ES2387013T3 - Conjugados de proteínas no citotóxicas - Google Patents

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Abstract

Un conjugado de proteína no citotóxica para la inhibición o reducción de fusión exocítica en una célulaaferente sensorial nociceptiva, que comprende:(i) una Fracción de direccionamiento (TM) de dinorfina,en el que dicha TM de dinorfina es un agonista de un receptor presente en dicha célula aferente sensorialnociceptiva, y en el que dicho receptor experimenta una endocitosis que se incorporará en un endosoma en elinterior de la célula aferente sensorial nociceptiva;(ii) una proteasa no citotóxica o un fragmento de la misma,en que la proteasa o el fragmento de proteasa es capaz de segmentar una proteína del aparato de fusión exocíticade dicha célula aferente sensorial nociceptiva; y(iii) un Dominio de translocación,en que el Dominio de translocación transloca la proteasa o el fragmento de proteasa desde el interior del endosoma,a través de la membrana endosómica, y en el citosol de la célula aferente sensorial nociceptiva.

Description

Conjugados de proteínas no citotóxicas
[0001] La presente invención se refiere a un conjugado de proteína no citotóxica, y al uso de dicho conjugado para el tratamiento del dolor.
[0002] Las toxinas pueden dividirse generalmente en dos grupos según el tipo de efecto que tienen en una célula diana. Más en detalle, el primer grupo de toxinas destruye sus células diana naturales, y por tanto son conocidas como moléculas de toxinas citotóxicas. Este grupo de toxinas se ilustra, entre otros, por toxinas vegetales como ricina y abrina, y por toxinas bacterianas como toxina de la difteria y exotoxina A de Pseudomonas. Normalmente, las toxinas citotóxicas destruyen sus células diana por la inhibición del proceso celular de síntesis de proteínas.
[0003] En cambio, el segundo grupo de toxinas, que son conocidas como toxinas no citotóxicas, no destruyen (como confirma su nombre) sus células diana naturales. Las toxinas no citotóxicas han atraído mucho menos interés comercial que sus alternativas citotóxicas, y ejercen sus efectos en una célula diana mediante la inhibición de procesos celulares distintos de la síntesis de proteínas. Al igual que sus alternativas citotóxicas, las toxinas no citotóxicas se producen a partir de una diversidad de fuentes como plantas y bacterias. A continuación se describen en más detalle las toxinas no citotóxicas bacterianas.
[0004] Las neurotoxinas clostridiales son proteínas que tienen normalmente una masa molecular del orden de 150 kDa. Son producidas por diversas especies de bacterias, especialmente del genero Clostridium, de forma muy significativa C. tetani y varias cepas de C. botulinum, C. butyricum y C. argentinense. En la actualidad existen ocho clases diferentes de la neurotoxina clostridial, que son: toxina tetánica y neurotoxina botulínica en sus serotipos A, B, C1, D, E, F y G, y todas comparten estructuras y modos de acción similares.
[0005] Las neurotoxinas clostridiales representan un grupo importante de moléculas de toxinas no citotóxicas, y son sintetizadas por la bacteria hospedadora como polipéptidos únicos que son modificados posttraduccionalmente por un episodio de segmentación proteolítica para formar dos cadenas de polipéptidos unidas entre sí por un enlace de disulfuro. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (cadena H), que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y cadena ligera (cadena L), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa.
[0006] Las cadenas L poseen una función proteasa (actividad de endopeptidasa dependiente del cinc) y muestran alta especificidad de sustratos para proteínas asociadas a membrana vesicular y/o plasmática implicadas en el procedimiento exocítico. Las cadenas L de diferentes especies o serotipos clostridiales pueden hidrolizar enlaces peptídicos diferentes pero específicos en una de tres proteínas sustrato, que son sinaptobrevina, sintaxina o SNAP-25. Estos sustratos son componentes importantes de la maquinaria neurosecretora.
[0007] Las toxinas no citotóxicas son producidas también por otras bacterias, como las del género Neisseria, de forma muy destacada de las especies N. gonorrhoeae. Por ejemplo, Neisseria sp. produce la IgA proteasa de toxina citotóxica (véase el documento WO-99/58.571).
[0008] Está bien documentado en la técnica que las moléculas de toxinas pueden ser redirigidas a una célula que no es la célula diana natural de la toxina. Cuando se redirige, la toxina modificada es capaz de unirse a una célula diana deseada y, después de la translocación posterior en el citosol, es capaz de ejercer su efecto en la célula diana. Dicho redireccionamiento se consigue sustituyendo la Fracción de direccionamiento (TM) natural de la toxina por una TM diferente. A este respecto, la TM se selecciona de manera que se unirá a una célula diana deseada, y permite el paso posterior de la toxina modificada en un endosoma en el interior de la célula diana. La toxina modificada también comprende un dominio de translocación para permitir la entrada de la proteasa no citotóxica en el citosol de la célula. El dominio de translocación puede ser el dominio de translocación natural de la toxina o puede ser un dominio de translocación diferente obtenido de una proteína microbiana con actividad de translocación.
[0009] Por ejemplo, en el contexto de moléculas de toxinas no citotóxicas, se ha documentado bien que una neurotoxina clostridial puede ser redirigida por incorporación de una Fracción de direccionamiento (TM), que no está en la TM natural de una neurotoxina clostridial. Las metodologías descritas de conjugación química y recombinantes se contemplan actualmente como convencionales, y se hace referencia a Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, y a Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press.
[0010] Por ejemplo, el documento WO-94/21.300 describe moléculas de neurotoxinas clostridiales modificadas que son capaces de regular la densidad de Proteínas Integrales de Membrana (IMP) presentes en la superficie celular de la célula diana. Las moléculas de neurotoxinas modificadas son así capaces de controlar la actividad celular (por ejemplo, recaptación de glucosa) de la célula diana. Los documentos WO-96/33.273 y WO99/17.806 describen moléculas de neurotoxinas clostridiales modificadas que se dirigen a aferentes sensoriales periféricos. Las moléculas de neurotoxinas modificadas son así capaces de mostrar un efecto analgésico. El documento WO-00/10.598 describe la preparación de moléculas de neurotoxinas clostridiales modificadas que se dirigen a células hipersecretoras de mucosidad (o células neuronales que controlan a dichas células hipersecretoras de mucosidad), neurotoxinas modificadas que son capaces de inhibir la hipersecreción de dichas células. El documento WO-01/21.213 describe moléculas de neurotoxinas clostridiales modificadas que se dirigen a una amplia variedad de tipos diferentes de células diana no neuronales. Las moléculas modificadas son así capaces de impedir la secreción desde las células diana. Entre las publicaciones adicionales en el campo técnico de moléculas de toxinas redirigidas se incluyen los documentos: WO-00/62.814; WO-00/04.926; US-5.773.586; WO-93/15.766; WO00/61.192; y WO-99/58.571.
[0011] Así, a partir de las publicaciones descritas anteriormente, se observará que el concepto básico de redireccionamiento de una proteasa no citotóxica en una célula diana deseada, por selección de una TM que tiene un receptor correspondiente presente en la célula diana, ha sido bien documentado.
[0012] Sin embargo, diferentes receptores presentes en una célula diana de interés muestran diferentes afinidades de unión para diferentes TM. Esto puede constituir un problema sobre todo en células de percepción del dolor, que poseen una amplia variedad de tipos de receptores que presentan diferentes afinidades de unión para diferentes TM. Así, un conjugado redirigido que comprende una TM determinada (que se une a un receptor en una célula de percepción del dolor) puede mostrar una baja afinidad de unión para una célula diana de percepción del dolor, lo cual no es deseable.
[0013] Por tanto, existe la necesidad de desarrollar conjugados no citotóxicos modificados que aborden uno o más de los problemas anteriores. De particular interés es el desarrollo de un conjugado mejorado para su uso en el tratamiento del dolor.
[0014] La presente invención pretende abordar uno o más de los problemas anteriores usando como Fracción de direccionamiento (TM) del conjugado un "agonista" de un receptor que está presente en la célula diana de percepción del dolor de interés. En formas de realización preferidas, la célula diana de percepción del dolor es un aferente sensorial nociceptivo, más preferentemente un aferente sensorial nociceptivo primario. En formas de realización preferidas en particular, la TM es un agonista del receptor de tipo opioide-1 (ORL1).
[0015] En consecuencia, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un conjugado no citotóxico según se expone en las reivindicaciones.
[0016] El uso de un "agonista", que estimularía normalmente un procedimiento biológico, en particular exocitosis (por ejemplo, un aumento en la secreción celular, o una regulación por aumento en expresión de proteínas de membrana), es un desarrollo estimulante en el campo técnico de toxinas redirigidas. Además, es sorprendente especialmente el hecho de que pueda emplearse un agonista en una composición terapéutica para conseguir una reducción o inhibición de un procedimiento biológico que el agonista normalmente estimularía.
[0017] Los conjugados que contienen agonistas de la presente invención representan un subconjunto diferenciado de conjugados de toxinas. En más detalle, los conjugados de la presente invención comprenden TM que han sido seleccionadas sobre la base de las propiedades específicas de los agonistas más que sobre la simple base de que tienen un receptor correspondiente en una célula diana de percepción del dolor de interés.
[0018] Convencionalmente, se ha considerado que un agonista es cualquier molécula que pueda aumentar o reducir las actividades dentro de una célula, es decir, cualquier molécula que simplemente provoca una alteración de la actividad celular. Por ejemplo, el significado convencional de agonista incluiría: una sustancia química capaz de combinarse con un receptor en una célula y de iniciar una reacción o actividad, o un fármaco que induce una respuesta activa modificando los receptores, si la respuesta es un aumento o una disminución de la actividad celular.
[0019] Sin embargo, para los fines de la presente invención, un agonista se define más específicamente como una molécula que es capaz de estimular el procedimiento de fusión exocítica en una célula diana de percepción del dolor, un procedimiento que es susceptible de inhibición por una proteasa (o un fragmento de la misma) capaz de segmentar una proteína del aparato de fusión exocítica en dicha célula diana.
[0020] En consecuencia, la definición de agonista en particular de la presente invención excluiría muchas moléculas que se considerarían convencionalmente como agonistas. Por ejemplo, el factor de crecimiento nervioso (NGF) es un agonista en cuanto a su capacidad para promover diferenciación neuronal por medio de la unión a un receptor TrkA. Sin embargo, el NGF no es un agonista cuando se valora según los criterios anteriores, ya que no es un inductor principal de fusión exocítica. Además, el procedimiento que NGF estimula (es decir, diferenciación celular) no es susceptible de inhibición por la actividad de proteasa de una molécula de toxina no citotóxica.
[0021] En uso, un conjugado que contiene agonista de la presente invención no desactiva un receptor de agonista en una célula diana de percepción del dolor, sino que la actividad de proteasa del conjugado sirve para denegar la respuesta mediada por el agonista.
[0022] Además, una vez que se suministra al citosol de la célula diana de percepción del dolor, el componente de proteasa de un conjugado de la presente invención inhibe o bloquea la acción de todos los agonistas posteriores capaces de provocar el mismo efecto (es decir, aumento de la fusión exocítica) en la misma célula diana. Esto resulta ventajoso y significa que los conjugados de la presente invención tienen aplicación en situaciones en las que múltiples agonistas pueden ser responsables de provocar la sensación de dolor. Así, cuando se diseña un conjugado de la presente invención, la TM que se selecciona para su suministro no ha de ser necesariamente el agonista principal implicado en provocar la sensación de dolor.
[0023] El suministro mediado por agonistas según la presente invención proporciona la siguiente ventaja significativa con respecto a la terapéutica que contiene proteasa no citotóxica anterior: el uso de un agonista puede conferir propiedades preferentes de unión y/o internalización en el conjugado. Esto, a su vez, puede dar como resultado un suministro más eficaz del componente de proteasa a una célula diana de percepción del dolor.
[0024] Además, el uso de un agonista como TM es autolimitado en cuanto a los efectos secundarios. Más en detalle, la unión de un agonista a una célula diana de percepción del dolor aumenta la fusión exocítica, lo que puede agravar la sensación de dolor. Sin embargo, el procedimiento exocítico que es estimulado por la unión a agonista se reduce o inhibe posteriormente por el componente de proteasa del conjugado.
[0025] En formas de realización preferidas de la invención, la TM de dinorfina es un agonista del receptor ORL1. El receptor ORL1 está presente en células de percepción del dolor en el cuerpo.
[0026] El receptor ORL1 es un miembro de la clase de receptores acoplada a proteína G, y tiene una estructura de dominio de siete transmembrana. Las propiedades del receptor ORL1 se exponen en detalle en Mogil y Pasternak (2001), Pharmacological Reviews, Vol. 53, nº 3, páginas 381 – 415.
[0027] Durante toda esta memoria descriptiva, la referencia al “receptor ORL1" comprende todos los miembros de la familia del receptor ORL1. Los miembros de la familia del receptor ORL1 tienen normalmente una estructura de dominio de siete transmembrana, y están acoplados a proteínas G de las familias G1 y G0. En el Ejemplo 17 se ofrece un procedimiento para determinar la actividad de estimulación de proteína G de ligandos del receptor ORL1. En el Ejemplo 16 se ofrece un procedimiento para medir la reducción en niveles de cAMP celulares después de activación por ORL1. Una característica adicional de los miembros de la familia del receptor ORL1 es que normalmente son capaces de unirse a nociceptina (el ligando natural de ORL1). A modo de ejemplo, todas las variantes de empalme alternativas del receptor ORL1, son miembros de la familia del receptor ORL1.
[0028] Los conjugados de la presente invención muestran generalmente una afinidad de unión reducida (en la región de hasta 100 veces) para células diana aferentes sensoriales nociceptivas cuando se comparan con la TM ‘libre’ correspondiente. Sin embargo, a pesar de esta observación, los conjugados de la presente invención muestran sorprendentemente buena eficacia. Esto puede atribuirse a dos características principales. En primer lugar, el componente de proteasa no citotóxica es catalítico; así, el efecto terapéutico de algunas de estas moléculas es amplificado rápidamente. En segundo lugar, los receptores presentes en los aferentes sensoriales nociceptivos sólo necesitan actuar como una pasarela para la entrada del agente terapéutico y no es preciso necesariamente que sean estimulados hasta un nivel requerido con el fin de conseguir una respuesta farmacológica mediada por el receptor-ligando. En consecuencia, los conjugados de la presente invención pueden administrarse en una dosis que es muy inferior a la que se emplearía para otros tipos de moléculas analgésicas como fármacos AINE, morfina y gabapentina. Las últimas moléculas se administran normalmente en altas cantidades de microgramos a miligramos (e incluso hasta varios centenares de miligramos), mientras que los conjugados de la presente invención pueden administrarse en dosis mucho menores, normalmente al menos 40 veces menores, y más normalmente 100 veces menores.
[0029] La presente memoria descriptiva describe conjugados en los que la TM del conjugado es nociceptina, el ligando natural para el receptor ORL1. La nociceptina se dirige al receptor ORL1 con alta afinidad.
[0030] Entre los ejemplos de otras TM se incluyen:
Código
Secuencia Ref. SEQ ID NO.
Nociceptina 1-17
FGGFTGARKSARKLANQ [1] 1,2
Nociceptina 1-11
FGGFTGARKSA [1] 3,4
Nociceptina [Y10]1-11
FGGFTGARKYA [1] 5,6
Nociceptina [Y11]1-11
FGGFTGARKSY [1] 7,8
Nociceptina [Y14]1-17
FGGFTGARKSARKYANQ [1] 9,10
Nociceptina 1-13
FGGFTGARKSARK [2] 11,12
Nociceptina [R14K15] 1-17 (también conocida como "variante" de nociceptina)
FGGFTGARKSARKRKNQ [3,4] 13,14
Nociceptina 1-13-NH2
FGGFTGARKSARK-NH2 [5] -
Nociceptina Phe (p-NO2) 1-17
(pNO2)FGGFTGARKSARKLANQ [5] -
Lofentanilo
Agonistas no peptídicos [5] -
Etorfina
Agonistas no peptídicos [5] -
Agonista peptídico
Agonistas peptídicos de biblioteca combinatoria [6] -
[1] Mogil y Pasternak, 2001, Pharmacol. Rev., 53, 381 – 415 [2] Maile y col., 2003, Neurosci. Lett., 350, 190 – 192 [3] Rizzi y col., 2002, J. Pharmacol. Exp. Therap., 300, 57 – 63 [4] Okada y col., 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 278, 493 – 498 [5] Zaveri, 2003, Life Sci., 73, 663 – 678. [6] Dooley y col., 1997, J Pharmacol Exp Ther. 283(2), 735 – 41.
10 [0031] La TM comprende preferentemente un máximo de 50 restos de aminoácidos, más preferentemente un máximo de 40 restos de aminoácidos, en particular preferentemente un máximo de 30 restos de aminoácidos, y con la máxima preferencia un máximo de 20 restos de aminoácidos. Por ejemplo, la nociceptina es un péptido con 17 restos de aminoácidos.
15 [0032] En el contexto de la presente invención, el término agonista del receptor ORL comprende moléculas que tienen al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 %, y con la máxima preferencia al menos el 95 % de homología con dicho agonista.
[0033] La memoria descriptiva describe fragmentos, variantes y derivados de una cualquiera de las TM
20 descritas anteriormente. Estos fragmentos, variantes y derivados conservan sustancialmente las propiedades que se adscriben a dichas TM.
[0034] Las propiedades de agonistas de una TM pueden confirmarse usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Estos procedimientos se basan en experimentos anteriores (véase Inoue y col. (1998) Proc. Natl. Acad.
25 Sci., 95, 10949 – 10953), que confirman que el agonista natural del receptor ORL1, la nociceptina, provoca la inducción de liberación de sustancia P desde las neuronas aferentes primarias nociceptivas. Esto se sustenta por el hecho de que:
-
las respuestas inducidas por nociceptina son abolidas por los antagonistas del receptor NK1 específico (receptor
30 de la sustancia P); y -el pretratamiento de las células con capsaicina (que consume la sustancia P de las neuronas aferentes primarias de pequeño diámetro) atenúa las respuestas inducidas por la nociceptina.
[0035] Análogamente, Inoue y col. confirman que una inyección intraplantar de neurotoxina botulínica tipo A
35 suprime las respuestas inducidas por nociceptina. Dado que se sabe que BoNT inhibe la liberación de sustancia P de las neuronas aferentes primarias (Welch y col., (2000), Toxicon, 38, 245 – 258), esto confirma el vínculo entre la interacción nociceptina-ORL1 y la ulterior liberación de sustancia P.
[0036] Así, puede decirse que una TM tiene actividad agonista en el receptor ORL1 si la TM provoca una inducción en la liberación de sustancia P de una neurona aferente sensorial nociceptiva (véase Ejemplo 1).
[0037] La presente invención emplea un grupo preferido de TM, en particular, la dinorfina. Los péptidos opioides se usan frecuentemente en la clínica para modificar la actividad de los nociceptores, y otras células que intervienen en la respuesta al dolor. Tal como se ilustra en la Escalera Analgésica en tres etapas de la Organización Mundial de la Salud, los opioides tienen puntos de entrada en el tratamiento farmacológico de dolor crónico por cáncer o no cáncer en las tres fases, lo que subraya su importancia para el tratamiento del dolor. La referencia a opioides comprende fragmentos, variantes y derivados de los mismos, que conservan la capacidad de unirse a aferentes sensoriales nociceptivos. La proteasa de la presente invención comprende todas las proteasas no citotóxicas de ocurrencia natural que son capaces de segmentar una o más proteínas del aparato de fusión exocítica en células eucariotas.
[0038] La proteasa de la presente invención es preferentemente una proteasa bacteriana.
[0039] Más preferentemente, la proteasa bacteriana se selecciona entre los géneros Clostridium o Neisseria (por ejemplo, cadena L clostridial, o una IgA proteasa de Neisseria, preferentemente de N. gonorrhoeae).
[0040] La presente invención también comprende proteasas no citotóxicas modificadas, que incluyen secuencias de aminoácidos que no se producen en la naturaleza y/o restos de aminoácidos sintéticos, en la medida en que las proteasas modificadas muestren todavía la actividad de proteasa mencionada anteriormente.
[0041] La proteasa de la presente invención muestra preferentemente una actividad de serina o de metaloproteasa (por ejemplo, actividad de endopeptidasa). La proteasa es preferentemente específica para una proteína SNARE (por ejemplo, SNAP-25, sinaptobrevina/VAMP o sintaxina).
[0042] Se realiza una mención en particular a los dominios de neurotoxinas de proteasa, por ejemplo, los dominios de proteasa de neurotoxinas bacterianas. Así, la presente invención comprende el uso de dominios de neurotoxinas, que se producen en la naturaleza, así como versiones preparadas de forma recombinante de dichas neurotoxinas de ocurrencia natural.
[0043] Las neurotoxinas de ejemplo son producidas por clostridias, y el término neurotoxina clostridial comprende neurotoxinas producidas por C. tetani (TeNT) y por C. botulinum (BoNT) serotipos A-G, así como las neurotoxinas de tipo BoNT estrechamente relacionadas producidas por C. baratii y C. butyricum. Las abreviaturas mencionadas anteriormente se usan a lo largo de toda la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, la nomenclatura BoNT/A denota la fuente de neurotoxina como BoNT (serotipo A). La nomenclatura correspondiente se aplica a otros serotipos BoNT.
[0044] El término fragmento de cadena L significa un componente de la cadena L de una neurotoxina, fragmento que muestra una actividad de metaloproteasa y es capaz de segmentar proteolíticamente una proteína asociada a membrana vesicular y/o plasmática que interviene en la exocitosis celular.
[0045] Un Dominio de translocación es una molécula que permite la translocación de una proteasa (o fragmento de la misma) en una célula diana de percepción del dolor de manera que tiene lugar una expresión funcional de la actividad de proteasa en el citosol de la célula diana. Si cualquier molécula (por ejemplo, una proteína
o un péptido) posee la función de translocación requerida de la presente invención puede confirmarse mediante uno cualquiera de una serie de ensayos convencionales.
[0046] Por ejemplo, Shone C. (1987) describe un ensayo in vitro que emplea liposomas, que se someten a pruebas de provocación con una molécula de prueba. La presencia de la función de translocación requerida se confirma mediante liberación desde los liposomas de K + y/o NAD marcado, que pueden vigilarse fácilmente (véase Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pág. 175 – 180).
[0047] Se proporciona un ejemplo adicional en Blaustein R. (1987), que describe un ensayo in vitro sencillo que emplea membranas de doble capa de fosfolípidos planas. Las membranas se someten a pruebas de provocación con una molécula de prueba y la función de translocación requerida se confirma por un aumento en la conductancia a través de dichas membranas (véase Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, nº 1: pág. 115 – 120).
[0048] Se proporciona la metodología adicional para permitir la valoración de la fusión de membranas y, así, identificación de Dominios de translocación adecuados para su uso en la presente invención en Methods in Enzymology, Vol. 220 y 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993.
[0049] El Dominio de translocación es capaz preferentemente de formación de poros permeables a iones en membranas lipídicas en condiciones de pH bajo. Preferentemente, se ha encontrado el uso sólo de aquellas partes de la molécula de proteínas capaces de formación de poros dentro de la membrana endosómica.
[0050] El Dominio de translocación puede obtenerse a partir de una fuente de proteínas microbianas, en particular, de una fuente de proteínas bacterianas o víricas. Por ello, en una forma de realización, el Dominio de translocación es un dominio de translocación de una enzima, por ejemplo, una toxina bacteriana o una proteína vírica.
[0051] Está bien documentado que ciertos dominios de moléculas de toxinas bacterianas son capaces de formar dichos poros. También se sabe que ciertos Dominios de translocación de proteínas de fusión de membranas expresadas de forma vírica son capaces de formar dichos. Dichos dominios pueden emplearse en la presente invención.
