JP5174463B2 - 融合タンパク質 - Google Patents

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Description

本発明は、非細胞傷害性融合タンパク質および鎮痛分子としてのその治療的適用に関する。
一般に、毒素は、標的細胞に対して有する効果のタイプに従って２つの群に分けられ得る。より詳細には、第一の毒素群は、それらの天然の標的細胞を殺傷し、このため、細胞傷害性毒素分子として知られる。この毒素群は、とりわけ、植物毒素（例えば、リシンおよびアブリン）および細菌毒素（例えば、ジフテリア毒素およびシュードモナス外毒素Ａ）によって例示される。細胞傷害性毒素は、細胞性障害および状態（例えば、癌）の治療のために「魔法の弾丸」（例えば、免疫結合体；これは、細胞傷害性毒素構成部分と標的細胞上の特異的マーカーに結合する抗体とを含む）の設計に多くの関心をひきつけている。細胞傷害性毒素は、代表的には、タンパク質合成の細胞プロセスを阻害することにより、それらの標的細胞を殺傷する。
第二の毒素群は、非細胞傷害性毒素として知られ、（これらの名称が証明するとおり）それらの天然の標的細胞を殺傷しない。非細胞傷害性毒素は、それらの細胞傷害性のものほどには商業上の関心をひきつけず、そしてタンパク質合成以外の細胞プロセスを阻害することにより、標的細胞に対してそれらの効果を発揮する。非細胞傷害性毒素は、種々の植物および種々の微生物（例えば、Clostridium sp.およびNeisseria sp.）から生成される。
クロストリジウム神経毒素は、代表的には150kDaの程度の分子量を有するタンパク質である。それらは、種々の細菌種、特に、クロストリジウム属の細菌、最も重要にはC. tetaniおよびC. botulinumの数株、C. butyricum、およびC. argentinenseによって生成される。現在、クロストリジウム神経毒素の８つの異なるクラスが存在し（すなわち、破傷風菌毒素およびボツリヌス菌神経毒素（その血清型Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ））、そしてそれらは全て、類似の構造および作用様式を共有する。
クロストリジウム神経毒素は、非細胞傷害性毒素分子の主要な群を代表し、そして単一ポリペプチドとして宿主細菌によって合成され、この単一ポリペプチドは、タンパク質分解切断事象によって翻訳後修飾されて、ジスルフィド結合によって互いに結合された２つのポリペプチド鎖を形成する。これらの２つの鎖は、重鎖（Ｈ鎖）（これは、約100kDaの分子量を有する）および軽鎖（Ｌ鎖）（これは、約50kDaの分子量を有する）と称される。
Ｌ鎖は、プロテアーゼ機能（亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性）を有し、そしてエキソサイトーシスプロセスに関与する小胞および／または原形質膜会合タンパク質に対する高い基質特異性を示す。異なるクロストリジウム種または血清型に由来するＬ鎖は、３つの基質タンパク質（すなわち、シナプトブレビン、シンタキシン、またはＳＮＡＰ−２５）の１つにおいて、異なるが特定のペプチド結合を加水分解し得る。これらの基質は、神経分泌機構の重要な構成部分である。
Neisseria sp.（N. gonorrhoeaeの種の中から最も重要である）は、機能的に類似する非細胞傷害性プロテアーゼを生産する。このようなプロテアーゼの一例は、ＩｇＡプロテアーゼである（ＷＯ９９／５８５７１を参照のこと）。
毒素分子が、その毒素の天然の標的細胞ではない細胞にリターゲティングされ得ることが当該分野において十分に書き記されている。そのようにリターゲティングされたとき、改変毒素は、所望の標的細胞に結合し得、そしてそれに続くサイトゾルへのトランスロケーション後、標的細胞にその効果を発揮し得る。該リターゲティングは、毒素の天然のターゲティング部分（ＴＭ）を異なるＴＭと置き換えることによって達成される。これに関して、ＴＭは、それが所望の標的細胞に結合し、そして標的細胞内のエンドソームへの改変毒素の引き続く通過を可能にするように選択される。改変毒素はまた、非細胞傷害性プロテアーゼの細胞サイトゾルへの侵入を可能にするトランスロケーションドメインを含む。このトランスロケーションドメインは、毒素の天然のトランスロケーションドメインであり得るか、またはトランスロケーション活性を有する微生物タンパク質から得られる別のトランスロケーションドメインであり得る。
例えば、ＷＯ９４／２１３００は、改変クロストリジウム神経毒素分子を記載しており、この分子は、標的細胞の細胞表面に存在する膜貫通タンパク質（ＩＭＰ）密度を調節し得る。したがって、この改変神経毒素分子は、標的細胞の細胞活性（例えば、グルコース取り込み）を制御し得る。ＷＯ９６／３３２７３およびＷＯ９９／１７８０６は、末梢感覚求心性神経をターゲティングする改変クロストリジウム神経毒素分子を記載している。したがって、この改変神経毒素分子は、鎮痛効果を示し得る。ＷＯ００／１０５９８は、粘液過分泌細胞（または該粘液過分泌細胞を制御する神経細胞）をターゲティングする改変クロストリジウム神経毒素分子の調製を記載している。この改変神経毒素は、該細胞からの過分泌を阻害し得る。ＷＯ０１／２１２１３は、広範な異なるタイプの非神経細胞標的細胞をターゲティングする改変クロストリジウム神経毒素分子を記載している。したがって、この改変分子は、標的細胞からの分泌を妨害し得る。リターゲティングされる毒素分子の技術分野におけるさらなる刊行物としては、以下が挙げられる：ＷＯ００／６２８１４；ＷＯ００／０４９２６；ＵＳ５，７７３，５８６；ＷＯ９３／１５７６６；ＷＯ００／６１１９２；およびＷＯ９９／５８５７１。
上記ＴＭ置換は、当業者に周知の従来の化学的結合体化技術によって行われ得る。これに関して、Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, およびWong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Pressに言及されている。
しかし、化学的結合体化は、しばしば不正確である。例えば、結合体化によって、ＴＭは、１つより多くの付着部位でその結合体の残りの部分に結合され得る。
また、化学的結合体化は制御するのが困難である。例えば、ＴＭは、プロテアーゼ構成部分および／またはトランスロケーション構成部分上の付着部位で改変毒素の残りの部分に結合され得る。これは、該構成部分の一方のみへの（好ましくは単一の部位での）付着が治療効力のために望まれる場合、問題となる。
したがって、化学的結合体化は、改変毒素分子の混合集団を生じ、これは望ましくない。
化学的結合体化の代替として、単一ポリペプチド融合タンパク質の組換え調製によってＴＭ置換が行われ得る（ＷＯ９８／０７８６４を参照のこと）。この技術は、天然型クロストリジウム神経毒素（すなわち、ホロ毒素）が調製されるインビボの細菌機構に基づいており、そして以下の構造配置を有する融合タンパク質を生じる：
ＮＨ２−［プロテアーゼ構成部分］−［トランスロケーション構成部分］−［ＴＭ］−ＣＯＯＨ
ＷＯ９８／０７８６４によれば、ＴＭは、融合タンパク質のＣ末端の方に配置される。次いで、この融合タンパク質がプロテアーゼでの処理によって活性化される。このプロテアーゼは、プロテアーゼ構成部分とトランスロケーション構成部分との間の部位で切断する。したがって、二本鎖のタンパク質が生成される。この二本鎖タンパク質は、ＴＭを加えたトランスロケーション構成部分を含む別のポリペプチド単鎖に（ジスルフィド架橋を介して）共有結合されたポリペプチド単鎖としてプロテアーゼ構成部分を含む。ＷＯ９８／０７８６４の方法は、（融合タンパク質の構造配置の点で）クロストリジウムホロ毒素の天然発現系に従うが、本発明者らは、この系が、意図した標的細胞に対する結合能が実質的に減少されたある種の融合タンパク質の生成を生じ得ることを見出した。
したがって、非細胞傷害性融合タンパク質の構築系を別に見出すか、または改善する必要がある。
本発明は、以下を含む単鎖ポリペプチド融合タンパク質を提供することによって、上記の問題点の１つ以上を解消している。単鎖ポリペプチド融合タンパク質は、
ａ．非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントであって、侵害受容感覚求心性神経細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る、プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメント；
ｂ．該侵害受容感覚求心性神経細胞上の結合部位に結合し得るターゲティング部分であって、該結合部位が、エンドサイトーシスを受けて該侵害受容感覚求心性神経細胞内のエンドソームに取り込まれ得る、ターゲティング部分；
ｃ．プロテアーゼ切断部位であって、該部位でプロテアーゼにより該融合タンパク質が切断され得、該プロテアーゼ切断部位が、該非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントと該ターゲティング部分との間に位置している、プロテアーゼ切断部位；および
ｄ．トランスロケーションドメインであって、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性神経細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせ得る、トランスロケーションドメイン
を含む。
ＷＯ９８／０７８６４の系は、標的細胞上の結合部位との相互作用のためにＣ末端ドメインを必要とするＴＭを有する結合体の調製のために十分に作用している。これに関して、ＷＯ９８／０７８６４は、標的細胞上の結合部位と相互作用するのに「フリー」であるＣ末端ドメインを有する融合タンパク質を提供している。本発明者らは、この構造配置が全てのＴＭに適しているわけではないことを見出した。ＴＭの１つのこのようなカテゴリーは、侵害受容感覚求心性神経細胞に結合するＴＭ群である。より詳細には、本発明者らは、ＷＯ９８／０７８６４の融合タンパク質系は、侵害受容感覚求心性神経細胞上の結合部位と相互作用するためにＮ末端側ドメインを必要とするＴＭには最適ではないことを見出した。特に、この問題点は、侵害受容感覚求心性神経細胞上の結合部位と相互作用するために、特定のＮ末端アミノ酸残基またはこの特定のＮ末端アミノ酸残基を含むアミノ酸残基からなる特定配列を必要とするＴＭにとって重大である。
ＷＯ９８／０７８６４とは対照的に、本発明は、結合体のＴＭ構成部分が、ＴＭの内部ドメインまたは中間部の方に位置している（すなわち、直鎖状ペプチド配列の）アミノ酸配列、好ましくはＴＭのＮ末端の方に位置しているアミノ酸配列、より好ましくはＮ末端にまたはその付近に位置しているアミノ酸配列内に、関連結合ドメインを含む、非細胞傷害性結合体を調製するためのシステムを提供する。Ｎ末端側ドメインは、侵害受容感覚求心性神経細胞上の結合部位に結合し得、そしてＴＭは、好ましくは、アミノ酸残基の特定の所定の配列がそのＮ末端で「フリー」であるとの要件を有している。
本発明の非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分は、非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントであり、このプロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントは、侵害受容感覚求心性神経細胞のエキソサイトーシス融合器官の３つの基質タンパク質、すなわち、シナプトブレビン、シンタキシン、またはＳＮＡＰ−２５の１つにおいて、異なるが特定のペプチド結合を切断し得る。これらの基質は、神経分泌機構の重要な構成部分である。本発明の非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分は、好ましくは、ナイセリアＩｇＡプロテアーゼもしくはそのフラグメントまたはクロストリジウム神経毒素Ｌ鎖もしくはそのフラグメントである。特に好ましい非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分は、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）Ｌ鎖またはそのフラグメントである。
本発明のトランスロケーション構成部分は、プロテアーゼ活性の機能的発現が標的細胞のサイトゾル内で生じるように、標的細胞への非細胞傷害性プロテアーゼ（またはそのフラグメント）のトランスロケーションを可能にする。トランスロケーション構成部分は、好ましくは、低ｐＨ条件下で脂質膜中にイオン透過孔を形成し得る。好ましくは、エンドソーム膜内の孔形成が可能なタンパク質分子の部分のみを使用することが見出されている。トランスロケーション構成部分は、微生物タンパク質供給源（特に、細菌またはウイルスタンパク質供給源）から得られ得る。したがって、１つの実施態様では、トランスロケーション構成部分は、細菌毒素またはウイルスタンパク質のような酵素のトランスロケーションドメインである。本発明のトランスロケーション構成部分は、好ましくは、クロストリジウム神経毒素Ｈ鎖またはそのフラグメントである。最も好ましくは、それは、ＨＮドメイン（またはその機能的構成部分）である。ＨＮは、Ｈ鎖のアミノ末端側半分にほぼ等価なクロストリジウム神経毒素のＨ鎖の一部またはフラグメント、または完全なＨ鎖中のそのフラグメントに対応するドメインを意味する。
本発明のＴＭ構成部分は、本発明の結合体の標的細胞上の結合部位への結合を担う。したがって、ＴＭ構成部分は、単に、選択された標的細胞に対して本発明の結合体が結合するリガンドである。
本発明においては、標的細胞は、侵害受容感覚求心性神経細胞、好ましくは、一次侵害受容求心性神経細胞（例えば、Ａ線維（例えば、Ａδ線維）またはＣ線維）である。したがって、本発明の結合体は、侵害受容感覚求心性神経細胞の分離した集団からの神経伝達物質または神経調節物質［例えば、グルタミン酸塩、サブスタンスＰ、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、および／またはニューロペプチドＹ］の放出を阻害し得る。使用に際して、結合体は、末梢から中枢疼痛線維への感覚求心性シグナル（例えば、神経伝達物質または神経調節物質）の伝達を減少または妨害し、したがって、疼痛（特に慢性疼痛）の治療用の治療分子としての適用を有する。
ＴＭが侵害受容感覚求心性神経細胞に結合することを確認することは通常の技術によってなされる。例えば、侵害受容感覚求心性神経細胞の代表となる組織または細胞（例えば、ＤＲＧ）が、過剰な非標識リガンドの存在下で標識（例えば、トリチウム化）リガンドに曝露される簡単な放射能置換実験が、用いられ得る。このような実験において、非特異的結合および特異的結合の相対的割合を求め、それにより、リガンドが侵害受容感覚求心性神経標的細胞に結合することの確認が可能になり得る。必要に応じて、アッセイは、１つ以上の結合アンタゴニストを含み得、そしてこのアッセイは、リガンド結合の喪失を観察する工程をさらに含み得る。このタイプの実験の例は、Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, 概要, 303〜311頁, Receptor biochemistry, A Practical Approach, E.C. Hulme編, Oxford University Pressに見出され得る。
本発明の融合タンパク質は、概して、対応する「フリー」なＴＭと比較した場合、侵害受容感覚求心性神経標的細胞に対して（１００倍までの範囲で）低下した結合親和性を示している。しかし、この観察にも関わらず、本発明の融合タンパク質は、驚くべきことに、良好な効力を示している。これは、２つの主要な特徴に帰するものであり得る。第一に、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分は、触媒性である。したがって、少数のこのような分子の治療効果が迅速に増幅される。第二に、侵害受容感覚求心性神経細胞上に存在するレセプターは、治療剤の侵入のための出入口としてのみ作用する必要があり、必ずしもリガンド−レセプター媒介薬理学的応答を達成するために必要とされるレベルまで刺激される必要はない。したがって、本発明の融合タンパク質は、他のタイプの鎮痛分子（例えば、ＮＳＡＩＤＳ、モルヒネ、およびガバペンチン）について用いられるよりもずっと低い投薬量で投与され得る。後者のタイプの分子は、代表的には、高マイクログラムからミリグラム（数百ミリグラムまででさえある）量で投与される。これに対して、本発明の融合タンパク質は、ずっとより低い投薬量（代表的には少なくとも１０倍低く、そしてより代表的には１００倍低い）で投与され得る。
ＴＭは、好ましくは最大で５０アミノ酸残基、より好ましくは最大で４０アミノ酸残基、特に好ましくは最大で３０アミノ酸残基、そして最も好ましくは最大で２０アミノ酸残基を含む。
オピオイドは、本発明のＴＭの好ましい群を代表する。このペプチドファミリー内には、エンケファリン（ｍｅｔおよびｌｅｕ）、エンドモルフィン１および２、β−エンドルフィンおよびダイノルフィンが含まれる。オピオイドペプチドは、侵害受容器および疼痛応答に関与する他の細胞に対する活性を改変するために、臨床で頻繁に使用されている。世界保健機構の三段階徐痛ラダー（three-step World Health Organisation Analgesic Ladder）によって例示されるように、オピオイドは、全ての三段階で慢性癌および非癌性の疼痛の薬理治療への進入点を有し、このことが、疼痛の治療に対するそれらの重要性の根底にある。オピオイドという場合、侵害受容感覚求心性神経細胞に結合する能力を保持する限り、それらのフラグメント、改変体、および誘導体も包含する。
本発明のＴＭはまた、侵害受容感覚求心性神経細胞、より特定すると一次侵害受容求心性神経細胞上に存在するレセプターの１つ以上で「アゴニスト」として作用する分子であり得る。従来、アゴニストは、細胞内で活性を増大または減少のいずれかを行い得る任意の分子、すなわち、単に細胞活性の変化を引き起こす任意の分子であると考えられてきた。例えば、アゴニストの従来の意味は、細胞上のレセプターと結合して反応または活性を開始させ得る化学物質、またはレセプターの活性化により活性な応答（その応答が細胞活性の増大または減少のいずれであっても）を誘発する薬物を含み得た。
しかし、本発明の目的では、アゴニストは、標的細胞におけるエキソサイトーシス融合のプロセスを刺激し得る分子であるとしてより特定して定められる。このプロセスは、該標的細胞におけるエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得るプロテアーゼ（またはそのフラグメント）による阻害を受けやすい。
したがって、本発明のアゴニストの特別な定義は、アゴニストとして従来考えられてきた多くの分子を排除し得る。例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）は、TrkAレセプターへの結合を介して神経細胞分化を促進する能力の点でアゴニストである。しかし、ＮＧＦは、エキソサイトーシス融合の主要となる誘発因子ではないので、上記基準によって評価する場合アゴニストではない。さらに、ＮＧＦが刺激するプロセス（すなわち、細胞分化）は、非細胞傷害性毒素分子のプロテアーゼ活性による阻害を受けにくい。
侵害受容求心性神経細胞上のレセプターに結合するＴＭのアゴニスト特性は、実施例１０に記載の方法を用いて確認され得る。
本発明の好ましい実施態様では、ＴＭの標的はＯＲＬ１レセプターである。このレセプターは、Ｇタンパク質結合クラスのレセプターのメンバーであり、そして７回膜貫通ドメイン構造を有する。ＯＲＬ１レセプターの特性は、MogilおよびPasternak (2001), Pharmacological Reviews, 53巻, 3号, 381-415頁に詳細に考察されている。
１つの実施態様では、ＴＭは、ＯＲＬ１レセプターに結合する（好ましくは特異的に結合する）分子である。より好ましくは、ＴＭは、ＯＲＬ１レセプターの「アゴニスト」である。この文脈での用語「アゴニスト」は、上で定義したとおりである。
ＯＲＬ１レセプターに結合するＴＭのアゴニスト特性は、実施例１０に記載の方法を用いて確認され得る。これらの方法は、以前の実験（Inoueら, 1998 [Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 10949-10953]を参照のこと）に基づいており、ＯＲＬ１レセプターの天然アゴニストであるノシセプチンが、一次侵害受容求心性神経細胞からのサブスタンスＰ放出の誘発を引き起こすことを確認している。これは、以下の事実によって支持されている：
ノシセプチン誘発応答は、特異的ＮＫ１レセプター（サブスタンスＰレセプター）アンタゴニストによって撤廃される；および
カプサイシンでの細胞の前処理（直径の小さい一次求心性神経細胞からサブスタンスＰを枯渇させる）によって、ノシセプチン誘発応答は減弱する。
同様に、Inoueらは、ボツリヌス菌神経毒素Ａ型の足底内への注射によりノシセプチン誘発応答が撤廃されることを確認している。ＢｏＮＴが、一次求心性神経細胞からのサブスタンスＰの放出を阻害することが公知である（Welchら, 2000, Toxicon, 38, 245-258）ので、これにより、ノシセプチン−ＯＲＬ１相互作用とそれに続くサブスタンスＰの放出との間の関係が確認される。
したがって、ＴＭは、それが侵害受容感覚求心性神経細胞からのサブスタンスＰの放出において誘発を引き起こすのであれば、ＯＲＬ１レセプターにアゴニスト活性を有するとされ得る（実施例１０を参照のこと）。
本発明の特に好ましい実施態様では、ＴＭは、ノシセプチン（ＯＲＬ１レセプターの天然リガンド）である。ノシセプチンは、高い親和力でＯＲＬ１レセプターをターゲティングする。他の好ましいＴＭの例は、以下を含む：
Figure 0005174463
[1] MogilおよびPasternak, 2001, Pharmacol. Rev., 53, 381-415
[2] Maileら, 2003, Neurosci. Lett., 350, 190-192
[3] Rizziら, 2002, J. Pharmacol. Exp. Therap., 300, 57-63
[4] Okadaら, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 278, 493-498
[5] Dooleyら, 1997, J Pharmacol Exp Ther. 283(2), 735-41。
上記「改変体」ＴＭは、侵害受容感覚求心性神経細胞に対して特に良好な結合親和性（天然ノシセプチンと比較した場合）を示している。これは、そのアミノ酸改変がＴＭのＮ末端から離れた位置で生じているので、驚くべきことである。さらに、改変は、ＴＭのほぼＣ末端にあり、続いて、大きなポリペプチド配列（すなわち、トランスロケーションドメイン）が付着されている。一般的にいえば、ＴＭ含有融合タンパク質は、ＴＭそれ自体と比較してほぼ１００倍の結合能の低下を示す。上記「改変体」ＴＭそれ自体は、天然ノシセプチンと比較して、（例えば、ＯＲＬ１レセプターを介する）侵害受容感覚求心性神経細胞に対する結合能の約３〜１０倍の増大を示す。したがって、「改変体」ＴＭ含有融合物は、「フリー」ノシセプチンと比較して、（例えば、ＯＲＬ１レセプターを介する）侵害受容感覚求心性神経細胞に対する結合能の約１０倍の減少を示すと予想され得る。しかし、本発明者らは、このような「改変体」ＴＭ含有融合タンパク質が、（最も驚くべきことに）「フリー」ノシセプチンの結合能を密に反映している結合能を示すことを実証した−図１４を参照のこと。
本発明においては、オピオイドまたはＯＲＬ１レセプターのアゴニスト（例えば、ノシセプチンまたは上記表中に列挙したペプチドのいずれか）との用語は、該オピオイドまたはアゴニストと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する分子を包含する。アゴニストホモログは、ＯＲＬ１レセプターでノシセプチンのアゴニスト特性を保持し、これは、実施例１０に提供する方法を用いて調べられ得る。同様に、オピオイドホモログは、オピオイドの結合機能を実質的に保持し、オピオイドと高い相同性を示している。
本発明はまた、上記ＴＭのいずれかのフラグメント、改変体、および誘導体を包含する。これらのフラグメント、改変体、および誘導体は、該ＴＭが有する特性を実質的に保持している。
上記オピオイドおよび非オピオイドクラスのＴＭに加えて、種々の他のポリペプチドが、侵害受容感覚求心性神経細胞（例えば、侵害受容体）に本発明の結合体をターゲティングさせることに適している。これに関して、特に、ガラニンおよびガラニンの誘導体について述べられる。ガラニンレセプターは、ＤＲＧでシナプス前およびシナプス後に見られ（LiuおよびHokfelt, (2002), Trends Pharm. Sci., 23(10), 468-74）、そして神経障害性疼痛状態の間、発現が増強される。プロテイナーゼ活性化レセプター（ＰＡＲ）もまた、本発明のＴＭの好ましい群である（最も特にＰＡＲ−２）。ＰＡＲ−２のアゴニストは、神経性機構を部分的に介して、急性炎症を誘発／惹起することが知られる。ＰＡＲ２は、一次脊髄求心性神経細胞によって発現され、そしてＰＡＲ２アゴニストは、末梢組織においてサブスタンスＰ（ＳＰ）およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）の放出を刺激する。
本発明のＴＭの特に好ましいセットは、以下を含む：
Figure 0005174463
本発明のプロテアーゼ切断部位は、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分とＴＭ構成部分との間の位置での融合タンパク質の切断（好ましくは制御された切断）を可能にする。この切断反応は、融合タンパク質を単鎖ポリペプチドからジスルフィド結合で連結された二本鎖ポリペプチドに変換するものである。
