PT2366399E - Conjugados proteicos não citotóxicos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "CONJUGADOS PROTEICOS NÃO CITOTÓXICOS"

Esta invenção refere-se a proteínas de fusão não citotóxicas e à sua aplicação terapêutica como moléculas analgésicas.

As toxinas podem ser geralmente divididas em dois grupos de acordo com o tipo de efeito que têm numa célula alvo. Em mais detalhe, o primeiro grupo de toxinas mata as suas células alvo naturais e são, por esse motivo, conhecidas como moléculas de toxinas citotóxicas. Este grupo de toxinas é exemplificado inter alia por toxinas de plantas, tais como ricina e abrina e por toxinas bacterianas, tais como toxina da difteria e exotoxina A de Pseudomonas. As toxinas citotóxicas atraíram muito interesse na conceção de "balas mágicas" (e. g., imunoconjugados, os quais compreendem um componente de toxina citotóxica e um anticorpo que se liga a um marcador específico numa célula alvo) para o tratamento de distúrbios e estados celulares, tal como cancro. As toxinas citotóxicas tipicamente matam as suas células alvo por inibição do processo celular de síntese proteica. 0 segundo grupo de toxinas, as quais são conhecidas como toxinas não citotóxicas, não matam (como o próprio nome confirma) as suas células alvo naturais. As toxinas não citotóxicas atraíram muito menos interesse comercial do que as suas equivalentes citotóxicas e exercem os seus efeitos sobre uma célula alvo por inibição de processos celulares diferentes da síntese proteica. As toxinas não citotóxicas são produzidas por várias plantas e vários micro-organismos, tais como Clostridium sp. e Neisseria sp.

As neurotoxinas clostridiais são proteínas que, tipicamente, têm uma massa molecular da ordem dos 150 kDa. Estas são produzidas por várias espécies de bactérias, especialmente do género Clostridium, a mais importante, C. tetani e diversas estirpes de C. botulinum, C. butiricum e C. Argentinense. Existem atualmente oito classes diferentes da neurotoxina clostridial, nomeadamente: toxina do tétano e neurotoxina botulínica nos seus serotipos A, B, Cl, D, E, F e G e todas partilham estruturas e modos de ação semelhantes.

As neurotoxinas clostridiais representam um grande grupo de moléculas de toxinas não citotóxicas e são sintetizadas pela bactéria hospedeira como polipéptidos simples que são modificados pós-traducionalmente por um evento de clivagem proteolítica para formar duas cadeias polipeptídicas ligadas por uma ligação dissulfureto. As duas cadeias são denominadas a cadeia pesada (cadeia H) , a qual tem uma massa molecular de aproximadamente 100 kDa e a cadeia leve (cadeia L) , a qual tem uma massa molecular de aproximadamente 50 kDa.

As cadeias L possuem uma função de protease (atividade de endopeptidase dependente de zinco) e apresentam uma elevada especificidade de substrato para proteínas associadas a vesícula e/ou membrana plasmática envolvidas no processo exocítico. As cadeias L de diferentes espécies ou serotipos clostridiais podem hidrolisar ligações peptídicas diferentes mas específicas numa das três proteínas do substrato, nomeadamente, sinaptobrevina, sintaxina ou SNAP-25. Estes substratos são componentes importantes da maquinaria neurossecretora.

Neisseria sp ., a mais importante da espécie N. gonorrhoeae, produz proteases não citotóxicas funcionalmente semelhantes. Um exemplo dessa protease é a protease de IgA (ver o documento W099/58571).

Tem sido bem documentado na técnica que as moléculas de toxinas podem ser redirigidas para uma célula que não é a célula alvo natural da toxina. Quando assim redirigida, a toxina modificada é capaz de se ligar a uma célula alvo desejada e, após translocação subsequente no citosol, é capaz de exercer o seu efeito sobre a célula alvo. 0 referido redirecionamento é obtido por substituição da Unidade de Direcionamento (TM) natural da toxina com uma TM diferente. Neste sentido, a TM é selecionada de modo que se ligue a uma célula alvo desejada e permita a passagem subsequente da toxina modificada para um endossoma dentro da célula alvo. A toxina modificada compreende também um dominio de translocação para permitir a entrada da protease não citotóxica no citosol da célula. 0 dominio de translocação pode ser o dominio de translocação natural da toxina ou pode ser um dominio de translocação diferente obtido de uma proteína microbiana com atividade de translocação.

Por exemplo, o documento W094/21300 descreve moléculas de neurotoxina clostridial modificadas que são capazes de regular a densidade da Proteína Integral de Membrana (IMP) presente na superfície celular da célula alvo. As moléculas de neurotoxina modificada são, assim, capazes de controlar a atividade celular (e. g., absorção de glicose) da célula alvo. Os documentos W096/33273 e WO99/17806 descrevem moléculas de neurotoxina clostridial modificadas que direcionam aferentes sensoriais periféricos. As moléculas de neurotoxina modificadas são, assim, capazes de demonstrar um efeito analgésico. 0 documento WO00/10598 descreve a preparação de moléculas de neurotoxina clostridial modificadas que se direcionam para células hipersecretoras de muco (ou células neuronais que controlam as referidas células hipersecretoras de muco), cujas neurotoxinas modificadas são capazes de inibir a hipersecreção das referidas células. 0 documento WOOl/21213 descreve moléculas de neurotoxina clostridial modificadas que se direcionam para uma ampla gama de diferentes tipos de células alvo não neuronais. As moléculas modificadas são, assim, capazes de impedir a secreção a partir das células alvo. Outras publicações no domínio técnico de moléculas tóxicas redirigidas incluem: documentos WOOO/62814; WO00/04926; US 5773586; W093/15766; WOOO/61192 e W099/58571. A substituição de TM acima mencionada pode ser realizada por técnicas de conjugação química convencionais, as quais são bem conhecidas por um especialista. A este respeito, é feita referência a Hermanson, GT (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press e a Wong, SS (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press. A conjugação química é, contudo, muitas vezes imprecisa. Por exemplo, após conjugação, a TM pode tornar-se ligada ao restante do conjugado em mais que um local de ligação. A conjugação química é também difícil de controlar. Por exemplo, a TM pode tornar-se ligada ao restante da toxina modificada num local de ligação no componente de protease e/ou no componente de translocação. Isto é problemático quando é desejada a ligação a apenas um dos referidos componentes (de um modo preferido, num único local) para eficácia terapêutica.

Por este motivo, a conjugação química resulta numa população mista de moléculas de toxina modificadas, a qual é indesejável.

Como uma alternativa à conjugação química, a substituição de TM pode ser realizada por preparação recombinante de uma única proteína de fusão polipeptídica (ver o documento WO98/07864). Esta técnica baseia-se no mecanismo bacteriano in vivo pelo qual a neurotoxina clostridial nativa (i. e., holotoxina) é preparada e resulta numa proteína de fusão com a disposição estrutural seguinte: NH2 - [componente de protease] - [componente de

translocação] - [TM] - COOH

De acordo com o documento WO98/07864, a TM é colocada na direção da extremidade do C-terminal da proteína de fusão. A proteína de fusão é depois ativada por tratamento com uma protease, a qual cliva num local entre o componente de protease e o componente de translocação. Uma proteína de cadeia dupla é assim produzida, compreendendo o componente de protease como uma cadeia polipeptídica única ligada covalentemente (por meio de uma ponte dissulfureto) a outra cadeia polipeptídica única que contém o componente de translocação mais a TM. Embora a metodologia do documento WO98/07864 siga (em termos de arranjo estrutural da proteína de fusão), o sistema de expressão natural da holotoxina clostridial, a presente requerente verificou que este sistema pode resultar na produção de determinadas proteínas de fusão que têm uma capacidade de ligação substancialmente reduzida para a célula alvo pretendida. 0 documento US 5989545 descreve derivados de toxina clostridial. 0 documento W02004/024909 descreve fragmentos de toxinas recombinantes. 0 documento EP 1422240 descreve análogos de nociceptina.

Existe, por esse motivo, uma necessidade de um sistema alternativo ou melhorado para a construção de uma proteína de fusão não citotóxica. A presente invenção aborda um ou mais dos problemas acima mencionados ao proporcionar uma proteína de fusão polipeptídica, de cadeia única, como definida nas reivindicações. O sistema do documento WO98/07864 funciona bem para a preparação de conjugados com uma TM que exige um domínio C-terminal para interação com um Local de Ligação numa célula alvo. A este respeito, o documento WO98/07864 proporciona proteínas de fusão possuindo um domínio C-terminal que é "livre" para interagir com um Local de Ligação numa célula alvo. A presente requerente verificou que esse arranjo estrutural não é adequado para todas as TM. Uma dessas categorias de TM é um grupo de TM que se liga a aferentes sensoriais nociceptivos. Em mais detalhe, a presente requerente verificou que o sistema de proteína de fusão do documento WO 98/07864 não é ótimo para as TM que exigem um domínio N-terminal para interação com um local de Ligação num aferente sensorial nociceptivo. Este problema é particularmente agudo com TM que exigem um resíduo de aminoácido N-terminal específico ou uma sequência específica de resíduos de aminoácidos, incluindo o resíduo de aminoácido N-terminal para interação com um local de Ligação num aferente sensorial nociceptivo.

