PT1877073E - Conjugados proteicos não citotóxicos - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "CONJUGADOS PROTEICOS NÃO CITOTÓXICOS"
Esta invenção refere-se a um conjugado proteico não citotóxico e à utilização do referido conjugado para tratar a dor.
As toxinas podem ser divididas, geralmente, em dois grupos de acordo com o tipo de efeito que têm numa célula alvo. Mais detalhadamente, o primeiro grupo de toxinas mata as suas células alvo naturais e, portanto, são conhecidas como moléculas de toxinas citotóxicas. Este grupo de toxinas é exemplificado, inter alia, por toxinas de plantas, tais como ricina e abrina, e por toxinas bacterianas, tais como a toxina da difteria e exotoxina A de Pseudomonas. As toxinas citotóxicas matam tipicamente as suas células alvo por inibição do processo celular de sintese proteica.
Pelo contrário, o segundo grupo de toxinas, que são conhecidas como toxinas não citotóxicas, não mata (como o próprio nome confirma)as suas células alvo naturais. As toxinas não citotóxicas têm atraido muito menos interesse comercial do que têm as suas correspondentes citotóxicas e exercem os seus efeitos numa célula alvo através de inibição de processos celulares que não sejam a sintese proteica. Como com as suas correspondentes citotóxicas, as toxinas não citotóxicas são produzidas a partir de uma variedade de fontes, tais como plantas e bactérias. As toxinas não citotóxicas bacterianas são agora descritas mais detalhadamente. 1
As neurotoxinas clostridiais são proteínas que, normalmente, têm uma massa molecular da ordem de 150 kDa. São produzidas por várias espécies de bactérias, especialmente do género Clostridium, sendo o mais importante C. tetani e diversas estirpes de C. botulinum, C. butiricum e C. argentinense. Existem, actualmente, oito classes diferentes da neurotoxina clostridial, nomeadamente: a toxina do tétano e a neurotoxina botulínica nos seus serotipos A, B, Ci, D, E, F e G, e todas elas partilham estruturas e modos de acção semelhantes.
As neurotoxinas clostridiais representam um grupo importante de moléculas de toxinas não citotóxicas e são sintetizadas pela bactéria hospedeira como polipéptidos simples que são modificados pós-tradução, por um evento de clivagem proteolítica para formar duas cadeias polipeptídicas unidas por uma ligação persulfureto. As duas cadeias são denominadas cadeia pesada (cadeia H) , que têm uma massa molecular de, aproximadamente, 100 kDa, e cadeia leve (cadeia L) , que tem uma massa molecular de, aproximadamente, 50 kDa.
As cadeias L possuem uma função de protease (actividade endopeptidase zinco-dependente) e apresentam uma alta especificidade de substrato para proteínas associadas a vesículas e/ou à membrana plasmática, envolvidas no processo exocítico. As cadeias L de diferentes espécies ou serotipos clostridiais podem hidrolisar ligações peptídicas diferentes, mas específicas em uma das três proteínas de substrato, nomeadamente, sinaptobrevina, sintaxina ou SNAP-25. Estes substratos são importantes componentes da maquinaria neurossecretora.
As toxinas não citotóxicas são também produzidas por outras bactérias, tal como do género Neisseria, sendo o mais importante 2 da espécie N. gonorrhoeae. Por exemplo, Neisseria sp. produz a toxina não citotóxica protease de IgA (ver documento W099/58571).
Tem sido bem documentado na técnica que as moléculas de toxina pode ser redirigidas para uma célula que não é a célula alvo natural da toxina. Quando assim redirigidas, a toxina modificada é capaz de se ligar a uma célula alvo desejada e, após translocação subsequente no citosol, é capaz de exercer os seus efeitos sobre a célula alvo. 0 referido redireccionamento é alcançado por substituição da Unidade de Direccionamento (TM) natural da toxina com uma TM diferente. Neste sentido, a MT é seleccionada de modo que se ligue a uma célula alvo desejada e permita a passagem subsequente da toxina modificada num endossoma dentro da célula alvo. A toxina modificada compreende, também, um dominio de translocação para permitir a entrada da protease não citotóxica no citosol da célula. 0 dominio de translocação pode ser o dominio de translocação natural da toxina ou pode ser um dominio de translocação diferente obtido de uma proteina microbiana com actividade de translocação.
Por exemplo, no contexto de moléculas de toxina não citotóxica, tem sido bem documentado que uma neurotoxina clostridial pode ser redirigida por incorporação de uma Unidade de Direccionamento (TM) que não é a TM natural de um neurotoxina clostridial. As metodologias recombinantes e de conjugação quimica descritas são consideradas agora como convencionais e é feita referência a Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, e a Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press.
Por exemplo, o documento W094/21300 descreve moléculas de neurotoxina clostridial modificadas que são capazes de regular a 3 densidade da Proteína Integral da Membrana (IMP) presente na superfície celular da célula alvo. As moléculas de neurotoxina modificada são, portanto, capazes de controlar a actividade celular (e. g., a captação de glucose) da célula alvo. Os documentos W096/33273 e WO99/17806 descrevem moléculas de neurotoxina clostridial modificada que se direccionam para aferentes sensoriais periféricos. As moléculas de neurotoxina modificada são, portanto, capazes de demonstrar um efeito analgésico. O documento WO00/10598 descreve a preparação de moléculas de neurotoxina clostridial modificada que se direccionam para células hipersecretoras de muco (ou para células neuronais que controlam as referidas células hipersecretoras de muco), cujas neurotoxinas modificadas são capazes de inibir a hipersecreção das referidas células. O documento WOOl/21213 descreve moléculas de neurotoxina clostridial modificada que se direccionam para uma vasta gama de diferentes tipos de células alvo não neuronais. As moléculas modificadas são, portanto, capazes de impedir a secreção das células alvo. Outras publicações no domínio técnico de moléculas tóxicas redirigidas incluem: documentos WOOO/62814; WO00/04926; US 5773586; W093/15766; WOOO/61192; e W099/58571.
Assim, a partir das publicações descritas acima, deve ser entendido que o conceito básico de redireccionamento de uma protease não citotóxica para uma célula alvo desejada, por selecção de uma TM que tem um receptor correspondente presente na célula alvo, tem sido bem documentado.
Contudo, diferentes receptores presentes numa célula alvo de interesse demonstram diferentes afinidades de ligação para diferentes TM. Isto pode ser um problema particular com células sensoras de dor que possuem uma vasta gama de tipos de receptores que têm diferentes afinidades de ligação para 4 diferentes TM. Assim, um conjugado redirigido compreendendo uma TM particular (que se liga a um receptor numa célula sensora de dor) pode demonstrar uma baixa afinidade de ligação para uma célula alvo sensora de dor, o que é indesejável.
Existe, assim, uma necessidade para desenvolver conjugados não citotóxicos modificados que abordam um ou mais dos problemas acima. É de particular interesse o desenvolvimento de um conjugado melhorado para utilização no tratamento da dor. A presente invenção pretende abordar um ou mais dos problemas acima através da utilização, como Unidade de Direccionamento (TM) do conjugado, de um "agonista" de um receptor que esteja presente na célula alvo sensora de dor de interesse. Em formas de realização preferidas, a célula alvo sensora de dor é um aferente sensorial nociceptivo, de um modo mais preferido, um aferente sensorial nociceptivo primário. Em formas de realização particularmente preferidas, a TM é um agonista do receptor receptor-1 de tipo opióide (ORLi) . 0 documento U.S. 5989545 descreve derivados de toxina clostridial capazes de modificar funções aferentes sensoriais periféricas.
Os documentos WO 2004/024909 e WO 98/07864 descrevem fragmentos de toxina recombinante.
Numa primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um conjugado não citotóxico como referido nas reivindicações. A utilização de um "agonista" que estimularia normalmente um processo biológico, particularmente a exocitose (por exemplo, um aumento na secreção celular ou uma regulação positiva na 5 expressão de proteína membranar), é um desenvolvimento emocionante no campo técnico de toxinas redirigidas. Além disso, é particularmente surpreendente que um agonista possa ser utilizado numa composição terapêutica para conseguir uma redução ou inibição de um processo biológico que o agonista estimularia normalmente.
Os conjugados contendo agonista da presente invenção representam um subconjunto distinto de conjugados de toxina. Mais detalhadamente, os conjugados da presente invenção compreendem TM que foram seleccionadas com base em propriedades específicas de agonista, em vez de com base simples de terem um receptor correspondente numa célula alvo sensora de dor de interesse.
Convencionalmente, um agonista tem sido considerado qualquer molécula que pode aumentar ou diminuir actividades dentro de uma célula, nomeadamente qualquer molécula que provoca simplesmente uma alteração da actividade celular. Por exemplo, o significado convencional de um agonista incluiria: uma substância química capaz de se combinar com um receptor numa célula e iniciar uma reacção ou actividade, ou um fármaco que induz uma resposta activa por activação de receptores, quer a resposta seja um aumento ou uma diminuição na actividade celular.
Contudo, para os objectivos desta invenção, um agonista é mais especificamente definido como uma molécula que é capaz de estimular o processo de fusão exocítica numa célula alvo sensora de dor, cujo processo é susceptível à inibição por uma protease (ou um seu fragmento) capaz de clivar uma proteína da maquinaria de fusão exocítica na referida célula alvo. 6
Desta forma, a definição particular de agonista da presente invenção excluiria muitas moléculas que seriam consideradas convencionalmente como agonistas. Por exemplo, o factor de crescimento nervoso (NGF) é um agonista no que se refere à sua capacidade para promover a diferenciação neuronal através de ligação a um receptor TrkA. Contudo, o NGF não é um agonista quando avaliado pelos critérios acima porque não é um importante indutor da fusão exocitica. Além disso, o processo que o NGF estimula (i. e., diferenciação celular) não é susceptivel à inibição pela actividade de protease de uma molécula de toxina não citotóxica.
Em utilização, um conjugado contendo agonista da presente invenção não desactiva um receptor de agonista numa célula alvo sensora de dor, mas a actividade protease do conjugado serve, mais exactamente, para negar a resposta mediada por agonista.
Além disso, uma vez distribuído ao citosol da célula alvo sensora de dor, o componente de protease de um conjugado da presente invenção inibe ou bloqueia a acção de todos os agonistas subsequentes capazes de provocar o mesmo efeito (i. e., fusão exocitica aumentada) na mesma célula alvo. Isto é vantajoso e significa que os conjugados da presente invenção têm aplicação em situações em que múltiplos agonistas podem ser responsáveis por provocarem a sensação de dor. Assim, ao conceber um conjugado da presente invenção, a TM que é seleccionada para distribuição não necessita necessariamente ser o principal agonista envolvido em provocar a sensação de dor. A distribuição mediada por agonista, de acordo com a presente invenção, proporciona a seguinte vantagem significativa relativamente a agentes terapêuticos contendo protease não citotóxicos anteriores: a utilização de um agonista pode 7 proporcionar propriedades preferenciais de ligação e/ou internalização no conjugado. Isto, por sua vez, pode resultar numa distribuição mais eficiente do componente de protease a uma célula alvo sensora de dor.
Além disso, a utilização de um agonista como uma TM é auto-limitante no que se refere a efeitos secundários. Mais detalhadamente, a ligação de um agonista a uma célula alvo sensora de dor aumenta a fusão exocitica, o que pode exacerbar a sensação da dor. Contudo, o processo exocitico que é estimulado pela ligação do agonista é subsequente reduzido ou inibido pelo componente de protease do conjugado.
Em formas de realização preferidas da invenção, a TM nociceptina é um agonista do receptor ORLi. 0 receptor ORLi está presente em células sensoras de dor no corpo. O receptor ORLi é um membro da classe de proteína G-acoplada de receptores e tem uma estrutura de sete domínios transmembranares. As propriedades do receptor ORLi são discutidas em detalhe em Mogil e Pasternak (2001), Pharmalogical Reviews, Vol. 53, N° 3, páginas 381-415.
Ao longo desta descrição, a referência ao "receptor ORLi" abrange todos os membros da família do receptor ORLi. Os membros da família do receptor ORLx têm, normalmente, uma estrutura de sete domínios transmembranares e são acoplados a proteínas G das famílias Gi e G0. Um método para determinar a actividade estimulante da proteína G dos ligantes do receptor ORLi é apresentado no Exemplo 17. Um método para medir a redução nos níveis celulares de cAMP após activação de ORLi é apresentado no Exemplo 16. Outra característica dos membros da família do receptor ORLi é que estes são normalmente capazes de se ligarem à nociceptina (o ligante natural de ORLi) . Como um exemplo, todas as variantes de splice alternativas do receptor ORLi, são membros da família do receptor ORLi.
Os conjugados da presente invenção demonstram, geralmente, uma afinidade de ligação reduzida (na região até 100 vezes) para células alvo aferentes sensoriais nociceptivas, quando comparada com a correspondente TM "livre". Contudo, apesar desta observação, os conjugados da presente invenção demonstram, surpreendentemente, boa eficácia. Isto pode ser atribuído a duas características principais. Primeiro, o componente de protease não citotóxico é catalítico - assim, o efeito terapêutico de algumas dessas moléculas é amplificado rapidamente. Segundo, os receptores presentes nos aferentes sensoriais nociceptivos necessitam apenas actuar como uma passagem para a entrada do agente terapêutico e não necessitam necessariamente ser estimulados a um nível requerido de modo a conseguir uma resposta farmacológica mediada por ligando-receptor. Desta forma, os conjugados da presente invenção podem ser administrados a uma dosagem que é muito menor do que a que seria utilizada para outros tipos de moléculas analgésicas, tais como NSAID, morfina e gabapentina. As últimas moléculas são administradas tipicamente em quantidades elevadas de microgramas até miligramas (mesmo até centenas de miligramas), enquanto os conjugados da presente invenção podem ser administrados em dosagens muito mais baixas, pelo menos, tipicamente 10 vezes menores e, mais tipicamente, 100 vezes menores.
Numa forma de realização particularmente preferida da invenção, a TM do conjugado é nociceptina - o ligando natural para o receptor ORLi. A nociceptina direcciona-se para o receptor ORLi com elevada afinidade. 9
Exemplos de outras TM preferidas incluem: Código Sequência Ref. SEQ ID N° Nociceptina 1-17 FGGFTGARKSARKLANQ [1] 1,2 Nociceptina 1-11 FGGFTGARKSA [1] 3,4 Nociceptina [Y10]1—11 FGGFTGARKYA [1] 5,6 Nociceptina [Yll]1—11 FGGFTGARKSY [1] 7,8 Nociceptina [Y14]1—17 FGGFTGARKSARKYANQ [1] 9,10 Nociceptina 1-13 FGGFTGARKSARK [2] 11,12 Nociceptina[R14K15]1-17 (também conhecida como "variante" nociceptina) FGGFTGARKSARKRKNQ [3,4] 13,14 Nociceptina 1-13-NH2 fggftgarksark-nh2 [5] - Nociceptina Phe (_p-N02) 1-17 (pN02) FGGFTGARKSARKLANQ [5] Lofentanil Agonistas não peptídicos [5] Etorfina Agonistas não peptídicos [5] Péptido agonista Péptidos agonistas de uma abordagem de biblioteca combinatória [6] [1] Mogil e Pasternak, 2001, Pharmacol. Rev., 53, 381-415 [2] Maile et al. 2003, Neurosci. Lett., 350, 190-192 [3] Rizzi et al. 2002, J. Pharmacol. Exp. Therap., 300, 57-63 [4] Okada et al. 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 278, 493-498 [5] Zaveri, 2003, Life Sei., 73, 663-678 [6] Dooley et al., 1997, J Pharmacol Exp Ther. 283(2), 735-41 10 A TM compreende, de um modo preferido, um máximo de 50 resíduos de aminoácidos, de um modo mais preferido, um máximo de 40 resíduos de aminoácidos, de um modo particularmente preferido, um máximo de 30 resíduos de aminoácidos e, de um modo muito preferido, um máximo de 20 resíduos de aminoácidos. Por exemplo, a nociceptina é um péptido de 17 resíduos de aminoácidos. A TM "variante" identificada acima demonstra particularmente boa afinidade de ligação (quando comparada com a nociceptina natural) para aferentes sensoriais nociceptivos. Em termos gerais, um conjugado contendo TM demonstrará uma redução aproximada de 100 vezes na capacidade de ligação vis-à-vis a TM per se. A TM "variante" mencionada acima demonstra per se um aumento aproximado de 3 a 10 vezes na capacidade de ligação para um aferente sensorial nociceptivo vis-à-vis a nociceptina natural. Assim, pode-se esperar que uma fusão contendo a TM "variante" demonstre uma redução aproximada de 10 vezes na capacidade de ligação para um aferente sensorial nociceptivo vis-à-vis a nociceptina "livre". Contudo, as presentes requerentes demonstraram que conjugados compreendendo a referida TM "variante" apresentam uma capacidade de ligação que (muito surpreendentemente) espelha intimamente aquela da nociceptina "livre" - ver Figura 17.
No contexto da presente invenção, o termo agonista do receptor ORLi (tal como nociceptina, ou qualquer um dos péptidos listados na tabela acima) abrange moléculas que têm, pelo menos, 70%, de um modo preferido, pelo menos, 80%, de um modo mais preferido, pelo menos, 90% e, de um modo muito preferido, pelo menos, 95% de homologia com o referido agonista. Os homólogos de agonista retêm as propriedades do agonista da nociceptina no 11 receptor ORLi que podem ser testadas utilizando os métodos proporcionados no Exemplo 10. A descrição descreve também fragmentos, variantes e derivados de qualquer uma das TM descritas acima. Estes fragmentos, variantes e derivados retêm substancialmente as propriedades que são atribuídas à referida TM.
As propriedades agonistas de uma TM podem ser confirmadas através dos métodos descritos no Exemplo 1. Estes métodos são baseados em experiências anteriores (ver Inoue et al., (1998)
Proc. Natl. Acad. Sei., 95, 10949-10953) que confirmam que o agonista natural do receptor ORLi, nociceptina, provoca a indução da libertação de substância P de neurónios aferentes primários nociceptivos. Isto é apoiado pelo facto de que: as respostas induzidas por nociceptina são suprimidas por antagonistas do receptor NK1 específicos (o receptor da substância P); e pré-tratamento das células com capsaicina (que esgota a substância P de neurónios aferentes primários de pequeno diâmetro) atenua as respostas induzidas por nociceptina.
De modo semelhante, Inoue et al. confirmam que uma injecção intraplantar da neurotoxina botulínica tipo A extingue as respostas induzidas por nociceptina. Uma vez que é sabido que BoNT inibe a libertação de substância P em neurónios aferentes primários (Welch et al., 2000, Toxicon, 38, 245- 258), isto confirma a ligação entre a interaeção nociceptina-ORLi e a subsequente libertação de substância P. 12
Assim, pode-se dizer que a TM tem actividade agonista no receptor ORLi se a TM provocar uma indução na libertação de substância P de um neurónio aferente sensorial nociceptivo (ver Exemplo 1). A descrição descreve opióides. Dentro desta família de péptidos estão incluídas encefalinas (met e leu), endomorfinas 1 e 2, β-endorfina e dinorfina. Os péptidos opióides são frequentemente utilizados na prática clínica para modificar a actividade de nocirreceptores e outras células envolvidas na resposta de dor. Como exemplificado pela Escada Analgésica da Organização Mundial de Saúde de três passos, os opióides têm pontos de entrada no tratamento farmacológico de cancro crónico e da dor não cancerosa em todas as três fases, sublinhando a sua importância no tratamento da dor. A referência a opióides abrange fragmentos, variantes e seus derivados que retêm a capacidade de ligação a aferentes sensoriais nociceptivos. A protease da presente invenção abrange todas as proteases não citotóxicas naturais que são capazes de clivar uma ou mais proteínas da maquinaria de fusão exocítica em célula eucarióticas. A protease da presente invenção é, de um modo preferido, uma protease bacteriana.
De um modo mais preferido, a protease bacteriana é seleccionada do género Clostridium ou Neisseria (e. g., uma cadeia L clostridial ou uma protease IgA neisserial, de um modo mais preferido, de N. gonorrhoeae) . A presente invenção também engloba proteases não citotóxicas modificadas, que incluem sequências de aminoácidos que não ocorrem na natureza e/ou resíduos de aminoácidos sintéticos, 13 desde que as proteases modificadas ainda demonstrem a actividade de protease mencionada acima. A protease da presente invenção demonstra, de um modo preferido, uma actividade de serina ou metaloprotease (e. g., actividade de endopeptidase) . A protease é, de um modo preferido, especifica para uma proteína SNARE (e. g., SNAP-25, sinaptobrevina/VAMP ou sintaxina).
Uma menção partcular é feita para os domínios de protease de neurotoxinas, por exemplo, os domínios de protease de neurotoxinas bacterianas. Assim, a presente invenção abrange a utilização de domínios de neurotoxina que ocorrem na natureza, assim como versões preparadas de forma recombinante das referidas neurotoxinas naturais.
Neurotoxinas exemplificativas são produzidas por clostrídios e a expressão neurotoxina clostridial abrange neurotoxinas produzidas pelos sorotipos A-G de C. tetani (TeNT) e C. botulinum (BoNT), bem como as neurotoxinas de tipo BoNT intimamente relacionadas produzidas por C. baratii e C. butyricum. As abreviaturas mencionadas acima são utilizadas ao longo da presente descrição. Por exemplo, a nomenclatura BoNT/A denota a fonte da neurotoxina como BoNT (sorotipo A) . A nomenclatura correspondente aplica-se aos outros sorotipos BoNT. A expressão fragmento de cadeia L significa um componente da cadeia L de uma neurotoxina, cujo fragmento demonstra uma actividade de metaloprotease e é capaz de clivar proteoliticamente uma proteína associada a vesícula e/ou a membrana plasmática envolvida na exocitose celular. 14
Um Domínio de Translocação é uma molécula que permite a translocação de uma protease (ou um seu fragmento) numa célula alvo sensora de dor, de modo que uma expressão funcional da actividade de protease ocorra no citoplasma da célula alvo. Pode ser confirmada por qualquer um de uma série de ensaios convencionais se qualquer molécula (e. g., uma proteína ou péptido) possui a função de translocação requerida da presente invenção.
Por exemplo, Shone C. (1987) descreve um ensaio in vitro utilizando lipossomas, que são desafiados por uma molécula de teste. A presença da função de translocação requerida é confirmada pela libertação a partir dos lipossomas de K+ e/ou NAD marcado, que podem ser facilmente monitorizados (ver Shone C. (1987) Eur. J. Biochem, vol. 167 (1): p 175-180).
Um outro exemplo é fornecido por Blaustein R. (1987), que descreve um simples ensaio in vitro utilizando membranas em bicamada fosfolipídica planar. As membranas são desafiadas com uma molécula de teste e a função de translocação requerida é confirmada por um aumento na conductância através das referidas membranas (ver Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, N° 1: p. 115-120) .
Uma metodologia adicional para permitir a avaliação da fusão membranar e, portanto, a identificação de Domínios de
Translocação adequados para utilização na presente invenção é proporcionada por Methods in Enzymology, Vol. 220 e 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993. O Domínio de Translocação é, de um modo preferido, capaz de formar poros permeáveis a iões em membranas lipídicas sob condições de baixo pH. De um modo preferido, utilizam-se apenas 15 as partes da molécula de proteína capaz de formação de poros na membrana endossomal. O Domínio de Translocação pode ser obtido de uma fonte de proteína microbiana, em particular, de uma fonte de proteína virai ou bacteriana. Assim, numa forma de realização, o Domínio de Translocação é um domínio de translocação de uma enzima, tal como uma toxina bacteriana ou proteína virai.
Está bem documentado que certos domínios de moléculas de toxina bacterianas são capazes de formar esses poros. Sabe-se também que alguns dos domínios de translocação de proteínas de fusão membranar expressas em vírus são capazes de formar esses poros. Tais domínios podem ser utilizados na presente invenção. 0 Domínio de Translocação pode ser de origem clostridial, nomeadamente o domínio HN (ou um seu componente funcional). HN significa uma parte ou fragmento da cadeia H de uma neurotoxina clostridial aproximadamente equivalente à metade amino-terminal da cadeia H ou ao domínio correspondente a esse fragmento na cadeia H intacta. Exemplos de domínios de Translocação clostridial adequados incluem:
Neurotoxina botulínica tipo A- resíduos de aminoácidos (449-871) Neurotoxina botulínica tipo B- resíduos de aminoácidos (441-858) Neurotoxina botulínica tipo c- resíduos de aminoácidos (442-866) Neurotoxina botulínica tipo D- resíduos de aminoácidos (446-862) Neurotoxina botulínica tipo E- resíduos de aminoácidos (423-845) Neurotoxina botulínica tipo F- resíduos de aminoácidos (440-864) Neurotoxina botulínica tipo G- resíduos de aminoácidos (442-863) Neurotoxina do tétano - resíduos de aminoácidos (458-879) 16
Para mais detalhes sobre a base genética da produção de toxinas em Clostridium botulinum e C. tetani, faz-se referência a Henderson et ai. (1997), em The Clostridia: Molecular Blology and Pathogenesis, Academic Press. 0 termo HN abrange porções HN de neurotoxina natural, e porções HN modificadas que têm sequências de aminoácidos que não ocorrem na natureza e/ou resíduos de aminoácidos sintéticos, desde que as porções HN modificadas continuem a demonstrar a referida função de translocação.
Alternativamente, o Domínio de Translocação pode ser de origem não clostridial (ver tabela abaixo). Exemplos de origens de Domínios de Translocação não clostridiais incluem, mas não se limitam ao, domínio de translocação da toxina da difteria [0'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; e London E., Biochem. Biophys. Acta. (1992), 1112, p.25-51], o domínio de translocação de exotoxina tipo A de
Pseudomonas [Prior et al., Biochemistry (1992) 31, 3555-3559], os domínios de translocação da toxina do antraz [Blanke et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1996) 93, 8437-8442], uma variedade de péptidos fusogénicos ou hidrofóbicos de função de translocação [Plank et al. , J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918- 12924; e Wagner et al. (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938], e péptidos anfifílicos [Murata et al., (1992) Biochem., 31, p.1986-1992]. O Domínio de Translocação pode espelhar o domínio de translocação presente numa proteína natural ou pode incluir variações de aminoácidos, desde que as variações não destruam a capacidade de translocação do Domínio de Translocação.
Exemplos particulares de domínios de translocação virais adequados para utilização na presente invenção incluem certos 17 domínios da translocação de proteínas de fusão membranar expressas em vírus. Por exemplo, Wagner et al. , (1992) e Murata et al., (1992) descrevem a função de translocação (í. e., fusão membranar e vesiculação) de uma série de péptidos fusogénicos e anfifílicos derivados da região N-terminal da hemaglutinina do vírus da gripe. Outras proteínas de fusão membranar expressas em vírus conhecidas por terem a actividade de translocação desejada são um domínio de translocação de um péptido fusogénico do Vírus da Floresta de Semliki (SFV), um domínio de translocação da glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV), um domínio de translocação da proteína F do vírus SER e um domínio de translocação da glicoproteína do envelope do vírus Foamy. As "proteínas spike" codificadas por vírus têm aplicação específica no contexto da presente invenção, por exemplo, a proteína EI do SFV e a proteína G do VSV. A utilização de Domínios de Translocação (listados abaixo) inclui a utilização das suas sequências variantes. Uma variante pode incluir uma ou mais substituições conservadoras de ácido nucleico e/ou deleções ou inserções de ácidos nucleicos, na condição da variante possuir a função de translocação requerida. Uma variante também pode incluir uma ou mais substituições de aminoácidos e/ou deleções ou inserções de aminoácidos, desde que a variante possua a função de translocação requerida.
Origem do Domínio de Resíduos de Referências Translocação aminoácidos 18 (continuação)
Origem do Domínio de Translocação Resíduos de aminoácidos Referências Toxina da difteria 194-380 Silverman et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22524- 22532 London E., 1992, Biochem. Biophys. Acta., 1113, 25-51 Domínio II da exotoxina de pseudomonas 405-613 Prior et al., 1992, Biochemistry 31, 3555- 3559 Kihara e Pastan, 1994, Bioconj. Chem. 5, 532-538 Hemaglutinina do vírus da gripe GLFGAIAGFIENGWE GMIDGWYG e suas Variantes Plank et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918- 12924 Wagner et al., 1992, PNAS, 89, 7934-7938 Murata et al., 1992, Biochemistry 31, 1986-1992 Proteína fusogénica do Vírus da Floresta de Semliki Domínio de translocação Kielian et al., 1996, J Cell Biol. 134(4), 863-872 Glicoproteína G do vírus da Estomatite Vesicular 118-139 Yao et al., 2003, Virology 310(2), 319-332 Proteína F do vírus SER Domínio de translocação Seth et al., 2003, J Virol. 77(11) 6520-6527 19 (continuação)
Origem do Dominio de Translocação Resíduos de aminoácidos Referências Glicoproteina do envelope do Virus Foamy Domínio de translocação Picard-Maureau et al., 2003 J Virol. 77(8), 4722-4730
Uma vez identificado um potencial agonista do receptor (e. g., um agonista de ORLi) um ou mais dos seguintes passos opcionais podem ser realizados: (A) confirmar que a molécula agonista putativa ou o agonista são capazes de serem combinados com uma protease não citotóxica (ou um seu fragmento) e opcionalmente um Dominio de Translocação para formar um conjugado da presente invenção; e/ou (B) confirmar que a referida molécula agonista putativa ou o agonista se ligam ao receptor na célula alvo sensora de dor, cujo receptor é susceptivel a endocitose mediada por receptor; e/ou (C) confirmar que a referida molécula agonista putativa ou o agonista são capazes de distribuir uma protease não citotóxica (ou um seu fragmento) para o citosol de uma célula alvo sensora de dor.
Os passos (A)-(C) acima podem ser confirmados por testes de rotina que estão prontamente disponíveis a um especialista. 20
Por exemplo, o passo (A) pode ser realizado através de uma experiência de conjugação química simples utilizando reagentes de conjugação e/ou moléculas ligantes convencionais, seguida por electroforese em gel de poliacrilamida nativa para confirmar que se formou um conjugado da presente invenção que tem o peso molecular antecipado. Os componentes de conjugado são tipicamente ligados conjuntamente (opcionalmente através de moléculas ligantes) por ligações covalentes.
Por exemplo, o passo (B) pode ser realizado por qualquer uma de uma gama de metodologias para avaliação da ligação de um ligando. Estão disponíveis documentos de referência, por exemplo, "Receptor-Ligand Interactions. A Praticai Approach. Ed. E. C. Hulme, IRL Press, 1992" que descrevem tais abordagens em detalhe. Resumidamente, o agonista ou a molécula agonista putativa são marcados (por exemplo, com 125-iodo) e aplicados a uma preparação celular in vitro, na presença de um excesso de agonista não marcado. O objectivo do material não marcado é para saturar quaisquer locais de ligação não específica. 0 agonista é incubado com a preparação celular durante tempo suficiente para atingir o equilíbrio e a quantidade de marcador ligado às células é avaliada por medição da radioactividade associada às células, por exemplo, através de contagem de cintilações ou gama.
Um exemplo adicional envolve a marcação com ouro do agonista (ou agonista putativo), seguida pela utilização de microscopia electrónica para monitorizar o progresso de transporte celular do agonista marcado [ver a metodologia básica descrita por Rabinowitz S. (1992); J. Cell. Biol. 116(1): p. 95-112; e aquela descrita por vab Deurs (1986); J. Cell. Biol. 102: p. 37-47]. 21
Por exemplo, o passo (C) pode ser realizado por colocação em contacto do conjugado preparado no passo (A) com uma célula alvo adequada e avaliação da clivagem do substrato. Isto é realizado por extracção das proteínas SNARE, seguida por transferência de Western das amostras separadas por SDS-PAGE. A clivagem do substrato é indicadora da distribuição da protease na célula alvo. Quanto a isto, a clivagem pode ser monitorizada através do desaparecimento do substrato e/ou do surgimento do produto de clivagem. Um anticorpo particularmente útil que se liga selectivamente ao produto de substrato clivado é descrito no documento WO95/33850. A preparação de um conjugado de acordo com a presente invenção é agora discutida. É conhecido, na técnica, que a porção Hc de uma molécula de neurotoxina pode ser removida da outra porção da cadeia H, conhecida como HN, de modo que o fragmento HN permaneça ligado por persulfureto à cadeia L da neurotoxina proporcionando um fragmento conhecido como LHN. Assim, numa forma de realização da presente invenção o fragmento LHN de um neurotoxina está ligado covalentemente, utilizando ligações que podem incluir uma ou mais regiões espaçadoras, a uma TM.
Noutra forma de realização da invenção, a cadeia H de uma neurotoxina em que o domínio Hc é mutado, bloqueado ou modificado, e. g., por modificação química, para reduzir ou, de um modo preferido, incapacitar a sua capacidade de ligar a neurotoxina aos receptores na junção neuromuscular. Esta neurotoxina modificada é depois ligada covalentemente, utilizando ligações que podem incluir uma ou mais regiões espaçadoras, a uma TM. 22
Noutra forma de realização da invenção, a cadeia H de uma neurotoxina, em que o domínio Hc é mutado, bloqueado ou modificado, e. g., por modificação química, para reduzir ou, de um modo preferido, incapacitar a sua capacidade de ligação nativa, é combinada com a cadeia L de uma neurotoxina diferente ou outra protease capaz de clivar uma proteína da maquinaria de fusão exocítica (e. g., protease de IgA de N. gonorrhoeae) . Esta neurotoxina modificada híbrida é depois ligada covalentemente, utilizando ligações que podem incluir uma ou mais regiões espaçadoras, a uma TM.
Noutra forma de realização da invenção, o domínio HN de uma neurotoxina é combinado com a cadeia L de uma neurotoxina diferente ou outra protease capaz de clivar uma proteína de fusão da maquinaria de fusão exocítica (e. g., protease de IgA de N. gonorrhoeae) . Este híbrido é depois ligado covalentemente, utilizando ligações que podem incluir uma ou mais regiões espaçadoras, a uma TM.
Noutra forma de realização da invenção, a protease (por exemplo, o componente de cadeia L de uma neurotoxina) é ligada covalentemente, utilizando ligações que podem incluir uma ou mais regiões espaçadoras, a uma TM que pode também efectuar a internalização da protease para o citoplasma da(s) célula(s) alvo relevante(s).
Noutra forma de realização da invenção, a protease (por exemplo, o componente de cadeia L de uma neurotoxina) é ligada covalentemente, utilizando ligações que podem incluir uma ou mais regiões espaçadoras, a um domínio de translocação para efectuar o transporte do fragmento de protease para o citosol. 23
Em utilização, os dominios de um conjugado, de acordo com a presente invenção, estão associados uns aos outros. Numa forma de realização, dois ou mais dos dominios podem ser ligados conjuntamente, quer directamente (e. g., através de uma ligação covalente) ou através de uma molécula ligante.
Uma variedade de diferentes moléculas ligantes/espaçadoras podem ser utilizadas em quaisquer das proteínas de fusão da presente invenção. Exemplos de tais moléculas espaçadoras incluem aqueles ilustrados nas Figuras 31 e 32. É feita aqui menção particular a GS15, GS20, GS25 e Hx27 - ver Figuras 31 e 32 .
As presentes requerentes verificaram, inesperadamente, que conjugados protease-TM não citotóxicos (e. g., CPNv/A) podem demonstrar uma actividade de ligação melhorada para aferentes sensoriais nociceptivos quando o tamanho do espaçador é seleccionado de modo que (em utilização) a TM (de um modo preferido, o seu C-terminal) e o dominio de translocação (de um modo preferido, o seu N-terminal) estejam separados um do outro por 40-105 angstrõms, de um modo preferido, por 50-100 angstrõms e, de um modo mais preferido, por 50-90 angstrõms. Noutra forma de realização, os espaçadores preferidos têm uma sequência de aminoácidos de 11-29 resíduos de aminoácidos, de um modo preferido, 15-27 resíduos de aminoácidos e, de um modo mais preferido, 20-27 resíduos de aminoácidos. Os espaçadores adequados podem ser identificados rotineiramente e obtidos de acordo com Crasto, C.J. e Feng, J.A. (2000) Maio, 13(5), pp. 309-312 - ver também http://www.fccc./edu/research/ labs/feng/limker.html. 24
As técnicas de conjugação adequadas para utilização na presente invenção têm sido bem documentadas e são de rotina para um especialista na técnica. A metodologia envolvida no acoplamento de duas moléculas proteicas (A e B) conjuntamente é simples e é realizada por utilização de um agente de reticulação (também conhecido como um agente de acoplamento quimico). Por exemplo, as moléculas A e B são contactadas separadamente com um agente de reticulação, que modifica quimicamente um grupo de superfície especifico em cada das moléculas A e B, formando, assim, moléculas A' e B' derivatizadas. 0 grupo de superfície modificada na molécula A' é capaz de se ligar covalentemente com o grupo de superfície modificada na molécula B' . Assim, a reacção de acoplamento é terminada por mistura conjunta das duas moléculas proteicas A' e B' . A conjugação química é ilustrada com referência às seguintes formas de realização, em que P = componente de protease não citotóxico, T = componente de translocação e TM = unidade de direccionamento.
Numa forma de realização, é preparada uma cadeia simples P-T que é, depois, conjugada a uma TM. Noutra forma de realização, é preparada uma cadeia simples TM-T (ou T-TM) que é depois conjugada a um P. Numa forma de realização adicional, é preparada uma cadeia simples P-TM (ou TM-P) que é, depois, conjugada a um T. Outro conjugado particularmente preferido tem a estrutura P-TM-T (com um local de clivagem de protease opcional entre P e TM).
