JP5739854B2 - 融合タンパク質 - Google Patents
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Description
NH2−[プロテアーゼ構成部分]−[トランスロケーション構成部分]−[TM]−COOH
a.非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントであって、侵害受容感覚求心性神経細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る、プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメント;
b.該侵害受容感覚求心性神経細胞上の結合部位に結合し得るターゲティング部分であって、該結合部位が、エンドサイトーシスを受けて該侵害受容感覚求心性神経細胞内のエンドソームに取り込まれ得る、ターゲティング部分;
c.プロテアーゼ切断部位であって、該部位でプロテアーゼにより該融合タンパク質が切断され得、該プロテアーゼ切断部位が、該非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントと該ターゲティング部分との間に位置している、プロテアーゼ切断部位;および
d.トランスロケーションドメインであって、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性神経細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせ得る、トランスロケーションドメイン
を含む。
ノシセプチン誘発応答は、特異的NK1レセプター(サブスタンスPレセプター)アンタゴニストによって撤廃される;および
カプサイシンでの細胞の前処理(直径の小さい一次求心性神経細胞からサブスタンスPを枯渇させる)によって、ノシセプチン誘発応答は減弱する。
[2] Maileら, 2003, Neurosci. Lett., 350, 190-192
[3] Rizziら, 2002, J. Pharmacol. Exp. Therap., 300, 57-63
[4] Okadaら, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 278, 493-498
[5] Dooleyら, 1997, J Pharmacol Exp Ther. 283(2), 735-41。
エンテロキナーゼ(DDDDK↓)
第Xa因子(IEGR↓/IDGR↓)
TEV(タバコエッチウイルス)(ENLYFQ↓G)
トロンビン(LVPR↓GS)
PreScission(LEVLFQ↓GP)。
His−タグ(例えば、6×ヒスチジン)、好ましくはC末端タグおよび/またはN末端タグとして
MBP−タグ(マルトース結合タンパク質)、好ましくはN末端タグとして
GST−タグ(グルタチオン−S−トランスフェラーゼ)、好ましくはN末端タグとして
His−MBP−タグ、好ましくはN末端タグとして
GST−MBP−タグ、好ましくはN末端タグとして
チオレドキシンタグ、好ましくはN末端タグとして
CBD−タグ(キチン結合ドメイン)、好ましくはN末端タグとして。
a.本発明の単鎖ポリペプチド融合タンパク質と、プロテアーゼ切断部位を切断し得るプロテアーゼとを接触させる工程;
b.プロテアーゼ切断部位を切断し、そしてそれにより二本鎖融合タンパク質を形成する工程。
a.第一鎖は、非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントを含み、このプロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントは、侵害受容感覚求心性神経細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る;
b.第二鎖は、TMおよびトランスロケーションドメインを含み、トランスロケーションドメインは、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性神経細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせ得る;そして
第一鎖および第二鎖は、一緒にジスルフィド結合で連結されている。
ターゲティング部分(TM)は、薬剤と標的細胞の表面との間に物理的会合を引き起こすように、結合部位と機能的に相互作用する薬剤と会合する任意の化学的構造を意味する。本発明においては、標的細胞は、侵害受容感覚求心性神経細胞である。TMとの用語は、結合部位が内在化(例えば、エンドソーム形成)−レセプター媒介エンドサイトーシスとも呼ばれる−を行い得る、標的細胞上の結合部位に結合し得る任意の分子(すなわち、天然に存在する分子またはそれらの化学的/物理的に改変された改変体)を含む。TMは、エンドソーム膜トランスロケーション機能を保有し得、この場合、本発明の薬剤に、TM構成部分とトランスロケーションドメイン構成部分とが別々に存在する必要はない。
ボツリヌス菌A型神経毒素−アミノ酸残基(449〜871)
ボツリヌス菌B型神経毒素−アミノ酸残基(441〜858)
ボツリヌス菌C型神経毒素−アミノ酸残基(442〜866)
ボツリヌス菌D型神経毒素−アミノ酸残基(446〜862)
ボツリヌス菌E型神経毒素−アミノ酸残基(423〜845)
ボツリヌス菌F型神経毒素−アミノ酸残基(440〜864)
ボツリヌス菌G型神経毒素−アミノ酸残基(442〜863)
破傷風菌神経毒素−アミノ酸残基(458〜879)。
図1 LC/A−ノシセプチン−HN/A融合タンパク質の精製
図2 ノシセプチン−LC/A−HN/A融合タンパク質の精製
図3 LC/C−ノシセプチン−HN/C融合タンパク質の精製
図4 LC/A−metエンケファリン−HN/A融合タンパク質の精製
図5 LC/A−ノシセプチン−HN/A融合タンパク質とノシセプチン−LC/A−HN/A融合タンパク質との結合効力の比較
図6 LC/A−ノシセプチン−HN/A融合タンパク質のインビトロ触媒活性
図7 LC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合タンパク質の精製
図8 LC/A−ノシセプチン−HN/A融合タンパク質とLC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合タンパク質との結合効力の比較
図9 可変スペーサー長産物を有する発現/精製LC/A−ノシセプチン−HN/A融合タンパク質ファミリー
図10 CPN−AによるSP放出の阻害およびSNAP−25の切断
図11 CPN−AへのDRGの曝露後長期間にわたるSP放出の阻害およびSNAP−25の切断
図12 CPNv−AによるSNAP−25の切断
図13 CPNv−AへのDRGの曝露後長期間にわたるSNAP−25の切断
図14 [3H]−ノシセプチン結合のCPNv−A融合物媒介置換
図15 発現/精製CPNv(Ek)−A産物
図16 CPNv(Ek)−AによるSNAP−25の切断
図17 発現/精製CPNv−C産物
図18 CPNv−Cによるシンタキシンの切断
図19 急性カプサイシン誘発機械的異痛モデルにおけるCPN−A効力
図20 ストレプトゾトシン(STZ)誘発末梢糖尿病性神経障害(神経因性疼痛)モデルにおけるCPN−A効力
図21 急性カプサイシン誘発機械的異痛モデルにおけるCPNv−A効力
図22 発現/精製LC/A−CPLE−HN/A産物
図23 発現/精製LC/A−CPBE−HN/A産物
図24 発現/精製CPOP−A産物
図25 発現/精製CPOPv−A産物
図26 DRG細胞モデルにおけるインビトロSNAP−25切断
図27 発現/精製CPNv−A−FXa−HT(取り外し可能hisタグ)
図28 リガンド競合アッセイにより評価した可変スペーサー長を有するLC/A−ノシセプチン−HN/A融合タンパク質のインビトロ効力
図29 インビトロSNAP−25切断により評価した可変スペーサー長を有するLC/A−ノシセプチン−HN/A融合タンパク質のインビトロ効力
実施例9に示した方法を用いて、大腸菌BL21細胞からLC/A−ノシセプチン−HN/A融合タンパク質を精製した。簡潔にいえば、細胞破壊後に得た可溶性産物をニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Xa因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質(MBP)タグを除去し、次いで第2のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS-PAGE(パネルA)およびウェスタンブロッティング(パネルB)によって評価した。抗ノシセプチン抗血清(Abcamから入手)をウェスタンブロッティングの一次抗体として使用した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物を、それぞれ[−]および[+]で記したレーン中に同定する。
実施例9に示した方法を用いて、大腸菌BL21細胞からノシセプチン−LC/A−HN/A融合タンパク質を精製した。簡潔にいえば、細胞破壊後に得た可溶性産物をニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Xa因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質(MBP)タグを除去し、次いで第2のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS-PAGE(パネルA)およびウェスタンブロッティング(パネルB)によって評価した。抗ノシセプチン抗血清(Abcamから入手)をウェスタンブロッティングの一次抗体として使用した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物を、それぞれ[−]および[+]で記したレーン中に同定する。
実施例9に示した方法を用いて、大腸菌BL21細胞からLC/C−ノシセプチン−HN/C融合タンパク質を精製した。簡潔にいえば、細胞破壊後に得た可溶性産物をニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Xa因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質(MBP)タグを除去し、次いで第2のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS-PAGE(パネルA)およびウェスタンブロッティング(パネルB)によって評価した。抗ノシセプチン抗血清(Abcamから入手)をウェスタンブロッティングの一次抗体として使用した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物を、それぞれ[−]および[+]で記したレーン中に同定する。