本発明の好ましい実施態様によれば、ＴＭは、ＴＭのＣ末端から離れて位置しているドメインまたはアミノ酸配列を介して結合する。例えば、関連結合ドメインとしては、ＴＭの内部ドメインまたは中間部の方に位置している（すなわち、直鎖状ペプチド配列の）アミノ酸配列が挙げられ得る。好ましくは、関連結合ドメインは、ＴＭのＮ末端の方に、より好ましくは、Ｎ末端にまたはその付近に、位置している。
１つの実施態様では、単鎖ポリペプチド融合物は、１つより多くのタンパク質分解切断部位を含み得る。しかし、２つ以上のこのような部位が存在する場合、それらは、別のものであり、それにより、単一のプロテアーゼの存在下で複数の切断事象が生じることが実質的に防止される。別の実施態様では、単鎖ポリペプチド融合物は、単一のプロテアーゼ切断部位を有することが好ましい。
プロテアーゼ切断配列は、従来の手段（例えば、部位特異的変異誘発）によってＤＮＡレベルで導入（および／または任意の固有切断配列が除去）され得る。切断配列の存在を確認するためのスクリーニングは、手動またはコンピューターソフトウェア（例えば、DNASTAR, Inc.によるMapDrawプログラム）の補助のもとに実施され得る。
任意のプロテアーゼ切断部位が用いられ得るが、以下が好ましい：
エンテロキナーゼ（ＤＤＤＤＫ↓）
第Ｘａ因子（ＩＥＧＲ↓／ＩＤＧＲ↓）
ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）（ＥＮＬＹＦＱ↓Ｇ）
トロンビン（ＬＶＰＲ↓ＧＳ）
PreScission（ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ）。
用語「プロテアーゼ切断部位」には、インテイン（これは自己切断性配列である）も包含される。自己スプライシング反応は、例えば、存在する還元剤の濃度を変更することによって、制御可能である。
使用に際して、プロテアーゼ切断部位は切断されて、ＴＭのＮ末端側領域（好ましくはＮ末端）が露出されるようになる。生じたポリペプチドは、結合体の残りの部分から実質的にフリーであるＮ末端側ドメインまたは内部ドメインを伴うＴＭを有する。この配置によって、ＴＭのＮ末端側構成部分（または内部ドメイン）が、標的細胞上の結合部位と直接的に相互作用し得ることが確実となる。
好ましい実施態様では、ＴＭとプロテアーゼ切断部位とは、融合タンパク質中で、多くとも１０アミノ酸残基、より好ましくは多くとも５アミノ酸残基、そして最も好ましくは０アミノ酸残基離れて位置している。したがって、プロテアーゼ切断部位の切断によって、結合体は、結合体の残りの部分から実質的にフリーであるＮ末端側ドメインを有するＴＭを提供する。この配置によって、ターゲティング部分のＮ末端側構成部分が、標的細胞上の結合部位と直接的に相互作用し得ることが確実となる。
上記活性化工程に伴う１つの利点は、一旦融合タンパク質のタンパク質分解による切断が生じた場合にＴＭのみがＮ末端分解を受けるようになることである。さらに、特定プロテアーゼ切断部位の選択によって、二本鎖構造となるようにポリペプチド融合物の選択的活性化を可能にする。
本発明の単鎖ポリペプチド融合物の構築は、ＴＭと非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分との間にプロテアーゼ切断部位を配置する。
単鎖融合物において、ＴＭが、プロテアーゼ切断部位とトランスロケーション構成部分との間に位置していることが好ましい。これにより、ＴＭが、トランスロケーションドメインに付着されることが確実となる（すなわち、天然型クロストリジウムホロ毒素で生じるように）が、本発明の場合、これらの２つの構成部分の順序が天然型ホロ毒素に対して逆である。この配置に伴うさらなる利点は、ＴＭが、融合タンパク質の露出されたループ領域内に位置していることである。これは、融合タンパク質の構造に対して構成による影響を最小限とする。これに関して、該ループは、リンカー、活性化ループ、ドメイン間リンカー、または単に表面露出ループと種々に呼ばれる（Schiavoら, 2000, Phys. Rev., 80, 717-766；Turtonら, 2002, Trends Biochem. Sci., 27, 552-558）。
１つの実施態様では、単鎖ポリペプチドにおいて、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分とトランスロケーション構成部分とが、ジスルフィド結合によって一緒に連結されている。したがって、プロテアーゼ切断部位の切断によって、ポリペプチドは、二本鎖構造をとる。ここでは、プロテアーゼ構成部分とトランスロケーション構成部分とが、ジスルフィド結合によって一緒に連結されたままである。この目的のために、プロテアーゼ構成部分とトランスロケーション構成部分とは、単鎖融合タンパク質において、最大で１００アミノ酸残基、より好ましくは最大で８０アミノ酸残基、特に好ましくは最大で６０アミノ酸残基、そして最も好ましくは最大で５０アミノ酸残基、互いに離れて位置していることが好ましい。
１つの実施態様では、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分は、融合タンパク質のトランスロケーション構成部分とジスルフィド結合を形成する。例えば、ジスルフィド結合を形成するプロテアーゼ構成部分のアミノ酸残基は、プロテアーゼ構成部分の最後の２０アミノ酸、好ましくは最後の１０アミノ酸のＣ末端側アミノ酸残基内に位置している。同様に、ジスルフィド結合の第二部分を形成するトランスロケーション構成部分内のアミノ酸残基は、トランスロケーション構成部分の最初の２０アミノ酸、好ましくは最初の１０アミノ酸のＮ末端側アミノ酸残基内に位置し得る。
あるいは、単鎖ポリペプチドにおいて、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分とＴＭとが、ジスルフィド結合によって一緒に連結され得る。これに関して、ジスルフィド結合を形成するＴＭのアミノ酸残基は、好ましくは、ＴＭのＮ末端から離れて、より好ましくは、ＴＭのＣ末端の方に、位置している。
１つの実施態様では、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分は、融合タンパク質のＴＭ構成部分とジスルフィド結合を形成する。これに関して、ジスルフィド結合を形成するプロテアーゼ構成部分のアミノ酸残基は、好ましくは、プロテアーゼ構成部分の最後の２０アミノ酸、より好ましくは最後の１０アミノ酸のＣ末端側アミノ酸残基内に位置している。同様に、ジスルフィド結合の第二部分を形成するＴＭ構成部分内のアミノ酸残基は、好ましくは、ＴＭの最後の２０アミノ酸、より好ましくは最後の１０アミノ酸のＣ末端側アミノ酸残基内に位置している。
上記ジスルフィド結合配置は、プロテアーゼ構成部分およびトランスロケーション構成部分が、天然型クロストリジウム神経毒素に類似する様式で配置されるという利点を有する。比較のために、天然型クロストリジウム神経毒素の一次アミノ酸配列に関して、それぞれのシステインアミノ酸残基は、８〜２７アミノ酸残基離れて位置している−Popoff, MRおよびMarvaud, J-C, 1999, Structural & genomic features of clostridial neurotoxins, 第9章, The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. AloufおよびFreer編より抜粋。
Figure 0005174463
融合タンパク質は、１つ以上の精製タグを含み得る。これらの精製タグは、プロテアーゼ構成部分に対してＮ末端側および／またはトランスロケーション構成部分に対してＣ末端側に位置している。
任意の精製タグが用いられ得るが、以下が好ましい：
Ｈｉｓ−タグ（例えば、６×ヒスチジン）、好ましくはＣ末端タグおよび／またはＮ末端タグとして
ＭＢＰ−タグ（マルトース結合タンパク質）、好ましくはＮ末端タグとして
ＧＳＴ−タグ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ)、好ましくはＮ末端タグとして
Ｈｉｓ−ＭＢＰ−タグ、好ましくはＮ末端タグとして
ＧＳＴ−ＭＢＰ−タグ、好ましくはＮ末端タグとして
チオレドキシンタグ、好ましくはＮ末端タグとして
ＣＢＤ−タグ（キチン結合ドメイン）、好ましくはＮ末端タグとして。
本発明のさらなる実施態様によれば、融合タンパク質中に、１つ以上のペプチドスペーサー分子が含まれ得る。例えば、精製タグと融合タンパク質分子の残りとの間（例えば、Ｎ末端精製タグと本発明のプロテアーゼ構成部分との間；および／またはＣ末端精製タグと本発明のトランスロケーション構成部分との間）に、ペプチドスペーサーが用いられ得る。本発明のＴＭ構成部分とトランスロケーション構成部分との間にも、ペプチドスペーサーは用いられ得る。
種々の異なるスペーサー分子が、本発明の融合タンパク質のいずれかに用いられ得る。このようなスペーサー分子の例は、図２８および図２９に図示したものを含む。特に、ここでは、ＧＳ１５、ＧＳ２０、ＧＳ２５、およびＨｘ２７が述べられる−図２８および図２９を参照のこと。
予想外に、本発明者らは、スペーサーの大きさが、（使用に際して）ＴＭのＣ末端とトランスロケーション構成部分のＮ末端とが互いに４０〜１０５オングストローム、好ましくは５０〜１００オングストローム、そしてより好ましくは５０〜９０オングストローム離れているように選択される場合、本発明の融合タンパク質（例えば、ＣＰＮｖ／Ａ）が、侵害受容感覚求心性神経細胞に対する結合活性の改善を示し得ることを見出した。別の実施態様では、好ましいスペーサーは、１１〜２９アミノ酸残基、好ましくは１５〜２７アミノ酸残基、そしてより好ましくは２０〜２７アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する。適切なスペーサーは、Crasto, C.J.およびFeng, J.A. (2000) 5月; 13(5);309-312頁（http://www.fccc./edu/research/labs/feng/limker.html.もまた参照のこと）に従って、通常通りに同定および入手され得る。
本発明の第二の局面によれば、上記単鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が提供される。本発明の好ましい局面では、このＤＮＡ配列は、ＤＮＡベクターの一部として調製される。このベクターは、プロモーターおよびターミネーターを含む。
好ましい実施態様では、ベクターは、以下から選択されるプロモーターを有する：
Figure 0005174463
本発明のＤＮＡ構築物は、好ましくは、コンピュータ上で設計され、次いで従来のＤＮＡ合成技術によって合成される。
上記ＤＮＡ配列情報は、必要に応じて、用いられる最終宿主細胞（例えば、大腸菌）発現系に従ったコドン偏位のために改変される。
ＤＮＡバックボーンは、好ましくは、任意の固有核酸配列についてスクリーニングされる。この固有核酸配列は、転写および翻訳されたときに、第二のペプチドコード配列によってコードされるプロテアーゼ切断部位に相当するアミノ酸配列を生じ得る。このスクリーニングは、手動またはコンピューターソフトウェア（例えば、DNASTAR, Inc.によるMapDrawプログラム）の補助のもとで実施され得る。
本発明のさらなる実施態様によれば、非細胞傷害性薬剤を調製する方法が提供され、この方法は、以下の工程を含む：
ａ．本発明の単鎖ポリペプチド融合タンパク質と、プロテアーゼ切断部位を切断し得るプロテアーゼとを接触させる工程；
ｂ．プロテアーゼ切断部位を切断し、そしてそれにより二本鎖融合タンパク質を形成する工程。
この局面は、二本鎖ポリペプチドを提供し、これは、概して、クロストリジウムホロ毒素の構造を模倣している。より詳細には、得られた二本鎖ポリペプチドは、代表的には、以下のような構造を有する：
ａ．第一鎖は、非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントを含み、このプロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントは、侵害受容感覚求心性神経細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る；
ｂ．第二鎖は、ＴＭおよびトランスロケーションドメインを含み、トランスロケーションドメインは、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性神経細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせ得る；そして
第一鎖および第二鎖は、一緒にジスルフィド結合で連結されている。
本発明のさらなる局面によれば、疼痛の治療、予防、または緩和用の医薬品の製造のための、本発明の単鎖または二本鎖のポリペプチドの使用が提供される。
関連した局面によれば、患者の疼痛を治療、予防、または緩和する方法が提供され、該方法は、本発明の単鎖または二本鎖のポリペプチドの治療有効量を該患者に投与する工程を含む。
本発明は、広範な疼痛状態、特に慢性疼痛状態を解消する。好ましくは、状態としては、癌性および非癌性疼痛、炎症性疼痛、および神経障害性疼痛が挙げられる。本出願のオピオイド融合物は、炎症性疼痛の解消に特に適しているが、神経障害性疼痛の解消にも適し得る。ガラニン融合物は、神経障害性疼痛の解消に、より適している。
使用に際して、本発明のポリペプチドは、代表的には、薬学的キャリア、希釈剤および／または賦形剤と共に、薬学的組成物の形態で用いられる。組成物の的確な形態は、投与様式に合わせられ得る。投与は、好ましくは哺乳動物に、より好ましくはヒトに対してである。
ポリペプチドは、例えば、関節内投与または頭蓋内投与用に滅菌溶液の形態で用いられ得る。脊髄注射（例えば、硬膜外注射もしくは髄腔内注射）が好ましい。
本発明のポリペプチドの投与のための投薬量範囲は、所望の治療効果を生じる投薬量範囲である。必要投薬量範囲は、構成部分の正確な性質、投与経路、処方の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、程度、もしくは重篤度、禁忌（ある場合）、および主治医の判断に依存することが理解される。
適切な一日投薬量は、0.0001〜1mg/kg、好ましくは0.0001〜0.5mg/kg、より好ましくは0.002〜0.5mg/kg、および特に好ましくは0.004〜0.5mg/kgの範囲内である。単位投薬量は、１μg未満から30mgまでの間で変動し得るが、代表的には一投与あたり0.01〜1mgの範囲内であり、これは、毎日、または好ましくは頻度を下げて（例えば、毎週または半年毎に）投与され得る。
特に好ましい投薬レジメは、１×の用量として2.5ngの融合タンパク質（例えば、ＣＰＮｖ／Ａ）に基づく。これに関して、好ましい投薬量は、１×〜１００×（すなわち、2.5〜250ng）の範囲内である。この投薬量範囲は、他のタイプの鎮痛性分子（例えば、ＮＳＡＩＤＳ、モルヒネ、およびガバペンチン）で用いられるよりも有意に低い（すなわち、少なくとも１０倍、代表的には１００倍低い）。さらに、上記差異は、モル基準で同じ比較がなされる場合に相当に拡大される。これは、本発明の融合タンパク質が、従来の「小さな」分子治療剤よりも相当に大きなＭｗを有するからである。
しかしながら、必要投薬量に広範な変動があることは、構成部分の正確な性質および種々の投与経路の異なる効率に依存して予想されることである。
これらの投薬量レベルの変動は、当該分野で周知であるように、最適化のために標準的な経験的作業を用いて調整され得る。
注射に適した組成物は、溶液、懸濁液、もしくは乳濁液、または使用前に適切なビヒクル中に溶解もしくは懸濁される乾燥粉末の形態であり得る。
液状単位投薬剤形は、代表的には、発熱性物質除去滅菌ビヒクルを利用して調製される。活性成分は、使用するビヒクルおよび濃度に依存して、そのビヒクル中に溶解または懸濁され得る。
投与可能な溶液を調製する際、ポリペプチドはビヒクル中に溶解され得、溶液は、必要に応じて塩化ナトリウムの添加により等張にされる。そして無菌技術を用いて滅菌フィルタを通して濾過することにより滅菌され、次いで適切な滅菌バイアルまたはアンプル中に充填し、密封され得る。あるいは、溶液安定性が十分である場合、その密封容器中の溶液は、オートクレーブによって滅菌され得る。
好都合には、添加剤（例えば、緩衝化剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤もしくは殺菌剤、懸濁化剤もしくは乳化剤）がビヒクル中に溶解され得る。
使用前に適切なビヒクル中に溶解または懸濁される乾燥粉末は、滅菌区域で無菌技術を用いて、予め滅菌しておいた薬物および他の成分を滅菌容器中に充填することにより調製され得る。
あるいは、ポリペプチドおよび他の成分が水性ビヒクル中に溶解され得、この溶液は、濾過により滅菌され、そして滅菌区域で無菌技術を用いて適切な容器中に分配される。製品は、次いで凍結乾燥され、そして容器は、無菌下で密封される。
筋内注射、皮下注射、または皮内注射に適切な非経口投与用懸濁液は、滅菌構成部分を溶解する代わりに滅菌ビヒクル中に懸濁しそして滅菌が濾過によって達成できないことを除いて、実質的に同様にして調製される。構成部分は、滅菌状態で単離され得るか、あるいは単離後に（例えば、ガンマ照射によって）滅菌され得る。
好都合には、懸濁化剤（例えば、ポリビニルピロリドン）が、構成部分の均一な分布を促進するために、組成物中に含まれる。
（定義の節）
ターゲティング部分（ＴＭ）は、薬剤と標的細胞の表面との間に物理的会合を引き起こすように、結合部位と機能的に相互作用する薬剤と会合する任意の化学的構造を意味する。本発明においては、標的細胞は、侵害受容感覚求心性神経細胞である。ＴＭとの用語は、結合部位が内在化（例えば、エンドソーム形成）−レセプター媒介エンドサイトーシスとも呼ばれる−を行い得る、標的細胞上の結合部位に結合し得る任意の分子（すなわち、天然に存在する分子またはそれらの化学的／物理的に改変された改変体）を含む。ＴＭは、エンドソーム膜トランスロケーション機能を保有し得、この場合、本発明の薬剤に、ＴＭ構成部分とトランスロケーションドメイン構成部分とが別々に存在する必要はない。
本発明のＴＭは、侵害受容感覚求心性神経細胞（例えば、一次侵害受容求心性神経細胞）に結合（好ましくは特異的に結合）する。これに関して、特異的に結合するとは、ＴＭが侵害受容感覚求心性神経細胞（例えば、一次侵害受容求心性神経細胞）に、それが、他の神経細胞（例えば、非侵害受容求心性神経細胞）および／または運動神経細胞（すなわち、クロストリジウム神経毒素ホロ毒素の天然の標的）に結合するよりも大きな親和力で結合することを意味する。用語「特異的に結合する」とはまた、所与のＴＭが、所与のレセプター（例えば、ＯＲＬ１レセプター）に、１０６Ｍ−１以上、好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１以上、および最も好ましくは１０９Ｍ−１以上の結合親和力（Ｋａ）で結合することも意味し得る。
本発明の目的では、アゴニストは、標的細胞におけるエキソサイトーシス融合のプロセスを刺激し得る分子であると定められる。このプロセスは、該標的細胞におけるエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得るプロテアーゼ（またはそのフラグメント）による阻害を受けやすい。
したがって、本発明のアゴニストの特別な定義は、アゴニストとして従来考えられてきた多くの分子を排除し得る。
例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）は、ＴｒｋＡレセプターへの結合を介して神経細胞分化を促進する能力の点でアゴニストである。しかし、ＮＧＦは、エキソサイトーシス融合の主要となる誘発因子ではないので、上記基準によって評価する場合アゴニストではない。さらに、ＮＧＦが刺激するプロセス（すなわち、細胞分化）は、非細胞傷害性毒素分子のプロテアーゼ活性による阻害を受けやすいわけではない。
用語「フラグメント」は、タンパク質に関して用いる場合、問題のタンパク質のうちの少なくとも３５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも２０、および最も好ましくは少なくとも１０のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。
用語「改変体」は、タンパク質に関して用いる場合、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸）または置換結合を含むタンパク質のペプチドまたはペプチドフラグメントを意味する。
用語「誘導体」は、タンパク質に関して用いる場合、問題のタンパク質およびさらなるペプチド配列を含むタンパク質を意味する。このさらなるペプチド配列は、好ましくは、元のタンパク質の基本折りたたみを妨害せず、したがって立体構造を妨害しない。２つ以上のペプチド（またはフラグメント、または改変体）が一緒に結合されて、誘導体を形成し得る。あるいは、ペプチド（またはフラグメント、または改変体）が非関連分子（例えば、第二の非関連ペプチド）に結合され得る。誘導体は、化学合成され得るが、代表的には、組換え核酸法によって調製される。脂質成分、および／または多糖成分、および／またはポリケチド成分のような付加成分が含まれていてもよい。
本明細書全体にわたって、「ＯＲＬ１レセプター」という場合は、ＯＲＬ１レセプターファミリーの全てのメンバーを包含する。ＯＲＬ１レセプターファミリーのメンバーは、代表的には、７回膜貫通ドメイン構造を有し、そしてＧｉおよびＧ０ファミリーのＧタンパク質に結合される。ＯＲＬ１レセプターのリガンドのＧタンパク質刺激活性を決定するための方法を実施例１２に示す。ＯＲＬ１活性化後の細胞ｃＡＭＰレベルの減少を測定するための方法を実施例１１に示す。ＯＲＬ１レセプターファミリーのメンバーのさらなる特徴は、それらが代表的にはノシセプチン（ＯＲＬ１の天然リガンド）に結合し得るということである。一例として、ＯＲＬ１レセプターの全ての代替スプライシング改変体は、ＯＲＬ１レセプターファミリーのメンバーである。
用語「非細胞傷害性」は、問題のプロテアーゼ分子が、それがリターゲティングされた標的細胞を殺傷しないことを意味する。
本発明のプロテアーゼは、真核生物細胞においてエキソサイトーシス融合器官の１つ以上のタンパク質を切断し得る、全ての天然に存在する非細胞傷害性プロテアーゼを含む。
本発明のプロテアーゼは、好ましくは、細菌プロテアーゼ（またはそのフラグメント）である。より好ましくは、細菌プロテアーゼは、クロストリジウム属またはナイセリア属から選択される（例えば、クロストリジウムＬ鎖、またはナイセリアＩｇＡプロテアーゼ（好ましくは、N. gonorrhoeae由来））。
本発明はまた、改変非細胞傷害性プロテアーゼを含み、この改変プロテアーゼは、上記プロテアーゼ活性をなお示す限り、天然に存在しないアミノ酸配列および／または合成アミノ酸残基を含む。
本発明のプロテアーゼは、好ましくは、セリンまたはメタロプロテアーゼ活性（例えば、エンドペプチダーゼ活性）を示す。プロテアーゼは、好ましくは、ＳＮＡＲＥタンパク質（例えば、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン／ＶＡＭＰ、またはシンタキシン）に特異的である。
特に、神経毒素のプロテアーゼドメイン（例えば、細菌神経毒素のプロテアーゼドメイン）について述べられる。したがって、本発明は、天然に存在する神経毒素ドメインの使用、ならびに該天然に存在する神経毒素の組換え調製型を包含する。
例示の神経毒素は、クロストリジウム属によって生成される。そして用語「クロストリジウム神経毒素」は、C. tetaniによって生成される神経毒素（ＴｅＮＴ）およびC. botulinumによって生成される神経毒素（ＢｏＮＴ）血清型Ａ〜Ｇ、ならびにC. baratiiおよびC. butyricumにより生成される密に関連したＢｏＮＴ様神経毒素を含む。上記の略語は、本明細書中を通じて使用する。例えば、ＢｏＮＴ／Ａとの名称は、神経毒素の供給源がＢｏＮＴ（血清型Ａ）であることを示す。他のＢｏＮＴ血清型に対しても、対応する名称が適用される。
用語「Ｌ鎖フラグメント」は、神経毒素のＬ鎖の一構成部分を意味し、このフラグメントは、メタロプロテアーゼ活性を示し、そして細胞エキソサイトーシスに関与する小胞および／または原形質膜に会合したタンパク質をタンパク質分解により切断し得る。
トランスロケーションドメインは、プロテアーゼ活性の機能的発現が標的細胞のサイトゾル内で生じるように、標的細胞へのプロテアーゼ（またはそのフラグメント）のトランスロケーションを可能にする分子である。どの分子（例えば、タンパク質またはペプチド）が保有するのであっても、本発明の必要なトランスロケーション機能は、多数の従来アッセイの任意の１つによって確認され得る。
例えば、Shone C.（1987）は、試験分子でチャレンジされるリポソームを用いるインビトロアッセイを記載している。必要なトランスロケーション機能の存在は、Ｋ＋および／または標識ＮＡＤのリポソームからの放出によって確認され、これは容易にモニタリングされ得る［Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; 167(1)巻: 175-180頁を参照のこと］。
さらなる例は、Blaustein R.（1987）によって提供される。これは、平面リン脂質二層膜を用いる単純なインビトロアッセイを記載している。この膜を試験分子でチャレンジし、そして必要なトランスロケーション機能は、該膜を横断する伝導の増大によって確認される［Blaustein (1987) FEBS Letts; 226巻, 1号: 115-120頁を参照のこと］。