[0052] El Dominio de translocación puede ser de origen clostridial, es decir, el dominio HN (o un componente funcional del mismo). HN significa una parte o fragmento de la cadena H de una neurotoxina clostridial equivalente aproximadamente a la mitad aminoterminal de la cadena H, o el dominio correspondiente a ese fragmento en la cadena H intacta. Entre los ejemplos de Dominios de translocación clostridiales adecuados se incluyen:
neurotoxina botulínica tipo A -restos de aminoácidos (449 – 871) neurotoxina botulínica tipo B -restos de aminoácidos (441 – 858) neurotoxina botulínica tipo C -restos de aminoácidos (442 – 866) neurotoxina botulínica tipo D -restos de aminoácidos (446 – 862) neurotoxina botulínica tipo E -restos de aminoácidos (423 – 845) neurotoxina botulínica tipo F -restos de aminoácidos (440 – 864) neurotoxina botulínica tipo G -restos de aminoácidos (442 – 863) neurotoxina tetánica -restos de aminoácidos (458 – 879)
[0053] Para más detalles sobre la base genética de producción de toxinas en Clostridium botulinum y C. tetani, los autores de la invención hacen referencia a Henderson y col. (1997) en The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press.
[0054] El término HN comprende partes HN de neurotoxinas de ocurrencia natural, y partes HN modificadas que tienen secuencias de aminoácidos que no aparecen en la naturaleza y/o restos de aminoácidos sintéticos, siempre que las partes HN modificadas sigan mostrando la función de translocación mencionada anteriormente.
[0055] Alternativamente, el Dominio de translocación puede ser de un origen no clostridial (véase tabla más adelante). Entre los ejemplos de orígenes no clostridiales de Dominios de translocación se incluyen, pero no se limitan a, el dominio de translocación de toxina diftérica [O’Keefe y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1992) 89, 6202 – 6206; Silverman y col., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524 – 22532; y London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pág. 25-51], el dominio de translocación de exotoxina de Pseudomonas tipo A [Prior y col. Biochemistry (1992) 31, 3555 – 3559], los dominios de translocación de toxina del carbunco [Blanke y col. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1996) 93, 8437 – 8442], una variedad de péptidos fusógenos o hidrófobos de función de translocación [Plank y col. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918 – 12924; y Wagner y col. (1992) PNAS, 89, pág. 7934 – 7938], y péptidos anfifílicos [Murata y col. (1992) Biochem., 31, pág. 1986 – 1992]. El Dominio de translocación puede emular el Dominio de translocación presente en una proteína de ocurrencia natural, o puede incluir variaciones de aminoácidos siempre que las variaciones no destruyan la capacidad de translocación del Dominio de translocación.
[0056] Los ejemplos concretos de Dominios de translocación víricos adecuados para su uso en la presente invención incluyen ciertos dominios de translocación de proteínas de fusión de membrana expresadas víricamente. Por ejemplo, Wagner y col. (1992) y Murata y col. (1992) describen la función de translocación (es decir, fusión y vesiculación de membrana) de una series de péptidos fusógenos y anfifílicos obtenidos de la región N-terminal de hemaglutinina del virus de la gripe. Otras proteínas de fusión de membrana expresadas víricamente de las que se sabe que tienen la actividad de translocación deseada son un dominio de translocación de un péptido fusógeno del virus del bosque de Semliki (SFV), un dominio de translocación de la glucoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV), un dominio de translocación de la proteína F del virus SER y un dominio de translocación de la glucoproteína de envoltura del virus espumoso. Las "proteínas spike" codificadas víricamente tienen una aplicación especial en el contexto de la presente invención, por ejemplo, la proteína E1 de SFV y la proteína G de VSV.
5 [0057] El uso de los Dominios de translocación (enumerados a continuación) incluye el uso de variantes de secuencias de los mismos. Una variante puede comprender una o más sustituciones conservadoras de ácidos nucleicos y/o deleciones o inserciones de ácidos nucleicos, con la salvedad de que la variante posea la función de translocación requerida. Una variante puede comprender también una o más sustituciones de aminoácidos y/o
10 deleciones o inserciones de aminoácidos, siempre que la variante posea la función de translocación requerida.
Fuente del Dominio de translocación
Restos de aminoácidos Referencias
Toxina diftérica
194 – 380 Silverman y col., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22524 – 22532 London E., 1992, Biochem. Blophys. Acta., 1113, 25 – 51
Dominio II de exotoxina de Pseudomonas
405 – 613 Prior y col., 1992, Biochemistry 31, 3555 – 3559 Kihara & Pastan, 1994, Bioconj Chem. 5, 532 – 538
Hemaglutinina del virus de la gripe
GLFGAIAGFIENGWE GMIDGWYG, y variantes de los mismos Plank y col., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918 – 12924 Wagner y col., 1992, PNAS, 89, 7934 – 7938 Murata y col., 1992, Biochemistry 31,1986 – 1992
Proteína fusógena del virus del bosque de Semliki
Dominio de translocación Kielian y col., 1996, J Cell Biol. 134 (4), 863 – 872
Glucoproteína G del virus de estomatitis vesicular
118 – 139 Yao y col., 2003, Virology 310(2), 319 – 332
Proteína F del virus SER
Dominio de translocación Seth y col., 2003, J Virol 77(11) 6520 – 6527
Glucoproteína de envoltura del virus espumoso
Dominio de translocación Picard-Maureau y col., 2003, J Virol. 77(8), 4722 – 4730
[0058] Una vez que se ha identificado un agonista de receptor potencial (por ejemplo, un agonista ORL1), puede llevarse a cabo una o más de las siguientes etapas opcionales
(A) confirmación de que la posible molécula agonista o el agonista es capaz de combinarse con una proteasa no citotóxica (o un fragmento de la misma) y opcionalmente un Dominio de translocación para formar un conjugado de la presente invención; y/o
20 (B) confirmación de que dicha la posible molécula agonista o el agonista se une al receptor en la célula diana de percepción del dolor, receptor que es susceptible de endocitosis mediada por el receptor; y/o
(C) confirmación de que dicha posible molécula agonista o agonista es capaz de suministrar una proteasa no citotóxica (o fragmento de la misma) en el citosol de una célula diana de percepción del dolor.
25 [0059] Las etapas anteriores (A) – (C) pueden confirmarse mediante pruebas rutinarias que estarían disponibles fácilmente para un experto en la materia.
[0060] Por ejemplo, la etapa (A) puede realizarse mediante un sencillo experimento de conjugación química
30 que usa reactivos de conjugación convencionales y/o moléculas conectoras, seguido por electroforesis en geles de poliacrilamida nativa para confirmar que se forma un conjugado de la presente invención que tiene el peso molecular previsto. Los componentes del conjugado están conectados normalmente de forma conjunta (opcionalmente a través de moléculas conectoras) por enlaces covalentes.
35 [0061] Por ejemplo, la etapa (B) puede realizarse mediante una cualquiera de una serie de metodologías para valoración de la unión de un ligando. Se dispone de textos estándar, por ejemplo, "Receptor-Ligand Interactions. A Practical Approach. Ed. E. C. Hulme, IRL Press, 1992" que describen en detalle dichos enfoques. En breve, se marca el agonista o la posible agonista (por ejemplo, con 125-yodo) y se aplica a una preparación celular in vitro en presencia de un exceso de agonista no marcado. El fin del material no marcado es saturar cualquier sitio de unión inespecífico. El agonista se incuba con la preparación celular durante un tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio, y la cantidad de etiquetas unidas a las células se valora por la medida de la radiactividad asociada a las células, por ejemplo, por recuento de centelleo o gamma.
[0062] Un ejemplo adicional comprende el marcado con oro del agonista (o posible agonista), seguido por el uso de microscopia electrónica para vigilar el avance del transporte celular del agonista marcado [véase la metodología básica descrita por Rabinowitz S. (1992); J. Cell. Biol. 116(1): pág. 95 – 112; y la descrita por van Deurs (1986); J. Cell. Biol. 102: pág. 37 – 47].
[0063] Por ejemplo, la etapa (C) puede realizarse por puesta en contacto del conjugado preparado en la etapa (A) con una célula diana adecuada y valoración de la segmentación del sustrato. Esto se realiza mediante extracción de las proteínas SNARE, seguido por transferencia Western de muestras preparadas por SDS-PAGE. La segmentación del sustrato es indicativa de suministro de la proteasa a la célula diana. A este respecto, la segmentación puede vigilarse por desaparición del sustrato y/o aparición del producto de segmentación. Un anticuerpo especialmente útil que se une selectivamente al producto de sustrato segmentado se describe en el documento WO-95/33.850.
[0064] A continuación se expone la preparación de un conjugado según la presente invención.
[0065] En la técnica se sabe que la parte Hc de una molécula de neurotoxina puede extraerse de la otra parte de la cadena H, conocida como HN, de manera que el fragmento HN permanece unido por enlaces de disulfuro a la cadena L de la neurotoxina para proporcionar un fragmento conocido como LHN. Así, en una forma de realización de la presente invención el fragmento LHN de una neurotoxina está enlazado covalentemente, por medio de uniones que pueden incluir una o más regiones separadoras, a una TM.
[0066] En otra forma de realización de la invención, el dominio Hc de una neurotoxina está mutado, bloqueado o modificado, por ejemplo, por modificación química, para reducir o preferentemente incapacitar su capacidad de unir la neurotoxina a receptores en la unión neuromuscular. Esta neurotoxina modificada se enlaza a continuación de forma covalente, por medio de uniones que pueden incluir una o más regiones separadoras, a una TM.
[0067] En otra forma de realización de la invención, la cadena H de una neurotoxina, en la que el dominio Hc está mutado, bloqueado o modificado, por ejemplo, por modificación química, para reducir o preferentemente incapacitar su capacidad de unión nativa, se combina con la cadena L de una neurotoxina diferente, u otra proteasa capaz de segmentar una proteína del aparato de fusión exocítica (por ejemplo, IgA proteasa de N. gonorrhoeae). Esta neurotoxina modificada híbrida se une a continuación de forma covalente, usando uniones que pueden incluir una o más regiones separadoras, a una TM.
[0068] En otra forma de realización de la invención, el dominio HN de una neurotoxina se combina con la cadena L de una neurotoxina diferente, u otra proteasa capaz de segmentar una proteína del aparato de fusión exocítica (por ejemplo, IgA proteasa de N. gonorrhoeae). Este híbrido se une a continuación de forma covalente, usando uniones que pueden incluir una o más regiones separadoras, a una TM.
[0069] En otra forma de realización de la invención, la proteasa (por ejemplo, el componente de la cadena L de una neurotoxina) se une de forma covalente, usando uniones que pueden incluir una o más regiones separadoras, a una TM que puede realizar también la internalización de la proteasa en el citoplasma de la o las células diana relevantes.
[0070] En otra forma de realización de la invención, la proteasa (por ejemplo, el componente de la cadena L de una neurotoxina) se une de forma covalente, usando uniones que pueden incluir una o más regiones separadoras, a un dominio de translocación para realizar el transporte del fragmento de proteasa en el citosol.
[0071] En uso, los dominios de un conjugado según la presente invención están asociados entre sí. En una forma de realización, dos o más de los dominios pueden unirse entre sí ya sea directamente (por ejemplo, por un enlace covalente), o a través de una molécula conectora.
[0072] Puede emplearse una variedad de moléculas conectoras/separadoras diferentes en cualquiera de las proteínas de fusión de la presente invención. Entre los ejemplos de dichas moléculas separadoras se incluyen los ilustrados en las figs. 31 y 32. En este caso se hace mención especial a GS15, GS20, GS25 y Hx27; véanse fig. 31 y
32.
[0073] Los autores de la presente invención han encontrado de forma inesperada que los conjugados proteasa no citotóxica-TM (por ejemplo, CPNv/A) pueden mostrar una actividad de unión mejorada para aferentes sensoriales nociceptivos cuando el tamaño del separador se selecciona de manera que (en uso) la TM (preferentemente, el extremo C de la misma) y el dominio de translocación (preferentemente el extremo N del mismo) están separados entre sí por 40 – 105 angstroms, preferentemente por 50 – 100 angstroms, y más preferentemente por 50 – 90 angstroms. En otra forma de realización, los separadores preferidos tienen una secuencia de aminoácidos de 11 – 29 restos de aminoácidos, preferentemente 15 – 27 restos de aminoácidos, y más preferentemente 20 – 27 restos de aminoácidos. Los separadores adecuados pueden identificarse y obtenerse rutinariamente según Crasto, C.J. y Feng, J.A. (2000) mayo, 13(5), pág. 309 – 312; véase también http: //www.fccc.edu/research/labs/feng/limker.html.
[0074] Las técnicas de conjugación adecuadas para su uso en la presente invención han sido bien documentadas y son rutinarias para un experto en la materia.
[0075] La metodología que interviene en el acoplamiento de dos moléculas de proteínas (A y B) entre sí es sencillo, y se consigue a través del uso de un agente de reticulación (también conocido como agente de acoplamiento químico). Por ejemplo, las moléculas A y B se ponen en contacto de forma separada con un agente de reticulación, que modifica químicamente un grupo superficial específico en cada una de las moléculas A y B formando con ello moléculas derivadas A’ y B’. El grupo superficial modificado en la molécula A’ es capaz de unirse de forma covalente con el grupo superficial modificado en la molécula B’. Así, la reacción de acoplamiento se completa mezclando conjuntamente las dos moléculas de proteínas A’ y B’.
[0076] La conjugación química se ilustra como referencia a las siguientes formas de realización, en las que P = componente de proteasa no citotóxica, T = componente de translocación y TM = fracción de direccionamiento.
[0077] En una forma de realización, se prepara una única cadena P -T, que a continuación se conjuga con una TM. En otra forma de realización, se prepara una única cadena TM -T (o T -TM), que a continuación se conjuga con un P. En una forma de realización adicional, se prepara una única cadena P -TM (o TM -P), que a continuación se conjuga con un T. Otro conjugado preferido especialmente tiene la estructura P -TM -T (con un sitio de segmentación de proteasa opcional entre P y TM).
[0078] Cuando se preparan los componentes T y P como un único polipéptido de cadena, se incluye normalmente un sitio de segmentación de proteasa entre dichos componentes. A este respecto puede emplearse cualquier sitio de segmentación de proteasa.
[0079] En una forma de realización alternativa, los tres componentes pueden conjugarse juntos de forma simultánea o en secuencia. Así, la conjugación puede ser un procedimiento en una o en dos etapas, y puede incluir uno o más agentes de acoplamiento diferentes.
[0080] Los agentes de acoplamiento químico y los agentes de reticulación han estado disponibles comercialmente durante muchos años.
[0081] El Ejemplo 5 de la presente invención describe en detalle el uso de uno de estos agentes de acoplamiento, en particular SPDP, para acoplar químicamente dos moléculas de proteínas (nociceptina, y el LHN de neurotoxina botulínica). Las dos moléculas se ponen en contacto de forma separada con SPDP, y a continuación se mezclan para permitir la conjugación covalente.
[0082] El conjugado descrito en el Ejemplo 6 confirma que otro agente de acoplamiento, PDPH/EDAC o reactivo de Traut, puede emplearse como un agente de acoplamiento alternativo para SPDP.
[0083] El SPDP y el reactivo de Traut son agentes de acoplamiento populares y bien documentados en el campo técnico de la química de conjugación de proteínas y se presentan aquí simplemente como dos ejemplos de una clase bien conocida de compuestos que pueden emplearse para enlazarse de forma covalente con el componente de la Fracción de direccionamiento y el componente de la neurotoxina clostridial del conjugado de la presente invención. Otros agentes adecuados incluyen SMPB, SMCC (4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato de succinimidilo) y LC-SPDP.
[0084] En más detalle, pueden usarse miembros disponibles comercialmente de los bien conocidos agentes de acoplamiento para fines de conjugación con el fin de producir un conjugado de la invención. Pueden encontrarse detalles de dichos agentes en las siguientes publicaciones:
Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press;
Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press;
Thorpe y col. (1987), Cancer Res, 1987, 47, 5924 – 31. Este artículo describe el uso de SMBT (S-4succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-bencil-tiosulfato de sodio) y SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa(2piridilditio)tolueno); y
Peeters y col. (1989), J Immunol Methods. 1989, 120, 133 – 43. Este artículo describe el uso de 4 reactivos de acoplamiento, MHS (6-(N-maleimido)-n-hexanoato de succinimidilo), SMCC (4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1carboxilato de succinimidilo), MBS (m-maleimidobenzoato de succinimidilo) y SPDP
[0085] Los conjugados según la presente invención también pueden prepararse de forma recombinante, según se detalla en los Ejemplos 9 a 12.
[0086] En una forma de realización, la preparación de un conjugado recombinante implica la reordenación de las secuencias de codificación de una TM seleccionada, un componente de proteasa no citotóxica seleccionado y un componente de translocación (en cualquier orden) en una única construcción genética. Estas secuencias de codificación pueden ordenarse en el marco de manera que la posterior transcripción y traducción sea continua a través de las dos secuencias de codificación y dé como resultado una proteína de fusión. Todas las construcciones tendrían un codón 5’ ATG para codificar una metionina N-terminal, y un codón de parada traduccional C-terminal.
[0087] Así, el procedimiento de preparación recombinante da como resultado la generación de un único polipéptido de cadena. Con el fin de activar este polipéptido, está presente un sitio de segmentación de proteasa entre el componente de proteasa no citotóxica y el componente de translocación. La segmentación de este sitio genera un polipéptido de dicadena en el que la proteasa y los dominios de translocación están unidos entre sí por medio de un enlace covalente, preferentemente un enlace de disulfuro. A este respecto, puede emplearse cualquier sitio de segmentación de proteasa.
[0088] En el aspecto del polipéptido único de la presente invención, la TM está situada preferentemente en el extremo N o en el extremo C con respecto a la proteína de fusión. En otras palabras, se prefiere que la TM no esté situada entre los componentes P y T de la única proteína de fusión del polipéptido. En una forma de realización preferida en particular, la TM está situada en el extremo N con respecto a la proteína de fusión.
[0089] En una forma de realización, una cadena L de una neurotoxina clostridial u otra proteasa capaz de segmentar una proteína del aparato de fusión exocítica (por ejemplo, una IgA proteasa), o un fragmento/variante de la misma, puede expresarse de forma recombinante como una proteína de fusión con una TM, de manera que la TM puede efectuar también la internalización del componente de la cadena L en el citoplasma de la célula o células diana relevantes responsables de la secreción. Alternativamente, la proteína de fusión puede comprender además un Dominio de translocación. La proteína de fusión expresada puede incluir una o más regiones separadoras.
[0090] A modo de ejemplo, se requiere la siguiente información para producir, de forma recombinante, un agente de la presente invención:
(I)
datos de secuencias de ADN relativos a una TM seleccionada;
(II)
datos de secuencias de ADN relativos al componente de proteasa;
(III) datos de secuencias de ADN relativos al dominio de translocación; y
(IV) un protocolo que permita la construcción y expresión de la construcción que comprende (I), (II) y (III).
[0091] Toda la información básica anterior (I)-(IV) está fácilmente disponible y es fácil de determinar mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, los documentos WO-98/07.864 y WO-99/17.806 ilustran la tecnología recombinante adecuada para su uso en la presente solicitud.
[0092] Además, los procedimientos para la construcción y expresión de las construcciones de la presente invención pueden emplear información de las siguientes referencias y otras:
Lorberboum-Galski, H., FitzGerald, D., Chaudhary, V., Adhya, S., Pastan, I. (1988), Cytotoxic activity of an interleukin 2-Pseudomonas exotoxin chimeric protein produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 85(6): 1922 – 6;
Murphy, J.R. (1988), Diphtheria-related peptide hormone gene fusions: a molecular genetic approach to chimeric toxin development. Cancer Treat. Res.; 37: 123 – 40;
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[0093] La información adecuada de secuencias de neurotoxinas clostridiales relativa a cadenas L y LHN pueden obtenerse, por ejemplo, de Kurazono, H. (1992) J. Biol. Chem., vol. 267, nº 21, pág. 14721 – 14729; y Popoff, M.R., y Marvaud, J.-C. (1999) The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, 2ª edición (ed. Alouf, J.E., y Freer, J.H.), Academic Press, pág. 174 – 201.
[0094] Todas las publicaciones mencionadas anteriormente se incorporan, por tanto, en la presente memoria descriptiva a modo de referencia.
[0095] Análogamente, los datos de secuencias TM adecuados están ampliamente disponibles en la técnica. Alternativamente, todos los datos de secuencias necesarios pueden obtenerse por técnicas que son bien conocidas para el experto en la materia.
[0096] Por ejemplo, el ADN que codifica el componente de TM puede clonarse a partir de un organismo fuente por cribado de una biblioteca de ADNc para la región de codificación correcta (por ejemplo, usando oligonucleótidos específicos basados en la información de secuencia conocida para sondear la biblioteca), aislamiento del ADN de la TM, secuenciación de este ADN con fines de confirmación, y a continuación colocación del ADN aislado en un vector de expresión adecuado para la expresión en el hospedador elegido.
[0097] Como alternativa al aislamiento de la secuencia a partir de una biblioteca, la información de secuencias disponible puede emplearse para preparar cebadores específicos para su uso en PCR, en los que la secuencia de codificación se amplifica a continuación directamente desde el material fuente y, mediante el uso adecuado de cebadores, puede clonarse directamente en un vector de expresión.
[0098] Otro procedimiento alternativo para aislamiento de la secuencia de codificación consiste en usar la información de secuencias existente y sintetizar una copia, si es posible con incorporación de alteraciones, usando tecnología de síntesis de ADN. Por ejemplo, los datos de secuencias de ADN pueden generarse a partir de la información de secuencias existente de proteínas y/o ARN. El uso de tecnología de síntesis de ADN para esto (y la alternativa descrita anteriormente) permite modificar la preferencia codónica de la secuencia de codificación para que sea óptima para el hospedador de expresión elegido. Esto puede dar acceso a niveles de expresión superiores de la proteína de fusión.
[0099] La optimización de la preferencia codónica para el hospedador de expresión puede aplicarse a las secuencias de ADN que codifican la TM y los componentes clostridiales de la construcción. La optimización de la preferencia codónica es posible mediante la aplicación de la secuencia de proteínas en software de bases de datos de ADN/proteínas de libre acceso como, por ejemplo, programas disponibles de Genetics Computer Group, Inc.
[0100] Una vez preparado un conjugado de la invención, resulta rutinario confirmar que los diversos dominios han conservado su función especificada.
[0101] La función de proteasa después de conjugación puede someterse a prueba usando, por ejemplo, una cualquiera de las siguientes pruebas rutinarias:
SNAP-25 (o sinaptobrevina, o sintaxina) puede ser objeto de prueba de provocación con un conjugado que se someterá a prueba, y analizarse a continuación mediante técnicas de separación de péptidos SDS-PAGE. La posterior detección de péptidos (por ejemplo, por tinción de plata) que tienen pesos moleculares correspondientes a los productos segmentados de SNAP-25 (u otro componente de la maquinaria neurosecretora) confirmaría la presencia de una cadena L funcional.
[0102] Como alternativa adicional, el conjugado puede ser sometido a prueba mediante ensayo de productos de segmentación de SNAP-25 (o sinaptobrevina, o sintaxina) por medio de unión específica de anticuerpos (véase el documento WO-95/33.850). En más detalle, se emplea un anticuerpo específico para detectar la segmentación de SNAP-25. Como el anticuerpo reconoce el SNAP-25 segmentado, pero no el SNAP-25 no segmentado, la identificación del producto segmentado por el anticuerpo confirma la presencia de función proteolítica de cadena L. A modo de ilustración, dicho procedimiento se describe en los Ejemplos 2 y 3 del documento WO-96/33.273.
[0103] Es posible someter a prueba la función del componente de translocación después de la conjugación usando, por ejemplo, una cualquiera de las siguientes pruebas rutinarias:
Los procedimientos adecuados se describen, por ejemplo, en Shone y col. (1987) Eur. J. Biochem. 167, pág. 175 – 180; y en Blaustein y col. (1987) FEBS 226 (1), pág. 115 – 120.