実施例9に示した方法を用いて、大腸菌BL21細胞からLC/A−metエンケファリン−HN/A融合タンパク質を精製した。簡潔にいえば、細胞破壊後に得た可溶性産物をニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Xa因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質(MBP)タグを除去し、次いで第2のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS-PAGEによって評価した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物を、それぞれ[−]および[+]で記したレーン中に同定する。
ノシセプチン融合物がORL1レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節(DRG)の初代培養物を、1nMの[3H]−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射性標識リガンドの特異的結合の減少をシンチレーション計数によって評価し、そして非標識リガンド(Tocrisノシセプチン)の効力と比較してプロットした。ORL1レセプターとの相互作用は、LC/A−ノシセプチン−HN/A融合物が、ノシセプチン−LC/A−HN/A融合物よりもずっと優れることが明らかである。
精製LC/A−ノシセプチン−HN/A融合タンパク質のインビトロエンドペプチダーゼ活性を、本質的には、Chaddockら, 2002, Prot. Express Purif. 25, 219-228に記載されるようにして決定した。簡潔にいえば、ELISAプレートに固定化したSNAP−25ペプチドを、種々の濃度の融合タンパク質に37℃にて1時間曝露した。一連の洗浄後、切断されたSNAP−25ペプチドの量を、特異的抗血清との反応性によって定量した。
実施例9に示した方法を用いて、大腸菌BL21細胞からLC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合タンパク質を精製した。簡潔にいえば、細胞破壊後に得た可溶性産物をニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Xa因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質(MBP)タグを除去し、次いで第2のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS-PAGEによって評価した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物を、それぞれ[−]および[+]で記したレーン中に同定する。
ノシセプチン融合物がORL1レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節(DRG)の初代培養物を、1nMの[3H]−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射性標識リガンドの特異的結合の減少をシンチレーション計数によって評価し、そして非標識リガンド(Tocrisノシセプチン)の効力に比較してプロットした。ORL1レセプターとの相互作用は、LC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合物(CPNv−LHA)が、LC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(CPN−LHA)よりも優れることが明らかである。
実施例9に示した方法を用いて、大腸菌細胞ペーストから、GS10、GS30およびHX27からなるLC/A−CPN−HN/A融合物の改変体を精製する。LC/A−CPN(GS10)−HN/A、LC/A−CPN(GS15)−HN/A、LC/A−CPN(GS25)−HN/A、LC/A−CPN(GS30)−HN/AおよびLC/A−CPN(HX27)−HN/Aの精製からの試料を、クマシーブルーで染色する前にSDS-PAGEにより評価した。この電気泳動プロフィールは、CPBE−Aの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。上のパネル:M=分子量マーカー標線;S=大腸菌タンパク質全可溶性画分;FT=Ni2+−荷電セファロースカラムに結合しなかったタンパク質;融合物=イミダゾールの添加により溶出された融合タンパク質。下のパネル:レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン3=Ni2+−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物;レーン4=Ni2+−荷電セファロースの最終捕捉前の第Xa因子処理物;レーン5=第Xa因子での活性化後の精製最終物(5μl);レーン6=第Xa因子での活性化後の精製最終物(10μl);レーン7=第Xa因子での活性化後の精製最終物(20μl);レーン8=第Xa因子での活性化後の精製最終物+DTT(5μl);レーン9=第Xa因子での活性化後の精製最終物+DTT(10μl);レーン10=第Xa因子での活性化後の精製最終物+DTT(20μl)。
簡潔にいえば、背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPN−Aに24時間曝露した。細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合をデンシトメトリー分析によって算定し、そして融合物濃度に対してプロットした(破線)。また、材料を回収して、特異的EIAキットを用いるサブスタンスP含量の分析を行った。サブスタンスP放出の阻害を、実線にて示す。50%最大SNAP−25切断に達するのに必要な融合物濃度は、6.30±2.48nMであると概算される。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPN−Aに24時間曝露した。ボツリヌス菌神経毒素(BoNT/A)をコントロールとして使用した。この初期曝露後、細胞外物質を洗浄によって除去し、そして細胞を種々の期間にわたって37℃にてインキュベートした。特定の時点で、細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合をデンシトメトリー分析によって算定し、破線にて示した。また、材料を回収して、特異的EIAキットを用いるサブスタンスP含量の分析を行った。サブスタンスP放出の阻害を、実線にて示す。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPNv−Aに24時間曝露した。細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合をデンシトメトリー分析によって算定した。50%最大SNAP−25切断に達するのに必要な融合物濃度は、1.38±0.36nMであると概算される。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPNv−Aに24時間曝露した。CPN−Aをコントロールとして使用した。この初期曝露後、細胞外物質を洗浄によって除去し、そして細胞を種々の期間にわたって37℃にてインキュベートした。特定の時点で、細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合をデンシトメトリー分析によって算定した。
ノシセプチン融合物がORL1レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節(DRG)の初代培養物を、1nMの[3H]−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射性標識リガンドの特異的結合の減少をシンチレーション計数によって評価し、そして非標識リガンド(Tocrisノシセプチン)の効力と比較してプロットした。ORL1レセプターとの相互作用は、LC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合物(CPNv−LHnAと示す)が、LC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(CPN−LHnAと示す)よりも優れることが明らかである。
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、CPNv(Ek)−Aの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン3=Ni2+−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物;レーン4=エンテロキナーゼでの活性化後の精製最終物(5μl);レーン5=エンテロキナーゼでの活性化後の精製最終物(10μl);レーン6=エンテロキナーゼでの活性化後の精製最終物(20μl);レーン7=エンテロキナーゼでの活性化後の精製最終物+DTT(5μl);レーン8=エンテロキナーゼでの活性化後の精製最終物+DTT(10μl);レーン9=エンテロキナーゼでの活性化後の精製最終物+DTT(20μl)。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPNv(Ek)−Aに24時間曝露した。細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合をデンシトメトリー分析によって算定した。実施例9において調製したCPNv−Aを比較目的に使用した。CPNv(Ek)−A(En活性化と示す)およびCPNv−A(Xa活性化と示す)によるSNAP−25の切断割合を示す。