膜融合の評価、およびしたがって、本発明での使用に適したトランスロケーションドメインの同定を可能にするさらなる方法は、Methods in Enzymology 220巻および221巻, Membrane Fusion Techniques, A部およびB部, Academic Press 1993によって提供される。
トランスロケーションドメインは、好ましくは、低ｐＨ条件下で脂質膜中にイオン透過孔を形成し得る。好ましくは、エンドソーム膜内の孔形成が可能なタンパク質分子の部分のみを使用することが見出されている。
トランスロケーションドメインは、微生物タンパク質供給源（特に、細菌またはウイルスタンパク質供給源）から得られ得る。したがって、１つの実施態様では、トランスロケーションドメインは、細菌毒素またはウイルスタンパク質のような酵素のトランスロケーションドメインである。
細菌毒素分子のある種のドメインがこのような孔を形成し得ることは、十分に書き記されている。また、ウイルス発現膜融合タンパク質のある種のトランスロケーションドメインがこのような孔を形成し得ることも公知である。このようなドメインは、本発明において用いられ得る。
トランスロケーションドメインは、クロストリジウム属起源であり得、すなわち、ＨＮドメイン（またはその機能的構成部分）であり得る。ＨＮは、Ｈ鎖のアミノ末端側半分にほぼ等価なクロストリジウム神経毒素のＨ鎖の一部またはフラグメント、または完全なＨ鎖中のそのフラグメントに対応するドメインを意味する。Ｈ鎖が、Ｈ鎖のＨＣ構成部分の天然の結合機能を実質的に欠損していることが好ましい。これに関して、ＨＣ機能は、（ヌクレアーゼまたはプロテアーゼ処理によってＤＮＡ合成レベルまたは合成後レベルのいずれかの）ＨＣアミノ酸配列の欠失によって除去され得る。あるいは、ＨＣ機能は、化学的処理または生物学的処理によって不活性化され得る。したがって、Ｈ鎖は、好ましくは、天然型クロストリジウム神経毒素（すなわち、ホロ毒素）が結合する標的細胞上の結合部位に結合し得ない。
１つの実施態様では、トランスロケーションドメインは、クロストリジウム神経毒素のＨＮドメイン（またはそのフラグメント）である。適切なクロストリジウムトランスロケーションドメインの例は、以下を含む：
ボツリヌス菌Ａ型神経毒素−アミノ酸残基（449〜871）
ボツリヌス菌Ｂ型神経毒素−アミノ酸残基（441〜858）
ボツリヌス菌Ｃ型神経毒素−アミノ酸残基（442〜866）
ボツリヌス菌Ｄ型神経毒素−アミノ酸残基（446〜862）
ボツリヌス菌Ｅ型神経毒素−アミノ酸残基（423〜845）
ボツリヌス菌Ｆ型神経毒素−アミノ酸残基（440〜864）
ボツリヌス菌Ｇ型神経毒素−アミノ酸残基（442〜863）
破傷風菌神経毒素−アミノ酸残基（458〜879）。
ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）および破傷風菌（C. tetani）における毒素生成の遺伝的基礎に関するさらなる詳細については、Hendersonら (1997) The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic pressを参照のこと。
用語「ＨＮ」は、天然に存在する神経毒素ＨＮ部、および天然に存在しないアミノ酸配列および／または合成アミノ酸残基を有する改変ＨＮ部（但し、改変ＨＮ部が上記トランスロケーション機能をなお示す限り）を含む。
あるいは、トランスロケーションドメインは、非クロストリジウム属起源であり得る（表４を参照のこと）。非クロストリジウムトランスロケーションドメイン起源の例は、以下を含むが、これらに限定されない：ジフテリア毒素のトランスロケーションドメイン［O'Keefeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206；Silvermanら, J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532；およびLondon, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, 25-51頁］、シュードモナス外毒素Ａ型のトランスロケーションドメイン［Priorら, Biochemistry (1992) 31, 3555-3559］、炭疽菌毒素のトランスロケーションドメイン［Blankeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996）93, 8437-8442］、トランスロケーション機能の種々の融合性または疎水性ペプチド［Plankら, J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924；およびWagnerら, (1992) PNAS, 89, 7934-7938頁］、および両親媒性ペプチド［Murataら, (1992) Biochem., 31, 1986-1992頁］。トランスロケーションドメインは、天然に存在するタンパク質に存在するトランスロケーションドメインを反映し得るか、またはその変化がトランスロケーションドメインのトランスロケーション能を破壊しない限り、アミノ酸変化を含み得る。
本発明での使用に適したウイルストランスロケーションドメインの具体的な例には、ウイルス発現膜融合タンパク質のある種のトランスロケーションドメインが含まれる。例えば、Wagnerら（1992）およびMurataら（1992）は、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのＮ末端領域に由来する多数の融合性および両親媒性のペプチドのトランスロケーション（すなわち、膜融合および小胞形成）機能を記載している。所望のトランスロケーション活性を有することが公知の他のウイルス発現膜融合タンパク質は、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）の融合性ペプチドのトランスロケーションドメイン、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質Ｇのトランスロケーションドメイン、ＳＥＲウイルスＦタンパク質のトランスロケーションドメインおよび泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質のトランスロケーションドメインである。ウイルスがコードする「スパイクタンパク質（Aspike proteins）」は、本発明においては特別な適用を有し、例えば、ＳＦＶのＥ１タンパク質およびＶＳＶのＧタンパク質のＧタンパク質である。
表（以下）に列挙したトランスロケーションドメインの使用は、それらの配列改変体の使用を含む。改変体は、１つ以上の保存的な核酸置換および／または核酸欠失もしくは挿入を含み得る。但し、この改変体は、必要なトランスロケーション機能を保有する。改変体はまた、この改変体が必要なトランスロケーション機能を保有する限り、１つ以上のアミノ酸置換および／またはアミノ酸欠失もしくは挿入を含み得る。
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（図面）
図１ ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製
図２ ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製
図３ ＬＣ／Ｃ−ノシセプチン−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の精製
図４ ＬＣ／Ａ−ｍｅｔエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製
図５ ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質とノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質との結合効力の比較
図６ ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ触媒活性
図７ ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製
図８ ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質とＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質との結合効力の比較
図９ 可変スペーサー長産物を有する発現／精製ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質ファミリー
図１０ ＣＰＮ−ＡによるＳＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断
図１１ ＣＰＮ−ＡへのＤＲＧの曝露後長期間にわたるＳＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断
図１２ ＣＰＮｖ−ＡによるＳＮＡＰ−２５の切断
図１３ ＣＰＮｖ−ＡへのＤＲＧの曝露後長期間にわたるＳＮＡＰ−２５の切断
図１４ ［３Ｈ］−ノシセプチン結合のＣＰＮｖ−Ａ融合物媒介置換
図１５ 発現／精製ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａ産物
図１６ ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−ＡによるＳＮＡＰ−２５の切断
図１７ 発現／精製ＣＰＮｖ−Ｃ産物
図１８ ＣＰＮｖ−Ｃによるシンタキシンの切断
図１９ 急性カプサイシン誘発機械的異痛モデルにおけるＣＰＮ−Ａ効力
図２０ ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発末梢糖尿病性神経障害（神経因性疼痛）モデルにおけるＣＰＮ−Ａ効力
図２１ 急性カプサイシン誘発機械的異痛モデルにおけるＣＰＮｖ−Ａ効力
図２２ 発現／精製ＬＣ／Ａ−ＣＰＬＥ−ＨＮ／Ａ産物
図２３ 発現／精製ＬＣ／Ａ−ＣＰＢＥ−ＨＮ／Ａ産物
図２４ 発現／精製ＣＰＯＰ−Ａ産物
図２５ 発現／精製ＣＰＯＰｖ−Ａ産物
図２６ ＤＲＧ細胞モデルにおけるインビトロＳＮＡＰ−２５切断
図２７ 発現／精製ＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴ（取り外し可能ｈｉｓタグ）
図２８ リガンド競合アッセイにより評価した可変スペーサー長を有するＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ効力
図２９ インビトロＳＮＡＰ−２５切断により評価した可変スペーサー長を有するＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ効力
図面について、より詳細に説明する。
（図１ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製）
実施例９に示した方法を用いて、大腸菌BL21細胞からＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質を精製した。簡潔にいえば、細胞破壊後に得た可溶性産物をニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Ｘａ因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを除去し、次いで第２のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS-PAGE（パネルＡ）およびウェスタンブロッティング（パネルＢ）によって評価した。抗ノシセプチン抗血清（Abcamから入手）をウェスタンブロッティングの一次抗体として使用した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物を、それぞれ［−］および［＋］で記したレーン中に同定する。
（図２ − ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製）
実施例９に示した方法を用いて、大腸菌BL21細胞からノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質を精製した。簡潔にいえば、細胞破壊後に得た可溶性産物をニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Ｘａ因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを除去し、次いで第２のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS-PAGE（パネルＡ）およびウェスタンブロッティング（パネルＢ）によって評価した。抗ノシセプチン抗血清（Abcamから入手）をウェスタンブロッティングの一次抗体として使用した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物を、それぞれ［−］および［＋］で記したレーン中に同定する。
（図３ − ＬＣ／Ｃ−ノシセプチン−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の精製）
実施例９に示した方法を用いて、大腸菌BL21細胞からＬＣ／Ｃ−ノシセプチン−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質を精製した。簡潔にいえば、細胞破壊後に得た可溶性産物をニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Ｘａ因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを除去し、次いで第２のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS-PAGE（パネルＡ）およびウェスタンブロッティング（パネルＢ）によって評価した。抗ノシセプチン抗血清（Abcamから入手）をウェスタンブロッティングの一次抗体として使用した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物を、それぞれ［−］および［＋］で記したレーン中に同定する。
（図４ − ＬＣ／Ａ−ｍｅｔエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製）
実施例９に示した方法を用いて、大腸菌BL21細胞からＬＣ／Ａ−ｍｅｔエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質を精製した。簡潔にいえば、細胞破壊後に得た可溶性産物をニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Ｘａ因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを除去し、次いで第２のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS-PAGEによって評価した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物を、それぞれ［−］および［＋］で記したレーン中に同定する。
（図５ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質とノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質との結合効力の比較）
ノシセプチン融合物がＯＲＬ１レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、１ｎＭの［３Ｈ］−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射性標識リガンドの特異的結合の減少をシンチレーション計数によって評価し、そして非標識リガンド（Tocrisノシセプチン）の効力と比較してプロットした。ＯＲＬ１レセプターとの相互作用は、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物が、ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合物よりもずっと優れることが明らかである。
（図６ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ触媒活性）
精製ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロエンドペプチダーゼ活性を、本質的には、Chaddockら, 2002, Prot. Express Purif. 25, 219-228に記載されるようにして決定した。簡潔にいえば、ELISAプレートに固定化したＳＮＡＰ−２５ペプチドを、種々の濃度の融合タンパク質に３７℃にて１時間曝露した。一連の洗浄後、切断されたＳＮＡＰ−２５ペプチドの量を、特異的抗血清との反応性によって定量した。
（図７ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製）
実施例９に示した方法を用いて、大腸菌BL21細胞からＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質を精製した。簡潔にいえば、細胞破壊後に得た可溶性産物をニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Ｘａ因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを除去し、次いで第２のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS-PAGEによって評価した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物を、それぞれ［−］および［＋］で記したレーン中に同定する。
（図８ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質とＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質との結合効力の比較）
ノシセプチン融合物がＯＲＬ１レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、１ｎＭの［３Ｈ］−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射性標識リガンドの特異的結合の減少をシンチレーション計数によって評価し、そして非標識リガンド（Tocrisノシセプチン）の効力に比較してプロットした。ＯＲＬ１レセプターとの相互作用は、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮｖ−ＬＨＡ）が、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮ−ＬＨＡ）よりも優れることが明らかである。
（図９ − 可変スペーサー長産物を有する発現／精製ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質ファミリー）
実施例９に示した方法を用いて、大腸菌細胞ペーストから、ＧＳ１０、ＧＳ３０およびＨＸ２７からなるＬＣ／Ａ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ａ融合物の改変体を精製する。ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１０）−ＨＮ／Ａ、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１５）−ＨＮ／Ａ、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ２５）−ＨＮ／Ａ、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ３０）−ＨＮ／ＡおよびＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＨＸ２７）−ＨＮ／Ａの精製からの試料を、クマシーブルーで染色する前にSDS-PAGEにより評価した。この電気泳動プロフィールは、ＣＰＢＥ−Ａの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。上のパネル：Ｍ＝分子量マーカー標線；Ｓ＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；ＦＴ＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースカラムに結合しなかったタンパク質；融合物＝イミダゾールの添加により溶出された融合タンパク質。下のパネル：レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン３＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物；レーン４＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの最終捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン５＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物（５μｌ）；レーン６＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物（１０μｌ）；レーン７＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物（２０μｌ）；レーン８＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（５μｌ）；レーン９＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（１０μｌ）；レーン１０＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（２０μｌ）。
（図１０ − ＣＰＮ−ＡによるＳＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断）
簡潔にいえば、背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＮ−Ａに２４時間曝露した。細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合をデンシトメトリー分析によって算定し、そして融合物濃度に対してプロットした（破線）。また、材料を回収して、特異的ＥＩＡキットを用いるサブスタンスＰ含量の分析を行った。サブスタンスＰ放出の阻害を、実線にて示す。５０％最大ＳＮＡＰ−２５切断に達するのに必要な融合物濃度は、6.30±2.48nMであると概算される。
（図１１ − ＣＰＮ−ＡへのＤＲＧの曝露後長期間にわたるＳＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断）
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＮ−Ａに２４時間曝露した。ボツリヌス菌神経毒素（ＢｏＮＴ／Ａ）をコントロールとして使用した。この初期曝露後、細胞外物質を洗浄によって除去し、そして細胞を種々の期間にわたって３７℃にてインキュベートした。特定の時点で、細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合をデンシトメトリー分析によって算定し、破線にて示した。また、材料を回収して、特異的ＥＩＡキットを用いるサブスタンスＰ含量の分析を行った。サブスタンスＰ放出の阻害を、実線にて示す。
（図１２ − ＣＰＮｖ−ＡによるＳＮＡＰ−２５の切断）
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＮｖ−Ａに２４時間曝露した。細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合をデンシトメトリー分析によって算定した。５０％最大ＳＮＡＰ−２５切断に達するのに必要な融合物濃度は、1.38±0.36nMであると概算される。
（図１３ − ＣＰＮｖ−ＡへのＤＲＧの曝露後長期間にわたるＳＮＡＰ−２５の切断）
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＮｖ−Ａに２４時間曝露した。ＣＰＮ−Ａをコントロールとして使用した。この初期曝露後、細胞外物質を洗浄によって除去し、そして細胞を種々の期間にわたって３７℃にてインキュベートした。特定の時点で、細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合をデンシトメトリー分析によって算定した。
（図１４ − ［３Ｈ］−ノシセプチン結合のＣＰＮｖ−Ａ融合物媒介置換）
ノシセプチン融合物がＯＲＬ１レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、１ｎＭの［３Ｈ］−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射性標識リガンドの特異的結合の減少をシンチレーション計数によって評価し、そして非標識リガンド（Tocrisノシセプチン）の効力と比較してプロットした。ＯＲＬ１レセプターとの相互作用は、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮｖ−ＬＨｎＡと示す）が、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮ−ＬＨｎＡと示す）よりも優れることが明らかである。