Em contraste com o documento WO98/07864, a presente invenção proporciona um sistema para preparação de conjugados não citotóxicos, em que o componente de TM do conjugado inclui o domínio de ligação relevante num intra domínio ou numa sequência de aminoácidos localizados em direção ao meio (í. e., da sequência peptídica linear) da TM ou, de um modo preferido, localizada em direção ao N-terminal da TM ou, de um modo mais preferido, no ou perto do N-terminal. 0 domínio N-terminal é capaz de se ligar a um Local de Ligação num aferente sensorial nociceptivo e a TM, de um modo preferido, tem uma exigência para uma sequência específica e definida de resíduo(s) de aminoácido para ser livre no seu N-terminal. 0 componente de protease não citotóxica da presente invenção, é uma protease não citotóxica ou um seu fragmento, cuja protease ou fragmento de protease é capaz de clivar ligações peptídicas diferentes mas específicas numa das três proteínas do substrato, nomeadamente, sinaptobrevina, sintaxina ou SNAP-25, do aparelho de fusão exocítica num aferente sensorial nociceptivo. Estes substratos são importantes componentes da maquinaria neurossecretora. 0 componente de protease não citotóxico da presente invenção é, de um modo preferido, uma protease de IgA de neisseria ou um seu fragmento ou uma neurotoxina clostridial de cadeia L ou um seu fragmento. Um componente de protease não citotóxica particularmente preferido é uma neurotoxina botulínica de cadeia L (BoNT) ou um seu fragmento. 0 componente de translocação da presente invenção permite a translocação da protease não citotóxica (ou seu fragmento) para a célula alvo, de modo que a expressão funcional da atividade de protease ocorra dentro do citosol da célula alvo. 0 componente de translocação é, de um modo preferido, capaz de formar poros permeáveis a iões em membranas lipídicas sob condições de pH baixo. De um modo preferido, verificou-se a utilização apenas das partes da molécula de proteína capazes de formação de poros na membrana endossomal. 0 componente de translocação pode ser obtido de uma fonte de proteína microbiana, em particular, de uma fonte de proteínas virai ou bacteriana. Assim, numa forma de realização, o componente de translocação é um domínio de translocação de uma enzima, tais como uma toxina bacteriana ou proteína virai. 0 componente de translocação da presente invenção é, de um modo preferido, uma neurotoxina clostridial de cadeia H ou um seu fragmento. De um modo mais preferido, é o domínio HN (ou um seu componente funcional), em que HN significa uma parte ou fragmento da cadeia H de uma neurotoxina clostridial, aproximadamente equivalente à metade amino-terminal da cadeia H ou o domínio correspondente a esse fragmento na cadeia H intacta. 0 componente de TM da presente invenção é responsável pela ligação do conjugado da presente invenção a um Local de ligação numa célula alvo. Por este motivo, o componente de TM é simplesmente um ligante através do qual um conjugado da presente invenção se liga a uma célula alvo selecionada.

No contexto da presente invenção, a célula alvo é um aferente sensorial nociceptivo, de um modo preferido, um aferente nociceptivo primário (e. g., uma fibra A, tais como uma fibra Αδ ou uma fibra C) . Por este motivo, os conjugados da presente invenção são capazes de inibir a libertação de neurotransmissor ou neuromodulador [e. g., glutamato, substância P, péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) e/ou neuropéptido Y] de populações discretas de neurónios aferentes sensoriais nociceptivos. Em utilização, os conjugados reduzem ou impedem a transmissão de sinais aferentes sensoriais (e. g., neurotransmissores ou neuromoduladores) de fibras de dor periférica para central e, por esse motivo, têm aplicação como moléculas terapêuticas para o tratamento de dor, em particular, de dor crónica. É rotina confirmar que uma TM liga-se a um aferente sensorial nociceptivo. Por exemplo, pode ser empregue uma experiência de deslocamento radioactivo simples na qual o tecido ou células representativas do aferente sensorial nociceptivo (por exemplo, DRG) são expostos ao ligando marcado (e. g., tritiado) na presença de um excesso de ligando não marcado. Nessa experiência, as proporções relativas da ligação não especifica e especifica podem ser avaliadas permitindo, desse modo, a confirmação de que o ligando se liga à célula alvo aferente sensorial nociceptiva. Opcionalmente, o ensaio pode incluir um ou mais antagonistas de ligação e o ensaio pode ainda compreender a observação de uma perda de ligação do ligando. Exemplos deste tipo de experiência podem ser encontrados em Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, p. 303-311, Em Receptor Biochemistry, A Practical Approach, ed. E.C. Hulme, Oxford University Press.

As proteínas de fusão da presente invenção geralmente demonstram uma reduzida afinidade de ligação (na região de até 100 vezes) para células alvo aferentes sensoriais nociceptivas, quando comparadas com a correspondente TM "livre". No entanto, apesar desta observação, as proteínas de fusão da presente invenção demonstram surpreendentemente boa eficácia. Isto pode ser atribuído a duas caraterísticas principais. Primeiro, o componente de protease não citotóxica é catalítico - assim, o efeito terapêutico de algumas dessas moléculas é rapidamente amplificado. Em segundo lugar, os recetores presentes nos aferentes sensoriais nociceptivos só precisam de agir como uma porta de entrada do terapêutico e não precisam necessariamente de ser estimulados a um nivel necessário para atingir uma resposta farmacológica mediada por ligando-recetor. Por conseguinte, as proteínas de fusão da presente invenção podem ser administradas numa dosagem que é muito menor do que a que seria empregue para outros tipos de moléculas analgésicas, tais como NSAID, morfina e gabapentina. Estas últimas moléculas são tipicamente administradas em quantidades elevadas de microgramas a miligramas (até mesmo centenas de miligramas), enquanto que as proteínas de fusão da presente invenção podem ser administradas em dosagens muito mais baixas, tipicamente, pelo menos, 10 vezes menores e, mais tipicamente, 100 vezes menores. A TM compreende, de um modo preferido, um máximo de 50 resíduos de aminoácidos, de um modo mais preferido, um máximo de 40 resíduos de aminoácidos, de um modo particularmente preferido, um máximo de 30 resíduos de aminoácidos e, de um modo preferido muito preferido, um máximo de 20 resíduos de aminoácidos.

Os opióides representam um grupo preferido de TM da presente invenção. Dentro desta família de péptidos estão incluídas encefalinas (met e leu), endomorfinas 1 e 2, β-endorfina e dinorfina. Os péptidos opióides são frequentemente utilizados na clínica para modificar a atividade de nociceptores e outras células envolvidas na resposta à dor. Como exemplificado pelos três passos da Escada Analgésica da Organização Mundial de Saúde, os opióides têm pontos de entrada no tratamento farmacológico da dor crónica cancerígena e não cancerígena em todos os três passos, sublinhando a sua importância para o tratamento da dor. A referência aos opióides abrange os seus fragmentos, variantes e derivados, os quais mantêm a capacidade de se ligar a aferentes sensoriais nociceptivos. A TM da invenção também pode ser uma molécula que atua como um "agonista" num ou mais dos recetores presentes num aferente sensorial nociceptivo, mais particularmente, sobre um aferente nociceptivo primário. Convencionalmente, um agonista tem sido considerado qualquer molécula que pode aumentar ou diminuir as atividades dentro de uma célula, nomeadamente, qualquer molécula que simplesmente provoca uma alteração da atividade celular. Por exemplo, o significado convencional de um agonista iria incluir uma substância química capaz de combinar com um recetor numa célula e iniciar uma reação ou atividade, ou um fármaco que induz uma resposta ativa por recetores de ativação, se a resposta for um aumento ou diminuição na atividade celular.

No entanto, para os objetivos desta invenção, um agonista é mais especificamente definido como uma molécula que é capaz de estimular o processo de fusão exocítica numa célula alvo, cujo processo é suscetível à inibição por uma protease (ou seu fragmento) capaz de clivar uma proteína do aparelho de fusão exocítica na referida célula alvo.

Por conseguinte, a definição de agonista particular da presente invenção excluiria muitas moléculas que seriam consideradas convencionalmente como agonistas. Por exemplo, o fator de crescimento nervoso (NGF) é um agonista no que diz respeito à sua capacidade de promover a diferenciação neuronal através de ligação a um recetor TrkA. No entanto, o NGF não é um agonista quando avaliado pelos critérios acima, uma vez que não é um indutor principal de fusão exocítica. Além disso, o processo que estimula o NGF (i. e., diferenciação celular) não é suscetível à inibição pela atividade da protease de uma molécula de toxina não citotóxica.

As propriedades agonísticas de uma TM que se liga a um recetor num aferente nociceptivo podem ser confirmadas através dos métodos descritos no Exemplo 10.

Numa forma de realização preferida da invenção, o alvo para a TM é o recetor ORLi. Este recetor é um membro da classe de recetores de proteína G acoplada e tem uma estrutura de sete domínios transmembranares. As propriedades do recetor ORLi são discutidas em detalhe no Mogil & Pasternak (2001), Pharmalogical Reviews, vol. 53, N° 3, páginas 381-415.

Numa forma de realização, a TM é uma molécula que se liga (de um modo preferido, que se liga especificamente) a um recetor ORLi. De um modo mais preferido, a TM é um "agonista" do recetor ORLi. O termo "agonista" neste contexto é definido como acima.

As propriedades agonísticas de uma TM que se liga a um recetor ORLi podem ser confirmadas utilizando os métodos descritos no Exemplo 10. Esses métodos são baseados em experiências anteriores [ver Inoue et al., Proc 1998 [Natl. Acad. Sei., 95, 10949-10953]), as quais confirmam que o agonista natural do recetor ORLi, nociceptina, provoca a indução da libertação de substância P de neurónios aferentes primários nociceptivos. Esta opinião é corroborada pelo facto de que: > as respostas induzidas por nociceptina são abolidas pelos antagonistas do recetor NK1 específicos (o recetor da substância P), e > o pré-tratamento das células com capsaicina (o que diminui a substância P de neurónios aferentes primários de pequeno diâmetro) atenua as respostas induzidas por nociceptina.

De um modo semelhante, Inoue et al., confirmam que uma injeção intraplantar de neurotoxina botulínica tipo A abole as respostas induzidas por nociceptina. Uma vez que é conhecido que BoNT inibe a libertação de substância P de neurónios aferentes primários (Welch et al., 2000, Toxicon, 38, 245-258), isto confirma a ligação entre a interação nociceptina-ORLl e a subsequente libertação da substância P.

Assim, pode-se dizer que a TM tem atividade agonística no recetor ORL1 se a TM provocar uma indução na libertação da substância P de um neurónio aferente sensorial nociceptivo (ver Exemplo 10).

Numa forma de realização particularmente preferida da invenção, a TM é nociceptina - o ligando natural para o recetor ORLi. A nociceptina direciona-se para o recetor ORLi com elevada afinidade. Exemplos de outras TM preferidas incluem:

[1] Mogil & Pasternak, 2001, Pharmacol. Rev., 53, 381-415 [2] Maile et al., 2003, Neurosci. Lett., 350, 190-192 [3] Rizzi et al., 2002, J. Pharmacol. Exp. Therap., 300, 57-63 [4] Okada et al., 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 278, 493-498 [5] Dooley et al., 1997, J Pharmacol Exp Ther. 283(2), 735-41 A TM "variante" acima identificada demonstra afinidade de ligação particularmente boa (quando comparada com a nociceptina natural) para aferentes sensoriais nociceptivos. Isto é surpreendente uma vez que as modificações de aminoácidos ocorrem numa posição afastada do N-terminal da TM. Além disso, as modificações são quase no C-terminal da TM a qual, por sua vez, está ligada a uma sequência polipeptídica grande (i. e., o domínio de translocação) . De modo geral, a proteína de fusão contendo TM irá demonstrar uma redução aproximada de 100 vezes na capacidade de ligação vis-à-vis da TM per se. A TM "variante" acima mencionada demonstra per se um aumento aproximado de 3 a 10 vezes na capacidade de ligação de um aferente sensorial nociceptivo (e. g., por meio do recetor ORLi) vis-à-vis a nociceptina natural. Assim, poderia esperar-se que uma fusão contendo TM "variante" demonstrasse uma redução aproximada de 10 vezes na capacidade de ligação para um aferente sensorial nociceptivo (e. g, por meio do recetor ORLi) vis-à-vis a nociceptina "livre". No entanto, a presente requerente demonstrou que essas proteínas de fusão contendo TM "variante" demonstraram uma capacidade de ligação que reflecte (o mais surpreendentemente) a da nociceptina "livre" - ver Figura 14.