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、CPNv−Cの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン3=Ni2+−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物;レーン4=Ni2+−荷電セファロースの最終捕捉前の第Xa因子処理物;レーン5=Ni2+−荷電セファロースの第2の捕捉後の精製物;レーン6=最終精製物;レーン7=最終精製物+DTT;レーン8=分子量マーカー標線。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPNv−Aに24時間曝露した。細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗シンタキシンでプローブしてシンタキシン切断の評価を容易にした。切断されたシンタキシンの割合をデンシトメトリー分析によって算定した。50%最大シンタキシン切断に達するのに必要な融合物濃度は、3.13±1.96nMであると概算される。
LC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(CPN/A)がカプサイシン誘発機械的異痛を抑制する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注入により評価した。試験動物を、研究に参加させる前(処置前);CPN/Aでの皮下足底内処置後カプサイシン投与前(CAP前);およびCPN/Aの注射後カプサイシン追加投与後(15分および30分での応答の平均;CAP)に、10gのVon Freyフィラメントによる一連の刺激(10刺激×3試行)に応じた足逃避率(PWF%)について評価した。カプサイシン追加投与を10μLの0.3%溶液の注射によって行った。試料希釈液を0.5%BSA/生理食塩水中で調製した。
Sprague-Dawley雄ラット(250〜300g)をクエン酸緩衝液中65mg/kgのSTZで(静脈内)処置し、そして毎週、血中のグルコースおよび脂質濃度を測定して、モデルの準備ができていることを確認する。足逃避閾値(PWT)を所定の期間にわたりVon Freyフィラメントによる一連の刺激に応じて測定する。異痛は、2つの連続した試験日(1週間空ける)でのPWTがスケールで6gを下回って測定された場合に確立されるとする。この時点で、ラットを生理食塩水群(陰性効力コントロール)、ガバペンチン群(陽性効力コントロール)または試験群(CPN/A)に無作為に振り分ける。試験物質(20〜25μl)を1回の注射で皮下注入し(ガバペンチンを除く)、PWTを処置後1日目およびその後2週間にわたって定期的に測定する。ガバペンチン(3ml/kg注入容量で30mg/kg腹腔内)は、毎日、PWT試験開始の2時間前に注射する。
LC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合物(CPNv/A)がカプサイシン誘発機械的異痛を抑制する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注入により評価した。試験動物を、研究に参加させる前(処置前);CPNv/Aでの皮下足底内処置後カプサイシン投与前(CAP前);およびCPNv/Aの注射後カプサイシン追加投与後(15分および30分での応答の平均;CAP)の10gのVon Freyフィラメントによる一連の刺激(10刺激×3試行)に応じた足逃避率(PWF%)について評価した。カプサイシン追加投与を10μLの0.3%溶液の注射によって行った。試料希釈液を0.5%BSA/生理食塩水中で調製した。これらのデータを、正規化足逃避率差として表し、これは、ピーク応答(カプサイシン後)とベースライン応答(カプサイシン前)との間の差を百分率にて示す。この分析にて、CPNv/Aは、CPN/Aよりも強力であることが理解され得る。これは、CPNv/Aでは、CPN/Aで見られるのと同様の鎮痛効果を生じるのに必要とする投薬量が、より少ないからである。
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、CPLE−Aの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン3=Ni2+−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物;レーン4=Ni2+−荷電セファロースの最終捕捉前の第Xa因子処理物;レーン5=Ni2+−荷電セファロースの第2の捕捉後の精製物;レーン6=最終精製物;レーン7=最終精製物+DTT。
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、CPBE−Aの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン2=Ni2+−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物;レーン3=Ni2+−荷電セファロースの最終捕捉前の第Xa因子処理物;レーン4=第Xa因子での活性化後の精製最終物(5μl);レーン5=第Xa因子での活性化後の精製最終物(10μl);レーン6=第Xa因子での活性化後の精製最終物(20μl);レーン7=第Xa因子での活性化後の精製最終物+DTT(5μl);レーン8=第Xa因子での活性化後の精製最終物+DTT(10μl);レーン9=第Xa因子での活性化後の精製最終物+DTT(20μl);レーン10=分子量マーカー標線。
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、CPOP−Aの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=Ni2+−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物;レーン3=Ni2+−荷電セファロースの最終捕捉前の第Xa因子処理物;レーン4=Ni2+−荷電セファロースの第二の捕捉後の精製物;レーン5=第Xa因子での活性化後の精製最終物(5μl);レーン6=第Xa因子での活性化後の精製最終物(10μl);レーン7=第Xa因子での活性化後の精製最終物(20μl);レーン8=第Xa因子での活性化後の精製最終物+DTT(5μl);レーン9=第Xa因子での活性化後の精製最終物+DTT(10μl);レーン10=第Xa因子での活性化後の精製最終物+DTT(20μl)。
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、CPOPv−Aの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン3=Ni2+−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物;レーン4=Ni2+−荷電セファロースの最終捕捉前の第Xa因子処理物;レーン5=第Xa因子での活性化後の精製最終物(5μl);レーン6=第Xa因子での活性化後の精製最終物(10μl);レーン7=第Xa因子での活性化後の精製最終物(20μl);レーン8=第Xa因子での活性化後の精製最終物+DTT(5μl);レーン9=第Xa因子での活性化後の精製最終物+DTT(10μl);レーン10=第Xa因子での活性化後の精製最終物+DTT(20μl)。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPOPv−Aに24時間曝露した。細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合をデンシトメトリー分析によって算定した。
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、CPNv−A−FXa−HTの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン3=Ni2+−荷電セファロースの最終捕捉前の第Xa因子処理物;レーン4=第Xa因子での活性化後の精製最終物;レーン5=第Xa因子での活性化後の精製最終物+DTT。
可変スペーサー長のLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物がORL1レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節(DRG)の初代培養物を、1nMの[3H]−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射性標識リガンドの特異的結合の減少をシンチレーション計数によって評価し、そして非標識リガンド(Tocrisノシセプチン)の効力と比較してプロットした。上のパネルは、GS0、GS20、GS30およびHx27のスペーサーの置換の特徴を示している。一方、下のパネルは、GS10、GS15、およびGS25のスペーサーによる融合タンパク質により得られる置換を示している。ORL1レセプターからノシセプチンを置き換えるのに、GS0およびGS30スペーサーは有効でなく、そしてGS10は有効性に乏しいと結論される。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度の(可変スペーサー長の)CPN−Aに24時間曝露した。細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合をデンシトメトリー分析によって算定した。GS10スペーサーによる融合タンパク質の結合特性の効力が乏しいこと(図28を参照のこと)は、細胞内SNAP−25の切断を生じるのに必要とされる融合物の濃度がより高いことにおいて反映されている。GS0およびGS30のスペーサーによる融合タンパク質は、完全に有効でなかった(データは示さず)。GS15、GS20、およびGS25のスペーサーによる融合タンパク質は、同様に有効であった。
配列番号1 LC/AのDNA配列
配列番号2 HN/AのDNA配列
配列番号3 LC/BのDNA配列
配列番号4 HN/BのDNA配列
配列番号5 LC/CのDNA配列
配列番号6 HN/CのDNA配列
配列番号7 CPN−AリンカーのDNA配列
配列番号8 AリンカーのDNA配列
配列番号9 N末端側提示ノシセプチン挿入片のDNA配列
配列番号10 CPN−CリンカーのDNA配列
配列番号11 CPBE−AリンカーのDNA配列
配列番号12 CPNvar−AリンカーのDNA配列