（図１５ − 発現／精製ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａ産物）
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン３＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物；レーン４＝エンテロキナーゼでの活性化後の精製最終物（５μｌ）；レーン５＝エンテロキナーゼでの活性化後の精製最終物（１０μｌ）；レーン６＝エンテロキナーゼでの活性化後の精製最終物（２０μｌ）；レーン７＝エンテロキナーゼでの活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（５μｌ）；レーン８＝エンテロキナーゼでの活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（１０μｌ）；レーン９＝エンテロキナーゼでの活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（２０μｌ）。
（図１６ − ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−ＡによるＳＮＡＰ−２５の切断）
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａに２４時間曝露した。細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合をデンシトメトリー分析によって算定した。実施例９において調製したＣＰＮｖ−Ａを比較目的に使用した。ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａ（Ｅｎ活性化と示す）およびＣＰＮｖ−Ａ（Ｘａ活性化と示す）によるＳＮＡＰ−２５の切断割合を示す。
（図１７ − 発現／精製ＣＰＮｖ−Ｃ産物）
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、ＣＰＮｖ−Ｃの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン３＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物；レーン４＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの最終捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン５＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの第２の捕捉後の精製物；レーン６＝最終精製物；レーン７＝最終精製物＋ＤＴＴ；レーン８＝分子量マーカー標線。
（図１８ − ＣＰＮｖ−Ｃによるシンタキシンの切断）
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＮｖ−Ａに２４時間曝露した。細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗シンタキシンでプローブしてシンタキシン切断の評価を容易にした。切断されたシンタキシンの割合をデンシトメトリー分析によって算定した。５０％最大シンタキシン切断に達するのに必要な融合物濃度は、3.13±1.96nMであると概算される。
（図１９ − 急性カプサイシン誘発機械的異痛モデルにおけるＣＰＮ−Ａ効力）
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮ／Ａ）がカプサイシン誘発機械的異痛を抑制する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注入により評価した。試験動物を、研究に参加させる前（処置前）；ＣＰＮ／Ａでの皮下足底内処置後カプサイシン投与前（ＣＡＰ前）；およびＣＰＮ／Ａの注射後カプサイシン追加投与後（１５分および３０分での応答の平均；ＣＡＰ）に、１０ｇのVon Freyフィラメントによる一連の刺激（１０刺激×３試行）に応じた足逃避率（ＰＷＦ％）について評価した。カプサイシン追加投与を１０μＬの０．３％溶液の注射によって行った。試料希釈液を０．５％ＢＳＡ／生理食塩水中で調製した。
（図２０ − ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発末梢糖尿病性神経障害（神経因性疼痛）モデルにおけるＣＰＮ−Ａ効力）
Sprague-Dawley雄ラット（250〜300g）をクエン酸緩衝液中65mg/kgのSTZで（静脈内）処置し、そして毎週、血中のグルコースおよび脂質濃度を測定して、モデルの準備ができていることを確認する。足逃避閾値（ＰＷＴ）を所定の期間にわたりVon Freyフィラメントによる一連の刺激に応じて測定する。異痛は、２つの連続した試験日（１週間空ける）でのＰＷＴがスケールで６ｇを下回って測定された場合に確立されるとする。この時点で、ラットを生理食塩水群（陰性効力コントロール）、ガバペンチン群（陽性効力コントロール）または試験群（ＣＰＮ／Ａ）に無作為に振り分ける。試験物質（２０〜２５μｌ）を１回の注射で皮下注入し（ガバペンチンを除く）、ＰＷＴを処置後１日目およびその後２週間にわたって定期的に測定する。ガバペンチン（３ｍｌ／ｋｇ注入容量で３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）は、毎日、ＰＷＴ試験開始の２時間前に注射する。
（図２１ − 急性カプサイシン誘発機械的異痛モデルにおけるＣＰＮｖ−Ａ効力）
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮｖ／Ａ）がカプサイシン誘発機械的異痛を抑制する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注入により評価した。試験動物を、研究に参加させる前（処置前）；ＣＰＮｖ／Ａでの皮下足底内処置後カプサイシン投与前（ＣＡＰ前）；およびＣＰＮｖ／Ａの注射後カプサイシン追加投与後（１５分および３０分での応答の平均；ＣＡＰ）の１０ｇのVon Freyフィラメントによる一連の刺激（１０刺激×３試行）に応じた足逃避率（ＰＷＦ％）について評価した。カプサイシン追加投与を１０μＬの０．３％溶液の注射によって行った。試料希釈液を０．５％ＢＳＡ／生理食塩水中で調製した。これらのデータを、正規化足逃避率差として表し、これは、ピーク応答（カプサイシン後）とベースライン応答（カプサイシン前）との間の差を百分率にて示す。この分析にて、ＣＰＮｖ／Ａは、ＣＰＮ／Ａよりも強力であることが理解され得る。これは、ＣＰＮｖ／Ａでは、ＣＰＮ／Ａで見られるのと同様の鎮痛効果を生じるのに必要とする投薬量が、より少ないからである。
（図２２ − 発現／精製ＬＣ／Ａ−ＣＰＬＥ−ＨＮ／Ａ産物）
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、ＣＰＬＥ−Ａの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン３＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物；レーン４＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの最終捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン５＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの第２の捕捉後の精製物；レーン６＝最終精製物；レーン７＝最終精製物＋ＤＴＴ。
（図２３ − 発現／精製ＬＣ／Ａ−ＣＰＢＥ−ＨＮ／Ａ産物）
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、ＣＰＢＥ−Ａの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン２＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物；レーン３＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの最終捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン４＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物（５μｌ）；レーン５＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物（１０μｌ）；レーン６＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物（２０μｌ）；レーン７＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（５μｌ）；レーン８＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（１０μｌ）；レーン９＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（２０μｌ）；レーン１０＝分子量マーカー標線。
（図２４ − 発現／精製ＣＰＯＰ−Ａ産物）
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、ＣＰＯＰ−Ａの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物；レーン３＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの最終捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン４＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの第二の捕捉後の精製物；レーン５＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物（５μｌ）；レーン６＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物（１０μｌ）；レーン７＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物（２０μｌ）；レーン８＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（５μｌ）；レーン９＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（１０μｌ）；レーン１０＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（２０μｌ）。
（図２５ − 発現／精製ＣＰＯＰｖ−Ａ産物）
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、ＣＰＯＰｖ−Ａの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン３＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの初期捕捉後の精製物；レーン４＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの最終捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン５＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物（５μｌ）；レーン６＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物（１０μｌ）；レーン７＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物（２０μｌ）；レーン８＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（５μｌ）；レーン９＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（１０μｌ）；レーン１０＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ（２０μｌ）。
（図２６ − ＤＲＧ細胞モデルにおけるインビトロＳＮＡＰ−２５切断）
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＯＰｖ−Ａに２４時間曝露した。細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合をデンシトメトリー分析によって算定した。
（図２７ − 発現／精製ＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴ（取り外し可能ｈｉｓタグ））
タンパク質をSDS-PAGEに供した後、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、ＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン３＝Ｎｉ２＋−荷電セファロースの最終捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン４＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物；レーン５＝第Ｘａ因子での活性化後の精製最終物＋ＤＴＴ。
（図２８ − リガンド競合アッセイにより評価した可変スペーサー長を有するＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ効力）
可変スペーサー長のＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物がＯＲＬ１レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、１ｎＭの［３Ｈ］−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射性標識リガンドの特異的結合の減少をシンチレーション計数によって評価し、そして非標識リガンド（Tocrisノシセプチン）の効力と比較してプロットした。上のパネルは、ＧＳ０、ＧＳ２０、ＧＳ３０およびＨｘ２７のスペーサーの置換の特徴を示している。一方、下のパネルは、ＧＳ１０、ＧＳ１５、およびＧＳ２５のスペーサーによる融合タンパク質により得られる置換を示している。ＯＲＬ１レセプターからノシセプチンを置き換えるのに、ＧＳ０およびＧＳ３０スペーサーは有効でなく、そしてＧＳ１０は有効性に乏しいと結論される。
（図２９ − インビトロＳＮＡＰ−２５切断により評価した可変スペーサー長を有するＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ効力）
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度の（可変スペーサー長の）ＣＰＮ−Ａに２４時間曝露した。細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合をデンシトメトリー分析によって算定した。ＧＳ１０スペーサーによる融合タンパク質の結合特性の効力が乏しいこと（図２８を参照のこと）は、細胞内ＳＮＡＰ−２５の切断を生じるのに必要とされる融合物の濃度がより高いことにおいて反映されている。ＧＳ０およびＧＳ３０のスペーサーによる融合タンパク質は、完全に有効でなかった（データは示さず）。ＧＳ１５、ＧＳ２０、およびＧＳ２５のスペーサーによる融合タンパク質は、同様に有効であった。
（配列番号）
配列番号１ ＬＣ／ＡのＤＮＡ配列
配列番号２ ＨＮ／ＡのＤＮＡ配列
配列番号３ ＬＣ／ＢのＤＮＡ配列
配列番号４ ＨＮ／ＢのＤＮＡ配列
配列番号５ ＬＣ／ＣのＤＮＡ配列
配列番号６ ＨＮ／ＣのＤＮＡ配列
配列番号７ ＣＰＮ−ＡリンカーのＤＮＡ配列
配列番号８ ＡリンカーのＤＮＡ配列
配列番号９ Ｎ末端側提示ノシセプチン挿入片のＤＮＡ配列
配列番号１０ ＣＰＮ−ＣリンカーのＤＮＡ配列
配列番号１１ ＣＰＢＥ−ＡリンカーのＤＮＡ配列
配列番号１２ ＣＰＮｖａｒ−ＡリンカーのＤＮＡ配列
配列番号１３ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号１４ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号１５ Ｎ−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号１６ Ｎ−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号１７ ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ｃ融合物のＤＮＡ配列
配列番号１８ ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ｃ融合物のタンパク質配列
配列番号１９ ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ｃ（Ａリンカー）融合物のＤＮＡ配列
配列番号２０ ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ｃ（Ａリンカー）融合物のタンパク質配列
配列番号２１ ＬＣ／Ａ−ＣＰＭＥ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号２２ ＬＣ／Ａ−ＣＰＭＥ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号２３ ＬＣ／Ａ−ＣＰＢＥ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号２４ ＬＣ／Ａ−ＣＰＢＥ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号２５ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号２６ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号２７ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［１−１１］−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号２８ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［１−１１］−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号２９ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［［Ｙ１０］１−１１］−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号３０ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［［Ｙ１０］１−１１］−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号３１ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［［Ｙ１１］１−１１］−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号３２ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［［Ｙ１１］１−１１］−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号３３ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［［Ｙ１４］１−１７］−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号３４ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［［Ｙ１４］１−１７］−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号３５ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［１−１３］−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号３６ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［１−１３］−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号３７ ＣＰＮ［１−１７］のＤＮＡ配列
配列番号３８ ＣＰＮ［１−１７］のタンパク質配列
配列番号３９ ＣＰＮ［１−１１］のＤＮＡ配列
配列番号４０ ＣＰＮ［１−１１］のタンパク質配列
配列番号４１ ＣＰＮ［［Ｙ１０］１−１１］のＤＮＡ配列
配列番号４２ ＣＰＮ［［Ｙ１０］１−１１］のタンパク質配列
配列番号４３ ＣＰＮ［［Ｙ１１］１−１１］のＤＮＡ配列
配列番号４４ ＣＰＮ［［Ｙ１１］１−１１］のタンパク質配列
配列番号４５ ＣＰＮ［［Ｙ１４］１−１７］のＤＮＡ配列
配列番号４６ ＣＰＮ［［Ｙ１４］１−１７］のタンパク質配列
配列番号４７ ＣＰＮ［１−１３］のＤＮＡ配列
配列番号４８ ＣＰＮ［１−１３］のタンパク質配列
配列番号４９ ＣＰＮｖ（Ｎ［［Ｒ１４Ｋ１５］１−１７］としても公知）のＤＮＡ配列
配列番号５０ ＣＰＮｖ（Ｎ［［Ｒ１４Ｋ１５］１−１７］としても公知）のタンパク質配列
配列番号５１ ノシセプチン−スペーサー−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号５２ ノシセプチン−スペーサー−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号５３ ＣＰＮ−Ａ ＧＳ１０リンカーのＤＮＡ配列
配列番号５４ ＣＰＮ−Ａ ＧＳ１５リンカーのＤＮＡ配列
配列番号５５ ＣＰＮ−Ａ ＧＳ２５リンカーのＤＮＡ配列
配列番号５６ ＣＰＮ−Ａ ＧＳ３０リンカーのＤＮＡ配列
配列番号５７ ＣＰＮ−Ａ ＨＸ２７リンカーのＤＮＡ配列
配列番号５８ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１５）−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号５９ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１５）−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号６０ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ２５）−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号６１ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ２５）−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号６２ ＣＰＮｖａｒ−Ａエンテロキナーゼ活性化リンカーのＤＮＡ配列
配列番号６３ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号６４ ＬＣ／Ａ−ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号６５ ＣＰＮｖａｒ−ＡリンカーのＤＮＡ配列
配列番号６６ ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ｃ融合物（ａｃｔ．Ａ）のＤＮＡ配列
配列番号６７ ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ｃ融合物（ａｃｔ．Ａ）のタンパク質配列
配列番号６８ ＬＣ／Ａ−ＣＰＬＥ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号６９ ＬＣ／Ａ−ＣＰＬＥ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号７０ ＬＣ／Ａ−ＣＰＯＰ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号７１ ＬＣ／Ａ−ＣＰＯＰ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号７２ ＬＣ／Ａ−ＣＰＯＰｖ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号７３ ＬＣ／Ａ−ＣＰＯＰｖ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号７４ ＩｇＡプロテアーゼのＤＮＡ配列
配列番号７５ ＩｇＡ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号７６ ＩｇＡ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号７７ ＦＸａ−ＨＴのＤＮＡ配列