No contexto da presente invenção, o termo opióide ou um agonista do recetor ORLi (tais como nociceptina ou qualquer um dos péptidos listados na tabela acima) engloba moléculas tendo, pelo menos, 70%, de um modo preferido, pelo menos, 80%, de um modo mais preferido, pelo menos, 90% e, o mais preferido, pelo menos, 95% de homologia com o referido opióide ou agonista. Os homólogos agonísticos mantêm as propriedades agonísticas de nociceptina no recetor ORLi, o qual pode ser testado utilizando os métodos proporcionados no Exemplo 10. De um modo semelhante, um homólogo de opióide mantém substancialmente a função de ligação do opióide com o qual este mostra elevada homologia. A invenção também engloba fragmentos, variantes e derivados de qualquer uma das TM descritas acima. Esses fragmentos, variantes e derivados mantêm substancialmente as propriedades que são atribuídas às TM referidas.

Além das classes de opióides e não opióides de TM acima mencionadas, várias outros polipéptidos são adequados para direccionar os conjugados da presente invenção para aferentes sensoriais nociceptivos (e. g., para nociceptores). A este respeito, é feita especial referência à galanina e derivados de galanina. Os recetores de galanina são encontrados pré- e pós-sinapticamente em DRG (Liu & Hokfelt, (2002), Trends Pharm. Sei., 23 (10), 468-74) e são aumentados na expressão durante estados de dor neuropática. Recetores activados por proteinase (PAR) também são um grupo preferido de TM da presente invenção, mais particularmente, PAR-2. É conhecido que os agonistas dos PAR-2 induzem/provocam inflamação aguda, em parte por meio de um mecanismo neurogénico. O PAR2 é expresso por neurónios aferentes espinais primários e os agonistas de PAR2 estimulam a libertação da substância P (SP) e péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) em tecidos periféricos.

Um conjunto particularmente preferido da TM da presente invenção inclui:

0 local de clivagem da protease da presente invenção, permite a clivagem (de um modo preferido, clivagem controlada) da proteína de fusão numa posição entre o componente de protease não citotóxico e o componente de TM. É esta reação de clivagem que converte a proteína de fusão de um polipéptido de cadeia simples num polipéptido de cadeia dupla ligado a dissulfureto.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a TM liga-se por meio de um domínio ou sequência de aminoácidos que se encontra longe do C-terminal da TM. Por exemplo, o domínio de ligação relevante pode incluir um domínio intra ou uma sequência de aminoácidos localizada em direção ao meio (i. e., da sequência peptídica linear) da TM. De um modo preferido, o domínio de ligação relevante encontra-se em direção ao N-terminal da TM, de um modo preferido, no ou próximo do N-terminal.

Numa forma de realização, a fusão polipeptídica de cadeia única pode incluir mais do que um local de clivagem proteolítica. No entanto, quando existem dois ou mais desses sítios, estes são diferentes prevenindo substancialmente, desse modo, a ocorrência de múltiplos eventos de clivagem na presença de uma única protease. Noutra forma de realização, é preferido que a fusão polipeptídica de cadeia única possua um único local de clivagem da protease. A ou as sequências de clivagem da protease podem ser introduzidas (e/ou qualquer sequência de clivagem inerente removida) ao nível do ADN por meios convencionais, tal como por mutagénese sitio-dirigida. 0 rastreio para confirmar a presença de sequências de clivagem, pode ser realizado manualmente ou com o auxílio de software de computador (e. g., o programa MapDraw da DNASTAR, Inc.).

Embora possa ser empregue qualquer local de clivagem da protease, os seguintes são preferidos:

Enterocinase (DDDDKj.)

Fator Xa (IEGRj, /IDGRj,) TEV (vírus Etch do tabaco) (ENLYFQjG)

Trombina (LVPRjGS)

PreScission (LEVLFQjGP)

Também está abrangida pela expressão local de clivagem da protease uma inteína, a qual é uma sequência de auto-clivagem. A reação de auto excisão-união é controlável, por exemplo, variando a concentração de agente de redução presente.

Em utilização, o local de clivagem da protease é clivado e a região N-terminal (de um modo preferido, o N-terminal) da TM fica exposta. 0 polipéptido resultante tem uma TM com um domínio N-terminal ou um domínio intra que é substancialmente livre do restante do conjugado. Esta disposição assegura que o componente N-terminal (ou domínio intra) da TM possa interagir diretamente com um Local de Ligação sobre uma célula alvo.

Numa forma de realização preferida, a TM e o local de clivagem da protease estão distantes um do outro numa proteína de fusão por, no máximo, 10 resíduos de aminoácidos, de um modo mais preferido, no máximo, por 5 resíduos de aminoácidos e, de um modo muito preferido, por zero resíduos de aminoácidos. Por este motivo, após a clivagem do local de clivagem de protease, é proporcionado um conjugado com uma TM que tem um domínio N-terminal que é substancialmente livre do restante do conjugado. Esta disposição assegura que o componente N-terminal da Unidade de Direcionamento possa interagir diretamente com um Local de Ligação com uma célula alvo.

Uma vantagem associada ao passo de ativação mencionado acima, é que a TM só se torna suscetível à degradação do N-terminal, quando ocorreu a clivagem proteolítica da proteína de fusão. Além disso, a seleção de um local específico de clivagem da protease permite a ativação seletiva da fusão polipeptídica numa conformação de cadeia dupla. A construção da fusão polipeptídica de cadeia única da presente invenção coloca o local de clivagem da protease entre a TM e o componente de protease não citotóxica.

Na fusão de cadeia única, a TM está localizada entre o local de clivagem da protease e o componente de translocação. Isto assegura que a TM está ligada ao domínio de translocação (i. e., como ocorre com a holotoxina clostridial nativa), embora no caso da presente invenção a ordem dos dois componentes seja invertida vis-à-vis com a holotoxina nativa. Uma outra vantagem desta disposição é que a TM está localizada numa região de ansa exposta da proteína de fusão, a qual tem efeitos estruturais mínimos sobre a conformação da proteína de fusão. A este respeito, a referida ansa é variadamente referida como o ligante, a ansa de ativação, o ligante inter-domínio ou apenas a ansa exposta de superfície (Schiavo et al.r 2000, Phys. Rev., 80, 717-766; Turton et al., 2002, Trends Biochem. Sei., 27, 552-558) .

Numa forma de realização, no polipéptido de cadeia única, o componente de protease não citotóxica e o componente da translocação estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfureto. Por este motivo, após a clivagem do local de clivagem da protease, o polipéptido assume uma conformação de cadeia dupla, em que os componentes de protease e translocação permanecem ligados um ao outro pela ligação dissulfureto. Os componentes de protease e translocação estão separados um ao outro na proteína de fusão de cadeia única por um máximo de 100 resíduos de aminoácidos, de um modo mais preferido, por um máximo de 80 resíduos de aminoácidos, de um modo particularmente preferido, por um máximo de 60 resíduos de aminoácidos e, de um modo muito preferido, por um máximo de 50 resíduos de aminoácidos.

Numa forma de realização, o componente de protease não citotóxica forma uma ligação dissulfureto com o componente de translocação da proteína de fusão. Por exemplo, o resíduo do aminoácido do componente de protease que forma a ligação dissulfureto está localizado dentro dos 20 últimos, de um modo preferido, dentro dos últimos 10 resíduos de aminoácidos C-terminais do componente de protease. Do mesmo modo, o resíduo do aminoácido dentro do componente de translocação que forma a segunda parte da ligação dissulfureto pode estar localizado dentro dos primeiros 20, de um modo preferido, nos primeiros 10 resíduos de aminoácidos N-terminais do componente de translocação.

Em alternativa, no polipéptido de cadeia única, o componente de protease não citotóxica e a TM podem ser ligados um ao outro por uma ligação dissulfureto. A este respeito, o resíduo de aminoácido da TM que forma a ligação dissulfureto está, de um modo preferido, situado fora do N-terminal da TM, de um modo mais preferido, em direção ao C-terminal da TM.

Numa forma de realização, o componente de protease não citotóxica forma uma ligação dissulfureto com o componente TM da proteína de fusão. A este respeito, o resíduo de aminoácido do componente de protease que forma a ligação dissulfureto está, de um modo preferido, situado dentro dos 20 últimos, de um modo mais preferido, nos últimos 10 resíduos de aminoácidos C-terminais do componente de protease. Do mesmo modo, o resíduo do aminoácido dentro do componente de TM que constitui a segunda parte da ligação dissulfureto está, de um modo preferido, situado dentro dos 20 últimos, de um modo mais preferido, dentro dos últimos 10 resíduos de aminoácidos C-terminais da TM.

As disposições de ligações dissulfureto acima têm a vantagem de que os componentes de protease e translocação estão dispostos de um modo semelhante ao da neurotoxina clostridial nativa. A título de comparação, referindo-se à sequência primária de aminoácidos para neurotoxina clostridial nativa, os respetivos resíduos de aminoácidos de cisteína estão afastados um do outro por, entre 8 e 27 resíduos de aminoácidos - retirado de Popoff, MR & Marvaud, J-C, 1999, Structural & genomic features of clostridial neurotoxins, Capítulo 9, em The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, Ed. Alouf & Freer:

informação apenas a partir de estirpes proteolíticas A proteína de fusão pode compreender um ou mais marcadores de purificação, os quais estão localizados N-terminalmente em relação ao componente da protease e/ou C-terminalmente em relação ao componente de translocação.