配列番号13 LC/A−CPN−HN/A融合物のDNA配列
配列番号14 LC/A−CPN−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号15 N−LC/A−HN/A融合物のDNA配列
配列番号16 N−LC/A−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号17 LC/C−CPN−HN/C融合物のDNA配列
配列番号18 LC/C−CPN−HN/C融合物のタンパク質配列
配列番号19 LC/C−CPN−HN/C(Aリンカー)融合物のDNA配列
配列番号20 LC/C−CPN−HN/C(Aリンカー)融合物のタンパク質配列
配列番号21 LC/A−CPME−HN/A融合物のDNA配列
配列番号22 LC/A−CPME−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号23 LC/A−CPBE−HN/A融合物のDNA配列
配列番号24 LC/A−CPBE−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号25 LC/A−CPNv−HN/A融合物のDNA配列
配列番号26 LC/A−CPNv−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号27 LC/A−CPN[1−11]−HN/A融合物のDNA配列
配列番号28 LC/A−CPN[1−11]−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号29 LC/A−CPN[[Y10]1−11]−HN/A融合物のDNA配列
配列番号30 LC/A−CPN[[Y10]1−11]−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号31 LC/A−CPN[[Y11]1−11]−HN/A融合物のDNA配列
配列番号32 LC/A−CPN[[Y11]1−11]−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号33 LC/A−CPN[[Y14]1−17]−HN/A融合物のDNA配列
配列番号34 LC/A−CPN[[Y14]1−17]−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号35 LC/A−CPN[1−13]−HN/A融合物のDNA配列
配列番号36 LC/A−CPN[1−13]−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号37 CPN[1−17]のDNA配列
配列番号38 CPN[1−17]のタンパク質配列
配列番号39 CPN[1−11]のDNA配列
配列番号40 CPN[1−11]のタンパク質配列
配列番号41 CPN[[Y10]1−11]のDNA配列
配列番号42 CPN[[Y10]1−11]のタンパク質配列
配列番号43 CPN[[Y11]1−11]のDNA配列
配列番号44 CPN[[Y11]1−11]のタンパク質配列
配列番号45 CPN[[Y14]1−17]のDNA配列
配列番号46 CPN[[Y14]1−17]のタンパク質配列
配列番号47 CPN[1−13]のDNA配列
配列番号48 CPN[1−13]のタンパク質配列
配列番号49 CPNv(N[[R14K15]1−17]としても公知)のDNA配列
配列番号50 CPNv(N[[R14K15]1−17]としても公知)のタンパク質配列
配列番号51 ノシセプチン−スペーサー−LC/A−HN/A融合物のDNA配列
配列番号52 ノシセプチン−スペーサー−LC/A−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号53 CPN−A GS10リンカーのDNA配列
配列番号54 CPN−A GS15リンカーのDNA配列
配列番号55 CPN−A GS25リンカーのDNA配列
配列番号56 CPN−A GS30リンカーのDNA配列
配列番号57 CPN−A HX27リンカーのDNA配列
配列番号58 LC/A−CPN(GS15)−HN/A融合物のDNA配列
配列番号59 LC/A−CPN(GS15)−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号60 LC/A−CPN(GS25)−HN/A融合物のDNA配列
配列番号61 LC/A−CPN(GS25)−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号62 CPNvar−Aエンテロキナーゼ活性化リンカーのDNA配列
配列番号63 LC/A−CPNv(Ek)−HN/A融合物のDNA配列
配列番号64 LC/A−CPNv(Ek)−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号65 CPNvar−AリンカーのDNA配列
配列番号66 LC/C−CPNv−HN/C融合物(act.A)のDNA配列
配列番号67 LC/C−CPNv−HN/C融合物(act.A)のタンパク質配列
配列番号68 LC/A−CPLE−HN/A融合物のDNA配列
配列番号69 LC/A−CPLE−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号70 LC/A−CPOP−HN/A融合物のDNA配列
配列番号71 LC/A−CPOP−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号72 LC/A−CPOPv−HN/A融合物のDNA配列
配列番号73 LC/A−CPOPv−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号74 IgAプロテアーゼのDNA配列
配列番号75 IgA−CPNv−HN/A融合物のDNA配列
配列番号76 IgA−CPNv−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号77 FXa−HTのDNA配列
配列番号78 CPNv−A−FXa−HTのDNA配列
配列番号79 CPNv−A−FXa−HT融合物のタンパク質配列
配列番号80 DTトランスロケーションドメインのDNA配列
配列番号81 CPLE−DT−AのDNA配列
配列番号82 CPLE−DT−A融合物のタンパク質配列
配列番号83 TeNT LCのDNA配列
配列番号84 CPNv−TeNT LCのDNA配列
配列番号85 CPNv−TeNT LC融合物のタンパク質配列
配列番号86 CPNvar−CリンカーのDNA配列
配列番号87 LC/C−CPNv−HN/C融合物(act.C)のDNA配列
配列番号88 LC/C−CPNv−HN/C融合物(act.C)のタンパク質配列
以下の手順によって、マルチドメイン融合物発現用の構成部分バックボーンとして使用するためのLCおよびHNフラグメントを作製する。本実施例は、血清型Aベースのクローン(配列番号1および配列番号2)の調製に基づいているが、手順および方法は他の血清型にも同等に適用可能である[血清型B(配列番号3および配列番号4)ならびに血清型C(配列番号5および配列番号6)については配列表に図示]。
pCR 4(Invitrogen)は、構築物の確認を容易にするために、ベクター内の制限配列の欠損および隣接する配列決定プライマー部位によって選択した、選り抜きの標準的なクローニングベクターである。この発現ベクターは、pMAL(NEB)発現ベクターに基づいており、これは、構築物の挿入のために正しい方向でマルチプルクローニング部位内に所望の制限配列を有する(BamHI-SalI-PstI-HindIII)。非動員性プラスミドを作製するため、発現ベクターのフラグメントが除去されており、そして精製の選択肢を増大させるため、種々の異なる融合タグが挿入されている。
LC/A(配列番号1)を、二通りの方法の一方によって作製する:
DNA配列を、[種々の逆翻訳ソフトウェアツール(例えば、EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon))の1つを用いて、GenBank(アクセッション番号P10845)またはSwissprot(アクセッション位置BXA1_CLOBO)のような自由に利用可能なデータベースソースから得られる]LC/Aアミノ酸配列の逆翻訳によって設計する。BamHI/SalI認識配列を、配列の5’末端および3’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み取り枠を維持する。DNA配列を、逆翻訳の間に組み込んだ制限酵素切断配列について(MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウェアを用いて)スクリーニングする。クローニング系によって必要とされる配列と共通であることが見出されている切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser (Geneart)のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、LC/Aオープンリーディングフレーム(ORF)を含有するこの最適化したDNA配列は商業的に合成され(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
HN/A(配列番号2)を、二通りの方法の一方によって作製する:
DNA配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール[例えば、EditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon)]の1つを用いて、[GenBank(アクセッション番号P10845)またはSwissprot(アクセッション位置BXA1_CLOBO)のような自由に利用可能なデータベースソースから得られる]HN/Aアミノ酸配列の逆翻訳によって設計する。N末端にPstI制限配列を、そしてC末端にXbaI−停止コドン−HindIIIを付加し、正しい読み取り枠を維持するようにする。DNA配列を、逆翻訳の間に組み込んだ制限酵素切断配列について(MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウェアを用いて)スクリーニングする。クローニング系によって必要とされる配列と共通であることが見出されている配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、この最適化したDNA配列は商業的に合成され(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
