para introducir ADN heterólogo en células bacterianas para la expresión y/o replicación del mismo. Numerosos vectores adecuados para la presente invención están disponibles para el público, incluyendo plásmidos bacterianos y bacteriófagos. Cada vector contiene diversos componentes funcionales, que generalmente incluyen un sitio de clonación (o “poliligador”), un origen de replicación y por lo menos un gen marcador seleccionable. Si el vector dado es un vector de expresión, posee adicionalmente uno o más de los siguientes: elemento potenciador, promotor, secuencias señal y de terminación de la transcripción, cada uno colocado en las proximidades del sitio de clonación, de manera que se unan operativamente al gene que codifica para una IgA1 proteasa según la invención.

Tanto los vectores de clonación como los de expresión generalmente contienen secuencias de ácido nucleico que permiten que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Normalmente en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican de manera autónoma. Tales secuencias se conocen bien para una variedad de bacterias. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas.

Ventajosamente, un vector de clonación o expresión puede contener un gen de selección denominado también un marcador seleccionable. Este gen codifica para una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células huésped transformadas crecidas en un medio de cultivo selectivo. Por tanto, las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, complementan deficiencias autotróficas, o suministran nutrientes críticos no disponibles en los medios de crecimiento.

Puesto que la replicación de vectores se realiza de la manera más conveniente en E. coli, debe utilizarse un marcador seleccionable para E. coli, por ejemplo, el gen de -lactamasa que confiere resistencia al antibiótico ampicilina. Éstos pueden obtenerse de plásmidos de E. coli, tales como pBR322 o un plásmido pUC tal como pUC18

o pUC19.

Los vectores de expresión normalmente contienen un promotor que se reconoce por el microorganismo huésped y que se une operativamente a la secuencia codificante de interés. Un promotor de este tipo puede ser inducible o constitutivo. La expresión “unido operativamente” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia control “unida operativamente” a una secuencia codificante se liga de una manera tal que se logre la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias control.

Promotores adecuados para su utilización con huéspedes procariotas incluyen, por ejemplo, los sistemas de promotor de -lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema de promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Los promotores para su utilización en sistemas bacterianos también contendrán generalmente una secuencia de Shine-Delgamo unida operativamente a la secuencia codificante. Promotores preferidos son los promotores regulables por isopropiltiogalactósido (IPTG).

Cualquier cepa bacteriana se considera una célula huésped adecuada para la expresión y la clonación de la IgA1 proteasas de la presente invención. Un huésped a modo de ejemplo es E. coli.

Introducción de vectores en células huésped.

Los vectores pueden introducirse en células huésped seleccionadas mediante cualquiera de varios procedimientos adecuados conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden introducirse constructos de vector en células bacterianas apropiadas mediante infección utilizando partículas de vector de bacteriófago tales como lambda

o M13, o mediante cualquiera de varios procedimientos de transformación para vectores de plásmido o para ADN de bacteriófago. Por ejemplo, todavía se utiliza comúnmente transformación bacteriana mediada por cloruro de calcio convencional para introducir ADN desnudo en bacterias (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), pero también puede utilizarse electroporación (Ausubel et al., Current protocols in Molecular Biology, (1988), (John Wiley & Sons, Inc., NY, NY)).

Purificación de IgA1 proteasa soluble

Tras la introducción de un vector de expresión que codifica para la IgA1 proteasa en una célula bacteriana huésped adecuada, las bacterias se propagan para la producción en exceso de la IgA1 proteasa soluble mediante medios convencionales (Sambrook et al., Molecular Biology. A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel, et al., Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing (1995). En resumen, se hacen crecer bacterias, tales como E. coli, que albergan un vector de expresión que codifica para la IgA1 proteasa, o bacterias que tienen ADN que codifica para la IgA1 proteasa integrado en el genoma bacteriano, en medios de crecimiento bacteriano a 37ºC. Cuando los cultivos bacterianos alcanzan la fase logarítmica, la IgA1 proteasa soluble se purifica de los medios de crecimiento mediante medios bien conocidos en la materia.

Por ejemplo, se cultivan bacterias H. influenzae Rd que expresan 6x His-IgA1 proteasa hasta 20 L (dos de 10L) en un fermentador cargado con caldo infusión cerebro-corazón complementado con NAD y hemina. Se hacen crecer las células a 37ºC hasta que alcanzan la fase estacionaria, 16-20h. Entonces se elimina la masa bacteriana con un sistema Pellicon, y se concentra cada 10 L de sobrenadante de cultivo que contiene la enzima activa hasta 400 ml. Los tampones se ajustan para presentar la proteína en tampón Tris/HCl 25 mM, pH 7,5, con NaN3 al 0,05%. Para eliminar la proteína no deseada, se aplican lotes de 80 ml de este concentrado a una columna de intercambio aniónico DE-52 con un volumen de lecho de 40 ml equilibrada en tampón Tris 25 mM. La IgA proteasa no se une a esta columna y se recoge como fracción no retenida utilizando 500 ml de tampón Tris. El rendimiento de la recuperación normalmente es del 85-90% basado en el ensayo que utiliza sustrato de IgA humana. Entonces se utiliza sulfato de amonio para precipitar la enzima (saturación del 60% de sulfato de amonio; 390 gm por l). El precipitado se disuelve con el siguiente tampón: fosfato de sodio 50 mM, Tris/HCl 12,5 mM, NaCl 0,3 M y azida de sodio al 0,025%, ajustado a 7,5, y entonces se dializa la enzima frente a este tampón durante varios días. El volumen final de disolución enzimática es de aproximadamente 200 ml por cada 10 l de cultivo inicial.