Embora possa ser empregue qualquer marcador de purificação, os seguintes são preferidos:

Marcador de His (e. g., 6 x histidina) , de um modo preferido, como um marcador C-terminal e/ ou N-terminal

Marcador de MBP (proteína de ligação a maltose) , de um modo preferido, como um marcador N-terminal

Marcador de GST (glutationa-S-transferase), de um modo preferido, como um marcador N-terminal

Marcador de His-MBP, de um modo preferido, como um marcador N-terminal

Marcador de GST-MBP, de um modo preferido, como um marcador N-terminal

Marcador de tiorredoxina, de um modo preferido, como um marcador N-terminal

Marcador de CBD (Domínio de Ligação a Quitina) , de um modo preferido, como um marcador N-terminal.

De acordo com a forma de realização adicional da presente invenção, uma ou mais moléculas espaçadoras peptídicas podem ser incluídas na proteína de fusão. Por exemplo, um espaçador peptídico pode ser incluído entre um marcador de purificação e o resto da molécula de proteína de fusão (e. g., entre um marcador de purificação N-terminal e um componente de protease da presente invenção e/ou entre um marcador de purificação C-terminal e um componente de translocação da presente invenção). Um espaçador peptídico também pode ser empregue entre os componentes de TM e translocação da presente invenção.

Uma variedade de diferentes moléculas pode ser empregue em qualquer das proteínas de fusão da presente invenção. Exemplos dessas moléculas espaçadoras incluem as ilustradas nas Figuras 28 e 29. É aqui feita particular menção a GS15, GS20, GS25 e Hx27 - ver Figuras 28 e 29. A presente requerente verificou inesperadamente que as proteínas de fusão (e. g., CPNv/A) da presente invenção podem demonstrar uma melhoria na atividade de ligação para aferentes sensoriais nociceptivos quando o tamanho do espaçador é selecionado de modo que (em utilização) , o C-terminal da TM e N-terminal do componente de translocação sejam separados um do outro por 40-105 angstroms, de um modo preferido, por 50-100 angstroms e, de um modo ainda mais preferido, por 50-90 angstroms. Noutra forma de realização, os espaçadores preferidos têm uma sequência de aminoácidos de 11-29 resíduos de aminoácidos, de um modo preferido, 15-27 resíduos de aminoácidos e, de um modo mais preferido, 20-27 resíduos de aminoácidos. Espaçadores adequados podem ser rotineiramente identificados e obtidos de acordo com Crasto, C.J. e Feng, J.A. (2000) Maio, 13 (5), p. 309-312 - ver também http://www.fccc./edu/research/labs/feng/limker.html.

De acordo com um segundo aspeto da presente invenção, é proporcionada uma sequência de ADN que codifica o polipéptido de cadeia única acima mencionado. Num aspeto preferido da presente invenção, a sequência de ADN é preparada como parte de um vetor de ADN, em que o vetor compreende um promotor e um terminador.

Numa forma de realização preferida, o vetor tem um promotor selecionado de:

Promotor Agente de Indução Condições Típicas de

Indução

Tac (híbrido) IPTG 0,2 mM (0,05-2,0 mM)

AraBAD L-arabinose 0,2% (0,002-0,4%)

Operador T7-lac IPTG 0,2 mM (0,05-2,0 mM) A construção de ADN da presente invenção é, de um modo preferido, concebida in silico e, depois, sintetizada por técnicas de síntese de ADN convencional. A informação da sequência de ADN mencionada acima é opcionalmente modificada por influência de codão de acordo com o sistema de expressão da célula hospedeira (e. g., E. coli) definitivo que está a ser empregue. A estrutura do ADN é, de um modo preferido, rastreada para qualquer sequência de ácido nucleico inerente, a qual, quando transcrita e traduzida, produzirá uma sequência de aminoácidos correspondente ao local de clivagem da protease codificada pela segunda sequência de codificação do péptido. Este rastreio pode ser realizado manualmente ou com o auxílio de software de computador (e. g., o programa MapDraw da DNASTAR, Inc.).

De acordo com uma forma de realização adicional da presente invenção, é proporcionado um método de preparação de um agente não citotóxico, compreendendo: a. colocar em contacto uma proteína de fusão polipeptídica de cadeia única da invenção com uma protease capaz de clivar o local de clivagem de protease; b. clivar o local de clivagem da protease e, desse modo, formar uma proteína de fusão de cadeia dupla.

Este aspeto proporciona um polipéptido de cadeia dupla, o qual geralmente mimetiza a estrutura da holotoxina clostridial. Em mais detalhe, o polipéptido de cadeia dupla resultante tem tipicamente uma estrutura em que: a. a primeira cadeia compreende a protease não citotóxica ou um seu fragmento, cuja protease ou fragmento de protease é capaz de clivar uma proteína do aparelho de fusão exocítica de um aferente sensorial nociceptivo; b. a segunda cadeia compreende a TM e o domínio de translocação que é capaz de translocar a protease ou fragmento de protease de dentro de um endossoma, através da membrana endossomal e para o citosol do aferente sensorial nociceptivo; e a primeira e segunda cadeias estão ligadas uma à outra por dissulfureto.

De acordo com um aspeto adicional da presente invenção, é proporcionada a utilização de um polipéptido de cadeia única ou de cadeia dupla da invenção, para o fabrico de um medicamento para tratar, prevenir ou amenizar a dor.

De acordo com um aspeto relacionado, a descrição descreve um método para tratar, prevenir ou amenizar a dor num indivíduo, compreendendo administrar ao referido doente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido de cadeia única ou de cadeia dupla da invenção. A presente invenção aborda uma ampla gama de estados de dor, em particular, estados de dor crónica. As condições preferidas incluem dor cancerígena e não cancerígena, dor inflamatória e dor neuropática. As fusões de opióides do presente pedido são particularmente adequadas para abordar a dor inflamatória, embora possam ser menos adequadas para abordar a dor neuropática. As fusões de galanina são mais adequadas para abordar a dor neuropática.

Em utilização, os polipéptidos da presente invenção são tipicamente empregues na forma de uma composição farmacêutica, em associação com um veículo, diluente e/ou excipiente farmacêutico, embora a forma exata da composição possa ser adaptada ao modo de administração. A administração é, de um modo preferido, a um mamífero, de um modo mais preferido, a um humano.

Os polipéptidos podem, por exemplo, ser empregues na forma de uma solução estéril para administração intra-articular ou administração intracraniana. A injeção espinal (e. g., epidural ou intratecal) é preferida.

As gamas de dosagem para a administração dos polipéptidos da presente invenção são aquelas para produzir o efeito terapêutico desejado. Será entendido que a gama de dosagem necessária depende da natureza exata dos componentes, da via de administração, da natureza da formulação, da idade do doente, da natureza, extensão ou gravidade do estado do doente, contra-indicações, se houver, e avaliação do médico assistente.

As dosagens diárias adequadas estão na gama de 0,0001-1 mg/kg, de um modo preferido, 0001-0,5 mg/kg, de um modo mais preferido, 0,002-0,5 mg/kg e, de um modo particularmente preferido, 0,004-0,5 mg/kg. A dosagem unitária pode variar de menos que 1 micrograma a 30 mg mas, tipicamente, estará na gama de 0,01 a 1 mg por dose, a qual pode ser administrada diariamente ou, de um modo preferido, menos frequentemente, tais como semanal ou semestral.

Um regime de dosagem particularmente preferido é baseado em 2,5 ng de proteina de fusão (e. g. , CPNv/A) como a dose IX. A este respeito, as dosagens preferidas estão na gama de 1X-100X (i. e., 2,5-250 ng) . Esta gama de dosagem é significativamente menor (i. e., pelo menos, 10 vezes, tipicamente, 100 vezes menor) do que a que poderia ser empregue com outros tipos de moléculas analgésicas, tais como NSAID, morfina e gabapentina. Além disso, a diferença acima mencionada é consideravelmente ampliada quando a mesma comparação é feita numa base molar -isto é, devido às proteínas de fusão da presente invenção possuírem um Pm consideravelmente maior do que as terapêuticas de molécula "pequenas" convencionais.

Contudo, são esperadas grandes variações na dosagem necessária, em função da natureza precisa dos componentes e das diferentes eficiências das várias vias de administração.

As variações nestes níveis de dosagem podem ser ajustadas utilizando rotinas empíricas padrão para a optimização, como é bem compreendido na técnica.

As composições apropriadas para a injeção podem estar na forma de soluções, suspensões ou emulsões ou pós secos, os quais são dissolvidos ou suspensos num veiculo adequado, antes da utilização.

As formas de dosagem de unidade fluida são preparadas, tipicamente, utilizando um veiculo apirogénico estéril. Os ingredientes ativos, dependendo do veiculo e da concentração utilizada, podem ser dissolvidos ou suspensos no veiculo.

Na preparação de soluções administráveis, os polipéptidos podem ser dissolvidos num veiculo, sendo preparada a solução isotónica, se necessário, pela adição de cloreto de sódio e esterilizada por filtração através de um filtro estéril utilizando técnicas de assepsia adequadas antes do enchimento em frasquinhos ou ampolas estéreis adequados e vedação. Em alternativa, se a estabilidade da solução for adequada, a solução nos seus recipientes vedados pode ser esterilizada por autoclave.

De um modo vantajoso, aditivos, tais como agentes tampão, solubilizantes, estabilizantes, conservantes ou bactericidas, de suspensão ou emulsionantes podem ser dissolvidos no veiculo.

Os pós secos, os quais são dissolvidos ou suspensos num veiculo apropriado antes da utilização, podem ser preparados por enchimento da substância farmacológica pré-esterilizada e outros ingredientes num recipiente esterilizado, utilizando técnica assética numa área estéril.

Em alternativa, os polipéptidos e outros ingredientes podem ser dissolvidos num veiculo aquoso, a solução ser esterilizada por filtração e distribuída em recipientes adequados, utilizando uma técnica assética numa área estéril. 0 produto é, então, liofilizado e os recipientes são vedados de modo assético.

As suspensões parentéricas, adequadas para injeção intramuscular, subcutânea ou intradérmica, são preparadas de modo substancialmente semelhante, exceto que os componentes estéreis são suspensos no veiculo estéril em vez de serem dissolvidos e a esterilização não pode ser realizada por filtração. Os componentes podem ser isolados num estado estéril ou, em alternativa, podem ser esterilizados após isolamento, e. g., por radiação gama.

De um modo vantajoso, um agente de suspensão, por exemplo, polivinilpirrolidona, é incluído na ou nas composições para facilitar a distribuição uniforme dos componentes.