[0104] El procedimiento de Shone y col. emplea liposomas adicionales cargados con tampón de fosfato de potasio (pH 7,2) y NAD radiomarcado. La liberación de K + y NAD desde los liposomas guarda correlación con un resultado positivo para una actividad de formación de canales y, con ello, actividad de translocación. A este respecto, puede medirse la liberación de K + desde los liposomas usando un electrodo y puede calcularse la liberación de NAD midiendo la radioactividad en el sobrenadante (véase página 176, columna 1, línea 33 – columna 2, línea 17).
[0105] El procedimiento de Blaustein y col. emplea membranas de doble capa de fosfolípidos planas, que se usan para probar la actividad de formación de canales. En más detalle, se tamponan disoluciones salinas a ambos lados de la membrana a un pH diferente: en el lado cis, pH 4,7 o 5,5 y en el lado trans, pH 7,4. El "conjugado" que se someterá a prueba se añade al lado cis de la membrana y se realizan medidas eléctricas en condiciones de fijación de tensión, con el fin de supervisar el flujo de corriente a través de la membrana (véase párrafo 2.2, páginas 116 – 118). La presencia de una función de translocación activa se confirma mediante un ritmo uniforme de activación de canal (es decir, un resultado positivo para formación de canal), véase párrafo 3, página 118.
[0106] La función de la Fracción de direccionamiento (TM) después de la conjugación puede someterse a prueba mediante el ensayo de la función agonista inherente a la TM. Entre los procedimientos adecuados se incluyen los descritos en el Ejemplo 1.
[0107] La capacidad del conjugado de la invención de inhibir la liberación de sustancia P de células aferentes nociceptivas puede valorarse usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 15.
[0108] En el Ejemplo 15, se valora un conjugado de nociceptina-LHN/A según el primer aspecto de la invención en cuanto a su capacidad para inhibir la liberación de sustancia P desde las neuronas aferentes sensoriales nociceptivas primarias. Como puede verse en la Tabla 1, la incubación del conjugado con cultivos de neuronas aferentes nociceptivas produce una inhibición importante de liberación de sustancia P (cuando se compara con la incubación de las células con LHN/A en solitario). El experimento confirma, por tanto, que el conjugado es inhibidor de la liberación de sustancia P desde estas células.
[0109] En el uso de la presente invención, se selecciona una célula diana de percepción del dolor en la que se desea reducir o inhibir el procedimiento de fusión exocítica, un procedimiento exocítico que contribuye a los síntomas asociados con la sensación de dolor. Por ejemplo, la célula diana en cuestión puede mostrar un fenotipo no deseable (por ejemplo, una secreción no deseable, o la expresión de una concentración no deseable de receptor de membrana, transportador o canal de membrana), que contribuye a los síntomas asociados con el dolor. Alternativamente, puede seleccionarse una célula diana en la que el procedimiento de fusión exocítica contribuya a la sensación de dolor.
[0110] En formas de realización preferidas de la invención, la célula diana es una célula aferente sensorial nociceptiva, preferentemente una célula aferente nociceptiva primaria (por ejemplo, una fibra A como una fibra A8 o una fibra C). Así, los conjugados de la presente invención son capaces de inhibir la liberación de neurotransmisor o neuromodulador (por ejemplo, glutamato, sustancia P, péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) y/o neuropéptido Y) desde poblaciones discretas de neuronas aferentes sensoriales nociceptivas. En uso, los conjugados reducen o impiden la transmisión de señales aferentes sensoriales (por ejemplo, neurotransmisores o neuromoduladores) desde fibras del dolor periféricas a centrales, y tienen, por tanto, aplicación como moléculas terapéuticas para el tratamiento del dolor, en particular el dolor crónico.
[0111] Resulta rutinario confirmar que una TM se une a un aferente sensorial nociceptivo. Por ejemplo, puede emplearse un sencillo experimento de desplazamiento radiactivo en ese tejido o las células representativas del aferente sensorial nociceptivo (por ejemplo, DRG) se exponen a un ligando marcado (por ejemplo, tritiado) en presencia de un exceso de ligando no marcado. En dicho experimento, pueden valorarse las proporciones relativas de unión inespecífica o específica, permitiendo con ello la confirmación de que el ligando se une a la célula diana aferente sensorial nociceptiva. Opcionalmente, el ensayo puede incluir uno o más antagonistas de unión, y el ensayo puede comprender además la observación de una pérdida de unión de ligando. Pueden encontrarse ejemplos de este tipo de experimento en Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pág. 303 – 311, en Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Press.
[0112] Según un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado según el primer y/o el segundo aspecto de la presente invención.
[0113] La composición farmacéutica puede comprender además un soporte farmacéuticamente aceptable, y/o un diluyente y/o excipiente adecuado, aunque la forma exacta de la composición puede adaptarse al modo de administración. La administración es preferentemente a un mamífero, más preferentemente a un ser humano.
[0114] Los componentes de la composición pueden emplearse, por ejemplo, en la forma de un aerosol o disolución nebulizable para inhalación o una disolución estéril para administración parenteral, administración intraarticular o administración intracraneal.
[0115] La composición puede administrarse también por inyección i.v., que incluye el uso de sistemas de bomba. También puede usarse la inyección espinal (por ejemplo, epidural o intratecal) o las bombas internas.
[0116] Los intervalos de dosificación para administración de los componentes de la presente invención son aquellos que producen el efecto terapéutico deseado. Se observará que el intervalo de dosificación requerido depende de la naturaleza precisa de los componentes, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la edad del paciente, la naturaleza, magnitud o gravedad de la dolencia del paciente, las contraindicaciones, si existieran, y el criterio del médico responsable.
[0117] Las dosis diarias adecuadas (para cada componente) están en el intervalo de 0,0001 a 1 mg/kg, preferentemente de 0.0001 a 0,5 mg/kg, más preferentemente de 0,002 a 0,5 mg/kg, y preferentemente en particular de 0,004 a 0,5 mg/kg. La dosis unitaria puede variar desde menos de 1 microgramo a 30 mg, pero normalmente estará en la región de 0,01 a 1 mg por dosis, que puede administrarse diariamente o preferentemente con menos frecuencia, por ejemplo, semanalmente o cada seis meses.
[0118] Un régimen de dosificación preferido en particular se basa en 2,5 ng de proteína de fusión (por ejemplo, CPNv/A) como dosis 1X. A este respecto, las dosificaciones preferidas están en el intervalo 1X-100X (es decir, 2,5 – 250 ng). Este intervalo de dosificación es significativamente menor (es decir, al menos 10 veces, normalmente 100 veces menor) que el que se emplearía con otros tipos de moléculas analgésicas como AINE, morfina y gabapentina. Por otra parte, la diferencia mencionada anteriormente se amplifica considerablemente cuando se realiza la misma comparación en una base molar; esto se debe a que las proteínas de fusión de la presente invención tienen un Pm considerablemente mayor que el de la terapéutica convencional de moléculas ‘pequeñas’.
[0119] Sin embargo, deben esperarse amplias variaciones en la dosificación requerida dependiendo de la naturaleza precisa de los componentes, y las diferentes eficacias de las diversas vías de administración. Por ejemplo, sería de esperar que la administración oral necesitara dosis más altas que la administración por inyección intravenosa.
[0120] Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas estándar para optimización, como es bien conocido en la técnica.
[0121] Las composiciones adecuadas para inyección pueden estar en la forma de disoluciones, suspensiones
o emulsiones, o polvos secos que se disuelven o se suspenden en un vehículo adecuado antes de su uso.
[0122] Las formas de dosificación unitaria líquida se preparan normalmente usando un vehículo estéril sin pirógeno.
[0123] Los ingredientes activos, dependiendo del vehículo y la concentración usados, pueden ponerse en disolución o en suspensión en el vehículo.
[0124] Las disoluciones pueden usarse para todas las formas de parenteral administración, y se usan en particular para inyección intravenosa. En la preparación de disoluciones los componentes pueden disolverse en el vehículo, haciéndose la disolución isotónica si es necesario por adición de cloruro de sodio y esterilizándose por filtración a través de un filtro estéril usando técnicas asépticas antes de su llenado en viales o ampollas estériles adecuados y de su sellado. Alternativamente, si la estabilidad de la disolución es adecuada, la disolución en sus recipientes sellados puede esterilizarse por introducción en autoclave.
[0125] Ventajosamente, en el vehículo pueden disolverse aditivos como agentes de tamponamiento, solubilización, estabilización, conservantes o bactericidas, de suspensión o emulsionantes y/o anestésicos locales.
[0126] Los polvos secos que se disuelven o ponen en suspensión en un vehículo adecuado antes de su uso pueden prepararse por llenado de sustancias farmacológicas preesterilizadas y otros ingredientes en un recipiente estéril usando técnica aséptica en un área estéril.
[0127] Alternativamente los componentes de la composición pueden disolverse en un vehículo acuoso, la disolución se esteriliza por filtración y se distribuye en recipientes adecuados usando técnica aséptica en un área estéril. A continuación, el producto se liofiliza y los recipientes se sellan asépticamente.
[0128] Las suspensiones parenterales, adecuadas para inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica, se preparan sustancialmente de la misma manera con la salvedad de que los componentes estériles se ponen en suspensión en el vehículo estéril, en lugar de disolverse, y la esterilización no puede conseguirse por filtración. Los componentes pueden aislarse en un estado estéril o alternativamente pueden esterilizarse después de aislamiento, por ejemplo, por irradiación gamma.
[0129] Ventajosamente, se incluye un agente de suspensión, por ejemplo, polivinilpirrolidona, en la composición o composiciones para facilitar la distribución uniforme de los componentes.
[0130] Las composiciones adecuadas para su administración por medio del aparato respiratorio incluyen aerosoles, disoluciones nebulizables o polvos microfinos para insuflado. En el último caso, el tamaño de partícula es de menos de 50 micrómetros, especialmente se prefiere menos de 10 micrómetros. Dichas composiciones pueden prepararse de una manera convencional y emplearse en conjunción con dispositivos de administración convencional.
[0131] Las composiciones descritas en la presente invención pueden usarse in vivo, ya sea directamente o como una sal farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de dolencias que impliquen exocitosis (por ejemplo, secreción, o el suministro de proteínas como receptores, transportadores y canales de membrana a la membrana plasmática de una célula).
[0132] Según un tercer aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ADN que codifica un conjugado según los aspectos de la invención primero o segundo.
[0133] Mediante la expresión de la construcción en una célula hospedadora pueden prepararse conjugados de la invención.
[0134] Según un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un conjugado, composición o construcción según los aspectos de la invención primero a cuarto, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor, preferentemente el dolor crónico.
Sección de definiciones
[0135] La fusión exocítica es un procedimiento por el que las moléculas intracelulares son transportadas desde el citosol de una célula diana de percepción del dolor a la membrana plasmática (es decir, celular) de la misma. Posteriormente, las moléculas intracelulares pueden visualizarse en la superficie exterior de la membrana plasmática, o pueden secretarse en el entorno extracelular.
[0136] En un individuo sano, la velocidad de fusión exocítica es regulada minuciosamente y permite el control del transporte de moléculas entre el citosol y la membrana plasmática de una célula de percepción del dolor. Por ejemplo, la regulación del ciclo exocítico permite el control de la densidad de receptores, transportadores o canales de membrana presentes en la superficie de la célula, y/o permite el control de la velocidad de secreción de componentes intracelulares (por ejemplo, neurotransmisores) desde el citosol de la célula.
[0137] Sin embargo, en un individuo no sano, la regulación de la fusión exocítica puede estar modificada. Por ejemplo, la fusión exocítica puede provocar que las células de percepción del dolor afectadas entren en un estado de hipersecreción. Alternativamente, la fusión exocítica puede dar como resultado la visualización de una concentración aumentada de receptores, transportadores o canales de membrana presentes en la superficie de la percepción del dolor, que puede exponer la célula a estímulos externos no deseables. Así, el procedimiento de fusión exocítica puede contribuir a la progresión y/o gravedad del dolor, y proporciona, por tanto, una diana para la intervención terapéutica.
[0138] Debe observarse también que velocidades por lo demás normales de fusión exocítica celular pueden contribuir a la progresión y gravedad de dolor en pacientes deprimidos. Así, en el direccionamiento de la fusión exocítica de acuerdo con la presente invención, es posible también proporcionar terapia en dichos pacientes
[0139] Fracción de direccionamiento (TM) significa cualquier estructura química asociada con un conjugado que interacciona funcionalmente con un receptor, por ejemplo, un receptor ORL1, para provocar una asociación física entre el conjugado y la superficie de una célula diana de percepción del dolor. El término TM comprende cualquier molécula (es decir, una molécula de ocurrencia natural, o una variante química/físicamente modificada de la misma) que es capaz de unirse a un receptor en la célula diana, siendo ese receptor capaz de internalización (por ejemplo, formación de endosomas) también referida como endocitosis mediada por receptor. La TM puede poseer un dominio de translocación de membrana endosómica, en cuyo caso no es necesario que los componentes de TM y de Dominios de translocación separados estén presentes en un agente de la presente invención.
[0140] El término "fragmento" significa un péptido que tiene al menos treinta y cinco, preferentemente al menos veinticinco, más preferentemente al menos quince, y con la máxima preferencia al menos diez restos de aminoácidos de la TM en cuestión. En una forma de realización, el primer resto de aminoácido del fragmento es el resto de aminoácido N-terminal de la TM a partir del cual se ha obtenido el fragmento.
[0141] Un ejemplo de una "variante" es un péptido o fragmento peptídico de una TM que contiene uno o más análogos de un aminoácido (por ejemplo, un aminoácido no natural), o una unión sustituida.
[0142] Un "derivado" comprende la TM en cuestión, y una secuencia peptídica adicional. La secuencia peptídica adicional preferentemente no debería intervenir en el plegado básico y así en la estructura conformacional de la TM. Dos o más péptidos (o fragmentos, o variantes) pueden unirse conjuntamente para formar un derivado. Alternativamente, un péptido (o fragmento, o variante) puede unirse a una molécula no relacionada (por ejemplo, un segundo péptido no relacionado). Los derivados pueden sintetizarse químicamente, pero normalmente se prepararán mediante procedimientos de ácidos nucleicos recombinantes. Pueden incluirse componentes adicionales como componentes de lípidos, y/o polisacáridos, y/o policétidos.
[0143] El término no citotóxica significa que la molécula de proteasa en cuestión no destruye la célula diana de percepción del dolor a la que ha sido redirigida.
[0144] El "sitio de segmentación de proteasa" de la presente invención permite segmentación (preferentemente, segmentación controlada) del conjugado en una posición entre el componente de proteasa no citotóxica y el componente de TM. En una forma de realización, el conjugado puede incluir más de un sitio de segmentación proteolítica. Sin embargo, cuando existen dos o más de estos sitios, son diferentes, con lo que se previene sustancialmente la aparición de múltiples episodios de segmentación en presencia de una proteasa única. En otra forma de realización, se prefiere que el conjugado tenga un solo sitio de segmentación de proteasa. La o las secuencias de segmentación de proteasa pueden introducirse (y/o eliminarse cualquier secuencia de segmentación inherente) en el nivel de ADN por medios convencionales, por ejemplo, por mutagenia dirigida al sitio. El cribado para confirmar la presencia de secuencias de segmentación puede realizarse manualmente o con la ayuda de software informático (por ejemplo, el programa MapDraw de DNASTAR, Inc.).
[0145] Aunque puede emplearse cualquier sitio de segmentación de proteasa, se prefieren los siguientes:
Enterocinasa (DDDDKL) Factor Xa (IEGRL/IDGRL) TEV (virus del grabado del tabaco) (ENLYFQLG) Trombina (LVPRLGS) Preescisión (LEVLFQLGP).
[0146] En el término sitio de segmentación de proteasa se incluye también una inteína, que es una secuencia de autosegmentación. La reacción de autoempalme es controlable, por ejemplo, variando la concentración de agente reductor presente.
[0147] A continuación se describirá la presente invención con referencia a los siguientes Ejemplos y Figuras, sin pretender ninguna limitación de la misma.
Figuras [0148]
Fig. 1 Expresión y purificación de proteína de fusión recLHN/B Fig. 2 Expresión y purificación de proteína de fusión LHN/C Fig. 3 Expresión y purificación de proteína de fusión N[1-17]-LHN/A Fig. 4 Purificación de una proteína de fusión LC/A-nociceptina-HN/A Fig. 5 Purificación de una proteína de fusión nociceptina-LC/A-HN/A Fig. 6 Purificación de una proteína de fusión LC/C-nociceptina-HN/C Fig. 7 Purificación de una proteína de fusión LC/A-met encefalina-HN/A Fig. 8 Comparación de eficacia de unión de una proteína de fusión LC/A-nociceptina-HN/A y una proteína de fusión
nociceptina-LC/A-HN/A Fig. 9 Actividad catalítica in vitro de una proteína de fusión LC/A-nociceptina-HN/A Fig. 10 Purificación de una proteína de fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A Fig. 11 Comparación de la eficacia de unión de una proteína de fusión LC/A-nociceptina-HN/A y una proteína de
fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A
Fig. 12 Familia de proteínas de fusión LC/A-nociceptina-HN/A expresadas/purificadas con producto(s) de longitud de separación variable Fig. 13 Inhibición de liberación de SP y segmentación de SNAP-25 por CPN-A
Fig. 14 Inhibición de liberación de SP y segmentación de SNAP-25 durante periodos de tiempo prolongados después de exposición de DRG a CPN-A
Fig. 15 Segmentación de SNAP-25 por CPNv-A Fig. 16 Segmentación de SNAP-25 durante periodos de tiempo prolongados después de exposición de DRG a CPNv-A
Fig. 17 Desplazamiento mediado por fusión CPNv-A de unión a [3H]-nociceptina Fig. 18 Producto CPNv(Ek)-A expresado/purificado Fig. 19 Segmentación de SNAP-25 por CPNv(Ek)-A Fig. 20 Producto CPNv-C expresado/purificado Fig. 21 Segmentación de sintaxina por CPNv-C Fig. 22 Eficacia de CPN-A en el modelo de alodinia mecánica aguda inducida por capsaicina Fig. 23 Eficacia de CPN-A en el modelo de neuropatía neuropática diabética periférica (dolor neuropático) inducida
por estreptozotocina (STZ) Fig. 24 Eficacia de CPNv-A en el modelo de alodinia mecánica aguda inducida por capsaicina Fig. 25 Producto LC/A-CPLE-HN/A expresado/purificado Fig. 26 Producto LC/A-CPBE-HN/A expresado/purificado Fig. 27 Producto CPOP-A expresado/purificado Fig. 28 Producto CPOPv-A expresado/purificado Fig. 29 Segmentación de SNAP-25 in vitro en un modelo celular DRG Fig. 30 CPNv-A-FXa-HT expresado/purificado (marca his extraíble) Fig. 31 Eficacia in vitro de proteínas de fusión LC/A-nociceptina-HN/A con longitud de separador variable, según se
valora por ensayo de competición de ligando
Fig. 32 Eficacia in vitro de proteínas de fusión LC/A-nociceptina-HN/A con longitud de separador variable, según se valora por segmentación de SNAP-25 in vitro [0149] A continuación se describen las Figuras en más detalle. Fig. 1 -Expresión y purificación de proteína de fusión recLHN/B [0150] Análisis SDS-PAGE de expresión y purificación de recLHN/B a partir de E. coli. En la fig. 1, se purifica
recLHN/B a partir de pasta celular usando una estrategia de tres columnas según se describe en el Ejemplo 3. Se separan muestras de proteínas por SDS-PAGE y se visualizan por tinción con reactivo de Coomassie de tinción segura azul. Se carga la proteína de fusión MBP-LHN/B soluble en crudo contenida dentro del extracto aclarado (banda 2) en resina de intercambio aniónico Q-Sefarosa FF. La banda 3 representa fusión MBP-LHN/B recombinante eluida a partir de columna en sal 150 – 200 mM. Se trata esta muestra con factor Xa proteasa para eliminar la marca de afinidad de MBP (banda 4), y se segmenta la mezcla diluida para reducir la concentración de sal antes de cargarla en columna de intercambio aniónico Q-Sefarosa FF. El material eluido en sal 120 – 170 mM era rico en LHN/B (banda 5). La proteína en las bandas 6 y 8 representa LHN/B recogido después de tratamiento con enterocinasa y purificación final usando Benzamidina Sefarosa, en condiciones reductoras y no reductoras, respectivamente. Las bandas 1 y 7 representan marcadores de masa molecular [Mark 12 (Invitrogen)].
Fig. 2 -Expresión y purificación de proteína de fusión LHN/C
[0151] Análisis SDS-PAGE de expresión y purificación de LHN/C a partir de E. coli. En la fig. 2, se purifica recLHN/C a partir de pasta celular de E. coli usando una estrategia en dos etapas descrita en el Ejemplo 4. Se separan las muestras de proteínas por SDS-PAGE y se visualizan por tinción con azul de Coomassie. Se carga el lisado de célula en crudo aclarada (banda 2) en resina de intercambio aniónico Q-Sefarosa FF. Se eluye la proteína de fusión, MBP-LHN/C, con NaCl 0,1 M (banda 3). Se incuba el material eluido a 22 °C durante 16 h con proteasa de factor Xa (New England Biolabs) para segmentar la marca de fusión MBP y se corta recLHN/C en el sitio del conector. La proteína de interés es purificada adicionalmente a partir de productos de fusión segmentados (banda 4) usando Q-Sefarosa FF. Las bandas 5 y 7 muestran recLHN/C purificado en condiciones no reductoras y se reduce con DTT 10 mM respectivamente, para ilustrar enlaces de disulfuro en la región del conector entre dominios LC y HN después de corte con factor Xa. Las bandas 1 y 6 representan marcadores de masa molecular (mostrados en KDa); Mark 12 (Invitrogen).
Fig. 3 -Expresión y purificación de proteína de fusión N[1-17]-LHN/A
[0152] Análisis SDS-PAGE de expresión y purificación de N[1-17]-LHN/A a partir de E. coli. En la fig. 3, se purifica N[1-17]-LHN/A a partir de pasta celular de E. coli BL21 usando la metodología explicada en el Ejemplo 9. En resumen, los productos solubles obtenidos después de disrupción celular se aplicaron a una columna de captura de afinidad con carga de níquel. Se eluyeron las proteínas ligadas con imidazol 100 mM, se trató con Factor Xa para activar la proteína de fusión y eliminar la marca de proteína de unión a maltosa (MBP), y a continuación se volvió a aplicar a una columna de captura de afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se valoraron mediante SDS-PAGE (Panel A) y transferencia Western (Panel B). Se usaron antisueros anti-nociceptina (obtenidos de Abcam) como el anticuerpo primario para transferencia Western. El material purificado final en ausencia y presencia de agente reductor se identifica en las bandas marcadas como [ -] y [ + ] respectivamente.
Fig. 4 -Purificación de una proteína de fusión LC/A-nociceptina-HN/A
[0153] Usando la metodología explicada en el Ejemplo 26, se purificó una proteína de fusión LC/Anociceptina-HN/A a partir de células de E. coli BL21. En resumen, se aplicaron los productos solubles obtenidos después de disrupción celular a una columna de captura de afinidad cargada con níquel. Se eluyeron proteínas ligadas con imidazol 100 mM, se trató con Factor Xa para activar la proteína de fusión y eliminar la marca de proteína de unión a maltosa (MBP), y a continuación se volvió a aplicar a una segunda columna de captura de afinidad cargada con níquel. Se valoraron las muestras del procedimiento de purificación por SDS-PAGE (Panel A) y transferencia Western (Panel B). Se usaron antisueros de antinociceptina (obtenidos de Abcam) como el anticuerpo primario para transferencia Western. El material purificado final en ausencia y presencia de agente reductor se identifica en las bandas marcadas como [ -] y [ + ] respectivamente.