配列番号７８ ＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴのＤＮＡ配列
配列番号７９ ＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴ融合物のタンパク質配列
配列番号８０ ＤＴトランスロケーションドメインのＤＮＡ配列
配列番号８１ ＣＰＬＥ−ＤＴ−ＡのＤＮＡ配列
配列番号８２ ＣＰＬＥ−ＤＴ−Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号８３ ＴｅＮＴ ＬＣのＤＮＡ配列
配列番号８４ ＣＰＮｖ−ＴｅＮＴ ＬＣのＤＮＡ配列
配列番号８５ ＣＰＮｖ−ＴｅＮＴ ＬＣ融合物のタンパク質配列
配列番号８６ ＣＰＮｖａｒ−ＣリンカーのＤＮＡ配列
配列番号８７ ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ｃ融合物（ａｃｔ．Ｃ）のＤＮＡ配列
配列番号８８ ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ｃ融合物（ａｃｔ．Ｃ）のタンパク質配列
（実施例１ − ＬＣ／ＡおよびＨＮ／Ａバックボーンクローンの調製）
以下の手順によって、マルチドメイン融合物発現用の構成部分バックボーンとして使用するためのＬＣおよびＨＮフラグメントを作製する。本実施例は、血清型Ａベースのクローン（配列番号１および配列番号２）の調製に基づいているが、手順および方法は他の血清型にも同等に適用可能である［血清型Ｂ（配列番号３および配列番号４）ならびに血清型Ｃ（配列番号５および配列番号６）については配列表に図示］。
（クローニングベクターおよび発現ベクターの調製）
pCR 4（Invitrogen）は、構築物の確認を容易にするために、ベクター内の制限配列の欠損および隣接する配列決定プライマー部位によって選択した、選り抜きの標準的なクローニングベクターである。この発現ベクターは、pMAL（NEB）発現ベクターに基づいており、これは、構築物の挿入のために正しい方向でマルチプルクローニング部位内に所望の制限配列を有する（BamHI-SalI-PstI-HindIII）。非動員性プラスミドを作製するため、発現ベクターのフラグメントが除去されており、そして精製の選択肢を増大させるため、種々の異なる融合タグが挿入されている。
（プロテアーゼ（例えば、ＬＣ／Ａ）挿入片の調製）
ＬＣ／Ａ（配列番号１）を、二通りの方法の一方によって作製する：
ＤＮＡ配列を、［種々の逆翻訳ソフトウェアツール（例えば、EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon)）の１つを用いて、GenBank（アクセッション番号P10845）またはSwissprot（アクセッション位置BXA1_CLOBO）のような自由に利用可能なデータベースソースから得られる］ＬＣ／Ａアミノ酸配列の逆翻訳によって設計する。BamHI／SalI認識配列を、配列の５’末端および３’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み取り枠を維持する。ＤＮＡ配列を、逆翻訳の間に組み込んだ制限酵素切断配列について（MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウェアを用いて）スクリーニングする。クローニング系によって必要とされる配列と共通であることが見出されている切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser (Geneart)のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年９月13日）を参照することによって評価する。次いで、ＬＣ／Ａオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するこの最適化したＤＮＡ配列は商業的に合成され（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
別の方法は、それぞれ５’および３’のＰＣＲプライマーに組み込んだBamHI制限酵素配列およびSalI制限酵素配列を用いる既存ＤＮＡ配列からのＰＣＲ増幅を使用することである。相補的オリゴヌクレオチドプライマーは、製造業者（例えば、MWGまたはSigma-Genosys）によって、各対が、クロストリジウム標的ＤＮＡの範囲（ストレッチ）に隣接する向かい合った鎖に対して、これらの２つのＤＮＡ鎖の各々に１つのオリゴヌクレオチドを（互いに「向かって」３’末端の向きに）ハイブリダイズする能力を有するように、化学合成される。ＰＣＲ産物を生成するために、クロストリジウムＤＮＡ配列に特異的な短いオリゴヌクレオチドプライマーの対を、クロストリジウムＤＮＡ鋳型および他の反応成分と混合し、そして反応チューブのインキュベーション温度を自動変更し得る機器（「ＰＣＲ機器」）中に配置し、約９４℃（変性用）、５５℃（オリゴヌクレオチドアニーリング用）、および７２℃（合成用）のサイクルにかける。ＰＣＲ産物の増幅に必要な他の試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、TaqまたはPfuポリメラーゼ）、ＤＮＡの４つのヌクレオチドｄＮＴＰ構築ブロックの等モル量（50〜200μM）の各々、およびMg2+濃度（0.5〜5mM）に最適化した酵素に適した緩衝液が含まれる。
増幅産物を、Taq PCR産物に対してTOPO TAクローニングまたはPfu PCR産物に対してZero Blunt TOPOクローニング（両キットともInvitrogenより市販されている）のいずれかを用いて、pCR 4にクローニングする。得られたクローンを配列決定により確認する。次いで、クローニング系と適合可能でない付加制限配列を、部位特異的変異誘発を用いて［例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて］取り除く。
（トランスロケーション（例えばＨＮ）挿入片の調製）
ＨＮ／Ａ（配列番号２）を、二通りの方法の一方によって作製する：
ＤＮＡ配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール［例えば、EditSeq best E. coli reverse translation（DNASTAR Inc.）またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon)］の１つを用いて、［GenBank（アクセッション番号P10845）またはSwissprot（アクセッション位置BXA1_CLOBO）のような自由に利用可能なデータベースソースから得られる］ＨＮ／Ａアミノ酸配列の逆翻訳によって設計する。Ｎ末端にPstI制限配列を、そしてＣ末端にXbaI−停止コドン−HindIIIを付加し、正しい読み取り枠を維持するようにする。ＤＮＡ配列を、逆翻訳の間に組み込んだ制限酵素切断配列について（MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウェアを用いて）スクリーニングする。クローニング系によって必要とされる配列と共通であることが見出されている配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年９月13日）を参照することによって評価する。次いで、この最適化したＤＮＡ配列は商業的に合成され（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
別の方法は、それぞれ５’および３’のＰＣＲプライマーに組み込んだPstI制限酵素配列およびXbaI−停止コドン−HindIII制限酵素配列を用いる既存ＤＮＡ配列からのＰＣＲ増幅を使用することである。ＰＣＲ増幅は、上記のように行う。このＰＣＲ産物をpCR 4ベクターに挿入し、そして配列決定によって確認する。次いで、クローニング系と適合可能でない付加制限配列を、部位特異的変異誘発を用いて［例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて］取り除く。
（実施例２ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製）（ノシセプチンがＨＮ鎖のＮ末端側にある）
（リンカー−ノシセプチン−スペーサー挿入片の調製）
ＬＣ−ＨＮリンカーを、リンカーについての既存配列情報を鋳型として用いて、第一の原則から設計し得る。例えば、血清型Ａリンカー（この場合、ＬＣとＨＮとの間のジスルフィド架橋のシステイン間に存在するドメイン間ポリペプチド領域として定義される）は、２３アミノ酸長であり、そして配列ＶＲＧＩＩＴＳＫＴＫＳＬＤＫＧＹＮＫＡＬＮＤＬを有する。この配列内で、天然でのタンパク質分解による活性化により、配列ＡＬＮＤＬのＮ末端を有するＨＮドメインが生じると理解される。この配列情報は、GenBank（アクセッション番号P10845）またはSwissprot（アクセッション位置BXA1_CLOBO）のような利用可能なデータベースソースから自由に入手可能である。このリンカーに、第Ｘａ因子部位、ノシセプチンおよびスペーサーを組み込み、そして種々の逆翻訳ソフトウェアツール［例えば、EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon)］の１つを用いて、リンカー−リガンド−スペーサー領域をコードするＤＮＡ配列を決定する。次いで、制限部位をこのＤＮＡ配列に組み込み、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号７）として配置させ得る。スペーサー、ノシセプチン、および制限配列について正しい読み枠を維持し、そしてＤＡＭメチル化を生じ得るので塩基ＴＣがXbaI配列の前にならないようにすることが重要である。このＤＮＡ配列を、制限配列の組み込みについてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年９月13日）を参照することによって評価する。次いで、この最適化したＤＮＡ配列は商業的に合成され（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
（ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物の調製）
ＬＣ−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−ＨＮ構築物（配列番号１３）を作製するために、リンカー（配列番号７）をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、BamHIおよびSalIで切断したＬＣ／ＡのＤＮＡ（配列番号１）の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡをPstIおよびXbaI制限酵素で切断し、そしてPstIおよびXbaIで切断したＨＮ／ＡのＤＮＡ（配列番号２）の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ（配列番号１３）を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号１４に示される配列の融合タンパク質が発現される。
（実施例３ − ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製）（ノシセプチンがＬＣ鎖のＮ末端側にある）
ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａバックボーンを、活性化のために第Ｘａ因子部位を付加し、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−リンカー−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号８）として配置された合成血清型Ａリンカーを用いて、実施例２に記載のように構築する。ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａバックボーンおよび合成したＮ末端側提示ノシセプチン挿入片（配列番号９）を、BamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、ゲル精製し、そして一緒に連結してノシセプチン−スペーサー−ＬＣ−リンカー−ＨＮを作製する。次いで、ORF（配列番号１５）を制限酵素AvaIおよびXbaIを用いて切断し、これを、発現ベクターに移入して、配列番号１６に示される配列の融合タンパク質が発現される。
（実施例４ − ＬＣ／Ｃ−ノシセプチン−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製）
実施例１および２で使用した方法に従って、ＬＣ／Ｃ（配列番号５）およびＨＮ／Ｃ（配列番号６）を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号１０）として配置された血清型Ｃリンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ（配列番号１７）を含んでおり、これは、配列番号１８に示される配列のタンパク質を発現する。
（実施例５ − 血清型Ａ活性化配列を伴うＬＣ／Ｃ−ノシセプチン−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製）
実施例１および２で使用した方法に従って、ＬＣ／Ｃ（配列番号５）およびＨＮ／Ｃ（配列番号６）を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号７）として配置された血清型Ａリンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ（配列番号１９）を含んでおり、これは、配列番号２０に示される配列のタンパク質を発現する。
（実施例６ − ＬＣ／Ａ−ｍｅｔエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製）
ｍｅｔエンケファリンリガンドのサイズが小さい（５アミノ酸）ため、ＬＣ／Ａ−ｍｅｔエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合物を、鋳型としてＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号１３）を用いる部位特異的変異誘発［例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて］によって作製する。ＹＧＧＦＭ ｍｅｔエンケファリンペプチドをコードし、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号１３）のリンカー領域に相補的な配列が隣接されるようにするオリゴヌクレオチドを設計する。ＳＤＭ産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ｍｅｔエンケファリン−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ（配列番号２１）を含んでおり、これは、配列番号２２に示される配列のタンパク質を発現する。
（実施例７ − ＬＣ／Ａ−βエンドルフィン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製）
実施例１および２で使用した方法に従って、ＬＣ／Ａ（配列番号１）およびＨＮ／Ａ（配列番号２）を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−βエンドルフィン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号１１）として配置された血清型Ａ βエンドルフィンリンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−βエンドルフィン−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ（配列番号２３）を含んでおり、これは、配列番号２４に示される配列のタンパク質を発現する。
（実施例８ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製）
実施例１および２で使用した方法に従って、ＬＣ／Ａ（配列番号１）およびＨＮ／Ａ（配列番号２）を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号１２）として配置された血清型Ａノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ（配列番号２５）を含んでおり、これは、配列番号２６に示される配列のタンパク質を発現する。
（実施例９ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製法）
25ml 50mM HEPES（pH 7.2）、200mM NaClおよび約10gの大腸菌BL21細胞ペーストを含むファルコン管を解凍する。この融解した細胞ペーストを50mM HEPES（pH 7.2）、200mM NaClで80mlまでにし、そして氷上にて、22ミクロンのパワーで30秒間オン、30秒間オフを１０サイクルで超音波処理し、試料を冷却したままにする。溶解した細胞を18000rpmで4℃にて30分間遠心分離する。この上清を、50mM HEPES（pH 7.2）、200mM NaClで平衡化しておいた0.1M NiSO4荷電キレートカラム（20〜30mlカラムが十分である）に流す。10mMおよび40mMのイミダゾールのステップグラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を100mMイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を5Lの50mM HEPES（pH 7.2）、200mM NaClに対して４℃にて終夜透析し、そして透析した融合タンパク質のODを測定する。100μg融合タンパク質当たり１単位の第Xa因子を添加し、そして２５℃にて終夜静置インキュベートする。50mM HEPES（pH 7.2）、200mM NaClで平衡化しておいた0.1M NiSO4荷電キレートカラム（20〜30mlカラムが十分である）に流す。50mM HEPES（pH 7.2）、200mM NaClでベースラインまでカラムを洗浄する。10mMおよび40mMのイミダゾールのステップグラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を100mMイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を5Lの50mM HEPES（pH 7.2）、200mM NaClに対して４℃にて終夜透析し、そしてこの融合物を約2mg/mlに濃縮し、試料を小分けし、そして−20℃にて凍結する。OD、BCA、純度分析、およびＳＮＡＰ−２５評価を用いて精製タンパク質を試験する。
（実施例１０ − 神経細胞培養物からのサブスタンスＰの放出の測定によるＴＭアゴニスト活性の確認）
（材料）
サブスタンスＰ EIAはR&D Systems, UKから入手。
（方法）
ｅＤＲＧの初代神経細胞培養物を、既述（Dugganら, 2002）のようにして樹立させる。この培養物からのサブスタンスＰ放出を、本質的には、既述（Dugganら, 2002）のようにして、ＥＩＡによって評価する。目的のＴＭを（処理前に少なくとも２週間の間樹立させた）神経細胞培養物に添加する；ＴＭの代わりにビヒクルを添加することにより、コントロール培養を並行して行う。全細胞溶解物含量と共に、サブスタンスＰの刺激された（100mM KCl）放出および基底の放出を、コントロール培養およびＴＭ処理培養の両方について得る。サブスタンスＰ免疫反応性を、サブスタンスＰ酵素免疫アッセイキット（Cayman Chemical Company, USAまたはR&D Systems, UK）を製造者の指示書に従って用いて測定する。
目的のＴＭの存在下での神経細胞により放出されたサブスタンスＰの量を、100mM KClの存在または不在下で得られる放出と比較する。基底放出を上回る目的のＴＭによるサブスタンスＰ放出の刺激によって、目的のＴＭが本明細書中で定義した「アゴニストリガンド」であることが確立される。所望の場合、目的のＴＭによるサブスタンスＰ放出の刺激を、天然のＯＲＬ−１レセプターリガンドであるノシセプチン（Tocris）を用いて作成した標準サブスタンスＰ放出曲線と比較し得る。
（実施例１１ − フォルスコリン刺激ｃＡＭＰ生産の測定によるＯＲＬ１レセプター活性化の確認）
所与のＴＭがＯＲＬ１レセプターを介して作用することの確認は、以下の試験によって提供される。ここでは、ＴＭがフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ生産を阻害する能力を評価する。
（材料）
［３Ｈ］アデニンおよび［１４Ｃ］ｃＡＭＰはGE Healthcareから入手。
（方法）
この試験は、本質的には、Meunierら［Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature 377: 532-535, 1995］によって既述されるようにして、２４ウェルプラスチックプレート上に播種した無傷のトランスフェクトＣＨＯ細胞において行う。
細胞に、0.4mlの培養培地中で［３Ｈ］アデニン（1.0μCi）を添加する。細胞を３７℃にて２時間静置して細胞内ＡＴＰプールにアデニンを取り込ませる。２時間後、細胞を、以下を含有するインキュベーション緩衝液で１回洗浄する：130mM NaCl、4.8mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.3mM CaCl2、1.2mM MgSO4、10mMグルコース、1mg/ml ウシ血清アルブミン、および25mM HEPES pH 7.4。そしてこれを、目的のＴＭを含むまたは含まない、フォルスコリン（10μM）およびイソブチルメチルキサンチン（50μM）を含有する緩衝液と置き換える。１０分後、培地を吸引して0.5mlの0.2M HClと置き換える。約1000cpmの［１４Ｃ］ｃＡＭＰを各ウェルに添加し、これを内部標準として使用する。次いで、ウェルの中身を0.65g乾燥アルミナ粉末のカラムに移す。カラムを4mlの5mM HCl、0.5mlの0.1M酢酸アンモニウム、次いでさらに2mlの酢酸アンモニウムで溶出する。最終溶出物をシンチレーションバイアルに集めて１４Ｃおよびトリチウムについて計数する。集めた量を［１４Ｃ］ｃＡＭＰの回収率に対して補正する。ＯＲＬ１レセプターでアゴニストであるＴＭは、フォルスコリンに応じて生産されるｃＡＭＰのレベルの減少を引き起こす。
（実施例１２ − ＧＴＰγＳ結合機能アッセイを用いるＯＲＬ１レセプター活性化の確認）
所与のＴＭがＯＲＬ１レセプターを介して作用することの確認は、以下の試験、ＧＴＰγＳ結合機能アッセイによっても提供される。
（材料）
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳはGE Healthcareから入手。
小麦胚凝集素コーティング（ＳＰＡ）ビーズはGE Healthcareから入手。
（方法）
このアッセイは、本質的には、TraynorおよびNahorski［Modulation by μ-opioid agonists of guanosine-5-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47: 848-854, 1995］によって記載されるようにして行う。
細胞を、組織培養皿からかき取って20mM HEPES、1mM エチレンジアミン四酢酸に入れ、次いで500×gで１０分間遠心分離する。細胞をこの緩衝液に再懸濁してPolytron Homogenizerでホモジナイズする。
ホモジネートを27,000×gで１５分間遠心分離し、そしてペレットを緩衝液Ａ（20mM HEPES、10mM MgCl2、100mM NaCl、pH 7.4を含有する）に再懸濁する。懸濁液を20,000×gで再度遠心分離し、もう一度緩衝液Ａに懸濁する。結合アッセイのために、膜（8〜15μgタンパク質）を、総容量1.0mlで目的のＴＭと共におよびそれなしで［３５Ｓ］ＧＴＰ Ｓ（50pM）、ＧＤＰ（10μM）と２５℃にて６０分間インキュベートする。試料をガラスファイバーフィルターで濾過し、結合アッセイについて記載したように計数する。
（実施例１３ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製）（ノシセプチンがＨＮ鎖のＮ末端側にある）
リンカー−ノシセプチン−スペーサー挿入片を、実施例２に記載のように調製する。
（ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物の調製）
ＬＣ−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−ＨＮ構築物（配列番号１３）を作製するために、リンカー（配列番号７）をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、同様にBamHIおよびSalIで切断したＬＣ／ＡのＤＮＡ（配列番号１）の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡをBamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてpMALベクター（ＮＥＢ）のようなBamHI、SalI、PstI、およびHindIIIに対する独自のマルチプルクローニング部位を含むベクターを同様に切断して、これにＬＣ／Ａ−リンカーフラグメントを挿入する。次いで、ＨＮ／ＡのＤＮＡ（配列番号２）をPstIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてこれを同様に切断したpMAL−ＬＣ／Ａ−リンカー構築物に挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ（配列番号１３）を含んでおり、これは、配列番号１４に示される配列のタンパク質を発現する。