Secção de Definições

Unidade de Direcionamento (TM) significa qualquer estrutura química associada a um agente que interage funcionalmente com um Local de Ligação para provocar uma associação física entre o agente e a superfície de uma célula alvo. No contexto da presente invenção, a célula alvo é um aferente sensorial nociceptivo. 0 termo TM abrange qualquer molécula (i. e., uma molécula de ocorrência natural ou uma sua variante modificada quimicamente/fisicamente) que é capaz de se ligar a um Local de Ligação na célula alvo, cujo Local de Ligação é capaz de internalização (e. g., formação de endossoma) - também referida como endocitose mediada por recetor. A TM pode possuir uma função de translocação da membrana endossomal, caso em que os componentes de TM e de domínio de translocação separados não precisam estar presentes num agente da presente invenção. A TM da presente invenção liga-se (de um modo preferido, liga-se especificamente) a um aferente sensorial nociceptivo (e. g., um aferente nociceptivo primário) . A este respeito, liga-se especificamente significa que a TM liga-se a um aferente sensorial nociceptivo (e. g., um aferente nociceptivo primário) com uma maior afinidade do que se liga a outros neurónios, tais como aferentes não nociceptivos e/ou neurónios motores (i. e., o alvo natural para a neurotoxina clostridial holotoxina). A expressão "liga-se especificamente" também pode significar que uma dada TM se liga a um dado recetor, por exemplo, o recetor ORLi com uma afinidade de ligação (Ka) de 106 M_1 ou superior, de um modo preferido, 107 M_1 ou superior, de um modo mais preferido, 108 M_1 ou superior e, de um modo muito preferido, 109 M_1 ou superior.

Para os objetivos desta invenção, um agonista é definido como uma molécula que é capaz de estimular o processo de fusão exocítica numa célula alvo, cujo processo é suscetível à inibição por uma protease (ou seu fragmento) capaz de clivar uma proteína do aparelho de fusão exocítica na referida célula alvo.

Por conseguinte, a definição de agonista particular da presente invenção excluiria muitas moléculas que seriam consideradas convencionalmente como agonistas.

Por exemplo, o fator de crescimento nervoso (NGF) é um agonista no que diz respeito à sua capacidade de promover a diferenciação neuronal por meio de ligação a um recetor TrkA. No entanto, o NGF não é um agonista quando avaliado pelos critérios acima, uma vez que não é um indutor principal de fusão exocitica. Além disso, o processo que o NGF estimula (i. e., diferenciação celular) não é suscetível à inibição pela atividade da protease de uma molécula de toxina não citotóxica. 0 termo "fragmento", quando utilizado em relação a uma proteína, significa um péptido que tem, pelo menos, trinta e cinco, de um modo preferido, pelo menos, 25, de um modo mais preferido, pelo menos, vinte e, de um modo muito preferido, pelo menos, dez resíduos de aminoácidos da proteína em questão. 0 termo "variante", quando utilizado em relação a uma proteína, significa um péptido ou um fragmento peptídico da proteína que contém um ou mais análogos de um aminoácido (e. g., um aminoácido não natural) ou uma ligação substituída. 0 termo "derivado", quando utilizado em relação a uma proteína, significa uma proteína que compreende a proteína em questão e, ainda, uma sequência peptídica. A sequência peptídica seguinte deve, de um modo preferido, não interferir com o enrolamento básico e, assim, com a estrutura conformacional da proteína original. Dois ou mais péptidos (ou fragmentos ou variantes) podem ser ligados um ao outro para formar um derivado. Em alternativa, um péptido (ou fragmento ou variante) pode ser ligado a uma molécula independente (e. g., um segundo péptido, não relacionado). Os derivados podem ser sintetizados quimicamente, mas serão preparados tipicamente por métodos de recombinação de ácidos nucleicos. Podem ser incluídos componentes adicionais, tais como componentes lipídicos e/ou polissacarídicos e/ou policetídios.

Ao longo desta descrição, a referência ao "recetor ORLi" abrange todos os membros da família do recetor ORLi. Os membros da família do recetor ORLi têm tipicamente uma estrutura de sete domínios transmembranares e são acoplados a proteínas G das famílias Gi e Go- Um método para determinar a atividade de estimulação da proteína G dos ligantes do recetor ORLi é dado no Exemplo 12. Um método para medir a redução em níveis celulares de AMPc após a ativação de ORLi é dado no Exemplo 11. Uma outra característica dos membros da família do recetor ORLi é que estes são tipicamente capazes de se ligar à nociceptina (o ligando natural de ORLi) . Como um exemplo, todas as variantes de excisão-união alternativas do recetor ORLi, são membros da família do recetor ORLi. A expressão não citotóxica significa que a molécula de protease em questão não mata a célula alvo para a qual esta foi redirigida. A protease da presente invenção abrange todas as proteases não citotóxicas de ocorrência natural que são capazes de clivar uma ou mais proteínas do aparelho de fusão exocítica em células eucarióticas. A protease da presente invenção é, de um modo preferido, uma protease bacteriana (ou seu fragmento) . De um modo mais preferido, a protease bacteriana é selecionada do género Clostridium ou Neisseria (e. g., uma cadeia L clostridial ou uma protease IgA de neisseria, de um modo preferido, de N. gonorrhoeae) . A presente invenção também abrange proteases não citotóxicas modificadas, as quais incluem sequências de aminoácidos que não ocorrem na natureza e/ou resíduos de aminoácidos sintéticos, desde que as proteases modificadas continuem a demonstrar a atividade de protease acima mencionada. A protease da presente invenção demonstra, de um modo preferido, uma atividade de serina ou metaloprotease (e. g., atividade de endopeptidase). A protease é, de um modo preferido, específica para uma proteína SNARE (e. g., SNAP-25, sinaptobrevina/VAMP ou sintaxina). É feita particular menção aos domínios de protease de neurotoxinas, por exemplo, os domínios de protease de neurotoxinas bacterianas. Por este motivo, a presente invenção abrange a utilização de domínios de neurotoxina, os quais ocorrem na natureza, assim como versões recombinantemente preparadas das referidas neurotoxinas de ocorrência natural.

As neurotoxinas exemplificativas são produzidas por clostrídios e a expressão neurotoxina clostridial abrange neurotoxinas produzidas pelos serotipos A-G de C. tetani (TeNT) e C. botulinum (BoNT), bem como as neurotoxinas semelhantes a BoNT produzidas por C. baratii e C. butyricum. As abreviaturas mencionadas acima são utilizadas ao longo da presente descrição. Por exemplo, a nomenclatura BoNT/A denota a fonte da neurotoxina como BoNT (serotipo A) . A nomenclatura correspondente aplica-se a outros serotipos BoNT. A expressão fragmento de cadeia L significa um componente da cadeia L de uma neurotoxina, cujo fragmento demonstra uma atividade de metaloprotease e é capaz de clivar proteoliticamente uma proteína associada a vesícula e/ou membrana plasmática envolvida na exocitose celular.

Um Domínio de Translocação é uma molécula que permite a translocação de uma protease (ou seu fragmento) para uma célula alvo, de modo que uma expressão funcional da atividade da protease ocorra dentro do citosol da célula alvo. Se qualquer molécula (e. g., uma proteína ou péptido) possui a função de translocação necessária da presente invenção pode ser confirmado por qualquer um de vários ensaios convencionais.

Por exemplo, Shone C. (1987) descreve um ensaio in vitro empregando lipossomas, os quais são desafiados por uma molécula de teste. A presença da função de translocação necessária é confirmada pela libertação dos lipossomas de K+ e/ou NAD marcado, o que pode ser facilmente monitorizado [ver Shone C. (1987) Eur. J. Biochem, vol. 167 (1): p. 175-180].

Um outro exemplo é proporcionado por Blaustein R. (1987), o qual descreve um ensaio in vitro simples empregando membranas de bicamada fosfolipídica planar. As membranas são desafiadas com uma molécula de teste e a função de translocação necessária é confirmada por um aumento na condutância através das referidas membranas [ver Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, n° 1: p. 115-120] . É proporcionada metodologia adicional para permitir a avaliação da fusão de membrana e, assim, a identificação de Domínios da Translocação adequados para utilização na presente invenção por Methods in Enzymology, Vol. 220 e 221, Membrane Fusion Techniques, Partes A e B, Academic Press 1993. O Domínio de Translocação é, de um modo preferido, capaz de formar poros permeáveis a iões em membranas lipídicas sob condições de baixo pH. De um modo preferido, verificou-se a utilização apenas das partes da molécula de proteína capazes de formação de poros dentro da membrana endossomal. 0 Domínio de Translocação pode ser obtido de uma fonte proteica microbiana, em particular, de uma fonte proteica virai ou bacteriana. Assim, numa forma de realização, o Domínio de Translocação é um domínio de translocação de uma enzima, tais como uma toxina bacteriana ou proteína virai.

Está bem documentado que determinados domínios de moléculas de toxina bacterianas são capazes de formar esses poros. Sabe-se também que determinados domínios de translocação de proteínas de fusão membranares viralmente expressas são capazes de formar esses poros. Esses domínios podem ser empregues na presente invenção. 0 Domínio de Translocação pode ser de origem clostridial, nomeadamente o domínio HN (ou um seu componente funcional). HN significa uma parte ou fragmento da cadeia H de uma neurotoxina clostridial, aproximadamente equivalente à metade amino-terminal da cadeia H ou do domínio correspondente a esse fragmento na cadeia H intacta. É preferido que a cadeia H não tenha substancialmente a função de ligação natural do componente Hc da cadeia Η. A este respeito, a função Hc pode ser removida por delecção da sequência de aminoácidos Hc (ao nível da síntese de ADN ou ao nível da pós-síntese por tratamento com nuclease ou protease) . Em alternativa, a função Hc pode ser inativada por tratamento químico ou biológico. Por este motivo, a cadeia H é, de um modo preferido, incapaz de se ligar ao Local de Ligação de numa célula alvo à qual a neurotoxina clostridial nativa (i. e., holotoxina) se liga.