Fig. 5 -Purificación de una proteína de fusión nociceptina-LC/A-HN/A
[0154] Usando la metodología explicada en el Ejemplo, 26, se purificó una proteína de fusión nociceptinaLC/A-HN/A a partir de células de E. coli BL21. En resumen, los productos solubles obtenidos después de disrupción celular se aplicaron a una columna de captura de afinidad cargada con níquel. Se eluyeron proteínas ligadas con imidazol 100 mM, se trató con Factor Xa para activar la proteína de fusión y eliminar la marca de proteína de unión a maltosa (MBP), y a continuación se volvió a aplicar a una segunda columna de captura de afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se valoraron por SDS-PAGE (Panel A) y transferencia Western (Panel B). Se usaron antisueros de antinociceptina (obtenidos de Abcam) como el anticuerpo primario para transferencia Western. El material purificado final en ausencia y presencia de agente reductor se identifica en las bandas marcadas como [ -] y [ + ] respectivamente.
Fig. 6 -Purificación de una proteína de fusión LC/C-nociceptina-HN/C
[0155] Usando la metodología explicada en el Ejemplo 26, se purificó una proteína de fusión LC/Cnociceptina-HN/C a partir de células de E. coli BL21. En resumen, los productos solubles obtenidos después de disrupción celular se aplicaron a una columna de captura de afinidad cargada con níquel. Se eluyeron proteínas ligadas con imidazol 100 mM, se trató con Factor Xa para activar la proteína de fusión y eliminar la marca de proteína de unión a maltosa (MBP), y a continuación se volvió a aplicar a una segunda columna de captura de afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se valoraron por SDS-PAGE (Panel A) y transferencia Western (Panel B). Se usaron antisueros de antinociceptina (obtenidos de Abcam) como anticuerpo primario para transferencia Western. El material purificado final en ausencia y presencia de agente reductor se identifica en las bandas marcadas como [ -] y [ + ] respectivamente.
Fig. 7 -Purificación de una proteína de fusión LC/A-met encefalina-HN/A
[0156] Usando la metodología explicada en el Ejemplo 26, se purificó una proteína de fusión LC/A-met encefalina-HN/A a partir de células de E. coli BL21. En resumen, los productos solubles obtenidos después de disrupción celular se aplicaron a una columna de captura de afinidad cargada con níquel. Se eluyeron proteínas ligadas con imidazol 100 mM, se trató con Factor Xa para activar la proteína de fusión y eliminar la marca de proteína de unión a maltosa (MBP), y a continuación se volvió a aplicar a una segunda columna de captura de afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se valoraron por SDS-PAGE. El material purificado final en ausencia y presencia de agente reductor se identifica en las bandas marcadas como [ -] y [ + ] respectivamente.
Fig. 8 -Comparación de eficacia de unión de una proteína de fusión LC/A-nociceptina-HN/A y una proteína de fusión nociceptina-LC/A-HN/A
[0157] Se valoró la capacidad de las fusiones de nociceptina para unirse al receptor ORL1 usando un sencillo ensayo basado en competición. Se expusieron cultivos primarios de ganglios de la raíz dorsal (DRG) a concentraciones variables de material de prueba en presencia de [3H]-nociceptina 1 nM. Se valoró la reducción en unión específica del ligando marcado por recuento de centelleo, y se representó gráficamente en comparación con la eficacia de ligando no marcado (nociceptina Tocris). Está claro que la fusión LC/A-nociceptina-HN/A es bastante superior a la fusión nociceptina-LC/A-HN/A en interacción con el receptor ORL1.
Fig. 9 -Actividad catalítica in vitro de una proteína de fusión LC/A-nociceptina-HN/A
[0158] Se determinó la actividad de endopeptidasa in vitro de la proteína de fusión LC/A-nociceptina-HN/A purificada esencialmente según se describe en Chaddock y col. 2002, Prot. Express Purif. 25, 219 – 228. En resumen, se expuso el péptido SNAP-25 inmovilizado a una placa ELISA para concentraciones variables de proteína de fusión durante 1 hora a 37 °C. Después de una serie de lavados, se cuantificó la cantidad de péptido SNAP-25 segmentado por reactividad con un antisuero específico.
Fig. 10 -Purificación de una proteína de fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A
[0159] Usando la metodología explicada en el Ejemplo 26, se purificó una proteína de fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A a partir de células E. coli BL21. En resumen, los productos solubles obtenidos después de disrupción celular se aplicaron a una columna de captura de afinidad cargada con níquel. Se eluyeron proteínas ligadas con imidazol 100 mM, se trató con Factor Xa para activar la proteína de fusión y retirar la marca de proteína de unión a maltosa (MBP), y a continuación se volvió a aplicar a una segunda columna de captura de afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se valoraron por SDS-PAGE. El material purificado final en ausencia y presencia de agente reductor se identifica en las bandas marcadas como [ -] y [ + ] respectivamente.
Fig. 11 -Comparación de eficacia de unión de una proteína de fusión LC/A-nociceptina-HN/A y una proteína de fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A
[0160] Se valoró la capacidad de fusiones de nociceptina de unirse al receptor ORL1 usando un sencillo ensayo basado en competición. Se expusieron cultivos primarios de ganglios de la raíz dorsal (DRG) a concentraciones variables de material de prueba en presencia de [3H]-nociceptina 1 nM. Se valoró la reducción en la unión específica del ligando radiomarcado mediante recuento de centelleo, y se representó gráficamente en comparación con la eficacia de ligando no marcado (nociceptina Tocris). Está claro que la fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A (CPNv-LHA) es superior a la fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A (CPN-LHA) al interaccionar con el receptor ORL1.
Fig. 12 -Familia de proteínas de fusión LC/A-nociceptina-HN/A expresadas/purificadas con producto(s) de longitud de separador variable
[0161] Usando la metodología explicada en el Ejemplo 26, se purifican variantes de la fusión LC/A-CPN-HN/A consistentes en GS10, GS30 y HX27 a partir de pasta celular de E. coli. Se valoraron muestras a partir de la purificación de LC/A-CPN(GS10)-HN/A, LC/A-CPN (GS15)-HN/A, LC/A-CPN(GS25)-HN/A, LC/A, CPN(GS30)HN/A y LC/A-CPN(HX27)-HN/A mediante SDS-PAGE antes de tinción con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificación de una especie de dicadena con enlaces de disulfuro de la masa molecular esperada de CPBE-A. Panel superior: M = marcadores de masa molecular de referencia; S = fracción soluble de proteína de E. coli total; FT = proteínas que no se unen a la columna de Sefarosa cargada con Ni2 + ; FUSIÓN = proteína de fusión eluida por la adición de imidazol. Panel inferior: Banda 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Banda 2 = fracción soluble de proteína de E. coli total; Banda 3 = material purificado después de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 4 = Material tratado con Factor Xa antes de captura final en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 5 = material final purificado después de activación con Factor Xa (5 !l); Banda 6 = material final purificado después de activación con Factor Xa (10 !l); Banda 7 = material final purificado después de activación con Factor Xa (20 !l); Banda 8 = material final purificado después de activación con Factor Xa + DTT (5 !l); Banda 9 = material final purificado después de activación con Factor Xa + DTT (10 !l); Banda 10 = material final purificado después de activación con Factor Xa + DTT (20 !l).
Fig. 13 -Inhibición de liberación de SP y segmentación de SNAP-25 por CPN-A
[0162] En resumen, se expusieron cultivos primarios de ganglios de la raíz dorsal (DRG) a concentraciones variables de CPN-A durante 24 horas. Se separaron proteínas celulares por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una valoración de segmentación de SNAP-25. Se calculó el porcentaje de SNAP-25 segmentado por análisis densitométrico y se representó gráficamente frente a concentración de fusión (línea de puntos). También se recuperó material para un análisis de contenido de sustancia P usando un kit EIA específico. La inhibición de liberación de sustancia P se ilustra mediante la línea de trazo continuo. La concentración de fusión requerida para alcanzar el 50 % de segmentación de SNAP-25 máxima se estima en 6,30 ± 2,48 nM.
Fig. 14 -Inhibición de liberación de SP y segmentación de SNAP-25 durante periodos de tiempo prolongados después de exposición de DRG a CPN-A
[0163] Se expusieron cultivos primarios de ganglios de la raíz dorsal (DRG) a concentraciones variables de CPN-A durante 24 horas. Se usó neurotoxina botulínica (BoNT/A) como control. Después de esta exposición inicial, se eliminó material extracelular por lavado, y se incubaron las células a 37 °C durante periodos de tiempo variables. En momentos de tiempo específicos, se separaron proteínas celulares por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una valoración de segmentación de SNAP-25. Se calculó el porcentaje de SNAP-25 segmentado por análisis densitométrico y se ilustra mediante las líneas de puntos. También se recuperó material para un análisis de contenido de sustancia P usando un kit EIA específico. La inhibición de liberación de sustancia P se ilustra mediante las líneas de trazo continuo.
Fig. 15 -Segmentación de SNAP-25 por CPNv-A
[0164] Se expusieron cultivos primarios de ganglios de la raíz dorsal (DRG) a concentraciones variables de CPNv-A durante 24 horas. Se separaron proteínas celulares por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una valoración de segmentación de SNAP-25. Se calculó el porcentaje de SNAP-25 segmentado por análisis densitométrico. La concentración de fusión requerida para conseguir el 50 % segmentación de SNAP-25 máxima se estima en 1,38 ± 0,36 nM.
Fig. 16 -Segmentación de SNAP-25 durante periodos de tiempo prolongados después de exposición de DRG a CPNv-A
[0165] Se expusieron cultivos primarios de ganglios de la raíz dorsal (DRG) a concentraciones variables de CPNv-A durante 24 horas. Se usó CPN-A como control. Después de esta exposición inicial, se eliminó material extracelular por lavado, y se incubaron las células a 37 °C durante periodos de tiempo variables. En momentos de tiempo específicos, se separaron proteínas celulares por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una valoración de segmentación de SNAP-25. Se calculó el porcentaje de SNAP-25 segmentado por análisis densitométrico.
Fig. 17 -Desplazamiento mediado por fusión CPNv-A de unión a [3H]-nociceptina
[0166] Se valoró la capacidad de fusiones de nociceptina de unirse al receptor ORL1 usando un sencillo ensayo basado en competición. Se expusieron cultivos primarios de ganglios de la raíz dorsal (DRG) a concentraciones variables de material de prueba en presencia de [3H]-nociceptina 1 nM. Se valoró la reducción en la unión específica del ligando radiomarcado por recuento de centelleo, y se representó gráficamente en comparación con la eficacia de ligando no marcado (nociceptina Tocris). Está claro que la fusión LC/A-variante de nociceptinaHN/A (marcada como CPNv-LHNA) es superior a la fusión LC/A-nociceptina-HN/A (marcada como CPNLHNA) al interaccionar con el receptor ORL1.
Fig. 18 -Producto CPNv(Ek)-A expresado/purificado
[0167] Se sometieron proteínas a SDS-PAGE antes de tinción con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificación de una especie de dicadena unida a disulfuro de la masa molecular esperada de CPNv(Ek)-A. Banda 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Banda 2 = fracción soluble de proteína de E. coli total; Banda 3 = material purificado después de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 4 = material final purificado después de activación con enterocinasa (5 !l); Banda 5 = material final purificado después de activación con enterocinasa (10 !l); Banda 6 = material final purificado después de activación con enterocinasa (20 !l); Banda 7 = material final purificado después de activación con enterocinasa + DTT (5 !l); Banda 8 = material final purificado después de activación con enterocinasa + DTT (10 !l); Banda 9 = material final purificado después de activación con enterocinasa + DTT (20 !l).
Fig. 19 -Segmentación de SNAP-25 por CPNv(Ek)-A
[0168] Se expusieron cultivos primarios de ganglios de la raíz dorsal (DRG) a concentraciones variables de CPNv(Ek)-A durante 24 horas. Se separaron proteínas celulares por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una valoración de segmentación de SNAP-25. Se calculó el porcentaje de SNAP-25 segmentado por análisis densitométrico. Se usó CPNv-A según se preparó en el Ejemplo 26 con fines de comparación. Se ilustra el porcentaje de segmentación de SNAP-25 por CPNv (Ek)-A (marcado como En activado) y CPNv-A (marcado como Xa activado).
Fig. 20 -Producto CPNv-C expresado/purificado
[0169] Se sometieron proteínas a SDS-PAGE antes de tinción con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificación de una especie de dicadena unida a disulfuro de la masa molecular esperada de CPNv-C. Banda 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Banda 2 = fracción soluble de proteína de E. coli total; Banda 3 = material purificado después de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 4 = Material tratado con Factor Xa antes de captura final en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 5 = material purificado después de la segunda captura en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 6 = material purificado final; Banda 7 = material purificado final + DTT; Banda 8 = marcadores de masa molecular de referencia.
Fig. 21 -Segmentación de sintaxina por CPNv-C
[0170] Se expusieron cultivos primarios de ganglios de la raíz dorsal (DRG) a concentraciones variables de CPNv-C durante 24 horas. Se separaron proteínas celulares por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-sintaxina para facilitar una valoración de segmentación de sintaxina. Se calculó el porcentaje de sintaxina segmentada por análisis densitométrico. La concentración de fusión requerida para alcanzar el 50 % de segmentación de sintaxina máxima se estima en 3,13 ± 1,96 nM.
Fig. 22 -Eficacia de CPN-A en el modelo de alodinia mecánica aguda inducida por capsaicina
[0171] Se evaluó la capacidad de una fusión LC/A-nociceptina-HN/A (CPN/A) para inhibir alodinia mecánica inducida por capsaicina después de inyección intraplantar subcutánea en la pata trasera de una rata. En los animales de prueba se evaluó la frecuencia de retirada de la pata (% FRP) como respuesta a una serie de estímulos de filamento de Von Frey de 10 g (10 estímulos x 3 pruebas) antes de la inscripción en el estudio (Pre-tratamiento); después de tratamiento intraplantar subcutáneo con CPN/A pero antes de capsaicina (Pre-CAP); y después de prueba de provocación de capsaicina post-inyección de CPN/A (promedio de respuestas a 15’ y 30’; CAP). La prueba de provocación de capsaicina se consiguió por inyección de 10 !L de una disolución al 0,3 %. Se prepararon diluciones de muestra en BSA/suero salino al 0,5 %.
Fig. 23 -Eficacia de CPN-A en el modelo de neuropatía diabética periférica inducida por estreptozotocina (STZ) (dolor neuropático)
[0172] Se trata a ratas Sprague-Dawley macho (250 – 300 g) con 65 mg/kg de STZ en tampón de citrato (I.V.) y se mide la glucosa y los lípidos en sangre semanalmente para definir la competencia del modelo. Se mide el Umbral de Retirada de la Pata (URP) como respuesta a una serie de estímulos de filamento de Von Frey durante un periodo de tiempo. Se dice que se establece alodinia cuando el URP en dos fechas de prueba consecutivas (separadas por 1 semana) mide por debajo de 6 g en la balanza. En este punto, se aleatorizan las ratas en un grupo salino (control de eficacia negativo), un grupo de gabapentina (control de eficacia positivo) o un grupo de prueba (CPN/A). Se inyectan materiales de prueba (20 – 25 !l) subcutáneamente como una inyección única (excepto gabapentina) y se mide el URP 1 día después de tratamiento y después periódicamente durante un periodo de 2 semanas. La gabapentina (30 mg/kg i.p. @ 3 ml/kg volumen de inyección) se inyecta diariamente, 2 horas antes del inicio de la prueba de URP.
Fig. 24 -Eficacia de CPNv-A en el modelo de alodinia mecánica aguda inducida por capsaicina
[0173] Se evaluó la capacidad de una fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A (CPNv/A) para inhibir alodinia mecánica inducida por capsaicina después de inyección intraplantar subcutánea en la pata trasera de una rata. En los animales de prueba se evaluó la frecuencia de retirada de la pata ( %FRP) como respuesta a una serie de estímulos de filamento de Von Frey de 10 g (10 estímulos x 3 pruebas) antes de la inscripción en el estudio (Pretratamiento), después de tratamiento intraplantar subcutáneo con CPNv/A pero antes de capsaicina (Pre-CAP), y después de prueba de provocación de capsaicina post-inyección de CPNv/A (promedio de respuestas a 15’ y 30’; CAP). La prueba de provocación de capsaicina se consiguió por inyección de 10 !L de una disolución al 0,3 %. Se prepararon diluciones de muestra en BSA/suero salino al 0,5 %. Estos datos se expresan como un diferencial normalizado de la frecuencia de retirada de la pata, en el que la diferencia entre la respuesta pico (después de capsaicina) y la respuesta de base (pre-capsaicina) se expresa como un porcentaje. Con este análisis, puede verse que CPNv/A es más potente que CPN/A ya que se requiere una dosis menor de CPNv/A para conseguir un efecto analgésico similar al observado con CPN/A.
Fig. 25 -Producto LC/A-CPLE-HN/A expresado/purificado
[0174] Se sometieron proteínas a SDS-PAGE antes de tinción con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificación de una especie de dicadena unida a disulfuro de la masa molecular esperada de CPLE-A. Banda 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Banda 2 = fracción soluble de proteína de E. coli total; Banda 3 = material purificado después de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 4 = Material tratado con Factor Xa antes de captura final en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 5 = material purificado después de la segunda captura en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 6 = material purificado final; Banda 7 = material purificado final + DTT.
Fig. 26 -Producto LC/A-CPBE-HN/A expresado/purificado
[0175] Se sometieron proteínas a SDS-PAGE antes de tinción con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificación de una especie de dicadena unida a disulfuro de la masa molecular esperada de CPBE-A. Banda 1 = fracción soluble de proteína de E. coli total; Banda 2 = material purificado después de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 3 = Material tratado con Factor Xa antes de captura final en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 4 = material final purificado después de activación con Factor Xa (5 !l); Banda 5 = material final purificado después de activación con Factor Xa (10 !l); Banda 6 = material final purificado después de activación con Factor Xa (20 !l); Banda 7 = material final purificado después de activación con Factor Xa + DTT (5 !l); Banda 8 = material final purificado después de activación con Factor Xa + DTT (10 !l); Banda 9 = material final purificado después de activación con Factor Xa + DTT (20 !l); Banda 10 = marcadores de masa molecular de referencia.
Fig. 27 -Producto CPOP-A expresado/purificado
[0176] Se sometieron proteínas a SDS-PAGE antes de tinción con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificación de una especie de dicadena unida a disulfuro de la masa molecular esperada de CPOP-A. Banda 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Banda 2 = material purificado después de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 3 = Material tratado con Factor Xa antes de captura final en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 4 = material purificado después de segunda captura en Sefarosa cargada con Ni2
+ ; Banda 5 = material final purificado después de activación con Factor Xa (5 !l); Banda 6 = material final purificado después de activación con Factor Xa (10 !l); Banda 7 = material final purificado post-activación con Factor Xa (20 !l); Banda 8 = material final purificado después de activación con Factor Xa + DTT (5 !l); Banda 9 = material final purificado después de activación con Factor Xa + DTT (10 !l); Banda 10 = material final purificado después de activación con Factor Xa + DTT (20 !l).
Fig. 28 -Producto CPOPv-A expresado/purificado
[0177] Se sometieron proteínas a SDS-PAGE antes de tinción con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificación de una especie de dicadena unida a disulfuro de la masa molecular esperada de CPOPv-A. Banda 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Banda 2 = fracción soluble de proteína de E. coli total; Banda 3 = material purificado después de captura inicial en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 4 = Material tratado con Factor Xa antes de captura final en Sefarosa cargada con Ni2 + ; Banda 5 = material final purificado después de activación con Factor Xa (5 !l); Banda 6 = material final purificado después de activación con Factor Xa (10 !l); Banda 7 = material final purificado después de activación con Factor Xa (20 !l); Banda 8 = material final purificado después de activación con Factor Xa + DTT (5 !l); Banda 9 = material final purificado después de activación con Factor Xa + DTT (10 !l); Banda 10 = material final purificado después de activación con Factor Xa + DTT (20 !l).
Fig. 29 -Segmentación de SNAP-25 in vitro en un modelo de célula DRG
[0178] Se expusieron cultivos primarios de ganglios de la raíz dorsal (DRG) a concentraciones variables de CPOPv-A durante 24 horas. Se separaron proteínas celulares por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una valoración de segmentación de SNAP-25. Se calculó el porcentaje de SNAP-25 segmentado por análisis densitométrico.
Fig. 30 -CPNv-A-FXa-HT expresado/purificado (marca his extraíble)
[0179] Se sometieron proteínas a SDS-PAGE antes de tinción con azul de Coomassie. El perfil de electroforesis indica purificación de una especie de dicadena unida a disulfuro de la masa molecular esperada de CPNv-A-FXa-HT. Banda 1 = marcadores de masa molecular de referencia; Banda 2 = fracción soluble de proteína de E. coli total; Banda 3 = Material tratado con Factor Xa antes de captura final en Sefarosa cargada con Ni2 +; Banda 4 = material final purificado después de activación con Factor Xa; Banda 5 = material final purificado después de activación con Factor Xa + DTT.
Fig. 31 -Eficacia in vitro de proteínas de fusión LC/A-nociceptina-HN/A con longitud de separador variable, según se valora por ensayo de competición de ligando
[0180] Se valoró la capacidad de fusiones LC/A-nociceptina-HN/A de longitud de separador variable de unirse al receptor ORL1 usando un sencillo ensayo basado en competición. Se expusieron cultivos primarios de ganglios de la raíz dorsal (DRG) a concentraciones variables de material de prueba en presencia de [3H]-nociceptina 1 nM. Se valoró la reducción en la unión específica del ligando radiomarcado por recuento de centelleo, y se representó gráficamente en comparación con la eficacia de ligando no marcado (nociceptina Tocris). El panel superior ilustra las características de desplazamiento de los separadores GS0, GS20, GS30 y Hx27, mientras que el panel inferior ilustra el desplazamiento conseguido por las proteínas de fusión separadas GS10, GS15 y GS25. Se concluye que los separadores GS0 y GS30 son ineficaces, y el GS10 es escasamente eficaz, en el desplazamiento de nociceptina desde el receptor ORL1.
Fig. 32 -Eficacia in vitro de proteínas de fusión LC/A-nociceptina-HN/A con longitud de separador variable, según se valora por segmentación de SNAP-25 in vitro
[0181] Se expusieron cultivos primarios de ganglios de la raíz dorsal (DRG) a concentraciones variables de CPN-A (de longitud de separador variable) durante 24 horas. Se separaron proteínas celulares por SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western y se sondearon con anti-SNAP-25 para facilitar una valoración de segmentación de SNAP-25. Se calculó el porcentaje de SNAP-25 segmentado por análisis densitométrico. Las características de unión escasamente eficaces de la proteína de fusión separada GS10 (véase fig. 28) se reflejan en las mayores concentraciones de fusión requeridas para conseguir segmentación de SNAP-25 intracelular. Las proteínas de fusión separadas GS0 y GS30 fueron completamente ineficaces (datos no mostrados). Las proteínas de fusión separadas GS15, 20 y 25 tuvieron una eficacia similar.