(リンカー−ノシセプチン−スペーサー挿入片の調製)
LC−HNリンカーを、リンカーについての既存配列情報を鋳型として用いて、第一の原則から設計し得る。例えば、血清型Aリンカー(この場合、LCとHNとの間のジスルフィド架橋のシステイン間に存在するドメイン間ポリペプチド領域として定義される)は、23アミノ酸長であり、そして配列VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLを有する。この配列内で、天然でのタンパク質分解による活性化により、配列ALNDLのN末端を有するHNドメインが生じると理解される。この配列情報は、GenBank(アクセッション番号P10845)またはSwissprot(アクセッション位置BXA1_CLOBO)のような利用可能なデータベースソースから自由に入手可能である。このリンカーに、第Xa因子部位、ノシセプチンおよびスペーサーを組み込み、そして種々の逆翻訳ソフトウェアツール[例えば、EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon)]の1つを用いて、リンカー−リガンド−スペーサー領域をコードするDNA配列を決定する。次いで、制限部位をこのDNA配列に組み込み、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号7)として配置させ得る。スペーサー、ノシセプチン、および制限配列について正しい読み枠を維持し、そしてDAMメチル化を生じ得るので塩基TCがXbaI配列の前にならないようにすることが重要である。このDNA配列を、制限配列の組み込みについてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、この最適化したDNA配列は商業的に合成され(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
LC−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−HN構築物(配列番号13)を作製するために、リンカー(配列番号7)をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、BamHIおよびSalIで切断したLC/AのDNA(配列番号1)の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。次いで、得られたプラスミドDNAをPstIおよびXbaI制限酵素で切断し、そしてPstIおよびXbaIで切断したHN/AのDNA(配列番号2)の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−HN ORF(配列番号13)を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号14に示される配列の融合タンパク質が発現される。
LC/A−HN/Aバックボーンを、活性化のために第Xa因子部位を付加し、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−リンカー−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号8)として配置された合成血清型Aリンカーを用いて、実施例2に記載のように構築する。LC/A−HN/Aバックボーンおよび合成したN末端側提示ノシセプチン挿入片(配列番号9)を、BamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、ゲル精製し、そして一緒に連結してノシセプチン−スペーサー−LC−リンカー−HNを作製する。次いで、ORF(配列番号15)を制限酵素AvaIおよびXbaIを用いて切断し、これを、発現ベクターに移入して、配列番号16に示される配列の融合タンパク質が発現される。
実施例1および2で使用した方法に従って、LC/C(配列番号5)およびHN/C(配列番号6)を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号10)として配置された血清型Cリンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−HN ORF(配列番号17)を含んでおり、これは、配列番号18に示される配列のタンパク質を発現する。
実施例1および2で使用した方法に従って、LC/C(配列番号5)およびHN/C(配列番号6)を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号7)として配置された血清型Aリンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−HN ORF(配列番号19)を含んでおり、これは、配列番号20に示される配列のタンパク質を発現する。
metエンケファリンリガンドのサイズが小さい(5アミノ酸)ため、LC/A−metエンケファリン−HN/A融合物を、鋳型としてLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(配列番号13)を用いる部位特異的変異誘発[例えば、Quickchange(Stratagene Inc.)を用いて]によって作製する。YGGFM metエンケファリンペプチドをコードし、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(配列番号13)のリンカー領域に相補的な配列が隣接されるようにするオリゴヌクレオチドを設計する。SDM産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、LC−リンカー−metエンケファリン−スペーサー−HN ORF(配列番号21)を含んでおり、これは、配列番号22に示される配列のタンパク質を発現する。
実施例1および2で使用した方法に従って、LC/A(配列番号1)およびHN/A(配列番号2)を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−βエンドルフィン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号11)として配置された血清型A βエンドルフィンリンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−βエンドルフィン−スペーサー−HN ORF(配列番号23)を含んでおり、これは、配列番号24に示される配列のタンパク質を発現する。
実施例1および2で使用した方法に従って、LC/A(配列番号1)およびHN/A(配列番号2)を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号12)として配置された血清型Aノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−HN ORF(配列番号25)を含んでおり、これは、配列番号26に示される配列のタンパク質を発現する。
25ml 50mM HEPES(pH 7.2)、200mM NaClおよび約10gの大腸菌BL21細胞ペーストを含むファルコン管を解凍する。この融解した細胞ペーストを50mM HEPES(pH 7.2)、200mM NaClで80mlまでにし、そして氷上にて、22ミクロンのパワーで30秒間オン、30秒間オフを10サイクルで超音波処理し、試料を冷却したままにする。溶解した細胞を18000rpmで4℃にて30分間遠心分離する。この上清を、50mM HEPES(pH 7.2)、200mM NaClで平衡化しておいた0.1M NiSO4荷電キレートカラム(20〜30mlカラムが十分である)に流す。10mMおよび40mMのイミダゾールのステップグラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を100mMイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を5Lの50mM HEPES(pH 7.2)、200mM NaClに対して4℃にて終夜透析し、そして透析した融合タンパク質のODを測定する。100μg融合タンパク質当たり1単位の第Xa因子を添加し、そして25℃にて終夜静置インキュベートする。50mM HEPES(pH 7.2)、200mM NaClで平衡化しておいた0.1M NiSO4荷電キレートカラム(20〜30mlカラムが十分である)に流す。50mM HEPES(pH 7.2)、200mM NaClでベースラインまでカラムを洗浄する。10mMおよび40mMのイミダゾールのステップグラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を100mMイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を5Lの50mM HEPES(pH 7.2)、200mM NaClに対して4℃にて終夜透析し、そしてこの融合物を約2mg/mlに濃縮し、試料を小分けし、そして−20℃にて凍結する。OD、BCA、純度分析、およびSNAP−25評価を用いて精製タンパク質を試験する。
(材料)
サブスタンスP EIAはR&D Systems, UKから入手。
eDRGの初代神経細胞培養物を、既述(Dugganら, 2002)のようにして樹立させる。この培養物からのサブスタンスP放出を、本質的には、既述(Dugganら, 2002)のようにして、EIAによって評価する。目的のTMを(処理前に少なくとも2週間の間樹立させた)神経細胞培養物に添加する;TMの代わりにビヒクルを添加することにより、コントロール培養を並行して行う。全細胞溶解物含量と共に、サブスタンスPの刺激された(100mM KCl)放出および基底の放出を、コントロール培養およびTM処理培養の両方について得る。サブスタンスP免疫反応性を、サブスタンスP酵素免疫アッセイキット(Cayman Chemical Company, USAまたはR&D Systems, UK)を製造者の指示書に従って用いて測定する。