Para la purificación por afinidad, se aplican alícuotas de 40 ml de la disolución enzimática a Ni-NTA-agarosa en una columna con un volumen de lecho de 40 ml. La enzima unida se lava tres veces con volúmenes de 500 ml de tampones que contienen fosfato de sodio 50 mM, Tris/HCl 12,5 mM, NaCl 0,3 M y azida de sodio al 0,025%. El pH de estos lavados de tampón se reduce de forma progresiva, comenzando con pH 7,5, luego 6,6, luego 6,0, deseado para eliminar las proteínas débilmente adherentes, pero no las enzimáticas, del ligando de níquel. El lavado final utiliza de nuevo tampón a pH 7,5, ahora 200 ml. Entonces se eluye la 6x His-IgA proteasa de Ni-NTA agarosa utilizando 50 ml de imidazol 0,1 M en Tris/HCl 50 mM, pH 7,5. La enzima recuperada se concentra mediante filtración por presión positiva utilizando una membrana Centricon con punto de corte a 100 kDa, se lava tres veces con Hepes 25 mM, pH 7,15, y luego se almacena en tampón Hepes.

Ensayo para determinar la actividad de la IgA1 proteasa

La IgA1 proteasa se somete a prueba para determinar la actividad enzimática mediante unos medios convencionales tal como se describe en Plaut, AG y Bachovchin WW, IgA-specific prolyl endopeptidases: serine type. Methods Enzymol. 1994;244:137-51, que se incorpora a la presente memoria como referencia. El ensayo puede realizarse con proteasa purificada o IgA1 proteasa presente en medios de crecimiento bacteriano. Una IgA1 proteasa presenta actividad suficiente para ser útil según la invención si presenta una actividad de Unidad, siendo la Unidad igual a un microgramo de IgA1 humana escindida por minuto a 37ºC.

II. IgA1 proteasa marcada

En una forma de realización, la IgA1 proteasa se fusiona a un marcador. La fusión de un marcador a las IgA1 proteasas de la presente invención ayuda en la purificación y detección de la proteasa, así como proporciona un medio en el que la IgA1 proteasa puede formar un complejo con un ligando, tal como un anticuerpo antimarcador, para fines terapéuticos.

Para generar una IgA proteasa que comprende un marcador, puede ligarse en marco una secuencia que codifica para un marcador a una secuencia que codifica para una IgA1 proteasa utilizando técnicas de biología molecular convencionales. La secuencia del marcador se liga en el sentido de 5’ de la secuencia de ADN que codifica para el sitio de escisión autocatalítica de la IgA1 proteasa de manera que, con la escisión de la proteína precursora de IgA1

5

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40

proteasa, se secreta una IgA1 proteasa soluble que comprende un marcador en unos medios de crecimiento bacteriano.

Alternativamente, se genera una IgA1 proteasa que comprende un marcador mediante mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR. Existen varios procedimientos de mutagénesis dirigida al sitio conocidos en la materia que permiten mutar regiones específicas dentro de una proteína. Estos procedimientos se incorporan en varios kits comercializados para la realización de la mutagénesis dirigida al sitio, incluyendo procedimientos convencionales y basados en PCR. Los ejemplos incluyen el kit de mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR EXSITE™ disponible de Stratagene (n.º de catálogo 200502; basado en PCR) y el kit de mutagénesis dirigida al sitio QUIKCHANGE™ de Stratagene (n.º de catálogo 200518; basado en PCR), y el kit de mutagénesis dirigida al sitio bicatenario CHAMELEON®, también de Stratagene (n.º de catálogo 200509). En resumen, se introduce una secuencia de marcador en un fragmento de PCR mediante la inclusión de una secuencia que codifica para el marcador cerca del extremo 5’ o 3’ de uno del cebador de PCR. Se genera el fragmento de PCR de manera que se proporcionan sitios de restricción apropiados, de modo que el fragmento puede digerirse y luego ligarse en el vector original para la sustitución de codones de aminoácidos específicos.

En una forma de realización, el marcador presenta una afinidad de unión específica por un anticuerpo, de modo que la proteasa forma un inmunocomplejo al unirse al ligando. Por ejemplo, el marcador puede comprender un epítopo único para el que se dispone fácilmente de anticuerpos. Alternativamente, el marcador puede comprender aminoácidos quelantes de metal (por ejemplo His) de modo que las IgA proteasas pueden complejarse con una perla o resina de quelante de metal, por ejemplo perlas de níquel-NTA.

En otra forma de realización, el marcador comprende un marcador detectable, tal como una enzima, o comprende un aminoácido que puede marcarse con un marcador detectable. Los marcadores detectables incluyen, por ejemplo, radioisótopos, moléculas fluorescentes, moléculas cromogénicas, moléculas luminiscentes y enzimas. Los marcadores detectables útiles incluyen biotina para teñir con conjugado de estreptavidina marcado, colorantes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rojo Tejas, rodamina, proteína fluorescente verde, y similares), radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C, o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasas alcalinas y otros comúnmente utilizados en un ELISA), y marcadores colorimétricos tales como oro coloidal. Las patentes que enseñan la utilización de tales marcadores detectables incluyen las patentes US nos 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241, que se incorporan en su totalidad a la presente memoria como referencia.

Los ejemplos no limitativos de marcadores adecuados incluyen c-Myc, HA, y VSV-G, HSV, FLAG, V5 y HIS. A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos y ácido nucleico para cada marcador.