SEQ ID Nos
[0182]
SEQ ID1 Secuencia de ADN de N[1-17] SEQ ID2 Secuencia de proteínas de N[1-17] SEQ ID3 Secuencia de ADN de N[1-11] SEQ ID4 Secuencia de proteínas de N[1-11] SEQ ID5 Secuencia de ADN de N[[Y10]1-11] SEQ ID6 Secuencia de proteínas de N[[Y10]1-11] SEQ ID7 Secuencia de ADN de N[[Y11]1-11] SEQ ID8 Secuencia de proteínas de N[[Y11]1-11] SEQ ID9 Secuencia de ADN de N[[Y14]1-17] SEQ ID10 Secuencia de proteínas de N[[Y14]1-17] SEQ ID11 Secuencia de ADN de N[1-13] SEQ ID12 Secuencia de proteínas de N[1-13] SEQ ID13 Secuencia de ADN de Nv (también conocido como N[[R14K15]1-17]) SEQ ID14 Secuencia de proteínas de Nv (también conocido como N[[R14K15]1-17]) SEQ ID15 Secuencia de ADN de proteína de fusión N[1-17]-LHN/A SEQ ID16 Secuencia de proteínas de proteína de fusión N[1-17]-LHN/A SEQ ID17 Secuencia de ADN de proteína de fusión N[[Y11]1-11]-LHN/A SEQ ID18 Secuencia de proteínas de proteína de fusión N[[Y11]1-11]-LHN/A SEQ ID19 Secuencia de ADN de proteína de fusión N[1-13]-LHN/A SEQ ID20 Secuencia de proteínas de proteína de fusión N[1-13]-LHN/A SEQ ID21 Secuencia de ADN de proteína de fusión LHN/A-N[1-17] SEQ ID22 Secuencia de proteínas de proteína de fusión LHN/A-N[1-17] SEQ ID23 Secuencia de ADN de proteína de fusión LHN/C-N[1-11] SEQ ID24 Secuencia de proteínas de proteína de fusión LHN/C-N[1-11] SEQ ID25 Secuencia de ADN de proteína de fusión N[[Y14]1-17]-LHN/C SEQ ID26 Secuencia de proteínas de proteína de fusión N[[Y14]1-17]-LHN/C SEQ ID27 Secuencia de ADN de LC/A SEQ ID28 Secuencia de ADN de HN/A SEQ ID29 Secuencia de ADN de LC/B SEQ ID30 Secuencia de ADN de HN/B SEQ ID31 Secuencia de ADN de LC/C SEQ ID32 Secuencia de ADN de HN/C SEQ ID33 Secuencia de ADN del conector CPN-A SEQ ID34 Secuencia de ADN del conector A SEQ ID35 Secuencia de ADN del inserto de nociceptina de presentación N-terminal SEQ ID36 Secuencia de ADN del conector CPN-C SEQ ID37 Secuencia de ADN del conector CPBE-A SEQ ID38 Secuencia de ADN del conector CPNvar-A SEQ ID39 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPN-HN/A SEQ ID40 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPN-HN/A SEQ ID41 Secuencia de ADN de la fusión N-LC/A-HN/A SEQ ID42 Secuencia de proteínas de la fusión N-LC/A-HN/A SEQ ID43 Secuencia de ADN de la fusión LC/C-CPN-HN/C SEQ ID44 Secuencia de proteínas de la fusión LC/C-CPN-HN/C SEQ ID45 Secuencia de ADN de la fusión LC/C-CPN-HN/C (conector A) SEQ ID46 Secuencia de proteínas de la fusión LC/C-CPN-HN/C (conector A) SEQ ID47 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPME-HN/A SEQ ID48 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPME-HN/A SEQ ID49 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPBE-HN/A SEQ ID50 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPBE-HNA SEQ ID51 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPNv-HN/A SEQ ID52 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPNv-HN/A SEQ ID53 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPN[1-11]-HN/A SEQ ID54 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPN[1-11]-HN/A SEQ ID55 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPN[[Y10]1-11]-HN/A SEQ ID56 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPN[[Y10]1-11]-HN/A SEQ ID57 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPN[[Y11]1-11]-HN/A SEQ ID58 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPN[[Y11]1-11]-HN/A SEQ ID59 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPN[[Y14]1-17]-HN/A SEQ ID60 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPN[[Y14]1-17]-HN/A SEQ ID61 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPN[1-13]-HN/A SEQ ID62 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPN[1-13]-HN/A SEQ ID63 Secuencia de ADN de la fusión nociceptina-separador-LC/A-HN/A SEQ ID64 Secuencia de proteínas de la fusión nociceptina-separador-LC/A-HN/A SEQ ID65 Secuencia de ADN del conector CPN-A GS10 SEQ ID66 Secuencia de ADN del conector CPN-A GS15 SEQ ID67 Secuencia de ADN del conector CPN-A GS25 SEQ ID68 Secuencia de ADN del conector CPN-A GS30 SEQ ID69 Secuencia de ADN del conector CPN-A HX27 SEQ ID70 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPN(GS15)-HN/A SEQ ID71 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPN(GS15)-HN/A SEQ ID72 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPN(GS25)-HN/A SEQ ID73 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPN(GS25)-HN/A SEQ ID74 Secuencia de ADN del conector activable de enterocinasa CPNvar-A SEQ ID75 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPNv(Ek)-HN/A SEQ ID76 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPNv(Ek)-HN/A SEQ ID77 Secuencia de ADN del conector CPNvar-A SEQ ID78 Secuencia de ADN de la fusión LC/C-CPNv-HN/C (act. A) SEQ ID79 Secuencia de proteínas de la fusión LC/C-CPNv-HN/C (act. A) SEQ ID80 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPLE-HN/A SEQ ID81 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPLE-HN/A SEQ ID82 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPOP-HN/A SEQ ID83 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPOP-HN/A SEQ ID84 Secuencia de ADN de la fusión LC/A-CPOPv-HN/A SEQ ID85 Secuencia de proteínas de la fusión LC/A-CPOPv-HN/A SEQ ID86 Secuencia de ADN de la IgA proteasa SEQ ID87 Secuencia de ADN de la fusión IgA-CPNv-HN/A SEQ ID88 Secuencia de proteínas de la fusión IgA-CPNv-HN/A SEQ ID89 Secuencia de ADN de FXa-HT SEQ ID90 Secuencia de ADN de CPNv-A-FXa-HT SEQ ID91 Secuencia de proteínas de la fusión CPNv-A-FXa-HT SEQ ID92 Secuencia de ADN del dominio de translocación DT SEQ ID93 Secuencia de ADN de CPLE-DT-A SEQ ID94 Secuencia de proteínas de la fusión CPLE-DT-A SEQ ID95 Secuencia de ADN de TeNT LC SEQ ID96 Secuencia de ADN de CPNv-TENT LC SEQ ID97 Secuencia de proteínas de la fusión CPNV-TeNT LC SEQ ID98 Secuencia de ADN del conector CPNvar-C SEQ ID99 Secuencia de ADN de la fusión LC/C-CPNv-HN/C (act. C) SEQ ID100 Secuencia de proteínas de la fusión LC/C-CPNv-HN/C (act. C)
Ejemplos
Ejemplo 1 -Confirmación de actividad agonista de TM por medida de la liberación de sustancia P de cultivos de células neuronales
Materiales
[0183] La EIA de la sustancia P se obtiene de R&D Systems, RU.
Procedimientos
[0184] Se establecen cultivos neuronales primarios de eDRG según se ha descrito anteriormente (Duggan y col., 2002). La liberación de sustancia P de los cultivos se valora por EIA, esencialmente según se ha descrito anteriormente (Duggan y col., 2002). La TM de interés se añade a los cultivos neuronales (establecidos durante al menos 2 semanas antes de tratamiento); se realizan cultivos de control en paralelo por adición de vehículo en lugar de TM. Se obtiene liberación estimulada (KCl 100 mM) y basal, junto con contenido de lisado celular total, de sustancia P para cultivos de control y tratados con TM. Se mide la inmunorreactividad de la sustancia P usando Kits de Inmunoensayo Enzimático de Sustancia P (Cayman Chemical Company, EE.UU. o R&D Systems, RU) según las instrucciones del fabricante.
[0185] Se compara la cantidad de Sustancia P liberada por las células neuronales en presencia de la TM de interés con la liberación obtenida en presencia y ausencia de KCl 100 mM. La estimulación de liberación de sustancia P por la TM de interés anterior a la liberación basal establece que la TM de interés es un "ligando agonista" según se define en esta memoria descriptiva. Si se desea, puede compararse la estimulación de liberación de Sustancia P por la TM de interés con una curva de liberación de Sustancia P estándar producida usando el ligando de receptor ORL-1 natural, nociceptina (Tocris).
Ejemplo 2 -Expresión y purificación de LHN/A catalíticamente activo
Materiales
[0186] ADN sintético obtenido de Sigma Genosys.
[0187] Enzimas de restricción obtenidas de New England Biolabs.
Procedimientos
[0188] La expresión y purificación de LHN/A catalíticamente activo se realizó esencialmente según se describe en Sutton y col., (2005), Prot. Express. Purif., 40, pág. 31 – 41.
[0189] En resumen, se sintetizó ADN que codifica la cadena ligera más 423 aminoácidos del N-terminal de la cadena pesada de BoNT/A por Sigma-Genosys para producir un gen LHN/A sintético con una preferencia codónica de E. coli. La región conectora entre la cadena ligera y el dominio HN se diseñó por ingeniería para contener un sitio de segmentación de Factor Xa por PCR de extensión de empalme-superposición. Se generaron dos productos PCR usando pares de cebadores que consisten en un cebador mutagénico largo y un cebador no mutagénico más corto:
(5’-tccaaaactaaatctctgATAGAAGGTAGAaacaaagcgctgaacgac) con (5’-CTTGATGTACTCTGTGAACGTGCTC); y (5’-gtcgttcagcgctttgttTCTACCTTCTATcagagatttagttttgga) con (5’-ATGGAGTTCGTTAACAAACAGTTC).
[0190] Los productos de estas dos reacciones se usaron como plantillas para la PCR de extensión de empalme-superposición. Se estableció una reacción de PCR adicional para añadir sitios BamHI y SalI en cada extremo del gen recLHN/A activable y estos sitios se usaron para inserción en un vector de entrada de pasarela de Invitrogen. A continuación se usó el vector de entrada, junto con un sitio de recombinación de pasarela adaptado pMAL c2x, en una reacción de clonasa LR para formar pMAL c2x recLHN/A. El pMAL c2x recLHN/A se modificó para incorporar una marca 6’HIS en el extremo N de MBP. Esto se consiguió mediante la inserción de oligonucleótidos apareados que codifican la marca HIS en el sitio Ndel de pMAL.
[0191] El vector de expresión que expresa LHN/A se transformó en HMS174 o AD494(DE3) de E. coli (Novagen). Se dejaron crecer los cultivos en medio de cultivo Terrific Broth suplementado con ZnCl2 (1 !M), ampicilina (100 !g/ml), glucosa al 0,2 % (p/v). Los parámetros para expresión de todas las construcciones se determinaron inicialmente en cultivos en matraz de agitación antes de transferencia en sistemas de fermentación de 8 L. Se dejaron crecer cultivos de inicio durante 16 horas a 37 °C, 220 rpm y se usaron para inocular 1 L en el que el crecimiento continuó a 37 °C, 250 rpm. Para una DO600 nm de 0,6 la temperatura se redujo a 25 °C durante 30 minutos antes de inducción con IPTG 1 mM. La inducción continuó durante 4 horas antes de que se recogieran las células y se almacenaran a -70 °C.
[0192] Normalmente se pusieron en suspensión 16 g de pasta celular en 160 ml de PBS y se lisaron por sonicación (MSE Soniprep 150). El lisado resultante se aclaró por centrifugado antes de cargarlo en una columna de amilosa de 25 ml y se eluyó con maltosa 10 mM en PBS. El eluyente contenía aproximadamente el 50 % de proteína de fusión pura y se trató con Factor Xa (1 unidad de Factor Xa/100 !g de proteína de fusión; 20 horas; 26 °C) para extraer el HISMBP y segmentar la unión LC-HN para activar la proteína. Después de la incubación, se filtró la muestra (0,45 mm) y se diluyó dos veces con agua para dar una composición de tampón de 0,5 x PBS. Se procesó recLHN/A segmentado, filtrado y diluido a través de una columna Q Sefarosa FF (10 ml) y se eluyó con un gradiente de paso de NaCl 80 mM que contenía HISMBP y NaCl 120 mM que contenía aproximadamente el 75 % de recLHN/A puro. La adición de esta marca His a MBP superó los problemas anteriores de coelución con LHN/A y MBP. Como etapa de ajuste fino final para garantizar la extracción completa de HISMBP, se pasó la elución de NaCl 120 mM desde la columna de Q Sefarosa a través de una columna HisTrap de 5 ml con carga de níquel (Amersham). El flujo a través de esta columna HisTrap contenía aproximadamente el 95 % de recLHN/A puro (véanse las Figuras en Sutton y col., (2005), Prot. Express. Purif., 40, págs. 31 – 41 como ilustración del esquema de purificación para LHN/A).
Ejemplo 3 -Expresión y purificación de LHN/B recombinante catalíticamente activo
[0193] La metodología descrita a continuación purificará proteasa de LHN/B catalíticamente activo de E. coli transformada con el plásmido apropiado que codifica el polipéptido LHN/B. Debe observarse que se han descrito varias secuencias de polipéptidos LHN/B adecuados en los documentos PCT/GB97/02.273, US-6.461.617 concedido y la solicitud de patente de EE.UU. 10/241.596, incorporados en la presente memoria descriptiva como referencia.
Procedimientos
[0194] La región de codificación para LHN/B se inserta en marco en el 3’ del gen que codifica proteína de unión a maltosa (MBP) en el vector de expresión pMAL (New England Biolabs) para crear pMAL-c2x-LHN/B. En esta construcción, la MBP expresada y los polipéptidos LHN/B están separados por un sitio de segmentación de Factor Xa, y los dominios LC y HN están separados por un péptido que es susceptible de segmentación con enterocinasa. El clon de expresión se denomina pMAL-c2X-syn-LHN/B. pMALc2X-synLHN/B se transforma en HMS174 de E. coli y se cultiva en medio de cultivo Terrific Broth en sistemas de fermentador de 8 L. El crecimiento bacteriano preinducción se mantiene a 37 °C a una DO 600 nm de 5,0, en cuya fase la expresión de recMBP-LHN/B es inducida por adición de IPTG a 0,5 mM y una reducción en temperatura a 30 °C. Después de cuatro horas a 30 °C se recogen las bacterias por centrifugado y la pasta resultante se almacena a -70 °C.
[0195] La pasta celular se vuelve a suspender en Hepes 20 mM pH 7,2, NaCl 125 mM, ZnCl2 1 !M yse consiguió la disrupción celular usando un homogeneizador 1000 de modelo de laboratorio APV-Gaulin o un sonicador MSE Soniprep 150. La suspensión resultante se aclara por centrifugado antes de purificación.
[0196] Después de la disrupción celular, la MBP-proteína de fusión se captura bien en una resina de afinidad de amilosa en Hepes 20 mM pH 7,2, NaCl 125 mM, ZnCl2 1 !M, o en una resina de intercambio aniónico Q-Sefarosa FF en Hepes 50 mM pH 7,2, ZnCl2 1 !M sin sal. Se eluye un único pico a partir de la resina de amilosa en el mismo tampón más maltosa 10 mM y a partir de la Q Sefarosa en sal 150 – 200 mM. La segmentación de la unión MBP-LHN/B se completa en una etapa de incubación de 18 horas a 22 °C con Factor Xa (NEB) a 1 U/50 !g de proteína de fusión. Es deseable una concentración de sustrato (MBP-LHN/B) de al menos 4 mg/ml para que tenga lugar una segmentación eficaz.
[0197] La proteína segmentada se diluye con Hepes 20 mM a una composición de tampón de Hepes 20 mM, NaCl 25 mM, ZnCl2 1 !M, pH 7,2 y se procesa a través de una columna de Q Sefarosa para separar la MBP de LHN/B. El LHN/B se eluye a partir de la columna de Q-Sefarosa con sal 120-170 mM. A continuación se corta el conector entre la cadena ligera y el dominio HN por incubación con enterocinasa a 1 U/100 !g de LHN/B a 22 °C durante 16 horas. Finalmente, la enterocinasa se separa del LHN/B cortado y de otras proteínas contaminantes en una columna de Benzamidina Sefarosa, con la enzima uniéndose preferentemente a la resina durante una incubación de 30 minutos a 4 °C. El LHN/B purificado se almacena a -20 °C hasta que se necesite. Véase la fig. 1 a modo de ilustración del esquema de purificación para recLHN/B.
Ejemplo 4 -Expresión y purificación de LHN/C recombinante catalíticamente activo
[0198] Se inserta la región de codificación para LHN/C en marco en el 3’ del gen que codifica proteína de unión a maltosa (MBP) en el vector de expresión pMAL (New England Biolabs) para crear pMAL-c2x-LHN/C. En esta construcción la MBP expresada y los polipéptidos LHN/C son separados por un sitio de segmentación de Factor Xa.
[0199] Se transforma pMAL-c2x-LHN/C en AD494 de E. coli (DE3, IRL) y se cultiva en medio de cultivo Terrific Broth en sistemas de fermentador de 8 L. El crecimiento bacteriano preinducción se mantiene a 30 °C para una DO600 nm de 8,0, en la que la expresión de fase de recMBP-c2x-LHN/C es inducida por adición de IPTG a 0,5 mM y una reducción en la temperatura de cultivo a 25 °C. Después de 4 horas a 25 °C, las bacterias se recogen por centrifugado y la pasta resultante se almacena a -70 °C.
[0200] La pasta celular se vuelve a suspender en Hepes 50 mM pH 7,2, ZnCl2 1 !M a 1: 6 (p/v) y se consigue disrupción celular usando un homogeneizador 1000 de modelo de laboratorio APV-Gaulin o un sonicador MSE Soniprep 150. La suspensión resultante se aclara por centrifugado antes de purificación.
[0201] Después de la disrupción celular y el aclarado, la MBP-proteína de fusión se separa en una resina de intercambio aniónico Q-Sefarosa Fast Flow en Hepes 50 mM pH 7,2, ZnCl2 1 !M y se eluye con el mismo tampón más NaCl 100 mM. Se realiza una segmentación de doble punto en la unión MBP-LHN/C y el conector HN-LC en una única etapa de incubación con Factor Xa. La reacción se completa en una etapa de incubación de 16 horas a 22 °C con Factor Xa (NEB) a 1 U/100 ìg proteína de fusión. La proteína segmentada se diluye con Hepes 20 mM a una composición de tampón de Hepes 20 mM, NaCl 25 mM, pH 7,2 y se procesa a través de una segunda columna de Q-Sefarosa para separar la MBP del LHN/C. El LHN/C activado (conector segmentado unido con disulfuro) se eluye a partir de la columna de Q-Sefarosa mediante un gradiente salino (Hepes 20 mM, NaCl 500 mM, ZnCl2 1 !M, pH 7,2) en sal 120-170 mM. Véase la fig. 2 para una ilustración de la purificación de LHN/C.
Ejemplo 5 -Producción de un conjugado químico de nociceptina y LHN/A
Materiales
[0202] Péptido de nociceptina extendido en extremo C obtenido de Sigma Genosys.
[0203] Productos químicos de conjugación obtenidos de Pierce.
Procedimientos
[0204] Para acoplar el péptido de nociceptina por medio de Cys C-terminal, primero se sintetizó el péptido (por procedimientos estándar, que pueden obtenerse comercialmente) para incluir Cys como el aminoácido Cterminal final.
[0205] A continuación se usó este péptido como el segundo componente en una reacción de acoplamiento basada en sulfhidrilo según se describe más adelante (véanse también las publicaciones anteriores WO-99/17.806 y WO-96/33.273 y Duggan y col., (2002), J. Biol. Chem. 277,24846 – 34852 y Chaddock y col., (2000), Infect Immun., 68, 2587 – 2593).
Reacción de acoplamiento basada en sulfhidrilo
[0206] En resumen, se introdujeron aproximadamente dos grupos salientes reactivos en LHN/A (5 mg/ml en solución salina con tampón de fosfato) por reacción con N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP).
[0207] Se aisló material derivado de SPDP en exceso por cromatografía de exclusión por tamaño. Se mezcló ligando de nociceptina marcado por cisteína reconstituido con el LHN/A derivado en una razón molar de 4: 1, y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave para crear un conjugado químico a través de un enlace de disulfuro covalente reducible. El fraccionamiento inicial de la mezcla de conjugados para extraer el péptido no conjugado se realizó por cromatografía de exclusión por tamaño (Superose-12, o Superdex G-200 dependiendo de la escala de conjugación).
Ejemplo 6 -Producción de un conjugado químico de nociceptina y LHN/B
Materiales
[0208] Péptido extendido en C-terminal de nociceptina obtenido de Sigma Genosys.
[0209] Productos químicos de conjugación obtenidos de Pierce.
Procedimientos
[0210] Se disolvió nociceptina liofilizada mediante la adición de agua y se dializó en tampón MES (MES 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH 5,0). A esta disolución (a una concentración de 0,3 mg/ml aproximadamente) se le añadió PDPH (100 mg/ml en DMF) hasta una concentración final de 1 mg/ml. Después del mezclado, se añadió EDAC sólido para producir una concentración final de 0,2 mg/ml aproximadamente. Se dejó proseguir la reacción durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación se extrajo PDPH en exceso mediante desalación en una columna PD-10 (Pharmacia) equilibrada previamente con tampón MES.
[0211] Se hizo reaccionar una cantidad de LHN/B equivalente a la mitad del peso de nociceptina usado disuelto en tampón de trietanolamina (trietanolamina 0,02 M/HCl, cloruro de sodio 0,1 M, pH 7,8) a una concentración de 1 mg/ml aproximadamente, con reactivo de Traut (disolución de reserva 100 mM en trietanolamina 1 M/HCl, pH 8,0) a una concentración final de 2 mM. Después de 1 hora, se desaló el LHN/B en PBSE (solución salina con tampón de fosfato con EDTA 1 mM) usando una columna PD-10 (Pharmacia). Se concentró el pico de proteínas del eluato de la columna usando Microcon 50 (Amicon) a una concentración de 2 mg/ml aproximadamente.
[0212] Se sometió la nociceptina derivada a una etapa de concentración final que dio como resultado una reducción de volumen a menos del 10 % del volumen de partida y a continuación se mezcló con el LHN/B derivado durante toda la noche a temperatura ambiente. Se analizaron los productos de la reacción por electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE).
[0213] El conjugado resultante de la reacción anterior se purificó parcialmente por cromatografía de exclusión por tamaño en Bio-Gel P-100 (BioRad). El perfil de elución se siguió de la medida de la densidad óptica a 280 nm y análisis SDS-PAGE de las fracciones. Esto permitió la separación del conjugado de la nociceptina libre y los productos secundarios de la reacción.
Ejemplo 7 -Producción de un conjugado químico de nociceptina 1-11 y LHN/B
Materiales
[0214] Péptido nociceptina 1-11 extendido en C-terminal de Sigma Genosys.
[0215] Productos químicos de conjugación obtenidos de Pierce.
Procedimientos
[0216] Con el fin de acoplar el péptido de nociceptina 1-11 por medio de Cys C-terminal, primero se sintetizó el péptido (mediante procedimientos estándar, que pueden obtenerse comercialmente) para incluir Cys como el aminoácido C-terminal final.
[0217] A continuación se usó este péptido como segundo componente en una reacción de acoplamiento con base de sulfhidrilo según se describe en el Ejemplo 5.
Ejemplo 8 -Producción de un conjugado químico de nociceptina N[[Y14]1-17] y LHN/C
Material
[0218] Péptido de nociceptina N[[Y14]1-17] extendido en C-terminal obtenido de Sigma Genosys.
[0219] Productos químicos de conjugación obtenidos de Pierce.
Procedimientos
[0220] Con el fin de acoplar el péptido por medio de Cys C-terminal, primero se sintetizó el péptido (por procedimientos estándar, que pueden obtenerse comercialmente) para incluir Cys como el aminoácido C-terminal final.
[0221] A continuación se usó este péptido como segundo componente en una reacción de acoplamiento con base de sulfhidrilo según se describe en el Ejemplo 5.
Ejemplo 9 -Producción recombinante de una fusión nociceptina-LHN/A de polipéptido único (SEQ ID15 y SEQ ID16)
[0222] La secuencia de ADN para la nociceptina-LHN/A se diseñó por traducción inversa de secuencias de aminoácidos de LC/A, HN/A y nociceptina. Se reunió el ORF completo que contenía la secuencia nociceptina-LC/Abucle de activación-HN/A dentro del software de manipulación de secuencias de ADN (EditSeq). Se modificó el bucle de activación entre la cisteína LC/A y la cisteína HN/A (CVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLC) para incorporar un sitio de reconocimiento de proteasa de Factor Xa.