No caso em que os componentes T e P são preparados como um polipéptido de cadeia simples, um local de clivagem de protease 25 é tipicamente incluído entre os referidos componentes. A este respeito qualquer local de clivagem de protease pode ser utilizado.
Numa forma de realização alternativa, os três componentes podem ser simultanêa ou sequencialmente conjugados em conjunto. Assim, a conjugação pode ser um processo de um ou dois passos e pode incluir um ou mais agentes de acoplamento diferentes.
Os agentes químicos de acoplamento e os agentes de reticulação têm estado comercialmente disponíveis há muitos anos. 0 Exemplo 5 da presente invenção descreve, em detalhe, a utilização de um tal agente de acoplamento, nomeadamente SPDP, para acoplar quimicamente duas moléculas proteicas (nociceptina e LHn da neurotoxina botulínica). As duas moléculas são contactadas separadamente com SPDP e depois misturadas conjuntamente para permitir conjugação covalente. 0 conjugado descrito no Exemplo 6 confirma que um outro agente de acoplamento, PDPH/EDAC ou o reagente de Traut, podem ser utilizados como um agente de acoplamento alternativo a SPDP. SPDP e o reagente de Traut são agentes de acoplamento populares e bem documentados no campo técnico da química de conjugação proteica e são aqui apresentados apenas como dois exemplos de uma classe bem conhecida de compostos que podem ser utilizados para ligar covalentemente, em conjunto, o componente de Unidade de Direccionamento e o componente de neurotoxina clostridial do conjugado da presente invenção. Outros agentes adequados incluem SMPB, SMCC (4-(N-maleimidometil)ciclo-hexan-1-carboxilato de succinimidilo) e LC-SPDP. 26
Mais detalhadamente, os membros comercialmente disponíveis dos agentes de acoplamento bem conhecidos, podem ser utilizados para fins de conjugação para produzir um conjugado da invenção. Os detalhes de tais agentes são encontrados nas seguintes publicações:
Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press;
Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press;
Thorpe et al., (1987), Câncer Res, 1987, 47, 5924-31. Este artigo descreve a utilização de SMBT (S-4-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metilbenziltiossulfato de sódio) e SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa(2-piridilditio)-tolueno); e
Peeters et al. (1989), J Immunol Methods. 1989, 120, 133-43. Este artigo descreve a utilização de 4 reagentes de acoplamento, MHS (6-(N-maleimido)-n-hexanoato de succinimidilo), SMCC (4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidilo), MBS (m-maleimidobenzoato de succinimidilo) e SPDP.
Os conjugados, de acordo com a presente invenção, podem também ser preparados recombinantemente, como detalhado nos Exemplos 9 a 12.
Numa forma de realização, a preparação de um conjugado recombinante envolve a disposição de sequências codificantes de uma TM seleccionada, de um componente de protease não citotóxico 27 seleccionado e de um componente de translocação (em qualquer ordem) numa única construção genética. Estas sequências codificantes podem ser dispostas em-grelha de modo que a transcrição e tradução subsequentes sejam contínuas através de ambas as sequências codificantes e resulte numa proteína de fusão. Todas as construções teriam um codão ATG em 5' para codificar uma metionina N-terminal e um codão de terminação de tradução C-terminal.
Assim, o método de preparação recombinante resulta na produção de um polipéptido de cadeia simples. De modo a activar este polipéptido, um local de clivagem de protease está presente entre o componente de protease não citotóxico e o componente de translocação. A clivagem deste local gera um polipéptido de duas cadeias, em que a protease e os domínios de translocação estão ligados conjuntamente por meio de uma ligação covalente, de um modo preferido, uma ligação persulfureto. Quanto a isto, pode ser utilizado qualquer local de clivagem de protease.
No aspecto do polipéptido simples da presente invenção, a TM está, de um modo preferido, localizada N ou C-terminalmente relativamente à proteína de fusão. Por outras palavras, é preferido que a TM não esteja localizada entre os componentes P e T da proteína de fusão de polipéptido simples. Numa a forma de realização particularmente preferida, a TM está localizada N-terminalmente relativamente à proteína de fusão.
Numa forma de realização, um cadeia L de uma neurotoxina clostridial ou outra protease capaz de clivar uma proteína da maquinaria de fusão exocítica (e. g., uma protease de IgA) ou um seu fragmento/variante, pode ser expresso recombinantemente como uma proteína de fusão com uma TM, cuja TM pode também efectuar a internalização do componente de cadeia L para o citoplasma da(s) 28 célula (s) alvo relevante(s) responsável(eis) pela secreção. Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender ainda um domínio de translocação. A proteína de fusão expressa pode incluir uma ou mais regiões espaçadoras. A título de exemplo, a seguinte informação é requerida para produzir, recombinantemente, um agente da presente invenção: (I) dados de sequência de ADN relacionados com uma TM seleccionada; (II) dados de sequência de ADN relacionados com o componente de protease; (III) dados de sequência de ADN relacionados com o domínio de translocação; e (IV) um protocolo para permitir a construção e expressão da construção compreendendo (I), (II) e (III).
Toda a informação básica acima (I)-(IV) está prontamente disponível ou é prontamente determinável por métodos convencionais. Por exemplo, ambos os documentos, WO98/07864 e WO99/17806, exemplificam tecnologia recombinante adequada para a utilização no presente pedido.
Além disso, os métodos para a construção e expressão das construções da presente invenção podem utilizar informação das seguintes referências e outras:
Lorberboum-Galski, H., FitzGerald, D., Chaudhary, V., Adhya, S., Pastan, I. (1988), Cytotoxic activity of an interleukin 2-Pseudomonas exotoxin chimeric protein produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85(6):1922-6,- 29
Murphy, J.R. (1988), Diphtheria-related peptide hormone gene fusions: a molecular genetic approach to chimeric toxin development. Câncer Treat. Res.; 37:123-40;
Williams, D.P., Parker, K., Bacha, P., Bishai, W., Borowski, M., Genbauffe, F., Strom, T.B., Murphy, J.R. (1987), Diphtheria toxin receptor binding domain substitution with interleukin-2: genetic construction and properties of a diphtheria toxin-related interleukin-2 fusion protein. Protein Eng; 1 (6):493 — 8;
Arora, N., Williamson, L.C., Leppla, S.H., Halpern, J.L. (1994), Cytotoxic effects of a chimeric protein consisting of tetanus toxin light chain and anthrax toxin lethal factor in non-neuronal cells J. Biol. Chem., 269 (42) : 26165-71;
Brinkmann, U., Reiter, Y., Jung, S.H., Lee, B., Pastan, I. (1993), A recombinant immunotoxin containing a disulphide-stabilized Fv fragment. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90(16) :7538-42; e 0'Hare, M., Brown, A.N., Hussain, K., Gebhardt, A., Watson, G., Roberts, L.M., Vitetta, E.S., Thorpe, P.E., Lord, J.M. (1990) , Cytotoxicity of a recombinant ricin-A-chain fusion protein containing a proteolytically-cleavable spacer sequence. FEBS Lett, 29 Out; 273(1-2):200-4. A informação de sequência da neurotoxina clostridial adequada relacionada com as cadeias L e LHN pode ser obtida de, por exemplo, Kurazono, H. (1992) J. Biol. Chem., vol. 267, N° 21, pp.14721-14729; e Popoff, M.R., e Marvaud, J.-C. (1999) The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, 2a 30 edição (ed. Alouf, J.E., e Freer, J.H.), Academic Press, p. 174-201.
De modo semelhante, os dados de sequência de TM adequados estão extensamente disponíveis na técnica. Alternativamente, quaisquer dados de sequência necessários podem ser obtidos por técnicas bem conhecidas do especialista.
Por exemplo, o ADN que codifica o componente de TM pode ser clonado a partir de um orqanismo fonte por rastreio de uma biblioteca de ADNc para a região codificante correcta (por exemplo, através da utilização de oligonucleótidos específicos baseados na informação de sequência conhecida para sondar a biblioteca), isolamento do ADN de TM, sequenciação deste ADN para fins de confirmação e depois colocação do ADN isolado num vector de expressão apropriado para expressão no hospedeiro escolhido.
Como uma alternativa ao isolamento da sequência a partir de uma biblioteca, a informação de sequência disponível pode ser utilizada para preparar iniciadores específicos para utilização em PCR, pelo que a sequência codificante é depois amplificada directamente a partir do material fonte e, por utilização adequada de iniciadores, pode ser directamente clonada num vector de expressão.
Outro método alternativo para isolamento da sequência codificante é a utilização da informação de sequência existente e a síntese de uma cópia, incorporando possivelmente alterações, utilizando tecnologia de síntese de ADN. Por exemplo, os dados de sequência de ADN podem ser gerados a partir de informação existente de sequência de proteína e/ou ARN. A utilização de tecnologia de síntese de ADN para fazer isto (e a alternativa 31 descrita acima) permite que a utilização preferencial de codões da sequência codificante seja modificada para ser óptima para o hospedeiro de expressão escolhido. Isto pode originar niveis de expressão superiores da proteina de fusão. A optimização da utilização preferencial de codões para o hospedeiro de expressão pode ser aplicada às sequências de ADN que codificam a TM e componentes clostridiais da construção. A optimização da utilização preferencial de codões é possivel por aplicação da sequência proteica em software gratuito disponível de bases de dados de ADN/proteina, e. g., programas disponíveis de Genetics Computer Group, Inc.
Após preparação de um conjugado da invenção, é uma questão de rotina confirmar que os vários dominios retiveram a sua função especificada. A função de protease após conjugação pode ser testada por utilização, por exemplo, de qualquer um dos seguintes testes de rotina: SNAP-25 (ou sinaptobrevina ou sintaxina) pode ser desafiada com um conjugado a ser testado e, depois, analisada por técnicas de separação peptidica de SDS-PAGE. A detecção subsequente dos péptidos (e. g., por coloração de prata) que tem pesos moleculares correspondentes aos produtos clivados de SNAP-25 (ou outro componente da maquinaria neurossecretora) confirmaria a presença de uma cadeia L funcional.
Como uma alternativa adicional, o conjugado pode ser testado por ensaio para produtos de clivagem de SNAP-25 (ou sinaptobrevina ou sintaxina) através de ligação específica de anticorpo (ver documento WO95/33850). Mais detalhadamente, um 32 anticorpo especifico é utilizado para detectar a clivagem de SNAP-25. Uma vez que o anticorpo reconhece SNAP-25 clivado, mas não SNAP-25 não clivado, a identificação do produto clivado pelo anticorpo confirma a presença da função proteolitica da cadeia L. A titulo de exemplo, tal método é descrito nos Exemplos 2 e 3 do documento W096/33273. A função do componente de translocação após conjugação pode ser testada utilizando, por exemplo, qualquer um dos seguintes testes de rotina:
Os métodos adequados são, por exemplo, descritos por Shone et al. (1987) Eur. J. Biochem. 167, p.175-180/ e por Blaustein et al. (1987) FEBS 226 (1), p.115-120. O método de Shone et al., emprega lipossomas artificiais carregados com tampão fosfato de potássio (pH 7,2) e NAD radiomarcado. A libertação de K+ e NAD a partir dos lipossomas correlaciona-se com um resultado positivo para a actividade formadora de canal e assim actividade de translocação. Quanto a isto, a libertação de K+ a partir de lipossomas pode ser medida utilizando um eléctrodo e a libertação de NAD calculada por medição da radioactividade no sobrenadante (ver página 176, coluna 1, linha 33 - coluna 2, linha 17). O método de Blaustein et al., utiliza membranas fosfolipidicas em bicamada planar que são utilizadas para testar para a actividade formadora de canal. Mais detalhadamente, as soluções salinas de cada lado da membrana são tamponadas a um pH diferente - no lado cis, pH 4,7 ou 5,5 e no lado trans, pH 7,4. O "conjugado" a ser testado é adicionado ao lado cis da membrana e são realizadas medidas eléctricas sob condições de voltage clamp, de modo a monitorizar o fluxo de corrente através da 33 membrana (ver parágrafo 2.2, páginas 116-118). A presença de uma função de translocação activa é confirmada através uma taxa constante de canal ligado (i. e., um resultado positivo para a formação de canal) - ver parágrafo 3, página 118. A função de Unidade de Direccionamento (TM), após conjugação pode ser testada por ensaio para a função agonista inerente a TM. Os métodos adeguados incluem aqueles descritos no Exemplo 1. A capacidade do conjugado da invenção para inibir a libertação de substância P a partir de células aferentes nociceptivas é avaliada utilizando os métodos descritos no Exemplo 15.
No Exemplo 15, um conjugado nociceptina-LHN/A, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, é avaliado para a sua capacidade para inibir a libertação de substância P a partir de neurónios aferentes sensoriais nociceptivos primários. Como pode ser observado a partir da Tabela 1, a incubação do conjugado com culturas de neurónios aferentes nociceptivos resulta numa inibição significativa da libertação de substância P (quando comparada com incubação das células com apenas LHN/A). A experiência confirma assim que o conjugado inibe a libertação de substância P a partir destas células.
Na utilização da presente invenção, é seleccionada uma célula alvo sensora de dor em que é desejado reduzir ou inibir o processo de fusão exocitica, cujo processo exocitico contribui para os sintomas associados com a sensação de dor. Por exemplo, a célula alvo em questão pode demonstrar um fenótipo indesejável (e. g., uma secreção indesejável ou a expressão de uma concentração indesejável de receptor da membrana, transportador ou canal membranar), que contribui para os sintomas associados 34 com a dor. Alternativamente, pode ser seleccionada uma célula alvo em que o processo de fusão exocítica contribui para a sensação de dor.
Em formas de realização preferidas da invenção, a célula alvo é uma célula aferente sensorial nociceptiva, de um modo preferido, uma célula aferente nociceptiva primária (e. g., uma fibra A, tal como uma fibra Αδ ou uma fibra C) . Assim, os conjugados da presente invenção são capazes de inibir a libertação de neurotransmissor ou neuromodulador (e. g., glutamato, substância P, péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) e/ou neuropéptido Y) a partir de populações discretas de neurónios aferentes sensoriais nociceptivos. Em utilização, os conjugados reduzem ou previnem a transmissão de sinais aferentes sensoriais (e. g., neurotransmissores ou neuromoduladores) a partir de fibras de dor periféricas até centrais e têm, portanto, aplicação como moléculas terapêuticas para o tratamento da dor, em particular, dor crónica. É de rotina confirmar que uma TM se liga a um aferente sensorial nociceptivo. Por exemplo, pode ser utilizada uma simples experiência de deslocamento radioactivo em que tecido ou células representativas do aferente sensorial nociceptivo (por exemplo, DRG) são expostas a ligando marcado (e. g., tritiado) na presença de um excesso de ligando não marcado. Em tal experiência, as proporções relativas de ligação não específica e especifica podem ser avaliadas, permitindo, assim, a confirmação que o ligando se liga à célula alvo aferente sensorial nociceptiva. Opcionalmente, o ensaio pode incluir um ou mais antagonistas de ligação e o ensaio pode ainda compreender a observação de uma perda de ligação de ligando. Os exemplos deste tipo de experiência podem ser encontrados em Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp 303-311, em 35
Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Press.
De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado de acordo com o primeiro e/ou segundo aspecto da presente invenção. A composição farmacêutica pode ainda compreender um veiculo farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou excipiente adeguado, embora a forma exacta da composição possa ser adaptada à forma de realização de administração. A administração é, de um modo preferido, a um mamífero, de um modo mais preferido, a um humano.
Os componentes da composição podem, por exemplo, ser utilizados na forma de um aerossol ou solução nebulizável para inalação ou de uma solução estéril para administração parentérica, administração intra-articular ou administração intracraniana. A composição pode também ser administrada por injecção i.v., que inclui a utilização de sistemas de bomba. Pode também ser utilizada injecção espinal (e. g., epidural ou intratecal) ou bombas internas.
As gamas de dosagem para administração dos componentes da presente invenção são aquelas para produzir o efeito terapêutico desejado. Deve ser entendido que a gama de dosagem requerida depende da natureza precisa dos componentes, da via de administração, da natureza da formulação, da idade do doente, da natureza, extensão ou gravidade do estado do doente, contra-indicações, se existirem, e a avaliação do médico assistente. 36
As dosagens diárias adequadas (para cada componente) são na gama de 0,0001-1 mg, de um modo preferido, 0,0001-0,5 mg, de um modo mais preferido, 0,002-0,5 mg e, de um modo particularmente preferido, 0,004-0,5 mg. A unidade de dosagem pode variar de menos de 1 micrograma a 30 mg, mas tipicamente, será na gama de 0,01 a 1 mg por dose, que pode ser administrada diariamente ou, de um modo preferido, menos frequentemente, tal como semanalmente ou semestralmente.
Um regime de dosagem particularmente preferido é baseado em 2,5 ng de proteina de fusão (e. g., CPNv/A) como a dose lx. Quanto a isto, as dosagens preferidas são na gama lx-lOOx (i. e., 2,5-250 ng) . Esta gama de dosagem é significativamente mais baixa (i. e., pelo menos, 10 vezes, tipicamente 100 vezes inferior) do que seria utilizada com outros tipos de moléculas analgésicas, tais como NSAID, morfina e gabapentina. Além disso, a diferença mencionada acima é ampliada consideravelmente quando a mesma comparação é feita numa base molar - isto é porque as proteínas de fusão da presente invenção têm um PM consideravelmente maior do que os agentes terapêuticos de molécula "pequena" convencionais.
Grandes variações na dosagem requerida, contudo, são esperadas dependendo da natureza precisa dos componentes e das diferentes eficiências de várias vias de administração. Por exemplo, a administração oral seria esperada requerer dosagens mais elevadas do que a administração por injecção intravenosa.
As variações destes níveis de dosagem podem ser ajustadas utilizando rotinas empíricas convencionais para optimização, como é bem entendido na técnica. 37
As composições adequadas para injecção podem ser na forma de soluções, suspensões ou emulsões ou pós secos que são dissolvidos ou suspensos num veiculo adequado antes da utilização.
As formas de dosagem unitária fluidas são preparadas tipicamente utilizando um veiculo estéril apirógeno.
Os ingredientes activos, dependendo do veiculo e concentração utilizada, podem ser dissolvidos ou suspensos no veiculo.
Podem ser utilizadas soluções para todas as formas de administração parentérica e são utilizadas, particularmente, para injecção intravenosa. Na preparação de soluções, os componentes podem ser dissolvidos no veículo, se necessário a solução é tornada isotónica por adição de cloreto de sódio e esterilizada por filtração através de um filtro estéril, utilizando técnicas assépticas antes de encher em frasquinhos ou ampolas estéreis adequadas e selagem. Alternativamente, se a estabilidade da solução for adequada, a solução nos seus recipientes selados podem ser esterilizadas por autoclavagem.
Vantajosamente, podem ser dissolvidos no veículo aditivos, tais como agentes tamponantes, solubilizantes, estabilizantes, conservantes ou bactericidas, de suspensão ou emulsionantes e/ou anestésicos locais.
Os pós secos que são dissolvidos ou suspensos num veículo adequado, antes da utilização, podem ser preparados por enchimento da substância farmacológica pré-esterilizada e outros ingredientes num recipiente estéril, utilizando técnica asséptica numa área estéril. 38
Alternativamente, os componentes da composição podem ser dissolvidos num veiculo aquoso, a solução é esterilizada por filtração e distribuída em recipientes adequados, utilizando técnica asséptica numa área estéril. 0 produto é, depois, liofilizado e os recipientes são selados assepticamente.
As suspensões parentéricas, adequadas para injecção intramuscular, subcutânea ou intradérmica, são preparadas substancialmente do mesmo modo, excepto que os componentes estéreis são suspensos no veículo estéril, em vez de serem dissolvidos e a esterilização não pode ser realizada por filtração. Os componentes podem ser isolados num estado estéril ou, alternativamente, podem ser esterilizados após isolamento, e. g., irradiação por gama.
Vantajosamente, um agente de suspensão, por exemplo, polivinilpirrolidona é incluído na(s) composição (ões) para facilitar a distribuição uniforme dos componentes.
As composições adequadas para administração através do tracto respiratório incluem aerossóis, soluções nebulizáveis ou pós microfinos para insuflação. No último caso, é preferido um tamanho de partícula de menos de 50 mícrones, especialmente menos de 10 mícrones. Tais composições podem ser feitas de um modo convencional e utilizadas conjuntamente com dispositivos convencionais de administração.
As composições descritas nesta invenção podem ser utilizadas in vivo, directamente ou como um sal farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de estados que envolvem exocitose (por exemplo, secreção ou a distribuição de proteínas, tais como 39 receptor, transportadores e canais membranares para a membrana plasmática de uma célula).
De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona uma construção de ADN que codifica um conjugado de acordo com o primeiro ou segundo aspecto da invenção.
Através da expressão da construção numa célula hospedeira, podem ser preparados conjugados da invenção.
De acordo com um quarto aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de um conjugado, composição ou construção de acordo com o primeiro a quarto aspectos da invenção, para o fabrico de um medicamento para tratamento da dor, de um modo preferido, dor crónica.
Secção de Definições A fusão exocitica é um processo através do qual moléculas intracelulares são transportadas do citosol de uma célula alvo sensora de dor para a sua membrana plasmática (i. e., celular). Posteriormente, as moléculas intracelulares podem apresentar-se na superfície externa da membrana plasmática ou podem ser excretadas para o ambiente extracelular.
Num indivíduo saudável, a taxa de fusão exocitica é regulada cuidadosamente e permite o controlo do transporte de moléculas entre o citosol e a membrana plasmática de uma célula sensora de dor. Por exemplo, a regulação do ciclo exocítico permite o controlo da densidade de receptores, transportadores ou canais membranares presentes na superfície celular e/ou permite o 40 controlo da taxa de secreção de componentes intracelulares (e. g., neurotransmissores) a partir do citosol da célula.
Contudo, num indivíduo não saudável, a regulação da fusão exocítica pode ser modificada. Por exemplo, a fusão exocítica pode fazer com que as células sensoras de dor afectadas entrem num estado de hipersecreção. Alternativamente, a fusão exocítica pode resultar na apresentação de uma concentração aumentada de receptores, transportadores ou canais membranares presentes na superfície de células sensoras de dor, o que pode expor a célula a estímulos externos indesejáveis. Assim, o processo de fusão exocítica pode contribuir para a progressão e/ou gravidade da dor e, deste modo, proporciona um alvo para intervenção terapêutica.
Deve também ser entendido que, caso contrário, as taxas normais de fusão exocítica celular podem contribuir para a progressão e gravidade da dor em doentes comprometidos. Assim, através do direccionamento da fusão exocítica de acordo com a presente invenção, é também possível proporcionar terapia em tais doentes.
Unidade de Direccionamento (TM) significa qualquer estrutura química associada com um conjugado que interaja funcionalmente com um receptor, e. g., um receptor ORLi, para provocar uma associação física entre o conjugado e a superfície de uma célula alvo sensora de dor. A expressão TM abrange qualquer molécula (i. e., uma molécula natural ou uma sua variante quimicamente/fisicamente modificada) que é capaz de se ligar a um receptor na célula alvo, cujo receptor é capaz de internalização (e. g., formação de endossoma) - também referida como endocitose mediada por receptor. A TM pode possuir um domínio de translocação membranar endossomal, em cujo caso 41 componentes separados de TM e domínio de translocação não necessitam estar presentes num agente da presente invenção. 0 termo "fragmento" significa um péptido que tem, pelo menos, trinta e cinco, de um modo preferido, pelo menos, vinte e cinco, de um modo mais preferido, pelo menos, quinze e, de um modo muito preferido, pelo menos, dez resíduos de aminoácidos da TM em questão. Numa forma de realização, o primeiro resíduo de aminoácidos do fragmento é o resíduo de aminoácido N-terminal da TM a partir da qual o fragmento foi derivado.
Um exemplo de uma "variante" é um péptido ou fragmento peptídico de uma TM que contenha um ou mais análogos de um aminoácido (e. g. . , um aminoácido não natural) ou um ligação substituída.
Um "derivado" compreendem a TM em questão e uma sequência peptídica adicional. A sequência peptídica adicional não deve, de um modo preferido, interferir com o enrolamento básico e assim com a estrutura conformacional da TM. Dois ou mais péptidos (ou fragmentos ou variantes) podem ser ligados conjuntamente para formar um derivado. Alternativamente, um péptido (ou fragmento ou variante) pode ser ligado a uma molécula não relacionada (e. g., um segundo péptido não relacionado). Os derivados podem ser sintetizados quimicamente, mas serão preparados tipicamente por métodos de ácidos nucleicos recombinantes. Podem ser incluídos componentes adicionais, tais como lípidos e/ou polissacáridos e/ou componentes de policetídeos. A expressão não citotóxica significa que a molécula de protease em questão não mata a célula alvo sensora de dor à qual foi redirigida. 42 0 "local de clivagem de protease" da presente invenção permite a clivagem (de um modo preferido, clivagem controlada) do conjugado numa posição entre o componente de protease não citotóxico e o componente de TM. Numa forma de realização, o conjugado pode incluir mais de um local de clivagem proteolitica. Contudo, no caso em que existem dois ou mais desses locais, estes são diferentes, desta forma, prevenindo substancialmente a ocorrência de eventos múltiplos de clivagem na presença de uma única protease. Noutra forma de realização, é preferido que o conjugado tenha um único local de clivagem de protease. A(s) sequência (s) de clivagem de protease pode (m) ser introduzida(s) (e/ou qualquer sequência de clivagem inerente removida) ao nivel do ADN por meios convencionais, tal como mutagénese dirigida. 0 rastreio para confirmar a presença de sequências de clivagem pode ser realizado manualmente ou com auxilio de software computacional (e. g., o programa MapDraw da DNASTAR, Inc.).
Embora qualquer local de clivagem de protease possa ser utilizado, os seguintes são preferidos: (DDDDKq) (IEGRi/IDGRi) (ENLYFQjG) (LVPRj, GS) (LEVLFQiGP).
Enterocinase Factor Xa TEV (Virus Etch do Tabaco)
Trombina
PreScission
Está também abrangido pela expressão local de clivagem de protease uma inteina, que é uma sequência de auto-clivagem. A reacção de auto-splicing é controlável, por exemplo, através de variação da concentração do agente redutor presente. 43 A presente invenção é agora descrita com referência aos seguintes Exemplos e Figuras, sem pretenderem ser limitantes.
Figuras
Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura
1 Expressão e purificação da proteína de fusão recLHN/B
2 Expressão e purificação da proteína de fusão LHN/C
3 Expressão e purificação da proteína de fusão N [ 1-17 ] -LHn/A
4 Purificação de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-Hn/A
5 Purificação de uma proteína de fusão nociceptina-LC/A-Hn/A
6 Purificação de uma proteína de fusão LC/C-nociceptina-Hn/C
7 Purificação uma proteína de fusão LC/A-met encefalina-Hn/A
8 Comparação da eficácia de ligação de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A e uma proteína de fusão nociceptina-LC/A-HN/A
9 Actividade catalítica in vitro de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A
10 Purificação de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A
11 Comparação da eficácia de ligação de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A e uma proteína de fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A 12 Família de proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A expressa/purifiçada com produto(s) de comprimento de espaçador variável 44
Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura 24 25 26 27 28 29 30 31
Inibição da libertação de SP a clivagem de SNAP-25 por CPN-A
Inibição da libertação de SP e clivagem de SNAP-25 por longos periodos de tempo após exposição de DRG a CPN-A Clivagem de SNAP-25 por CPNv-A
Clivagem de SNAP-25 por longos periodos de tempo após exposição de DRG a CPNv-A
Deslocamento mediado pela fusão CPNv-A da ligação de [3H]-nociceptina
Produto CPNv(Ek)-A expresso/purifiçado Clivagem de SNAP-25 por CPNv(Ek)-A Produto CPNv-C expresso/purifiçado Clivagem de sintaxina por CPNv-C
Eficácia de CPN-A no Modelo Mecânico de Alodinia Aguda Induzida por Capsaicina
Eficácia de CPN-A no Modelo de Neuropatia Diabética Periférica (Dor Neuropática) Induzida por
Estreptozotocina (STZ)
Eficácia de CPNv-A no Modelo Mecânico de Alodinia Aguda Induzida por Capsaicina
Produto LC/A-CPLE-Hn/A expresso/purifiçado Produto LC/A-CPBE-Hn/A expresso/purifiçado Produto CPOP-A expresso/purifiçado Produto CPOPv-A expresso/purifiçado
Clivagem in vitro de SNAP-25 num modelo de célula DRG CPNv-A-FXa-HT expresso/purifiçado (marcador-His removível)
Eficácia in vitro de proteínas de fusão LC/A-nociceptina-HN/A com comprimento variável de espaçador, como avaliado por ensaio de competição de ligando 45
Figura 32 Eficácia in vitro de proteínas de fusão LC/A-nociceptina-HN/A com comprimento variável de espaçador, como avaliado por clivagem in vitro de SNAP-25
As Figuras são agora descritas mais detalhadamente.
Figura 1 - Expressão e purificação da proteína de fusão
recLHN/B
Análise de SDS-PAGE da expressão e purificação de recLHN/B de E. coli. Na Figura 1, recLHN/B é purificado a partir de pasta celular utilizando uma estratégia de três colunas como descrita no Exemplo 3. As amostras de proteína são separadas por SDS-PAGE e visualizadas por coloração com reagente de coomassie simplyblue safestain. A proteína de fusão MBP-LHN/B solúvel, em bruto, contida no extracto clarificado (pista 2) é aplicada em resina de permuta aniónica Q-Sepharose FF. A pista 3 representa a fusão MBP-LHn/B recombinante eluída da coluna em 150-200 mM de sal. Esta amostra é tratada com protease factor Xa para remover o Marcador de afinidade MBP (pista 4) e a mistura clivada é diluída para uma concentração mais baixa de sal antes de ser aplicada numa coluna de permuta aniónica Q-Sepharose FF. O material eluído entre 120-170 mM de sal era rico em LHN/B (pista 5) . A proteína nas pistas 6 e 8 representa LHN/B recolhido após tratamento com enterocinase e purificação final utilizando Benzamidina Sepharose, sob condições não redutoras e redutoras, respectivamente. As pistas 1 e 7 representam marcadores de massa molecular [Mark 12 (Invitrogen)].
Figura 2 - Expressão e purificação da proteína de fusão
LHn/C 46
Análise de SDS-PAGE da expressão e purificação de LHN/C de E. coli. Na Figura 2, recLHN/C é purificado a partir de pasta celular de E. coli utilizando uma estratégia de duas colunas como descrita no Exemplo 4. As amostras de proteína são separadas por SDS-PAGE e visualizadas por coloração com azul de coomassie. 0 lisado celular, em bruto, clarificado (pista 2) é aplicado em resina de permuta aniónica Q-Sepharose FF. A proteína de fusão MBP-LHN/C é eluída com 0,1 M de NaCl (pista 3). O material eluído é incubado a 22 °C durante 16 h com protease factor Xa (New England Biolabs) para clivar o Marcador de fusão MBP e criar uma ranhura em recLHN/C no local do ligante. A proteína de interesse é ainda purificada a partir de produtos de fusão clivados (pista 4) utilizando Q-Sepharose FF. As pistas 5 e 7 mostram recLHN/C purificado sob condições não redutoras e redutoras com 10 mM de DTT, respectivamente, para ilustrar a ligação de persulfureto na região do ligante entre os domínios LC e Hn após criar uma ranhura com factor Xa. As pistas 1 e 6 representam marcadores de massa molecular (mostrados em KDa); Mark 12 (Invitrogen).
Figura 3 - Expressão e purificação da proteína fusão
N[1-17]-LHn/A
Análise de SDS-PAGE da expressão e purificação de N[l-17]-LHn/C de E. coli. Na Figura 3, N [ 1-17 ]-LHN/A é purificado a partir de pasta de células BL21 de E. coli utilizando a metodologia delineada no Exemplo 9. Resumidamente, os produtos solúveis obtidos depois do rompimento das células foram aplicados numa coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As proteínas ligadas foram eluídas com 100 mM de imidazole, tratadas Factor Xa para activar a proteína de fusão e 47 remover o marcador de proteína de ligação de maltose (MBP), reaplicadas depois numa segunda coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As amostras do processo de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE (Painel A) e transferência de Western (Painel B) . Foram utilizados antissoros anti-nociceptina (obtidos em Abcam) como o anticorpo primário para a transferência de Western. 0 material final purificado na ausência e presença de agente redutor é identificado nas pistas marcadas [-] e [+], respectivamente.
Figura 4 - Purificação de uma proteína de fusão
LC/A-nociceptina-HN/A
Utilizando a metodologia descrita no Exemplo 26, uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A foi purificada a partir de células BL21 de E. coli. Resumidamente, os produtos solúveis obtidos após rompimento celular, foram aplicados a uma coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As proteínas ligadas foram eluídas com 100 mM de imidazole, tratadas com Factor Xa para activar a proteína de fusão e remover o marcador da proteína de ligação de maltose (MBP), depois reaplicadas a uma segunda coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As amostras do processo de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE (Painel A) e transferência de Western (Painel B) . Foram utilizados antissoros anti-nociceptina (obtidos de Abcam) como anticorpo primário para a transferência de Western. O material final purificado na ausência e presença de agente redutor é identificado nas pistas marcadas [-] e [+], respectivamente.
Figura 5 - Purificação de uma proteína de fusão nociceptina-LC/A-Hn/A 48
Utilizando a metodologia descrita no Exemplo 26, uma proteina de fusão LC/A-nociceptina-HN/A foi purificada a partir de células BL21 de E. coli. Resumidamente, os produtos solúveis obtidos após rompimento celular, foram aplicados a uma coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As proteínas ligadas foram eluídas com 100 mM de imidazole, tratadas com Factor Xa para activar a proteína de fusão e remover o marcador da proteína de ligação de maltose (MBP), depois reaplicadas a uma segunda coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As amostras do processo de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE (Painel A) e transferência de Western (Painel B) . Foram utilizados antissoros anti-nociceptina (obtidos de Abcam) como anticorpo primário para a transferência de Western. O material final purificado na ausência e presença de agente redutor é identificado nas pistas marcadas [-] e [+], respectivamente.
Figura 6 - Purificação de uma proteina de fusão LC/C-
nociceptina-HN/C
Utilizando a metodologia descrita no Exemplo 26, uma proteína de fusão LC/C-nociceptina-HN/C foi purificada a partir de células BL21 de E. coli. Resumidamente, os produtos solúveis obtidos após rompimento celular, foram aplicados a uma coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As proteínas ligadas foram eluídas com 100 mM de imidazole, tratadas com Factor Xa para activar a proteína de fusão e remover o marcador da proteína de ligação de maltose (MBP), depois reaplicadas a uma segunda coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As amostras do processo de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE (Painel A) e transferência de Western (Painel B) . Foram utilizados antissoros anti-nociceptina (obtidos de Abcam) como 49 anticorpo primário para a transferência de Western. 0 material final purificado na ausência e presença de agente redutor é identificado nas pistas marcadas [-] e [+], respectivamente.
Figura 7 - Purificação de uma proteína de fusão
LC/A-met encefalina-HN/A
Utilizando a metodologia descrita no Exemplo 26, uma proteína de fusão LC/A-met encefalina-HN/A foi purificada a partir de células BL21 de E. coli. Resumidamente, os produtos solúveis obtidos após rompimento celular, foram aplicados a uma coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As proteínas ligadas foram eluídas com 100 mM de imidazole, tratadas com Factor Xa para activar a proteína de fusão e remover o marcador da proteína de ligação de maltose (MBP) , depois reaplicadas a uma segunda coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As amostras do processo de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE. O material final purificado na ausência e presença de agente redutor é identificado nas pistas marcadas [-] e [+], respectivamente. 50
Figura 8 - Comparação da eficácia de ligação de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A e uma proteína de fusão nociceptina-LC/A-HN/A A capacidade das fusões de nociceptina para se ligarem ao receptor ORLi foi avaliada por meio de um ensaio simples baseado em competição. As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de material de teste na presença de 1 nM de [ 3H]-nociceptina. A redução da ligação especifica do ligante radiomarcado foi avaliada por contagem de cintilações e representada graficamente em comparação com a eficácia do ligante não marcado (Tocris nociceptina) . É claro que a fusão LC/A-nociceptina-HN/A é muito superior à fusão nociceptina-LC/A-HN/A na interacção com o receptor ORLi.
Figura 9 - Actividade catalítica in vitro de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A A actividade de endopeptidase in vitro da proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A purificada foi determinada, essencialmente como descrito em Chaddock et al., 2002, Prot. Express Purif. 25, 219-228. Resumidamente, o péptido SNAP-25 imobilizado numa placa de ELISA foi exposto a diferentes concentrações de proteína de fusão, durante uma hora, a 37 °C. Após uma série de lavagens, a quantidade de péptido SNAP-25 clivado foi quantificada pela reacção com antissoros específicos. 51
Figura 10 - Purificação da proteína de fusão
LC/A-nociceptina variante-HN/A
Utilizando a metodologia descrita no Exemplo 26, uma proteina de fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A foi purificada a partir de células BL21 de E. coli. Resumidamente, os produtos solúveis obtidos após rompimento celular foram aplicados a uma coluna de captura de afinidade carregada com niquel. As proteínas ligadas foram eluidas com 100 mM de imidazole, tratadas com Factor Xa para activar a proteína de fusão e remover o marcador da proteina de ligação de maltose (MBP), depois reaplicadas numa segunda coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As amostras do processo de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE. O material final purificado na ausência e presença de agente redutor é identificado nas pistas marcadas [-] e [+], respectivamente.