Marcador Secuencias de péptido y ácido nucleico

HIS

Proteína: HHHHHH (SEC ID nº: 6)

ADN: CAC CAT CAC CAT CAC CAT (SEC ID nº: 7)

c-Myc

Proteína: EQKLISEEDL (SEC ID nº: 8)

ADN: GAG CAA AAG CTC Art TCT GAA GAG GAC TTG (SEC ID nº: 9)

HA

Proteína: YPYDVPDYA (SEC ID nº: 10)

ADN: TAC CCT TAT GAT GTG CCA GAT TAT GCC (SEC ID nº: 11)

VSV-G

Proteína: YTDIEMNRLGK (SEC ID nº: 12)

ADN: TAT ACA GAC ATA GAG ATG AAC CGA CTT GGA AAG (SEC ID nº: 13)

HSV

Proteína: QPELAPEDPED (SEC ID nº: 14)

ADN: CAG CCA GAA CTC GCC CCG GAA GAC CCC GAG GAT (SEC ID nº: 15)

V5

imagen1

FLAG Proteína: DYKDDDDKG (SEC ID nº: 18) ADN: GAT TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA GGA (SEC ID nº: 19)

La colocación de un marcador en una IgA1 proteasa presenta el beneficio de que permite la fácil detección de la IgA1 proteasa tanto in vivo e in vitro. Un marcador que comprende un epítopo para un anticuerpo puede detectarse utilizando o bien anticuerpos antimarcador o bien anticuerpos que se conjugan con un marcador detectable. El marcador detectable puede ser un aminoácido que se produce de manera natural o uno que no se produce de manera natural que porta, por ejemplo, radioisótopos (por ejemplo, 125I, 35S), grupos fluorescentes o luminescentes, biotina, haptenos, antígenos y enzimas. Existen muchos Ac comercializados frente a marcadores, tales como c-myc, HA, VSV-G, HSV, V5, His y FLAG. Además, los anticuerpos frente a marcadores utilizados en la invención pueden producirse utilizando procedimientos convencionales para producir anticuerpos, por ejemplo, mediante la producción de anticuerpos monoclonales (Campbell, A.M., Monoclonal Antibodies Technology: Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Ámsterdam, Países Bajos (1984); St. Groth et al.,

J. Immunology, (1990) 35: 1-21; y Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72). Los anticuerpos antimarcador pueden marcarse entonces de manera detectable a través de la utilización de radioisótopos, marcadores de afinidad (tales como biotina, avidina, etc.), marcadores enzimáticos (tales como peroxidase de rábano, fosfatasa alcalina, etc.) utilizando procedimientos bien conocidos en la materia, tales como los descritos en la solicitud internacional WO 00/70023 y (Harlour y Lane (1989) Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, págs. 1-726).

Los ensayos para detectar marcadores comprenden de manera no limitativa análisis de inmunotransferencia de tipo Western, inmunohistoquímica, Elisa, análisis de FACS, ensayos enzimáticos y autorradiografía. Los expertos en la materia conocen bien los medios para realizar estos ensayos. Por ejemplo, pueden detectarse radiomarcadores utilizando película fotográfica o contadores de centelleo o marcadores fluorescentes utilizando un fotodetector para detectar la luz emitida. Los marcadores enzimáticos normalmente se detectan proporcionando a la enzima un sustrato y detectando el producto de reacción producido por la acción de la enzima en el sustrato, y los marcadores colorimétricos se detectan visualizando simplemente el marcador coloreado.

El marcador puede utilizarse adicionalmente para aislar la IgA1 proteasa de otro material celular. Por ejemplo, mediante inmunoprecipitación, o mediante la utilización de columnas de afinidad de anticuerpo antimarcador o perlas conjugadas con anticuerpo antimarcador. Cuando se utiliza una cola de HIS, el aislamiento puede realizarse utilizando una columna de quelato de metal (Véase Hochuli en Genetic Engineering: Principles and Methods ed. JK Setlow, Plenum Press, NY, cáp.18, págs. 87-96). Los medios para realizar estos tipos de purificación se conocen bien en la materia.

En una forma de realización preferida, se utiliza un anticuerpo antimarcador para generar un inmunocomplejo de IgA1 proteasa de manera que la IgA1 proteasa conserva la actividad enzimática una vez complejada. Un inmunocomplejo de este tipo puede utilizarse en preparaciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades por deposición de IgA1. Por ejemplo, se cree que un inmunocomplejo de IgA1, cuando se administra a un paciente, queda atrapado en los glomérulos del riñón, un sitio de deposición de IgA1 en la nefropatía por IgA y la enfermedad de púrpura de Henoch-Schoenlein.

III. Tratamiento de enfermedades por deposición de IgA1

En la presente memoria, se utilizan IgA1 proteasas como agentes terapéuticos para tratar enfermedades por deposición de IgA1. Se sabe que la deposición anómala de moléculas de IgA1 produce insuficiencia renal, formación de ampollas cutáneas, exantema, artritis, hemorragia gastrointestinal y dolor abdominal.

Nefropatía por IgA

En la presente memoria se da a conocer un procedimiento para tratar la nefropatía por IgA mediante la administración a un paciente que necesita tal tratamiento de una IgA1 proteasa. La nefropatía por IgA es una enfermedad del riñón. La enfermedad se considera una glomerulonefritis mediada por inmunocomplejo, que se caracteriza por la deposición granular de IgA1 en las áreas mesangiales glomerulares. Da como resultado neuropatía y se define por cambios proliferativos en las células mesangiales glomerulares.

La nefropatía por IgA es uno de los tipos más comunes de glomerulonefritis cónica y una causa frecuente de enfermedad renal en fase terminal.

Dermatitis herpetiforme

En la presente memoria se da a conocer un procedimiento para tratar la dermatitis herpetiforme (DH) mediante la administración a un paciente que necesita tal tratamiento de una IgA1 proteasa. La dermatitis herpetiforme es una enfermedad cutánea de formación de ampollas crónica asociada con depósitos de IgA1 en la unión dermoepidérmica (Hall, RP & T.J. Lawley, J. Immunol. (1985) 135(3): 1760-5). Los pacientes con DH presentan depósitos granulares de IgA1 y presentan una enteropatía por sensibilidad al gluten asociada (GSE).