Numa forma de realização, o domínio de translocação é um domínio HN (ou um seu fragmento) de uma neurotoxina clostridial. Exemplos de Domínios de Translocação clostridial adequados incluem:

Neurotoxina botulínica tipo A - resíduos de aminoácidos (449-871)

Neurotoxina botulínica tipo B - resíduos de aminoácidos (441-858)

Neurotoxina botulínica tipo C - resíduos de aminoácidos (442-866)

Neurotoxina botulínica tipo D - resíduos de aminoácidos (446-862)

Neurotoxina botulínica tipo E - resíduos de aminoácidos (423-845)

Neurotoxina botulínica tipo F - resíduos de aminoácidos (440-864)

Neurotoxina botulínica tipo G - resíduos de aminoácidos (442-863)

Neurotoxina do Tétano - resíduos de aminoácidos (458-879)

Para detalhes adicionais sobre a base genética da produção de toxinas em Clostridium botulinum e C. tetani, a requerente refere-se a Henderson et ai., (1997), em The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic Press. O termo HN abrange partes HN de neurotoxina de ocorrência natural e partes HN modificadas tendo sequências de aminoácidos que não ocorrem na natureza e/ou resíduos de aminoácidos sintéticos, desde que as partes HN modificadas demonstrem ainda a função de translocação acima mencionada.

Em alternativa, o Domínio de Translocação pode ser de uma origem não clostridial (ver Tabela 4). Exemplos de origens de Domínios de Translocação não clostridiais incluem, mas não estão restritos ao domínio de translocação da toxina da difteria [0=Keefe et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al., J. Biol. Chem.(1993) 269, 22524-22532; e London E., Biochem. Biophys. Acta. (1992) , 1112, p. 25-51], o domínio de translocação de exotoxina tipo A de Pseudomonas [Prior et al., Biochemistry (1992) 31, 3555-3559], os domínios de translocação da toxina do antraz [Blanke et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1996) 93, 8437-8442], vários péptidos fusogénicos ou hidrófobos de função de translocação [Plank et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924; e Wagner et al., (1992) PNAS, 89, p. 7934-7938] e péptidos anfifílicos [Murata et al., (1992) Biochem., 31, p. 1986-1992]. O Domínio de Translocação pode espelhar o Domínio de Translocação presente numa proteína de ocorrência natural ou pode incluir variações de aminoácidos, desde que as variações não destruam a capacidade de translocação do Domínio de Translocação.

Exemplos particulares de Domínios de Translocação virais adequados para utilização na presente invenção, incluem determinados domínios de translocação de proteínas de fusão membranares viralmente expressas. Por exemplo, Wagner et al., (1992) e Murata et al., (1992) descrevem a função de translocação (i. e., fusão da membrana e vesiculação) de uma série de péptidos fusogénicos e anfifílicos derivados da região N-terminal da hemaglutinina do vírus de influenza. Outras proteínas de fusão membranares viralmente expressas conhecidas por terem a atividade de translocação desejada são um domínio de translocação de um péptido fusogénico de Vírus da Floresta de Semliki (SFV), um domínio de translocação da glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV), um domínio de translocação da proteína F do vírus SER e um domínio de translocação da glicoproteína do envelope do vírus Foamy. Proteínas Aspike codificadas viralmente têm aplicação particular no contexto da presente invenção, por exemplo, a proteína El do SFV e a proteína G da proteína G de VSV. A utilização dos Domínios de Translocação listados na Tabela (abaixo) inclui a utilização das suas sequências variantes. Uma variante pode incluir uma ou mais substituições conservadoras do ácido nucleico e/ou deleções ou inserções de ácidos nucleicos, com a condição de que a variante possua a função de translocação necessária. Uma variante também pode compreender uma ou mais substituições de aminoácidos e/ou deleções ou inserções de aminoácidos, desde que a variante possui a função de translocação necessária.

Figuras

Figura 1 Purificação de uma proteína de fusão

LC/A-nociceptina-HN/A

Figura 2 Purificação de uma proteína de fusão

nociceptina-LC/A-HN/A

Figura 3 Purificação de uma proteína de fusão

LC/C-nociceptina-HN/C

Figura 4 Purificação de uma proteína de fusão LC/A-met-

encefalina-HN/A

Figura 5 Comparação da eficácia de ligação de uma

proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A e uma proteína de fusão nociceptina-LC/A-HN/A

Figura 6 Atividade catalítica in vitro de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A

Figura 7 Purificação de uma proteína de fusão

LC/A-nociceptina variante-HN/A

Figura 8 Comparação da eficácia de ligação de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A e uma proteína de fusão LC/A-nociceptina

variante-HN/A

Figura 9 Família de proteínas de fusão LC/A-nociceptina-HN/A expressas/purifiçadas com produto(s) de comprimento variável de espaçador

Figura 10 Inibição da libertação de SP e de clivagem de

SNAP-25 por CPN-A

Figura 11 Inibição da libertação de SP e de clivagem de

SNAP-25 durante longos períodos de tempo após a exposição de DRG a CPN-A

Figura 12 Clivagem de SNAP-25 por CPNv-A

Figura 13 Clivagem de SNAP-25 durante longos períodos de

tempo após exposição de DRG a CPNv-A

Figura 14 Deslocamento mediado por fusão de CPNv-A de ligação de [3H]-nociceptina

Figura 15 Produto de CPNv(Ek)-A expresso/purifiçado

Figura 16 Clivagem da SNAP-25 por CPNv(Ek)-A

Figura 17 Produto de CPNv(Ek)-C expresso/purifiçado

Figura 18 Clivagem de sintaxina por CPNv-C

Figura 19 Eficácia de CPN-A no modelo Mecânico de Alodinia Aguda Induzida por Capsaicina

Figura 20 Eficácia de CPN-A no modelo de Neuropatia

Diabética Periférica (Dor Neuropática) Induzida por estreptozotocina (STZ)

Figura 21 Eficácia de CPNv-A no modelo Mecânico de

Alodinia Aguda Induzida por Capsaicina

Figura 22 Produto de LC/A-CPLE-HN/A expresso/purifiçado

Figura 23 Produto de LC/A-CPBE-HN/A expresso/purifiçado

Figura 24 Produto de CPOP-A expresso/purifiçado

Figura 25 Produto de CPOPv-A expresso/purifiçado

Figura 26 Clivagem de SNAP-25 in vitro, num modelo de célula DRG

Figura 27 CPNv-A-FXa-HT expresso/purifiçado (marcador de His removível)

Figura 28 Eficácia in vitro de proteínas de fusão LC/A-nociceptina-HN/A com o comprimento variável de espaçador, como avaliado pelo ensaio de competição de ligando

Figura 29 Eficácia in vitro de proteínas de fusão LC/A-nociceptina-HN/A com o comprimento variável de espaçador, como avaliado pela clivagem in vitro de SNAP-25

As Figuras são agora descritas em maior detalhe.

Figura 1 - Purificação de uma proteína de fusão

LC/A-nociceptina-HN/A

Utilizando a metodologia delineada no Exemplo 9, foi purificada uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A a partir de células BL21 de E. coli. Resumidamente, os produtos solúveis obtidos depois do rompimento das células foram aplicados a uma coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As proteínas ligadas foram eluídas com 100 mM de imidazole, tratadas com Fator Xa para ativar a proteína de fusão e remover o marcador da proteína de ligação de maltose (MBP), aplicadas novamente, depois, a uma segunda coluna de captura de afinidade carregada com níquel. Amostras do processo de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE (Painel A) e transferência de Western (Painel B). Foram utilizados anti-soros de anti-nociceptina (obtidos de Abeam) como o anticorpo primário para transferência de Western. O material purificado final na ausência e presença de agente redutor é identificado nas pistas marcadas com [-] e [+], respetivamente.

Figura 2 - Purificação de uma proteína de fusão

nociceptina-LC/A-HN/A

Utilizando a metodologia delineada no Exemplo 9, foi purificada uma proteína de fusão nociceptina-LC/A-HN/A a partir de células BL21 de E. coli. Resumidamente, os produtos solúveis obtidos depois do rompimento das células foram aplicados a uma coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As proteínas ligadas foram eluídas com 100 mM de imidazole, tratadas com Fator Xa para ativar a proteína de fusão e remover o marcador da proteína de ligação de maltose (MBP), aplicadas novamente, depois, a uma segunda coluna de captura de afinidade carregada com níquel. Amostras do processo de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE (Painel A) e transferência de Western (Painel B). Foram utilizados anti-soros de anti-nociceptina (obtidos de Abeam) como o anticorpo primário para transferência de Western. O material purificado final na ausência e presença de agente redutor é identificado nas pistas marcadas com [-] e [+], respetivamente.

Figura 3 - Purificação de uma proteína de fusão

LC/C-nociceptina-HH/C

Utilizando a metodologia delineada no Exemplo 9, foi purificada uma proteína de fusão LC/C-nociceptina-HN/C a partir de células BL21 de E. coli. Resumidamente, os produtos solúveis obtidos depois do rompimento das células foram aplicados a uma coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As proteínas ligadas foram eluídas com 100 mM de imidazole, tratadas com Fator Xa para ativar a proteína de fusão e remover o marcador da proteína de ligação de maltose (MBP), aplicadas novamente, depois, a uma segunda coluna de captura de afinidade carregada com níquel. Amostras do processo de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE (Painel A) e transferência de Western (Painel B). Foram utilizados anti-soros de anti-nociceptina (obtidos de Abeam) como o anticorpo primário para transferência de Western. 0 material purificado final na ausência e presença de agente redutor é identificado nas pistas marcadas com [-] e [+], respetivamente.

Figura 4 - Purificação de uma proteína de fusão

LC/A-met-encefalina-HN/A

Utilizando a metodologia delineada no Exemplo 9, foi purificada uma proteína de fusão LC/A-met-encefalina-HN/A a partir de células BL21 de E. coli. Resumidamente, os produtos solúveis obtidos depois do rompimento das células foram aplicados a uma coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As proteínas ligadas foram eluídas com 100 mM de imidazole, tratadas com Fator Xa para ativar a proteína de fusão e remover o marcador da proteína de ligação de maltose (MBP), aplicadas novamente, depois, a uma segunda coluna de captura de afinidade carregada com níquel. Amostras do processo de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE. O material purificado final na ausência e presença de agente redutor é identificado nas pistas marcadas com [-] e [+], respetivamente.

Figura 5 - Comparação da eficácia de ligação de uma

proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A e uma proteína de fusão nociceptina-LC/A-HN/A A capacidade das fusões de nociceptina para se ligarem ao recetor ORLi foi avaliada utilizando um ensaio simples baseado em competição. As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de material de teste na presença de 1 nM de [ 3H]-nociceptina. A redução na ligação específica do ligando radiomarcado foi avaliada por contagem de cintilação e representada graficamente em comparação com a eficácia do ligando não marcado (Tocris nociceptina). É claro que a fusão LC/A-nociceptina-HN/A é muito superior à fusão nociceptina-LC/A-HN/A na interação com o recetor ORLi.