Figura 11 - Comparação da eficácia de ligação de uma
proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A e uma proteína de fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A A capacidade das fusões de nociceptina para se ligarem ao receptor ORLi foi avaliada por meio de um ensaio simples baseado em competição. As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de material de teste na presença de 1 nM de [ 3H]-nociceptina. A redução da ligação específica do ligante radiomarcado foi avaliada por contagem de cintilações e representada graficamente em comparação com a eficácia do ligante não-marcado (nociceptina Tocris). É claro que a fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A (CPNv-LHA) é superior à fusão LC/A-nociceptina-HN/A (CPN-LHA) na interacção com o receptor ORLi. 52
Figura 12 - Família de proteína de fusão LC/A-nociceptina-Hn/A expressa/purifiçada com produto(s) de comprimento de espaçador variável
Utilizando a metodologia descrita no Exemplo 26, variantes da fusão LC/A-CPN-Hn/A consistindo em GS10, GS30 e HX27 são purificadas a partir de pasta celular de E. coli. As amostras da purificação de LC/A-CPN(GS10-HN/A, LC/A-CPN(GS15)-HN/A, LC/A-CPN(GS25)-Hn/A, LC/A-CPN(GS30)-Hn/A e LC/A-CPN(HX27)-HN/A foram avaliadas por SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. 0 perfil electroforético indica a purificação de uma espécie de dupla cadeia ligada por persulfureto da massa molecular esperada de CPBE-A. Painel superior: M = marcadores de massa molecular benchmark; S = fracção proteica solúvel total de E. coli; FT = proteínas que não se ligaram à coluna de Sepharose carregada com Ni2+; FUSÃO = proteína de fusão eluída pela adição de imidazole. Painel inferior: Pista 1 = marcadores de massa molecular benchmark; Pista 2 = fracção proteica solúvel total de E. coli; Pista 3 = material purificado, após a captura inicial de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material tratado com Factor Xa, antes da captura final de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 5 = material purificado final após activação com
Factor Xa (5pL); Pista 6 = material purificado final após activação com Factor Xa (10 pL) ; Pista 7 = material purificado final após activação com Factor Xa (20 pL) ; Pista 8 = material purificado final após activação com Factor Xa + DTT (5 pL) ; Pista 9 = material purificado final após activação com o Factor Xa + DTT (10 pL) ; Pista 10 = material purificado final após activação com Factor Xa + DTT (20 pL). 53
Figura 13 - Inibição da libertação de SP e clivagem de SNAP-25 por CPN-A
Resumidamente, culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPN-A durante 24 horas. As proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP-25 para facilitar a avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada por análise densitométrica e representada graficamente em função da concentração de fusão (linha tracejada). 0 material também foi recuperado para uma análise do teor de substância P utilizando um kit de EIA específico. A inibição da libertação de substância P é ilustrada pela linha a traço cheio. A concentração de fusão necessária para atingir 50% do máximo de clivagem de SNAP-25 é estimada em 6,30+2,48 nM.
Figura 14 - Inibição da liberação de SP e clivagem de SNAP-25 por longos períodos de tempo após exposição de DRG a CPN-A
As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPN-A durante 24 horas. Foi utilizada neurotoxina botulínica (BoNT/A) como controlo. Após esta exposição inicial, o material extracelular foi removido por lavagem e as células incubadas a 37 °C durante períodos variáveis de tempo. Em momentos específicos, as proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP-25 para facilitar a avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada por análise densitométrica e ilustrada por linhas tracejadas. O material também foi 54 recuperado para uma análise do teor de substância P utilizando um kit de EIA especifico. A inibição da libertação de substância P é ilustrada pelas linhas a traço cheio.
Figura 15 - Clivagem de SNAP-25 por CPNv-A
As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPNv-A durante 24 horas. As proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP-25 para facilitar a avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada por análise densitométrica. A concentração de fusão necessária para atingir 50% do máximo de clivagem de SNAP-25 é estimada ser 1,3810,36 nM.
Figura 16 - Clivagem de SNAP-25 por longos períodos de tempo após exposição de DRG a CPNv-A
As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPNv-A durante 24 horas. A CPN-A foi utilizada como controlo. Após esta exposição inicial, o material extracelular foi removido por lavagem e as células incubadas a 37 °C durante períodos variáveis de tempo. Em momentos específicos, as proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP-25 para facilitar a avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada por análise densitométrica.
Figura 17 - Deslocamento mediado pela fusão CPNv-A da ligação de [3H]-nociceptina 55 A capacidade das fusões de nociceptina para se ligarem ao receptor ORLi foi avaliada por meio de um ensaio simples baseado em competição. As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de material de teste na presença de 1 nM de [3H]-nociceptina. A redução da ligação especifica do ligante radiomarcado foi avaliada por contagem de cintilações e representada graficamente em comparação com a eficácia do ligante não-marcado (nociceptina Tocris). É claro que a fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A (marcada como CPNv-LHnA) é superior à fusão LC/A-nociceptina-HN/A (marcada como CPN-LHnA) na interacção com o receptor ORLi.
Figura 18 - Produto CPNv(Ek)-A expresso/purificado
As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. 0 perfil electroforético indica a purificação de uma espécie de dupla cadeia ligada por persulfureto da massa molecular esperada de CPNv(Ek)-A. Pista 1 = marcadores de massa moleculares benchmark;
Pista 2 = fracção proteica total solúvel de E. coli;
Pista 3 = material purificado, após a captura inicial de
Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material purificado final após activação com enterocinase (5 pL) ; Pista 5 = material purificado final após activação com enterocinase (10 pL) ; Pista 6 = material purificado final após activação com enterocinase (20 pL) ; Pista 7 = material purificado final após activação com enterocinase + DTT (5 pL) ; Pista 8 = material purificado final após activação com enterocinase + DTT (10 pL); Pista 9 = material purificado final após activação com enterocinase + DTT (20 pL). 56
Figura 19 - Clivagem de SNAP-25 por CPNv(Ek)-A
As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPNv(Ek)-A durante 24 horas. As proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP-25 para facilitar a avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada por análise densitométrica. A CPNv-A, como preparada no Exemplo 26, foi utilizada para fins de comparação. É ilustrada a clivagem percentual de SNAP-25 por CPNv(Ek)-A (marcado como En activado) e CPNv-A (marcado como Xa activado).
Figura 20 - Produto CPNv-C expresso/purificado
As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. O perfil electroforético indica a purificação de uma espécie de dupla cadeia ligada por persulfureto da massa molecular esperada de CPNv-C. Pista 1 = marcadores de massa moleculares benchmark;
Pista 2 = fracção proteica total solúvel de E. coli;
Pista 3 = material purificado, após a captura inicial de
Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material tratado com
Factor Xa antes da captura final de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 5 = material purificado, após a segunda captura de
Sepharose carregada com Ni2+;Pista 6 = material purificado final; Pista 7 = material purificado final + DTT; Pista 8 = marcadores de massa moleculares benchmark.
Figura 21 - Clivagem de sintaxina por CPNv-C 57
As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPNv-C durante 24 horas. As proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-sintaxina para facilitar uma avaliação da clivagem da sintaxina. A percentagem de sintaxina clivada foi calculada por análise densitométrica. A concentração de fusão necessária para atingir 50% do máximo de clivagem de sintaxina é estimada em 3,13±1,96 nM.
Figura 22 - Eficácia de CPN-A no Modelo Mecânico de Alodinia Aguda Induzida por Capsaicina A capacidade de uma fusão LC/A-nociceptina-HN/A (CPN/A) para inibir a alodinia mecânica induzida por capsaicina foi avaliada após injecção intraplantar subcutânea na pata traseira de rato. Os animais testados foram avaliados quanto à frequência de retirada da pata (% de PWF) em resposta a uma série de estímulos de filamentos Von Frey de 10 g (10 estímulos x 3 ensaios) antes do recrutamento para o estudo (pré-tratamento); após o tratamento intraplantar subcutâneo com CPN/A, mas antes da capsaicina (pré-CAP); e após o desafio de capsaicina pós-injecção de CPN/A (média de respostas a 15' e 30'; CAP) . O desafio de capsaicina foi realizado por injecção de 10 pL de uma solução a 0,3%. As diluições das amostras foram preparadas em 0,5% de BSA/solução salina.
Figura 23 - Eficácia de Cpn-A No Modelo de Neuropatia Diabética Periférica (Dor Neuropática) Induzida por Estreptozotocina (STZ) 58
Ratos machos Sprague-Dawley (250-300 g) são tratados com 65-mg/kg de STZ em tampão citrato (I.V.) e a Glucose e lípidos sanguíneos são medidos semanalmente para definir a disponibilidade do modelo. O Limite de Retirada da Pata (PWT) é medido em resposta a uma série de estímulos de filamentos Von Frey durante um período de tempo. Refere-se que a alodinia é estabelecida quando as medidas de PWT em duas datas consecutivas de testes (separadas por uma semana) se situam abaixo de 6 g na escala. Neste ponto, os ratos são aleatorizados num grupo soro fisiológico (controlo negativo de eficácia), grupo de gabapentina (controlo positivo de eficácia) ou um grupo de teste (CPN/A). Os materiais de ensaio (20-25 pL) são injectados por via subcutânea como uma única injecção (excepto a gabapentina) e o PWT é medido 1 dia após o tratamento e depois periodicamente durante um período de 2 semanas. A gabapentina (30 mg/kg i.p. a 3 mL/kg de volume de injecção) é injectada diariamente, duas horas antes do início dos testes PWT.
Figura 24 - Eficácia de CPNv-A no Modelo Mecânico de
Alodinia Aguda Induzida por Capsaicina A capacidade da fusão LC/A-nociceptina-HN/A (CPNv/A) para inibir a alodinia mecânica induzida por capsaicina foi avaliada após injecção intraplantar subcutânea na pata traseira de rato. Os animais testados foram avaliados quanto à frequência de retirada da pata (% de PWF) em resposta a uma série de estímulos de filamentos Von Frey de 10 g (10 estímulos x 3 ensaios) antes do recrutamento para o estudo (pré-tratamento); após o tratamento intraplantar subcutâneo com CPNv/A, mas antes da capsaicina (pré-CAP) e após o desafio de capsaicina pós-injecção de CPNv/A (média de respostas a 15' e 30'; CAP) . O desafio de capsaicina foi realizado por injecção de 10 pL de uma solução a 59 0,3%. As diluições das amostras foram preparadas em 0,5% de BSA/solução salina. Estes dados são expressos como um diferencial de frequência normalizada de retirada da pata, na qual a diferença entre o pico de resposta (pós-capsaicina) e a resposta de base (pré-capsaicina) é expressa como uma percentaqem. Com esta análise, pode-se observar que a CPNv/A é mais potente que a CPN/A uma vez que é necessária uma dose menor de CPNv/A para consequir um efeito analgésico semelhante aquele observado com CPN/A.
Figura 25- Produto LC/A-CPLE-HN/A expresso/purifiçado
As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. O perfil electroforético indica a purificação de uma espécie de dupla cadeia ligada por persulfureto da massa molecular esperada de CPLE-A. Pista 1 = marcadores de massa moleculares benchmark;
Pista 2 = fracção proteica solúvel total de E. coli;
Pista 3 = material purificado, após a captura inicial de
Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material tratado com
Factor Xa antes da captura final de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 5 = material purificado, após a segunda captura de
Sepharose carregada com Ni2+; Pista 6 = material purificado final; Pista 7 = material purificado final + DTT.
Figura 26 - Produto LC/A-CPBE-HN/A expresso/purifiçado
As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. O perfil electroforético indica a purificação de uma espécie de dupla cadeia ligada por persulfureto da massa molecular esperada de CPBE-A. 60
Pista 1 = fracção proteica solúvel total de E. coli; Pista 2 = material purificado, após a captura inicial de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 3 = material tratado com Factor Xa antes da captura final de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material purificado final após a activação com Factor Xa (5 pL) ; Pista 5 = material purificado final após activação com Factor Xa (10 pL) ; Pista 6 = material purificado final após activação com Factor Xa (20 pL) ; Pista 7 = material purificado final após activação com Factor Xa + DTT (5 pL); Pista 8 = material purificado final após activação com Factor Xa + DTT (10 pL); Pista 9 = material purificado final após activação com o Factor Xa + DTT (20 pL) ; Pista 10 = referências de marcadores de massa molecular.
Figura 27 - Produto CPOP-A expresso/purificado
As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. O perfil electroforético indica a purificação de uma espécie de dupla cadeia ligada por persulfureto da massa molecular esperada de CPOP-A.
Pista 1 = marcadores de massa molecular benchmark;
Pista 2 = material purificado, após a captura inicial de
Sepharose carregada com Ni2+; Pista 3 = material tratado com
Factor Xa antes da captura final de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material purificado, após a segunda captura de
Sepharose carregada com Ni2+; Pista 5 = material purificado final após a activação com Factor Xa (5 pL) ; Pista 6 = material purificado final após a activação com Factor Xa (10 pL);
Pista 7 = material purificado final após activação com Factor Xa (20 pL) ; Pista 8 = material purificado final após activação com Factor Xa + DTT (5 pL); Pista 9 = material purificado final após 61 activação com o Factor Xa + DTT (10 pL) ; Pista 10 = material purificado final após activação com o Factor Xa + DTT (20 pL).
Figura 28 - Produto CPOPv-A expresso/purifiçado
As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. O perfil electroforético indica a purificação de uma espécie de dupla cadeia ligada por persulfureto da massa molecular esperada de CPOPv-A. Pista 1 = marcadores de massa moleculares benchmark;
Pista 2 = fracção proteica solúvel total de E. coli;
Pista 3 = material purificado, após a captura inicial de
Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material tratado com Factor Xa antes da captura final de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 5 = material purificado final após a activação com Factor Xa (5 pL); Pista 6 = material purificado final após a activação com Factor Xa (10 pL) ; Pista 7 = material purificado final após activação com Factor Xa (20 pL) ; Pista 8 = material purificado final após activação com Factor Xa + DTT (5 pL); Pista 9 = material purificado final após activação com o Factor Xa + DTT (10 pL) ; Pista 10 = material purificado final após activação com o Factor Xa + DTT (20 pL).
Figura 29 - Clivagem in vitro de SNAP-25, num modelo de célula DRG
As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de GPOPv-A durante 24 horas. As proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP-25 para 62 facilitar a avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada por análise densitométrica.
Figura 30 - Expresso/purificado CPNv-A-FXa-HT (marcador-His removível)
As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. 0 perfil electroforético indica a purificação de uma espécie de dupla cadeia ligada por persulfureto da massa molecular esperada de CPNv-A-FXa-HT. Pista 1 = marcadores de massa moleculares benchmark;
Pista 2 = fracção proteica total solúvel de E. coli; Pista 3 = material tratado com Factor Xa antes da captura final de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material purificado final após activação com Factor Xa; Pista 5 = material purificado final após activação com Factor Xa + DTT.
Figura 31 - Eficácia in vitro de proteínas de fusão LC/A-nociceptina-HN/A com comprimento variável de espaçador, como avaliado por ensaio de competição de ligante A capacidade das fusões LC/A-nociceptina-HN/A de comprimento variável de espaçador para se ligarem ao receptor ORLi foi avaliada por meio de um ensaio simples baseado em competição. As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de material de teste na presença de 1 nM de [3H]-nociceptina. A redução da ligação específica do ligante radiomarcado foi avaliada por contagem de cintilações e representada graficamente em comparação com a eficácia do ligante não-marcado (nociceptina Tocris). O painel 63 superior mostra as características de deslocamento dos espaçadores GSO, GS20, GS30 e Hx27, enquanto o painel inferior mostra os deslocamentos realizados pelas proteinas de fusão espaçadas com GS10, GS15 e GS25. Conclui-se que os espaçadores GSO e GS30 são ineficazes e o GS10 é pouco efectivo, em deslocar a nociceptina do receptor ORLi.
Figura 32 - Eficácia in vitro de proteinas de fusão LC/A-nociceptina-HN/A com comprimento variável de espaçador, como avaliado por clivagem in vitro de SNAP-25
As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPN-A (de comprimento variável de espaçador) durante 24 horas. As proteinas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP-25 para facilitar a avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada por análise densitométrica. As caracteristicas de ligação pouco eficazes da proteina de fusão espaçada com GS10 (ver Figura 28) são reflectidas nas concentrações de fusão mais elevadas necessárias para atingir a clivagem intracelular de SNAP-25. As proteinas de fusão espaçadas com GSO e GS30 foram completamente ineficazes (dados não mostrados). As proteinas de fusão espaçadas com GS15, 20 e 25 foram igualmente eficazes. SEQ ID N° SEQ ID1 SEQ ID2 SEQ ID3 SEQ ID4 SEQ ID5
Sequência de ADN de N[1—17] Sequência proteica de N[l-17] Sequência de ADN de N[1—11] Sequência proteica de N[1—11] Sequência de ADN de N[[Y10]1—11] 64 SEQ ID6 SEQ ID7 SEQ ID8 SEQ ID9 SEQ ID10 SEQ ID11 SEQ ID12 SEQ ID13 SEQ ID14 SEQ ID15 SEQ IDl6 SEQ ID17 SEQ IDl8 SEQ IDl9 SEQ ID20 SEQ ID21 SEQ ID22 SEQ ID23 SEQ ID24 SEQ ID25 SEQ ID2 6 SEQ ID27 SEQ ID28 SEQ ID2 9 SEQ ID30 SEQ ID31 SEQ ID32
Sequência proteica de N[[Y10]1—11]
Sequência de ADN de N[[Yll]1—11]
Sequência proteica de N[[Yll]1-11]
Sequência de ADN de N[[Y14]1-17]
Sequência proteica de N[[Y14]1-17]
Sequência de ADN de N[l-13]
Sequência proteica de N[l-13]
Sequência de ADN de Nv (também conhecida como N[[R14K15]1-17])
Sequência proteica de Nv (também conhecida como N[[R14K15]1-17])
Sequência de ADN da proteína de fusão N[1-17]-LHN/A Sequência proteica da proteína de fusão N[1-17]-LHN/A Sequência de ADN da proteína de fusão N[[Yll]1-11]-lhn/a
Sequência proteica da proteína de fusão N[[Yll]1-11]- lhn/a
Sequência de ADN da proteína de fusão N[1-13]-LHN/A Sequência proteica da proteína de fusão N[1-13]-LHN/A Sequência de ADN da proteína de fusão LHn/A-N[1-17] Sequência proteica da proteína de fusão LHn/A-N[1-17] Sequência de ADN da proteína de fusão LHn/C-N[1-11] Sequência proteica da proteína de fusão LHn/C-N[1-11] Sequência de ADN da proteína de fusão N[[Y14]1-17]-LHn/C
Sequência proteica da proteína de fusão N[[Y14]1-17]-LHn/C
Sequência de ADN de LC/A Sequência de ADN de HN/A Sequência de ADN de LC/B Sequência de ADN de HN/B Sequência de ADN de LC/C Sequência de ADN de HN/C 65 SEQ ID33 SEQ ID34 SEQ ID35 SEQ ID3 6 SEQ ID37 SEQ ID38 SEQ ID39 SEQ ID4 0 SEQ ID41 SEQ ID42 SEQ ID43 SEQ ID44 SEQ ID45 SEQ ID4 6 SEQ ID47 SEQ ID4 8 SEQ ID49 SEQ ID50 SEQ ID51 SEQ ID52 SEQ ID53 SEQ ID54 SEQ ID55 SEQ ID56 SEQ ID57 SEQ ID58 SEQ ID59 SEQ ID60 SEQ ID61 SEQ ID62 SEQ ID63
Sequência de ADN do ligante CPN-A
Sequência de ADN do ligante A
Sequência de ADN da inserção de nociceptina N-terminal
Sequência de ADN do ligante CPN-c Sequência de ADN do ligante CPBE-A Sequência de ADN do ligante CPNvar-A Sequência de ADN da fusão LC/A-CPN-Hn/A Sequência proteica de fusão LC/A-CPN-Hn/A Sequência de ADN da fusão N-LC/A-Hn/A Sequência proteica da fusão N-LC/A-Hn/A Sequência de ADN da fusão LC/C-CPN-Hn/C Sequência proteica da fusão LC/C-CPN-Hn/C Sequência de ADN da fusão LC/C-CPN-Hn/C (ligante-A) Sequência proteica da fusão LC/C-CPN-Hn/C (ligante-A) Sequência de ADN da fusão LC/A-CPME-HN/A Sequência proteica da fusão LC/A-CPME-HN/A Sequência de ADN da fusão LC/A-CPBE-HN/A Sequência proteica da fusão LC/A-CPBE-HN/A Sequência de ADN da fusão LC/A-CPNv-Hn/A Sequência proteica da fusão LC/A-CPNv-Hn/A Sequência de ADN da fusão LC/A-CPN[1-11]-HN/A Sequência proteica da fusão LC/A-CPN[1-11]-HN/A Sequência de ADN da fusão LC/A-CPN[[Y10]1-11]-HN/A Sequência proteica da fusão LC/A-CPN[[Y10]1-11]-HN/A Sequência de ADN da fusão LC/A-CPN[[Yll]1-11]-HN/A Sequência proteica da fusão LC/A-CPN[[Yll]1-11]-HN/A Sequência de ADN da fusão LC/A-CPN[[Y14]1-17]-HN/A Sequência proteica da fusão LC/A-CPN[[Y14]1-17]-HN/A Sequência de ADN da fusão LC/A-CPN[1-13]-HN/A Sequência proteica da fusão LC/A-CPN[1-13]-HN/A Sequência de ADN da fusão nociceptina-espaçador-LC/A- hn/a 6 6 SEQ ID64 Sequência proteica LC/A-Hn/A SEQ ID65 Sequência de ADN do SEQ ID66 Sequência de ADN do SEQ ID67 Sequência de ADN do SEQ ID68 Sequência de ADN do SEQ ID69 Sequência de ADN do SEQ ID7 0 Sequência de ADN da SEQ ID71 Sequência proteica SEQ ID72 Sequência de ADN da SEQ ID73 Sequência proteica SEQ ID74 Sequência de ADN do Enterocinase SEQ ID75 Sequência de ADN da SEQ ID7 6 Sequência proteica SEQ ID77 Sequência de ADN do SEQ ID78 Sequência de ADN da SEQ ID7 9 Sequência proteica SEQ ID8 0 Sequência de ADN da SEQ ID81 Sequência proteica SEQ ID82 Sequência de ADN da SEQ ID83 Sequência proteica SEQ ID84 Sequência de ADN da SEQ ID85 Sequência proteica SEQ ID8 6 Sequência de ADN da SEQ ID87 Sequência de ADN da SEQ ID88 Sequência proteica SEQ ID8 9 Sequência de ADN de SEQ ID90 Sequência de ADN de SEQ ID91 Sequência proteica SEQ ID92 Sequência de ADN do SEQ ID93 Sequência de ADN de SEQ ID94 Sequência proteica da fusão nociceptina-espaçador- ligante CPN-A GS10 ligante CPN-A GS15 ligante CPN-A GS25 ligante CPN-A GS30 ligante CPN-A HX27 fusão LC/A-CPN(GS15)-Hn/A da fusão LC/A-CPN(GS15)-Hn/A fusão LC/A-CPN(GS25)-Hn/A da fusão LC/A-CPN(GS25)-Hn/A ligante CPNvar-A activável por
fusão LC/A-CPNv(Ek)-Hn/A da fusão LC/A-CPNv(Ek)-Hn/A ligante CPNvar-A fusão LC/C-CPNv-Hn/C (act. A) da fusão LC/C-CPNv-Hn/C (act. A) fusão LC/A-CPLE-Hn/A da fusão LC/A-CPLE-Hn/A fusão LC/A-CPOP-Hn/A da fusão LC/A-CPOP-Hn/A fusão LC/A-CPOPv-Hn/A da fusão LC/A-CPOPv-Hn/A protease de IgA fusão IgA-CPNv-HN/A da fusão IgA-CPNv-HN/A FXa-HT
CPNv-A-FXa-HT da fusão CPNv-A-FXa-HT domínio de translocação DT CPLE-DT-A
da fusão CPLE-DT-A 67
Sequência Sequência Sequência Sequência Sequência Sequência SEQ ID95 SEQ ID96 SEQ ID97 SEQ ID98 SEQ ID99 SEQ ID100
de ADN da TeNT LC
de ADN de CPNv-TeNT LC
proteica da fusão CPNV-TeNT LC
de ADN do ligante CPNvar-C de ADN da fusão LC/C-CPNv-Hn/C (act. C) proteica da fusão LC/C-CPNv-Hn/C (act. C)
Exemplos
Exemplo 1 - Confirmação da actividade agonista da TM por medição da libertação de substância P a partir de culturas de células neuronais
Materiais A substância P EIA é obtida de R & D Systems, RU. Métodos
São estabelecidas culturas neuronais primárias de eDRG conforme descrito anteriormente (Duggan et al., 2002). A libertação de substância P a partir das culturas é avaliada por EIA, essencialmente como descrito anteriormente (Duggan et al. , 2002) . A TM de interesse é adicionada às culturas neuronais (estabelecidas durante, pelo menos, duas semanas antes do tratamento); culturas de controlo são realizadas em paralelo por adição de veiculo no lugar da TM. A libertação estimulada (100 mM de KC1) e basal, junto com o conteúdo total de lisado celular, de substância P são obtidas para ambas as culturas de controlo e tratadas com TM. A imunorreactividade da substância P é medida utilizando Kits de Imunoensaio Enzimático da Substância 68 P (Cayman Chemical Company, EUA, ou R & D Systems, RU) de acordo com as instruções dos fabricantes. A quantidade de Substância P libertada pelas células neuronais na presença da TM de interesse é comparada com a libertação obtida na presença e ausência de 100 mM de KC1. A estimulação da libertação de Substância P pela TM de interesse acima da libertação basal, estabelece que a TM de interesse é um "ligante agonista", como definido nesta descrição. Se desejado, a estimulação da libertação da Substância P pela TM de interesse pode ser comparada a uma curva padrão de libertação de Substância P produzida utilizando o ligante natural do receptor ORL-1, nociceptina (Tocris).
Exemplo 2 - Expressão e purificação de LHN/A catalíticamente activo
Materiais ADN sintético obtido a partir de Sigma Genosys.
As enzimas de restrição obtidas de New England Biolabs. Métodos A expressão e purificação de LHN/A cataliticamente activo foram realizadas essencialmente como descrito em Sutton et ai., (2005), Prot. Express. Purif., 40, p 31-41.
Resumidamente, o ADN que codifica a cadeia leve mais 423 aminoácidos do N-terminal da cadeia pesada de BoNT/A foi sintetizado por Sigma-Genosys para produzir um gene LHN/A 69 sintético com uma utilização preferencial de codões de E. coli. A região ligante entre a cadeia leve e dominio HN foi concebida para conter um local de clivagem do Factor Xa por PCR de extensão de sobreposição-splice. Dois produtos de PCR foram produzidos utilizando pares de iniciadores consistindo em um iniciador mutagénico longo e um iniciador não mutagénico mais curto: (5'-tccaaaactaaatctctgATAGAAGGTAGAaacaaagcgctgaacgac) com (5'-CTTGATGTACTCTGTGAACGTGCTC); e (5'-gtcgttcagcgctttgttTCTACCTTCTATcagagatttagttttgga) com (5'-ATGGAGTTCGTTAACAAACAGTTC).
Os produtos destas duas reacções foram utilizados como moldes para PCR de extensão de sobreposição-splice. Uma reacção adicional de PCR foi estabelecida para adicionar locais BamHI e SalI em ambas as extremidades do gene recLHN/A activável e estes locais foram utilizados para inserção num vector de entrada Invitrogen Gateway. 0 vector de entrada foi depois utilizado, juntamente com um local de recombinação Gateway adaptado pMAL c2x, numa reacção de LR clonase para formar pMAL c2x recLHN/A. 0 pMAL c2x recLHN/A foi modificado para incorporar um marcador 6'HIS no N-terminal da MBP. Isto foi realizado através da inserção de oligonucleótidos emparelhados que codificam o marcador HIS no local NdeI do pMAL. 0 vector de expressão que expressa LHN/A foi transformado em HMS174 ou AD494(DE3) (Novagen) de E. coli. As culturas foram cultivadas em meio Terrific Broth complexo suplementado com ZnCl2 (1 μΜ), ampicilina (100 yg/mL), 0,2% de glucose (p/v). Os parâmetros para a expressão de todas as construções foram determinados inicialmente em culturas agitadas em balão antes de 70 serem transferidas para sistemas fermentadores de 8 L. As culturas iniciais foram cultivadas durante 16 horas, a 37 °C, 220 rpm e utilizadas para inocular 1 L, em que o crescimento foi continuado, a 37 °C, 250 rpm. A uma OD600 nm de 0,6, a temperatura foi reduzida para 25 °C, durante 30 minutos, antes da indução com 1 mM de IPTG. A indução foi continuada durante 4 horas antes das células serem recolhidas e armazenadas a -70 °C.
Tipicamente, 16 g de pasta celular foram suspensas em 160 mL de PBS e lisadas por sonicação (MSE Soniprep 150) . O lisado resultante foi clarificado por centrifugação antes de ser aplicado numa coluna de amilose de 25 mL e eluido com 10 mM de maltose em PBS. O eluido continha aprox. 50% de proteina de fusão pura e foi tratado com Factor Xa (1 unidade de Factor Xa/100 yg de proteina de fusão; 20 horas; 26 °C) para remover a HISMBP e para clivar a junção LC-HN para activar a proteina. Após incubação, a amostra foi filtrada (0,45 mm) e diluída duas vezes com água para produzir uma composição de tampão 0,5 x PBS. O recLHN/A clivado, filtrado e diluído foi processado através de uma coluna Q sepharose FF (10 mL) e eluido com um gradiente
descontínuo de 80 mM de NaCl contendo HISMBP e 120 mM contendo aprox. 75% de recLHN/A puro. A adição do marcador HIS a MBP supera problemas anteriores de co-eluição com LHN/A e MBP. Como um passo final de aperfeiçoamento para assegurar a remoção completa da HISMBP, a eluição de 120 mM de NaCl da coluna
Q sepharose foi passada através de uma coluna HisTrap de 5 mL carregada com níquel (Amersham). O eluido directo desta coluna HisTrap continha aprox. 95% de recLHN/A puro (ver as Figuras em Sutton et al., (2005), Prot. Express. Purif., 40, p 31-41, para uma ilustração do esquema de purificação para LHN/A) . 71
Exemplo 3 - Expressão e purificação de LHN/B recombinante cataliticamente activa A metodologia descrita abaixo irá purificar protease LHN/B cataliticamente activa a partir de E. coli transformada com o plasmídeo apropriado que codifica o polipéptido LHN/B. Deve ser assinalado que várias sequências de polipéptidos LHN/B adequadas têm sido descritas no documento PCT/GB97/02273, patente U.S. 6461617 concedida e no Pedido de Patente U.S. 10/241596, incorporados aqui por referência. Métodos
A região codificante para LHN/B é introduzida em-grelha na extremidade 3' do gene que codifica a proteina de ligação de maltose (MBP) no vector de expressão pMAL (New England Biolabs) para criar pMAL-c2x-LHN/B. Nesta construção, a MBP e os polipéptidos LHN/B expressos estão separados por um local de clivagem do Factor Xa e os domínios LC e HN estão separados por um péptido que é susceptível a clivagem com enterocinase. O clone de expressão é denominado pMAL-c2X-synLHN/B. O pMAL-c2X-synLHN/B é transformado em HMS174 de E. coli e cultivado em meio Terrrific Broth complexo, em sistemas fermentadores de 8 L. O crescimento bacteriano de pré-indução é mantido a 37 °C até uma OD600 nm de 5,0, em cuja fase é induzida a expressão de recMBP-LHN/B por adição de IPTG até 0,5 mM e uma redução na temperatura até 30 °C. Após quatro horas a 30 °C, as bactérias são recolhidas por centrifugação e a pasta resultante armazenada a -70 °C. A pasta celular é ressuspensa em 20 mM de Hepes pH 7,2, 125 mM de NaCl, 1 μΜ de ZnCl2 e o rompimento das células é 72 efectuado utilizando um homogeneizador APV-Gaulin lab model 1000 ou um sonicator MSE Soniprep 150. A suspensão resultante é clarificada por centrifugação antes da purificação.
Após rompimento das células, a proteina de fusão-MBP é capturada numa resina de afinidade de amilose em 20 mM de Hepes pH 7,2, 125 mM de NaCl, 1 μΜ de ZnCl2 ou numa resina de permuta aniónica Q-Sepharose FF em 50 mM de Hepes pH 7,2, 1 μΜ de ZnCl2 sem sal. Um único pico é eluido a partir da resina de amilose no mesmo tampão mais 10 mM de maltose e a partir da coluna Q-Sepharose em 150-200 mM de sal. A clivagem da junção MBP-LHN/B é completada num passo de incubação de 18 horas, a 22 °C, com Factor Xa (NEB) a 1 U/50 pg de proteina de fusão. Uma concentração de substrato (MBP-LHN/B) de, pelo menos, 4 mg/mL é desejável para gue ocorra clivagem eficiente. A proteina clivada é diluida com 20 mM de Hepes para uma composição de tampão de 20 mM de Hepes, 25 mM de NaCl, 1 μΜ de ZnCl2, pH 7,2 e processada através de uma coluna Q sepharose para separar a MBP da LHN/B. A LHN/B é eluída a partir da coluna Q-Sepharose com 120-170 mM de sal. O ligante entre a cadeia leve e domínio HN é depois ranhurado por incubação com enterocinase a 1 U/100 pg de LHN/B a 22 °C durante 16 horas. Finalmente, a enterocinase é separada de LHN/B, ranhurada e de outras proteínas contaminantes numa coluna de Benzamidina Sepharose, em gue a enzima se liga, de um modo preferido, à resina durante uma incubação de 30 minutos a 4 °C. A LHN/B purificada é armazenada, a -20 °C, até ser requerida. Ver Figura 1 para uma ilustração do esquema de purificação para recLHN/B.
Exemplo 4 - Expressão e purificação de LHN/C recombinante cataliticamente activa 73 A região codificante para LHN/C é introduzida em-grelha na extremidade 3' do gene que codifica a proteína de ligação de maltose (MBP) no vector de expressão pMAL (New England Biolabs) para criar pMAL-c2x-LHN/C. Nesta construção, a MBP e os polipéptidos LHn/C expressos estão separados por um local de clivagem do Factor Xa. pMAL-c2x-LHN/C é transformado em AD494 (DE3, IRL) de E. coli e cultivado em meio Terrrific Broth complexo, em sistemas fermentadores de 8 L. 0 crescimento bacteriano de pré-indução é mantido, a 30 °C, até uma OD600 nm de 8,0, em cuja fase é induzida a expressão de recMBP-LHN/C por adição de IPTG até 0,5 mM e uma redução na temperatura até 25 °C. Após quatro horas a 25 °C, as bactérias são recolhidas por centrifugação e a pasta resultante armazenada a -70 °C. A pasta celular é ressuspensa em 50 mM de Hepes pH 7,2, 1 μΜ de ZnCl2 a 1:6 (p/v) e o rompimento das células é efectuado utilizando um homogeneizador APV-Gaulin lab model 1000 ou um sonicator MSE Soniprep 150. A suspensão resultante é clarificada por centrifugação antes da purificação.
Após rompimento das células e clarificação, a proteína de fusão-MBP é separada numa resina de permuta aniónica Q-Sepharose Fast Flow em 50 mM de Hepes pH 7,2, 1 μΜ de ZnCl2 e eluída com o mesmo tampão mais 100 mM de NaCl. Uma clivagem de duplo ponto é realizada na junção MBP-LHN/C e no ligante HN-LC, num único passo de incubação com Factor Xa. A reacção é completada num passo de incubação de 16 horas a 22 °C, com Factor Xa (NEB) a 1 U/100 pg de proteína de fusão. A proteína clivada é diluída com 20 mM de Hepes para uma composição de tampão de 20 mM de Hepes, 25 mM de NaCl, pH 7,2 e processada através de uma coluna Q sepharose para 74 separar a MBP da LHN/C. A LHN/C activada (ligante clivado ligado por persulfureto) é eluída a partir da coluna Q-Sepharose por um gradiente de sal (20 mM de Hepes, 500 mM de NaCl, 1 μΜ de ZnCl2, pH 7,2) em 120-170 mM de sal. Ver Figura 2 para uma ilustração da purificação de LHN/C.
Exemplo 5 - Produção de um conjugado químico de nociceptina e LHn/A
Materiais Péptido de nociceptina perlongado no C-terminal obtido de Sigma Genosys.
Os guimicos de conjugação obtidos de Pierce. Métodos
De modo a acoplar o péptido de nociceptina através de uma Cys C-terminal, o péptido foi primeiro sintetizado (por processos convencionais, obteníveis comercialmente) para incluir uma Cys como o aminoácido C-terminal final.