Púrpura de Henoch-Schoenlein

En la presente memoria se da a conocer un procedimiento para tratar la púrpura de Henoch-Schoenlein (HS) mediante la administración a un paciente que necesita dicho tratamiento de una IgA1 proteasa. La púrpura de Henoch-Schoenlein es una enfermedad cutánea y renal. La HSP se caracteriza por deposición de inmunocomplejos que contienen IgA1 en tejido. La enfermedad se diagnostica observando la evidencia de deposición de IgA1 en el tejido cutáneo o el riñón mediante microscopía de inmunofluorescencia. Las manifestaciones clínicas normalmente incluyen exantema; artralgias; dolor abdominal; y enfermedad renal.

Modelos animales

El efecto terapéutico de las IgA proteasas de la presente invención pueden someterse a prueba en cualquier modelo animal adecuado conocido por los expertos en la materia. A continuación se describen algunos modelos animales ejemplificativos.

1. Nefropatía por IgA

Se dispone de varios modelos animales de ratas y ratones de nefropatía por IgA y son útiles en la presente invención. Estos modelos se describen en Emancipator, S. N. et al., (1987) Animal models of IgA Nephropathy in IgA Nephropathy. A. R. Clarkson, editor. Martinus Nijhoff publishing, Boston. 188-203. Un modelo ejemplificativo se describe en Gesualdo L. et al, (1990) J. Clin. Invest. 86: 715-722. En resumen, se inyecta un complejo de anticuerpo IgA/sulfato de dextrano a ratones. El inmunocomplejo se aloja en el riñón y los ratones presentan glomerulonefritis que se asemeja a los casos típicos de neuropatía por IgA humana. A continuación se describe con mayor detalle cómo se realiza y se utiliza el modelo para someter a prueba agentes terapéuticos.

Se preparan inmunocomplejos solubles de sulfato de dextrano (500 kD, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e IgA monoclonal anti-glucósido 1-6 (J558: Litton Bionetics, Kensington, MD) con un exceso de tres veces (26,5 mg de dextrano/mg de J558 (modelo de nefropatía); 22,0 mg de dextrano/mg de MOPC 104 E (control normal)). Los complejos que contiene 3 mg de anticuerpo se inyectan en ratones Swiss-Webster a través de una inyección en la vena de la cola. Tras 1 hora, el momento de máxima deposición de complejos de IgA en el riñón, se inyecta a los ratones por vía intraperitoneal múltiples dosis de o bien solución salina o bien agente terapéutico a intervalos dados, tales como intervalos de 10 minutos. Se sacrifica a los ratones 1 hora tras la última inyección.

Entonces se aíslan los riñones de cada ratón para comprobar la deposición de IgA1 y la morfología mediante microscopía óptica, de inmunofluorescencia y electrónica.

En resumen, para monitorizar la deposición de IgA1, se tiñen muestras congeladas instantáneamente de corteza renal, se cortan con criostato a 4 um, se tiñen con fracciones de IgG marcadas con fluoresceína de antisueros de cabra específicos para IgA de ratón (US Biochemical Corp) mediante inmunofluorescencia directa para puntuar de manera semicuantitativa los depósitos de IgA1 (Nakazawa, M. et al., (1986) Lab. Invest. 55:551-556, y Nakazawa,

M. et al., (1986) J. Exp. Med. 164:1973-1987). Se considera que un agente terapéutico es un agente eficaz cuando el número de depósitos de IgA1 puntuado se reduce aproximándose al número de depósitos de IgA1 observados en un riñón normal.

Se puntúan los cambios morfológicos, tales como la expansión de la matriz mesangial y la hipercelularidad mensangial, tiñendo cortes de corteza renal con reactivo de PAS (Gesualdo, L. et al, (1990) J. Clin. Invest. 86: 715722). En resumen, la corteza renal se fija en formalina al 10%, se embebe en parafina y se tiñe. Se puntúa la expansión de la matriz mesangial y la hipercelularidad mensangial de manera semicuatitativa según los procedimientos descritos en Nakazawa, M. et al (1986) Lab. Invest. 55:551-556, y Nakazawa, M. et al. (1986) J. Exp. Med. 164:1973-1987.

La matriz mesangial normal se puntúa como 0. La expansión de la matriz mesangial se puntúa como +1 cuando se observan tallos mesangiales ensanchados, +2 cuando se observa invasión de la matriz en las luces capilares, y +3 cuando se observa ensanchamiento manifiesto del tallo mesangial junto con una disminución en la luz capilar. Se considera que un agente terapéutico es un agente eficaz cuando se reduce la expansión de la matriz mesangial aproximándose a la morfología de la matriz observada en un riñón normal, por ejemplo con una puntuación de +2, o +1, o 0.

La celularidad mensangial normal se puntúa como 0 y se define como 3 o menos núcleos celulares por área mensangial. La hipercelularidad se puntúa como +1 cuando se observan de 4 a 6 núcleos celulares por área mesangial, como +2 cuando se observan de 4 a 6 núcleos celulares por área mesangial en la mayoría de las áreas pero algunas áreas tienen 7 o más núcleos, y como +3 cuando se observan 7 o más núcleos celulares por área mesangial en la mayoría de las áreas. Se considera que un agente terapéutico es un agente eficaz cuando se reduce la hipercelularidad mesangial aproximándose a la observada en un riñón normal, por ejemplo con una puntuación de +2, o +1, o 0.

El área glomerular total, el área de la matriz y la celularidad glomerular también se cuantifican en glomérulos seleccionados al azar de cada ratón mediante morfometría por ordenador (Cue image analysis system, Olympus Corp., Columbia, MD.) (Gesualdo L. et al, (1990) J. Clin. Invest. 86: 715-722). En resumen, se fijan cubos de corteza en glutaraldehído al 2,5% en cacodilato de sodio 0,1 M, se fijan posteriormente en OsO4 al 1% y se embeben en resina epoxídica de Spurr (Polysciences, Inc. Warrington, PA). Se tiñen cortes de 50-70 nm con acetato de uranilo e hidróxido de plomo. Se examinan las rejillas codificadas en un microscopio JEOL JEM 100EX y se semicuantifican la matriz, la celularidad y los inmunodepósitos tal como se describe en Nakazawa, M. et al., (1986) J. Exp. Med. 164:1973-1987.