[0223] Se incorporaron sitios de restricción para facilitar la clonación en el vector de expresión requerido (por ejemplo, BamHI/SalI) en los extremos 5’ y 3’, respectivamente, de la secuencia que mantenía el marco de lectura correcto. Se cribó la secuencia de ADN (usando software como MapDraw, DNASTAR Inc.) para secuencias de segmentación de enzimas de restricción incorporadas durante la traducción inversa. Todas las secuencias de segmentación que se encontraron comunes con las requeridas por el sistema de clonación se extrajeron manualmente de la secuencia de codificación propuesta asegurando que se mantenía el uso de codón de E. coli común. Se valoró el uso de codón de E. coli con referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y se valoró la proporción entre el contenido de %GC y el uso de codón con referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank, edición 143, 13 de septiembre de 2004).
[0224] A continuación se sintetizó comercialmente esta secuencia de ADN optimizada que contenía el marco de lectura abierto (ORF) de nociceptina-LC/A-bucle de activación-HN/A y se proporcionó en el vector pCR 4.
[0225] Se aisló el ADN que codifica la fusión nociceptina-LHN/A a partir de pCR 4 y se transfirió en esqueleto del vector pMAL para facilitar la expresión de proteínas. El vector PMAL-NO-LHN/A resultante se transformó en E. coli BL21 competente y se seleccionaron los transformantes correctos. Se desarrolló una única colonia de pMAL NO-LHN/A en medio de cultivo Terrific Broth suplementado con ZnCl2 (1 mM), ampicilina (100 !g/ml), glucosa al 0,2 % (p/v). Se indujo la expresión del inserto mediante la adición de IPTG (0,1 mM) y se mantuvo el cultivo a 16 °C durante 16 horas. Después de este periodo de expresión se aislaron las bacterias por centrifugado y se almacenó el sedimento celular a -20 °C hasta su uso.
[0226] Se descongelaron 10 g de pasta celular de E. coli BL21 en un tubo Falcon que contenía 25 ml de Hepes 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM. La pasta celular descongelada se completó hasta 80 ml con Hepes 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM y se sometió a sonicación en hielo con activación de 30 segundos y desactivación de 30 segundos durante 10 ciclos a una potencia de 22 micrómetros asegurando que la muestra se mantuviera fría. Se centrifugaron las células lisadas a 18.000 rpm, 4 °C durante 30 minutos. Se cargó el sobrenadante en una columna de quelación cargada con NiSO4 0,1 M (son suficientes 20 – 30 ml de columna) y se equilibró con Hepes 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM.
[0227] Usando un gradiente escalonado de imidazol 10 y 40 mM, se eliminó por lavado la proteína ligada inespecífica y se eluyó la proteína de fusión con imidazol 100 mM. Se dializó la proteína de fusión eluida frente a 5 L de Hepes 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM a 4 °C durante toda la noche y se midió la DO de la proteína de fusión dializada. Se añadió 1 unidad de Factor Xa por 100 !g de proteína de fusión y se incubó a 25 °C estáticos durante toda la noche. Se cargó la mezcla de segmentación en una columna de quelación cargada con NiSO4 0,1 M (son suficientes 20 – 30 ml de columna) y se equilibró Hepes 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM.
[0228] Usando un gradiente escalonado de imidazol 10 y 40 mM, se eliminó por lavado la proteína ligada inespecífica y se eluyó la proteína de fusión con imidazol 100 mM. Se dializó la proteína de fusión eluida frente a 5 L de Hepes 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM a 4 °C durante toda la noche y se concentró la fusión a aproximadamente 2 mg/ml, se distribuyó en partes alícuotas y se almacenó a -20 °C.
[0229] La fig. 3 muestra el análisis de expresión SDS-PAGE y la purificación de N[1-17]-LHN/A.
Ejemplo 10 -Producción recombinante de una fusión (nociceptina 1-11)-LHN/B de polipéptido único
[0230] Se diseñó la secuencia de ADN para la (nociceptina 1-11)-LHN/B por traducción inversa de las secuencias de aminoácidos de LC/B, HN/B y nociceptina 1-11. Se reunió el ORF completo que contenía la secuencia (nociceptina 1-11)-LC/B-bucle de activación-HN/B dentro del software de manipulación de secuencias de ADN estándar (EditSeq). Se modificó el bucle de activación entre la cisteína de LC/B y la cisteína de HN/B para incorporar un sitio de reconocimiento de proteasa de Factor Xa.
[0231] A continuación se produjo la proteína de fusión recombinante esencialmente según se describe en el Ejemplo 9.
Ejemplo 11 -Producción recombinante de una fusión (nociceptina N[[Y14]1-17])-LHN/C de polipéptido único (SEQ ID25 y SEQ ID26)
[0232] Se diseñó la secuencia de ADN para la nociceptina N[[Y14]1-17] por traducción inversa de las secuencias de aminoácidos de LC/C, HN/C y nociceptina N[[Y14]1-17]. Se reunió el ORF completo que contenía la secuencia (nociceptina N[[Y14]1-17])-LC/C-bucle de activación-HN/C dentro del software de manipulación de secuencias de ADN estándar (EditSeq). Se modificó el bucle de activación entre la cisteína de LC/C y la cisteína de HN/C para incorporar un sitio de reconocimiento de proteasa de Factor Xa.
[0233] A continuación se produjo la proteína de fusión recombinante esencialmente según se describe en el Ejemplo 9.
Ejemplo 12 -Producción recombinante de una fusión LHN/C-(nociceptina 1-11) de polipéptido único (SEQ ID23 y SEQ ID24)
[0234] Se diseñó la secuencia de ADN para la LHN/C-(nociceptina 1-11) por traducción inversa de las secuencias de aminoácidos de LC/C, HN/C y nociceptina 1-11. Se reunió el ORF completo (SEQ ID23) que contenía la secuencia LC/C-bucle de activación-HN/C-separador flexible-(nociceptina 1-11) dentro del software de manipulación de secuencias de ADN estándar (EditSeq).
[0235] A continuación se produjo la proteína de fusión recombinante (SEQ ID24) esencialmente según se describe en el Ejemplo 9.
Ejemplo 13 -Producción de un conjugado para suministro de ADN que codifica LC/C en una célula
[0236] A continuación se describe la construcción de un conjugado de nociceptina-HN-[LC/C], en el que [LC/C] representa el ADN condensado de polilisina que codifica la cadena ligera de neurotoxina botulínica tipo C.
Materiales
[0237] SPDP procede de Pierce Chemical Co. [0238] Los reactivos adicionales se obtienen de Sigma Ltd.
Procedimientos
[0239] Usando un plásmido que contiene el gen que codifica LC/C bajo el control de un promotor CMV (temprano inmediato), se consiguió la condensación de ADN usando polilisina derivada de SPDP en una proporción de 2 ADN por 1 polilisina. A continuación se prepararon conjugados mezclando ADN condensado (0,4 mg/ml) con HN-nociceptina (100 !g/ml) durante 16 h a 25 °C. La polilisina derivada de SPDP y el grupo -SH libre presente en el dominio HN se combinan para facilitar la fijación covalente del ADN y la proteína.
Ejemplo 14 -Producción de un conjugado para suministro de ADN que codifica LC/B en una célula
[0240] A continuación se describe la construcción de un conjugado de (nociceptina 1-11)-HN-[LC/B], en el que [LC/B] representa el ADN condensado de polilisina que codifica la cadena ligera de neurotoxina botulínica tipo B.
Materiales
[0241] SPDP es de Pierce Chemical Co. [0242] Los reactivos adicionales se obtienen de Sigma Ltd.
Procedimientos
[0243] Usando un plásmido que contiene el gen que codifica LC/B bajo el control de un promotor CMV (temprano inmediato), se obtuvo la condensación de ADN usando polilisina derivada de SPDP en una proporción de 2 ADN por 1 polilisina. A continuación se prepararon conjugados mezclando ADN condensado (0,4 mg/ml) con HN(nociceptina 1-11) (100 !g/ml) durante 16 h a 25 °C. La polilisina derivada de SPDP y el grupo -SH libre presentes en el dominio HN se combinan para facilitar la fijación covalente del ADN y la proteína.
Ejemplo 15 -Valoración de la actividad de nociceptina-LHN/A en sustancia P que libera células neuronales
5 [0244] Usando la metodología descrita en Duggan y col., (2002, J. Biol. Chem., 277, 34846 – 34852), se valoró la actividad de nociceptina-LHN/A en sustancia P que libera células neuronales.
[0245] Se aplicó proteína de fusión nociceptina-LHN/A a cultivos neuronales de ganglios de la raíz dorsal de 2 semanas, y se incubó a 37 °C durante 16 horas. Después de la incubación, se extrajo el medio y se valoró la capacidad de las células de someterse a liberación estimulada de sustancia P (SP).
[0246] Se sometió a ensayo la liberación de SP a partir de las células neuronales incubadas con la proteína de fusión nociceptina-LHN/A en comparación con (i) células tratadas sólo con LHN/A y (ii) células tratadas sólo con
15 medio. Esto permitió calcular el % inhibición de sustancia P a partir de eDRG. En la Tabla 1 se comunicó la capacidad de la proteína de fusión nociceptina-LHN/A para inhibir la liberación de SP (con respecto a las células tratadas con medio en solitario). Los datos representan la media de 3 determinaciones:
Tabla 1
Material de prueba (!M)
Proteína de fusión nociceptina-LHN/A LHN/A sólo
% Inhibición
% Inhibición
1,0
47,3 25,6
0,1
13,8 -11,5

Ejemplo 16 -Confirmación de activación de receptor ORL1 midiendo la producción de cAMP estimulada por forskolina
[0247] La confirmación de que una TM dada está actuando por medio del receptor ORL1 se proporciona
25 mediante la siguiente prueba, en la que se valora la capacidad de las TM para inhibir la producción de cAMP estimulada por forskolina.
Materiales
[0248] [3H]adenina y [14C]cAMP se obtienen de GE Healthcare
Procedimientos
[0249] La prueba se realiza esencialmente según se ha descrito anteriormente por Meunier y col. [Isolation
35 and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like receptor ORL1. Nature 377: 532 – 535, 1995] en células CHO transfectadas intactas estudiadas en placas de plástico de 24 pocillos.
[0250] A las células se añade [3H]-adenina (1,0 !Ci) en 0,4 ml de medio de cultivo. Las células se mantienen a 37 °C durante 2 h para permitir que la adenina se incorpore en la reserva de ATP intracelular. Después de 2 h, se lavan células una vez con tampón de incubación que contiene: NaCl 130 mM, KCl 4,8 mM, KH2PO4 1,2 mM, CaCl2 1,3 mM, MgSO4 1,2 mM, glucosa 10 mM, 1 mg/ml de albúmina de suero bovino y 25 mM de HEPES, pH 7,4, y se sustituyó por tampón que contenía forskolina (10 !M) e isobutilmetilxantina (50 !M) con o sin la TM de interés. Después de 10 min., el medio se aspira y se sustituye por 0,5 ml de HCl 0,2 M. Se añade aproximadamente 1000 cpm de [14C]cAMP a cada pocillo y se usa como un patrón interno. A continuación se transfiere el contenido de los
45 pocillos a columnas de 0,65 g de polvo de alúmina seco. Se eluyen las columnas con 4 ml de HCl 5 mM, 0,5 ml de acetato de amonio 0,1 M, y a continuación dos mililitros adicionales de acetato de amonio. Se recoge el eluato final en viales de centelleo y se cuenta el 14C y el tritio. Las cantidades recogidas se corrigen en cuanto a recuperación de [14C] cAMP. Las TM que son agonistas en el receptor ORL1 provocan una reducción en el nivel de cAMP producido como respuesta a forskolina.
Ejemplo 17 -Confirmación de activación de receptor ORL1 usando un ensayo funcional de unión a GTPyS
[0251] La confirmación de que una TM dada está actuando por medio del receptor ORL1 se proporciona también mediante la prueba siguiente, un ensayo funcional de unión a GTPyS.
Materiales
[0252] [35S]GTPyS se obtiene de GE Healthcare.
[0253] Las perlas (SPA) recubiertas con aglutinina de germen de trigo se obtienen de GE Healthcare.
Procedimientos
[0254] Este ensayo se realiza esencialmente según se describe en Traynor y Nahorski [Modulation by Popioid agonists of guanosine-5-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47: 848 – 854, 1995].
[0255] Las células se obtienen de platos de cultivo tisular en Hepes 20 mM, ácido etilendiamintetraacético 1 mM, y a continuación se centrifugan a 500 x g durante 10 min. Se vuelven a suspender las células en este tampón y se homogeneizan con un homogeneizador Politron.
[0256] Se centrifuga el homogeneizado a 27.000 x g durante 15 min., y se vuelve a suspender el sedimento en tampón A, que contiene: Hepes 20 mM, MgCl2 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4. La suspensión se vuelve a centrifugar a 20.000 x g y se suspende una vez más en tampón A. Para el ensayo de unión, se incuban las membranas (8 – 15 !g de proteínas) con [35S]GTP S (50 pM), GDP (10 !M), con y sin la TM de interés, en un volumen total de 1,0 ml, durante 60 min a 25 °C. Se filtran las muestras en filtros de fibra de vidrio y se cuentan según se describe para los ensayos de unión.
Ejemplo 18 -Preparación de clones de esqueleto de LC/A y HN/A
[0257] El siguiente procedimiento crea los fragmentos de LC y HN para su uso como el esqueleto de componentes para expresión de fusión multidominio. Este ejemplo se basa en la preparación de un clon basado en serotipo A (SEQ ID27 y SEQ ID28), aunque los procedimientos y métodos son aplicables igualmente a los otros serotipos [ilustrados por el listado de secuencias para serotipo B (SEQ ID29 y SEQ ID30) y serotipo C (SEQ ID31 y SEQ ID32)].
Preparación de vectores de clonación y expresión
[0258] pCR 4 (Invitrogen) es el vector de clonación patrón elegido, seleccionado debido a la falta de secuencias de restricción dentro del vector y adyacentes que secuencian sitios de cebador por facilidad de confirmación de la construcción. El vector de expresión se basa en el vector de expresión pMAL (NEB), que tiene las secuencias de restricción deseadas dentro del sitio de clonación múltiple en la orientación correcta para inserción de la construcción (BamHI-SalI-PstI-HindIII). Se ha extraído un fragmento del vector de expresión para crear un plásmido no movilizable y se ha insertado una variedad de diferentes marcas de fusión para aumentar las opciones de purificación.
Preparación de un inserto de proteasa (por ejemplo, LC/A)
[0259] LC/A (SEQ ID27) se crea mediante una de dos formas posibles:
La secuencia de ADN se diseña por traducción inversa de la secuencia de aminoácidos LC/A [obtenida de fuentes de bases de datos disponibles libremente como GenBank (número de acceso P10845) o Swissprot (locus de acceso BXA1_CLOBO) usando una entre una variedad de herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, EditSeq que es la mejor para traducción inversa de E. coli (DNASTAR Inc.), o la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)]. Las secuencias de reconocimiento BamHI/SalI se incorporan en los extremos 5’ y 3’ respectivamente de la secuencia, manteniendo el marco de lectura correcto. La secuencia de ADN es cribada (usando software como MapDraw, DNASTAR Inc.) para secuencias de segmentación de enzimas de restricción incorporadas durante la traducción inversa. Todas las secuencias de segmentación que se consideren comunes a las requeridas por el sistema de clonación son eliminadas manualmente de la secuencia de codificación propuesta asegurando que se mantiene el uso de codón de E. coli común. El uso de codón de E. coli se valora con referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y se valoró la proporción entre el contenido %GC y el uso de codón con referencia a las tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank edición 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada que contiene el marco de lectura abierto (ORF) de LC/A se sintetiza a continuación comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector de pCR 4.
[0260] El procedimiento alternativo consiste en usar amplificación de PCR a partir de una secuencia de ADN existente con secuencias de enzimas de restricción BamHI y SalI incorporadas en los cebadores de PCR 5’ y 3’, respectivamente. Los cebadores de oligonucleótido complementarios son sintetizados químicamente por un proveedor (por ejemplo, MWG o Sigma-Genosys), de manera que cada par tiene la capacidad de hibridarse en las hebras opuestas (extremos 3’ que apuntan "hacia" el otro mutuamente) que flanquean la extensión del ADN diana de Clostridium, un oligonucleótido para cada una de las dos hebras de ADN. Para generar un producto de PCR se mezcla el par de cebadores de oligonucleótidos cortos específicos para la secuencia de ADN de Clostridium con la plantilla de ADN de Clostridium y otros componentes de reacción y se coloca en una máquina (la ’máquina de PCR’) que puede cambiar la temperatura de incubación del tubo de reacción automáticamente, con cambio cíclico entre aproximadamente 94 °C (para desnaturalización), 55 °C (para apareamiento de oligonucleótidos) y 72 °C (para síntesis). Otros reactivos requeridos para la amplificación de un producto de PCR incluyen una ADN polimerasa (como Taq o Pfu polimerasa), los cuatro bloques elementales dNTP de nucleótidos de ADN en cantidades equimolares (50 – 200 !M) y un tampón apropiado para la enzima optimizada para concentración de Mg2 + (0,5 – 5 mM).
[0261] El producto de amplificación se clona en pCR 4 usando clonación TOPO TA para productos de PCR Taq o clonación Zero Blunt TOPO para productos de PCR Pfu (ambos kits disponibles comercialmente en Invitrogen). El clon resultante se verifica por secuenciación. A continuación se eliminan todas las secuencias de restricción adicionales que no son compatibles con el sistema de clonación usando mutagenia dirigida al sitio [por ejemplo, usando Quickchange (Stratagene Inc.)].
Preparación de inserto de translocación (por ejemplo, HN)
[0262] HN/A (SEQ ID28) se crea con una de dos formas posibles:
La secuencia de ADN se diseña por traducción inversa de las secuencias de aminoácidos HN/A [obtenidos de fuentes de bases de datos disponibles libremente como GenBank (número de acceso P10845) o Swissprot (locus de acceso BXA1_CLOBO)] usando una entre una variedad de herramientas de software de traducción inversa [por ejemplo, EditSeq que es la mejor para traducción inversa de E. coli (DNASTAR Inc.), o la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)]. Se mantiene una secuencia de restricción PstI añadida al extremo N y Xbalcodón de parada-HindIII al extremo C que asegura que se mantenga el marco de lectura correcto. Se criba la secuencia de ADN (usando software como MapDraw, DNASTAR Inc.) para secuencias de segmentación de enzimas de restricción incorporadas durante la traducción inversa. Todas las secuencias que se consideran comunes para las requeridas por el sistema de clonación son eliminadas manualmente de la secuencia de codificación propuesta asegurando que se mantiene el uso de codón de E. coli común. El uso de codón de E. coli se valora con referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y se valora la proporción entre contenido de %GC y uso de codones con referencia a las tablas publicadas de uso de codones (por ejemplo, GenBank edición 143, 13 de septiembre de 2004). A continuación se sintetiza comercialmente esta secuencia de ADN optimizada (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
[0263] El procedimiento alternativo consiste en usar amplificación PCR a partir de una secuencia de ADN existente con secuencias de enzimas de restricción PstI y Xbal-codón de parada-HindIII incorporadas en los cebadores PCR 5’ y 3’ respectivamente. La amplificación de PCR se realiza según se describe anteriormente. El producto PCR se inserta en un vector pCR 4 y se verifica por secuenciación. A continuación se eliminan todas las secuencias de restricción adicionales que son no compatibles con el sistema de clonación usando mutagenia dirigida al sitio [por ejemplo, usando Quickchange (Stratagene Inc.)].
Ejemplo 19 -Preparación de una proteína de fusión LC/A-nociceptina-HN/A (la nociceptina es N-terminal de la cadena HN)
Preparación de inserto conector-nociceptina-espaciador
[0264] El conector LC-HN puede diseñarse a partir del primer principio, usando la información de secuencias existente para el conector como plantilla. Por ejemplo, el conector del serotipo A (en este caso definido como la región polipeptídica inter-dominio que existe entre las cisteínas del puente de disulfuro entre LC y HN) tiene 23 aminoácidos de longitud y presenta la secuencia VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL. Dentro de esta secuencia, se entiende que la activación proteolítica en la naturaleza conduce a un dominio HN que tiene un extremo N de la secuencia ALNDL. Esta información de secuencias está disponible libremente en fuentes de bases de datos disponibles como GenBank (número de acceso P10845) o Swissprot (locus de acceso BXA1_CLOBO). En este conector se incorpora un sitio de Factor Xa, nociceptina y separador; y usando una entre una variedad de herramientas de software de traducción inversa [por ejemplo, EdftSeq que es la mejor para traducción inversa de E. coli (DNASTAR Inc.), o la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)], se determina la secuencia de ADN que codifica la región conector-ligando-separador. A continuación se incorporan los sitios de restricción en la secuencia de ADN y pueden disponerse como BamHI-SalI-conector-sitio de proteasa-nociceptina-NheI-separador SpeIPstIXbaI-codón de parada-HindIII (SEQ ID33). Es importante asegurar que se mantiene el marco de lectura para separador, nociceptina y secuencias de restricción y que la secuencia Xbal no está precedida por las bases, TC, que darían como resultado una metilación DAM. La secuencia de ADN se criba para incorporación de secuencias de restricción, y toda secuencia adicional se elimina manualmente de la secuencia residual que asegura que se mantenga el uso de codón de E. coli común. El uso de codón de E. coli se valora con referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y la proporción entre contenido de %GC y uso de codones se valora con referencia a las tablas publicadas de uso de codones (por ejemplo, GenBank edición 143, 13 de septiembre de 2004). A continuación se sintetiza comercialmente esta secuencia de ADN optimizada (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Preparación de la fusión LC/A-nociceptina-HN/A
[0265] Para crear la construcción LC-conector-nociceptina-separador-HN (SEQ ID39), el vector pCR 4 que codifica el conector (SEQ ID33) se segmenta con enzimas de restricción BamHI + SalI. Este vector segmentado sirve a continuación como el vector de recepción para inserción y ligamiento del ADN LC/A (SEQ ID27) segmentado con BamHI + SalI. A continuación se segmenta el ADN de plásmido resultante con enzimas de restricción PstI + XbaI y sirve como vector de recepción para la inserción y ligamiento del HN/A ADN (SEQ ID28) segmentado con PstI
+ XbaI. La construcción final contiene el ORF de LC-conector-nociceptina-separador-HN (SEQ ID39) para transferencia en vectores de expresión para expresión con el resultado de una proteína de fusión de la secuencia ilustrada en SEQ ID40.
Ejemplo 20 -Preparación de una proteína de fusión nociceptina-LC/A-HN/A (la nociceptina es N-terminal de la cadena LC)
[0266] El esqueleto LC/A-HN/A se construye según se describe en el Ejemplo 19 usando el conector de serotipo A sintetizado con la adición de un sitio de Factor Xa para activación, configurado como BamHI-SalIconector-sitio de proteasa-conector-Pstl-Xbal-codón de parada-HindIII (SEQ ID34). El esqueleto LC/A-HN/A y el inserto de nociceptina de presentación N-terminal sintetizado (SEQ ID35) son segmentados con enzimas de restricción BamHI + HindIII, gel purificado y ligado conjuntamente para crear nociceptina-separador-LC-conector-HN. A continuación se corta el ORF (SEQ ID41) usando enzimas de restricción AvaI + XbaI para transferencia en vectores de expresión para expresión con el resultado de una proteína de fusión de la secuencia ilustrada en SEQ ID42.
Ejemplo 21-Preparación de una proteína de fusión LC/C-nociceptina-HN/C
[0267] Según los procedimientos usados en los Ejemplos 1 y 2, LC/C (SEQ ID39) y HN/C (SEQ ID32) se crean y se insertan en el conector de serotipo C dispuesto como BamHI-SalI-conector-sitio de proteasa-nociceptinaNhel-separador-Spel-Pstl-Xbal-codón de parada-HindIII (SEQ ID36). La construcción final contiene ORF de LCconector-nociceptina-separador-HN (SEQ ID43) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID44.