Este péptido foi depois utilizado como o segundo componente numa reacção de acoplamento baseada em sulfidrilo como descrita abaixo (ver também publicações anteriores WO 99/17806 e WO 96/33273 e Duggan et al., (2002), J. Biol. Chem. 277. 24846-34852 e Chaddock et al., (2000), infect lmmun., 68, 2587-2593). 75
Reacção de acoplamento baseada em sulfidrilo
Resumidamente, aproximadamente dois grupos abandonantes reactivos foram introduzidos em LHN/A (5 mg/mL em soro fisiológico tamponado com fosfato) por reacção com N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP). 0 material derivatizado foi isolado do excesso de SPDP por cromatografia de exclusão de tamanho. 0 ligando de nociceptina marcado com cisterna reconstituido foi misturado com a LHN/A derivatizada numa razão molar de 4:1 e incubado à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação delicada, de modo a criar um conjugado quimico através de uma ligação persulfureto covalente reduzivel. 0 fraccionamento inicial da mistura de conjugado para remover o péptido não conjugado foi realizado por cromatografia de exclusão de tamanho (Superose-12 ou Superdex G-200 dependendo da escala da conjugação). 76
Exemplo 6 - Produção de um conjugado químico de nociceptina e LHn/B
Materiais Péptido de nociceptina perlongado no C-terminal obtido de Sigma Genosys.
Os químicos de conjugação obtidos de Pierce. Métodos A nociceptina liofilizada foi dissolvida por adição de água e dializada em tampão MES (0,1 M de MES, 0,1 M de NaCl, pH 5,0). A esta solução (a uma concentração de cerca de 0,3 mg/mL) foi adicionado PDPH (100 mg/mL em DMF) para uma concentração final de 1 mg/mL. Após mistura, foi adicionado EDAC sólido para produzir uma concentração final de cerca de 0,2 mg/mL. A reacção foi deixada a proseguir durante, pelo menos, 30 minutos à temperatura ambiente. O excesso de PDPH foi depois removido por dessalinização numa coluna PD-10 (Pharmacia) previamente equilibrada com tampão MES.
Uma quantidade de LHN/B, equivalente a metade do peso de nociceptina utilizada, dissolveu-se em tampão de trietanolamina (0,02 M de trietanolamina/HCl, 0,1 M de cloreto de sódio, pH 7,8) a uma concentração de cerca de 1 mg/mL, foi feita reagir com reagente de Traut (solução stock de 100 mM em 1 M de trietanolamina/HCl, pH 8,0) a uma concentração final de 2 mM. Após 1 hora, a LHN/B foi dessalinizada em PBSE (soro fisiológico tamponado com fosfato com 1 mM de EDTA) utilizando uma coluna PD-10 (Pharmacia) . O pico de proteína do eluído da coluna foi 77 concentrado utilizando um Microcon 50 (Amicon) a uma concentração de cerca de 2 mg/mL. A nociceptina derivatizada foi submetida a um passo final de concentração resultando numa redução em volume de menos de 10% do volume inicial e, depois, misturada com LHN/B derivatizada, de um dia para o outro à temperatura ambiente. Os produtos da reacção foram analisados por electroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE). O conjugado resultante da reacção acima foi parcialmente purificado por cromatografia de exclusão de tamanho em Bio-Gel P-100 (BioRad) . O perfil de eluição foi seguido através de medição da densidade óptica a 280 nm e análise de SDS-PAGE das fracções. Isto permitiu a separação do conjugado da nociceptina livre e de subprodutos da reacção.
Exemplo 7 - Produção de um conjugado químico de nociceptina 1-11 e LHn/B
Materiais Péptido de nociceptina 1-11 perlongado no C-terminal obtido de Sigma Genosys.
Os quimicos de conjugação obtidos de Pierce. Métodos 78
De modo a acoplar o péptido de nociceptina 1-11 através de uma Cys C-terminal, o péptido foi primeiro sintetizado (por processos convencionais, obteníveis comercialmente) para incluir uma Cys como o aminoácido C-terminal final.
Este péptido foi depois utilizado como o segundo componente numa reacção de acoplamento baseada em sulfidrilo como descrito no Exemplo 5.
Exemplo 8 - Produção de um conjugado químico de nociceptina N[[Y14]1-17] e LHN/C
Materiais Péptido de nociceptina N[[Y14]1—17] perlongado no C-terminal obtido de Sigma Genosys.
Os químicos de conjugação obtidos de Pierce. Métodos
De modo a acoplar o péptido de nociceptina 1-11 através de uma Cys C-terminal, o péptido foi primeiro sintetizado (por processos convencionais, obteníveis comercialmente) para incluir uma Cys como o aminoácido C-terminal final.
Este péptido foi depois utilizado como o segundo componente numa reacção de acoplamento baseada em sulfidrilo como descrito no Exemplo 5. 79
Exemplo 9 - Produção recombinante de uma fusão de polipéptido simples de nociceptina-LHN/A (SEQ ID15 e SEQ ID16) A sequência de ADN para a nociceptina-LHN/A foi concebida por retro-tradução da LC/A, Hn/A e sequências de aminoácidos da nociceptina. A ORF completa contendo a sequência nociceptina-LC/A-ansa de activação-HN/A foi montada em software convencional de manipulação de sequências de ADN (EditSeq). A ansa de activação entre a cisteina de LC/A e a cisteina de HN/A (CVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLC) foi modificada para incorporar um local de reconhecimento da protease Factor Xa.
Locais de restrição apropriados para facilitar a clonagem no vector de expressão requerido (por exemplo, BamHI/SalI) foram incorporados nas extremidades 5' e 3', respectivamente, da sequência mantendo a grelha de leitura correcta. A sequência de ADN foi rastreada (utilizando software, tal como MapDraw, DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem de enzimas de restrição incorporadas durante a retro-tradução. Quaisquer sequências de clivagem que fossem comuns àquelas requeridas pelo sistema de clonagem foram removidas manualmente da sequência codificante proposta, assegurando que era mantida a utilização comum de codões de E. coli. A utilização de codões de E. coli foi avaliada com referência a programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e o conteúdo de GC em % e a razão de utilização de codões avaliados com referência a tabelas publicadas de utilização de codões (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004).
Esta sequência de ADN optimizada contendo a grelha de leitura aberta (ORF) de nociceptina-LC/A-ansa de activação-HN/A 80 foi depois comercialmente sintetizada e proporcionada no vector pCR4 . 0 ADN que codifica a fusão nociceptina-LHN/A foi isolado de pCR4 e transferido na estrutura básica do vector pMAL para facilitar a expressão da proteina. 0 vector resultante pMAL NO-LHn/A foi transformado em BL21 de E. coli competentes e os transformantes correctos seleccionados. Uma colónia isolada de pMAL NO-LHn/A foi cultivada em meio Terrific Broth complexo suplementado com ZnCl2 (1 mM) , ampicilina (100 pg/mL) , 0,2% de glucose (p/v). A expressão da inserção foi induzida por adição de IPTG (0,1 mM) e a cultura, mantida a 16 °C, durante 16 horas. Após este período de expressão, as bactérias foram isoladas por centrifugação e o sedimento celular armazenado a -20 °C até utilização. 10 g de pasta de células BL21 de E. coli foram descongelados num tubo Falcon contendo 25 mL de 50 mM de HEPES, pH 7,2, 200 mM de NaCl. A pasta celular descongelada foi preenchida até 80 mL com 50 mM de HEPES, pH 7,2, 200 mM de NaCl e sonicada em gelo 30 segundos ligado/30 segundos desligado, durante 10 ciclos a uma potência de 22 mícrones assegurando que a amostra permanecia fresca. As células lisadas foram centrifugadas a 18000 rpm, 4 °C, durante 30 minutos. O sobrenadante foi aplicado numa coluna quelante carregada com 0,1 M de NiS04 (20-30 mL de coluna é suficiente) e equilibrada com 50 mM de HEPES, pH 7,2, 200 mM de NaCl.
Utilizando um gradiente descontínuo de 10 e 40 mM de imidazole, a proteína ligada não específica foi removida por lavagem e a proteína de fusão eluída com 100 mM de imidazole. A proteína de fusão eluída foi dializada contra 5 L de 50 mM de HEPES, pH 7,2, 200 mM de NaCl, a 4 °C, de um dia para o outro e 81 a OD da proteína de fusão dializada medida. Foi adicionada 1 unidade de Factor Xa por 100 yg de proteína de fusão e incubada estática a 25 °C, de um dia para o outro. A mistura de clivagem foi aplicada numa coluna quelante carregada com 0,1 M de NiS04 (20-30 mL de coluna é suficiente) e equilibrada com 50 mM de HEPES, pH 7,2, 200 mM de NaCl.
Utilizando um gradiente descontínuo de 10 e 40 mM de imidazole, a proteína ligada não específica foi removida por lavagem e a proteína de fusão eluída com 100 mM de imidazole. A proteína de fusão eluída foi dializada contra 5 L de 50 mM de HEPES, pH 7,2, 200 mM de NaCl, a 4 °C, de um dia para o outro e a fusão concentrada a cerca de 2 mg/mL, distribuída em fracções e armazenada a -20 °C. A Figura 3 mostra a análise de SDS-PAGE de expressão e purificação de N[1-17]-LHN/A.
Exemplo 10 - Produção recomblnante de uma fusão de
polipéptido simples de (nociceptina 1-11)-LHN/B A sequência de ADN para a (nociceptina 1-11)-LHN/B foi concebida por retro-tradução da LC/B, HN/B e sequências de aminoácidos da nociceptina 1-11. A ORF completa contendo a sequência (nociceptina 1-11)-LC/B-ansa de activação-HN/B foi montada em software convencional de manipulação de sequências de ADN (EditSeq) . A ansa de activação entre a cisterna de LC/B e a cisteína de HN/B foi modificada para incorporar um local de reconhecimento da protease Factor Xa. A proteína de fusão recombinante foi depois produzida essencialmente como descrito no Exemplo 9. 82
Exemplo 11 - Produção recombinante de uma fusão de polipéptido simples de (nociceptina N[[Y14]1-17])-LHN/C (SEQ ID25 e SEQ ID26) A sequência de ADN para a (nociceptina N[[Y14]1-17]) foi concebida por retro-tradução da LC/C, HN/C e sequências de aminoácidos da nociceptina N[[Y14]1-17]. A ORF completa contendo a sequência (nociceptina N [ [Y14]1-17])-LC/C-ansa de activação-HN/C foi montada em software convencional de manipulação de sequências de ADN (EditSeq). A ansa de activação entre a cisteina de LC/C e a cisterna de HN/C foi modificada para incorporar um local de reconhecimento da protease Factor Xa. A proteina de fusão recombinante foi depois produzida essencialmente como descrito no Exemplo 9.
Exemplo 12 - Produção recombinante de uma fusão de polipéptido simples de LHN/C-(nociceptina 1-11) (SEQ ID23 e SEQ ID24) A sequência de ADN para a LHN/C-(nociceptina 1-11) foi concebida por retro-tradução da LC/C, HN/C e sequências de aminoácidos da nociceptina 1-11. A ORF completa (SEQ ID23) contendo LC/C-ansa de activação-HN/C- espaçador flexível-(nociceptina 1-11) foi montada em software convencional de manipulação de sequências de ADN (EditSeq). A proteina de fusão recombinante (SEQ ID24) foi depois produzida essencialmente como descrito no Exemplo 9. 83
Exemplo 13 - Produção de um conjugado para a distribuição de ADN que codifica LC/C numa célula A construção de um conjugado nociceptina-HN-[LC/C] é descrita abaixo, em que [LC/C] representa o ADN condensado de polilisina que codifica a cadeia leve da neurotoxina botulinica de tipo C.
Materiais SPDP é de Pierce Chemical Co.
Reagentes adicionais são obtidos de Sigma Ltd. Métodos
Utilizando um plasmídeo contendo o gene que codifica LC/C sob controlo de um promotor CMV (imediatamente precoce), a condensação de ADN foi realizada utilizando polilisina derivatizada com SPDP, a uma razão de 2 de ADN para 1 de polilisina. Os conjugados foram depois preparados por mistura de ADN condensado (0,4 mg/mL) com HN-nociceptina (100 yg/mL) durante 16 h a 25 °C. A polilisina derivatizada com SPDP e o grupo SH livre presentes no domínio HN combinam-se para facilitar a ligação covalente do ADN e proteína.
Exemplo 14 - Produção de um conjugado para distribuição de ADN que codifica LC/B numa célula 84 A construção de um conjugado (nociceptina 1-11)-HN-[LC/B] é descrita abaixo, em que [LC/B] representa o ADN condensado de polilisina que codifica a cadeia leve da neurotoxina botulinica de tipo B.
Materiais SPDP é de Pierce Chemical Co.
Reagentes adicionais são obtidos de Sigma Ltd. Métodos
Utilizando um plasmideo contendo o gene que codifica LC/B sob controlo de um promotor CMV (imediatamente precoce), a condensação de ADN foi realizada utilizando polilisina derivatizada com SPDP, a uma razão de 2 de ADN para 1 de polilisina. Os conjugados foram depois preparados por mistura de ADN condensado (0,4 mg/mL) com HN-(nociceptina 1-11) (100 yg/mL), durante 16 h a 25 °C. A polilisina derivatizada com SPDP e o grupo SH livre presentes no dominio HN combinam-se para facilitar a ligação covalente do ADN e proteina. 85
Exemplo 15 - Avaliação da actividade de nocicept±na-LHN/A em células neuronais que libertam substância P
Utilizando a metodologia descrita em Duggan et al., (2002, J. Biol. Chem., 277, 34846-34852), a actividade de nociceptina- LHn/A em células neuronais que libertam substância P foi avaliada. A proteina de fusão nociceptina-LHN/A foi aplicada em culturas neuronais de gânglios da raiz dorsal com 2 semanas e incubadas a 37 °C durante 16 horas. Após a incubação, o meio foi removido e a capacidade das células para sofrerem libertação estimulada de substância P (SP) foi avaliada. A libertação de SP a partir das células neuronais incubadas com a proteina de fusão nociceptina-LHN/A foi ensaiada em comparação com (i) células tratadas apenas com LHN/A e (i i) células tratadas apenas com meio. Isto permitiu calcular a % de inibição de substância P a partir de eDRG. A capacidade da proteina de fusão nociceptina-LHN/A para inibir a libertação de SP (relativamente a células tratadas apenas os meio) foi descrita na Tabela 1. Os dados representam a média de 3 determinações:
Tabela 1
Material de Teste (μΜ) Proteina de fusão nociceptina-LHN/A apenas LHN/A % de Inibição % de Inibição 1/0 47,3 25, 6 0,1 13, 8 -11,5 86
Exemplo 16 - Confirmação da activação do receptor 0RL1 por medição da produção de cAMP estimulada por forscolina A confirmação de que uma dada TM está a actuar através do receptor ORLi é proporcionada pelo teste que se segue, em que a capacidade das TM para inibir a produção de cAMP estimulada por forscolina é avaliada.
Materiais [3H]-Adenina e [14C] -cAMP são obtidos de GE Healthcare Métodos 0 ensaio é realizado essencialmente como descrito anteriormente por Meunier et al. , [Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORLi receptor, Nature 377: 532-535, 1995] em células CHO transfectadas intactas plaqueadas em placas de 24 poços de plástico. Às células é adicionada [3H] -adenina (1,0 pCi) em 0,4 mL de meio de cultura. As células permanecem, a 37 °C, durante 2 h para permitir a adenina se incorporar no reservatório intracelular de ATP. Após 2 h, as células são lavadas uma vez com tampão de incubação contendo: 130 mM de NaCl, 4,8 mM de KC1, 1,2 mM de KH2P04, 1,3 mM de CaCl2, 1,2 mM de MgS04, 10 mM de Glucose, 1 mg/mL de albumina de soro bovino e 25 mM de HEPES pH 7,4, e substituídas por um tampão contendo forscolina (10 μΜ) e isobutilmetilxantina (50 μΜ) , com ou sem a TM de interesse. Após 10 minutos, o meio é aspirado e substituído por 0,5 mL, 0,2 M de HC1. Cerca de 1000 cpm de [14C]-cAMP é adicionado a cada poço e 87 utilizado como padrão interno. 0 conteúdo dos poços é então transferido para colunas de 0,65 g de pó de alumina seca. As colunas são eluidas com 4 mL de 5 mM de HC1, 0,5 mL de 0,1 M de acetato de amónio, seguidos de dois mililitros adicionais de acetato de amónio. O eluido final é recolhido em frasquinhos de cintilações e contado para 14C e tritio. Os valores recolhidos são corrigidos para a recuperação de [14C]-cAMP. As TM que são agonistas no receptor ORLi causam uma redução do nivel de cAMP produzido em resposta à forscolina.
Exemplo 17 - Confirmação de activação do receptor ORLi
utilizando um ensaio funcional de ligação a GTPyS A confirmação de que uma dada TM está a actuar através do receptor ORLi é também proporcionada pelo teste que se segue, um ensaio funcional de ligação a GTPyS.
Materiais [35S]-GTPyS é obtido de GE Healthcare.
Esferas revestidas com aglutinina de gérmen de trigo (SPA) são obtidas de GE Healthcare Métodos
Este ensaio é realizado essencialmente como descrito por Traynor e Nahorski [Modulation by μ-opioid agonists of guanosine -5-0-(3-[35S]thio) triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47: 848-854, 1995]. 88
As células são raspadas de placas de cultura de tecido em 20 mM de HEPES, 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético, em seguida centrifugadas a 500 χ g durante 10 min. As células são ressuspensas neste tampão e homogeneizadas com um homogeneizador Polytron. O homogeneizado é centrifugado a 27000 χ g durante 15 min e o sedimento ressuspenso em tampão A contendo: 20 mM de HEPES, 10 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, pH 7,4. A suspensão é centrifugada novamente a 20000 χ g e, mais uma vez, suspensa em tampão A. Para o ensaio de ligação, as membranas (8-15 pg de proteína) são incubadas com [35S]-GTPyS (50 pM) , GDP (10 μΜ) , com e sem a TM de interesse, num volume total de 1,0 mL, durante 60 min a 25 °C. As amostras são filtradas através de filtros de fibra de vidro e contadas como descrito para os ensaios de ligação.
Exemplo 18 - A preparação de clones com estrutura básica de LC/A e Hn/A 0 seguinte processo produz os fragmentos de LC e HN para utilização como o componente de estrutura básica para a expressão de fusões multidomínios. Este exemplo é baseado na preparação de um clone baseado em serotipo A (SEQ ID27 e SEQ ID28), embora os processos e métodos sejam igualmente aplicáveis a outros serotipos [ilustrados pela listagem de seguências para o serotipo B (SEQ ID29 e SEQ ID30) e serotipo C (SEQ ID31 e SEQ ID32)].
Preparação de vectores de clonagem e expressão 89 pCR4 (Invitrogen) é o vector de clonagem padrão escolhido, seleccionado devido à falta de sequências de restrição dentro do vector e aos locais iniciadores de sequenciação adjacentes para fácil confirmação da construção. O vector de expressão é baseado no vector de expressão pMAL (NEB) , que tem as sequências de restrição desejadas dentro do local múltiplo de clonagem na orientação correcta para a inserção da construção (BamHI-SalI-PstI-HindIII). Um fragmento do vector de expressão foi removido para criar um plasmideo não mobilizável e uma variedade de diferentes marcadores de fusão foram introduzidos para aumentar as opções de purificação.
Preparação da inserção de protease (e. g., LC/A) A LC/A (SEQ ID27) é criado por um de dois modos: A sequência de ADN é concebida por retro-tradução da sequência de aminoácidos de LC/A [obtida de fontes de bases de dados disponíveis gratuitamente, tais como GenBank (número de acesso P10845) ou Swissprot (locus de acesso BXAl_CLOBO) utilizando uma de uma variedade de ferramentas de software de retro-tradução (por exemplo, retro-tradução de E. coli EditSeq Best (DNASTAR Inc.), ou a ferramenta Backtranslation v2.0 (Entelechon)]. As sequências de reconhecimento BamRI/SalI são incorporadas nas extremidades 5' e 3', respectivamente, da sequência, mantendo a grelha de leitura correcta. A sequência de ADN é rastreada (utilizando software, tal como MapDraw, DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem de enzimas de restrição incorporadas durante a retro-tradução. Quaisquer sequências de clivagem que forem comuns àquelas requeridas pelo sistema de clonagem são removidas manualmente da sequência codificante 90 proposta, assegurando que é mantida a utilização de codões comum de E. coli. A utilização de codões de E. coli é avaliada com referência a programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e o conteúdo de GC em % e a razão de utilização de codões avaliados com referência a tabelas publicadas de utilização de codões (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de ADN optimizada contendo a grelha aberta da leitura de LC/A (ORF) é depois comercialmente sintetizada (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vector pCR4. O método alternativo é a utilização de amplificação por PCR a partir de uma sequência de ADN existente com as sequências de enzimas de restrição BarriRI e Sall incorporadas nos iniciadores 5' e 3' de PCR, respectivamente. Os iniciadores oligonucleotidicos complementares são sintetizados quimicamente por um fornecedor (por exemplo, MWG ou Sigma-Genosys) , de modo que cada par tenha a capacidade para hibridar com as cadeias opostas (extremidades 3' a "apontar" uma para a outra) que flanqueiam a região de ADN alvo de Clostridium, um oligonucleótido para cada uma das duas cadeias de ADN. Para gerar um produto de PCR, o par dos iniciadores oligonucleotidicos curtos específicos para a sequência de ADN de Clostridium é misturado com o molde de ADN de Clostridium e os outros componentes de reacção e colocados numa máquina (a "máquina de PCR") que pode variar automaticamente a temperatura de incubação do tubo de reacção, fazendo ciclos entre aproximadamente 94 °C (para a desnaturação), 55 °C (para o emparelhamento dos oligonucleótidos) e 72 °C (para síntese). Outros reagentes requeridos para a amplificação de um produto de PCR incluem uma ADN polimerase (tais como Taq ou Pfu polimerases), cada um dos quatro blocos de construção nucleótídicos dNTP de ADN em quantidades equimolares (50-200 μΜ) 91 e um tampão apropriado para a enzima optimizado para a concentração de Mg2+ (0,5-5 mM) . O produto de amplificação é clonado em pCR4 utilizando a clonagem TOPO TA para produtos de PCR de PCR ou clonagem Zero Blunt TOPO para produtos de PCR de Pfu (ambos os kits disponíveis comercialmente de Invitrogen). O clone resultante é verificado por sequenciação. Quaisquer sequências de restrição adicionais que não sejam compatíveis com o sistema de clonagem são depois removidas utilizando mutagénese dirigida [por exemplo, utilizando Quickchange (Stratagene Inc.)].
Preparação da inserção de translocação (e. g.f HN) A Hn/A (SEQ ID28) é criada de dois modos: A sequência de ADN é concebida por retro-tradução da sequência de aminoácidos de HN/A [obtida de fontes de bases de dados disponíveis gratuitamente, tais como GenBank (número de acesso P10845) ou Swissprot (locus de acesso BXAl_CLOBO)] utilizando uma de uma variedade de ferramentas de software de retro-tradução (por exemplo, retro-tradução de E. coli EditSeq Best (DNASTAR Inc.)/ ou a ferramenta Backtranslation v2.0 (Entelechon)]. A sequência de restrição PstI adicionada ao N-terminal e Xbal-codão de terminação-HindIII no C-terminal assegurando que é mantida a grelha de leitura correcta. A sequência de ADN é rastreada (utilizando software tal como MapDraw, DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem de enzimas de restrição incorporadas durante a retro-tradução. Quaisquer sequências de clivagem que forem comuns àquelas requeridas pelo sistema de clonagem são removidas manualmente da sequência codificante proposta, assegurando que é mantida a utilização de 92 codões comum de E. coli. A utilização de codões de E. coli é avaliada com referência a programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e o conteúdo de GC em % e a razão de utilização de codões avaliados com referência a tabelas publicadas de utilização de codões (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de ADN optimizada é depois comercialmente sintetizada (por exemplo por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vector pCR4. O método alternativo é a utilização de amplificação por PCR a partir de uma sequência de ADN existente com sequências de enzimas de restrição Pst I e Xbal-codão de terminação-HindlII incorporadas nos iniciadores de PCR 5' e 3', respectivamente. A amplificação por PCR é realizada como descrita acima. O produto de PCR é introduzido no vector pCR4 e verificado por sequenciação. Quaisquer sequências de restrição adicionais que não sejam compatíveis com o sistema de clonagem são depois removidas utilizando mutagénese dirigida [por exemplo, utilizando Quickchange (Stratagene Inc.)].
Exemplo 19 - Preparação de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A (a nociceptina é N-terminal da cadeia HN)
Preparação de uma inserção ligante-nociceptina-espaçador O ligante LC-HN pode ser concebido a partir do primeiro princípio, utilizando a informação de sequência existente para o ligante como o molde. Por exemplo, o ligante do sorotipo A (neste caso definido como a região polipeptídica inter-domínio que existe entre as cisternas da ponte persulfureto entre LC e Hn) tem 23 aminoácidos de comprimento e tem a sequência 93 VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL. Dentro desta sequência, entende-se que a activação proteolítica na natureza conduz a um domínio HN que tem um N-terminal da sequência ALNDL. Esta informação de sequência está disponível gratuitamente a partir de fontes de bases de dados disponíveis, tais como GenBank (número de acesso P10845) ou Swissprot (locus de acesso BXAl_CLOBO). Dentro deste ligante são incorporados um local de Factor Xa, nociceptina e espaçador; e utilizando uma de uma variedade de ferramentas de software de retro-tradução [por exemplo, retro-tradução de E. coli EditSeq Best (DNASTAR Inc.), ou a ferramenta Backtranslation v2.0 (Entelechon)], a sequência de ADN que codifica a região ligante-ligando-espaçador é determinada. Sítios de restrição são depois incorporados na sequência de ADN e podem ser dispostos como BamHJ-SalI-ligante-local de protéase-nociceptina-Nhel-espaçador-Spel-Pstl-XbaI-codão de terminação-Hindi 11 (SEQ ID33) . É importante assegurar que a grelha de leitura correcta é mantida para o espaçador, nociceptina e sequências de restrição e que a sequência Xbal não é precedida pelas bases, TC, o que resultaria numa metilação DAM. A sequência de ADN é rastreada para incorporação de sequências de restrição e quaisquer outras sequências adicionais são removidas manualmente da sequência restante assegurando que é mantida a utilização de codões comuns de E. coli. A utilização de codões de E. coli é avaliada com referência a programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e o conteúdo de GC em % e a razão de utilização de codões avaliados com referência a tabelas publicadas de utilização de codões (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004). Esta sequência de ADN optimizada é depois comercialmente sintetizada (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vector pCR4.
Preparação da fusão LC/A-nociceptina-HN/A 94
De modo a criar a construção LC-ligante-nociceptina-espaçador-HN (SEQ ID39), o vector pCR4 que codifica o ligante (SEQ ID33) é clivado com enzimas de restrição BamHl + SalI. Este vector clivado serve, depois, como vector recipiente para inserção e ligação do ADN de LC/A (SEQ ID27) clivada com BamHl + SalI. 0 plasmídeo de ADN resultante é então clivado com enzimas de restrição PstI + Xfoal e serve como vector recipiente para a inserção e ligação do ADN de HN/A (SEQ ID28) clivado com PstI + Xfoal. A construção final contém a ORF de LC-ligante-nociceptina-espaçador-HN (SEQ ID39) para transferência para vectores de expressão para resultar numa proteina de fusão da sequência ilustrada em SEQ ID40.
Exemplo 20 - Preparação de uma proteina de fusão nociceptina-LC/A-HN/A (a nociceptina é N-terminal da cadeia LC) A estrutura básica de LC/A-HN/A é construída como descrito no Exemplo 19 utilizando o ligante do sorotipo A sintetizado com a adição de um local de Factor Xa para activação, disposta como BamHl-Sall-ligante-local de protease-ligante-Pstl-Xbal-codão de terminação-HindlII (SEQ ID34). A estrutura básica de LC/A-HN/A e a inserção de nociceptina apresentada no N-terminal sintetizada (SEQ ID35) são clivadas com enzimas de restrição BamHl + JííndlII, purificadas do gel e ligadas conjuntamente para criar nociceptina-espaçador-ligante-LC-HN. A ORF (SEQ ID41) é depois cortada utilizando enzimas de restrição Aval + Xfoal para transferir em vectores de expressão para resultar numa proteína de fusão da sequência ilustrada na SEQ ID42. 95
Exemplo 21 - Preparação de uma proteína de fusão
LC/C-nociceptina-HN/C
Seguindo os métodos utilizados nos Exemplos 1 e 2, LC/C (SEQ ID31) e HN/C (SEQ ID32) são criadas e introduzidas no ligante do sorotipo C dispostas como BamHI-Sall-ligante-local de protease-nociceptina-Whel-espaçador-Spel-Pstl-Xjbal-codão de terminação-HindIII (SEQ ID36). A construção final contém a ORF LC-ligante-nociceptina-espaçador-HN (SEQ ID43) para expressão como uma proteina da sequência ilustrada em SEQ ID44.
Exemplo 22 - Preparação de uma proteina de fusão LC/C-nociceptina-HN/C com uma sequência de activação do sorotipo A
Seguindo os métodos utilizados nos Exemplos 1 e 2, LC/C (SEQ ID31) e HN/C (SEQ ID32) são criadas e introduzidas no ligante do sorotipo A dispostas como BamRI-Sall-ligante-local de protease-nociceptina-Whel-espaçador-Spel-Pstl-Xbal-codão de terminação-Jíindl 11 (SEQ ID33). A construção final contém a ORF LC-ligante-nociceptina-espaçador-HN (SEQ ID45) para expressão como uma proteina da sequência ilustrada em SEQ ID46.
Exemplo 23 - Preparação de uma proteina de fusão
LC / A-me t-ence f al ina - HN / A
Devido ao pequeno tamanho, cinco aminoácidos, do ligante met-encefalina, a fusão LC/A-met-encefalina-HN/A é criada por mutagénese dirigida [por exemplo, utilizando Quickchange (Stratagene Inc.)] utilizando a fusão LC/A-nociceptina-HN/A 96 (SEQ ID39) como um molde. Os oligonucleótidos são concebidos para codificar o péptido YGGFM de met-encefalina, garantindo gue seja mantida a utilização de codões de E. coli padrão e gue nenhum local de restrição adicional seja incorporado, flanqueado por sequências complementares à região ligante da fusão LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID39) de cada lado da secção de nociceptina. 0 produto SDM é verificado por sequenciação e a construção final contendo a ORF LC-ligante-met-encefalina-espaçador-HN (SEQ ID47) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID48.
Exemplo 24 - Preparação de uma proteína de fusão
LC/A-p-endorfina-HN/A
Seguindo os métodos utilizados nos Exemplos 1 e 2, LC/A (SEQ ID27) e HN/A (SEQ ID28) são criadas e introduzidas no ligante de β endorfina do sorotipo A dispostas como BamHI-SalI-ligante-local de protease^-endorfina-Nhel-espaçador-Spel-Pstl-Xbal-codão de terminação-JíindIII (SEQ ID37) . A construção final contém a ORF de LC-ligante^-endorfina-espaçador-HN (SEQ ID49) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID50.
Exemplo 25 - Preparação de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A
Seguindo os métodos utilizados nos Exemplos 1 e 2, LC/A (SEQ ID27) e HN/A (SEQ ID28) são criadas e introduzidas no ligante de nociceptina variante do sorotipo A dispostas como BamHI-SalI-ligante-local de protease-nociceptina variante-Miel-espaçador-Spel-Pstl-Xbal-codão de terminação-ííindIII (SEQ ID38) . 97 A construção final contém a ORF de LC-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN (SEQ ID51) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID52.
Exemplo 26 - Método de purificação para a proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A
Descongelar um tubo Falcon de 25 mL contendo 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCl e, aproximadamente, 10 g de pasta de células BL21 de E. coli. Perfazer a massa celular descongelada até 80 mL com 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCl e sonicar durante em gelo 30 segundos ligado/30 segundos desligado durante 10 ciclos com uma potência de 22 mícrones assegurando que a amostra permanece fresca. Centrifugar as células lisadas a 18000 rpm, a 4 °C, durante 30 minutos. Aplicar o sobrenadante numa coluna quelante carregada com 0,1 M de NiS04 (20-30 mL de coluna é suficiente) equilibrada com 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCl. Utilizando um gradiente descontínuo de 10 e 40 mM de imidazole, remover por lavagem a proteína ligada não-específica e eluir a proteína de fusão com 100 mM de imidazole. Dialisar a proteína de fusão eluída contra 5 L de 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCl, a 4 °C, de um dia para o outro e medir a OD da proteína de fusão dialisada. Adicionar 1 unidade do factor Xa por 100 pg de proteína de fusão e incubar estaticamente a 25 °C, de um dia para o outro. Carregar numa coluna quelante carregada com 0,1 M de NiS04 (20-30 mL de coluna é suficiente), equilibrar com 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCl. Lavar a coluna para a linha de base com 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCl. Utilizando um gradiente descontínuo de 10 e 40 mM de imidazole, remover por lavagem a proteína ligada não-específica e eluir a proteína de fusão com 100 mM de imidazole. Dialisar a proteína de fusão eluída contra 5 L de 50 mM de HEPES pH 7,2, 2 00 mM de 98
NaCl, a 4 °C, de um dia para o outro e concentrar a fusão a cerca de 2 mg/mL, distribuir por fracções e congelar a -20 °C. Testar a proteina purificada utilizando OD, BCA, análise de pureza e avaliações de SNAP-25.
Exemplo 27 - Preparação de uma proteina de fusão LC/A- nociceptina-HN/A (a nociceptina é N-terminal da cadeia HN) A inserção ligante-nociceptina-espaçador é preparada como descrito no Exemplo 19.
Preparação da fusão LC/A-nociceptina-H^/A
De modo a criar a construção LC-ligante-nociceptina- espaçador-HN (SEQ ID39), 0 vector pCR4 codificando o ligante (SEQ ID33) é clivado com as enzimas de restrição BamRI + Sall.
Este vector clivado serve depois como receptor para inserção e ligação do ADN de LC/A (SEQ ID27) também clivado com
BamHl + SalI. O plasmideo de ADN resultante é então clivado com as enzimas de restrição BamRI + HindIII e o fragmento LC/A-ligante introduzido num vector igualmente clivado contendo um único local de clonagem múltipla para BamRI, SalI, Pstl e
HindIII, tal como o vector pMAL (NEB) . O ADN de HN/A (SEQ ID28) é então clivado com as enzimas de restrição PstI + HindIII e introduzido na construção pMAL-LC/A-ligante igualmente clivada. A construção final contém a ORF de LC-ligante-nociceptina-espaçador-HN (SEQ ID39) para expressão como uma proteina da sequência ilustrada em SEQ ID40. 99
Exemplo 28 - Preparação de uma proteína de fusão nociceptina-LC/A-HN/A (a nociceptina é N-terminal da cadela LC)
De modo a criar a construção nociceptina-espaçador-LC/A-Hn/A, um ligante do sorotipo A com a adição de um local de Factor Xa para activação, dispostos como BamHI-SalI-ligante-local de protease-ligante-Pstl-Xbal-codão de terminação-HindIII (SEQ ID34) é sintetizado como descrito no Exemplo 27. 0 vector pCR4 codificando o ligante é clivado com as enzimas de restrição BamHl + SalI. Este vector clivado serve, então, como recipiente para inserção e ligação do ADN de LC/A (SEQ ID27) também clivado com BamRI + Sal I. 0 plasmideo de ADN resultante é, então, clivado com as enzimas de restrição BamRI + HlndlII e o fragmento LC/A-ligante introduzido num vector igualmente clivado contendo a inserção de nociceptina apresentada no N-terminal sintetizada (SEQ ID35). Esta construção é então clivada com Aval + HindIII e introduzida num vector de expressão, tal como o plasmideo pMAL (NEB) . 0 ADN de HN/A (SEQ ID28) é então clivado com as enzimas de restrição PstI + HindIII e introduzido na construção pMAL-nociceptina-LC/A-ligante igualmente clivada. A construção final contém a ORF de nociceptina-espaçador-LC/A-HN/A (SEQ ID63) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID64. 100
Exemplo 29 - Preparação e purificação de uma família de proteínas de fusão LC/A-nociceptina-HN/A com comprimento de espaçador variável
Utilizando a mesma estratégia utilizada no Exemplo 19, foi preparada uma gama de ligantes de ADN que codificam nociceptina e conteúdo variável de espaçador. Utilizando uma variedade de ferramentas de software de retro-tradução [por exemplo, retro-tradução de E. coli EditSeq Best (DNASTAR Inc.) ou a ferramenta Backtranslation v2.0 (Entelechon)], é determinada a sequência de ADN que codifica a região ligante-ligando-espaçador. Sitios de restrição são, depois, incorporados na sequência de ADN e podem ser dispostos como BamHJ-SalI-ligante-local de protease-nociceptina-Spel-Pstl-Xfoal-codão de terminação-HindlII (SEQ ID65 a SEQ ID69). É importante assegurar que a grelha de leitura correcta é mantida para o espaçador, nociceptina e sequências de restrição e que a sequência de Xbal não é precedida pelas bases TC que resultaria numa metilação DAM. A sequência de ADN é rastreada para incorporação de sequência de restrição e quaisquer sequências adicionais são removidas manualmente da sequência restante garantindo que é mantida a utilização de codões de E. coli. A utilização de codões de E. coli é avaliada com referência a programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e o conteúdo de GC em % e a razão de utilização de codões são avaliados com referência a tabelas publicadas de utilização de codões (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004). Esta sequência de ADN optimizada é depois comercialmente sintetizada (por exemplo por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vector pCR4.