La hematuria (la presencia de glóbulos rojos en la orina) y la proteinuria (la presencia de proteína en la orina) también son una medida adecuada de la neuropatía por IgA. En resumen, se colocan ratones en cajas metabólicas y se recoge la orina durante 24 horas. Entonces se centrifuga la orina y se somete a ensayo para determinar la proteína mediante turbidimetría en ácido sulfosalicílico al 3% y la hematuria mediante microscopía, tal como se describe en Nakazawa, M. et al., (1986) J. Exp. Med. 164:1973-1987. Normalmente, un ratón normal sin nefropatía por IgA presentará menos de tres glóbulos rojos por campo de gran aumento (40X), mientras que los ratones con nefropatía por IgA presentarán más de 10 glóbulos rojos por campo de gran aumento. Una reducción en el número de glóbulos rojos por campo de gran aumento es indicativa de que el agente terapéutico es eficaz para la nefropatía por IgA. Se somete a prueba a los ratones para determinar la hematuria y la proteinuria antes del tratamiento para determinar el valor de referencia indicativo de la enfermedad. Una reducción en el valor de referencia, en comparación con el valor para la hematuria y la proteinuria obtenido antes del tratamiento, del 5%, 10%, 30%, 40% preferentemente del 50%, y más preferentemente superior a 50% tras el tratamiento con el agente terapéutico es indicativo de que el agente es eficaz para el tratamiento de la neuropatía por IgA1.

IV Dosificación, formulación y administración

En la presente memoria, se utilizan IgA proteasas bacterianas para tratar enfermedades por deposición de IgA. La IgA1 proteasa de la presente invención puede utilizarse en una composición que se combina con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición de este tipo también puede contener diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizadores y otros materiales bien conocidos en la materia. En un aspecto, la IgA1 proteasa se compleja con un anticuerpo para formar un inmunocomplejo terapéutico. Un inmunocomplejo terapéutico de este tipo es particularmente útil para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por la deposición de IgA1 en el riñón puesto que se cree que inmunocomplejos grandes se alojan en el glomérulo renal tras la administración.

La expresión “farmacéuticamente aceptable” significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del/de los principio(s) activo(s). Las características del vehículo dependerán de la vía de administración. Tales vehículos comprenden de manera no limitativa, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. Para los fármacos administrados por vía oral, los vehículos farmacéuticamente aceptables comprenden de manera no limitativa excipientes farmacéuticamente aceptables tales como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes de unión, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y conservantes. Los diluyentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y calcio, fosfatos de sodio y calcio, y lactosa, mientras que el almidón de maíz y el ácido algínico son agentes disgregantes adecuados. Los agentes de unión pueden incluir almidón y gelatina, mientras que el agente lubricante, si está presente, generalmente será estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, los comprimidos pueden recubrirse con un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, para retrasar la absorción en el tracto gastrointestinal.

Las sales farmacéuticamente aceptables pueden formarse con ácidos inorgánicos tales como acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenesulfonato, bisulfato butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yohidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Las sales básicas incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos tales como sales de sodio y potasio, sales de metales alcalinotérreos tales como sales de calcio y magnesio, sal con bases orgánicas tales como sales de diciclohexilamina, N-metil-D-glucamina, y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina, etc. Además, los grupos que contienen nitrógeno básico pueden cuaternizarse con agentes tales como haluros de alquilo inferior, tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dialquilo como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo, haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo, haluros de aralquilo como bromuros de bencilo y fenetilo y otros. De ese modo de obtienen productos dispersables o solubles en agua o aceite.

La composición también puede contener otros agentes, que o bien potencian la actividad de la composición, o bien complementan su actividad o utilización en el tratamiento, o bien mantienen la actividad del agente terapéutico en almacenamiento. Tales factores y/o agentes adicionales pueden incluirse en la composición para producir un efecto sinérgico o para minimizar los efectos secundarios. Además, la administración de la composición puede realizarse simultáneamente con otras terapias.

La administración del agente terapéutico puede llevarse a cabo de una variedad de formas convencionales, tales como ingestión oral, inhalación, aplicación tópica o inyección cutánea, subcutánea, intraperitoneal, parenteral o intravenosa.

Las composiciones que contienen el agente terapéutico pueden administrarse por vía intravenosa, tal como mediante inyección de una dosis unitaria, por ejemplo. La expresión “dosis unitaria” cuando se utiliza en referencia con una composición terapéutica, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificación unitaria para el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido, es decir, el excipiente o vehículo.

Los modos de administración del agente terapéutico incluyen infusión e inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarterial. Las composiciones farmacéuticas para la inyección parenteral comprenden disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles farmacéuticamente aceptables, así como polvos estériles para su reconstitución en disoluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su utilización. Los ejemplos de excipientes, diluyentes, disolventes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante la utilización de materiales de recubrimiento tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante la utilización de tensioactivos. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes, y/o compuestos para proteger el determinante inmunogénico del agente terapéutico. La prevención de la acción de microorganismos puede mejorarse mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos tales como parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de una forma farmacéutica inyectable puede llevarse a cabo mediante la inclusión de agentes, tales como monoestearato de aluminio y gelatina, que retrasan la absorción. Se obtienen formas de liberación lenta inyectables formando matrices microencapsuladas del agente terapéutico en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Dependiendo de la razón del agente terapéutico con respecto al polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la tasa de liberación del agente terapéutico. Las formulaciones inyectables de liberación lenta también se preparan atrapando el agente terapéutico en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales. Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que retiene las bacterias o mediante la incorporación de agentes de esterilización en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otros medios inyectables estériles justo antes de su utilización.