Figura 6 - Atividade catalítica in vitro de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A A atividade de endopeptidase in vitro da proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A purificada foi determinada, essencialmente, como descrito em Chaddock et ai., 2002, Prot. Express Purif. 25, 219-228. Resumidamente, o péptido SNAP-25 imobilizado para uma placa de ELISA foi exposto a diferentes concentrações de proteína de fusão durante uma hora, a 37 °C. Após uma série de lavagens, a quantidade de péptido SNAP-25 clivado foi quantificada pela reação com anti-soros específicos.

Figura 7 - Purificação de uma proteína de fusão

LC/A-nociceptina variante-HN/A

Utilizando a metodologia delineada no Exemplo 9, foi purificada uma proteína de fusão LC/A-nociceptina variante- HN/A a partir de células BL21 de E. coli. Resumidamente, os produtos solúveis obtidos depois do rompimento das células foram aplicados a uma coluna de captura de afinidade carregada com níquel. As proteínas ligadas foram eluídas com 100 mM de imidazole, tratadas com Fator Xa para ativar a proteína de fusão e remover o marcador da proteína de ligação de maltose (MBP), aplicadas novamente, depois, a uma segunda coluna de captura de afinidade carregada com níquel. Amostras do processo de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE. 0 material purificado final na ausência e presença de agente redutor é identificado nas pistas marcadas com [-] e [+], respetivamente.

Figura 8 - Comparação da eficácia de ligação de uma

proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A e uma proteína de fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A A capacidade das fusões de nociceptina para se ligarem ao recetor ORLi foi avaliada utilizando um ensaio simples baseado em competição. As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de material de teste na presença de 1 nM de [ 3H]-nociceptina. A redução na ligação específica do ligando radiomarcado foi avaliada por contagem de cintilação e representada graficamente em comparação com a eficácia do ligando não marcado (Tocris nociceptina). É claro que a fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A (CPNv-LHA) é superior à fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A (CPN-LHA) na interação com o recetor ORLi.

Figura 9 - Família de proteínas de fusão LC/A-nociceptina-HN/A expressas/purificadas com produto(s) de comprimento de espaçadores variável

Utilizando a metodologia delineada no Exemplo 9, variantes da fusão LC/A-CPN-Hn/A consistindo em GS10, GS30 e HX27 são purificadas a partir de pasta celular de E. coli. Amostras da purificação da LC/A-CPN(GS10)-HN/A, LC/A-CPN(GS15)-HN/A, LC/A-CPN (GS25)-Hn/A, LC/A-CPN(GS30)-Hn/A e LC/A-CPN(HX27)-HN/A foram avaliadas por SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. O perfil eletroforético indica a purificação de uma espécie de cadeia dupla ligada por dissulfureto da massa molecular esperada de CPBE-A. Painel superior: M = marcadores de massa molecular de referência; S = fração proteica solúvel total de E. coli; FT = proteínas que não se ligam à coluna de Sepharose carregada com Ni2+; FUSÃO = proteína de fusão eluída pela adição de imidazole. Painel inferior: Pista 1 = marcadores de massa molecular de referência; Pista 2 = fração proteica solúvel total de E. coli; Pista 3 = material purificado, após captura de base de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material tratado com Fator Xa antes da captura final na Sepharose carregada com Ni2+; Pista 5 = material purificado final após ativação com Fator Xa (5 pL) ; Pista 6 = material final purificado após ativação com o Fator Xa (10 pL) ; Pista 7 = material final purificado após ativação com o Fator Xa (20 pL) ; Pista 8 = material final purificado após ativação com o Fator Xa + DTT (5 pL) ;

Pista 9 = material final purificado após ativação com o Fator Xa + DTT (10 pL); Pista 10 = material final purificado após ativação com o Fator Xa + DTT (20 pL).

Figura 10 - Inibição da libertação de SP e clivagem de

SNAP-25 por CPN-A

Resumidamente, culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPN-A durante 24 horas. As proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP- 25 para facilitar uma avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada pela análise densitométrica e representada graficamente em função da concentração de fusão (linha a tracejado). 0 material também foi recuperado para uma análise do teor de substância P, utilizando um kit de EIA específico. A inibição da libertação da substância P é ilustrada pela linha sólida. A concentração de fusão necessária para atingir 50% do máximo de clivagem de SNAP-25 é estimada para ser 6,3012,48 nM.

Figura 11 - Inibição da libertação de SP e clivagem de SNAP-25 durante longos períodos de tempo após exposição de DRG a CPN-A

As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPN-A durante 24 horas. Foi utilizada neurotoxina botulínica (BoNT/A) como um controlo. Após esta exposição de base, o material extracelular foi removido por lavagem e as células incubadas, a 37 °C, durante períodos de tempo variados. Em pontos temporais específicos, as proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP-25 para facilitar uma avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada por análise densitométrica e ilustrada pelas linhas a tracejado. O material também foi recuperado para uma análise do teor de substância P utilizando um kit de EIA específico. A inibição da libertação de substância P é ilustrada pelas linhas sólidas.

Figura 12 - Clivagem de SNAP-25 por CPNv-A

As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPNv-A durante 24 horas. As proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP-25 para facilitar uma avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada por análise densitométrica. A concentração de fusão necessária para atingir 50% do máximo de clivagem de SNAP-25 é estimada em 1,3810,36 nM.

Figura 13 - Clivagem de SNAP-25 durante longos períodos de tempo após exposição de DRG a CPNv-A

As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPNv-A durante 24 horas. A CPN-A foi utilizada como controlo. Após esta exposição de base, o material extracelular foi removido por lavagem e as células incubadas, a 37 °C, durante períodos de tempo variados.

Em pontos temporais específicos, as proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP-25, para facilitar uma avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada por análise densitométrica.

Figura 14 - Deslocamento mediado por fusão CPNv-A de ligação a [3H]-nociceptina A capacidade de fusões de nociceptina para se ligarem ao recetor ORLi foi avaliada utilizando um ensaio simples baseado em competição. As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de material de teste na presença de 1 nM de [ 3H]-nociceptina. A redução na ligação especifica do ligando radiomarcado foi avaliada por contagem de cintilação e representada graficamente em comparação com a eficácia de ligando não marcado (Tocris nociceptina). É claro que a fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A (marcada como CPNv-LHnA) é superior à fusão LC/A-nociceptina-HN/A (marcada como CPN-LHnA) na interação com o recetor ORLi.

Figura 15 - Produto CPNv(Ek)-A expresso/purificado

As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. 0 perfil eletroforético indica a purificação de uma espécie de cadeia dupla ligada com dissulfureto da massa molecular esperada de CPNv(Ek)-A. Pista 1 = marcadores de massa molecular de referência; Pista 2 = fração proteica solúvel total de E. coli; Pista 3 = material purificado após captura de base de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material final purificado após ativação com enterocinase (5 pL) ; Pista 5 = material final purificado após ativação com enterocinase (10 pL) ; Pista 6 = material final purificado após ativação com enterocinase (20 pL) ; Pista 7 = material final purificado após ativação com enterocinase + DTT (5 pL); Pista 8 = material final purificado após ativação com enterocinase + DTT (10 pL); Pista 9 = material final purificado após ativação com enterocinase + DTT (20 pL).

Figura 16 - Clivagem de SNAP-25 por CPNv(Ek)-A

As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPNv(Ek)-A durante 24 horas. As proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP-25, para facilitar uma avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada por análise densitométrica. A CPNv-A, como preparada no Exemplo 9, foi utilizada para fins de comparação. É ilustrada a clivagem percentual de SNAP-25 por CPNv(Ek)-A (marcado como En activado) e CPNv-A (marcado como Xa activado).

Figura 17 - Produto CPNv-C expresso/purificado

As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. 0 perfil eletroforético indica purificação de uma espécie de cadeia dupla ligada com dissulfureto da massa molecular esperada de CPNv-C. Pista 1 = marcadores de massa molecular de referência;

Pista 2 = fração proteica solúvel total de E. coli;

Pista 3 = material purificado, após captura de base de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material tratado com Fator Xa antes da captura final em Sepharose carregada com Ni2+;

Pista 5 = material purificado após a segunda captura em Sepharose carregada com Ni2+; Pista 6 = material final purificado; Pista 7 = material final purificado + DTT; Pista 8 = marcadores de massa molecular de referência.

Figura 18 - Clivagem de sintaxina por CPNv-C

As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPNv(Ek)-A durante 24 horas. As proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-sintaxina para facilitar uma avaliação da clivagem de sintaxina. A percentagem de sintaxina clivada foi calculada por análise densitométrica. A concentração de fusão necessária para atingir o máximo de 50% de clivagem de sintaxina é estimada em 3,13+1,96 nM.

Figura 19 - Eficácia de CPN-A no modelo Mecânico de Alodinia Aguda Induzida por Capsaicina A capacidade de uma fusão LC/A-nociceptina-HN/A (CPN/A) para inibir alodinia mecânica induzida por capsaicina foi avaliada após injeção intraplantar subcutânea na pata posterior de rato. Os animais de teste foram avaliados quanto à frequência de retirada da pata (% de PWF) em resposta a uma série de estímulos de filamentos de Von Frey de 10 g (10 estímulos x 3 ensaios) antes do recrutamento para o estudo (Pré-tratamento); após o tratamento intraplantar subcutâneo com CPN/A mas antes da capsaicina (Pré-CAP) e após o desafio de capsaicina pós-injeção de CPN/A (média de respostas a 15' e 30'; CAP) . O desafio de capsaicina foi obtido através de injeção de 10 pL de uma solução a 0,3%. As diluições da amostras foram preparadas em 0,5% de BSA/solução salina.

Figura 20 - Eficácia de CPN-A no modelo de

Neuropatia Diabética (Dor Neuropática) Periférica Induzida por Estreptozotocina (STZ)

Ratos machos Sprague-Dawley (250-300 g) , são tratados com 65-mg/kg de STZ em tampão citrato (I.V.) e a glicose e lipidos no sangue são medidos semanalmente para definir a prontidão do modelo. O Limite de Retirada da Pata (PWT) é medido em resposta a uma série de estímulos de filamentos Von Frey durante um período de tempo. Refere-se que a alodínia é estabelecida quando o PWT em duas datas de teste consecutivas (separadas por uma semana) se situam abaixo de 6 g na escala. Neste ponto, os ratos são aleatorizados para um grupo de solução salina (controlo de eficácia negativo), grupo de gabapentina (controlo de eficácia positivo) ou um grupo de teste (CPN/A) . Os materiais de teste (20-25 pL) são injetados subcutaneamente como uma única injeção (exceto a gabapentina) e o PWT é medido 1 dia após o tratamento e, depois, periodicamente durante um período de 2 semanas. A gabapentina (30 mg/kg i.p. @ 3 mL/kg de volume de injeção) é injetada diariamente, duas horas antes do início dos testes de PWT.