所与のTMがORL1レセプターを介して作用することの確認は、以下の試験によって提供される。ここでは、TMがフォルスコリン刺激cAMP生産を阻害する能力を評価する。
[3H]アデニンおよび[14C]cAMPはGE Healthcareから入手。
この試験は、本質的には、Meunierら[Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature 377: 532-535, 1995]によって既述されるようにして、24ウェルプラスチックプレート上に播種した無傷のトランスフェクトCHO細胞において行う。
所与のTMがORL1レセプターを介して作用することの確認は、以下の試験、GTPγS結合機能アッセイによっても提供される。
[35S]GTPγSはGE Healthcareから入手。
小麦胚凝集素コーティング(SPA)ビーズはGE Healthcareから入手。
このアッセイは、本質的には、TraynorおよびNahorski[Modulation by μ-opioid agonists of guanosine-5-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47: 848-854, 1995]によって記載されるようにして行う。
リンカー−ノシセプチン−スペーサー挿入片を、実施例2に記載のように調製する。
LC−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−HN構築物(配列番号13)を作製するために、リンカー(配列番号7)をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、同様にBamHIおよびSalIで切断したLC/AのDNA(配列番号1)の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。次いで、得られたプラスミドDNAをBamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてpMALベクター(NEB)のようなBamHI、SalI、PstI、およびHindIIIに対する独自のマルチプルクローニング部位を含むベクターを同様に切断して、これにLC/A−リンカーフラグメントを挿入する。次いで、HN/AのDNA(配列番号2)をPstIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてこれを同様に切断したpMAL−LC/A−リンカー構築物に挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−HN ORF(配列番号13)を含んでおり、これは、配列番号14に示される配列のタンパク質を発現する。
ノシセプチン−スペーサー−LC/A−HN/A構築物を作製するために、活性化のために第Xa因子部位を付加した、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−リンカー−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号8)として配置された血清型Aリンカーを、実施例13に記載のように合成する。このリンカーをコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、同様にBamHIおよびSalIで切断したLC/AのDNA(配列番号1)の挿入および連結用のレシピエントとして使用する。次いで、得られたプラスミドDNAをBamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、そして合成N末端提示ノシセプチン挿入片(配列番号9)を含む同様に切断したベクターにLC/A−リンカーフラグメントを挿入する。次いで、この構築物をAvaIおよびHindIIIで切断し、pMALプラスミド(NEB)のような発現ベクターに挿入する。次いで、HN/A DNA(配列番号2)をPstIおよびHindIII制限酵素で切断し、そして同様に切断したpMAL−ノシセプチン−LC/A−リンカー構築物に挿入する。最終構築物は、ノシセプチン−スペーサー−LC/A−HN/A ORF(配列番号51)を含んでおり、これは、配列番号52に示される配列のタンパク質を発現する。
実施例2で用いたのと同じストラテジーを用いて、ノシセプチンおよび可変スペーサー内容をコードする種々のDNAリンカーを調製した。種々の逆翻訳ソフトウェアツール[例えば、EditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon)]の1つを用いて、リンカー−リガンド−スペーサー領域をコードするDNA配列を決定する。次いで、制限部位をDNA配列に組み込み、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号53から配列番号57)として配置させ得る。スペーサー、ノシセプチン、および制限配列について正しい読み枠を維持し、そしてDAMメチル化を生じ得るので塩基TCがXbaI配列の前にならないようにすることが重要である。このDNA配列を、制限配列組み込みについてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、この最適化したDNA配列は商業的に合成され(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
実施例2および9に従って調製した融合タンパク質をeDRG神経細胞モデルにおいて評価した。
実施例8および9に従って調製した融合タンパク質を、実施例16に記載の方法を用いて、eDRG神経細胞モデルにおいて評価した。
実施例1および2で使用した方法に従って、LC/A(配列番号1)およびHN/A(配列番号2)を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−エンテロキナーゼプロテアーゼ部位−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号62)として配置された血清型Aノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−HN ORF配列(配列番号63)を含んでおり、これは、配列番号64に示される配列のタンパク質を発現する。この融合タンパク質をCPNv(Ek)−Aと称する。図15は、活性化のために100μgの融合タンパク質当たり0.00064μgでエンテロキナーゼを用いたこと以外は実施例9で使用した方法に従って行った、大腸菌からのCPNv(Ek)−Aの精製を示している。
実施例18で調製したCPNv(Ek)−Aを精製形態で得て、eDRG細胞モデルに適用してSNAP−25の切断を評価する(実施例16からの方法を用いる)。図16は、CPNv(Ek)−AへのeDRGの24時間曝露後のSNAP−25の切断を示している。切断の効率は、実施例17に報告したような第Xa因子切断物で得られるのと同様であることが観察される。
実施例4で使用した方法に従って、LC/C(配列番号5)およびHN/C(配列番号6)を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号65)として配置された血清型Aノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−HN ORF配列(配列番号66)を含んでおり、これは、配列番号67に示される配列のタンパク質を発現する。この融合タンパク質をCPNv−C(act.A)と称する。図17は、実施例9で使用した方法に従って行った、大腸菌からのCPNv−C(act.A)の精製を示している。
実施例9で使用した方法に従って、実施例20で調製したCPNv−C(act.A)を精製形態で得て、eDRG細胞モデルに適用してSNAP−25の切断を評価する(実施例16からの方法を用いる)。融合物への24時間曝露後、3.1±2.0nMの融合物濃度で、最大の50%のシンタキシン切断が生じている。図18は、CPNv−C(act.A)へのeDRGの24時間曝露後のシンタキシンの切断を示している。
LC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(CPN/A)が急性カプサイシン誘発機械的異痛を抑制する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注入により評価する。試験動物を、研究に参加させる前;CPN/Aでの皮下処置後カプサイシン投与前;およびCPN/Aの注射後カプサイシン追加投与後(15分および30分での応答の平均)の10gのVon Freyフィラメントによる一連の刺激(10刺激×3試行)に応じた足逃避率(PWF%)について評価する。カプサイシン追加投与を10μLの0.3%溶液の注射によって行う。試料希釈液を0.5%BSA/生理食塩水中で調製する。図19は、LC/A−ノシセプチン−HN/A融合物の種々の濃度での動物の前処置により得られる機械的異痛の逆転を示している。
LC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合物(CPNv/A)がカプサイシン誘発機械的異痛を抑制する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注入により評価する。試験動物を、研究に参加させる前(処置前);CPNv/Aでの皮下足底内処置後カプサイシン投与前(CAP前);およびCPNv/Aの注射後カプサイシン追加投与後(15分および30分での応答の平均;CAP)の10gのVon Freyフィラメントによる一連の刺激(10刺激×3試行)に応じた足逃避率(PWF%)について評価する。カプサイシン追加投与を10μLの0.3%溶液の注射によって行う。試料希釈液を0.5%BSA/生理食塩水中で調製する。
leuエンケファリンリガンドのサイズが小さい(5アミノ酸)ため、LC/A−leuエンケファリン−HN/A融合物を、鋳型としてLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(配列番号13)を用いる部位特異的変異誘発[例えば、Quickchange(Stratagene Inc.)を用いて]によって作製する。YGGFL leuエンケファリンペプチドをコードし、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(配列番号13)のリンカー領域に相補的な配列が隣接するオリゴヌクレオチドを設計する。SDM産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、LC−リンカー−leuエンケファリン−スペーサー−HN ORF(配列番号68)を含んでおり、これは、配列番号69に示される配列のタンパク質を発現する。この融合タンパク質をCPLE−Aと称する。図22は、実施例9で使用した方法に従って行った、大腸菌からのCPLE−Aの精製を示している。