（実施例１４ − ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製）（ノシセプチンがＬＣ鎖のＮ末端側にある）
ノシセプチン−スペーサー−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ構築物を作製するために、活性化のために第Ｘａ因子部位を付加した、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−リンカー−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号８）として配置された血清型Ａリンカーを、実施例１３に記載のように合成する。このリンカーをコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、同様にBamHIおよびSalIで切断したＬＣ／ＡのＤＮＡ（配列番号１）の挿入および連結用のレシピエントとして使用する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡをBamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、そして合成Ｎ末端提示ノシセプチン挿入片（配列番号９）を含む同様に切断したベクターにＬＣ／Ａ−リンカーフラグメントを挿入する。次いで、この構築物をAvaIおよびHindIIIで切断し、pMALプラスミド（ＮＥＢ）のような発現ベクターに挿入する。次いで、ＨＮ／Ａ ＤＮＡ（配列番号２）をPstIおよびHindIII制限酵素で切断し、そして同様に切断したpMAL−ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−リンカー構築物に挿入する。最終構築物は、ノシセプチン−スペーサー−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ ＯＲＦ（配列番号５１）を含んでおり、これは、配列番号５２に示される配列のタンパク質を発現する。
（実施例１５ − 可変スペーサー長を有するＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質ファミリーの調製および精製）
実施例２で用いたのと同じストラテジーを用いて、ノシセプチンおよび可変スペーサー内容をコードする種々のＤＮＡリンカーを調製した。種々の逆翻訳ソフトウェアツール［例えば、EditSeq best E. coli reverse translation（DNASTAR Inc.）またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon)］の１つを用いて、リンカー−リガンド−スペーサー領域をコードするＤＮＡ配列を決定する。次いで、制限部位をＤＮＡ配列に組み込み、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号５３から配列番号５７）として配置させ得る。スペーサー、ノシセプチン、および制限配列について正しい読み枠を維持し、そしてＤＡＭメチル化を生じ得るので塩基ＴＣがXbaI配列の前にならないようにすることが重要である。このＤＮＡ配列を、制限配列組み込みについてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年９月13日）を参照することによって評価する。次いで、この最適化したＤＮＡ配列は商業的に合成され（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
作製したスペーサーは、以下を含んだ：
Figure 0005174463
例示のために、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１５）−ＨＮ／Ａ融合構築物（配列番号５８）を作製するために、リンカー（配列番号５４）をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、同様にBamHIおよびSalIで切断したＬＣ／ＡのＤＮＡ（配列番号１）の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡをBamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてpMALベクター（ＮＥＢ）のようなBamHI、SalI、PstI、およびHindIIIに対する独自のマルチプルクローニング部位を含むベクターを同様に切断して、これにＬＣ／Ａ−リンカーフラグメントを挿入する。次いで、ＨＮ／ＡのＤＮＡ（配列番号２）をPstIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてこれを同様に切断したpMAL−ＬＣ／Ａ−リンカー構築物に挿入する。最終構築物は、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１５）−ＨＮ／Ａ ＯＲＦ（配列番号５８）を含んでおり、これは、配列番号５９に示される配列のタンパク質を発現する。
さらなる例として、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ２５）−ＨＮ／Ａ融合構築物（配列番号６０）を作製するために、リンカー（配列番号５５）をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、BamHIおよびSalIで切断したＬＣ／ＡのＤＮＡ（配列番号１）の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡをBamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてpMALベクター（ＮＥＢ）のようなBamHI、SalI、PstI、およびHindIIIに対する独自のマルチプルクローニング部位を含むベクターを同様に切断して、これにＬＣ／Ａ−リンカーフラグメントを挿入する。次いで、ＨＮ／ＡのＤＮＡ（配列番号２）をPstIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてこれを同様に切断したpMAL−ＬＣ／Ａ−リンカー構築物に挿入する。最終構築物は、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ２５）−ＨＮ／Ａ ＯＲＦ（配列番号６０）を含んでおり、これは、配列番号６１に示される配列のタンパク質を発現する。
ＧＳ１０、ＧＳ３０およびＨＸ２７からなるＬＣ／Ａ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ａ融合物の改変体も同様に作製する。実施例９に記載の精製法を用いて、融合タンパク質を大腸菌細胞ペーストから精製する。図９は、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１０）−ＨＮ／Ａ、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１５）−ＨＮ／Ａ、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ２５）−ＨＮ／Ａ、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ３０）−ＨＮ／ＡおよびＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＨＸ２７）−ＨＮ／Ａの場合に得られた精製産物を示している。
（実施例１６ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物のインビトロ効力の評価）
実施例２および９に従って調製した融合タンパク質をｅＤＲＧ神経細胞モデルにおいて評価した。
サブスタンスＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断に関するアッセイは、以前に報告されている（Dugganら, 2002, J. Biol. Chem., 277, 34846-34852）。簡潔にいえば、背根神経節神経細胞を１５日齢胎児Sprague-Dawleyラットから摘出し、そして解離した細胞を、Matrigelでコーティングされた２４ウェルプレート上に、１×１０６細胞／ウェルの密度で播種した。播種の１日後、細胞を10μM シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシドで４８時間処理する。細胞を、５％熱不活性化ウシ胎児血清、5mM Ｌ−グルタミン、０．６％ Ｄ−グルコース、２％ Ｂ２７補充物、および100ng/ml ２．５Ｓマウス神経成長因子を加えたダルベッコ最小必須培地中に維持する。試験物質を添加する前、培養物を９５％空気／５％ＣＯ２中に３７℃にて２週間維持する。
ｅＤＲＧからのサブスタンスＰの放出を酵素結合免疫吸着アッセイによって評価する。簡潔にいえば、ｅＤＲＧ細胞を低カリウム平衡塩類溶液（ＢＳＳ：5mM KCl、137mM NaCl、1.2mM MgCl2、5mMグルコース、0.44mM KH2PO4、20mM HEPES、pH 7.4、2mM CaCl2）で２回洗浄する。基本試料を、各ウェルを1mlの低カリウムＢＳＳと５分間インキュベートすることにより得る。この緩衝液を除去した後、1mlの高カリウム緩衝液（上記ＢＳＳに対して100mM KClを含む（NaClで等張平衡化）ように改変した）と５分間インキュベートすることにより、細胞を放出に対して刺激する。サブスタンスＰのアッセイ前に、全ての試料を氷上のチューブに移す。250μlの2M酢酸／0.1%トリフルオロ酢酸を添加して細胞を溶解し、遠心分離にてエバポレートし、そして500μlのアッセイ緩衝液に再懸濁することにより、全細胞溶解物を調製する。希釈した試料を、サブスタンスＰ含量について評価する。サブスタンスＰ免疫反応性を、サブスタンスＰ酵素免疫アッセイキット（Cayman Chemical CompanyまたはR&D Systems）を製造者の指示書に従って用いて測定する。サブスタンスＰは、並行して実行した標準サブスタンスＰ曲線に対してpg/mlで表す。
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を、標準プロトコル（Novex）を用いて実施した。ＳＮＡＰ−２５タンパク質を12％Tris／グリシンポリアクリルアミドゲル（Novex）上で分離し、引き続いてニトロセルロース膜に転写した。この膜を、切断されたＳＮＡＰ−２５および完全なＳＮＡＰ−２５を認識するモノクローナル抗体（ＳＭＩ−８１）でプローブした。ペルオキシダーゼ結合二次抗体および化学発光検出系を用いて特異的結合を可視化した。ＳＮＡＰ−２５の切断を、走査デンシトメトリー（Molecular Dynamics Personal SI, ImageQuantデータ解析ソフトウェア）によって定量した。ＳＮＡＰ−２５の切断パーセントを、以下の式に従って算定した：（切断されたＳＮＡＰ−２５／（切断されたＳＮＡＰ−２５＋完全なＳＮＡＰ−２５））×１００。
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮ−Ａと称する）へのｅＤＲＧ神経細胞の曝露後、サブスタンスＰ放出の阻害とＳＮＡＰ−２５の切断との両方が観察されている（図１０）。融合物への２４時間の曝露後、6.3±2.5nMの融合物濃度で、最大の５０％のＳＮＡＰ−２５切断が生じている。
融合物の効果は、ＣＰＮ−ＡへのｅＤＲＧの１６時間曝露後の所定の時点でも評価している。図１１は、ＣＰＮ−Ａ融合タンパク質の長期にわたる作用期間を示しており、曝露後２８日でもなお、測定可能な活性が観察されている。
（実施例１７ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物のインビトロ効力の評価）
実施例８および９に従って調製した融合タンパク質を、実施例１６に記載の方法を用いて、ｅＤＲＧ神経細胞モデルにおいて評価した。
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮｖ−Ａと称する）へのｅＤＲＧ神経細胞の曝露後、サブスタンスＰ放出の阻害とＳＮＡＰ−２５の切断との両方が観察されている。融合物への２４時間の曝露後、1.4±0.4nMの融合物濃度で、最大の５０％のＳＮＡＰ−２５切断が生じている（図１２）。
融合物の効果は、ＣＰＮ−ＡへのｅＤＲＧの１６時間曝露後の所定の時点でも評価している。図１３は、ＣＰＮ−Ａ融合タンパク質の長期にわたる作用期間を示しており、曝露後２４日でもなお、測定可能な活性が観察されている。
また、ＣＰＮｖ−Ａ融合タンパク質の結合能を、ＣＰＮ−Ａ融合物と比較して評価している。図１４は、ＯＲＬ−１レセプターでの結合効力を決定するための競合実験の結果を示している。ＣＰＮｖ−Ａが［３Ｈ］−ノシセプチンを置き換えることが示され、それにより、中心提示フォーマットのリガンドを用いて、レセプターへの接近が可能であることが確認される。
（実施例１８ − エンテロキナーゼでの処理により活性化されるＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製）
実施例１および２で使用した方法に従って、ＬＣ／Ａ（配列番号１）およびＨＮ／Ａ（配列番号２）を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−エンテロキナーゼプロテアーゼ部位−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号６２）として配置された血清型Ａノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ配列（配列番号６３）を含んでおり、これは、配列番号６４に示される配列のタンパク質を発現する。この融合タンパク質をＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａと称する。図１５は、活性化のために100μgの融合タンパク質当たり0.00064μgでエンテロキナーゼを用いたこと以外は実施例９で使用した方法に従って行った、大腸菌からのＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａの精製を示している。
（実施例１９ − エンテロキナーゼでの処理により活性化されているＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物のインビトロ効力の評価）
実施例１８で調製したＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａを精製形態で得て、ｅＤＲＧ細胞モデルに適用してＳＮＡＰ−２５の切断を評価する（実施例１６からの方法を用いる）。図１６は、ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−ＡへのｅＤＲＧの２４時間曝露後のＳＮＡＰ−２５の切断を示している。切断の効率は、実施例１７に報告したような第Ｘａ因子切断物で得られるのと同様であることが観察される。
（実施例２０ − 血清型Ａに由来する第Ｘａ因子活性化リンカーを伴うＬＣ／Ｃ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製）
実施例４で使用した方法に従って、ＬＣ／Ｃ（配列番号５）およびＨＮ／Ｃ（配列番号６）を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号６５）として配置された血清型Ａノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ配列（配列番号６６）を含んでおり、これは、配列番号６７に示される配列のタンパク質を発現する。この融合タンパク質をＣＰＮｖ−Ｃ（ａｃｔ．Ａ）と称する。図１７は、実施例９で使用した方法に従って行った、大腸菌からのＣＰＮｖ−Ｃ（ａｃｔ．Ａ）の精製を示している。
（実施例２１ − ＬＣ／Ｃ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質のインビトロ効力の評価）
実施例９で使用した方法に従って、実施例２０で調製したＣＰＮｖ−Ｃ（ａｃｔ．Ａ）を精製形態で得て、ｅＤＲＧ細胞モデルに適用してＳＮＡＰ−２５の切断を評価する（実施例１６からの方法を用いる）。融合物への２４時間曝露後、3.1±2.0nMの融合物濃度で、最大の５０％のシンタキシン切断が生じている。図１８は、ＣＰＮｖ−Ｃ（ａｃｔ．Ａ）へのｅＤＲＧの２４時間曝露後のシンタキシンの切断を示している。
（実施例２２ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物のインビボ効力の評価）
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮ／Ａ）が急性カプサイシン誘発機械的異痛を抑制する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注入により評価する。試験動物を、研究に参加させる前；ＣＰＮ／Ａでの皮下処置後カプサイシン投与前；およびＣＰＮ／Ａの注射後カプサイシン追加投与後（１５分および３０分での応答の平均）の１０ｇのVon Freyフィラメントによる一連の刺激（１０刺激×３試行）に応じた足逃避率（ＰＷＦ％）について評価する。カプサイシン追加投与を１０μＬの０．３％溶液の注射によって行う。試料希釈液を０．５％ＢＳＡ／生理食塩水中で調製する。図１９は、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物の種々の濃度での動物の前処置により得られる機械的異痛の逆転を示している。
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮ／Ａ）がラットにおいてストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発機械的（触覚）異痛を抑制する能力を評価する。ラットにおけるＳＴＺ誘発機械的異痛をストレプトゾトシンの注射（腹腔内または静脈内）によって生じさせる。これにより、膵臓β細胞が破壊され、インスリン生産の喪失が生じ、代謝ストレスを併発する（高血糖および高脂血症）。このように、ＳＴＺは、Ｉ型糖尿病を誘発する。さらに、ＳＴＺ処置により神経障害の進行性の発症が生じ、これは、痛覚過敏および異痛を伴う慢性疼痛のモデルとなり、これは、ヒト糖尿病患者で観察される徴候（末梢糖尿病性神経障害）を反映し得る。
Sprague-Dawley雄ラット（250〜300g）をクエン酸緩衝液中65mg/kgのSTZで（静脈内）処置し、そして毎週、血中のグルコースおよび脂質を測定して、モデルの準備ができていることを確認する。足逃避閾値（ＰＷＴ）を所定の期間にわたりVon Freyフィラメントによる一連の刺激に応じて測定する。異痛は、２つの連続した試験日（１週間空ける）でのＰＷＴがスケールで６ｇを下回って測定された場合に確立されるとする。この時点で、ラットを生理食塩水群（陰性効力コントロール）、ガバペンチン群（陽性効力コントロール）または試験群（ＣＰＮ／Ａ）に無作為に振り分ける。試験物質（２０〜２５μｌ）を１回の注射で皮下注入し（ガバペンチンを除く）、ＰＷＴを処置後１日目およびその後２週間にわたって定期的に測定する。ガバペンチン（３ｍｌ／ｋｇ注入容量で３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）は、毎日、ＰＷＴ試験開始の２時間前に注射する。図２０は、750ngのＣＰＮ／Ａでの動物の前処置により得られる異痛の逆転を示している。データは、ＣＰＮ／Ａの単回注射後２週間にわたって得た。
（実施例２３ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物のインビボ効力の評価）
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮｖ／Ａ）がカプサイシン誘発機械的異痛を抑制する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注入により評価する。試験動物を、研究に参加させる前（処置前）；ＣＰＮｖ／Ａでの皮下足底内処置後カプサイシン投与前（ＣＡＰ前）；およびＣＰＮｖ／Ａの注射後カプサイシン追加投与後（１５分および３０分での応答の平均；ＣＡＰ）の１０ｇのVon Freyフィラメントによる一連の刺激（１０刺激×３試行）に応じた足逃避率（ＰＷＦ％）について評価する。カプサイシン追加投与を１０μＬの０．３％溶液の注射によって行う。試料希釈液を０．５％ＢＳＡ／生理食塩水中で調製する。
図２１は、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物の種々の濃度での動物の前処置により得られる機械的異痛の逆転を、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物の添加で得られた逆転と比較して示している。これらのデータを、正規化足逃避率差として表し、これは、ピーク応答（カプサイシン後）とベースライン応答（カプサイシン前）との間の差を百分率にて示す。この分析にて、ＣＰＮｖ／Ａは、ＣＰＮ／Ａよりも強力であることが理解され得る。これは、ＣＰＮｖ／Ａでは、ＣＰＮ／Ａで見られるのと同様の鎮痛効果を生じるのに必要とする投薬量が、より少ないからである。
（実施例２４ − ＬＣ／Ａ−ｌｅｕエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製）
ｌｅｕエンケファリンリガンドのサイズが小さい（５アミノ酸）ため、ＬＣ／Ａ−ｌｅｕエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合物を、鋳型としてＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号１３）を用いる部位特異的変異誘発［例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて］によって作製する。ＹＧＧＦＬ ｌｅｕエンケファリンペプチドをコードし、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号１３）のリンカー領域に相補的な配列が隣接するオリゴヌクレオチドを設計する。ＳＤＭ産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ｌｅｕエンケファリン−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ（配列番号６８）を含んでおり、これは、配列番号６９に示される配列のタンパク質を発現する。この融合タンパク質をＣＰＬＥ−Ａと称する。図２２は、実施例９で使用した方法に従って行った、大腸菌からのＣＰＬＥ−Ａの精製を示している。
（実施例２５ − ＬＣ／Ａ−βエンドルフィン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の発現および精製）
実施例９で使用した方法に従って、そして実施例７で作製したＬＣ／Ａ−βエンドルフィン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質（ＣＰＢＥ−Ａと称する）を用いて、ＣＰＢＥ−Ａを大腸菌から精製する。図２３は、精製したタンパク質をSDS-PAGEによる分析にて示している。
（実施例２６ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン変異体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製）
１位をＰｈｅからＴｙｒにするようにノシセプチン配列を変異させるのに必要な単一アミノ酸改変のために、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン変異体−ＨＮ／Ａ融合物を、鋳型としてＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号１３）を用いる部位特異的変異誘発［例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて］によって作製する。ノシセプチン配列の１位でチロシンをコードし、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号１３）のリンカー領域に相補的な配列が隣接するオリゴヌクレオチドを設計する。ＳＤＭ産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン変異体−スペーサー−ＨＮ／Ａ融合物ＯＲＦ（配列番号７０）を含んでおり、これは、配列番号７１に示される配列のタンパク質を発現する。この融合タンパク質をＣＰＯＰ−Ａと称する。図２４は、実施例９で使用した方法に従って行った、大腸菌からのＣＰＯＰ−Ａの精製を示している。
（実施例２７ − ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体変異体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製および評価）