Las formulaciones incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, oftálmica (incluyendo intravítrea o intracameral), nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), intrauterina, vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intracraneal, intratraqueal, y epidural). Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma farmacéutica unitaria y pueden prepararse mediante técnicas farmacéuticas convencionales. Tales técnicas incluyen la etapa que consiste en asociar el principio activo y el/los vehículo(s) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima el principio activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o de múltiples dosis. Pueden prepararse disoluciones y suspensiones para inyección improvisada a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una “cantidad terapéuticamente eficaz” hace referencia a la cantidad total de cada principio activo de la composición farmacéutica o procedimiento que es suficiente para mostrar un beneficio significativo en un paciente, es decir, tratamiento, curación, prevención o mejora del estado médico relevante, o un aumento en la tasa de tratamiento, curación, prevención o mejora de tales estados. Cuando se aplica a un principio activo individual, administrado solo, la expresión se refiere a ese principio solo. Cuando se aplica a una combinación, la expresión se refiere a cantidades combinadas de los principios activos que dan como resultado el efecto terapéutico ya se administren en combinación, en serie, o simultáneamente. En general, una composición se administrará en una dosis única en el intervalo de 100 g - 10 mg/kg de peso corporal, preferentemente en el intervalo de 1 g - 100 mg/kg de peso corporal. Esta dosificación puede repetirse de manera diaria, semanal, mensual, anual, o según considere apropiado el médico que trate.

Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico se administra por vía oral, la composición puede estar en forma de un líquido, la composición contiene aproximadamente desde el 0,5 hasta el 90% en peso de proteína, y preferentemente aproximadamente desde el 1 hasta el 50% de proteína.

Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico se administra mediante inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, la proteína está en forma de una disolución acuosa, aceptable por vía parenteral, libre de pirógeno. La preparación de tales disoluciones de proteína aceptables por vía parenteral, considerando particularmente la tracción, isotonicidad, estabilidad, y similares, resultará evidente para el experto en la materia. Una composición preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debe contener, además de la proteína, un vehículo isotónico tal como cloruro de sodio para inyección, solución de Ringer para inyección, dextrosa para inyección, dextrosa y cloruro de sodio para inyección, solución de Ringer lactato para inyección, u otro vehículo tal como se conoce en la materia. La composición de la presente invención también puede contener estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes, u otros aditivos conocidos por los expertos en la materia.

La administración tópica, en la que la composición se pone en contacto con tejido(s), puede ser adecuada para la dermatitis herpetiforme. Mediante “poner en contacto” se hace referencia a no sólo la aplicación tópica, sino también a los modos de administración que introducen la composición en los tejidos, o en las células de los tejidos.

La utilización de sistemas de administración de liberación controlada o liberación sostenida también se incluye en la invención. Tales sistemas son sumamente deseables en situaciones en las que la cirugía es difícil o imposible, por ejemplo, en pacientes debilitados por la edad o por el propio transcurso de la enfermedad, o cuando el análisis de riesgo – beneficio indica el control en vez de la cura.

Una matriz de liberación sostenida, tal como se utiliza en la presente memoria, es una matriz realizada en materiales, normalmente polímeros, que pueden degradarse mediante hidrólisis enzimática o ácida/básica o mediante disolución. Una vez insertada en el organismo, la matriz se activa mediante enzimas y líquidos corporales. La matriz de liberación sostenida se selecciona de manera deseable de materiales biocompatibles tales como liposomas, polilactidas (poli(ácido láctico)), poliglicolida (polímero de ácido glicólico), polilactida co-glicolida (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico), polianhídridos, poli(orto)ésteres, poliproteínas, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinilpropileno, polivinilpirrolidona y silicona. Una matriz biodegradable preferida es una matriz de uno de o bien, polilactida, poligicolida, o bien polilactida co-glicolida (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico).

La cantidad de agente terapéutico en la composición farmacéutica dependerá de la naturaleza y la gravedad del estado que se esté tratando, y de la naturaleza de los tratamientos anteriores a los que se haya sometido el paciente. Finalmente, el médico que atiende decidirá la cantidad del agente terapéutico con el que tratar a cada paciente individual. Inicialmente, el médico que atiende administrará dosis bajas del agente terapéutico y observará la respuesta del paciente. Pueden administrarse dosis mayores hasta que se obtiene el efecto terapéutico óptimo para el paciente, y en ese momento ya no se aumenta la dosificación.

La duración de la terapia intravenosa utilizando la composición farmacéutica variará dependiendo de la gravedad de de la enfermedad que se esté tratando y del estado y la posible respuesta idiosincrásica de cada paciente individual. Se contempla que la duración de cada aplicación del agente terapéutico de la presente invención estará en el intervalo de 12 a 72 horas de administración intravenosa continua, a una tasa de aproximadamente 30 mg/hora. Finalmente, el médico que atiende decidirá la duración apropiada de la terapia intravenosa utilizando la composición farmacéutica.

Ejemplos

Ejemplo 1. Construcción de la IgA1 proteasa marcada

Se ha fusionado en marco una cola de His en la IgA1 proteasa de Haemophilus influenzae mediante mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR utilizando el plásmido pFG26 que contiene la secuencia de ADN que codifica para la IgA1 proteasa de Haemophilus influenzae. Se generaron dos fragmentos de PCR de tal como se ilustra en la figura

4. El primer fragmento, XbA 1 y fragmento de pml 1, que contiene la cola de His recién insertada y el sitio de pml 1 se generó utilizando cebadores de oligonucleótido “HFD6His1” (cebador 1) y “HFD6His2” (cebador 2) mostrados a continuación. El segundo fragmento, pmL I y el fragmento de Ace I, se generó utilizando el cebador 3 y el cebador 4 también mostrados a continuación.