Ejemplo 22 -Preparación de una proteína de fusión LC/C-nociceptina-HN/C con una secuencia de activación de serotipo A
[0268] Según los procedimientos usados en los Ejemplos 1 y 2, LC/C (SEQ ID31) y HN/C (SEQ ID32) se crean y se insertan en el conector de serotipo A dispuesto como BamHI-SalI-conector-sitio de proteasa-nociceptinaNheI-separador-SpeI-PstI-XbaI-codón de parada-HindIII (SEQ ID33). La construcción final contiene el ORF de LCconector-nociceptina-separador-HN (SEQ ID45) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID46.
Ejemplo 23 -Preparación de una proteína de fusión LC/A-met encefalina-HN/A
[0269] Debido al pequeño tamaño, de cinco aminoácidos, del ligando met-encefalina se crea la fusión LC/Amet encefalina-HN/A por mutagenia dirigida al sitio [por ejemplo, usando Quickchange (Stratagene Inc.)] usando la fusión LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID39) como plantilla. Se diseñan oligonucleótidos que codifican el péptido YGGFM met-encefalina, asegurando que se mantiene el uso de codón de E. coli estándar y no se incorporan sitios de restricción adicionales, flanqueados por secuencias favorables para la región de conector de la fusión LC/Anociceptina-HN/A (SEQ ID39) a ambos lados de la sección de nociceptina. El producto SDM se verifica por secuenciación y la construcción final que contiene el ORF de LC-conector-met encefalina-separador-HN (SEQ ID47) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID48.
Ejemplo 24 -Preparación de una proteína de fusión LC/A-1 endorfina-HN/A
[0270] Según los procedimientos usados en los Ejemplos 1 y 2, LC/A (SEQ ID27) y HN/A (SEQ ID28) se crean y se insertan en el conector de serotipo A 1 endorfina dispuesto como BamHI-SalI-conector-sitio de proteasa-1 endorfina-NheI-separador-SpeI-PstI-XbaI-codón de parada-HindIII (SEQ ID37). La construcción final contiene el ORF de LC-conector-1 endorfina-separador-HN (SEQ ID49) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID50.
Ejemplo 25 -Preparación de una proteína de fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A
[0271] Según los procedimientos usados en los Ejemplos 1 y 2, LC/A (SEQ ID27) y HN/A (SEQ ID28) se crean y se insertan en el conector de variante de nociceptina de serotipo A dispuesto como BamHI-SalI-conectorsitio de proteasa-variante de nociceptina-NheI-separador-SpeI-PstI-XbaI-codón de parada-HindIII (SEQ ID38). La construcción final contiene el ORF de LC-conector-variante de nociceptina-separador-HN (SEQ ID51) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID52.
Ejemplo 26 – Procedimiento de purificación para una proteína de fusión LC/A-nociceptina-HN/A
[0272] Se descongela un tubo Falcon que contiene 25 ml de Hepes 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM y aproximadamente 10 g de pasta celular de E. coli BL21. Se completa la pasta celular descongelada hasta 80 ml con Hepes 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM y se somete a sonicación en hielo con activación durante 30 segundos y desactivación durante 30 segundos durante 10 ciclos a una potencia de 22 micrómetros asegurando que la muestra se mantiene fría. Se hacen girar las células lisadas a 18.000 rpm, 4 °C durante 30 minutos. Se carga el sobrenadante en una columna de quelación cargada con NiSO4 0,1 M (son suficientes 20 – 30 ml de columna) equilibrada con Hepes 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM. Usando un gradiente escalonado de imidazol 10 y 40 mM, se elimina por lavado la proteína ligada inespecífica y se eluye la proteína de fusión con imidazol 100 mM. Se dializa la proteína de fusión eluida frente a 5 L de Hepes 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM a 4 °C durante toda la noche y se mide la DO de la proteína de fusión dializada. Se añade 1 unidad de factor Xa por 100 !g de proteína de fusión y se incuba a 25 °C estática durante toda la noche. Se carga en una columna de quelación cargada con NiSO4 0,1 M (son suficientes 20-30 ml de columna) equilibrado con Hepes 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM. Se lava la columna hasta la línea de base con Hepes 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM. Usando un gradiente escalonado de imidazol 10 y 40 mM, se elimina por lavado la proteína ligada inespecífica y se eluye la proteína de fusión con imidazol 100 mM. Se dializa la proteína de fusión eluida frente a 5 L de Hepes 50 mM pH 7,2, NaCl 200 mM a 4 °C durante toda la noche y se concentra la fusión a aproximadamente 2 mg/ml, se distribuye la muestra en partes alícuotas y se congela a -20 °C. Se somete a prueba la proteína purificada usando valoraciones de DO, BCA, análisis de pureza y SNAP-25.
Ejemplo 27 -Preparación de una proteína de fusión LC/A-nociceptina-HN/A (la nociceptina es N-terminal de la cadena HN)
[0273] Se prepara el inserto conector-nociceptina-espaciador según se describe en el Ejemplo 19.
Preparación de la fusión LC/A-nociceptina-HN/A
[0274] Para crear la construcción LC-conector-nociceptina-separador-HN (SEQ ID39), el vector pCR 4 que codifica el conector (SEQ ID33) se segmenta con enzimas de restricción BamHI + SalI. A continuación este vector segmentado sirve como receptor para inserción y ligamiento del ADN de LC/A (SEQ ID27) también segmentado con BamHI + SalI. A continuación se segmenta el ADN de plásmido resultante con enzimas de restricción BamHI + HindIII y el fragmento de conector LC/A en un vector segmentado análogamente que contiene un sitio de clonación múltiple único para BamHI, SalI, PstI e HindIII como el vector pMAL (NEB). A continuación se segmenta ADN de HN/A (SEQ ID28) con enzimas de restricción PstI + HindIII y se inserta en la construcción pMAL-LC/A-conector segmentada análogamente. La construcción final contiene el ORF de LC-conector-nociceptina-separador-HN (SEQ ID39) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID40.
Ejemplo 28 -Preparación de una proteína de fusión nociceptina-LC/A-HN/A (nociceptina es N-terminal de la cadena LC)
[0275] Para crear la construcción nociceptina-separador-LC/A-HN/A, se sintetiza un conector de serotipo A con la adición de un sitio de Factor Xa para activación, dispuesto como BamHI-SalI-conector-sitio de proteasaconector-PstI-XbaI-codón de parada-HindIII (SEQ ID34) según se describe en el Ejemplo 27. Se segmenta el vector pCR 4 que codifica el conector con enzimas de restricción BamHI + SalI. A continuación este vector segmentado sirve como receptor para inserción y ligamiento del ADN de LC/A (SEQ ID27) también segmentado con BamHI + SalI. A continuación se segmenta el ADN de plásmido resultante con enzimas de restricción BamHI + HindIII y el fragmento de conector LC/A en un vector segmentado análogamente que contiene el inserto de nociceptina de presentación N-terminal sintetizado (SEQ ID35). A continuación se segmenta esta construcción con AvaI + HindIII y se inserta en un vector de expresión como el plásmido pMAL (NEB). A continuación se segmenta el ADN de HN/A (SEQ ID28) con enzimas de restricción PstI + HindIII y se inserta en la construcción pMAL-nociceptina-LC/Aconector segmentada análogamente. La construcción final contiene el ORF de nociceptina-separador-LC/A-HN/A (SEQ ID63) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID64.
Ejemplo 29 -Preparación y purificación de una familia de proteínas de fusión LC/A-nociceptina-HN/A con longitud de separador variable
[0276] Usando la misma estrategia empleada en el Ejemplo 19, se preparó una variedad de conectores de ADN que codificaban nociceptina y contenido de separador variable. Usando una entre una variedad de herramientas de software de traducción inversa [por ejemplo, EditSeq que es la mejor para traducción inversa de E. coli (DNASTAR Inc.), o la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)], se determina la secuencia de ADN que codifica la región de conector-ligando-separador. A continuación se incorporan sitios de restricción en la secuencia de ADN y pueden disponerse como BamHI-SalI-conector-sitio de proteasa-nociceptina-NheI-separador-SpeI-PstIXbaI-codón de parada-HindIII (SEQ ID65 a SEQ ID69). Es importante asegurar que se mantiene el marco de lectura correcto para el separador, la nociceptina y las secuencias de restricción y que la secuencia Xbal no está precedida por las bases, TC que darían como resultado metilación DAM. Se criba la secuencia de ADN para incorporación de secuencias de restricción y cualquier secuencia adicional se elimina manualmente de la secuencia restante asegurando que se mantiene el uso de codón de E. coli común. El uso de codón de E. coli se valora con referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y la proporción entre contenido de %GC y uso de codones se valora con referencia a las tablas publicadas de uso de codones (por ejemplo, GenBank edición 143, 13 de septiembre de 2004). A continuación se sintetiza comercialmente esta secuencia de ADN optimizada (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
[0277] Las separadores que se crearon incluían:
Tabla 2
Código
Secuencia de proteínas del conector SEQ ID del ADN de conector
GS10
ALAGGGGSALVLQ 53
GS15
ALAGGGGSGGGGSALVLQ 54
GS25
ALAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVLQ 55
GS30
ALAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVLQ 56
HX27
ALAAEAAAKEAAAKEAAAKAGGGGSALVLQ 57
[0278] A modo de ejemplo, para crear la construcción de fusión LC/A-CPN(GS15)-HN/A (SEQ ID70), se
5 segmenta el vector pCR 4 que codifica el conector (SEQ ID66) con enzimas de restricción BamHI + SalI. A continuación este vector segmentado sirve como vector de recepción para inserción y ligamiento del ADN de LC/A (SEQ ID27) segmentado también con BamHI + SalI. A continuación se segmenta el ADN de plásmido resultante con enzimas de restricción BamHI + HindIII y el fragmento de conector LC/A en un vector segmentado análogamente que contiene un sitio de clonación múltiple único para BamHI, SalI, PstI e HindIII como el vector pMAL (NEB). A
10 continuación se segmenta el ADN de HN/A (SEQ ID28) con enzimas de restricción PstI + HindIII y se inserta en la construcción pMAL-LC/A-conector segmentada análogamente. La construcción final contiene el ORF de LC/A-CPN(GS15)-HN/A (SEQ ID70) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID71.
[0279] Como ejemplo adicional, para crear la construcción de fusión LC/A-CPN(GS25)-HN/A (SEQ ID72), el
15 vector pCR 4 que codifica el conector (SEQ ID67) se segmenta con enzimas de restricción BamHI + SalI. A continuación este vector segmentado sirve como vector de recepción para inserción y ligamiento del ADN de LC/A (SEQ ID27) segmentado con BamHI + SalI. A continuación se segmenta el ADN de plásmido resultante con enzimas de restricción BamHI + HindIII y el fragmento de conector LC/A en un vector segmentado análogamente que contiene un sitio de clonación múltiple único para BamHI, SalI, PstI e HindIII como el vector pMAL (NEB). A
20 continuación se segmenta el ADN de HN/A (SEQ ID28) con enzimas de restricción PstI + HindIII y se inserta en la construcción pMAL-LC/A-conector segmentada análogamente. La construcción final contiene el ORF de LC/A-CPN(GS25)-HN/A (SEQ ID72) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID73.
[0280] Análogamente se crean variantes de la fusión LC/A-CPN-HN/A consistentes en GS10, GS30 y HX27.
25 Usando la metodología de purificación descrita en el Ejemplo 26, se purifica la proteína de fusión a partir de pasta celular de E. coli. La fig. 12 ilustra el producto purificado obtenido en el caso de LC/A-CPN(GS10)-HN/A, LC/A-CPN(GS15)-HN/A, LC/A-CPN(GS25)-HN/A, LC/A-CPN(GS30)-HN/A y LC/A-CPN(HX27)-HN/A.
Ejemplo 30 -Valoración de eficacia in vitro de una fusión LC/A-nociceptina-HN/A
30 [0281] Se valoró la proteína de fusión preparada según los Ejemplos 2 y 9 en el modelo de célula neuronal eDRG.
[0282] Los ensayos para la inhibición de liberación de sustancia P y segmentación de SNAP-25 han sido
35 referidos anteriormente (Duggan y col., 2002, J. Biol. Chem., 277, 34846 – 34852). En resumen, se recogen neuronas de ganglios de la raíz dorsal a partir de ratas Sprague-Dawley fetales de 15 días de vida y se disocian células recogidas en placas de 24 pocillos recubiertos con Matrigel en una densidad de 1 x 106 células/pocillo. Un día después de puesta en placas las células son tratadas con citosina 1-D-arabinofuranosida 10 !M durante 48 h. Las células se mantienen en medio esencial mínimo de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal inactivado
40 por calor al 5 %, L-glutamina 5 mM, D-glucosa al 0,6 %, suplemento B27 al 2 % y 100 ng/ml de factor de crecimiento nervioso de ratón 2,5S. Los cultivos se mantienen durante 2 semanas a 37 °C en aire al 95 %/CO2 al 5 % antes de adición de materiales de prueba.
[0283] La liberación de sustancia P desde eDRG se valora mediante enzimoinmunoanálisis de adsorción. En
45 resumen, se lavan dos veces células eDRG con disolución de sal equilibrada con potasio bajo (BSS: KCI 5 mM, NaCl 137 mM, MgCl2 1,2 mM, glucosa 5 mM, KH2PO4 0,44 mM, Hepes 20 mM, pH 7,4, CaCl2 2 mM). Se obtienen muestras basales incubando cada pocillo durante 5 min con 1 ml de BSS bajo en potasio. Después de la extracción de este tampón, se estimula a las células para que se liberen por incubación con 1 ml de tampón alto en potasio (BSS como antes con modificación para incluir KCI 100 mM equilibrado isotónicamente con NaCl) durante 5 min. Se
50 extraen todas las muestras en tubos en hielo antes del ensayo de sustancia P. Se preparan lisados celulares totales por adición de 250 !l de ácido acético 2 M/ácido trifluoroacético al 0,1 % para lisar las células, evaporación centrífuga y resuspensión en 500 !l de tampón de ensayo. Se valoran las muestras diluidas en cuanto al contenido
de sustancia P. Se mide la inmunorreactividad de la sustancia P usando Kits de Inmunoensayo Enzimático de Sustancia P (Cayman Chemical Company o R&D Systems) según las instrucciones del fabricante. La sustancia P se expresa en pg/ml con respecto a una curva patrón de sustancia P ejecutada en paralelo.
[0284] Se realizaron análisis SDS-PAGE y de transferencia Western usando protocolos estándar (Novex). Se resolvieron proteínas SNAP-25 en un gel de poliacrilamida glicina/Tris al 12 % (Novex) y posteriormente se transfirió a membrana de nitrocelulosa. Se sondearon las membranas con un anticuerpo monoclonal (SMI-81) que reconoce SNAP-25 segmentada e intacta. Se visualizó la unión específica usando anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y un sistema de reacción quimioluminiscente. Se cuantificó la segmentación de SNAP-25 mediante densitometría de barrido (Molecular Dynamics Personal SI, software de análisis de datos ImageQuant). Se calculó la segmentación porcentual de SNAP-25 según la fórmula: (SNAP-25 segmentada/(SNAP-25 segmentada + intacta)) x
100.
[0285] Después de exposición de neuronas eDRG a una fusión LC/A-nociceptina-HN/A (denominada CPN-A), se observa la inhibición de liberación de sustancia P y la segmentación de SNAP-25 (fig. 13). Después de 24 h de exposición a la fusión, se consigue un 50 % de segmentación de SNAP-25 máxima mediante una concentración de fusión de 6,3 ± 2,5 nM.
[0286] También se valora el efecto de la fusión en puntos temporales definidos después de una exposición de 16 h de eDRG a CPN-A. La fig. 14 ilustra la duración de acción prolongada de la proteína de fusión CPN-A, en la que se sigue observando actividad mensurable 28 días después de la exposición.
Ejemplo 31 -Valoración de eficacia in vitro de una fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A
[0287] Se valoró la proteína de fusión preparada según los Ejemplos 8 y 9 en el modo de célula neuronal eDRG usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 30.
[0288] Después de la exposición de neuronas eDRG a una fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A (denominada CPNv-A), se observa la inhibición de liberación de sustancia P y la segmentación de SNAP-25. Después de una exposición de 24 h a la fusión, se alcanza el 50 % de segmentación de SNAP-25 máxima mediante una concentración de fusión de 1,4 ± 0,4 nM (fig. 15).
[0289] También se valora el efecto de la fusión en puntos temporales definidos después de una exposición de 16 h de eDRG a CPN-A. La fig. 16 ilustra la duración de acción prolongada de la proteína de fusión CPN-A, en la que se sigue observando actividad mensurable 24 días después de la exposición.
[0290] Se valora también la capacidad de unión de la proteína de fusión CPNv-A en comparación con la fusión CPN-A. La fig. 17 ilustra los resultados de un experimento de competición para determinar la eficacia de unión en el receptor ORL-1. Se demuestra que CPNv-A desplaza [3H]-nociceptina, con lo que se confirma que es posible el acceso al receptor con el ligando en el formato de presentación central.
Ejemplo 32 -Preparación de una proteína de fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A que es activada por tratamiento con enterocinasa
[0291] Según los procedimientos usados en los Ejemplos 1 y 2, se crean y se insertan LC/A (SEQ ID27) y HN/A (SEQ ID28) en el conector de variante de nociceptina de serotipo A dispuesto como BamHI-SalI-conector-sitio de proteasa enterocinasa-variante de nociceptina-NheI-separador-SpeI-PstI-XbaI-codón de parada-HindIII (SEQ ID74). La construcción final contiene las secuencias de ORF LC-conector-variante de nociceptina-separador-HN (SEQ ID75) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID76. La proteína de fusión se denomina CPNv(Ek)-A. La fig. 18 ilustra la purificación de CPNv(Ek)-A a partir de E. coli según los procedimientos usados en el Ejemplo 26 pero usando enterocinasa para activación a 0,00064 !g por 100 !g de proteína de fusión.
Ejemplo 33 -Valoración de eficacia in vitro de una fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A que ha sido activada por tratamiento con enterocinasa
[0292] El CPNv(Ek)-A preparado en el Ejemplo 32 se obtiene en una forma purificada y se aplica al modelo celular eDRG para valorar la segmentación de SNAP-25 (usando metodología del Ejemplo 30). La fig. 19 ilustra la segmentación de SNAP-25 después de una exposición de 24 h de eDRG a CPNv(Ek)-A. Se observa que la eficacia de la segmentación sea similar a la obtenida con el material segmentado de Factor Xa, según se registra en el Ejemplo 31.
Ejemplo 34 -Preparación de una proteína de fusión LC/C-variante de nociceptina-HN/C con un conector de activación de Factor Xa obtenido de serotipo A
[0293] Según los procedimientos usados en el Ejemplo 21, se crean y se insertan LC/C (SEQ ID31) y HN/C (SEQ ID32) en el conector de variante de nociceptina de serotipo A dispuesto como BamHI-SalI-conector-variante de nociceptina-NheI-separador-SpeI-PstI-XbaI-codón de parada-HindIII (SEQ ID77). La construcción final contiene las secuencias de ORF LC-conector-variante de nociceptina-separador-HN (SEQ ID78) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en la SEQ ID79. La proteína de fusión se denomina CPNv-C (act. A). La fig. 20 ilustra la purificación de CPNv-C (act. A) a partir de E. coli según los procedimientos usados en el Ejemplo 26.
Ejemplo 35 -Valoración de eficacia in vitro de una proteína de fusión LC/C-variante de nociceptina-HN/C
[0294] Según los procedimientos usados en el Ejemplo 26, se obtiene CPNv-C (act. A) preparado en el Ejemplo 34 en una forma purificada y se aplica al modelo celular eDRG para valorar la segmentación de SNAP-25 (usando metodología del Ejemplo 30). Después de una exposición de 24 h a la fusión, se obtiene el 50 % de segmentación máxima de sintaxina mediante una concentración de fusión de 3,1 ± 2,0 nM. La fig. 21 ilustra la segmentación de sintaxina después de una exposición de 24 h de eDRG a CPNv-C (act. A).
Ejemplo 36 -Valoración de la eficacia in vivo de una fusión LC/A-nociceptina-HN/A
[0295] Se evalúa la capacidad de una fusión LC/A-nociceptina-HN/A (CPN/A) para inhibir alodinia mecánica aguda inducida por capsaicina después de inyección intraplantar subcutánea en la pata trasera de una rata. Se evalúa en los animales de prueba la frecuencia de retirada de la pata (% FRP) como respuesta a una serie de estímulos de filamento de Von Frey de 10 g (10 estímulos x 3 pruebas) antes de la inscripción en el estudio, después de tratamiento subcutáneo con CPN/A pero antes de capsaicina, y después de prueba de provocación de capsaicina después de inyección de CPN/A (promedio de respuestas a 15’ y 30’). Se obtiene una prueba de provocación de capsaicina por inyección de 10 !L de una disolución al 0,3 %. Se preparan diluciones de la muestra en BSA/suero salino al 0,5 %. La fig. 22 ilustra la reversión de la alodinia mecánica que se consigue mediante pretratamiento de los animales con un intervalo de concentraciones de fusión LC/A-nociceptina-HN/A.
[0296] Se evalúa la capacidad de una fusión LC/A-nociceptina-HN/A (CPN/A) para inhibir alodinia mecánica (táctil) inducida por estreptozotocina (STZ) en ratas. La alodinia mecánica inducida por STZ en ratas se consigue por inyección de estreptozotocina (i.p. o i.v.) que lleva a la destrucción de células pancreáticas que conducen a la pérdida de producción de insulina, con estrés metabólico concomitante (hiperglucemia e hiperlipidemia). De este modo, STZ induce diabetes Tipo I. Además, el tratamiento con STZ conduce al desarrollo progresivo de neuropatía, que sirve como modelo de dolor crónico con hiperalgesia y alodinia que puede reflejar signos observados en seres humanos diabéticos (neuropatía diabética periférica).
[0297] Se trata a ratas Sprague-Dawley macho (250 – 300 g) con 65 mg/kg de STZ en tampón de citrato (I.V.) y se mide la glucosa y los lípidos en sangre semanalmente para definir la competencia del modelo. Se mide el Umbral de Retirada de la Pata (URP) como respuesta a una serie de estímulos de filamento de Von Frey durante un periodo de tiempo. Se dice que se establece alodinia cuando el URP en dos fechas de prueba consecutivas (separadas 1 semana) mide menos de 6 g en la balanza. En este punto, se aleatorizan las ratas en un grupo salino (control de eficacia negativo), un grupo de gabapentina (control de eficacia positivo) o un grupo de prueba (CPN/A). Los materiales de prueba (20 – 25 !l) se inyectan subcutáneamente como una inyección única (excepto gabapentina) y se mide el URP un día después de tratamiento y posteriormente de forma periódica durante un periodo de 2 semanas. La gabapentina (30 mg/kg i.p. @ 3 ml/kg volumen de inyección) se inyecta diariamente, 2 horas antes del inicio de la prueba de URP. La fig. 23 ilustra la reversión de la alodinia obtenida por pretratamiento de los animales con 750 ng de CPN/A. Los datos se obtuvieron durante un periodo de 2 semanas después de una única inyección de CPN/A.
Ejemplo 37 -Valoración de la eficacia in vivo de una fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A
[0298] Se evalúa la capacidad de una fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A (CPNv/A) para inhibir alodinia mecánica inducida por capsaicina después de inyección intraplantar subcutánea en la pata trasera de una rata. En los animales de prueba se evalúa la frecuencia de retirada de la pata ( %FRP) como respuesta a una serie de estímulos de filamento de Von Frey de 10 g (10 estímulos x 3 pruebas) antes de la inscripción en el estudio (Pretratamiento); después de tratamiento intraplantar subcutáneo con CPNv/A pero antes de capsaicina (Pre-CAP); y después de prueba de provocación de capsaicina post-inyección de CPNv/A (promedio de respuestas a 15’ y 30’; CAP). Se consigue prueba de provocación de capsaicina por inyección de 10 !L de una disolución al 0,3 %. Se preparan diluciones de muestras en BSA/suero salino al 0,5 %.