Os espaçadores que foram criados incluiam:
Tabela 2 101 Código Sequência proteica do ligante SEQ ID do ADN ligante GS10 ALAGGGGSALVLQ 53 GS15 ALAGGGGSGGGGSALVLQ 54 GS25 ALAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVLQ 55 GS30 ALAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVLQ 56 HX2 7 ALAAE AAAKE AAAKE AAAKAG GGGSALVLQ 57 A título de exemplo, de modo a criar a construção de fusão LC/A-CPN(GS15)-Hn/A (SEQ ID70), o vector pCR4 que codifica o ligante (SEQ ID66) é clivado com as enzimas de restrição BamRI + Sal I . Esse vector clivado serve então como vector recipiente para inserção e ligação do ADN de LC/A (SEQ ID27) também clivado com BamRI + SalI. 0 plasmídeo de ADN resultante é, então, clivado com as enzimas de restrição BamRI + HindlII e o fragmento de LC/A-ligante introduzido num vector igualmente clivado contendo um único local de clonagem múltipla para BamRI, Sall, PstI e HindlII, tal como o vector pMAL (NEB) . 0 ADN de HN/A (SEQ ID28) é, depois, clivado com as enzimas de restrição PstI + HindIII e introduzido na construção pMAL-LC/A-ligante igualmente clivada. A construção final contém a ORF de LC/A-CPN(GS15)-HN/A (SEQ ID70) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID71.
Como um exemplo adicional, para criar a construção da fusão LC/A-CPN(GS25)-Hn/A (SEQ ID72), o vector pCR4 codificando o ligante (SEQ ID67) é clivado com as enzimas de restrição BamRI + Sall. Esse vector clivado serve então como vector recipiente para inserção e ligação do ADN de LC/A (SEQ ID27) 102 também clivado com BamRI + SalI. O plasmídeo de ADN resultante é então clivado com as enzimas de restrição BamRI + HindIII e o fragmento LC/A-ligante introduzido num vector igualmente clivado contendo um único local de clonagem múltipla para BamRI, SalI, PstI e HindIII, tal como o vector pMAL (NEB) . O ADN de HN/A (SEQ ID28) é então clivado com as enzimas de restrição PstI + HindIII e introduzido na construção pMAL-LC/A-ligante igualmente clivada. A construção final contém a ORF de LC/A-CPN(GS25)-HN/A (SEQ ID72) para expressão como uma proteina da sequência ilustrada em SEQ ID73.
Variantes da fusão LC/A-CPN-Hn/A consistindo em GS10, GS30 e HX27 são criadas de forma semelhante. Utilizando a metodologia de purificação descrita no Exemplo 26, a proteina de fusão é purificada a partir de pasta celular de E. coli. A Figura 12 ilustra o produto purificado obtido no caso de LC/A-CPN(GS10)-Hn/A, LC/A-CPN(GS15)-Hn/A, LC/A-CPN(GS25)-HN/A, LC/A-CPN(GS30)-Hn/A e LC/A-CPN(HX27)-Hn/A.
Exemplo 30 - Avaliação da eficácia in vitro de uma fusão LC/A-nociceptina-HN/A A proteina de fusão preparada de acordo com os Exemplos 2 e 9 foi avaliada no modelo de célula neuronal eDRG.
Ensaios para a inibição da libertação de substância P e de clivagem de SNAP-25 foram previamente descritos (Duggan et al., 2002, J. Biol. Chem., 277, 34846-34852). Resumidamente, os neurónios dos gânglios da raiz dorsal são recolhidos a partir de ratos Sprague-Dawley fetais de 15 dias e as células dissociadas plaqueadas em placas de 24 poços revestidas com Matrigel a uma 103 densidade de 1 x IO6 células/poço. Um dia após o plaqueamento, as células são tratadas com 10 μΜ de β-D-arabinofuranósido de citosina durante 48 h. As células são mantidas em meio minimo essencial De Dulbecco suplementado com 5% de soro fetal bovino inactivado pelo calor, 5 mM de L-glutamina, 0,6% de Glucose, 2% de suplemento B27 e 100 ng/mL de factor de crescimento neuronal de rato 2.5S. As culturas são mantidas durante duas semanas a 37 °C em 95% de ar/5% de C02, antes da adição dos materiais de teste. A libertação da substância P de eDRG é avaliada por imunoensaio de adsorção ligado à enzima. Resumidamente, as células eDRG são lavadas duas vezes com solução salina equilibrada com niveis baixos de potássio (BSS: 5 mM de KC1, 137 mM de NaCl, 1,2 mM de MgCl 2,5 mM de Glucose, 0,44 mM de KH2P04, 20 mM de HEPES, pH 7,4, 2 mM de CaCl2) . Amostras basais são obtidas por incubação de cada poço durante 5 min. com 1 mL de BSS de baixo potássio. Após a remoção deste tampão, as células são estimuladas para libertar através de incubação com 1 mL de tampão de elevado potássio (BSS como acima com modificação para incluir 100 mM de KC1 isotonicamente equilibrado com NaCl) durante 5 min. Todas as amostras são removidas para tubos em gelo antes do ensaio da substância P. Os lisados celulares totais são preparados por adição de 250 pL de 2 M de ácido acético/0,1% de ácido trifluoroacético para lisar as células, evaporação centrífuga e ressuspensão em 500 pL de tampão de ensaio. As amostras diluidas são avaliadas quanto ao teor de substância P. A imunorreactividade da substância P é medida utilizando kits de imunoensaio enzimático de substância P (Cayman Chemical Company ou R & D Systems) de acordo com as instruções dos fabricantes. A substância P é expressa em pg/mL em relação a uma curva padrão de substância P em paralelo. 104 A análise SDS-PAGE e a transferência de Western foram realizadas utilizando protocolos convencionais (Novex). As proteinas SNAP-25 foram resolvidas num gel a 12% de Tris/glicina poliacrilamida (Novex) e, posteriormente, transferidas para membrana de nitrocelulose. As membranas foram testadas com um anticorpo monoclonal (SMI-81) que reconhece SNAP-25 clivada e intacta. A ligação específica foi visualizada utilizando anticorpos secundários conjugados com peroxidase e um sistema de detecção quimiluminescente. A clivagem de SNAP-25 foi quantificada por densitometria (Molecular Dynamics Personal SI, software de análise de dados ImageQuant). A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada de acordo com a fórmula: (SNAP-25 Clivada/(SNAP-25 Clivada + Intacta))xlOO.
Após a exposição de neurónios eDRG a uma fusão LC/A-nociceptina-HN/A (denominada CPN-A), a inibição da libertação de substância P e a clivagem de SNAP-25 são observadas (Figura 13) . Após 24 h de exposição à fusão, 50% do máximo de clivagem de SNAP-25 é atingido por uma concentração de fusão de 6,3 ± 2,5 nM. O efeito da fusão é também avaliado em momentos definidos após uma exposição de 16 h de eDRG a CPN-A. A Figura 14 ilustra a duração prolongada de acção da proteina de fusão CPN-A, sendo ainda observada actividade mensurável 28 dias após a exposição.
Exemplo 31 - Avaliação da eficácia in vitro de rama fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A 105 A proteína de fusão preparada de acordo com os Exemplos 8 e 9 foi avaliada no modelo de células neuronais eDRG utilizando o método descrito no Exemplo 30.
Após exposição de neurónios eDRG a uma fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A (denominada CPNv-A), a inibição da libertação de substância P e a clivagem de SNAP-25 são observadas. Após 24 h de exposição à fusão, 50% do máximo de clivagem de SNAP-25 é atingido por uma concentração de fusão de 1,4 ± 0,4 nM (Figura 15). O efeito da fusão é também avaliado em momentos definidos após uma exposição de 16 h de eDRG a CPN-A. A Figura 16 ilustra a duração prolongada de acção da proteína de fusão CPN-A, sendo ainda observada actividade mensurável 24 dias após a exposição. A capacidade de ligação da proteína de fusão CPNv-A é também avaliada em comparação com a fusão CPN-A. A Figura 17 ilustra os resultados de uma experiência de competição para determinar a eficácia de ligação no receptor ORL-1. Demonstra-se que a CPNv-A desloca a [3H]-nociceptina, confirmando assim que o acesso ao receptor é possível com o ligante no formato de apresentação central.
Exemplo 32 - Preparação de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A que é activada por tratamento com enterocinase 106
Seguindo os métodos utilizados nos Exemplos 1 e 2, LC/A (SEQ ID27) e HN/A (SEQ ID28) são criadas e introduzidas no ligante de nociceptina variante do sorotipo A dispostas como BamRI-Sall-ligante-enterocinase-local de protease-nociceptina variante-Spel-Pstl-Xfoal-codão de terminação-HindIII (SEQ ID74). A construção final contém as sequências da ORF de LC-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN (SEQ ID75) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID76. A proteína de fusão é denominada CPNv(Ek)-A. A Figura 18 ilustra a purificação de CPNv(Ek)-A de E. coli seguindo os métodos utilizados no Exemplo 26, mas utilizando enterocinase para activação a 0,00064 pg por 100 pg de proteína de fusão.
Exemplo 33 - Avaliação da eficácia in vitro de uma fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A que foi activada por tratamento com enterocinase A CPNv(Ek)-A preparada no Exemplo 32 é obtida numa forma purificada e aplicada ao modelo de células eDRG para avaliar a clivagem de SNAP-25 (utilizando a metodologia do Exemplo 30) . A Figura 19 ilustra a clivagem de SNAP-25 após 24 h de exposição de eDRG a CPNv(Ek)-A. A eficiência de clivagem é observada como sendo semelhante à alcançada com o material clivado com Factor Xa, como registado no Exemplo 31.
Exemplo 34 - Preparação de uma proteína de fusão LC/C-nociceptina variante-HN/C com um ligante activado por Factor Xa derivado do sorotipo A 107
Seguindo os métodos utilizados no Exemplo 21, LC/C (SEQ ID31) e HN/C (SEQ ID32) são criadas e introduzidas no ligante de nociceptina variante do sorotipo A dispostas como BarriRI-Sall-ligante--nociceptina variante-Miel-espaçador-Spel-
Pstl-Xfoal-codão de terminação-HindIII (SEQ ID77) . A construção final contém as sequências da ORF de LC-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN (SEQ ID78) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID79. A proteína de fusão é denominada CPNv-C (act. A) . A Figura 20 ilustra a purificação de CPNv-C (act. A) de E. coli seguindo os métodos utilizados no Exemplo 26.
Exemplo 35 - Avaliação da eficácia in vitro de uma proteína de fusão LC/C-nociceptina variante-HN/C
Seguindo os métodos utilizados no Exemplo 26, a CPNv-C (act. A) preparada no Exemplo 34 é obtida numa forma purificada e aplicada ao modelo de células eDRG para avaliar a clivagem de SNAP-25 (utilizando a metodologia do Exemplo 30). Após 24 h de exposição à fusão, é alcançado 50% do máximo de clivagem de sintaxina por uma concentração de fusão de 3,1 ± 2,0 nM. A
Figura 21 ilustra a clivagem da sintaxina após 24 h de exposição de eDRG a CPNv-C (act. A). 108
Exemplo 36 - Avaliação da eficácia in vivo de uma fusão LC/A-nociceptina-HN/A A capacidade de uma fusão LC/A-nociceptina-HN/A (CPN/A) para inibir a alodinia mecânica aguda induzida por capsaicina é avaliada após injecção intraplantar subcutânea na pata traseira de rato. Os animais de teste são avaliados quanto à frequência de retirada da pata (% de PWF) em resposta a uma série de estímulos de filamentos Von Frey 10 g (10 estímulos x 3 ensaios) antes de recrutamento para o estudo, após o tratamento subcutâneo com CPN/A mas antes da capsaicina e no seguimento de desafio de capsaicina após injecção de CPN/A (média de respostas a 15' e 30') . O desafio de capsaicina é realizado por injecção de 10 pL de uma solução a 0,3%. As diluições das amostras são preparadas em 0,5% de BSA/soro fisiológico. A Figura 22 ilustra a inversão da alodinia mecânica que é conseguida através de pré-tratamento dos animais com uma gama de concentrações da fusão LC/A-nociceptina-HN/A. A capacidade da fusão LC/A-nociceptina-HN/A (CPN/A) para inibir alodinia mecânica (táctil) induzida por estreptozotocina (STZ) em ratos é avaliada. A alodinia mecânica induzida por STZ em ratos é realizada por injecção de estreptozotocina (i.p. ou i.v.), que produz a destruição de células β pancreáticas conduzindo à perda da produção de insulina, com stress metabólico concomitante (hiperglicemia e hiperlipidemia). Como tal, a STZ induz diabetes Tipo I. Além disso, o tratamento com STZ leva ao desenvolvimento progressivo de neuropatia, que serve como um modelo de dor crónica com hiperalgesia e alodinia que pode reflectir os sinais observados em humanos diabéticos (neuropatia diabética periférica). 109
Ratos Sprague-Dawley machos (250-300 g) são tratados com 65 mg/kg de STZ em tampão citrato (I.V.) e a Glucose e lipídios sanguíneos são medidos semanalmente para definir a disponibilidade do modelo. O Limite de Retirada da Pata (PWT) é medido em resposta a uma série de estímulos de filamentos Von Frey durante um período de tempo. É dito que a alodinia se estabeleceu quando o PWT em duas datas de testes consecutivas (separadas por uma semana) mede abaixo de 6 g na escala. Neste ponto, os ratos são aleatorizados para um grupo soro fisiológico (controlo negativo de eficácia), grupo da gabapentina (controlo positivo de eficácia) ou um grupo de teste (CPN/A). Os materiais de ensaio (20-25 pL) são injectados por via subcutânea como uma única injecção (excepto gabapentina) e o PWT é medido 1 dia pós-tratamento e depois periodicamente durante um período de duas semanas. A gabapentina (30 mg/kg i.p. a 3 mL/kg de volume de injecção) é injectada diariamente, duas horas antes do início dos testes de PWT. A Figura 23 ilustra a reversão da alodinia alcançada pelo pré-tratamento dos animais com 750 ng de CPN/A. Os dados foram obtidos durante um período de duas semanas após uma única injecção de CPN/A.
Exemplo 37 - Avaliação da eficácia in vivo de uma fusão
LC/A-nociceptina variante-HN/A A capacidade de uma fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A (CPNv/A) para inibir a alodinia mecânica aguda induzida por capsaicina é avaliada após injecção intraplantar subcutânea na pata traseira de rato. Os animais de teste são avaliados quanto à frequência de retirada da pata (% de PWF) em resposta a uma série de estímulos de filamentos Von Frey 10 g (10 estímulos x 3 ensaios) antes de recrutamento para o estudo (Pré-Tratamento); após o tratamento intraplantar subcutâneo com CPNv/A mas antes 110 da capsaicina (pré-CAP); e no seguimento de desafio de capsaicina após injecção de CPNv/A (média de respostas a 15' e 30'). O desafio de capsaicina é realizado por injecção de 10 pL de uma solução a 0,3%. As diluições das amostras são preparadas em 0,5% de BSA/soro fisiológico. A Figura 24 ilustra a reversão da alodinia mecânica que é conseguida através de pré-tratamento dos animais com uma gama de concentrações da fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A em comparação com a reversão conseguida com a dição da fusão LC/A-nociceptina-HN/A. Estes dados são expressos como uma diferença normalizada da frequência de retirada da pata, na qual a diferença entre o pico de resposta (pós-capsaicina) e da resposta de base (pré-capsaicina) é expressa como uma percentagem. Com esta análise, pode-se verificar que CPNv/A é mais potente que a CPN/A uma vez que é necessária uma dose menor de CPNv/A para conseguir o efeito analgésico semelhante àquele observado com CPN/A.
Exemplo 38 - Preparação de uma proteína de fusão
LC/A-leu-encefalina-HN/A
Devido ao pequeno tamanho, cinco aminoácidos do ligando leu-encefalina a fusão LC/A-leu-encefalina-HN/A é criada por mutagénese dirigida [por exemplo, utilizando Quickchange (Stratagene Inc.)] utilizando a fusão LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID39) como um molde. São concebidos oligonucleótidos que codificam o péptido leu-encefalina YGGFL, assegurando que a utilização de codões padrão de E. coli é mantida e que não são incorporados locais de restrição adicionais, flanqueados por sequências complementares à região do ligante da fusão LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID39) de cada lado da secção de 111 nociceptina. 0 produto SDM é verificado por sequenciação e a construção final contendo a ORF de LC-ligante-leu-encefalina-espaçador-HN (SEQ ID80) para expressão como uma proteina da sequência ilustrada em SEQ ID81. A proteina de fusão é denominada CPLE-A. A Figura 25 ilustra a purificação de CPLE-A de E. coli seguindo os métodos utilizados no Exemplo 26.
Exemplo 39 - Expressão e purificação de uma proteina de
fusão LC/A-beta-endorfina-HN/A
Seguindo os métodos utilizados no Exemplo 26, e com a proteina de fusão LC/A-beta-endorfina-HN/A (denominada CPBE-A) criada no Exemplo 24, a CPBE-A é purificada de E. coli. A Figura 26 ilustra a proteina purificada como analisada por SDS-PAGE.
Exemplo 40 - Preparação de uma proteina de fusão LC/A-nociceptina mutante-HN/A
Devido à alteração de um único aminoácido necessária para transformar a sequência de nociceptina na posição 1 de Phe para Tyr, a fusão LC/A-nociceptina mutante-HN/A é criada por mutagénese dirigida [por exemplo, utilizando Quickchange (Stratagene Inc.)] utilizando a fusão LC/A-nociceptina mutante-Hn/A (SEQ ID39) como um molde. São concebidos oligonucleótidos que codificam a tirosina na posição 1 da sequência de nociceptina, assegurando que a utilização de codões padrão de E. coli é mantida e que não são incorporados locais de restrição adicionais, flanqueados por sequências complementares à região do ligante da fusão LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID39) de cada lado da secção de nociceptina. 0 produto SDM é verificado por 112 sequenciação e a construção final contendo a ORF de LC/A-nociceptina mutante-espaçador-HN/A (SEQ ID82) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID83. A proteína de fusão é denominada CPOP-A. A Figura 27 ilustra a purificação de CPOP-A de E. coli seguindo os métodos utilizados no Exemplo 26.
Exemplo 41 - Preparação e avaliação de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina variante mutante-HN/A
Devido à alteração de um único aminoácido necessária para transformar a sequência de nociceptina na posição 1 de Phe para Tyr, a fusão LC/A-nociceptina variante mutante-HN/A é criada por mutagénese dirigida [por exemplo, utilizando Quickchange (Stratagene Inc.)] utilizando a fusão LC/A-nociceptina variante-Hn/A (SEQ ID51) como um molde. São concebidos oligonucleótidos que codificam a tirosina na posição 1 da sequência de nociceptina, assegurando que a utilização de codões padrão de E. coli é mantida e que não são incorporados locais de restrição adicionais, flanqueados por sequências complementares à região do ligante da fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A (SEQ ID51) de cada lado da secção de nociceptina. 0 produto SDM é verificado por sequenciação e a construção final contendo a ORF de LC/A-nociceptina mutante-espaçador-HN/A (SEQ ID84) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID85. A proteína de fusão é denominada CPOPv-A. A Figura 28 ilustra a purificação de CPOPv-A de E. coli seguindo os métodos utilizados no Exemplo 26.
Utilizando a metodologia descrita no Exemplo 30, CPOPv-A é avaliada quanto à sua capacidade de clivar SNAP-25 no modelo de células eDRG. A Figura 29 ilustra que CPOPv-A é capaz de clivar 113 SNAP-25 no modelo eDRG, conseguindo 50% do máximo de clivagem de SNAP-25 após a exposição das células a cerca de 5, 9 nM de fusão durante 24 h.
Exemplo 42 - Preparação de uma proteína de fusão protease de IgA-nociceptina variante-HN/A A sequência de aminoácidos da protease de IgA foi obtida de fontes disponíveis gratuitamente, tal como GenBank (número de acesso P09790). Informações relativamente à estrutura do gene da protease de IgA de N. Gonorrhoeae estão disponíveis na literatura (Pohlner et al. , Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease, Nature, 1987, 325 (6103), 458-62). Utilizando a ferramenta
Backtranslation v2.0 (Entelechon), foi determinada a sequência de ADN que codifica a protease de IgA modificada para expressão em E. coli. Uma sequência de reconhecimento BamRI foi incorporada na extremidade 5' e um codão que codifica um aminoácido cisteína e a sequência de reconhecimento SalI foram incorporados na extremidade 3' do ADN de IgA. A sequência de ADN foi rastreada utilizando MapDraw (DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem de enzimas de restrição incorporadas durante a retro-tradução. Quaisquer sequências de clivagem que fossem comuns àquelas requeridas pelo sistema de clonagem foram removidas manualmente da sequência codificante proposta, assegurando que era mantida a utilização comum de codões de E. coli. A utilização de codões de E. coli é avaliada com Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e o conteúdo de GC em % e a razão de utilização de codões avaliados com referência a tabelas publicadas de utilização de codões. Esta sequência de ADN optimizada (SEQ ID86) contendo a grelha de leitura aberta de IgA (ORF) é então sintetizada comercialmente. 114 A IgA (SEQ ID86) é introduzida na ORF de LC-ligante-nociceptina variante-HN (SEQ ID51) utilizando as enzimas de restrição BamRI e SalI para substituir LC com o ADN da protease de IgA. A construção final contém a ORF de IgA-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN (SEQ ID87) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID88.
Exemplo 43 - Preparação e avaliação de uma proteína de fusão de endopeptidase dirigida a nociceptina com um marcador de purificação de histidina removível.
Foi preparado ADN que codifica um marcador His removível por Factor Xa (his6), embora seja claro que locais de proteases alternativos, tal como enterocinase, e marcadores de purificação alternativos, tal como marcadores de histidina mais longos, são também possíveis. Utilizando uma de uma variedade de ferramentas de software de retro-tradução [por exemplo, retro-tradução de E. coli EditSeq Best (DNASTAR Inc.) ou a ferramenta Backtranslation v2.0 (Entelechon)], a sequência de ADN que codifica da região de marcador His do Factor Xa é determinada. Sítios de restrição são depois incorporados na sequência de ADN e podem ser dispostos como A7heI-ligante-SpeI-PstI-HN/A-XbaI-LEIEGRSGHHHHHH-codão de terminação-HindlII (SEQ ID89). A sequência de ADN é rastreada para sequências de restrição incorporadas e quaisquer sequências adicionais são removidas manualmente da sequência restante, assegurando que era mantida a utilização comum de codões de E. coli. A utilização de codões de E. coli é avaliada com referência a programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e o conteúdo de GC em % e a razão de utilização de codões avaliados com referência a tabelas publicadas de utilização de codões (por exemplo, 115
GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de
ADN optimizada é depois comercialmente sintetizada (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vector pCR4. De modo a criar CPNv-A-FXa-HT (SEQ ID90, construção de marcador his removível), o vector pCR4 que codifica o marcador His removível é clivado com NheI e HindIII. O fragmento Nhel-HindIII é depois introduzido no vector LC/A-CPNv-Hn/A (SEQ ID51), que também foi clivado por NheI e HindIII. A construção final contém as sequências da ORF de LC/A-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN-FXa-marcador His-HíndIII (SEQ ID90) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID91. A Figura 30 ilustra a purificação de CPNv-A-FXa-HT de E. coli seguindo os métodos utilizados no Exemplo 26.
Exemplo 44 - Preparação de uma proteína de fusão de endopeptidase dirigida a leu-encefalina contendo um domínio de translocação derivado da toxina da difteria A sequência de ADN é concebida por retro-tradução da sequência de aminoácidos do domínio de translocação da toxina da difteria (obtida de fontes de dados disponíveis gratuitamente, tal como GenBank (número de acesso 1XDTT) utilizando uma de uma variedade de ferramentas de software de retro-tradução [por exemplo, retro-tradução de E. coli EditSeq Best (DNASTAR Inc.), ou a ferramenta Backtranslation v2.0 (Entelechon)]. Locais de restrição são depois incorporados na sequência de ADN e podem ser dispostos como WheJ-ligante-Spel-PstI-domínio de translocação da difteria-Xbal-codão de terminação-HindIII (SEQ ID92). As sequências de reconhecimento Pstl/Xbal são incorporadas nas extremidades 5' e 3' do domínio de 116 translocação, respectivamente, da sequência, mantendo a grelha de leitura correcta. A sequência de ADN é rastreada (utilizando software como MapDraw, DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem de enzimas de restrição incorporadas durante a retro-tradução. Quaisquer sequências de clivagem que fossem comuns àquelas requeridas pelo sistema de clonagem foram removidas manualmente da sequência codificante proposta, assegurando que era mantida a utilização comum de codões de E. coli. A utilização de codões de E. coli é avaliada com referência a programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e o conteúdo de GC em % e a razão de utilização de codões avaliados com referência a tabelas publicadas de utilização de codões (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de ADN optimizada com o dominio de translocação da difteria é depois sintetizada comercialmente como Nhel-ligante-Spel-PstI-domínio de translocação da difteria-Xbal-codão de terminação-Hindlll (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vector pCR4 (Invitrogen). O vector pCR4 que codifica o domínio de translocação da difteria é clivado com Nhel e Xfoal. O fragmento Nhel-Xbal é introduzido no vector LC/A-CPLE-Hn/A (SEQ ID80), que foi também clivado por Nhel e Xba1. A construção final contém as sequências da ORF de LC/A-leu-encefalina-espaçador-domínio de translocação da difteria (SEQ ID93) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID94. 117
Exemplo 45 - Preparação de uma proteína de fusão de endopeptidase dirigida a nociceptina variante contendo um domínio LC derivado da toxina tetânica. A sequência de ADN é concebida por retro-tradução da sequência de aminoácidos LC da toxina tetânica (obtida de fontes de dados disponiveis gratuitamente, tal como GenBank (número de acesso X04436) utilizando uma de uma variedade de ferramentas de software de retro-tradução [por exemplo, retro-tradução de E. coli EditSeq Best (DNASTAR Inc.), ou a ferramenta Backtranslation v2.0 (Entelechon)]] . As sequências de reconhecimento BamHI/SalI são incorporadas nas extremidades 5' e 3' da sequência, mantendo a grelha de leitura correcta. A sequência de ADN é rastreada (utilizando software como MapDraw, DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem de enzimas de restrição incorporadas durante a retro-tradução. Quaisquer sequências de clivagem que fossem comuns àquelas requeridas pelo sistema de clonagem foram removidas manualmente da sequência codificante proposta, assegurando que era mantida a utilização comum de codões de E. coli. A utilização de codões de E. coli é avaliada com referência a programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e o conteúdo de GC em % e a razão de utilização de codões avaliados com referência a tabelas publicadas de utilização de codões (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de ADN optimizada contendo a grelha de leitura aberta (ORF) LC da toxina tetânica é sintetizada comercialmente (por exemplo, Entelechon, Geneart ou Sigma- Genosys) e é proporcionada no vector pCR4 (Invitrogen). O vector pCR4 que codifica o LC TeNT é também clivado por BamHI e Sall. O fragmento BamHI-SalI é, depois, introduzido no vector LC/A-CPNv-Hn/A (SEQ ID51) que foi também clivado por BamHI e Sall. A construção final contém as sequências da ORF de TeNT LC-ligante-nociceptina 118 variante-espaçador-HN (SEQ ID96) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID97.
Exemplo 46 - Preparação de uma proteína de fusão LC/C-nociceptina variante-HN/C com um ligante do sorotipo C nativo que é susceptível à clivagem do Factor Xa
Seguindo os métodos utilizados no Exemplo 21, LC/C (SEQ ID31) e HN/C (SEQ ID32) são criadas e introduzidas no ligante de nociceptina variante do sorotipo C dispostas como BamHI-SalI-ligante-nociceptina variante-Whel-espaçador-Spel-PstI-Xbal-codão de terminação-ffindIII (SEQ ID98). A construção final contém as sequências da ORF LC-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN (SEQ ID99) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada em SEQ ID100. A proteína de fusão é denominada CPNv-C (act. C). 119
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Health Protection Agency Allergan, Inc.