１位をＰｈｅからＴｙｒにするようにノシセプチン配列を変異させるのに必要な単一アミノ酸改変のために、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体変異体−ＨＮ／Ａ融合物を、鋳型としてＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号２５）を用いる部位特異的変異誘発［例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて］によって作製する。ノシセプチン配列の１位でチロシンをコードし、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号２５）のリンカー領域に相補的な配列が隣接するオリゴヌクレオチドを設計する。ＳＤＭ産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン変異体−スペーサー−ＨＮ／Ａ融合物ＯＲＦ（配列番号７２）を含んでおり、これは、配列番号７３に示される配列のタンパク質を発現する。この融合タンパク質をＣＰＯＰｖ−Ａと称する。図２５は、実施例９で使用した方法に従って行った、大腸菌からのＣＰＯＰｖ−Ａの精製を示している。
実施例１６に記載の方法を用いて、ＣＰＯＰｖ−ＡをｅＤＲＧ細胞モデルでＳＮＡＰ−２５を切断する能力について評価する。図２６は、ＣＰＯＰｖ−ＡがｅＤＲＧモデルでＳＮＡＰ−２５を切断できることを示しており、約5.9nMの融合物に細胞を２４時間曝露した後、最大の５０％のＳＮＡＰ−２５切断を生じている。
（実施例２８ − ＩｇＡプロテアーゼ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製）
ＩｇＡプロテアーゼアミノ酸配列を、自由に利用可能なデータベースソース（例えば、GenBank（アクセッション番号P09790））から入手した。N. GonorrhoeaeＩｇＡプロテアーゼ遺伝子の構造に関する情報は、文献で入手可能である（Pohlnerら, Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease, Nature, 1987, 325(6103), 458-62）。Backtranslation tool v2.0（Entelechon）を用いて、大腸菌発現のために改変したＩｇＡプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を決定した。BamHI認識配列をＩｇＡ ＤＮＡの５’末端に組み込み、システインアミノ酸をコードするコドンおよびSalI認識配列をＩｇＡ ＤＮＡの３’末端に組み込んだ。ＤＮＡ配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について、MapDraw,（DNASTAR Inc.）を用いてスクリーニングした。クローニングに必要とされる配列と共通であることが見出されている切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）によって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表を参照することによって評価した。次いで、ＩｇＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むこの最適化したＤＮＡ配列（配列番号７４）は商業的に合成される。
ＩｇＡ（配列番号７４）を、BamHIおよびSalI制限酵素を用いてＬＣ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ（配列番号２５）に挿入して、ＬＣをＩｇＡプロテアーゼＤＮＡに置換する。最終構築物は、ＩｇＡ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ（配列番号７５）を含んでおり、これは、配列番号７６に示される配列のタンパク質を発現する。
（実施例２９ − 取り外し可能なヒスチジン精製タグを伴うノシセプチン標的エンドペプチダーゼ融合タンパク質の調製および評価）
第Ｘａ因子の取り外し可能なｈｉｓタグ（ｈｉｓ６）をコードするＤＮＡを調製したが、エンテロキナーゼのような別のプロテアーゼ部位およびもっと長いヒスチジンタグのような別の精製タグもまた可能であることが明らかである。種々の逆翻訳ソフトウェアツール［例えば、EditSeq best E. coli reverse translation（DNASTAR Inc.）またはBacktranslation tool v2.0（Entelechon）］の１つを用いて、第Ｘａ因子の取り外し可能なｈｉｓタグ領域をコードするＤＮＡ配列を決定する。次いで、制限部位をこのＤＮＡ配列に組み込み、NheI−リンカー−SpeI−PstI−ＨＮ／Ａ−XbaI−ＬＥＩＥＧＲＳＧＨＨＨＨＨＨ停止コドン−HindIII（配列番号７７）として配置させ得る。このＤＮＡ配列を、組み込まれた制限配列についてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年９月13日）を参照することによって評価する。次いで、この最適化したＤＮＡ配列は商業的に合成され（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター中に提供される。ＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴ（配列番号７８、取り外し可能なｈｉｓタグ構築物）を作製するために、取り外し可能なｈｉｓタグをコードしているpCR 4ベクターをNheIおよびHindIIIで切断する。次いで、NheI−HindIIIフラグメントを、同様にNheIおよびHindIIIによって切断しておいたＬＣ／Ａ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ａベクター（配列番号２５）に挿入する。最終構築物は、ＬＣ／Ａ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮ−ＦＸａ−Ｈｉｓタグ−HindIII ＯＲＦ配列（配列番号７８）を含んでおり、これは、配列番号７９に示される配列のタンパク質を発現する。図２７は、実施例９で使用した方法に従って行った、大腸菌からのＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴの精製を示している。
（実施例３０ − ジフテリア毒素由来トランスロケーションドメインを含むｌｅｕエンケファリン標的エンドペプチダーゼ融合タンパク質の調製）
ＤＮＡ配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール［例えば、EditSeq best E. coli reverse translation（DNASTAR Inc.）またはBacktranslation tool v2.0（Entelechon）］の１つを用いて、ジフテリア毒素のトランスロケーションドメインのアミノ酸配列（自由に利用可能なデータベースソース（例えば、GenBank（アクセッション番号1XDTT））から入手）の逆翻訳によって設計する。次いで、制限部位をこのＤＮＡ配列に組み込み、NheI−リンカー−SpeI−PstI−ジフテリアトランスロケーションドメイン−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号８０）として配置させ得る。PstI／XbaI認識配列を、配列のトランスロケーションドメインの５’末端および３’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み枠を維持する。このＤＮＡ配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について、（MapDraw（DNASTAR Inc.）のようなソフトウェアを用いて）スクリーニングする。クローニング系に必要とされる配列と共通であることが見出されている切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年９月13日）を参照することによって評価する。次いで、ジフテリアトランスロケーションドメインを含むこの最適化したＤＮＡ配列は、NheI−リンカー−SpeI−PstI−ジフテリアトランスロケーションドメイン−XbaI−停止コドン−HindIIIとして商業的に合成され（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター（Invitrogen）中に提供される。ジフテリアトランスロケーションドメインをコードしているpCR 4ベクターをNheIおよびXbaIで切断する。次いで、NheI−XbaIフラグメントを、同様にNheIおよびXbaIによって切断しておいたＬＣ／Ａ−ＣＰＬＥ−ＨＮ／Ａベクター（配列番号６８）に挿入する。最終構築物は、ＬＣ／Ａ−ｌｅｕエンケファリン−スペーサー−ジフテリアトランスロケーションドメインのＯＲＦ配列（配列番号８１）を含んでおり、これは、配列番号８２に示される配列のタンパク質を発現する。
（実施例３１ − 破傷風菌毒素由来ＬＣドメインを含むノシセプチン改変体標的エンドペプチダーゼ融合タンパク質の調製）
ＤＮＡ配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール［例えば、EditSeq best E. coli reverse translation（DNASTAR Inc.）またはBacktranslation tool v2.0（Entelechon）］の１つを用いて、破傷風菌毒素ＬＣアミノ酸配列（自由に利用可能なデータベースソース（例えば、GenBank（アクセッション番号X04436））から入手）の逆翻訳によって設計する。BamHI／SalI認識配列を、配列の５’末端および３’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み枠を維持する（配列番号８３）。このＤＮＡ配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について、（MapDraw（DNASTAR Inc.）のようなソフトウェアを用いて）スクリーニングする。クローニング系に必要とされる配列と共通であることが見出されている切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年９月13日）を参照することによって評価する。次いで、破傷風菌毒素ＬＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むこの最適化したＤＮＡ配列は、商業的に合成され（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター（Invitrogen）中に提供される。ＴｅＮＴ ＬＣをコードしているpCR 4ベクターをBamHIおよびSalIで切断する。次いで、BamHI−SalIフラグメントを、同様にBamHIおよびSalIによって切断しておいたＬＣ／Ａ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ａベクター（配列番号２５）に挿入する。最終構築物は、ＴｅＮＴ ＬＣ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ配列（配列番号８４）を含んでおり、これは、配列番号８５に示される配列のタンパク質を発現する。
（実施例３２ − 第Ｘａ因子切断を受けやすい天然型血清型Ｃリンカーを伴うＬＣ／Ｃ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製）
実施例４で使用した方法に従って、ＬＣ／Ｃ（配列番号５）およびＨＮ／Ｃ（配列番号６）を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号８６）として配置された血清型Ｃノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ配列（配列番号８７）を含んでおり、これは、配列番号８８に示される配列のタンパク質を発現する。この融合タンパク質をＣＰＮｖ−Ｃ（ａｃｔ．Ｃ）と称する。
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製を示す。 ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製を示す。 ＬＣ／Ｃ−ノシセプチン−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の精製を示す。 ＬＣ／Ａ−ｍｅｔエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製を示す。 ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質とノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質との結合効力の比較を示す。 ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ触媒活性を示す。 ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製を示す。 ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質とＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質との結合効力の比較を示す。 可変スペーサー長産物を有する発現／精製ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質ファミリーを示す。 ＣＰＮ−ＡによるＳＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断を示す。 ＣＰＮ−ＡへのＤＲＧの曝露後長期間にわたるＳＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断を示す。 ＣＰＮｖ−ＡによるＳＮＡＰ−２５の切断を示す。 ＣＰＮｖ−ＡへのＤＲＧの曝露後長期間にわたるＳＮＡＰ−２５の切断を示す。 ［３Ｈ］−ノシセプチン結合のＣＰＮｖ−Ａ融合物媒介置換を示す。 発現／精製ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａ産物を示す。 ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−ＡによるＳＮＡＰ−２５の切断を示す。 発現／精製ＣＰＮｖ−Ｃ産物を示す。 ＣＰＮｖ−Ｃによるシンタキシンの切断を示す。 急性カプサイシン誘発機械的異痛モデルにおけるＣＰＮ−Ａ効力を示す。 ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発末梢糖尿病性神経障害（神経因性疼痛）モデルにおけるＣＰＮ−Ａ効力を示す。 急性カプサイシン誘発機械的異痛モデルにおけるＣＰＮｖ−Ａ効力を示す。 発現／精製ＬＣ／Ａ−ＣＰＬＥ−ＨＮ／Ａ産物を示す。 発現／精製ＬＣ／Ａ−ＣＰＢＥ−ＨＮ／Ａ産物を示す。 発現／精製ＣＰＯＰ−Ａ産物を示す。 発現／精製ＣＰＯＰｖ−Ａ産物を示す。 ＤＲＧ細胞モデルにおけるインビトロＳＮＡＰ−２５切断を示す。 発現／精製ＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴ（取り外し可能ｈｉｓタグ）を示す。 リガンド競合アッセイにより評価した可変スペーサー長を有するＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ効力を示す。 インビトロＳＮＡＰ−２５切断により評価した可変スペーサー長を有するＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ効力を示す。

Claims (25)

  1. 単鎖ポリペプチド融合タンパク質であって：
    ａ）非細胞傷害性プロテアーゼであって、該プロテアーゼが、侵害受容感覚求心性神経細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得、該非細胞傷害性プロテアーゼが、クロストリジウム神経毒素Ｌ鎖プロテアーゼまたはＩｇＡプロテアーゼである、プロテアーゼ；
    ｂ）該侵害受容感覚求心性神経細胞上の結合部位に結合し得るオピオイドペプチドターゲティング部分であって、該結合部位が、エンドサイトーシスを受けて該侵害受容感覚求心性神経細胞内のエンドソームに取り込まれ得、該ターゲティング部分が、ノシセプチン、β−エンドルフィン、エンドモルフィン−１、エンドモルフィン−２、ダイノルフィン、ｍｅｔ−エンケファリン、ｌｅｕ−エンケファリン、ガラニン、およびＰＡＲ−２ペプチドからなる群から選択される、オピオイドペプチドターゲティング部分；
    ｃ）プロテアーゼ切断部位であって、該部位でプロテアーゼにより該融合タンパク質が切断され得、該プロテアーゼ切断部位が、該非細胞傷害性プロテアーゼと該ターゲティング部分との間に位置している、プロテアーゼ切断部位；および
    ｄ）トランスロケーションドメインであって、該トランスロケーションドメインが、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性神経細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼをトランスロケートさせ得、該トランスロケーションドメインが、クロストリジウム神経毒素のＨＮドメインであるか、またはジフテリア毒素、シュードモナス外毒素のドメインII、炭疽菌毒素、インフルエンザウイルスヘマグルチニンに由来する融合性および／または両親媒性のペプチド、セムリキ森林ウイルスの融合性ペプチド、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Ｇ、ＳＥＲウイルスＦタンパク質、および泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質からなる群より選択されるトランスロケーションドメインである、トランスロケーションドメイン
    を含み、
    該ターゲティング部分が、該プロテアーゼ切断部位と該トランスロケーションドメインとの間に位置しており、そして該ターゲティング部分および該プロテアーゼ切断部位が、０アミノ酸残基離れている、融合タンパク質。
  2. 前記オピオイドぺプチドターゲティング部分が、多くとも５０アミノ酸残基、または多くとも４０アミノ酸残基、または多くとも３０アミノ酸残基、または多くとも２０アミノ酸残基を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記オピオイドぺプチドターゲティング部分が、侵害受容感覚求心性神経細胞上に存在するレセプターのアゴニストである、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記オピオイドぺプチドターゲティング部分が、一次侵害受容感覚求心性神経細胞上に存在するレセプターのアゴニストである、請求項３に記載の融合タンパク質。
  5. 前記オピオイドぺプチドターゲティング部分が、ＯＲＬ１レセプターに結合する、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  6. 前記オピオイドぺプチドターゲティング部分が、ＯＲＬ１レセプターに特異的に結合する、請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 前記オピオイドぺプチドターゲティング部分が、ＯＲＬ１レセプターのアゴニストである、請求項５または６に記載の融合タンパク質。
  8. 前記オピオイドぺプチドターゲティング部分が、配列番号３８である、請求項５から７のいずれかに記載の融合タンパク質。
  9. 前記オピオイドぺプチドターゲティング部分が、配列番号４０、４２、４４、４６、４８または５０のいずれかである、請求項５から７のいずれかに記載の融合タンパク質。
  10. 前記オピオイドぺプチドターゲティング部分が、ノシセプチンである、請求項５から７のいずれかに記載の融合タンパク質。
  11. 前記融合タンパク質が精製タグを含む、請求項１から１０のいずれかに記載の融合タンパク質。
  12. 前記融合タンパク質が精製タグを含み、該精製タグが該融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に存在する、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  13. 前記精製タグが、ペプチドスペーサー分子によって前記融合タンパク質に結合されている、請求項１１または１２に記載の融合タンパク質。
  14. 前記トランスロケーションドメインが、ペプチドスペーサー分子によって前記オピオイドぺプチドターゲティング部分から離されている、請求項１から１３のいずれかに記載の融合タンパク質。
  15. 配列番号１４、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、５９、６１、６４、６７、６９、７１、７３、７６、７９、８２、８５または８８のいずれか１つを含む、ポリペプチド融合タンパク質。
  16. 請求項１から１５のいずれかに記載のポリペプチド融合タンパク質をコードする核酸。
  17. 前記核酸分子が、配列番号１から１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５８、６０、６３、６６、６８、７０、７２、７５、７８、８１、８４または８７のいずれか１つを含む、請求項１６に記載の核酸。
  18. プロモーター、請求項１６または請求項１７に記載の核酸、およびターミネーターを含むＤＮＡベクターであって、該ＤＮＡ配列が、該プロモーターの下流に位置し、そして該ターミネーターが、該ＤＮＡ構築物の下流に位置している、ベクター。
  19. 請求項１６または請求項１７に記載のＤＮＡ配列の相補ＤＮＡ鎖。
  20. 請求項１から１５のいずれかに記載の単鎖ポリペプチド融合タンパク質を調製するための方法であって、請求項１６または請求項１７に記載の核酸、または請求項１８に記載のＤＮＡベクターを宿主細胞で発現させる工程を含む、方法。
  21. 非細胞傷害性薬剤を調製する方法であって、該方法が、
    ａ）請求項１から１５のいずれかに記載の単鎖ポリペプチド融合タンパク質と、前記プロテアーゼ切断部位を切断し得るプロテアーゼとを接触させる工程；
    ｂ）該プロテアーゼ切断部位を切断し、そしてそれにより二本鎖融合タンパク質を形成する工程
    を含む、方法。
  22. 請求項２１に記載の方法により得られ得る非細胞傷害性ポリペプチドであって、該ポリペプチドが二本鎖ポリペプチドであり、そして
    （ａ）第一鎖が、前記非細胞傷害性プロテアーゼを含み、該プロテアーゼが、侵害受容感覚求心性神経細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得、該非細胞傷害性プロテアーゼが、クロストリジウム神経毒素Ｌ鎖プロテアーゼまたはＩｇＡプロテアーゼであり；
    （ｂ）第二鎖が、前記オピオイドペプチドターゲティング部分および前記トランスロケーションドメインを含み、該トランスロケーションドメインが、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性神経細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼをトランスロケートさせ得、該トランスロケーションドメインが、クロストリジウム神経毒素のＨＮドメインであるか、またはジフテリア毒素、シュードモナス外毒素のドメインII、炭疽菌毒素、インフルエンザウイルスヘマグルチニンに由来する融合性および／または両親媒性のペプチド、セムリキ森林ウイルスの融合性ペプチド、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Ｇ、ＳＥＲウイルスＦタンパク質、および泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質からなる群より選択されるトランスロケーションドメインであり；そして
    該第一鎖および第二鎖が一緒にジスルフィド結合で連結されている、
    非細胞傷害性ポリペプチド。
  23. 疼痛の治療、予防、または緩和用の医薬品の製造のための、請求項１から１５のいずれかに記載の融合タンパク質または請求項２２に記載のポリペプチドの使用。
  24. 前記疼痛が慢性疼痛である、請求項２３に記載の使用。
  25. 疼痛を治療、予防、または緩和するための組成物であって、請求項１から１５のいずれかに記載の融合タンパク質または請求項２２に記載のポリペプチドの治療有効量を含む、組成物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012045003A (ja) * 2004-12-01 2012-03-08 Health Protection Agency 非細胞傷害性タンパク質結合体

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9617671D0 (en) * 1996-08-23 1996-10-02 Microbiological Res Authority Recombinant toxin fragments
US7192596B2 (en) * 1996-08-23 2007-03-20 The Health Protection Agency Ipsen Limited Recombinant toxin fragments
ES2277854T5 (es) * 1999-08-25 2011-02-04 Allergan, Inc. Neurotoxinas recombinantes activables.