実施例9で使用した方法に従って、そして実施例7で作製したLC/A−βエンドルフィン−HN/A融合タンパク質(CPBE−Aと称する)を用いて、CPBE−Aを大腸菌から精製する。図23は、精製したタンパク質をSDS-PAGEによる分析にて示している。
1位をPheからTyrにするようにノシセプチン配列を変異させるのに必要な単一アミノ酸改変のために、LC/A−ノシセプチン変異体−HN/A融合物を、鋳型としてLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(配列番号13)を用いる部位特異的変異誘発[例えば、Quickchange(Stratagene Inc.)を用いて]によって作製する。ノシセプチン配列の1位でチロシンをコードし、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(配列番号13)のリンカー領域に相補的な配列が隣接するオリゴヌクレオチドを設計する。SDM産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、LC/A−ノシセプチン変異体−スペーサー−HN/A融合物ORF(配列番号70)を含んでおり、これは、配列番号71に示される配列のタンパク質を発現する。この融合タンパク質をCPOP−Aと称する。図24は、実施例9で使用した方法に従って行った、大腸菌からのCPOP−Aの精製を示している。
1位をPheからTyrにするようにノシセプチン配列を変異させるのに必要な単一アミノ酸改変のために、LC/A−ノシセプチン改変体変異体−HN/A融合物を、鋳型としてLC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合物(配列番号25)を用いる部位特異的変異誘発[例えば、Quickchange(Stratagene Inc.)を用いて]によって作製する。ノシセプチン配列の1位でチロシンをコードし、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のLC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合物(配列番号25)のリンカー領域に相補的な配列が隣接するオリゴヌクレオチドを設計する。SDM産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、LC/A−ノシセプチン変異体−スペーサー−HN/A融合物ORF(配列番号72)を含んでおり、これは、配列番号73に示される配列のタンパク質を発現する。この融合タンパク質をCPOPv−Aと称する。図25は、実施例9で使用した方法に従って行った、大腸菌からのCPOPv−Aの精製を示している。
IgAプロテアーゼアミノ酸配列を、自由に利用可能なデータベースソース(例えば、GenBank(アクセッション番号P09790))から入手した。N. GonorrhoeaeIgAプロテアーゼ遺伝子の構造に関する情報は、文献で入手可能である(Pohlnerら, Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease, Nature, 1987, 325(6103), 458-62)。Backtranslation tool v2.0(Entelechon)を用いて、大腸菌発現のために改変したIgAプロテアーゼをコードするDNA配列を決定した。BamHI認識配列をIgA DNAの5’末端に組み込み、システインアミノ酸をコードするコドンおよびSalI認識配列をIgA DNAの3’末端に組み込んだ。DNA配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について、MapDraw,(DNASTAR Inc.)を用いてスクリーニングした。クローニングに必要とされる配列と共通であることが見出されている切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)によって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表を参照することによって評価した。次いで、IgAオープンリーディングフレーム(ORF)を含むこの最適化したDNA配列(配列番号74)は商業的に合成される。
第Xa因子の取り外し可能なhisタグ(his6)をコードするDNAを調製したが、エンテロキナーゼのような別のプロテアーゼ部位およびもっと長いヒスチジンタグのような別の精製タグもまた可能であることが明らかである。種々の逆翻訳ソフトウェアツール[例えば、EditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0(Entelechon)]の1つを用いて、第Xa因子の取り外し可能なhisタグ領域をコードするDNA配列を決定する。次いで、制限部位をこのDNA配列に組み込み、NheI−リンカー−SpeI−PstI−HN/A−XbaI−LEIEGRSGHHHHHH停止コドン−HindIII(配列番号77)として配置させ得る。このDNA配列を、組み込まれた制限配列についてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、この最適化したDNA配列は商業的に合成され(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター中に提供される。CPNv−A−FXa−HT(配列番号78、取り外し可能なhisタグ構築物)を作製するために、取り外し可能なhisタグをコードしているpCR 4ベクターをNheIおよびHindIIIで切断する。次いで、NheI−HindIIIフラグメントを、同様にNheIおよびHindIIIによって切断しておいたLC/A−CPNv−HN/Aベクター(配列番号25)に挿入する。最終構築物は、LC/A−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−HN−FXa−Hisタグ−HindIII ORF配列(配列番号78)を含んでおり、これは、配列番号79に示される配列のタンパク質を発現する。図27は、実施例9で使用した方法に従って行った、大腸菌からのCPNv−A−FXa−HTの精製を示している。
DNA配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール[例えば、EditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0(Entelechon)]の1つを用いて、ジフテリア毒素のトランスロケーションドメインのアミノ酸配列(自由に利用可能なデータベースソース(例えば、GenBank(アクセッション番号1XDTT))から入手)の逆翻訳によって設計する。次いで、制限部位をこのDNA配列に組み込み、NheI−リンカー−SpeI−PstI−ジフテリアトランスロケーションドメイン−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号80)として配置させ得る。PstI/XbaI認識配列を、配列のトランスロケーションドメインの5’末端および3’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み枠を維持する。このDNA配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について、(MapDraw(DNASTAR Inc.)のようなソフトウェアを用いて)スクリーニングする。クローニング系に必要とされる配列と共通であることが見出されている切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、ジフテリアトランスロケーションドメインを含むこの最適化したDNA配列は、NheI−リンカー−SpeI−PstI−ジフテリアトランスロケーションドメイン−XbaI−停止コドン−HindIIIとして商業的に合成され(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター(Invitrogen)中に提供される。ジフテリアトランスロケーションドメインをコードしているpCR 4ベクターをNheIおよびXbaIで切断する。次いで、NheI−XbaIフラグメントを、同様にNheIおよびXbaIによって切断しておいたLC/A−CPLE−HN/Aベクター(配列番号68)に挿入する。最終構築物は、LC/A−leuエンケファリン−スペーサー−ジフテリアトランスロケーションドメインのORF配列(配列番号81)を含んでおり、これは、配列番号82に示される配列のタンパク質を発現する。
DNA配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール[例えば、EditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0(Entelechon)]の1つを用いて、破傷風菌毒素LCアミノ酸配列(自由に利用可能なデータベースソース(例えば、GenBank(アクセッション番号X04436))から入手)の逆翻訳によって設計する。BamHI/SalI認識配列を、配列の5’末端および3’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み枠を維持する(配列番号83)。このDNA配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について、(MapDraw(DNASTAR Inc.)のようなソフトウェアを用いて)スクリーニングする。クローニング系に必要とされる配列と共通であることが見出されている切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、破傷風菌毒素LCのオープンリーディングフレーム(ORF)を含むこの最適化したDNA配列は、商業的に合成され(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター(Invitrogen)中に提供される。TeNT LCをコードしているpCR 4ベクターをBamHIおよびSalIで切断する。次いで、BamHI−SalIフラグメントを、同様にBamHIおよびSalIによって切断しておいたLC/A−CPNv−HN/Aベクター(配列番号25)に挿入する。最終構築物は、TeNT LC−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−HN ORF配列(配列番号84)を含んでおり、これは、配列番号85に示される配列のタンパク質を発現する。