Chaddock, John Foster, Keith Penn, Charles Aoki, K Roger Francis, Joseph Steward, Lance <120> Conjugados de toxina redirigidos
<130> P27211W0/MRM <150> GBO42 63 94.3 <151> 2004-12-01 <160> 100
<170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 1 51 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat tagctaacca g 120
<210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 2
Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ala Asn 15 10 15
Gin
<210> 3 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 3 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcg 33 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético 121 <4Ο0> 4
Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala 15 10
<210> 5 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 5 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatat gcg 33 <210> 6 <211> 11 <212> PRT A cn \—1 cn V Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 6
Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Tyr Ala 15 10 <210> 7 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético 122 <4Ο0> 7 33 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca tat
<210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 8
Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Tyr 15 10
<210> 9 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 9 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat atgctaacca g 51
<210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> 123 <223> Sintético <4 0 0> 10
Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Tyr Ala Asn 15 10 15
Gin
<210> 11 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 11 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaa 39
<210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 12
Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys 15 10 <210> 13 124 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <4 0 0> 13 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaac gcaaaaacca g 51 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 14
Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Arg Lys Asn 15 10 15
Gin <210> 15 <211> 2736 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 15 125 ctcgggattg agggtcgttt tggcggtttc ac999c9cac gcaaatcagc gcgtaaatta 60 gctaaccaga ctagtggcgg tgggggtagt ggcggtggcg gttcgggcgg gggtgggagc 120 cctaggggat ccatggagtt cgttaacaaa cagttcaact ataaagaccc agttaacggt 180 gttgacattg cttacatcaa aatcccgaac gctggccaga tgcagccggt aaaggcattc 240 aaaatccaca acaaaatctg ggttatcccg gaacgtgata cctttactaa cccggaagaa 300 ggtgacctga acccgccacc ggaagcgaaa caggtgccgg tatcttacta tgactccacc 360 tacctgtcta ccgataacga aaaggacaac tacctgaaag gtgttactaa actgttcgag 420 cgtatttact ccaccgacct gggccgtatg ctgctgacta gcatcgttcg cggtatcccg 480 ttctggggcg gttctaccat cgataccgaa ctgaaagtaa tcgacactaa ctgcatcaac 540 gttattcagc cggacggttc ctatcgttcc gaagaactga acctggtgat catcggcccg 600 tctgctgata tcatccagtt cgagtgtaag agctttggtc acgaagttct gaacctcacc 660 cgtaacggct acggttccac tcagtacatc cgtttctctc cggacttcac cttcggtttt 720 gaagaatccc tggaagtaga cacgaaccca ctgctgggcg ctggtaaatt cgcaactgat 780 cctgcggtta ccctggctca cgaactgatt catgcaggcc accgcctgta cggtatcgcc 840 atcaatccga accgtgtctt caaagttaac accaacgcgt attacgagat gtccggtctg 900 gaagttagct tcgaagaact gcgtactttt ggcggtcacg acgctaaatt catcgactct 960 ctgcaagaaa acgagttccg tctgtactac tataacaagt tcaaagatat cgcatccacc 1020 ctgaacaaag cgaaatccat cgtgggtacc actgctfcctc tccagtacat gaagaacgtt 1080 tttaaagaaa aatacctgct cagcgaagac acctccggca aattctctgt agacaagttg 1140 aaattcgata aactttacaa aatgctgact gaaatttaca ccgaagacaa cttcgttaag 1200 ttctttaaag ttctgaaccg caaaacctat ctgaacttcg acaaggcagt attcaaaatc 1260 aacatcgtgc cgaaagttaa ctacactatc tacgatggtt tcaacctgcg taacaccaac 1320 ctggctgcta attttaacgg ccagaacacg gaaatcaaca acatgaactt cacaaaactg 1380 aaaaacttca ctggtctgtt cgagttttac aagctgctgt gcgtcgacgg catcattacc 1440 tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga aacaaagcgc tgaacgacct ctgtatcaag 1500 gttaacaact gggatttatt cttcagcccg agtgaagaca acttcaccaa cgacctgaac 1560 126 aaaggtgaag aaatcacctc agatactaac atcgaagcag ccgaagaaaa catctcgctg 1620 gacctgatcc agcagtacta cctgaccttt aatttcgaca acgagccgga aaacatttct 1680 atcgaaaacc tgagctctga tatcatcggc cagctggaac tgatgccgaa catcgaacgt 1740 ttcccaaacg gtaaaaagta cgagctggac aaatatacca tgttccacta cctgcgcgcg 1800 caggaatttg aacacggcaa atcccgtatc gcactgacta actccgttaa cgaagctctg 1860 ctcaacccgt cccgtgtata caccttcttc tctagcgact acgtgaaaaa ggtcaacaaa 1920 gcgactgaag ctgcaatgtt cttgggttgg gttgaacagc ttgtttatga ttttaccgac 1980 gagacgtccg aagtatctac taccgacaaa attgcggata tcactatcat catcccgtac 2040 atcggtccgg ctctgaacat tggcaacatg ctgtacaaag acgacttcgt tggcgcactg 2100 atcttctccg gtgcggtgat cctgctggag ttcatcccgg aaatcgccat cccggtactg 2160 ggcacctttg ctctggtttc ttacattgca aacaaggttc tgactgtaca aaccatcgac 2220 aacgcgctga gcaaacgtaa cgaaaaatgg gatgaagttt acaaatatat cgtgaccaac 2280 tggctggcta aggttaatac tcagatcgac ctcatccgca aaaaaatgaa agaagcactg 2340 gaaaaccagg cggaagctac caaggcaatc attaactacc agtacaacca gtacaccgag 2400 gaagaaaaaa acaacatcaa cttcaacatc gacgatctgt cctctaaact gaacgaatcc 2460 atcaacaaag ctatgatcaa catcaacaag ttcctgaacc agtgctctgt aagctatctg 2520 atgaactcca tgatcccgta cggtgttaaa cgtctggagg acttcgatgc gtctctgaaa 2580 gacgccctgc tgaaataeat ttacgacaac cgtggcactc tgatcggtca ggttgatcgt 2640 ctgaaggaca aagtgaacaa taccttatcg accgacatcc cttttcagct cagtaaatat 2700 gtcgataacc aacgcctttt gtccactcta gactag 2736
<210> 16 <211> 911 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético 127 <4 Ο 0> 16
Leu Gly Ile Glu Gly Arg phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser 15 10 15
Ala Arg Lys Leu Ala Asn Gin Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg Gly Ser Met Glu Phe Vai 35 40 45 Asn Lys 50 Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Vai Asn Gly Vai Asp ile Ala 55 60 Tyr Ile 65 Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gin Met Gin Pro Vai Lys Ala Phe 70 75 80 Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Vai Ile Pro Glu Arg Asp Thr Phe Thr 85 90 95
Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu Ala Lys Gin Vai 100 105 110 Pro Vai Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr Asp Asn Glu Lys 115 120 125
Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Vai Thr Lys Leu Phe Glu Arg Ile Tyr Ser 130 135 140 Thr Asp 145 Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Vai Arg Gly Ile Pro 150 155 160 Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys Vai Ile Asp Thr 165 170 175 Asn Cys Ile Asn Vai Ile Gin Pro Asp Gly Ser Tyr Arg Ser Glu Glu 180 185 190
Leu Asn Leu Vai Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile Ile Gin Phe Glu 195 200 205 Cys Lys 210 Ser Phe Gly His Glu Vai Leu Asn Leu Thr Arg Asn Gly Tyr 215 220 128
Gly Ser Thr Gin Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe Thr Phe Gly Phe 225 230 235 240 Glu Glu Ser Leu Glu Vai Asp Thr Asn Pro Leu Leu Gly Ala Gly Lys 245 250 255 Phe Ala Thr Asp Pr o Ala Vai Thr Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala 260 265 270 Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn Arg Vai Phe Lys 275 280 285 Vai Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu Glu Vai Ser Phe 290 295 300 Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys Phe Ile Asp Ser 305 310 315 320 Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn Lys Phe Lys Asp 325 330 335 lie Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Vai Gly Thr Thr Ala 340 345 350 Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Vai Phe Lys Glu Lys Tyr Leu Leu Ser 355 360 365 Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Vai Asp Lys Leu Lys Phe Asp Lys 370 375 380 Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp Asn Phe Vai Lys 385 390 395 400 Phe Phe Lys Vai Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn Phe Asp Lys Ala 405 410 415 Vai Phe Lys Ile Asn Ile Vai Pro Lys Vai Asn Tyr Thr Ile Tyr Asp 420 425 430
Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn Phe Asn Gly Gin 435 440 445 129
Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn 450 455
Phe Thr Lys Leu Lys Asn Phe Thr 460
Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu 465 470
Leu Cys Vai Asp Gly Ile Ile Thr 475 480
Ser Lys Thr Lys Ser Leu Ile Glu 485
Gly Arg Asn Lys Ala Leu Asn Asp 490 495
Leu Cys Ile Lys Vai Asn Asn Trp 500
Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu 505 510
Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn 515 520
Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp 525
Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu 530 535
Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gin 540
Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe 545 550
Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser 555 560
Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile 565
Ile Gly Gin Leu Glu Leu Met Pro 570 575
Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly 580
Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr 585 590
Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala 595 600
Gin Glu Phe Glu His Gly Lys Ser 605
Arg lie Ala Leu Thr Asn Ser Vai 610 615
Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser 620
Arg Vai Tyr Thr Phe Phe Ser Ser 625 630
Asp Tyr Vai Lys Lys Vai Asn Lys 635 640
Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu 645
Gly Trp Vai Glu Gin Leu Vai Tyr 650 655
Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu 660
Vai Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala 665 670 130
Asp Ile Thr Ile Ile lie Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn lie Gly 675 680 685
Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Vai Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly 690 695 700
Ala Vai Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala Ile Pro Vai Leu 705 710 715 720
Gly Thr Phe Ala Leu Vai Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Vai Leu Thr Vai 725 730 735
Gin Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu 740 745 750
Vai Tyr Lys Tyr Ile Vai Thr Asn Trp Leu Ala Lys Vai Asn Thr Gin 755 760 765
Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala 770 775 780
Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu 785 790 795 800
Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys 805 810 815
Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu 820 825 830
Asn Gin Cys Ser Vai Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly 835 840 845
Vai Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu 850 855 860
Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gin Vai Asp Arg 865 870 875 880
Leu Lys Asp Lys Vai Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gin 885 890 895
Leu Ser Lys Tyr Vai Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser Thr Leu Asp 900 905 910 131
<210> 17 <211> 2700 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <4 0 0> 17 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca tatactagtc gcggtggggg tagtggcggt 60 ggcggttcgg gcgggggtgg gagccctagg ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc 120 aactataaag acccagttaa cggtgttgac attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc 180 cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt 240 gataccttta ctaacccgga agaaggtgac ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg 300 ccggtatctt actatgactc cacctacctg tctaccgata acgaaaagga caactacctg 360 aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt tactccaccg acctgggccg tatgctgctg 420 actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa 480 gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa 540 ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt 600 ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac ggctacggtt ccactcagta catccgtttc 660 tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa tccctggaag tagacacgaa cccactgctg 720 ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca 780 ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac 840 gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt 900 cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac 960 aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct 1020 tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc 1080 ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt 1140 tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac 1200 ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat 1260 ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct gctaatttta acggccagaa cacggaaatc 1320 aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg 1380 132 1440 ctgtgcgtcg acggcatcat gcgctgaacg acctctgtat gacaacttca ccaacgacct gcagccgaag aaaacatctc gacaacgagc cggaaaacat gaactgatgc cgaacatcga accatgttcc actacctgcg actaactccg ttaacgaagc gactacgtga aaaaggtcaa cagcttgttt atgattttac gatatcacta tcatcatccc aaagacgact tcgttggcgc ccggaaatcg ccatcccggt gttctgactg tacaaaccat gtttacaaat atatcgtgac cgcaaaaaaa tgaaagaagc taccagtaca accagtacac ctgtcctcta aactgaacga aaccagtgct ctgtaagcta gaggacttcg atgcgtctct actctgatcg gtcaggttga atcccttttc agctcagtaa
<210> 18 <211> 899 <212> PRT tacctccaaa actaaatctc caaggttaac aactgggatt gaacaaaggt gaagaaatca gctggacctg atccagcagt ttctatcgaa aacctgagct acgtttccca aacggtaaâa cgcgcaggaa tttgaacacg tctgctcaac ccgtcccgtg caaagcgact gaagctgcaa cgacgagacg tccgaagtat gtacatcggt ccggctctga actgatcttc tccggtgcgg actgggcacc tttgctctgg cgacaacgcg ctgagcaaac caactggctg gctaaggtta actggaaaac caggcggaag cgaggaagaa aaaaacaaca atccatcaac aaagctatga tctgatgaac tccatgatcc gaaagacgcc ctgctgaaat tcgtctgaag gacaaagtga atatgtcgat aaccaacgcc 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 tgatagaagg tagaaacaaa tattcttcag cccgagtgaa cctcagatac taacatcgaa actacctgac ctttaatttc ctgatatcat cggccagctg agtacgagct ggacaaatat gcaaatcccg tatcgcactg tatacacctt cttctctagc tgttcttggg ttgggttgaa ctactaccga caaaattgcg acattggcaa catgctgtac tgatcctgct ggagttcatc tttcttacat tgcaaacaag gtaacgaaaa atgggatgaa atactcagat cgacctcatc ctaccaaggc aatcattaac tcaacttcaa catcgacgat tcaacatcaa caagttcctg cgtacggtgt taaacgtctg acatttacga caaccgtggc acaatacctt atcgaccgac ttttgtccac tctagactag <213> Sequência Artificial 133 <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 18
Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Tyr Thr Ser Gly Gly Gly 15 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg Gly Ser 20 25 30
Met Glu Phe Vai Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Vai Asn Gly 35 40 45
Vai Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gin Met Gin Pro 50 55 60
Vai Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Vai Ile Pro Glu Arg 65 70 75 80
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 85 90 95
Ala Lys Gin Vai Pro Vai Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 100 105 110
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Vai Thr Lys Leu Phe Glu 115 120 125
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Vai 130 135 140
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 145 150 155 160
Vai Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Vai Ile Gin Pro Asp Gly Ser Tyr 165 170 175
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Vai Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 180 185 190
Ile Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Vai Leu Asn Leu Thr 195 200 205 134
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 210 215 220
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Vai Asp Thr Asn Pro Leu Leu 225 230 235 240
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Vai Thr Leu Ala His Glu 245 250 255
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 260 265 270
Arg Vai Phe Lys Vai Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 275 280 285
Glu Vai Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 290 295 300
Phe Ile Asp Ser Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 305 310 315 320
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Vai 325 330 335
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Vai Phe Lys Glu Lys 340 345 350
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Vai Asp Lys Leu 355 360 365
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 370 375 380
Asn Phe Vai Lys Phe Phe Lys Vai Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 385 390 395 400
Phe Asp Lys Ala Vai Phe Lys Ile Asn Ile Vai Pro Lys Vai Asn Tyr 405 410 415
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 420 425 430
Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 435 440 445 135
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu 450 455
Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Vai Asp 460
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys 465 470
Ser Leu Ile Glu Gly Arg Asn Lys 475 480
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys 485
Vai Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe 490 495
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr 500
Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu 505 510
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu 515 520
Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu 525
Asp Leu Ile Gin Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro 530 535 540
Glu Asn Ile Ser lie Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gin Leu 545 550 555 560
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu 565 570 575
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gin Glu Phe Glu 580 585 590
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Vai Asn Glu Ala Leu 595 600 605
Leu Asn Pro Ser Arg Vai Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Vai Lys 610 615 620
Lys Vai Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Vai Glu 625 630 635 640
Gin Leu Vai Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Vai Ser Thr Thr 645 650 655
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala 660 665 670
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Vai Gly Ala Leu 675 680 685 136
Ile Phe Ser Gly Ala Vai Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala 690 695 700
Ile Pro Vai Leu Gly Thr Phe Ala Leu Vai Ser Tyr Ile Ala Asn Lys 705 710 715 720
Vai Leu Thr Vai Gin Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu 725 730 735
Lys Trp Asp Glu Vai Tyr Lys Tyr Ile Vai Thr Asn Trp Leu Ala Lys 740 745 750
Vai Asn Thr Gin Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu 755 760 765
Glu Asn Gin Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gin Tyr Asn 770 775 780
Gin Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp 785 790 795 800
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile 805 810 815
Asn Lys Phe Leu Asn Gin Cys Ser Vai Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met 820 825 830
Ile Pro Tyr Gly Vai Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys 835 840 845
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Ile Pro Phe Gin Leu Ser Lys Tyr Vai Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser 885 890 895
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Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125
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Gin
<210> 23 <211> 2676 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 23 atgccaataa caattaacaa ctttaattat tcagatcctg ttgataataa aaatatttta 60 tatttagata ctcatttaaa tacactagct aatgagcctg aaaaagcctt tcgcattaca 120 ggaaatatat gggtaatacc tgatagattt tcaagaaatt ctaatccaaa tttaaataaa 180 cctcctcgag ttacaagccc taaaagtggt tattatgatc ctaattattt gagtactgat 240 tctgacaaag atacattttt aaaagaaatt ataaagttat ttaaaagaat taattctaga 300 gaaataggag aagaattaat atatagactt tcgacagata taccctttcc tgggaataac 360 aatactccaa ttaatacctt tgattttgat gtagatttta acagtgttga tgttaaaact 420 agacaaggta acaactgggt taaaactggt agcataaatc ctagtgttat aataactgga 480 cctagagaaa acattataga tccagaaact tctacgttta aattaactaa caataccttt 540 gcggcacaag aaggatttgg tgctttatca ataatttcaa tatcacctag atttatgcta 600 acatatagta atgcaactaa tgatgtagga gagggtagat tttctaagtc tgaattttgc 660 atggatccaa tactaatttt aatgcatgaa cttaatcatg caatgcataa tttatatgga 720 atagctatac caaatgatca aacaatttca tctgtaacta gtaatatttt ttattctcaa 780 tataatgtga aattagagta tgcagaaata tatgcatttg gaggtccaac tatagacctt 840 attcctaaaa gtgcaaggaa atattttgag gaaaaggcat tggattatta tagatctata 900 gctaaaagac ttaatagtat aactactgca aatccttcaa gctttaataa atatataggg 960 gaatataaac agaaacttat tagaaagtat agattcgtag tagaatcttc aggtgaagtt 1020 150 1080 acagtaaatc gtaataagtt tgttgagtta tataatgaac ttacacaaat atttacagaa tttaactacg ctaaaatata taatgtacaa aataggaaaa tatatctttc aaatgtatat 1140 actccggtta cggcgaatat attagacgat aatgtttatg atatacaaaa tggatttaat 1200 atacctaaaa gtaatttaaa tgtactattt atgggtcaaa atttatctcg aaatccagca 1260 ttaagaaaag tcaatcctga aaatatgctt tatttattta caaaattttg tcataaagca 1320 atagatggta gatcattata taataaaaca ttagattgta gagagctttt agttaaaaat 1380 actgacttac cctttatagg tgatattagt gatgttaaaa ctgatatatt tttaagaaaa 1440 gatattaatg aagaaactga agttatatac tatccggaca atgtttcagt agatcaagtt 1500 attctcagta agaatacctc agaacatgga caactagatt tattataccc tagtattgac 1560 agtgagagtg aaatattacc aggggagaat caagtctttt atgataatag aactcaaaat 1620 gttgattatt tgaattctta ttattaccta gaatctcaaa aactaagtga taatgttgaa 1680 gattttactt ttacgagatc aattgaggag gctttggata atagtgcaaa agtatatact 1740 tactttccta cactagctaa taaagtaaat gcgggtgttc aaggtggttt atttttaatg 1800 tgggcaaatg atgtagttga agattttact acaaatattc taagaaaaga tacattagat 1860 aaaatatcag atgtatcagc tattattccc tatataggac ccgcattaaa tataagtaat 1920 tctgtaagaa gaggaaattt tactgaagca tttgcagtta ctggtgtaac tattttatta 1980 gaagcatttc ctgaatttac aatacctgca cttggtgcat ttgtgattta tagtaaggtt 2040 caagaaagaa acgagattat taaaactata gataattgtt tagaacaaag gattaagaga 2100 tggaaagatt catatgaatg gatgatggga acgtggttat ccaggattat tactcaattt 2160 aataatataa gttatcaaat gtatgattct ttaaattatc aggcaggtgc aatcaaagct 2220 aaaatagatt tagaatataa aaaatattca ggaagtgata aagaaaatat aaaaagtcaa 2280 gttgaaaatt taaaaaatag tttagatgta aaaatttcgg aagcaatgaa taatataaat 2340 aaatttatac gagaatgttc cgtaacatat ttatttaaaa atatgttacc taaagtaatt 2400 gatgaattaa atgagtttga tcgaaatact aaagcaaaat taattaatct tatagatagt 2460 cataatatta ttctagttgg tgaagtagat aaattaaaag caaaagtaaa taatagcttt 2520 caaaatacaa taccctttaa tattttttca tatactaata attctttatt aaaagatata 2580 attaatgaat atttcaatgg cggtgggggt agtggcggtg gcggttcggg cgggggtggg 2640 agctttggcg gtttcacggg cgcacgcaaa tcagcg 2676 151 <210> 24 <211> 892 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 24
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Ser Asp Lys Asp Thr Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg 85 90 95
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Leu Asp Lys Ile Ser Asp Vai Ser Ala lie Ile Pro Tyr Ile Gly Pro 660 665 670
Ala Leu Asn Ile Ser Asn Ser Vai Arg Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala 675 680 685
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<210> 27 <211> 1302 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 27 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tottcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctaogat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg ac 1302 162
<210> 28 <211> 1257 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 28 ctgcagtgta tcaaggttaa caactgggat ttattcttca gcccgagtga agacaacttc 60 accaacgacc tgaacaaagg tgaagaaatc acctcagata ctaacatcga agcagccgaa 120 gaaaacatct cgctggacct gatccagcag tactacctga cctttaattt cgacaacgag 180 ccggaaaaca tttctatcga aaacctgagc tctgatatca tcggccagct ggaactgatg 240 ccgaacatcg aacgtttccc aaacggtaaa aagtacgagc tggacaaata taccatgttc 300 cactacctgc gcgcgcagga atttgaacac ggcaaatccc gtatcgcact gactaactcc 360 gttaacgaag ctctgctcaa cccgtcccgt gtatacacct tcttctctag cgactacgtg 420 aaaaaggtca acaaagcgac tgaagctgca atgttcttgg gttgggttga acagcttgtt 480 tatgatttta ccgacgagac gtccgaagta tctactaccg acaaaattgc ggatatcact 540 atcatcatcc cgtacatcgg tccggctctg aacattggca acatgctgta caaagacgac 600 ttcgttggcg cactgatctt ctccggtgcg gtgatcctgc tggagttcat cccggaaatc 660 gccatcccgg tactgggcac ctttgctctg gtttcttaca ttgcaaacaa ggttctgact 720 gtacaaacca tcgacaacgc gctgagcaaa cgtaacgaaa aatgggatga agtttacaaa 780 tatatcgtga ccaactggct ggctaaggtt aatactcaga tcgacctcat ccgcaaaaaa 840 atgaaagaag cactggaaaa ccaggcggaa gctaccaagg caatcattaa ctaccagtac 900 aaccagtaca ccgaggaaga aaaaaacaac atcaacttca acatcgacga tctgtcctct 960 aaactgaacg aatccatcaa caaagctatg atcaacatca acaagttcct gaaccagtgc 1020 tctgtaagct atctgatgaa ctccatgatc ccgtacggtg ttaaacgtct ggaggaottc 1080 gatgcgtctc tgaaagacgc cctgctgaaa tacatttacg acaaccgtgg cactctgatc 1140 ggtcaggttg atcgtctgaa ggacaaagtg aacaatacct tatcgaccga catccctttt 1200 cagctcagta aatatgtcga taaccaacgc cttttgtcca ctctagacta gaagctt 1257 163
<210> 29 <211> 1323 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <400> 29 ggatccatgc cggttaccat caacaacttc aactacaacg acccgatcga caacaacaac 60 atcattatga tggaaccgcc gttcgcacgt ggtaccggac gttactacaa ggcttttaag 120 atcaccgacc gtatctggat catcccggaa cgttacacct tcggttacaa acctgaggac 180 ttcaacaaga gtagcgggat tttcaatcgt gacgtctgcg agtactatga tccagattat 240 ctgaatacca acgataagaa gaacatattc cttcagacta tgattaaact cttcaaccgt 300 atcaaaagca aaccgctcgg tgaaaaactc ctcgaaatga ttatcaacgg tatcccgtac 360 ctcggtgacc gtcgtgtccc gcttgaagag ttcaacacca acatcgcaag cgtcaccgtc 420 aacaaactca tcagcaaccc aggtgaagtc gaacgtaaaa aaggtatctt cgcaaacctc 480 atcatcttcg gtccgggtcc ggtcctcaac gaaaacgaaa ccatcgacat cggtafcccag 540 aaccacttcg caagccgtga aggtttcggt ggtatcatgc agatgaaatt ctgcccggaa 600 tacgtcagtg tcttcaacaa cgtccaggaa aacaaaggtg caagcatctt caaccgtcgt 660 ggttacttca gcgacccggc actcatcctc atgcatgaac tcatccacgt cctccacggt 720 ctctacggta tcaaagttga cgacctcccg atcgtcccga acgagaagaa attcttcatg 780 cagagcaccg acgcaatcca ggctgaggaa ctctacacct tcggtggcca agacccaagt 840 atcataaccc cgtccaccga caaaagcatc tacgacaaag tcctccagaa cttcaggggt 900 atcgtggaca gactcaacaa agtcctcgtc tgcatcagcg acccgaacat caatatcaac 960 atatacaaga acaagttcaa agacaagtac aaattcgtcg aggacagcga aggcaaatac 1020 agcatcgacg tagaaagttt cgacaagctc tacaaaagcc tcatgttcgg tttcaccgaa 1080 accaacatcg ccgagaacta caagatcaag acaagggcaa gttacttcag cgacagcctc 1140 ccgcctgtca aaatcaagaa cctcttagac aacgagattt acacaattga agagggcttc 1200 aacatcagtg acaaagacat ggagaaggaa tacagaggtc agaacaaggc tatcaacaaa 1260 caggcatacg aggagatcag caaagaacac ctcgcagtct acaagatcca gatgtgcgtc 1320 gac 1323 164
<210> 30 <211> 1260 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 30 ctgcagtgca tcgacgttga caacgaagac ctgttcttca tcgctgacaa aaacagcttc 60 agtgacgacc tgagcaaaaa cgaacgtatc gaatacaaca cccagagcaa ctacatcgaa 12 0 aacgacttcc cgatcaacga actgatcctg gacaccgacc tgataagtaa aatcgaactg 180 ccgagcgaaa acaccgaaag tctgaccgac ttcaacgttg acgttccggt ttacgaaaaa 240 cagccggcta tcaagaaaat cttcaccgac gaaaacacca tcttccagta cctgtacagc 300 cagaccttcc cgctggacat ccgtgacatc agtctgacca gcagtttcga cgacgctctg 360 ctgttcagca acaaagttta cagtttcttc agcatggact acatcaaaac cgctaacaaa 420 gttgttgaag cagggctgtt cgctggttgg gttaaacaga tcgttaacga cttcgttatc 480 gaagctaaca aaagcaacac tatggacaaa atcgctgaca tcagtctgat cgttccgtac 540 atcggtctgg ctctgaacgt tggtaacgaa accgctaaag gtaactttga aaacgctttc 600 gagatcgctg gtgcaagcat cctgctggag ttcatcccgg aactgctgat cccggttgtt 660 ggtgctttcc tgctggaaag ttacatcgac aacaaaaaca agatcatcaa aaccatcgac 72 0 aacgctctga ccaaacgtaa cgaaaaatgg agtgatatgt acggtctgat cgttgctcag 780 tggctgagca ccgtcaacac ccagttctac accatcaaag aaggtatgta caaagctctg 840 aactaccagg ctcaggctct ggaagagatc atcaaatacc gttacaacat ctacagtgag 900 aaggaaaaga gtaacatcaa catcgacttc aacgacatca acagcaaact gaacgaaggt 960 atcaaccagg ctatcgacaa catcaacaac ttcatcaacg gttgcagtgt tagctacctg 1020 atgaagaaga tgatcccgct ggctgttgaa aaactgctgg acttcgacaa caccctgaaa 1080 aagaacctgc tgaactacat cgacgaaaac aagctgtacc tgatcggtag tgctgaatac 1140 gaaaaaagta aagtgaacaa atacctgaag accatcatgc cgttcgacct gagtatctac 1200 accaacgaca ccatcctgat cgaaatgttc aacaaataca actctctaga ctagaagctt 1260 165
<210> 31 <211> 1329 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 31 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataac €0 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 ccgggcaaca acaacacccc gatcaàcacc tttgatttcg atgtggatfct caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 166 1260 aaeggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgcgtcgac 1329
<210> 32 <211> 1263 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 32 ctgcagtgtc gtgaactgct ggtgaaaaac accgatctgc cgtttattgg cgatatcagc 60 gatgtgaaaa ccgatatctt cctgcgcaaa gatatcaacg aagaaaccga agtgatctac 120 tacccggata acgtgagcgt tgatcaggtg atcctgagca aaaacaccag cgaacatggt ieo cagctggatc tgctgtatcc gagcattgat agcgaaagcg aaattctgcc gggcgaaaac 240 caggtgtttt acgataaccg tacccagaac gtggattacc tgaacagcta ttactacctg 300 gaaagccaga aactgagcga taacgtggaa gattttacct ttacccgcag cattgaagaa 360 gcgctggata acagcgcgaa agtttacacc tattttccga ccctggcgaa caaagttaat 420 gcgggtgttc agggcggtct gtttctgatg tgggcgaacg atgtggtgga agatttcacc 480 accaacatcc tgcgtaaaga taccctggat aaaatcagcg atgttagcgc gattattccg 540 tatattggtc cggcgctgaa cattagcaat agcgtgcgtc gtggcaattt taccgaagcg 600 tttgcggtta ccggtgtgac cattctgctg gaagcgtttc cggaatttac cattccggcg 660 ctgggtgcgt ttgtgatcta tagcaaagtg caggaacgca acgaaatcat caaaaccatc 720 gataactgcc tggaacagcg tattaaacgc tggaaagata gctatgaatg gatgatgggc 780 acctggctga gccgtattat cacccagttc aacaacatca gctaccagat gtacgatagc 840 ctgaactatc aggegggtgc; gattaaagcg aaaatcgatc tggaatacaa aaaatacagc 900 ggcagcgata aagaaaacat caaaagccag gttgaaaacc tgaaaaacag cctggatgtg 960 167 1020 aaaattagcg aagcgatgaa taacatcaac aaattcatcc gcgaatgcag cgtgacctac ctgttcaaaa acatgctgcc gaaagtgatc gatgaactga acgaatttga tcgcaacacc 1080 aaagcgaaac tgatcaacct gatcgatagc cacaacatta ttctggtggg cgaagtggat 1140 aaactgaaag cgaaagttaa caacagcttc cagaacacca tcccgtttaa catcttcagc 1200 tataccaaca acagcctgct gaaagatatc atcaacgaat acttcaatct agactagaag 1260
Ctt 1263
<210> 33 <211> 207 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <400> 33 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat cgaaggtcgt 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat tagctaacca ggcgctagcg 120 ggcggtggcg gtagcggcgg tggcggtagc ggcggtggcg gtagcgcact agtgctgcag 180 acgcacggtc tagaatgata aaagctt 207
<210> 34 <211> 108 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 34 ggatc.cacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga 60 aacaaagcgc tgaacctgca gacgcacggt ctagaatgat aaaagctt 108 168
<210> 35 <211> 186 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 35 60 120 180 186 catatgaata acctcgggat tgagggtcgt tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat tagctaacca gactagtggc ggtgggggta gtggcggtgg cggttcgggc gggggtggga gccctagggg atccgtcgac ctgcagggtc tagaagcgct agcgtgataa aagctt
<210> 36 <211> 180 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <400> 36 60 120 180 ggatccacgc acgtcgacgc gattgatggt cgttttggcg gtttcacggg cgcacgcaaa tcagcgcgta aattagctaa ccaggcgcta gcgggcggtg gcggtagcgg cggtggcggt agcggcggtg gcggtagcgc actagtgctg cagacgcacg gtctagaatg ataaaagctt
<210> 37 <211> 249 <212> ADN <213> Sequência Artificial 169 <22 0> <223> Sintético <400> 37 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat cgaaggtcgt 60 tacggtggtt tcatgacctc tgaaaaatct cagaccccgc tggttaccct gttcaaaaac 120 gctatcatca aaaacgctta caaaaaaggt gaagcgctag cgggtggtgg tggttctggt 180 ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctgca ctagtgctgc agacgcacgg tctagaatga 240 taaaagctt 249
<210> 38 <211> 207 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 38 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat cgaaggtcgt 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaac gtaagaacca ggcgctagcg 120 ggcggtggcg gtagcggcgg tggcggtagc ggcggtggcg gtagcgcact agtgctgcag 180 acgcacggtc tagaatgata aaagctt 207
<210> 39 <211> 2709 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético 170 <4Ο0> 39 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatttggo ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaattagcta accaggcgct agcgggcggt ggcggtagcg gcggtggcgg tagcggcggt 1440 ggcggtagcg cactagtgct gcagtgtatc aaggttaaca actgggattt attcttcagc 1500 ccgagtgaag acaacttcac caacgacctg aacaaaggtg aagaaatcac ctcagatact 1560 aacatcgaag cagccgaaga aaacatctcg ctggacctga tccagcagta ctacctgacc 1620 tttaatttcg acaacgagcc ggaaaacatt tctatcgaaa acctgagctc tgatatcatc 1680 171 ggccagctgg aactgatgcc gaacatcgaa cgtttcccaa acggtaaaaa gtacgagctg gacaaatata ccatgttcca ctacctgcgc gcgcaggaat ttgaacacgg caaatcecgt atcgcactga ctaactccgt taacgaagct ctgctcaacc cgtcccgtgt atacaccttc ttctctagcg actacgtgaa aaaggtcaac aaagcgactg aagctgcaat gttcttgggt tgggttgaac agcttgttta tgattttacc gacgagacgt ccgaagtatc tactaccgac aaaattgcgg atatcactat catcatcccg tacatcggtc cggctctgaa cattggcaac atgctgtaca aagacgactt cgttggcgca ctgatcttct ccggtgcggt gatcctgctg gagttcatcc cggaaatcgc catcccggta ctgggcacct ttgctctggt ttcttacatt gcaaacaagg ttctgactgt acaaaccatc gacaacgcgc tgagcaaacg taacgaaaaa tgggatgaag tttacaaata tatcgtgacc aactggctgg ctaaggttaa tactcagatc gacctcatcc gcaaaaaaat gaaagaagca ctggaaaacc aggcggaagc taccaaggca atcattaact accagtacaa ccagtacacc gaggaagaaa aaaacaacat caacttcaac atcgacgatc tgtcctctaa actgaacgaa tccatcaaca aagctatgat caacatcaac aagttcctga accagtgctc tgtaagctat ctgatgaact ccatgatccc gtacggtgtt aaacgtctgg aggacttcga tgcgtctctg aaagacgccc tgctgaaata catttacgac aaccgtggca ctctgatcgg tcaggttgat cgtctgaagg acaaagtgaa caatacctta tcgaccgaca tcccttttca gctcagtaaa tatgtcgata accaacgcct tttgtccact 1740 ctagactag 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2709 <210> 40 <211> 902 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético 172 <4Ο0> 40
Gly Ser Met Glu Phe Vai Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Vai 15 10 15
Asn Gly Vai Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gin Met 20 25 30
Gin Pro Vai Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Vai Ile Pro 35 40 45
Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro 50 55 60
Pro Glu Ala Lys Gin Vai Pro Vai Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu 55 70 75 80
Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Vai Thr Lys Leu 85 90 95
Phe Glu Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser 100 105 110
Ile Vai Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu 115 120 125
Leu Lys Vai Ile Asp Thr Asn Cys lie Asn Vai Ile Gin Pro Asp Gly 130 135 140
Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Vai Ile Ile Gly Pro Ser Ala 145 150 155 160
Asp Ile Ile Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Vai Leu Asn 165 170 175
Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr Ile Arg Phe Ser Pro 180 185 190
Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Vai Asp Thr Asn Pro 195 200 205
Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Vai Thr Leu Ala 210 215 220
His Glu Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn 225 230 235 240 173
Pro Asn Arg Vai Phe Lys Vai Asm Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 245 250 255
Gly Leu Glu Vai Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 260 265 270
Ala- Lys Phe Ile Asp Ser Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr 275 280 285
Tyr Asn Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser 290 295 300
Ile Vai Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Vai Phe Lys 305 310 315 320
Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Vai Asp 325 330 335
Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr 340 345 350
Glu Asp Asn Phe Vai Lys Phe Phe Lys Vai Leu Asn Arg Lys Thr Tyr 355 360 365
Leu Asn Phe Asp Lys Ala Vai Phe Lys Ile Asn Ile Vai Pro Lys Vai 370 375 380
Asn Tyr Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 385 390 395 400
Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr 405 410 415
Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 420 425 430
Vai Asp Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu ile Glu Gly Arg 435 440 445
Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ala Asn 450 455 460 174
Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly 465 470
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 475 480
Gly Gly Ser Ala Leu Vai Leu Gin 485
Cys Ile Lys Vai Asn Asn Trp Asp 490 495
Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp 500
Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys 505 510
Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp Thr 515 520
Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn 525
Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gin Gin 530 535
Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp 540
Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser Ile 545 550
Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile 555 560
Gly Gin Leu Glu Leu Met Pro Asn 565
Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys 570 575
Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr 580
Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gin 585 590
Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg 595 600
Ile Ala Leu Thr Asn Ser Vai Asn 605
Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg 610 615
Vai Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp 620
Tyr Vai Lys Lys Vai Asn Lys Ala 625 630
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Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile 885 890 895
Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Leu Asp 900 188