ES2648046T3 (es) 2002-11-12 2017-12-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Vacuna de polisacárido para infecciones estafilocócicas
US7811584B2 (en) * 2004-06-30 2010-10-12 Allergan, Inc. Multivalent clostridial toxins
EP1824971B1 (en) * 2004-11-22 2016-01-13 New York University Genetically engineered clostridial genes, proteins encoded by the engineered genes, and uses thereof
US8399400B2 (en) * 2004-12-01 2013-03-19 Syntaxin, Ltd. Fusion proteins
US8603779B2 (en) 2004-12-01 2013-12-10 Syntaxin, Ltd. Non-cytotoxic protein conjugates
US8778634B2 (en) 2004-12-01 2014-07-15 Syntaxin, Ltd. Non-cytotoxic protein conjugates
US8512984B2 (en) * 2004-12-01 2013-08-20 Syntaxin, Ltd. Non-cytotoxic protein conjugates
US8168206B1 (en) 2005-10-06 2012-05-01 Allergan, Inc. Animal protein-free pharmaceutical compositions
AR060188A1 (es) * 2006-03-30 2008-05-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Procedimiento de conjugacion
GB0610867D0 (en) 2006-06-01 2006-07-12 Syntaxin Ltd Treatment of pain
US10792344B2 (en) 2006-06-29 2020-10-06 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa High frequency application of botulinum toxin therapy
AR061669A1 (es) * 2006-06-29 2008-09-10 Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa Aplicacion de alta frecuencia de terapia con toxina botulinica
AU2009223161B2 (en) 2008-03-14 2014-10-30 Allergan, Inc. Immuno-based botulinum toxin serotype A activity assays
KR101604515B1 (ko) * 2008-03-14 2016-03-17 알러간, 인코포레이티드 면역-기반 보툴리눔 독소 세로타입 ａ 활성 검정
EP2310029B1 (en) 2008-06-12 2019-04-03 Ipsen Bioinnovation Limited Fusion proteins for use in the treatment of cancer
CN102112145B (zh) * 2008-06-12 2014-07-30 辛它可辛有限公司 神经内分泌病的抑制
CN105085349B (zh) * 2008-07-21 2018-02-09 布赖汉姆妇女医院 与合成的β‑1,6 葡糖胺寡糖相关的方法和组合物
GB0820970D0 (en) * 2008-11-17 2008-12-24 Syntaxin Ltd Suppression of cancer
EP2373294B1 (en) 2008-12-10 2016-04-20 Allergan, Inc. Clostridial toxin pharmaceutical compositions
DK3281953T3 (da) 2009-03-13 2020-01-20 Allergan Inc Immun-baserede omdirigerede endopeptidase-aktivitetsassays
US8198229B2 (en) * 2009-05-29 2012-06-12 Allergan, Inc. Methods of treating urogenital-neurological disorders using galanin retargeted endopepidases
MX2012006985A (es) 2009-12-16 2012-09-12 Allergan Inc Toxinas clostridium modificadas que comprenden un dominio de enlace al sitio de escision de la proteasa integrado.
MX2012008650A (es) 2010-01-25 2012-11-23 Allergan Inc Metodos de conversion intracelular de proteinas monocatenarias en su formula bicatenaria.
WO2011091419A2 (en) * 2010-01-25 2011-07-28 New York Universiy Recombinant derivatives of botulinum neurotoxins engineered for trafficking studies and neuronal delivery
EP2650003B1 (en) 2010-05-20 2016-07-27 Allergan, Inc. Degradable clostridial toxins
EP3173095A1 (en) 2010-10-14 2017-05-31 Allergan, Inc. Targeted delivery of targeted exocytosis modulators to the sphenopalatine ganglion for treatment of headache disorders
WO2012112420A1 (en) 2011-02-14 2012-08-23 Allergan, Inc. Treatments using psma ligand endopeptidases
US20120244188A1 (en) 2011-03-25 2012-09-27 Allergan, Inc. Treatment of Sensory Disturbance Disorders
US20120251573A1 (en) 2011-03-28 2012-10-04 Allergan, Inc. Endopeptidase Treatment of Neuroendocrine Disorders
US20120251575A1 (en) 2011-03-28 2012-10-04 Allergan, Inc. Endopeptidase Treatment of Involuntary Movement Disorders
US20120251574A1 (en) 2011-03-28 2012-10-04 Allergan, Inc. Endopeptidase and Neurotoxin Combination Treatment of Multiple Medical Conditions
US20120251519A1 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Allergan, Inc. Endopeptidase Treatment of Smooth Muscle Disorders
US20120258132A1 (en) 2011-03-29 2012-10-11 Allergan, Inc. Vagal Nerve-Based Disorders
US20120251518A1 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Allergan, Inc. Endopeptidase Treatment of Sexual Dysfunction Disorders
US20120251515A1 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Allergan, Inc. Endopeptidase Treatment of Cosmesis Disorders
US8697090B2 (en) 2011-05-05 2014-04-15 Allergan, Inc. Method of treating persistent genital arousal disorder with a neurotoxin
GB201108108D0 (en) * 2011-05-16 2011-06-29 Syntaxin Ltd Therapeutic fusion proteins
US9764009B2 (en) 2011-06-13 2017-09-19 Allergan, Inc. Treatment of psychological trauma
EP2729163A1 (en) 2011-07-08 2014-05-14 Allergan, Inc. Method for treatment of autonomic nervous system disorders
US8992941B2 (en) 2011-07-08 2015-03-31 Allergan, Inc. Method for treatment of esophageal spasm
US9144600B2 (en) 2011-07-14 2015-09-29 Allergan, Inc. Methods for treatment of incontinence associated with sexual activity
US20130171122A1 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Allergan, Inc. Endopeptidase and neurotoxin combination treatment of bladder disorders
WO2013102088A2 (en) 2011-12-31 2013-07-04 Allergan, Inc. Highly Sensitive Cell-Based Assay to Detect the Presence of Active Botulinum Neurotoxin Serotype-A
US20140056870A1 (en) * 2012-08-27 2014-02-27 Allergan, Inc. Fusion proteins
BR112015003591B1 (pt) 2012-11-21 2022-02-01 Ipsen Bioinnovation Limited Usos de lys-c e métodos para fabricação de um polipeptídeo proteoliticamente processado
EP2934571B1 (en) 2012-12-18 2018-05-30 Allergan, Inc. Prophylactic treatment of herpes recurrence
WO2014117148A1 (en) 2013-01-28 2014-07-31 New York University Treatment methods using atoxic neurotoxin derivatives
US11897921B2 (en) 2014-12-09 2024-02-13 New York University Propeptide fusion comprising a mutated clostridium botulinum neurotoxin and a VHH domain
EP3436054B2 (en) 2016-09-13 2022-07-27 Allergan, Inc. Stabilized non-protein clostridial toxin compositions
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP3858264A1 (en) 2017-12-26 2021-08-04 Goodman Co., Ltd. Hemostatic device
US11965191B2 (en) 2018-01-18 2024-04-23 California Institute Of Technology Programmable protein circuits in living cells
WO2019147478A2 (en) * 2018-01-18 2019-08-01 California Institute Of Technology Programmable protein circuits in living cells
DE102018114028A1 (de) * 2018-06-12 2019-12-12 Bundesrepublik Deutschland (Robert Koch-Institut) Probenpräparation für proteomische Untersuchungen
US11453893B2 (en) 2018-08-30 2022-09-27 California Institute Of Technology RNA-based delivery systems with levels of control
US11542305B2 (en) 2018-08-31 2023-01-03 California Institute Of Technology Synthetic protein circuits detecting signal transducer activity
WO2020146627A1 (en) 2019-01-10 2020-07-16 California Institute Of Technology A synthetic system for tunable thresholding of protein signals
EP4277654A1 (en) 2021-01-18 2023-11-22 Conserv Bioscience Limited Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5668255A (en) * 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
JPH05502880A (ja) * 1989-12-22 1993-05-20 セラジェン・インコーポレーテッド トランスロケーション領域および細胞結合領域を有するハイブリッド分子
US5200722A (en) 1991-11-27 1993-04-06 United Solar Systems Corporation Microwave window assembly
WO1993015766A1 (en) 1992-02-10 1993-08-19 Seragen, Inc. Desensitization to specific allergens
GB9305735D0 (en) * 1993-03-19 1993-05-05 North John R Novel agent for controlling cell activity
CZ343795A3 (en) 1993-06-29 1996-07-17 Chiron Corp Shortened keratinocyte growth factor /kgf/ exhibiting increased biological activity
AU2592395A (en) 1994-05-19 1995-12-18 Monsanto Company Method for purifying somatotropin monomers
GB9411138D0 (en) 1994-06-03 1994-07-27 Microbiological Res Authority Toxin assay
GB9508204D0 (en) * 1995-04-21 1995-06-07 Speywood Lab Ltd A novel agent able to modify peripheral afferent function
CA2229202C (en) 1995-08-15 2008-05-20 Universite Libre De Bruxells Methods for identifying antagonist or agonist to human opioid receptor-like 1 "orl1"
JP2000500019A (ja) * 1995-11-16 2000-01-11 ロシュ ダイアグノスティクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ストレプトアビジン融合タンパク質経由でのペプチドの生産方法
US7192596B2 (en) * 1996-08-23 2007-03-20 The Health Protection Agency Ipsen Limited Recombinant toxin fragments
GB9617671D0 (en) * 1996-08-23 1996-10-02 Microbiological Res Authority Recombinant toxin fragments
WO1999003880A1 (en) * 1997-07-15 1999-01-28 Novo Nordisk A/S Nociceptin analogues
GB9721189D0 (en) * 1997-10-08 1997-12-03 Speywood Lab The Limited Analgesic conjugates
PT1084146E (pt) 1998-05-13 2003-02-28 Biotecon Gesells Biotec Entwic Proteina hibrida para inibicao de desgranulacao de mastocitos e seu uso
WO2000004926A2 (en) 1998-07-22 2000-02-03 Osprey Pharmaceuticals Limited Conjugates for treating inflammatory disorders and associated tissue damage
US8790897B2 (en) 1998-08-25 2014-07-29 Syntaxin Ltd. Treatment of mucus hypersecretion
US20040071736A1 (en) * 1998-08-25 2004-04-15 Health Protection Agency Methods and compounds for the treatment of mucus hypersecretion
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
GB9907429D0 (en) 1999-03-31 1999-05-26 Microbiological Res Authority Modulation of C-fibre activity
US6776990B2 (en) * 1999-04-08 2004-08-17 Allergan, Inc. Methods and compositions for the treatment of pancreatitis
US6358697B2 (en) 1999-04-21 2002-03-19 Children's Hospital Medical Center Intracellular pharmaceutical targeting
US20090018081A1 (en) * 1999-08-25 2009-01-15 Allergan, Inc. Activatable clostridial toxins
ES2277854T5 (es) * 1999-08-25 2011-02-04 Allergan, Inc. Neurotoxinas recombinantes activables.
US7740868B2 (en) * 1999-08-25 2010-06-22 Allergan, Inc. Activatable clostridial toxins
US20080032931A1 (en) * 1999-08-25 2008-02-07 Steward Lance E Activatable clostridial toxins
US20030180289A1 (en) * 1999-09-23 2003-09-25 Foster Keith Alan Inhibition of secretion from non-neuronal cells
US20080038274A1 (en) * 1999-09-23 2008-02-14 Foster Keith A Inhibition of secretion from non-neuronal cells
GB9922554D0 (en) 1999-09-23 1999-11-24 Microbiological Res Authority Inhibition of secretion from non-neuronal cells
DK1234043T3 (da) 1999-12-02 2004-07-19 Health Prot Agency Konstruktion for afgivelse af terapeutiske midler til neuroceller
US6641820B1 (en) 2000-01-19 2003-11-04 Allergan, Inc. Clostridial toxin derivatives and methods to treat pain
US7138127B1 (en) * 2000-01-19 2006-11-21 Allergan, Inc. Clostridial toxin derivatives and methods for treating pain
JP2004521067A (ja) * 2000-06-28 2004-07-15 サンダース，イラ 動物（哺乳動物）における有用な用途を目的とする破傷風毒素の使用方法
ITMI20022022A1 (it) 2002-09-24 2004-03-25 Girolamo Calo' Analoghi di nocicettina.
GB0228723D0 (en) * 2002-12-09 2003-01-15 Cambridge Biotechnology Ltd Treatment of pain
US20040115727A1 (en) * 2002-12-11 2004-06-17 Allergan, Inc., A Corporation Evolved clostridial toxins with altered protease specificity
GB0305149D0 (en) * 2003-03-07 2003-04-09 Cambridge Biotechnology Ltd Compounds for the treatment of pain
GB0321344D0 (en) * 2003-09-11 2003-10-15 Health Prot Agency Re-targeted toxin conjugates
US7811584B2 (en) * 2004-06-30 2010-10-12 Allergan, Inc. Multivalent clostridial toxins
US7514088B2 (en) * 2005-03-15 2009-04-07 Allergan, Inc. Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use
EP1982996A1 (en) 2004-09-01 2008-10-22 Allergan, Inc. Degradable clostridial toxins
EP1824971B1 (en) * 2004-11-22 2016-01-13 New York University Genetically engineered clostridial genes, proteins encoded by the engineered genes, and uses thereof
US8778634B2 (en) * 2004-12-01 2014-07-15 Syntaxin, Ltd. Non-cytotoxic protein conjugates
GB0426397D0 (en) 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
US7659092B2 (en) * 2004-12-01 2010-02-09 Syntaxin, Ltd. Fusion proteins
AU2005311086B2 (en) 2004-12-01 2012-03-29 Allergan, Inc. Fusion proteins
GB0426394D0 (en) * 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
PL1877073T3 (pl) 2004-12-01 2014-03-31 The Sec Dep For Health Niecytotoksyczne koniugaty białkowe
GB0610867D0 (en) 2006-06-01 2006-07-12 Syntaxin Ltd Treatment of pain
WO2008011157A2 (en) * 2006-07-20 2008-01-24 The General Hospital Corporation Methods, compositions, and kits for the selective activation of protoxins through combinatorial targeting
US20080023928A1 (en) * 2006-07-25 2008-01-31 Lee Cole Quad roller skate
BRPI0819212A2 (pt) * 2007-10-23 2015-06-16 Allergan Inc Métodos de tratamento de inflamação neurogênica crônica usando toxinas modificadas de clostrídio
SG185338A1 (en) * 2007-10-23 2012-11-29 Allergan Inc Methods of treating urogenital-neurological disorders using modified clostridial toxins
WO2010085473A1 (en) * 2009-01-20 2010-07-29 Trustees Of Tufts College Methods for the delivery of toxins or enzymatically active portions thereof
US20100303791A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Allergan, Inc. Methods of Treating Chronic Neurogenic Inflammation Using Glucagon Like Hormone Retargeted Endopepidases
US20100303757A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Allergan, Inc. Methods of Treating Chronic Neurogenic Inflammation Using Interleukin Retargeted Endopepidases
US20100303789A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Allergan, Inc. Methods of Treating Chronic Neurogenic Inflammation Using Neurotrophin Retargeted Endopepidases
GB201108108D0 (en) 2011-05-16 2011-06-29 Syntaxin Ltd Therapeutic fusion proteins

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012045003A (ja) * 2004-12-01 2012-03-08 Health Protection Agency 非細胞傷害性タンパク質結合体

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