Cebador 1: HFD-5 XbaI: 5’ GATCCGCTTACCAATTATGC 3’ (SEC ID nº: 20)

Cebador 2: HFD6His1:

imagen2

Cebador 3: HFD6His2: 5’-CCTAATAATATTCAAGCTCACGTGCCTAGCGTACC-3’ (SEC ID nº: 22)

Cebador 4: HFD-F-ACCI: 5’-TTCAGCAGAAGTCTCTTGC-3’ (SEC ID nº: 23)

Tras la amplificación de los dos fragmentos mediante PCR, se digirieron los fragmentos o bien con Xb a I y Pml I o bien con Pml I y Acc I y se ligaron en sitios de Xba I y Acc I del plásmido pFG26 original utilizando técnicas convencionales. Se confirmó la mutación mediante la secuencia de ADN y se designó al nuevo plásmido como pJQ/Rd6His. Los fragmentos se diseñaron de manera que codones de ADN para seis histidinas sustituyeran a los codones originales en la posición 1007-1012 de la IgA1 proteasa; asn-asn-ile-gln-ala-asp (SEC ID nº: 24).

Ejemplo 2. Generación de una cepa bacteriana que expresa la IgA1 proteasa marcada

Se generó una cepa bacteriana de Haemophilus influenzae que expresa sólo una IgA1 proteasa marcada que es enzimáticamente activa mediante técnicas de recombinación convencionales. En resumen, se cortó el plásmido pJQ/Rd6His que se generó en el ejemplo 1 con las enzimas de restricción Cla I y Nde I. El gen se aisló y se transformó en una cepa bacteriana Rd de Haemophilus influenzae (Rd 3-13) que produce una IgA1 proteasa sin actividad enzimática (Plaut AG, Qiu, J, Grundy, F. y Wright, A. J Infect Dis. (1992) Jul;1 66(1):43-52) para permitir la inserción de la IgA1 proteasa con cola de His en el genoma bacteriano mediante recombinación. Entonces se examinaron las bacterias para determinar el restablecimiento de la actividad enzimática sometiendo a prueba unos medios de crecimiento bacteriano de colonias seleccionadas para comprobar la presencia de proteasa activa utilizando IgA1 humana como sustrato.

La introducción de la mutación de 6-His en la enzima activa se confirmó verificando la presencia de un sitio de Pml I utilizando un fragmento de PCR del ADN genómico. Esta cepa se designó Rd 6His.

La cepa Rd 6His presentaba una tasa de crecimiento y una morfología de colonia idénticas a la cepa Rd de tipo natural. El rendimiento de actividad de la IgA proteasa y el tamaño de la enzima fueron indistinguibles de los del tipo natural. Aunque la mutación de 6 His se introdujo sólo a una distancia de dos aminoácidos del sitio a autoproteolítico, no hubo ningún problema detectable ni con la secreción de la enzima de la célula bacteriana, ni con su autoprocesamiento.

Se unió un anticuerpo monoclonal anti-5His (Qiagen, Inc) a la proteasa determinado mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Cuando se combinó con el anticuerpo monoclonal en disolución, la IgA proteasa de Rd 6His mantuvo su actividad completa.

Ejemplo 3.

El efecto terapéutico de la IgA1 proteasa para el tratamiento de la nefropatía por IgA puede someterse a prueba en un modelo de ratón para nefropatía por IgA.

Se utilizan múltiples ratones Swiss-Webster (Laboratorios Charles River) por experimento y se dividen en grupos (normalmente, 10 ratones/grupo). Los ratones se colocan en primer lugar en una cámara metabólica, y se recoge orina durante 24 horas para determinar la cantidad de hematuria (la presencia de glóbulos rojos en la orina) y proteinuria (la presencia de proteína presente en la orina) en orina. Esto proporciona un valor de base para hematuria y proteinuria en ratones sanos normales. Entonces se induce nefropatía por IgA en los ratones tal como se describe en Gesualdo L. et al, (1990) J. Clin. Invest. 86: 715-722.

Tras la inducción de nefropatía, se inyectaron a los ratones por vía intraperitoneal múltiples dosis de solución salina (control), IgA1 proteasa inactiva (control), IgA1 proteasa activa, e IgA1 proteasa complejada con inmunoglobulina (por ejemplo complejada con anticuerpo antimarcador, o anticuerpo anti-IgA1 proteasa). Un régimen de dosificación ejemplo incluye la inyección de 0,1-0,5 mg de proteasa por vía intraperitoneal, dos veces al día durante 5 días. La dosificación y el régimen de dosificación pueden variarse según el efecto terapéutico observado en experimentos piloto, por ejemplo en un único ratón. Normalmente, se seleccionan dosis máximas que no provocan efectos toxicológicos o histológicos clínicos. Cuando la IgA1 proteasa está complejada con un ligando, se usan concentraciones variadas de ligando para determinar la razón proteasa/ligando más eficaz. También puede modificarse el modo de administración, por ejemplo la administración puede realizarse mediante inyección intravenosa.

Se sometió a prueba a los ratones 1-24 h tras la administración de la última dosis de agente terapéutico, para determinar el alivio de la nefropatía por IgA midiendo la hematuria y la proteinuria en ratones que no recibieron el agente terapéutico. Una reducción en la cantidad de hematuria y proteinuria en comparación con los ratones que no recibieron agente terapéutico, aproximándose a los valores observados en ratones sanos normales es indicativo de éxito terapéutico.

También se evalúan las medidas morfológicas de la nefropatía por IgA. Se sacrifican los ratones tras la recogida de orina y se extraen los riñones para determinar la cantidad de i) deposición de IgA1, ii) expansión de la matriz mesangial y ii) hipercelularidad mensangial tal como se describe. Una reducción en los parámetros i-iii en comparación con los observados en ratones que no recibieron el agente terapéutico es indicativa de éxito terapéutico

Ejemplo 4.