<210> 45 <211> 2742 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <400> 45 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataac 60 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 189 aacggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgcgtcgacg gcatcattac ctccaaaact aaatctctga tagaaggtag atttggcggt 1380 ttcacgggcg cacgcaaatc agcgcgtaaa ttagctaacc aggcgctagc gggcggtggc 1440 ggtagcggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcgcac tagtgctgca gtgtcgfcgaa 1500 ctgctggtga aaaacaccga tctgccgttt attggcgata tcagcgatgt gaaaaccgat 1560 atcttcctgc gcaaagatat caacgaagaa accgaagtga tctactaccc ggataacgtg 1620 agcgttgatc aggtgatcct gagcaaaaac accagcgaac atggtcagct ggatctgctg 1680 tatccgagca ttgatagcga aagcgaaatt ctgccgggcg aaaaccaggt gttttacgat 1740 aaccgtaccc agaacgtgga ttacctgaac agctattact acctggaaag ccagaaactg 1800 agcgataacg tggaagattt tacctttacc cgcagcattg aagaagcgct ggataacagc 1860 gcgaaagttt acacctattt tccgaccctg gcgaacaaag ttaatgcgag tgttcagggc 1920 ggtctgtttc tgatgtgggc gaacgatgtg gtggaagatt tcaccaccaa catcctgcgt 1980 aaagataccc tggataaaafc cagcgatgtt agcgcgatta ttccgtatat tggtccggcg 2040 ctgaacatta gcaatagcgt gcgtcgtggc aattttaccg aagcgtttgc ggttaccggt 2100 gtgaccattc tgctggaagc gtttccggaa tttaccattc cggcgctggg tgcgtttgtg 2160 atctatagca aagtgcagga acgcaacgaa atcatcaaaa ccatcgataa ctgcctggaa 2220 cagcgtatta aacgctggaa agatagctat gaatggatga tgggcacctg gctgagccgt 2280 attatcaccc agttcaacaa catcagctac cagatgtacg atagcctgaa ctatcaggcg 2340 ggtgcgatta aagcgaaaat cgatctggaa tacaaaaaat acagcggcag cgataaagaa 2400 aacatcaaaa gccaggttga aaacctgaaa aacagcctgg atgtgaaaat tagcgaagcg 2460 atgaataaca tcaacaaatt catccgcgaa tgcagcgtga cctacctgtt caaaaacatg 2520 ctgccgaaag tgatcgatga actgaacgaa tttgatcgca acaccaaagc gaaactgatc 2580 aacctgatcg atagccacaa cattattctg gtgggcgaag tggataaact gaaagcgaaa 2640 gttaacaaca gcttccagaa caccatcccg tttaacatct tcagctatac caacaacagc 2700 ctgctgaaag atatcatcaa cgaatacttc aatctagact ag 2742
<210> 46 <211> 913 <212> PRT <213> Sequência Artificial 190 <22 0> <223> Sintético <400> 4 6
Gly Ser Glu Phe Met Pro lie Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp 15 10 15
Pro Vai Asp Asn Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr 20 25 30
Leu Ala Asn Glu Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp 35 40 45
Vai Ile Pro Asp Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys 50 55 60
Pro Pro Arg Vai Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr 65 70 75 80
Leu Ser Thr Asp Ser Asp Lys Asp Thr Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys 85 90 95
Leu-Phe Lys Arg Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr 100 105 110
Arg Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile 115 120 125
Asn Thr Phe Asp Phe Asp Vai Asp Phe Asn Ser Vai Asp Vai Lys Thr 130 135 140
Arg Gin Gly Asn Asn Trp Vai Lys 145 150
Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Vai 155 160
Ile Ile Thr Gly Pro Arg Glu Asn 165
Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr 170 175
Phe Lys Leu Thr Asn Asn Thr Phe 180
Ala Ala Gin Glu Gly Phe Gly Ala 185 190
Leu Ser Ile Ile Ser Ile Ser Pro 195 200
Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn 205 191
Ala Thr Asn Asp Vai Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys 210 215 220 Met Asp 225 Pro Ile Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His 230 235 240 Asn Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gin Thr Ile Ser Ser Vai 245 250 255 Thr Ser Asn Ile Phe Tyr Ser Gin Tyr Asn Vai Lys Leu Glu Tyr Ala 260 265 270 Glu Ile Tyr Ala Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Lys Ser 275 280 285 Ala Arg 290 Lys Tyr Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile 295 300 Ala Lys 305 Arg Leu Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn 310 315 320 Lys Tyr Ile Gly Glu Tyr Lys Gin Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe 325 330 335 Vai Vai Glu Ser Ser Gly Glu Vai Thr Vai Asn Arg Asn Lys Phe Vai 340 345 350 Glu Leu Tyr Asn Glu Leu Thr Gin Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala 355 360 365 Lys Ile 370 Tyr Asn Vai Gin Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn Vai Tyr 375 380 Thr Pro 385 Vai Thr Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Vai Tyr Asp Ile Gin 390 395 400
Asn Gly Phe Asn Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Vai Leu Phe Met Gly 405 410 415
Gin Asn Leu Ser Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Vai Asn Pro Glu Asn 420 425 430
Met Leu Tyr Leu Phe Thr Lys Phe Cys Vai Asp Gly Ile Ile Thr Ser 435 440 445 192
Lys Thr Lys Ser Leu Ile Glu Gly 450 455
Arg Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala 460
Arg Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ala 465 470
Asn Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly 475 480
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 485
Gly Gly Gly Ser Ala Leu Vai Leu 490 495
Gin Cys Arg Glu Leu Leu Vai Lys 500
Asn Thr Asp Leu Pro Phe Ile Gly 505 510
Asp Ile Ser Asp Vai Lys Thr Asp 515 520
Ile Phe Leu Arg Lys Asp Ile Asn 525
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Pro Asp Asn Vai Ser Vai Asp Gin 540
Vai Ile Leu Ser Lys Asn Thr Ser 545 550
Glu His Gly Gin Leu Asp Leu Leu 555 560
Tyr Pro Ser IIe Asp Ser Glu Ser 565
Glu Ile Leu Pro Gly Glu Asn Gin 570 575
Vai Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gin 580
Asn Vai Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr 585 590
Tyr Tyr Leu Glu Ser Gin Lys Leu 595 600
Ser Asp Asn Vai Glu Asp Phe Thr 605
Phe Thr Arg Ser Ile Glu Glu Ala 610 615
Leu Asp Asn Ser Ala Lys Vai Tyr 620
Thr Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn 625 630
Lys Vai Asn Ala Gly Vai Gin Gly 635 640
Gly Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn 645
Asp Vai Vai Glu Asp Phe Thr Thr 650 655
Asn Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu 660
Asp Lys Ile Ser Asp Vai Ser Ala 665 670
Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala 675 680
Leu Asn Ile Ser Asn Ser Vai Arg 685 193
Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala Vai Thr Gly Vai Thr Ile Leu 690 695 700
Leu Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly Ala Phe Vai 705 710 715 720
Ile Tyr Ser Lys Vai Gin Glu Arg Asn Glu Ile Ile Lys Thr Ile Asp 725 730 735
Asn Cys Leu Glu Gin Arg Ile Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Glu Trp 740 745 750
Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg Ile Ile Thr Gin Phe Asn Asn Ile 755 760 765
Ser Tyr Gin Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gin Ala Gly Ala Ile Lys 770 775 780
Ala Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu 785 790 795 800
Asn Ile Lys Ser Gin Vai Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp Vai Lys 805 810 815
Ile Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser 820 825 830
Vai Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Vai Ile Asp Glu Leu 835 840 845
Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu Ile Asn Leu Ile Asp 850 855 860
Ser His Asn Ile Ile Leu Vai Gly Glu Vai Asp Lys Leu Lys Ala Lys 865 870 875 880
Vai Asn Asn Ser Phe Gin Asn Thr Ile Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr 885 890 895
Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Leu 900 905 910
Asp 194
<210> 47 <211> 2673 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <400> 47 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa eggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac tttfcggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 195 1260 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatacggt ggtttcatgg cgctagcggg cggtggcggt 1380 agcggcggtg gcggtagcgg cggtggcggt agcgcactag tgctgcagtg tatcaaggtt 1440 aacaactggg atttattctt cagcccgagt gaagacaact tcaccaacga cctgaacaaa 1500 ggtgaagaaa tcacctcaga tactaacatc gaagcagccg aagaaaacat ctcgctggac 1560 ctgatccagc agtactacct gacctttaat ttcgacaacg agccggaaaa catttctatc 1620 gaaaacctga gctctgatat catcggccag ctggaactga tgccgaacat cgaacgtttc 1680 ccaaacggta aaaagtacga gctggacaaa tataccatgt tccactacct gcgcgcgcag 1740 gaatttgaac acggcaaatc ccgtatcgca ctgactaact ccgttaacga agctctgctc 1800 aacccgtccc gtgtatacac cttcttctct agcgactacg tgaaaaaggt caacaaagcg 1860 actgaagctg caatgttctt gggttgggtt gaacagcttg tttatgattt taccgacgag 1920 acgtccgaag tatctactac cgacaaaatt gcggatatca ctatcatcat cccgtacatc 1980 ggtccggctc tgaacattgg caacatgctg tacaaagacg acttcgttgg cgcactgatc 2040 ttctccggtg cggtgatcct gctggagttc atcccggaaa tcgccatccc ggtactgggc 2100 acctttgctc tggtttctta cattgcaaac aaggttctga ctgtacaaac catcgacaac 2160 gcgctgagca aacgtaacga aaaatgggat gaagtttaca aatatatcgt gaccaactgg 2220 ctggctaagg ttaatactca gatcgacctc atccgcaaaa aaatgaaaga agcactggaa 2280 aaccaggcgg aagctaccaa ggcaatcatt aactaccagt acaaccagta caccgaggaa 2340 gaaaaaaaca acatcaactt caacatcgac gatctgtcct ctaaactgaa cgaatccatc 2400 aacaaagcta tgatcaacat caacaagttc ctgaaccagt gctctgtaag ctatctgatg 2460 aactccatga tcccgtacgg tgttaaacgt ctggaggact tcgatgcgtc tctgaaagac 2520 gccctgctga aatacattta cgacaaccgt ggcactctga tcggtcaggt tgatcgtctg 2580 aaggacaaag tgaacaatac cttatcgacc gacatccctt ttcagctcag taaatatgtc 2640 gataaccaac gccttttgtc cactctagac tag 2673 196
<210> 48 <211> 890 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <400> 48
Gly Ser Met Glu Phe Vai Asn Lys 1 5
Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Vai 10 15
Asn Gly Vai Asp Ile Ala Tyr Ile 20
Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gin Met 25 30
Gin Pro Vai Lys Ala Phe Lys Ile 35 40
His Asn Lys Ile Trp Vai Ile Pro 45
Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro 50 55
Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro 60
Pro Glu Ala Lys Gin Vai Pro Vai 65 70
Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu 75 80
Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn 85
Tyr Leu Lys Gly Vai Thr Lys Leu 90 95
Phe Glu Arg Ile Tyr Ser Thr Asp 100
Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser 105 110
Ile Vai Arg Gly Ile Pro Phe Trp 115 120
Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu 125
Leu Lys Vai Ile Asp Thr Asn Cys 130 135
Ile Asn Vai Ile Gin Pro Asp Gly 140
Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn 145 150
Leu Vai Ile Ile Gly Pro Ser Ala 155 160
Asp Ile Ile Gin Phe Glu Cys Lys 165
Ser Phe Gly His Glu Vai Leu Asn 170 175 197
Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr Ile Arg Phe Ser Pro 180 185 190
Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Vai Asp Thr Asn Pro 195 200 205
Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Vai Thr Leu Ala 210 215 220
His Glu Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn 225 230 235 240
Pro Asn Arg Vai Phe Lys Vai Asn 245
Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 250 255
Gly Leu Glu Vai Ser Phe Glu Glu 260
Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 265 270
Ala Lys Phe Ile Asp Ser Leu Gin 275 280
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Tyr Asn Lys Phe Lys Asp Ile Ala 290 295
Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser 300
Ile Vai Gly Thr Thr Ala Ser Leu 305 310
Gin Tyr Met Lys Asn Vai Phe Lys 315 320
Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp 325
Thr Ser Gly Lys Phe Ser Vai Asp 330 335
Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr 340
Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr 345 350
Glu Asp Asn Phe Vai Lys Phe Phe 355 360
Lys Vai Leu Asn Arg Lys Thr Tyr 365
Leu Asn Phe Asp Lys Ala Vai Phe 370 375
Lys Ile Asn lie Vai Pro Lys Vai 380
Asn Tyr Thr Ile Tyr Asp Gly Phe 385 390
Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 395 400 198
Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu lie Asn Asn Met Asn Phe Thr 405 410 4:15
Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 420 425 430
Vai Asp Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Ile Glu Gly Arg 435 440 445
Tyr Gly Gly Phe Met Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Vai Leu Gin Cys Ile Lys Vai 465 470 475 480
Asn Asn Trp Asp
Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe 485 490
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Ile Glu Ala 510
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Leu Arg Ala Gin Glu Phe Glu His 580
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Asn Pro Ser Arg Vai Tyr Thr Phe 605
Phe Ser Ser Asp Tyr Vai Lys Lys 610 615
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Thr Ser Glu Vai Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile 645 650 655
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Asp Asp Phe Vai Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Vai Ile Leu Leu 675 680 685
Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala Ile Pro Vai Leu Gly Thr Phe Ala Leu 690 695 700
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Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp 835 840 845
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Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr Ile Arg Phe Ser Pro 180 185 190
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<210> 62 <211> 898 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético 238 <4 Ο Ο > 62
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Pro Tyr Gly Vai Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp 835 840 845
Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gin 850 855 860
Vai Asp Arg Leu Lys Asp Lys Vai Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile 865 870 875 880
Pro Phe Gin Leu Ser Lys Tyr Vai Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser Thr 885 890 895
Leu Asp
<210> 63 <211> 2736 <212> ADN <213> Sequência Artificial 242 <220> <223> Sintético <400> 63 ctcgggattg agggtcgttt tggcggtttc acgggcgcae gcaaatcagc gcgtaaatta 60 gctaaccaga ctagtggcgg tgggggtagt ggcggtggcg gttcgggcgg gggtgggagc 120 cctaggggat ccatggagtt cgttaacaaa cagttcaact ataaagaccc agttaacggt 180 gttgacattg cttacatcaa aatcccgaac gctggccaga tgcagccggt aaaggcattc 240 aaaatccaca acaaaatctg ggttatcccg gaacgtgata cctttactaa cccggaagaa 300 ggtgacctga acccgccacc ggaagcgaaa caggtgccgg tatcttacta tgactccacc 360 tacctgtcta ccgataacga aaaggacaac tacctgaaag gtgttactaa actgttcgag 420 cgtatttact ccaccgacct gggccgtatg ctgctgacta gcatcgttcg cggtatcccg 480 ttctggggcg gttctaccat cgataccgaa ctgaaagtaa tcgacactaa ctgcatcaac 540 gttattcagc cggacggttc ctatcgttcc gaagaactga acctggtgat catcggcccg 600 tctgctgata tcatccagtt cgagtgtaag agctttggtc acgaagttct gaacctcacc 660 cgtaacggct acggttccac tcagtacatc cgtttctctc cggacttcac cttcggtttt 720 gaagaatccc tggaagtaga cacgaaccca ctgctgggcg ctggtaaatt cgcaactgat 780 cctgcggtta ccctggctca cgaactgatt catgcaggcc accgcctgta cggtatcgcc 840 atcaatccga accgtgtctt caaagttaac accaacgcgt attacgagat gtccggtctg 900 gaagttagct tcgaagaact gcgtactttt ggcggtcacg acgctaaatt catcgactct 960 ctgcaagaaa acgagttccg tctgtactac tataacaagt tcaaagatat cgcatccacc 1020 ctgaacaaag cgaaatccat cgtgggtacc actgcttctc tccagtacat gaagaacgtt 1080 tttaaagaaa aatacctgct cagcgaagac acctccggca aattctctgt agacaagttg 1140 aaattcgata aactttacaa aatgctgact gaaatttaca ccgaagacaa cttcgttaag 1200 ttctttaaag ttctgaaccg caaaacctat ctgaacttcg acaaggcagt attcaaaatc 1260 aacatcgtgc cgaaagttaa ctacactatc tacgatggtt tcaacctgcg taacaccaac 1320 ctggctgcta attttaacgg ccagaacacg gaaatcaaca acatgaactt cacaaaactg 1380 aaaaacttca ctggtctgtt cgagttttac aagctgctgt gcgtcgacgg catcattacc 1440 tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga aacaaagcgc tgaacctgca gtgtatcaag 1500 243 gttaacaact gggatttatt cttcagcccg agtgaagaca acttcaccaa cgacctgaac 1S60 aaaggtgaag aaatcacctc agatactaac atcgaagcag ccgaagaaaa catctcgctg 1620 gacctgatcc agcagtacta cctgaccttt aatttcgaca acgagccgga aaacatttct 1680 atcgaaaacc tgagctctga tatcatcggc cagctggaac tgatgccgaa oatcgaacgt 1740 ttcccaaacg gtaaaaagta cgagctggac aaatatacca tgttccacta cctgcgcgcg 1800 caggaatttg aacacggcaa atcccgtatc gcactgacta actccgttaa cgaagctctg 1860 ctcaacccgt cccgtgtata caccttcttc tctagcgact acgtgaaaaa ggtcaacaaa 1920 gcgactgaag ctgcaatgtt cttgggttgg gttgaacagc ttgtttatga ttttaccgac 1980 gagacgtccg aagtatctac taccgacaaa attgcggata tcactatcat catcccgtac 2040 atcggtccgg ctctgaacat tggcaacatg ctgtacaaag acgacttcgt tggcgcactg 2100 atcttctccg gtgcggtgat cctgctggag ttcatcccgg aaatcgccat cccggtactg 2160 ggcacctttg ctctggtttc ttacattgca aacaaggttc tgactgtaca aaccatcgac 2220 aacgcgctga gcaaacgtaa cgaaaaatgg gatgaagttt acaaatatat cgtgaccaac 2280 tggctggcta aggttaatac tcagatcgac ctcatccgca aaaaaatgaa agaagcactg 2340 gaaaaccagg cggaagctac caaggcaatc attaactacc agtacaacca gtacaccgag 2400 gaagaaaaaa acaacatcaa cttcaacatc gacgatctgt cctctaaact gaacgaatcc 2460 atcaacaaag ctatgatcaa catcaacaag ttcctgaacc agtgctctgt aagctatctg 2520 atgaactcca tgatcccgta cggtgttaaa cgtctggagg acttcgatgc gtctctgaaa 2580 gacgccctgc tgaaatacat ttacgacaac cgtggcactc tgatcggtca ggttgatcgt 2640 ctgaaggaca aagtgaacaa taccttatcg accgacatcc cttttcagct cagtaaatat 2700 gtcgataacc aacgcctttt gtccactcta gactag 2736
<210> 64 <211> 911 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético 244 <4 Ο Ο> 64
Leu Gly Ile Glu Gly Arg Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser 1 5 10 15 Ala Arg Lys Leu Ala Asn Gin Thr 20 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 Pro Arg Gly Ser Met Glu Phe Vai 45 Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp 50 55 Pro Vai Asn Gly Vai Asp 11e Ala 60 Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly 65 70 Gin Met Gin Pro Vai Lys Ala Phe 75 80 Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Vai 85 Ile Pro Glu Arg Asp Thr Phe Thr 90 95 Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn 100 Pro Pro Pro Glu Ala Lys Gin Vai 105 110 Pro Vai Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr 115 120 Tyr Leu Ser Thr Asp Asn Glu Lys 125 Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Vai Thr 130 135 Lys Leu Phe Glu Arg Ile Tyr Ser 140
Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Vai Arg Gly Ile Pro 145 150 155 160 Phe Trp Gly Gly Ser Thr ile Asp 165 Thr Glu Leu Lys Vai Ile Asp Thr 170 175 Asn cys Ile Asn Vai Ile Gin Pro 180 Asp Gly Ser Tyr Arg Ser Glu Glu 185 190
Leu Asn Leu Vai Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile Ile Gin Phe Glu 195 200 205 Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Vai 210 215 Leu Asn Leu Thr Arg Asn Gly Tyr 220 245
Gly Ser Thr Gin Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe Thr Phe Gly Phe 225 230 235 240
Glu Glu Ser Leu Glu Vai Asp Thr Asn Pro Leu Leu Gly Ala Gly Lys 245 250 255
Phe Ala Thr Asp Pro Ala Vai Thr Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala 260 265 270
Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn Arg Vai Phe Lys 275 280 285
Vai Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu Glu Vai Ser Phe 290 295 300
Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys Phe Ile Asp Ser 305 310 315 320
Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn Lys Phe Lys Asp 325 330 335
Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Vai Gly Thr Thr Ala 340 345 350
Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Vai Phe Lys Glu Lys Tyr Leu Leu Ser 355 360 365
Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Vai Asp Lys Leu Lys Phe Asp Lys 370 375 380
Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp Asn Phe Vai Lys 385 390 395 400
Phe Phe Lys Vai Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn Phe Asp Lys Ala 405 410 415
Vai Phe Lys Ile Asn Ile Vai Pro Lys Vai Asn Tyr Thr Ile Tyr Asp 420 425 430
Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn Phe Asn Gly Gin 435 440 445
Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu Lys Asn Phe Thr 450 455 460 246
Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu 465 470
Leu Cys Vai Asp Gly Ile Ile Thr 475 480
Ser Lys Thr Lys Ser Leu Ile Glu 485
Gly Arg Asn Lys Ala Leu Asn Leu 490 495
Gin Cys lie Lys Vai Asn Asn Trp 500
Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu 505 510
Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn 515 520
Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp 525
Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu 530 535
Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gin 540
Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe 545 550
Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser 555 560
Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile 565
Ile Gly Gin Leu Glu Leu Met Pro 570 575
Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly 580
Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr 585 590
Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala 595 600
Gin Glu Phe Glu His Gly Lys Ser 605
Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Vai 610 615
Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser 620
Arg Vai Tyr Thr Phe Phe Ser Ser 625 630
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Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu 645
Gly Trp Vai Glu Gin Leu Vai Tyr 650 655
Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu 660
Vai Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala 665 670
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Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly 685 247
Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe 690 695
Vai Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly 700
Ala Vai Ile Leu Leu Glu Phe Ile 705 710
Pro Glu Ile Ala Ile Pro Vai Leu 715 720
Gly Thr Phe Ala Leu Vai Ser Tyr 725
Ile Ala Asn Lys Vai Leu Thr Vai 730 735
Gin Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser 740
Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu 745 750
Vai Tyr Lys Tyr Ile Vai Thr Asn 755 760
Trp Leu Ala Lys Vai Asn Thr Gin 765
Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met 770 775
Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala 780
Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn 785 790
Tyr Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu 795 800
Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe 805
Asn lie Asp Asp Leu Ser Ser Lys 810 815
Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala 820
Met Ile Asn lie Asn Lys Phe Leu 825 830
Asn Gin Cys Ser Vai Ser Tyr Leu 835 840
Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly 845
Vai Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp 850 855
Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu 860
Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly 865 870
Thr Leu Ile Gly Gin Vai Asp Arg 875 880
Leu Lys Asp Lys Vai Asn Asn Thr 885
Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gin 890 895
Leu Ser Lys Tyr Vai Asp Asn Gin 900
Arg Leu Leu Ser Thr Leu Asp 905 910 248
<210> 65 <211> 177 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 65 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat tagctaacca ggcgctagcg 120 ggtggtggtg gttctgcact agtgctgcag acgcacggtc tagaatgata aaagctt 177
<210> 66 <211> 192 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 6 6 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat tagctaacca ggcgctagcg 120 ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct gcactagtgc tgcagacgca cggtctagaa 180 tgataaaagc tt 192
<210> 67 <211> 222 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> 249 <223> Sintético <400> 67 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat tagctaacca ggcgctagcg 120 ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct 180 gcactagtgc tgcagacgca cggtctagaa tgataaaagc tt 222
<210> 68 <211> 237 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 68 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat tagctaacca ggcgctagcg 120 ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct 180 ggtggtggtg gttctgcact agtgctgcag acgcacggtc tagaatgata aaagctt 237
<210> 69 <211> 228 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 69 250 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta l aatctctgat agaaggtaga 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat . tagctaacca ggcgctagcg 120 gctgaagctg ctgctaaaga agctgctgct aaagaagctg [ ctgctaaagc tggtggcggt 180 ggttccgcac tagtgctgca gacgcacggt ctagaatgat . aaaagctt 228 <210> 70 <211> 2694 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 70 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccáccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaacfcgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 251 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaattagcta accaggcgct agcgggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctgcacta 1440 gtgctgcagt gtatcaaggt taacaactgg gatttattct tcagcccgag tgaagacaac 1500 ttcaccaacg acctgaacaa aggtgaagaa atcacctcag atactaacat cgaagcagcc 1560 gaagaaaaca tctcgctgga cctgatccag cagtactacc tgacctttaa tttcgacaac 1620 gagccggaaa acatttctat cgaaaacctg agctctgata tcatcggcca gctggaactg 1680 atgccgaaca tcgaacgttt cccaaacggt aaaaagtacg agctggacaa atataccatg 1740 ttccactacc tgcgcgcgca ggaatttgaa cacggcaaat cccgtatcgc actgactaac 1800 tccgttaacg aagctctgct caacccgtcc cgtgtataca ccttcttctc tagcgactac 1860 gtgaaaaagg tcaacaaagc gactgaagct gcaatgttct tgggttgggt tgaacagctt 1920 gtttatgatt ttaccgacga gacgtccgaa gtatctacfca ccgacaaaat tgcggatatc 1980 actatcatca tcccgtacat cggtccggct ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac 2040 gacttcgttg gcgcactgat cttctccggt gcggtgatcc tgctggagtt catcccggaa 2100 atcgccatcc cggtactggg cacctttgct ctggtttefct acattgcaaa caaggttctg 2160 actgtacaaa ccatcgacaa cgcgctgagc aaacgtaacg aaaaatggga tgaagtttac 2220 aaatatatcg tgaccaactg gctggctaag gttaatactc agatcgacct catccgcaaa 2280 aaaatgaaag aagcactgga aaaccaggcg gaagctacca aggcaatcat taactaccag 2340 tacaaccagt acaccgagga agaaaaaaac aacatcaact tcaacatcga cgatctgtcc 2400 tctaaactga acgaatccat caacaaagct atgatcaaca tcaacaagtt cctgaaccag 2460 tgctctgtaa gctatctgat gaactccatg atcccgtacg gtgttaaacg tctggaggac 2520 ttcgatgcgt ctctgaaaga cgccctgctg aaatacattt 252 acgacaaccg tggcactctg 2580 atcggtcagg ttgatcgtct gaaggacaaa gtgaacaata ccttatcgac cgacatccct 2640 2694 tttcagctca gtaaatatgt cgataaccaa cgccttttgt ccactctaga ctag
<210> 71 <211> 897 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 71
Gly Ser Met Glu Phe Vai Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Vai 15 10 15
Asn Gly Vai Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gin Met 20 25 30
Gin Pro Vai Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Vai Ile Pro 35 40 45
Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro 50 55 60
Pro Glu Ala Lys Gin Vai Pro Vai Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu 65 70 75 80
Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Vai Thr Lys Leu 85 90 95
Phe Glu Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser 100 105 110
Ile Vai Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu 115 120 125
Leu Lys Vai Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Vai Ile Gin Pro Asp Gly 130 135 140 253
Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Vai Ile Ile Gly Pro Ser Ala 145 150 155 160
Asp Ile Ile Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Vai Leu Asn 165 170 175
Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr Ile Arg Phe Ser Pro 180 185 190 Asp Phe Thr Phe Gly 195 Phe Glu Glu Ser Leu Glu Vai Asp Thr Asn Pro 200 205 Leu Leu Gly Ala Gly 210 Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Vai Thr Leu Ala 215 220
His Glu Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn 225 230 235 240 Pro Asn Arg Vai Phe 245 Lys Vai Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 250 255 Gly Leu Glu Vai Ser 260 Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 265 270 Ala Lys Phe Ile Asp 275 Ser Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr 280 285
Tyr Asn Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser 290 295 300
Ile Vai Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Vai Phe Lys 305 310 315 320 Glu Lys Tyr Leu Leu 325 Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Vai Asp 330 335 Lys Leu Lys Phe Asp 340 Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr 345 350 Glu Asp Asn Phe Vai 355 Lys Phe Phe Lys Vai Leu Asn Arg Lys Thr Tyr 360 365 254
Leu Asn Phe Asp Lys Ala Vai Phe 370 375
Lys Ile Asn Ile Vai Pro Lys Vai 380
Asn Tyr Thr Ile Tyr Asp Gly Phe 385 390
Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 395 400
Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr 405
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Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu 420
Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 425 430
Vai Asp Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Ile Glu Gly Arg 435 440 445
Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ala Asn 450 455 460
Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu 465 470 475 480
Vai Leu Gin Cys Ile Lys Vai Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro 485 490 495
Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu Ile Thr 500 505 510
Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu Asp Leu 515 520 525
Ile Gin Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn 530 535 540
Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gin Leu Glu Leu 545 550 555 560
Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp 565 570 575
Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gin Glu Phe Glu His Gly 580 585 590 255
Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn 595 600
Ser Vai Asn Glu Ala Leu Leu Asn 605
Pro Ser Arg Vai Tyr Thr Phe Phe 610 615
Ser Ser Asp Tyr Vai Lys Lys Vai 620
Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met 625 630
Phe Leu Gly Trp Vai Glu Gin Leu 635 640
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Ser Glu Vai Ser Thr Thr Asp Lys 650 655
He Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile 660
Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp 675 680
Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn 665 670
Asp Phe Vai Gly Ala Leu Ile Phe 685
Ser Gly Ala Vai Ile Leu Leu Glu 690 695
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Vai Leu Gly Thr Phe Ala Leu Vai 705 710
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Thr Vai Gin Thr Ile Asp Asn Ala 725
Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp 730 735
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Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn 765
Gin Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile 770 775
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Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser 795 800
Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn 805
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Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro 825 830 256
Tyr Gly Vai Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala 835 840 845
Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gin Vai 850 855 860
Asp Arg Leu Lys Asp Lys Vai Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile Pro 865 870 875 880
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<210> 78 <211> 2742 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <400> 78 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataac 60 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 270 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgo agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 aacggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgcgtcgacg gcatcattac ctccaaaact aaatctctga tagaaggtag atttggcggt 1380 ttcacgggcg cacgcaaatc agcgcgtaaa cgtaagaacc aggcgctagc gggcggtggc 1440 ggtagcggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcgcac tagtgctgca gtgtcgtgaa 1500 ctgctggtga aaaacaccga tctgccgttt attggcgata tcagcgatgt gaaaaccgat 1560 atcttcctgc gcaaagatat caacgaagaa accgaagtga tctactaccc ggataacgtg 1620 agcgttgatc aggtgatcct gagcaaaaac accagcgaac atggtcagct ggatctgctg 1680 tatccgagca ttgatagcga aagcgaaatt ctgccgggcg aaaaccaggt gttttacgat 1740 aaccgtaccc agaacgtgga ttacctgaac agctattact acctggaaag ccagaaactg 1800 agcgataacg tggaagattt tacctttacc cgcagcattg aagaagcgct ggataacagc 1860 gcgaaagttt acacctattt tccgaccctg gcgaacaaag ttaatgcggg tgttcagggc 1920 ggtctgtttc tgatgtgggc gaacgatgtg gtggaagatt tcaccaccaa catcctgcgt 1980 aaagataccc tggataaaat cagcgatgtt agcgcgatta ttccgtatat tggtccggcg 2040 ctgaacatta gcaatagcgt gcgtcgtggc aattttaccg aagcgtttgc ggttaccggt 2100 gtgaccattc tgctggaagc gtttccggaa tttaccattc cggcgctggg tgcgtttgtg 2160 atctatagca aagtgcagga acgcaacgaa atcatcaaaa ccatcgataa ctgcctggaa 2220 cagcgtatta aacgctggaa agatagctat gaatggatga tgggcacctg gctgagccgt 2280 attatcaccc agttcaacaa catcagctac cagatgtacg atagcctgaa ctatcaggcg 2340 ggtgcgatta aagcgaaaat cgatctggaa tacaaaaaat acagcggcag cgataaagaa 2400 aacatcaaaa gccaggttga aaacctgaaa aacagcctgg atgtgaaaat tagcgaagcg 2460 271 atgaataaca tcaacaaatt ctgccgaaag tgatcgatga aacctgatcg atagccacaa gttaacaaca gcttccagaa ctgctgaaag atatcatcaa catccgcgaa tgcagcgtga actgaacgaa tttgatcgca cattattctg gtgggcgaag caccatcccg tttaacatct cgaatacttc aatctagact cctacctgtt caaaaacatg acaccaaagc gaaactgatc tggataaact gaaagcgaaa tcagctatac caacaacagc ag 2520 2580 2640 2700 2742
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Leu Ala Asn Glu Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp 35 40 45
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Pro Pro Arg Vai Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr 65 70 75 80
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Leu Phe Lys Arg Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr 100 105 110 272
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Tyr Tyr Leu Glu Ser Gin Lys Leu Ser Asp Asn Vai Glu Asp Phe Thr 595 600 605
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Asp
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Leu Leu Ser Thr Leu Asp 900 <210> 86 <211> 2889 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético 294 <4Ο0> 8 6 ggatccttgg tacgagatga cgttgactat caaattttcc gcgactttgc ggaaaataaa 60 ggtaagtttt tcgtcggcgc cacagacctg tccgtcaaaa ataagagagg ccagaacatc 120 ggtaacgcac tgagcaacgt ccctatgatt gattttagtg tagcggacgt taataaacgg 180 attgcaaccg tcgttgatcc gcagtatgct gtcagcgtca aacatgctaa agcggaagtt 240 catacgttct attacgggca atataacggc cataacgatg tggctgataa agaaaatgaa 300 tatcgcgtgg tcgagcagaa caattacgaa ccgcacaaag cgtggggcgc gagtaattta 360 ggccgcctgg aggactataa catggcccgt ttcaataaat tcgtgaccga ggtagcaccg 420 atcgccccca cagatgctgg tgggggcctg gatacctaca aagataaaaa ccgcttctct 480 agcttcgtgc gcattggcgc cggtcgtcag ctcgtgtacg agaagggtgt ctatcaccag 540 gaaggtaatg aaaaggggta cgacctccgt gatttgtccc aggcgtatcg ctacgctatt 600 gccggaaccc cgtataaaga tattaatatc gatcaaacca tgaataccga aggcctaatt 660 ggtttcggga atcataataa gcaatatagc gcagaagagc taaagcaggc cctcagccaa 720 gatgcgttaa ccaattacgg agtgttaggc gatagcggca gtccgctgtt tgccttcgat 780 aaacagaaaa atcaatgggt gtttctgggc acttatgatt attgggccgg atatggtaaa 840 aagagctggc aggaatggaa tatttataaa aaggaattcg cagacaaaat caagcagcat 900 gacaacgcag gtacggtgaa ggggaacggc gaacatcact ggaagacgac cggcacgaat 960 agtcatatcg gatcgacggc cgttcgcctg gcgaacaatg agggcgatgc aaacaatggg 1020 caaaacgtga cctttgagga caacggtacc ctggtcetta accagaacat aaatcagggc 1080 gcgggaggct tgttctttaa aggcgaetat actgttaagg gagcaaacaa tgacatcacc 1140 tggttagggg ccggtattga cgttgcggat ggaaaaaagg tggtttggca ggttaaaaac 1200 cctaacgggg accggctggc aaaaatcggc aaagggacat tggaaattaa tggtaccggt 1260 gtgaatcagg gtcagctgaa agtgggagat gggaccgtga ttctgaacca gaaagcagac 1320 gctgacaaaa aggtgcaagc ctttagccaa gtaggaattg ttagtggtcg tggcacactc 1380 gtcttgaact caagcaacca aataaatccg gataacctgt actttggatt tcgtggcgga 1440 cgcctggatg ctaacgggaa tgatctgacc tttgaacata tccgtaacgt tgacgagggt 1500 gcgcgcatag ttaatcataa tactgaccat gcatcaacta tcaccttgac cgggaaaagt 1560 ctgattacaa acccaaactc tctgtcagta cattccatcc agaatgatta tgatgaagac 1620 295 gattactcat actattaccg gccgcgtaga ccaattccac aaggtaaaga tctttattac 1680 aaaaattacc gttattacgc attaaaatcc ggagggcggc tgaatgcacc tatgccggaa 1740 aatggcgtgg ccgaaaacaa tgactggatt tttatgggtt atactcaaga agaggctcgc 1800 aaaaatgcaa tgaaccataa aaataaccga aggatcggtg atttcggcgg atttttcgat 1860 gaggaaaatg gtaaaggtca caatggtgcg ctgaatctaa attttaacgg caaaagtgcc 1920 cagaaacgtt tccttctgac tggtggcgct aatctgaatg gtaaaatcag tgtgacgcag 1980 ggtaacgtgc tgctttctgg ccggccaact ccgcatgcac gtgattttgt aaataaatcg 2040 agcgctcgta aagatgcgca tttttctaaa aataacgagg tcgtgtttga agatgactgg 2100 ataaatcgca cctttaaagc ggcagaaatc gcggttaatc agagtgcgag cttttcatcg 2160 ggtaggaatg tatctgatat tacagcaaac attacagcca ctgataatgc gaaggtcaac 2220 ctgggttata aaaacggtga tgaagtttgt gttcgatcgg attacacggg ctatgttacc 2280 tgcaacactg gcaatctgtc tgataaagcg cttaactctt ttgacgccac gcgcattaac 2340 gggaatgtga acctgaacca aaacgctgcc ttggtacttg gtaaggccgc gttgtggggt 2400 aaaattcagg gccagggcaa ctcccgtgtg tctctgaacc agcactcgaa gtggcacctg 2460 acgggggact cgcaggtgca caacttgtcc ctggccgata gccatattca ccttaacaat 2520 gcgtccgatg cccagtcagc taataaatat catacgatca aaatcaatca cctctctggc 2580 aacggtcact ttcactactt aacggattta gcaaaaaact taggggataa agtcctggta 2640 aaagaatcag cgagcggaca ttatcagtta catgtacaga acaaaacagg cgagccaaat 2700 caggaaggcc ttgacttatt tgatgcttca tcggtacaag atcgttccag actgttcgtt 2760 tcactcgcga atcactacgt tgatctgggt gcgctgcgct atactataaa gacggaaaat 2820 ggcataacac gcctctataa tccctatgcc ggtaacggcc gtccggtgaa acctgctccc 2880 tgcgtcgac 2889