実施例4で使用した方法に従って、LC/C(配列番号5)およびHN/C(配列番号6)を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号86)として配置された血清型Cノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−HN ORF配列(配列番号87)を含んでおり、これは、配列番号88に示される配列のタンパク質を発現する。この融合タンパク質をCPNv−C(act.C)と称する。
Claims (26)
- 単鎖ポリペプチド融合タンパク質であって:
a.非細胞傷害性プロテアーゼであって、該プロテアーゼが、侵害受容感覚求心性神経細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得、ここで該非細胞傷害性プロテアーゼが、クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼまたはIgAプロテアーゼである、プロテアーゼ;
b.該侵害受容感覚求心性神経細胞上の結合部位に結合し得るオピオイドペプチドターゲティング部分であって、該結合部位が、エンドサイトーシスを受けて該侵害受容感覚求心性神経細胞内のエンドソームに取り込まれ得、該ターゲティング部分が、ノシセプチン、β−エンドルフィン、エンドモルフィン−1、エンドモルフィン−2、ダイノルフィン、met−エンケファリン、leu−エンケファリン、ガラニン、およびPAR−2ペプチドからなる群から選択される、オピオイドペプチドターゲティング部分;
c.プロテアーゼ切断部位であって、該部位でプロテアーゼにより該融合タンパク質が切断され得、該プロテアーゼ切断部位が、該非細胞傷害性プロテアーゼと該ターゲティング部分との間に位置している、プロテアーゼ切断部位;および
d.トランスロケーションドメインであって、該トランスロケーションドメインが、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性神経細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼをトランスロケートさせ得、該トランスロケーションドメインが、クロストリジウム神経毒素のH N ドメインであるか、またはジフテリア毒素、シュードモナス外毒素のドメインII、炭疽菌毒素、インフルエンザウイルスヘマグルチニンに由来する融合性および/または両親媒性のペプチド、セムリキ森林ウイルスの融合性ペプチド、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質G、SERウイルスFタンパク質、および泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質からなる群より選択されるトランスロケーションドメインである、トランスロケーションドメイン
を含み、
該ターゲティング部分が、該プロテアーゼ切断部位と該トランスロケーションドメインとの間に位置しており、
そして該ターゲティング部分および該プロテアーゼ切断部位が、多くとも10アミノ酸残基離れており、
そして該ターゲティング部分および該プロテアーゼ切断部位が、0アミノ酸残基離れたものでない、融合タンパク質。 - 前記オピオイドぺプチドターゲティング部分および前記プロテアーゼ切断部位が、多くとも5アミノ酸残基離れている、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記オピオイドぺプチドターゲティング部分が、多くとも50アミノ酸残基、または多くとも40アミノ酸残基、または多くとも30アミノ酸残基、または多くとも20アミノ酸残基を含む、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 前記オピオイドペプチドターゲティング部分が、侵害受容感覚求心性神経細胞上に存在するレセプターのアゴニストである、請求項1から3のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記オピオイドペプチドターゲティング部分が、一次侵害受容感覚求心性神経細胞上に存在するレセプターのアゴニストである、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記オピオイドペプチドターゲティング部分がORL 1 レセプターに結合する、請求項1から5のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記オピオイドペプチドターゲティング部分がORL 1 レセプターに特異的に結合する、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 前記オピオイドペプチドターゲティング部分がORL 1 レセプターのアゴニストである、請求項6または7に記載の融合タンパク質。
- 前記オピオイドペプチドターゲティング部分が、配列番号38である、または前記オピオイドペプチドターゲティング部分が、配列番号40、42、44、46、48または50のいずれかである、請求項6から8のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記オピオイドペプチドターゲティング部分が、ノシセプチンである、請求項6から9のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が精製タグを含む、請求項1から10のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が精製タグを含み、該精製タグが該融合タンパク質のN末端および/またはC末端に存在する、請求項11に記載の融合タンパク質。
- 前記精製タグが、ペプチドスペーサー分子によって前記融合タンパク質に結合されている、請求項11または12に記載の融合タンパク質。
- 前記トランスロケーションドメインが、ペプチドスペーサー分子によって前記オピオイドペプチドターゲティング部分から離されている、請求項1から13のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 請求項1から14のいずれかに記載のポリペプチド融合タンパク質をコードする核酸。
- 請求項15に記載のDNA配列の相補DNA鎖。
- プロモーター、請求項15に記載の核酸、およびターミネーターを含むDNAベクターであって、該DNA配列が、該プロモーターの下流に位置し、そして該ターミネーターが、該DNA構築物の下流に位置している、ベクター。
- 請求項1から14のいずれかに記載の単鎖ポリペプチド融合タンパク質を調製するための方法であって、請求項15に記載の核酸、または請求項17に記載のDNAベクターを宿主細胞で発現させる工程を含む、方法。
- 非細胞傷害性薬剤を調製する方法であって、該方法が、
a.請求項1から14のいずれかに記載の単鎖ポリペプチド融合タンパク質と、前記プロテアーゼ切断部位を切断し得るプロテアーゼとを接触させる工程;
b.該プロテアーゼ切断部位を切断し、そしてそれにより二本鎖融合タンパク質を形成する工程
を含む、方法。 - 請求項19に記載の方法により得られ得る非細胞傷害性ポリペプチドであって、該ポリペプチドが二本鎖ポリペプチドであり、そして
a.第一鎖が前記非細胞傷害性プロテアーゼを含み、該プロテアーゼが侵害受容感覚求心性神経細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得、該非細胞傷害性プロテアーゼが、クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼまたはIgAプロテアーゼであり;
b.第二鎖が前記オピオイドペプチドターゲティング部分および前記トランスロケーションドメインを含み、該トランスロケーションドメインが、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性神経細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼをトランスロケートさせ得、該トランスロケーションドメインが、クロストリジウム神経毒素のH N ドメインであるか、またはジフテリア毒素、シュードモナス外毒素のドメインII、炭疽菌毒素、インフルエンザウイルスヘマグルチニンに由来する融合性および/または両親媒性のペプチド、セムリキ森林ウイルスの融合性ペプチド、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質G、SERウイルスFタンパク質、および泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質からなる群より選択されるトランスロケーションドメインであり;そして
該第一鎖および第二鎖が一緒にジスルフィド結合で連結されている、
非細胞傷害性ポリペプチド。 - 疼痛の治療、予防、または緩和用の医薬品の製造のための、請求項1から14のいずれかに記載の融合タンパク質または請求項20に記載のポリペプチドの使用。
- 前記疼痛が慢性疼痛である、請求項21に記載の使用。
- 疼痛を治療、予防、または緩和に用いるための、請求項1から14のいずれかに記載の融合タンパク質または請求項20に記載のポリペプチド。
- 前記疼痛が慢性疼痛である、請求項23に記載の使用のための融合タンパク質またはポリペプチド。
- 疼痛を治療、予防、または緩和するための組成物であって、該組成物が、請求項1から14のいずれかに記載の融合タンパク質または請求項20に記載のポリペプチドの治療有効量を含む、組成物。
- 前記疼痛が慢性疼痛である、請求項25に記載の組成物。
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