El efecto terapéutico de la IgA1 proteasa para el tratamiento de la dermatitis herpetiforme puede someterse a prueba en un modelo de ratón para dermatitis herpetiforme.

5

15

25

35

45

Ejemplo 5.

El efecto terapéutico de la IgA1 proteasa para el tratamiento de la púrpura de Henoch-Schoenlein puede someterse a prueba en un modelo de ratón para púrpura de Henoch-Schoenlein.

Listado de secuencias

<110> New England Medical Center Hospitals, Inc. Plaut, Andrew G Qiu, Jiazhou

<120> Tratamiento de enfermedades por deposición de IgA1

<130> 28154/2068

<140> Sin asignar todavía

<141> 05-03-2004

<150> US 60/453055

<151> 07-07-2003

<160> 26

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

imagen2

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 2

imagen2

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de proteasa mutada

<400> 3

imagen3

<210> 4

<211> 1694

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 4

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

<210> 5

<211> 5085

<212> ADN

<213> Haemophilus influenzae

<400> 5

imagen4

imagen2

imagen2

imagen2

<210> 6

<211> 6 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de marcador de péptido heteróloga 10

<400> 6

imagen2

<210> 7

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido que codifica la secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 7 caccatcacc atcaccat 18

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 8

imagen2

<210> 9

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido que codifica la secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 9 gagcaaaagc tcatttctga agaggacttg 30

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 10

imagen2

<210> 11

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido que codifica la secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 11 tacccttatg atgtgccaga ttatgcc 27

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 12

imagen2

<210> 13

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido que codifica la secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 13 tatacagaca tagagatgaa ccgacttgga aag 33

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 14

imagen2

<210> 15

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido que codifica la secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 15 cagccagaac tcgccccgga agaccccgag gat 33

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 16

imagen2

<210> 17

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido que codifica la secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 17 ggcaaaccaa tcccaaaccc actgctgggc ctggatagta ct 42

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 18

imagen2

<210> 19

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido que codifica la secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 19 gattacaaag acgatgacga taaagga 27

<210> 20

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético para mutagénesis dirigida al sitio

<400> 20 gatccgctta ccaattatgc 20

<210> 21

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético para mutagénesis dirigida al sitio

<400> 21 cttggtacgc taggcacgtg atgatgatga tgatgaggtg ttgtgatatt tgtcg 55

<210> 22

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético para mutagénesis dirigida al sitio

<400> 22 cctaataata ttcaagctca cgtgcctagc gtac 34

<210> 23

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleótido sintético para mutagénesis dirigida al sitio

<400> 23 ttcagcagaa gtctcttgc 19

<210> 24

<211> 6

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 24

imagen2

<210> 25

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido que codifica la secuencia de marcador de péptido heteróloga

<400> 25 atcacaacac ctaataatat tcaagctgat gtgcctagc 39

<210> 26

<211> 39

<212> ADN

<213> Haemophilus influenzae

<400> 26 atcacaacac ctcatcatca tcatcatcac gtgcctagc 39

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   IgA1 proteasa para su utilización en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la deposición de IgA1 en un paciente.

2. 2.

   IgA1 proteasa según la reivindicación 1, en la que dicha enfermedad es la nefropatía por IgA.

3. 3.

   IgA1 proteasa según la reivindicación 1, en la que dicha enfermedad es la dermatitis herpetiforme.

4. 4.

   IgA1 proteasa según la reivindicación 1, en la que dicha enfermedad es la púrpura de Henoch-Schoenlein.

5. 5.

   IgA1 proteasa según la reivindicación 1, en la que la IgA1 proteasa se fusiona a un marcador.

6. 6.

   IgA1 proteasa según la reivindicación 5, en la que el marcador se selecciona de entre el grupo constituido por c-Myc, HA, VSV-G, HSV, FLAG, V5 y HIS.

7. 7.

   IgA1 proteasa según la reivindicación 1, en la que la IgA1 proteasa se selecciona de entre el grupo constituido por IgA1 proteasa de Streptococcus pneumoniae, IgA1 proteasa de Streptococcus sanguis, IgA1 proteasa de Clostridium ramosum, IgA1 proteasa de Haemophilus influenzae, IgA1 proteasa de Neisseria meningitidis e IgA1 proteasa de Neisseria gonorrhoeae.

8. 8.

   IgA1 proteasa según la reivindicación 7, en la que la IgA1 proteasa se selecciona de entre el grupo constituido por IgA1 proteasa de Streptococcus sanguis, IgA1 proteasa de Clostridium ramosum, IgA1 proteasa de Haemophilus influenzae e IgA1 proteasa de Neisseria gonorrhoeae.

9. 9.

   IgA1 proteasa según la reivindicación 8, en la que la IgA1 proteasa es la IgA1 proteasa de Haemophilus influenzae.

10. 10.

    IgA1 proteasa según la reivindicación 9, en la que la IgA1 proteasa de Haemophilus influenzae se selecciona de entre el grupo constituido por IgA1 proteasa de Haemophilus influenzae de tipo 1 e IgA1 proteasa de Haemophilus influenzae de tipo 2.

11. 11.

    IgA1 proteasa según la reivindicación 8, en la que la IgA proteasa es la IgA1 proteasa de Neisseria meningitidis.

12. 12.

    IgA1 proteasa según la reivindicación 11, en la que la IgA1 proteasa de Neisseria meningitidis se selecciona de entre el grupo constituido por IgA1 proteasa de Neisseria meningitidis de tipo 1 e IgA1 proteasa de Neisseria meningitidis de tipo 2.

13. 13.

    IgA1 proteasa según la reivindicación 1, en la que la IgA1 proteasa escinde en la región bisagra de IgA1.

14. 14.

    Utilización de una IgA1 proteasa para la preparación de un medicamento para su utilización en el tratamiento de nefropatía por IgA, dermatitis herpetiforme o púrpura de Henoch-Schoenlein.