<210> 87 <211> 4296 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético 296 <4Ο0> 87 ggatccttgg tacgagatga cgttgactat caaattttcc gcgactttgc ggaaaataaa 60 ggtaagtttt tcgtcggcgc cacagacctg tccgtcaaaa ataagagagg ccagaacatc 120 ggtaacgcac tgagcaacgt ccctatgatt gattttagtg tagcggacgt taataaacgg 180 attgcaaccg tcgttgatcc gcagtatgct gtcagcgtca aacatgctaa agcggaagtt 240 catacgttct attacgggca atataacggc cataacgatg tggctgataa agaaaatgaa 300 tatcgcgtgg tcgagcagaa caattacgaa ccgcacaaag cgtggggcgc gagtaattta 360 ggccgcctgg aggactataa catggcccgt ttcaataaat tcgtgaccga ggtagcaccg 420 atcgccccca cagatgctgg tgggggcctg gatacctaca aagataaaaa ccgcttctct 480 agcttcgtgc gcattggcgc cggtcgtcag ctcgtgtacg agaagggtgt ctatcaccag 540 gaaggtaatg aaaaggggta cgacctccgt gatttgtccc aggcgtatcg ctacgctatt 600 gccggaaccc cgtataaaga tattaatatc gatcaaacca tgaataccga aggcctaatt 660 ggtttcggga atcataataa gcaatatagc gcagaagagc taaagcaggc cctcagccaa 720 gatgcgttaa ccaattacgg agtgttaggc gatagcggca gtccgctgtt tgccttcgat 780 aaacagaaaa atcaatgggt gtttctgggc acttatgatt attgggccgg atatggtaaa 840 aagagctggc aggaatggaa tatttataaa aaggaattcg cagacaaaat caagcagcat 900 gacaacgcag gtacggtgaa ggggaacggc gaacatcact ggaagacgac cggcacgaat 960 agtcatatcg gatcgacggc cgttcgcctg gcgaacaatg agggcgatgc aaacaatggg 1020 caaaacgtga cctttgagga caacggtacc ctggtcctta accagaacat aaatcagggc 1080 gcgggaggct tgttctttaa aggcgactat actgttaagg gagcaaacaa tgacatcacc 1140 tggttagggg ccggtattga cgttgcggat ggaaaaaagg tggtttggca ggttaaaaac 1200 cctaacgggg accggctggc aaaaatcggc aaagggacat tggaaattaa tggtaccggt 1260 gtgaatcagg gtcagctgaa agtgggagat gggaccgtga ttctgaacca gaaagcagac 1320 gctgacaaaa aggtgcaagc ctttagccaa gtaggaattg ttagtggtcg tggcacactc 1380 gtcttgaact caagcaacca aataaatccg gataacctgt actttggatt tcgtggcgga 1440 cgcctggatg ctaacgggaa tgatctgacc tttgaacata tccgtaacgt tgacgagggt 1500 gcgcgcatag ttaatcataa tactgaccat gcatcaacta tcaccttgac cgggaaaagt 1560 ctgattacaa acccaaactc tctgtcagta cattccatcc agaatgatta tgatgaagac 1620 gattactcat actattaccg gccgcgtaga ccaattccac aaggtaaaga tctttattac 1680 297 1740 aaaaattacc gttattacgc attaaaatcc ggagggcggc tgaatgcacc tatgccggaa aatggcgtgg ccgaaaacaa tgactggatt tttatgggtt atactcaaga agaggctcgc 1800 aaaaatgcaa tgaaccataa aaataaccga aggatcggtg atttcggcgg atttttcgat 1860 gaggaaaatg gtaaaggtca caatggtgcg ctgaatctaa attttaacgg caaaagtgcc 1920 cagaaacgtt tccttctgac tggtggcgct aatctgaatg gtaaaatcag tgtgacgcag 1980 ggtaacgtgc tgctttctgg ccggccaact ccgcatgcac gtgattttgt aaataaatcg 2040 agcgctcgta aagatgcgca tttttctaaa aataacgagg tcgtgtttga agatgactgg 2100 ataaatcgca cctttaaagc ggcagaaatc gcggttaatc agagtgcgag cttttcatcg 2160 ggtaggaatg tatctgatat tacagcaaac attacagcca ctgataatgc gaaggtcaac 2220 ctgggttata aaaacggtga tgaagtttgt gttcgatcgg attacacggg ctatgttacc 2280 tgcaacactg gcaatctgtc tgataaagcg cttaactctt ttgacgccac gcgcattaac 2340 gggaatgtga acctgaacca aaacgctgcc ttggtacttg gtaaggccgc gttgtggggt 2400 aaaattcagg gccagggcaa ctcccgtgtg tctctgaacc agcactcgaa gtggcacctg 2460 acgggggact cgcaggtgca caacttgtcc ctggccgata gccatattca ccttaacaat 2520 gcgtccgatg cccagtcagc taataaatat catacgatca aaatcaatca cctctctggc 2580 aacggtcact ttcactactt aacggattta gcaaaaaact taggggataa agtcctggta 2640 aaagaatcag cgagcggaca ttatcagtta catgtacaga acaaaacagg cgagccaaat 2700 caggaaggcc ttgacttatt tgatgcttca tcggtacaag atcgttccag actgttcgtt 2760 tcactcgcga atcactacgt tgatctgggt gcgctgcgct atactataaa gacggaaaat 2820 ggcataacac gcctctataa tccctatgcc ggtaacggcc gtccggtgaa acctgctccc 2880 tgcgtcgacg gcatcattac ctccaaaact aaatctctga tagaaggtag atttggcggt 2940 ttcacgggcg cacgcaaatc agcgcgtaaa cgtaagaacc aggcgctagc gggcggtggc 3000 ggtagcggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcgcac tagtgctgca gtgtatcaag 3060 gttaacaact gggatttatt cttcagcccg agtgaagaca acttcaccaa cgacctgaac 3120 aaaggtgaag aaatcacctc agatactaac atcgaagcag ccgaagaaaa catctcgctg 3180 gacctgatcc agcagtacta cctgacct.tt aatttcgaca acgagccgga aaacatttct 3240 atcgaaaacc tgagctctga tatcatcggc cagctggaac tgatgccgaa catcgaacgt 3300 ttcccaaacg gtaaaaagta cgagctggac aaatatacca tgttccacta cctgcgcgcg 3360 caggaatttg aacacggcaa atcccgtatc gcactgacta actccgttaa cgaagctctg 3420 298 ctcaacccgt cccgtgtata caccttcttc tctagcgact acgtgaaaaa ggtcaacaaa 3480 gcgactgaag ctgcaatgtt cttgggttgg gttgaacagc ttgtttatga ttttaccgac 3540 gagacgtccg aagtatctac taccgacaaa attgcggata tcactatcat catcccgtac 3600 atcggtccgg ctctgaacat tggcaacatg ctgtacaaag acgacttcgt tggcgcactg 3660 atcttctccg gtgcggtgat cctgctggag ttcatcccgg aaatcgccat cccggtactg 3720 ggcacctttg ctctggtttc ttacattgca aacaaggttc tgactgtaca aaccatcgac 3780 aacgcgctga gcaaacgtaa cgaaaaatgg gatgaagttt acaaatatat cgtgaccaac 3840 tggctggcta aggttaatac tcagatcgac ctcatccgca aaaaaatgaa agaagcactg 3900 gaaaaccagg cggaagctac caaggcaatc attaactacc agtacaacca gtacaccgag 3960 gaagaaaaaa acaacatcaa cttcaacatc gacgatctgt cctctaaact gaacgaatcc 4020 atcaacaaag ctatgatcaa catcaacaag ttcctgaacc agtgctctgt aagctatctg 4080 atgaactcca tgatcccgta cggtgttaaa cgtctggagg acttcgatgc gtctctgaaa 4140 gacgccctgc tgaaatacat ttacgacaac cgtggcactc tgatcggtca ggttgatcgt 4200 ctgaaggaca aagtgaacaa taccttatcg accgacatcc cttttcagct cagtaaatat 4260 gtcgataacc aacgcctttt gtccactcta gactag 4296 <210> 88 <211> 1431 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 88 Gly Ser Leu Vai Arg Asp Asp Vai Asp Tyr Gin Ile Phe Arg Asp Phe 1 5 10 15
Ala Glu Asn Lys Gly Lys Phe Phe Vai Gly Ala Thr Asp Leu Ser Vai 20 25 30
Lys Asn Lys Arg Gly Gin Asn lie Gly Asn Ala Leu Ser Asn Vai Pro 35 40 45 299
Met Ile Asp Phe Ser Vai Ala Asp 50 55
Vai Asn Lys Arg Ile Ala Thr Vai 60
Vai Asp Pro Gin Tyr Ala Vai Ser 65 70
Vai Lys His Ala Lys Ala Glu Vai 75 80
His Thr Phe Tyr Tyr Gly Gin Tyr 65
Asn Gly His Asn Asp Vai Ala Asp 90 95
Lys Glu Asn Glu Tyr Arg Vai Vai 100
Glu Gin Asn Asn Tyr Glu Pro His 105 110
Lys Ala Trp Gly Ala Ser Asn Leu 115 120
Gly Arg Leu Glu Asp Tyr Asn Met 125
Ala Arg Phe Asn Lys Phe Vai Thr 130 135
Glu Vai Ala Pro Ile Ala Pro Thr 140
Asp Ala Gly Gly Gly Leu Asp Thr 145 150
Tyr Lys Asp Lys Asn Arg Phe Ser 155 160
Ser Phe Vai Arg Ile Gly Ala Gly 165
Arg Gin Leu Vai Tyr Glu Lys Gly 170 175
Vai Tyr His Gin Glu Gly Asn Glu 180
Lys Gly Tyr Asp Leu Arg Asp Leu 185 190
Ser Gin Ala Tyr Arg Tyr Ala Ile 195 200
Ala Gly Thr Pro Tyr Lys Asp Ile 205
Asn Ile Asp Gin Thr Met Asn Thr 210 215
Glu Gly Leu Ile Gly Phe Gly Asn 220
His Asn Lys Gin Tyr Ser Ala Glu 225 230
Glu Leu Lys Gin Ala Leu Ser Gin 235 240
Asp Ala Leu Thr Asn Tyr Gly Vai 245
Leu Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu 250 255
Phe Ala Phe Asp Lys Gin Lys Asn 260
Gin Trp vai Phe Leu Gly Thr Tyr 265 270 300
Asp Tyr Trp Ala Gly Tyr Gly Lys Lys Ser Trp Gin Glu Trp Asn Ile 275 280 285
Tyr Lys Lys Glu Phe Ala Asp Lys Ile Lys Gin His Asp Asn Ala Gly 290 295 300
Thr Vai Lys Gly Asn Gly Glu His His Trp Lys Thr Thr Gly Thr Asn 305 310 315 320
Ser His Ile Gly Ser Thr Ala Vai Arg Leu Ala Asn Asn Glu Gly Asp 325 330 335
Ala Asn Asn Gly Gin Asn Vai Thr Phe Glu Asp Asn Gly Thr Leu Vai 340 345 350
Leu Asn Gin Asn Ile Asn Gin Gly Ala Gly Gly Leu Phe Phe Lys Gly 355 360 365
Asp Tyr Thr Vai Lys Gly Ala Asn Asn Asp Ile Thr Trp Leu Gly Ala 370 375 380
Gly Ile Asp Vai Ala Asp Gly Lys Lys Vai Vai Trp Gin Vai Lys Asn 385 390 395 400
Pro Asn Gly Asp Arg Leu Ala Lys Ile Gly Lys Gly Thr Leu Glu Ile 405 410 415
Asn Gly Thr Gly Vai Asn Gin Gly Gin Leu Lys Vai Gly Asp Gly Thr 420 425 430
Vai Ile Leu Asn Gin Lys Ala Asp Ala Asp Lys Lys Vai Gin Ala Phe 435 440 445
Ser Gin vai Gly Ile Vai Ser Gly Arg Gly Thr Leu Vai Leu Asn Ser 450 455 460
Ser Asn Gin Ile Asn Pro Asp Asn Leu Tyr Phe Gly Phe Arg Gly Gly 465 470 475 480
Arg Leu Asp Ala Asn Gly Asn Asp Leu Thr Phe Glu His Ile Arg Asn 485 490 495
Vai Asp Glu Gly Ala Arg Ile Vai Asn His Asn Thr Asp His Ala Ser 500 505 510 301
Thr Ile Thr Leu Thr Gly Lys Ser Leu Ile Thr Asn Pro Asn Ser Leu 515 520 525
Ser Vai His Ser Ile Gin Asn Asp Tyr Asp Glu Asp Asp Tyr Ser Tyr 530 535 540
Tyr Tyr Arg Pro Arg Arg Pro Ile Pro Gin Gly Lys Asp Leu Tyr Tyr 545 550 555 560
Lys Asn Tyr Arg Tyr Tyr Ala Leu Lys Ser Gly Gly Arg Leu Asn Ala 565 570 575
Pro Met Pro Glu Asn Gly Vai Ala Glu Asn Asn Asp Trp Ile Phe Met 580 585 590
Gly Tyr Thr Gin Glu Glu Ala Arg Lys Asn Ala Met Asn His Lys Asn 595 600 605
Asn Arg Arg Ile Gly Asp Phe Gly Gly Phe Phe Asp Glu Glu Asn Gly 610 615 620
Lys Gly His Asn Gly Ala Leu Asn Leu Asn Phe Asn Gly Lys Ser Ala 625 630 635 640
Gin Lys Arg Phe Leu Leu Thr Gly Gly Ala Asn Leu Asn Gly Lys Ile 645 650 655
Ser val Thr Gin Gly Asn Vai Leu Leu Ser Gly Arg Pro Thr Pro His 660 665 670
Ala Arg Asp Phe Val Asn Lys Ser Ser Ala Arg Lys Asp Ala His Phe 675 680 685
Ser Lys Asn Asn Glu Val Val Phe Glu Asp Asp Trp Ile Asn Arg Thr 690 695 700
Phe Lys Ala Ala Glu Ile Ala Val Asn Gin Ser Ala Ser Phe Ser Ser 705 710 715 720
Gly Arg Asn Val Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ile Thr Ala Thr Asp Asn 725 730 735
Ala Lys Val Asn Leu Gly Tyr Lys Asn Gly Asp Glu Val Cys Val Arg 740 745 750 302
Ala Lys Vai Asn Leu Gly Tyr Lys Asn Gly Asp Glu Vai Cys Vai Arg 740 745 750
Ser Asp Tyr Thr Gly Tyr Vai Thr Cys Asn Thr Gly Asn Leu Ser Asp 755 760 765
Lys Ala Leu Asn Ser Phe Asp Ala Thr Arg Ile Asn Gly Asn Vai Asn 770 775 780
Leu Asn Gin Asn Ala Ala Leu Vai Leu Gly Lys Ala Ala Leu Trp Gly 785 790 795 800
Lys Ile Gin Gly Gin Gly Asn Ser Arg Vai Ser Leu Asn Gin His Ser 805 810 815
Lys Trp His Leu Thr Gly Asp Ser Gin Vai His Asn Leu Ser Leu Ala 820 825 830
Asp Ser His Ile His Leu Asn Asn Ala Ser Asp Ala Gin Ser Ala Asn 835 840 845
Lys Tyr His Thr Ile Lys Ile Asn His Leu Ser Gly Asn Gly His Phe 850 855 860
His Tyr Leu Thr Asp Leu Ala Lys Asn Leu Gly Asp Lys Vai Leu Vai 8S5 870 875 880
Lys Glu Ser Ala Ser Gly His Tyr Gin Leu His Vai Gin Asn Lys Thr 885 890 895
Gly Glu Pro Asn Gin Glu Gly Leu Asp Leu Phe Asp Ala Ser Ser Vai 900 905 910
Gin Asp Arg Ser Arg Leu Phe Vai Ser Leu Ala Asn His Tyr Vai Asp 915 920 925
Leu Gly Ala Leu Arg Tyr Thr Ile Lys Thr Glu Asn Gly Ile Thr Arg 930 935 940
Leu Tyr Asn Pro Tyr Ala Gly Asn Gly Arg Pro Vai Lys Pro Ala Pro 945 950 955 960 303
Cys Vai Asp Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Ile Glu Gly 965 970 975
Arg Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Arg Lys 980 985 990
Asn Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 995 1000 1005
Gly Gly Gly Ser Ala Leu Vai Leu Gin Cys Ile Lys Vai Asn Asn 1010 1015 1020
Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp 1025 1030 1035
Leu Asn Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala 1040 1045 1050
Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gin Gin Tyr Tyr Leu 1055 1060 1065
Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn 1070 1075 1080
Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gin Leu Glu Leu Met Pro Asn Ile 1085 1090 1095
Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr 1100 1105 1110
Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gin Glu Phe Glu His Gly Lys Ser 1115 1120 1125
Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Vai Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro 1130 1135 1140
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Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Vai Glu Gin 1160 1165 1170
Leu Vai Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Vai Ser Thr Thr 1175 1180 1185 304
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro 1190 1195 1200
Ala Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Vai Gly 1205 1210 1215
Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Vai Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro 1220 1225 1230
Glu Ile Ala Ile Pro Vai Leu Gly Thr Phe Ala Leu Vai Ser Tyr 1235 1240 1245
Ile Ala Asn Lys Vai Leu Thr Vai Gin Thr Ile Asp Asn Ala Leu 1250 1255 1260
Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Vai Tyr Lys Tyr Ile Vai 1265 1270 1275
Thr Asn Trp Leu Ala Lys Vai Asn Thr Gin Ile Asp Leu Ile Arg 1280 1285 1290
Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala Glu Ala Thr Lys 1295 1300 1305
Ala Ile Ile Asn Tyr Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu Glu Glu Lys 1310 1315 1320
Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn 1325 1330 1335
Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn 1340 1345 1350
Gin Cys Ser Vai Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly 1355 1360 1365
Vai Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu 1370 1375 1380
Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gin Vai 1385 1390 1395 305
Asp Arg Leu Lys Asp Lys Vai Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp lie 1400 1405 1410
Pro Phe Gin Leu Ser Lys Tyr Vai Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser 1415 1420 1425
Thr Leu Asp 1430
<210> 89 <211> 1357 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <400> 89 gctagcgggc ggtggcggta gcggcggtgg cggtagcggc ggtggcggta gcgcactagt 60 gctgcagtgt atcaaggtta acaactggga tttattcttc agcccgagtg aagacaactt 120 caccaacgac ctgaacaaag gtgaagaaat cacctcagat actaacatcg aagcagccga 180 agaaaacatc tcgctggacc tgatccagca gtactacctg acctttaatt tcgacaacga 240 gccggaaaac atttctatcg aaaacctgag etctgatatc atcggccagc tggaactgat 300 gccgaacatc gaacgtttcc caaacggtaa aaagtacgag ctggacaaat ataccatgtt 360 ccactacctg cgcgcgcagg aatttgaaca cggcaaatcc cgtatcgcac tgactaactc 420 cgttaacgaa gctctgctca acccgtcccg tgtatacacc ttcttctcta gcgactacgt 480 gaaaaaggtc aacaaagcga ctgaagctgc aatgttcttg ggttgggttg aacagcttgt 540 ttatgatttt accgacgaga cgtccgaagt atctactacc gacaaaattg cggatatcac 600 tatcatcatc ccgtacatcg gtccggctct gaacattggc aacatgctgt acaaagacga 660 cttcgttggc gcactgatct tctccggtgc ggtgatcctg ctggagttca tcccggaaat 720 cgccatcccg gtactgggca cctttgctct ggtttcttac attgcaaaca aggttctgac 780 tgtacaaacc atcgacaacg cgctgagcaa acgtaacgaa aaatgggatg aagtttacaa 840 306 atatatcgtg accaactggc tggctaaggt taatactcag atcgacctca tccgcaaaaa 900 aatgaaagaa gcactggaaa accaggcgga agctaccaag gcaatcatta actaccagta 960 caaccagtac accgaggaag aaaaaaacaa catcaacttc aacatcgacg atctgtcctc 1020 taaactgaac gaatccatca acaaagctat gatcaacatc aacaagttcc tgaaccagtg 1080 ctctgtaagc tatctgatga actccatgat cccgtacggt gttaaacgtc tggaggactt 1140 cgatgcgtct ctgaaagacg ccctgctgaa atacatttac gacaaccgtg gcactctgat 1200 cggtcaggtt gatcgtctga aggacaaagt gaacaatacc ttatcgaccg acatcccttt 1260 tcagctcagt aaatatgtcg ataaccaacg ccttttgtcc actctagaaa tagaaggtag 1320 aagtgggcac catcaccatc accattaatg aaagctt 1357
<210> 90 <211> 2745 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 90 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 307 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga acogcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaacgtaaga accaggcgct agcgggcggt ggcggtagcg gcggtggcgg tagcggcggt 1440 ggcggtagcg cactagtgct gcagtgtatc aaggttaaca actgggattt attcttcagc 1500 ccgagtgaag acaacttcac caacgacctg aacaaaggtg aagaaatcac ctcagatact 1560 aacatcgaag cagccgaaga aaacatctcg ctggacctga tccagcagta ctacctgacc 1620 tttaatttcg acaacgagcc ggaaaacatt tctatcgaaa acctgagctc tgatatcatc 1680 ggccagctgg aactgatgcc gaacatcgaa cgtttcccaa acggtaaaaa gtacgagctg 1740 gacaaatata ccatgttcca ctacctgcgc gcgcaggaat ttgaacacgg caaatcccgt 1800 atcgcactga ctaactccgt taacgaagct ctgctcaacc cgtcccgtgt atacaccttc 1860 ttctctagcg actacgtgaa aaaggtcaac aaagcgactg aagctgcaat gttcttgggt 1920 tgggttgaac agcttgttta tgattttacc gacgagacgt ccgaagtatc tactaccgac 1980 aaaattgcgg atatcactat catcatcccg tacatcggtc cggctctgaa cattggcaac 2040 atgctgtaca aagacgactt cgttggcgca ctgatcttct ccggtgcggt gatcctgctg 2100 gagttcatcc cggaaatcgc catcccggta ctgggcacct ttgctctggt ttcttacatt 2160 gcaaacaagg ttctgactgt acaaaccatc gacaacgcgc tgagcaaacg taacgaaaaa 2220 tgggatgaag tttacaaata tatcgtgacc aactggctgg ctaaggttaa tactcagatc 2280 gacctcatcc gcaaaaaaat gaaagaagca ctggaaaacc aggcggaagc taccaaggca 2340 atcattaact accagtacaa ccagtacacc gaggaagaaa aaaacaacat caacttcaac 2400 308 atcgacgatc tgtcctctaa actgaacgaa tccatcaaca aagctatgat caacatcaac 2460 aagttcctga accagtgctc tgtaagctat ctgatgaact ccatgatcoc gtacggtgtt 2520 aaacgtctgg aggacttcga tgcgtctctg aaagacgccc tgctgaaata catttacgac 2580 aaccgtggca ctctgatcgg tcaggttgat cgtctgaagg acaaagtgaa caatacctta 2640 tcgaccgaca tcccttttca gctcagtaaa tatgtcgata accaacgcct tttgtccact 2700 ctagaaatag aaggtagaag tgggcaccat caccatcacc attaa 2745
<210> 91 <211> 914 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 91
Gly Ser Met Glu Phe Vai Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Vai 15 10 15
Asn Gly Vai Asp lie Ala Tyr Ile Lys lie Pro Asn Ala Gly Gin Met 20 25 30
Gin Pro Vai Lys Ala Phe Lys lie His Asn Lys Ile Trp Vai Ile Pro 35 40 45
Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro 50 55 60
Pro Glu Ala Lys Gin Vai Pro Vai Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu 65 70 75 80
Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Vai Thr Lys Leu 85 90 95
Phe Glu Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser 100 105 110
Ile Vai Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu 115 120 125 309
Leu Lys Vai Ile Asp Thr Asn Cys 130 135
Ile Asn Vai Ile Gin Pro Asp Gly 140
Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn 145 150
Leu Vai Ile Ile Gly Pro Ser Ala 155 160
Asp Ile Ile Gin Phe Glu Cys Lys 165
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Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser 180
Thr Gin Tyr Ile Arg Phe Ser Pro 185 190
Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu 195 200
Ser Leu Glu Vai Asp Thr Asn Pro 205
Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala 210 215
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Pro Asn Arg Vai Phe Lys Vai Asn 245
Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 250 255
Gly Leu Glu Vai Ser Phe Glu Glu 260
Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 265 270
Ala Lys Phe Ile Asp Ser Leu Gin 275 280
Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr 285
Tyr Asn Lys Phe Lys Asp Ile Ala 290 295
Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser 300
Ile Vai Gly Thr Thr Ala Ser Leu 305 310
Gin Tyr Met Lys Asn Vai Phe Lys 315 320
Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp 325
Thr Ser Gly Lys Phe Ser Vai Asp 330 335
Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr 340
Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr 345 350 310
Glu Asp Asn Phe Vai Lys Phe Phe 355 360
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Leu Asn Phe Asp Lys Ala Vai Phe 370 375
Lys Ile Asn Ile Vai Pro Lys Vai 380
Asn Tyr Thr Ile Tyr Asp Gly Phe 385 390
Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 395 400
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Glu lie Asn Asn Met Asn Phe Thr 410 415
Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu 420
Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 425 430
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Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg 450 455
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Glu Ile Ala Ile Pro Vai Leu Gly Thr Phe Ala Leu Vai Ser Tyr Ile 705 710 715 720
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Leu Ala Lys Vai Asn Thr Gin Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys 755 760 765
Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr 770 775 780
Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn 785 790 795 800
Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met 805 810 815 312
Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn Gin Cys Ser Vai Ser Tyr Leu Met 820 825 830
Asn Ser Met lie Pro Tyr Gly Vai Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala 835 840 845
Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr 850 855 860
Leu ile Gly Gin Vai Asp Arg Leu Lys Asp Lys vai Asn Asn Thr Leu 865 870 875 880
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Leu Leu Ser Thr Leu Glu Ile Glu Gly Arg 900 905
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<210> 96 <211> 2736 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 96 ggatccatgc ctattactat taacaatttt cgttatagcg atcccgtcaa caatgacacc SO attatcatga tggaaccgcc atattgcaaa ggactggaca tttactataa agccttcaag 120 attactgacc gcatttggat tgttccagag cgttacgagt tcgggacgaa accagaagat 180 tttaacccgc cttcatcgct gatcgaagga gcatcagagt attacgatcc gaactatctg 240 cgtacggaca gcgataaaga ccgcttctta cagaccatgg tcaaactttt taaccgtatt 300 aagaacaatg tggccggaga agcactcttg gataagatta tcaacgcgat tccatacctg 360 ggcaattctt acagcctgct ggataaattt gacacaaata gtaattcagt cagctttaac 420 ctgttagaac aagatccgag tggcgcaacc acgaagtctg ccatgctgac aaatctgatc 480 atttttggtc caggtcctgt actgaataaa aatgaagtac gcggcatcgt tctccgcgtg 540 gacaataaga actacttccc atgccgtgac ggcttcggtt cgatcatgca gatggctttc 600 tgtccggagt acgttccgac gtttgataat gttattgaga atatcacgag tttaacaatc 660 ggtaagtcaa aatattttca agatccggcc cttctcctta tgcatgaact gattcacgtg 720 ctgcacggct tatatggtat gcaagtgtcc tcgcatgaaa tcattccgtc caaacaggaa 780 atttatatgc agcataccta cccgatttca gctgaagagt tgtttacgtt tggtggooag 840 gacgcgaatt tgatctccat cgacatcaaa aacgatctgt atgagaaaac attaaatgac 900 tataaagcga ttgcgaacaa actgtctcag gtgactagct gcaacgatcc taacattgat 960 attgattcct acaaacaaat ttatcaacag aaataccagt tcgataaaga cagcaatggt 1020 cagtatatcg taaacgaaga taaatttcag atcctgtata acagcattat gtatggcttt 1080 accgaaattg agttggggaa gaaatttaac attaaaaccc gtctgtctta ttttagtatg 1140 aaccatgatc cggtgaaaat ccccaatctg cttgatgata ccatttataa tgataccgaa 1200 gggttcaaca ttgaatctaa ggatctgaaa tccgaataca aaggccaaaa tatgcgtgtt 1260 aatactaacg ctttccgtaa tgttgatggt agtggactcg totcgaaact gattgggttg 1320 320 tgtgtcgacg gcatcattac ctccaaaact aaatctctga tagaaggtag atttggcggt 1380 ttcacgggcg cacgcaaatc agcgcgtaaa cgtaagaacc aggcgctagc gggcggtggc 1440 ggtagcggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcgcac tagtgctgca gtgtatcaag 1500 gttaacaact gggatttatt cttcagcccg agtgaagaca acttcaccaa cgacctgaac 1560 aaaggtgaag aaatcacctc agatactaac atcgaagcag ccgaagaaaa catctcgctg 1620 gacctgatcc agcagtacta cctgaccttt aatttcgaca acgagccgga aaacatttct 1680 atcgaaaacc tgagctctga tatcatcggc cagctggaac tgatgccgaa catcgaacgt 1740 ttcccaaacg gtaaaaagta cgagctggac aaatatacca tgttccacta cctgcgcgcg 1800 caggaatttg aacacggcaa atcccgtatc gcactgacta actccgttaa cgaagctctg 1860 ctcaacccgt cccgtgtata caccttcttc tctagcgact acgtgaaaaa ggtcaacaaa 1920 gcgactgaag ctgcaatgtt cttgggttgg gttgaacagc ttgtttatga ttttaccgac 1980 gagacgtccg aagtatctac taccgacaaa attgcggata tcactatcat catcccgtac 2040 atcggtccgg ctctgaacat tggcaacatg ctgtacaaag acgacttcgt tggcgcactg 2100 atcttctccg gtgcggtgat cctgctggag ttcatcccgg aaatcgccat cccggtactg 2160 ggcacctttg ctctggtttc ttacattgca aacaaggttc tgactgtaca aaccatcgac 2220 aacgcgctga gcaaacgtaa cgaaaaatgg gatgaagttt acaaatatat cgtgaccaac 2280 tggctggcta aggttaatac tcagatcgac ctcatccgca aaaaaatgaa agaagcactg 2340 gaaaaccagg cggaagctac caaggcaatc attaactacc agtacaacca gtacaccgag 2400 gaagaaaaaa acaacatcaa cttcaacatc gacgatctgt cctctaaact gaacgaatcc 2460 atcaacaaag ctatgatcaa catcaacaag ttcctgaacc agtgctctgt aagctatctg 2520 atgaactcca tgatcccgta cggtgttaaa cgtctggagg acttcgatgc gtctctgaaa 2580 gacgccctgc tgaaatacat ttacgacaac cgtggcactc tgatcggtca ggttgatcgt 2640 ctgaaggaca aagtgaacaa taccttatcg accgacatcc cttttcagct cagtaaatat 2700 gtcgataacc aacgcctttt gtccactcta gactag 2736 321 <210> 97 <211> 911 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <4 0 0> 97
Gly Ser Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Vai 15 10 15
Asn Asn Asp Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu 20 25 30
Asp Ile Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Vai 35 40 45
Pro Glu Arg Tyr Glu Phe Gly Thr 50 55
Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro 60
Ser Ser Leu Ile Glu Gly Ala Ser 65 70
Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu 75 80
Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg 85
Phe Leu Gin Thr Met Vai Lys Leu 90 95
Phe Asn Arg Ile Lys Asn Asn Vai 100
Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys 105 110
Ile Ile Asn Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp 115 120 125
Lys Phe Asp Thr Asn Ser Asn Ser Vai Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gin 130 135 140
Asp Pro Ser Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile 145 150 155 160
Ile Phe Gly Pro Gly Pro Vai Leu Asn Lys Asn Glu Vai Arg Gly Ile 165 170 175 322
Vai Leu Arg Vai Asp Asn Lys Asn 180
Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe 185 190
Gly Ser Ile Met Gin Met Ala Phe 195 200
Cys Pro Glu Tyr Vai Pro Thr Phe 205
Asp Asn Vai Ile Glu Asn Ile Thr 210 215
Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys 220
Tyr Phe Gin Asp Pro Ala Leu Leu 225 230
Leu Met His Glu Leu Ile His Vai 235 240
Leu His Gly Leu Tyr Gly Met Gin 245
Vai Ser Ser His Glu Ile Ile Pro 250 255
Ser Lys Gin Glu Ile Tyr Met Gin 260
His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu 265 270
Glu Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gin 275 280
Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp 285
Ile Lys Asn Asp Leu Tyr Glu Lys 290 295
Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile 300
Ala Asn Lys Leu Ser Gin Vai Thr 305 310
Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp 315 320
Ile Asp Ser Tyr Lys Gin Ile Tyr 325
Gin Gin Lys Tyr Gin Phe Asp Lys 330 335
Asp Ser Asn Gly Gin Tyr Ile Vai 340
Asn Glu Asp Lys Phe Gin Ile Leu 345 350
Tyr Asn Ser Ile Met Tyr Gly Phe 355 360
Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys 365
Phe Asn Ile Lys Thr Arg Leu Ser 370 375
Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro 380
Vai Lys Ile Pro Asn Leu Leu Asp 385 390
Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu 395 400
Gly Phe Asn Ile Glu Ser Lys Asp 405
Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gin 410 415 323
Asn Met Arg Vai Asn Thr Asn Ala 420
Phe Arg Asn Vai Asp Gly Ser Gly 425 430
Leu Vai Ser Lys Leu Ile Gly Leu 435 440
Cys Vai Asp Gly Ile Ile Thr Ser 445
Lys Thr Lys Ser Leu Ile Glu Gly 450 455
Arg Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala 460
Arg Lys Ser Ala Arg Lys Arg Lys 465 470
Asn Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly 475 480
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 485
Gly Gly Gly Ser Ala Leu Vai Leu 490 495
Gin Cys Ile Lys Vai Asn Asn Trp 500
Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu 505 510
Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn 515 520
Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp 525
Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu 530 535
Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gin 540
Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe 545 550
Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser 555 560
Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile 565
Ile Gly Gin Leu Glu Leu Met Pro 570 575
Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly 580
Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr 585 590
Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala 595 600
Gin Glu Phe Glu His Gly Lys Ser 605
Arg He Ala Leu Thr Asn Ser Vai 610 615
Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser 620
Arg Vai Tyr Thr Phe Phe Ser Ser 625 630
Asp Tyr Vai Lys Lys Vai Asn Lys 635 640
Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Vai Glu Gin Leu Vai Tyr 645 650 655 324
Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Vai Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala 660 665 670 Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly 675 680 685 Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Vai Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly 690 695 700 Ala Vai Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala Ile Pro Vai Leu 705 710 715 720 Gly Thr Phe Ala Leu Vai Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Vai Leu Thr Vai 725 730 735 Gin Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu 740 745 750 Vai Tyr Lys Tyr Ile Vai Thr Asn Trp Leu Ala Lys Vai Asn Thr Gin 755 760 765 Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala 770 775 780 Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu 785 790 795 800 Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys 805 810 815 Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu 820 825 830 Asn Gin Cys Ser Vai Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly 835 840 845 Vai Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu 850 855 860 Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gin Vai Asp Arg 865 870 875 880 325
Leu Lys Asp Lys Vai Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gin 885 890 895
Leu Ser Lys Tyr Vai Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser Thr Leu Asp 900 905 910
<210> 98 <211> 180 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 98 ggatccacgc acgtcgacgc gattgatggt cgttttggcg gtttcacggg cgcacgcaaa 60 tcagcgcgta aacgtaagaa ccaggcgcta gcgggcggtg gcggtagcgg cggtggcggt 120 agcggcggtg gcggtagcgc actagtgctg cagacgcacg gtctagaatg ataaaagctt 180
<210> 99 <211> 2715 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintético <400> 99 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataae 60 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 326 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 aacggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgcgtcgacg cgattgatgg tcgttttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaacgtaaga accaggcgct agcgggeggt ggcggtagcg gcggtggcgg tagcggcggt 1440 ggcggtagcg cactagtgct gcagtgtcgt gaactgctgg tgaaaaacac cgatctgccg 1500 tttattggcg atatcagcga tgtgaaaacc gatatcttcc tgcgcaaaga tatcaacgaa 1560 gaaaccgaag tgatctacta cccggataac gtgagcgttg atcaggtgat cctgagcaaa 1620 aacaccagcg aacatggtca gctggatctg ctgtatccga gcattgatag cgaaagcgaa 1680 attctgccgg gcgaaaacca ggtgttttac gataaccgta cccagaacgt ggattacctg 1740 aacagctatt actacctgga aagccagaaa ctgagcgata acgtggaaga ttttaccttt 1800 acccgcagca ttgaagaagc gctggataac agcgcgaaag tttacaccta ttttccgacc 1860 etggcgaaca aagttaatgc gggtgttcag ggcggtctgt ttctgatgtg ggcgaacgat 1920 gtggtggaag atttcaccac caacatcctg cgtaaagata ccctggataa aatcagcgat 1980 gttagcgcga ttattccgta tattggtccg gcgctgaaca ttagcaatag cgtgcgtcgt 2040 327 ggcaatttta ccgaagcgtt tgcggttacc gaatttacca ttccggcgct gggtgcgttt gaaatcatca aaaccatcga taactgcctg tatgaatgga tgatgggcac ctggctgagc taccagatgt acgatagcct gaactatcag gaatacaaaa aatacagcgg cagcgataaa aaaaacagcc tggatgtgaa aattagcgaa gaatgcagcg tgacctacct gttcaaaaac gaatttgatc gcaacaccaa agcgaaactg ctggtgggcg aagtggataa actgaaagcg ccgtttaaca tcttcagcta taccaacaac ttcaatctag actag ggtgtgacca ttctgctgga agcgtttccg gtgatctata gcaaagtgca ggaacgcaac gaacagcgta ttaaacgctg gaaagatagc cgtattatca cccagttcaa caacatcagc gcgggtgega ttaaagcgaa aatcgatctg gaaaacatca aaagccaggt tgaaaacctg gcgatgaata acatcaacaa attcatccgc atgctgccga aagtgatcga tgaactgaac atcaacctga tcgatagcca caacattatt aaagttaaca acagcttcca gaacaccatc agcctgctga aagatatcat caacgaatac 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2715 <210> 100 <211> 904 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 100
Gly Ser Glu Phe Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp 15 10 15
Pro Vai Asp Asn Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr 20 25 30
Leu Ala Asn Glu Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp 35 40 45
Vai Ile Pro Asp Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys 50 55 60 328
Pro Pro Arg Vai Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr 65 70 75 80
Leu Ser Thr Asp Ser Asp Lys Asp Thr Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys 85 90 95
Leu Phe Lys Arg Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr 100 105 110
Arg Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile 115 120 125
Asn Thr Phe Asp Phe Asp Vai Asp Phe Asn Ser Vai Asp Vai Lys Thr 130 135 140
Arg Gin Gly Asn Asn Trp Vai Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Vai 145 150 155 160
Ile Ile Thr Gly Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr 165 170 175
Phe Lys Leu Thr Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gin Glu Gly Phe Gly Ala 180 185 190
Leu Ser Ile Ile Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn 195 200 205
Ala Thr Asn Asp Vai Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys 210 215 220
Met Asp Pro Ile Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His 225 230 235 240
Asn Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gin Thr ile Ser Ser Vai 245 250 255
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Ala Arg Lys Tyr Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile 290 295 300 329
Ala Lys Arg Leu Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn 305 310 315 320
Lys Tyr Ile Gly Glu Tyr Lys Gin Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe 325 330 335
Vai Vai Glu Ser Ser Gly Glu Vai Thr Vai Asn Arg Asn Lys Phe Vai 340 345 350
Glu Leu Tyr Asn Glu Leu Thr Gin Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala 355 360 365
Lys Ile Tyr Asn Vai Gin Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn Vai Tyr 370 375 380
Thr Pro Vai Thr Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Vai Tyr Asp 11 e Gin 385 390 395 400
Asn Gly Phe Asn Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Vai Leu Phe Met Gly 405 410 415
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Met Leu Tyr Leu Phe Thr Lys Phe Cys Vai Asp Ala Ile Asp Gly Arg 435 440 445
Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Arg Lys Asn 450 455 460
Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480
Gly Gly Ser Ala Leu Vai Leu Gin Cys Arg Glu Leu Leu Vai Lys Asn 485 490 495
Thr Asp Leu Pro Phe Ile Gly Asp Ile Ser Asp Vai Lys Thr Asp lie 500 505 510
Phe Leu Arg Lys Asp Ile Asn Glu Glu Thr Glu Vai Ile Tyr Tyr Pro 515 520 525
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His Gly Gin Leu Asp Leu Leu Tyr 545 550
Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu 555 560
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Tyr Leu Glu Ser Gin Lys Leu Ser 585 590
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Vai Asn Ala Gly Vai Gin Gly Gly 625 630
Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp 635 640
Vai Vai Glu Asp Phe Thr Thr Asn 645
Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp 650 655
Lys Ile Ser Asp Vai Ser Ala Ile 660
Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu 665 670
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Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala 685
Vai Thr Gly Vai Thr Ile Leu Leu 690 695
Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile 700
Pro Ala Leu Gly Ala Phe Vai Ile 705 710
Tyr Ser Lys Vai Gin Glu Arg Asn 715 720
Glu Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn 725
Cys Leu Glu Gin Arg Ile Lys Arg 730 735
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Ile Thr Gin Phe Asn Asn Ile Ser 755 760
Tyr Gin Met Tyr Asp Ser Leu Asn 765
Tyr Gin Ala Gly Ala Ile Lys Ala 770 775
Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys 780 331
Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn Ile Lys Ser Gin Val Glu Asn Leu 785 790 795 800 Lys Asn Ser Leu Asp Val Lys Ile Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn 805 810 815 Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser Val Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu 820 825 83 0 Pro Lys Val Ile Asp Glu Leu Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala 835 840 845 Lys Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ser His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu 850 855 860 val Asp Lys Leu Lys Ala Lys Val Asn Asn Ser Phe Gin Asn Thr Ile 865 870 875 880 Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile 885 890 895 Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Leu Asp 900
Lisboa, 18 de Novembro de 2013 332

Claims (18)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Conjugado proteico não citotóxico para inibição ou redução da fusão exocitica numa célula aferente sensorial nociceptiva, compreendendo: (i) um Unidade de Direccionamento (TM) de nociceptina, em que a referida TM é um agonista de um receptor presente na referida célula aferente sensorial nociceptiva e em que o referido receptor sofre endocitose para ser incorporado num endossoma dentro da célula aferente sensorial nociceptiva; (ii) uma protease não citotóxica ou um seu fragmento, em que a protease ou o fragmento de protease é capaz de clivar uma proteína da maquinaria de fusão exocitica da referida célula aferente sensorial nociceptiva; e (iii) um Domínio de Translocação, em que o Domínio de Translocação transloca a protease ou o fragmento de protease de dentro do endossoma, através da membrana endossomal e para o citosol da célula aferente sensorial nociceptiva, em que a TM de nociceptina, o Domínio de Translocação e a protease não citotóxica ou seu fragmento estão ligados covalentemente. 1
  2. 2. Conjugado não citotóxico da Reivindicação 1, em que o receptor é um receptor ORLi.
  3. 3. Conjugado não citotóxico da Reivindicação 1 ou 2, em que a TM tem, pelo menos, 70% ou, pelo menos, 80% de homologia com a SEQ ID N° 2 ou um seu fragmento.
  4. 4. Conjugado não citotóxico da Reivindicação 1 ou 2, em que a TM tem, pelo menos, 90% de homologia com a SEQ ID N° 2 ou um seu fragmento; ou em que a TM tem, pelo menos, 95% de homologia com a SEQ ID N° 2 ou um seu fragmento.
  5. 5. Conjugado não citotóxico da Reivindicação 1 ou Reivindicação 2, em que a TM é a SEQ ID N° 2 ou um seu fragmento.
  6. 6. Conjugado não citotóxico da Reivindicação 1 ou Reivindicação 2, em que a TM é uma nociceptina seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID N° 4, 6, 8, 10, 12, 14.
  7. 7. Conjugado não citotóxico da Reivindicação 1 ou Reivindicação 2, em que a TM tem, pelo menos, 70% ou, pelo menos, 80% ou, pelo menos, 90% ou, pelo menos, 95% de homologia com a SEQ ID N° 14 ou um seu fragmento.
  8. 8. Conjugado não citotóxico de qualquer reivindicação anterior, em que a protease não citotóxica é uma proteína bacteriana, ou um seu fragmento, capaz de clivar uma proteína da maquinaria de fusão exocítica da célula aferente sensorial nociceptiva. 2
  9. 9. Conjugado não citotóxico da Reivindicação 8, em que a protease não citotóxica é seleccionada de uma neurotoxina clostridial ou uma protease de IgA.
  10. 10. Conjugado não citotóxico de qualquer reivindicação anterior, em que o Dominio de Translocação é derivado de uma fonte clostridial; de um modo preferido, em que o Dominio de Translocação é um dominio HN botulinico.
  11. 11. Conjugado não citotóxico de qualquer reivindicação anterior, em que a célula aferente sensorial nociceptiva é uma célula aferente sensorial nociceptiva primária.
  12. 12. Conjugado não citotóxico de acordo com a Reivindicação 1, em que o referido conjugado compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID N° 14, 16, 18, 20, 22, 24 e 26.
  13. 13. Composição farmacêutica, compreendendo um conjugado de acordo com qualquer das Reivindicações 1 a 12 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
  14. 14. Construção de ADN que codifica o conjugado de qualquer das Reivindicações 1 a 12.
  15. 15. Construção de ADN de acordo com a Reivindicação 14, em que a construção compreende uma sequência de ADN seleccionada de SEQ ID N° 13, 15, 17, 19, 21, 23 e 25.
  16. 16. Método de preparação do conjugado de qualquer das Reivindicações 1 a 12, compreendendo a expressão da 3 construção de ADN da Reivindicação 15 numa célula hospedeira.
  17. 17. Utilização de um conjugado de acordo com qualquer das Reivindicações 1-12 ou de uma composição de acordo com a Reivindicação 13, para o fabrico de um medicamento para tratamento da dor.
  18. 18. Conjugado de acordo com qualquer das Reivindicações 1-12 ou uma composição de acordo com a Reivindicação 13, para utilização no tratamento da dor. Lisboa, 18 de Novembro de 2013 4
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