[0299] La fig. 24 ilustra la reversión de alodinia que se consigue por pretratamiento de los animales con un intervalo de concentraciones de fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A en comparación con la reversión conseguida con la adición de fusión LC/A-nociceptina-HN/A. Estos datos se expresan como un diferencial normalizado de la frecuencia de retirada de la pata, en el que la diferencia entre la respuesta pico (post-capsaicina) y la respuesta de línea de base (pre-capsaicina) se expresa como un porcentaje. Con este análisis, puede observarse que CPNv/A es más potente que CPN/A ya que se requiere una dosis menor de CPNv/A para conseguir un efecto analgésico similar al observado con CPN/A.
Ejemplo 38 -Preparación de una proteína de fusión LC/A-leu encefalina-HN/A
[0300] Debido al pequeño tamaño, de cinco aminoácidos, del ligando leu-encefalina se crea la fusión LC/Aleu encefalina-HN/A por mutagenia dirigida al sitio [por ejemplo, usando Quickchange (Stratagene Inc.)] usando la fusión LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID39) como plantilla. Se diseñan oligonucleótidos que codifican el péptido de leu-encefalina YGGFL, asegurando que se mantiene el uso de codón de E. coli estándar y que no se incorporan sitios de restricción adicionales, flanqueados por secuencias favorables a la región del conector de la fusión LC/Anociceptina-HN/A (SEQ ID39) a ambos lados en la sección de nociceptina. El producto de SDM se verifica por secuenciación y la construcción final contiene el ORF de LC-conector-leu encefalina-separador-HN (SEQ ID80) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID81. La proteína de fusión se denomina CPLEA. La fig. 25 ilustra la purificación de CPLE-A a partir de E. coli según los procedimientos usados en el Ejemplo 26.
Ejemplo 39 -Expresión y purificación de una proteína de fusión LC/A-beta-endorfina-HN/A
[0301] Según los procedimientos usados en el Ejemplo 26, y con la proteína de fusión LC/A-beta-endorfinaHN/A (denominada CPBE-A) creada en el Ejemplo 24, se purifica CPBE-A de E. coli. La fig. 26 ilustra la proteína purificada según se analiza por SDS-PAGE.
Ejemplo 40 -Preparación de una proteína de fusión LC/A-mutante de nociceptina-HN/A
[0302] Debido a la única modificación de aminoácidos necesaria para mutar la secuencia de nociceptina en la posición 1 desde Phe a Tyr, la fusión LC/A-mutante de nociceptina-HN/A se crea por mutagenia dirigida al sitio [por ejemplo, usando Quickchange (Stratagene Inc.)] usando la fusión LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID39) como plantilla. Se diseñan oligonucleótidos que codifican tirosina en la posición 1 de la secuencia de nociceptina, asegurando que se mantiene el uso de codón de E. coli estándar y no se incorporan sitios de restricción adicionales, flanqueados por secuencias favorables a la región del conector de la fusión LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID39) a ambos lados de la sección de nociceptina. Se verifica el producto SDM por secuenciación y la construcción final que contiene el ORF de fusión LC/A-mutante de nociceptina-separador-HN/A (SEQ ID82) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en la SEQ ID83. La proteína de fusión se denomina GPOP-A. La fig. 27 ilustra la purificación de CPOP-A a partir de E. coli según los procedimientos usados en el Ejemplo 26.
Ejemplo 41 -Preparación y valoración de una proteína de fusión LC/A-mutante de variante de nociceptinaHN/A
[0303] Debido a la única modificación de aminoácidos necesaria para mutar la secuencia de nociceptina en la posición 1 de Phe a Tyr, se crea la fusión LC/A-variante de mutante de nociceptina-HN/A por mutagenia dirigida al sitio [por ejemplo, usando Quickchange (Stratagene Inc.)] usando la fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A (SEQ ID51) como plantilla. Se diseñan oligonucleótidos que codifican la tirosina en la posición 1 de la secuencia de nociceptina, asegurando que se mantiene el uso de codón de E. coli estándar y no se incorporan sitios de restricción adicionales, flanqueados por secuencias favorables a la región del conector de la fusión LC/A-variante de nociceptina-HN/A (SEQ ID51) a ambos lados de la sección de nociceptina. Se verifica el producto SDM por secuenciación y la construcción final que contiene el ORF de fusión LC/A-mutante de nociceptina-separador-HN/A (SEQ ID84) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en la SEQ ID85. La proteína de fusión se denomina CPOPv-A. La fig. 28 ilustra la purificación de CPOPv-A a partir de E. coli según los procedimientos usados en el Ejemplo 26.
[0304] Usando la metodología descrita en el Ejemplo 30, se valora CPOPv-A en cuanto a su capacidad de segmentar SNAP-25 en el modelo celular eDRG. La fig. 29 ilustra que CPOPv-A es capaz de segmentar SNAP-25 en el modelo eDRG, consiguiendo segmentación del 50 % de la SNAP-25 máxima después de exposición de las células a aproximadamente 5,9 nM de fusión durante 24 h.
Ejemplo 42 -Preparación de una proteína de fusión IgA proteasa-variante de nociceptina-HN/A
[0305] Se obtuvo la secuencia de aminoácidos de IgA proteasa a partir de fuentes de bases de datos disponibles libremente como GenBank (número de acceso P09790). La información relativa a la estructura del gen de IgA proteasa de N. gonorrhoeae está disponible en la literatura especializada (Pohlner y col., Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease, Nature, 1987, 325(6103), 458 – 62). Usando la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon), se determinó la secuencia de ADN que codifica la IgA proteasa modificada para expresión de E. coli. Se incorporó una secuencia de reconocimiento BamHI en el extremo 5’ y un codón que codifica un aminoácido de cisteína y se incorporó una secuencia de reconocimiento SalI en el extremo 3’ del ADN de IgA. Se cribó la secuencia de ADN usando MapDraw, (DNASTAR Inc.) para secuencias de segmentación de enzimas de restricción incorporadas durante la traducción inversa. Todas las secuencias de segmentación que se encuentran comunes para las requeridas para clonación se eliminaron manualmente de la secuencia de codificación propuesta asegurando que se mantiene un uso de codón de E. coli común. Se valoró el uso de codón de E. coli usando Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y se valoró la proporción entre contenido de %GC y uso de codones con referencia a tablas de uso de codones publicadas. A continuación se sintetiza comercialmente esta secuencia de ADN optimizada (SEQ ID86) que contiene el marco de lectura abierto (ORF) de IgA.
[0306] Se inserta la IgA (SEQ ID86) en el ORF de LC-conector-variante de nociceptina-separador-HN (SEQ ID51) usando enzimas de restricción BamHI y SalI para sustituir LC por el ADN de IgA proteasa. La construcción final contiene el ORF de IgA-conector-nociceptina variante-separador HN (SEQ ID87) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en la SEQ ID88.
Ejemplo 43 -Preparación y valoración de una proteína de fusión de endopeptidasa dirigida a nociceptina con una marca de purificación de histidina extraíble
[0307] Se preparó ADN que codificaba una marca his de Factor Xa extraíble (his6), aunque está claro que también son posibles sitios alternativos de proteasas como enterocinasa y marcas de purificación alternativas como marcas de histidina más largas. Usando una entre una variedad de herramientas de software de traducción inversa [por ejemplo, EditSeq que es la mejor para traducción inversa de E. coli (DNASTAR Inc.), o la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)], se determina la secuencia de ADN que codifica la región de marca his de Factor Xa extraíble. A continuación se incorporan sitios de restricción en la secuencia de ADN y pueden disponerse como NheI-conector-SpeIPstI-HN/A-XbaI-LEIEGRSGHHHHHH-codón de parada-HindIII (SEQ ID89). Se criba la secuencia de ADN en cuanto a secuencia de restricción incorporada y se eliminan manualmente todas las secuencias adicionales de la secuencia restante asegurando que se mantiene el uso de codón de E. coli común. Se valora el uso de codón E. coli con referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y se valora la proporción entre contenido de %GC y uso de codones con referencia a las tablas publicadas de uso de codones (por ejemplo, GenBank edición 143, 13 de septiembre de 2004). A continuación se sintetiza comercialmente esta secuencia de ADN optimizada (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4. Para crear CPNv-A-FXa-HT (SEQ ID90, construcción de marca his extraíble) se segmenta el vector pCR 4 que codifica marca his extraíble con NheI e HindIII. A continuación se inserta el fragmento NheI-HindIII en el vector LC/A-CPNV-HN/A (SEQ ID51) que se ha segmentado también por NheI e HindIII. La construcción final contiene las secuencias de ORF LC/A-conector-variante de nociceptina-separador-HN-FXa-Histag-HindIII (SEQ ID90) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en la SEQ ID91. La fig. 30 Ilustra la purificación de CPNv-A-FXa-HT a partir de E. coli según los procedimientos usados en el Ejemplo 26.
Ejemplo 44 -Preparación de una proteína de fusión de endopeptidasa dirigida a leu-encefalina que contiene un dominio de translocación obtenido de toxina diftérica
[0308] La secuencia de ADN se diseña por traducción inversa de la secuencia de aminoácidos del dominio de translocación de la toxina diftérica (obtenido de fuentes de bases de datos disponibles libremente como GenBank (número de acceso 1XDTT) usando una entre una variedad de herramientas de software de traducción inversa [por ejemplo, EditSeq que es la mejor para traducción inversa de E. coli (DNASTAR Inc.), o la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)]. A continuación se incorporan sitios de restricción en la secuencia de ADN y pueden disponerse como Nhel-conector-Spel-Pstl-dominio de translocación de difteria-Xbal-codón de parada-HindIII (SEQ ID92). Las secuencias de reconocimiento PstI/XbaI se incorporan en los extremos 5’ y 3’ del dominio de translocación respectivamente de la secuencia manteniendo el marco de lectura correcto. La secuencia de ADN se criba (usando software como MapDraw, DNASTAR Inc.) para secuencias de segmentación de enzimas de restricción incorporadas durante la traducción inversa. Todas las secuencias de segmentación que se encuentran comunes para las requeridas por el sistema de clonación se eliminan manualmente a partir de la secuencia de codificación propuesta asegurando que se mantiene el uso de codón de E. coli común. El uso de codón de E. coli se valora con referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y la proporción entre contenido de %GC y uso de codones se valora con referencia a las tablas publicadas de uso de codones (por ejemplo, GenBank edición 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada que contiene el dominio de translocación de difteria se sintetiza a continuación comercialmente como Nhel-Conector-Spel-Pstldominio de translocación diftérico-Xbal-codón de parada-HindIII (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4 (Invitrogen). El vector pCR 4 que codifica el dominio de translocación de difteria se segmenta con Nhel y XbaI. A continuación se inserta el fragmento NheI-XbaI en el vector LC/A-CPLEHN/A (SEQ ID80) que también ha sido segmentado por NheI y XbaI. La construcción final contiene las secuencias de ORF de LC/A-leu-encefalina-separador-dominio de translocación de difteria (SEQ ID93) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID94.
Ejemplo 45 -Preparación de una proteína de fusión de endopeptidasa dirigida a variante de nociceptina que contiene un dominio LC obtenido de toxina tetánica
[0309] La secuencia de ADN se diseña por traducción inversa de la secuencia de aminoácidos de la toxina tetánica LC (obtenido de fuentes de bases de datos disponibles libremente como GenBank (número de acceso X04436) usando una entre una variedad de herramientas de software de traducción inversa [por ejemplo, EditSeq que es la mejor para traducción inversa de E. coli (DNASTAR Inc.), o la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)]. Las secuencias de reconocimiento de BamHI/SalI se incorporan en los extremos 5’ y 3’ respectivamente de la secuencia manteniendo el marco de lectura correcto (SEQ ID95). Se criba la secuencia de ADN (usando software como MapDraw, DNASTAR Inc.) para secuencias de segmentación de enzimas de restricción incorporadas durante la traducción inversa. Todas las secuencias de segmentación que se encuentran comunes para las requeridas por el sistema de clonación son eliminadas manualmente a partir de la secuencia de codificación propuesta asegurando que se mantiene el uso de codón de E. coli común. El uso de codón de E. coli se valora con referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y la proporción entre contenido de %GC y uso de codones se valora con referencia a las tablas publicadas de uso de codones (por ejemplo, GenBank edición 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada que contiene el marco de lectura abierto (ORF) de toxina tetánica LC se sintetiza a continuación comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4 (invitrogen). El vector pCR 4 que codifica TeNT LC se segmenta con BamHI y SalI. A continuación se inserta el fragmento BamHI-SalI en el vector LC/ACPNv-HN/A (SEQ ID51) que también se ha segmentado por BamHI y SalI. La construcción final contiene las secuencias ORF de TeNT LC-conector-variante de nociceptina-separador-HN (SEQ ID96) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID97.
Ejemplo 46 -Preparación de una proteína de fusión LC/C-variante de nociceptina-HN/C con un conector de serotipo C nativo que es susceptible de segmentación de Factor Xa
[0310] Según los procedimientos usados en el Ejemplo 21, LC/C (SEQ ID31) y HN/C (SEQ ID32) se crean y se insertan en la variante de serotipo C de conector de nociceptina dispuesta como BamHI-SalI-conector-variante de nociceptina-NheI-separador-SpeI-PstI-Xbal-codón de parada-HindIII (SEQ ID98). La construcción final contiene las secuencias de ORF LC-conector-variante de nociceptina-separador-HN (SEQ ID99) para expresión como una proteína de la secuencia ilustrada en SEQ ID100. La proteína de fusión se denomina CPNv-C (act. C).
LISTADO DE SECUENCIAS
[0311]
< 110 > Health Protection Agency Allergan, Inc. Chaddock, John Foster, Keith Penn, Charles
Aoki, K Roger Francis, Joseph Steward, Lance
5 < 120 > Conjugados de toxina redirigidos
<
130 > P27211WO/MRM
<
150 > GB0426394.3
<
151 > 2004-12-01
<
160 > 100
<
170 > PatentIn versión 3.3
< 210 > 1 15 < 211 > 51
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
400 > 1 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat tagctaacca g 51
25 < 210 > 2
<
211 > 17
<
212 > PRT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
211 > 33
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
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45 < 400 > 3 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcg 33
<
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<
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<
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<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
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<
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<
211 > 33
<
212 > ADN
<
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<
220 >
<
223 > Sintético
<
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<
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<
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<
212 > PRT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
400 > 6
<
210 > 7
<
211 > 33
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
400 > 7 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca tat 33
<
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<
211 > 11
<
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<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
400 > 8
<
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<
211 > 51
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 5
< 400 > 9 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat atgctaacca g 51
<
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<
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<
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<
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20 25
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30
< 400 > 11 39 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaa 39
35
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< 220 > < 223 > sintético
40
< 400 > 12
<
210 > 13
<
211 > 51
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
400 > 13
tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaac gcaaaaacca g 51 5
<
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<
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<
212 > PRT
<
213 > Secuencia artificial 10
<
220 >
<
223 > Sintético
<
211 > 2736 20 < 212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
213 > Secuencia artificial
<
220 > 10 < 223 > Sintético
< 400 > 16
<
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<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 10
<
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<
220 >
<
220 >
<
223 > Sintético 10
<
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<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
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<
400 > 21
<
211 > 897
<
212 > PRT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
400 > 22
<
220 >
<
223 > Sintético 10
<
400 > 24
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 10
<
400 > 25
<
220 >
<
210 > 30
<
211 > 1260
<
212 > ADN 5 < 213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
211 > 207
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
211 > 108
<
212 > ADN 15 < 213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
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<
220 >
<
223 > Sintético 25
<
212 > PRT
<
211 > 899 5 < 212 > PRT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
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<
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<
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<
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<
223 > Sintético 10
<
400 > 19
<
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<
213 > Secuencia artificial
<
211 > 2691 5 < 212 > ADN,
<
211 > 2676 5 < 212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
223 > Sintético 10
<
400 > 23
<
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<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
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< 211 > 904
< 212 > PRT
< 213 > Secuencia artificial
5
< 220 >
< 223 > Sintético
< 400 > 26
10
<
211 > 1302
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
223 > Sintético
5
< 210 > 28
< 211 > 1257
< 212 > ADN
< 213 > Secuencia artificial
10
<
220 >
<
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<
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<
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<
212 > ADN
<
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<
220 >
<
223 > Sintético
10 < 400 > 30
<
211 > 1329 5 < 212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
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<
210 > 32
<
211 > 1263
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
210 > 33
<
210 > 34
20 < 400 > 34
<
210 > 35 25 < 211 > 186
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 > 30 < 223 > Sintético
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 25
35
< 210 > 36
< 211 > 180
< 212 > ADN
< 213 > Secuencia artificial
40
< 220 >
< 223 > Sintético
5
< 210 > 37
< 211 > 249
< 212 > ADN
< 213 > Secuencia artificial
10
< 220 >
< 223 > Sintético
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15
<
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30 < 210 > 39
<
211 > 2709
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
35 < 220 >
<
223 > sintético
<
400 > 39
<
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<
220 >
<
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<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
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<
211 > 2736 5 < 212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
223 > Sintético 10
<
400 > 41
<
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<
211 > 911 5 < 212 > PRT
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<
220 >
<
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<
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<
211 > 2715
<
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<
220 >
<
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<
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<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
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<
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<
220 >
<
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<
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<
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<
223 > Sintético
<
400 > 48
<
220 >
<
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<
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<
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<
220 >
<
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<
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<
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<
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<
220 >
<
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<
213 > Secuencia artificial
<
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<
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<
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<
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<
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<
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<
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<
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<
211 > 896
<
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<
220 >
<
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<
220 >
<
223 > Sintético
<
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<
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<
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<
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<
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<
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<
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<
220 >
<
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<
213 > Secuencia artificial
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<
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<
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<
220 >
<
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<
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220 >
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<
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<
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212 > ADN
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213 > Secuencia artificial
<
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<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 10
<
211 > 2709 5 < 212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
10 < 400 > 60
<
211 > 2697
<
212 > ADN
<
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<
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<
220 >
<
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<
211 > 2736 5 < 212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
10 < 400 > 65
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 > 20 < 223 > Sintético
<
211 > 237
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 30
<
400 > 70
<
210 > 71
<
211 > 897 5 < 212 > PRT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
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<
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<
210 > 72
<
211 > 2724
<
212 > ADN 5 < 213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
400 > 75
<
400 > 76
25
< 210 > 67
< 211 > 222
< 212 > ADN
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30
< 220 >
< 223 > Sintético
< 400 > 67
35
10
< 210 > 69
< 211 > 228
< 212 > ADN
< 213 > Secuencia artificial
15
< 220 >
< 223 > Sintético
< 400 > 69
20
<
211 > 2694 25 < 212 > ADN
10 < 400 > 72
<
211 > 907 5 < 212 > PRT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 10
<
400 > 73
<
211 > 207 5 < 212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 10
<
210 > 75
<
211 > 2709
<
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<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 10
<
211 > 207 5 < 212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 10
15 < 210 > 78
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211 > 2742
<
212 > ADN
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213 > Secuencia artificial
20 < 220 >
<
223 > Sintético
<
400 > 78
<
220 >
<
211 > 913 5 < 212 > PRT
<
213 > Secuencia artificial
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223 > Sintético 10
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400 > 79
<
220 >
<
223 > Sintético 10
<
400 > 80
<
210 > 81
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211 > 890
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212 > PRT 5 < 213 > Secuencia artificial
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220 >
<
223 > Sintético
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220 >
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223 > Sintético
<
400 > 82
<
400 > 83
<
220 >
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223 > Sintético 10
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400 > 84
<
210 > 85
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211 > 902 5 < 212 > PRT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
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223 > Sintético 10
<
400 > 85
<
210 > 86
<
211 > 2889
<
212 > ADN 5 < 213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
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220 >
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223 > Sintético 10
<
400 > 88
<
220 >
<
400 > 89
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210 > 91
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211 > 914 5 < 212 > PRT
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213 > Secuencia artificial
<
220 >
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223 > Sintético 10
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400 > 91
<
210 > 92
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211 > 619
<
212 > ADN 5 < 213 > Secuencia artificial
<
211 > 2673 5 < 212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
10 < 400 > 81
<
211 > 2709
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
211 > 902 5 < 212 > PRT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 10
<
211 > 2709 5 < 212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
10 < 400 > 86
<
211 > 4296 5 < 212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 10
<
400 > 87
<
211 > 1431 5 < 212 > PRT
<
213 > Secuencia artificial
<
211 > 1357 5 < 212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
223 > Sintético 10
<
211 > 2745
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
220 >
10 < 400 > 92
<
210 > 93 15 < 211 > 1971
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 > 20 < 223 > Sintético
<
400 > 93
<
223 > Sintético
<
400 > 94
<
220 >
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 10
< 400 > 97
<
211 > 180 5 < 212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 10
<
211 > 656
<
212 > PRT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
211 > 1329 5 < 212 > ADN,
<
213 > Secuencia artificial
<
223 > Sintético 10
<
400 > 95
<
211 > 2736
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético
<
211 > 911 5 < 212 > PRT
15 < 210 > 99
<
211 > 2715
<
212 > ADN
<
213 > Secuencia artificial
20 < 220 >
<
223 > Sintético
<
400 > 99
<
210 > 100
<
211 > 904 5 < 212 > PRT
<
213 > Secuencia artificial
<
220 >
<
223 > Sintético 10
< 400 > 100

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un conjugado de proteína no citotóxica para la inhibición o reducción de fusión exocítica en una célula aferente sensorial nociceptiva, que comprende:
    (i)
    una Fracción de direccionamiento (TM) de dinorfina,
    en el que dicha TM de dinorfina es un agonista de un receptor presente en dicha célula aferente sensorial nociceptiva, y en el que dicho receptor experimenta una endocitosis que se incorporará en un endosoma en el interior de la célula aferente sensorial nociceptiva;
    (ii)
    una proteasa no citotóxica o un fragmento de la misma,
    en que la proteasa o el fragmento de proteasa es capaz de segmentar una proteína del aparato de fusión exocítica de dicha célula aferente sensorial nociceptiva; y
    (iii) un Dominio de translocación,
    en que el Dominio de translocación transloca la proteasa o el fragmento de proteasa desde el interior del endosoma, a través de la membrana endosómica, y en el citosol de la célula aferente sensorial nociceptiva.
  2. 2.
    El conjugado no citotóxico según la reivindicación 1, en el que el receptor es un receptor ORL1.
  3. 3.
    El conjugado no citotóxico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la TM comprende un máximo de 40 o un máximo de 30 o un máximo de 20 restos de aminoácidos.
  4. 4.
    El conjugado no citotóxico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteasa no citotóxica es una proteína bacteriana, o un fragmento de la misma, capaz de segmentar una proteína del aparato de fusión exocítica de la célula aferente sensorial nociceptiva; preferentemente en el que la proteasa no citotóxica se selecciona entre una neurotoxina clostridial, una IgA proteasa.
  5. 5.
    El conjugado no citotóxico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el Dominio de translocación se obtiene de una fuente clostridial; preferentemente en el que el Dominio de translocación es un dominio HN botulínico.
  6. 6.
    El conjugado no citotóxico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula aferente sensorial nociceptiva es una célula aferente sensorial nociceptiva primaria.
  7. 7.
    Una composición farmacéutica, que comprende un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y un soporte farmacéuticamente aceptable.
  8. 8.
    Una construcción de ADN que codifica el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  9. 9.
    Un procedimiento de preparación del conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende la expresión de la construcción de ADN según la reivindicación 8 en una célula hospedadora.
  10. 10.
    Uso de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una composición según la reivindicación 7, para la fabricación de un medicamento para tratar el dolor.
  11. 11.
    Un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una composición según la reivindicación 7, para su uso en el tratamiento del dolor.
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