Figura 21 - Eficácia de CPNv-A no modelo Mecânico de

Alodinia Aguda Induzida por Capsaicina A capacidade de uma fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A (CPNv/A) para inibir a alodínia mecânica induzida por capsaicina foi avaliada após injeção intraplantar subcutânea na pata posterior de rato. Os animais de teste foram avaliados quanto à frequência de retirada da pata (% de PWF) em resposta a uma série de estímulos de filamentos de Von Frey de 10 g (10 estímulos x 3 ensaios) antes do recrutamento para o estudo (Pré-tratamento); após o tratamento intraplantar subcutâneo com CPNv/A mas antes da capsaicina (Pré-CAP) e após o desafio de capsaicina pós-injeção de CPNv/A (média de respostas a 15' e 30'; CAP) . O desafio de capsaicina foi obtido por injeção de 10 pL de uma solução a 0,3%. As diluições da amostra foram preparadas em 0,5% de BSA/solução salina. Estes dados são expressos como um diferencial de frequência normalizado de retirada de pata, no qual a diferença entre a resposta do pico (pós-capsaicina) e a resposta de base (pré-capsaicina) é expressa como uma percentagem. Com esta análise, pode observar-se que a CPNv/A é mais potente do que a CPN/A, uma vez que é necessária uma dose menor de CPNv/A para conseguir um efeito analgésico semelhante ao observado com CPN/A.

Figura 22 - Produto LC/A-CPLE-HN/A expresso/purificado

As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. O perfil eletroforético indica purificação de uma espécie de cadeia dupla ligada com dissulfureto da massa molecular esperada de CPLE-A.

Pista 1 = marcadores de massa molecular de referência;

Pista 2 = fração proteica solúvel total de E. coli;

Pista 3 = material purificado, após captura de base de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material tratado com Fator Xa antes da captura final em Sepharose carregada com Ni2+;

Pista 5 = material purificado após a segunda captura em Sepharose carregada com Ni2+; Pista 6 = material final purificado; Pista 7 = material final purificado + DTT.

Figura 23 - Produto LC/A-CPBE-HN/A expresso/purificado

As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. 0 perfil eletroforético indica purificação de uma espécie de cadeia dupla ligada com dissulfureto da massa molecular esperada de CPBE-A. Pista 1 = fração proteica solúvel total de E. coli;

Pista 2 = material purificado, após captura de base de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 3 = material tratado com Fator Xa antes da captura final em Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material final purificado após ativação com o Fator Xa (5 pL) ; Pista 5 = material final purificado após a ativação com Xa (10 yL) ; Pista 6 = material final purificado após ativação com o Fator Xa (20 pL); Pista 7 = material final purificado após ativação com o Fator Xa + DTT (5 pL) ; Pista 8 = material final purificado após ativação com o Fator Xa + DTT (10 pL); Pista 9 = material final purificado após ativação com o Fator Xa + DTT (20 pL) ; Pista 10 = marcadores de massa molecular de referência.

Figura 24 - Produto CPOP-A expresso/purificado

As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. O perfil eletroforético indica purificação de uma espécie de cadeia dupla ligada com dissulfureto da massa molecular esperada de CPOP-A. Pista 1 = marcadores de massa molecular de referência;

Pista 2 = fração proteica solúvel total de E. coli;

Pista 3 = material purificado, após captura de base de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material tratado com Fator Xa antes da captura final em Sepharose carregada com Ni2+;

Pista 5 = material final purificado após ativação com o Fator Xa (5 pL) ; Pista 6 = material final purificado após a ativação com Xa (10 pL) ; Pista 7 = material final purificado após ativação com o Fator Xa (20 pL) (20 pL); Pista 8 = material final purificado após ativação com o Fator Xa + DTT (5 pL) ; Pista 9 = material final purificado após ativação com o Fator Xa + DTT (10 pL); Pista 10 = material final purificado após ativação com o Fator Xa + DTT (20 pL).

Figura 25 - Produto CPOPv-A expresso/purificado

As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. O perfil eletroforético indica purificação de uma espécie de cadeia dupla ligada com dissulfureto da massa molecular esperada de CPOPv-A. Pista 1 = marcadores de massa molecular de referência; Pista 2 = fração proteica solúvel total de E. coli; Pista 3 = material purificado, após captura de base de Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material tratado com Fator Xa antes da captura final em Sepharose carregada com Ni2+; Pista 5 = material final purificado após ativação com o Fator Xa (5 pL) ; Pista 6 = material final purificado após a ativação com Xa (10 pL) ; Pista 7 = material final purificado após ativação com o Fator Xa (20 pL) (20 pL); Pista 8 = material final purificado após ativação com o Fator Xa + DTT (5 pL) ; Pista 9 = material final purificado após ativação com o Fator Xa + DTT (10 pL); Pista 10 = material final purificado após ativação com o Fator Xa + DTT (20 pL).

Figura 26 - Clivagem in vitro de SNAP-25 num modelo de célula DRG

As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de GPOPv-A durante 24 horas. As proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP-25 para facilitar uma avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada por análise densitométrica.

Figura 27 - CPNv-A-FXa-HT expresso/purificado (marcador his removível)

As proteínas foram submetidas a SDS-PAGE antes da coloração com Azul de Coomassie. 0 perfil eletroforético indica purificação de uma espécie de cadeia dupla ligada com dissulfureto da massa molecular esperada de CPNv-A-FXa-HT. Pista 1 = marcadores de massa molecular de referência;

Pista 2 = fração proteica solúvel total de E. coli;

Pista 3 = material tratado com Fator Xa antes da captura final em Sepharose carregada com Ni2+; Pista 4 = material final purificado após ativação com o Fator Xa; Pista 5 = material final purificado após ativação com o Fator Xa + DTT.

Figura 28 - Eficácia in vitro de proteínas de fusão LC/A-nociceptina-HN/A com comprimento variável de espaçador, como avaliado por ensaio de competição de ligando A capacidade de fusões LC/A-nociceptina-HN/A de comprimento variável de espaçador para se ligarem ao recetor ORLi foi avaliada utilizando um ensaio simples baseado em competição. As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de material de teste na presença de 1 nM de [3H]-nociceptina. A redução na ligação específica do ligando radiomarcado foi avaliada por contagem de cintilação e representada graficamente em comparação com a eficácia de ligando não marcado (Tocris nociceptina). 0 painel superior ilustra as características de deslocamento dos espaçadores GSO, GS20, GS30 e Hx27, enquanto o painel inferior ilustra o deslocamento obtido pelas proteínas de fusão espaçadas GS10, GS15 e GS25. Conclui-se que os espaçadores GSO e GS30 são ineficazes e a GS10 é pouco eficaz, em deslocar a nociceptina do recetor ORLi.

Figura 29 - Eficácia in vitro de proteínas de fusão LC/A-nociceptina-HN/A com comprimento variável de espaçador, como avaliado por clivagem in vitro de SNAP-25

As culturas primárias de gânglios da raiz dorsal (DRG) foram expostas a diferentes concentrações de CPN-A (de comprimento variável de espaçador) durante 24 horas. As proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE, submetidas a transferência de Western e sondadas com anti-SNAP-25 para facilitar uma avaliação da clivagem de SNAP-25. A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada por análise densitométrica. As características de ligação pouco eficazes da proteína de fusão espaçada GS10 (ver Figura 28) estão refletidas nas concentrações de fusão mais elevadas necessárias para obter a clivagem intracelular de SNAP-25. As proteínas de fusão espaçadas GSO e GS30 foram completamente ineficazes (dados não mostrados). As proteínas de fusão espaçadas GS15, 20 e 25 foram, de um modo semelhante, eficazes. SEQ IP N°

SEQ ID 1 Sequência de ADN do LC/A

SEQ ID 2 Sequência de ADN do HN/A

SEQ ID 3 Sequência de ADN do LC/B

SEQ ID 4 Sequência de ADN do HN/B

SEQ ID 5 Sequência de ADN do LC/C

SEQ ID 6 Sequência de ADN do HN/C

SEQ ID 7 Sequência de ADN do ligante CPN-A

SEQ ID 8 Sequência de ADN do ligante A

SEQ ID 9 Sequência de ADN da inserção de nociceptina da apresentação N-terminal SEQ ID 10 Sequência de ADN do ligante CPN-C

SEQ ID 11 Sequência de ADN do ligante CPBE-A

SEQ ID 12 Sequência de ADN do ligante CPNvar-A

SEQ ID 13 Sequência de ADN da fusão LC/A-CPN-Hn/A SEQ ID 14 Sequência proteica da fusão de LC/A-CPN-Hn/A SEQ ID 15 Sequência de ADN da fusão N-LC/A-Hn/A SEQ ID 16 Sequência proteica da fusão N-LC/A-Hn/A SEQ ID 17 Sequência de ADN da fusão LC/C-CPN-Hn/C SEQ ID 18 Sequência proteica da fusão LC/C-CPN-Hn/C SEQ ID 19 Sequência de ADN da fusão LC/C-CPN-Hn/C (ligante A) SEQ ID 20 Sequência proteica da fusão LC/C-CPN-Hn/C (ligante A) SEQ ID 21 Sequência de ADN da fusão LC/A-CPME-HN/A SEQ ID 22 Sequência proteica da fusão LC/A-CPME-HN/A SEQ ID 23 Sequência de ADN da fusão LC/A-CPBE-HN/A SEQ ID 24 Sequência proteica da fusão LC/A-CPBE-HN/A SEQ ID 25 Sequência de ADN da fusão LC/A-CPNv-Hn/A

SEQ ID 26 Sequência proteica da fusão LC/A-CPNv-Hn/A SEQ ID 27 Sequência de ADN da fusão LC/A-CPN[1-11]-HN/A SEQ ID 28 Sequência proteica da fusão LC/A-CPN[1-11]-HN/A SEQ ID 29 Sequência de ADN da fusão LC/A-CPN[[Y10]1-11]-HN/A SEQ ID 30 Sequência proteica da fusão LC/A-CPN[[ΥΙΟ]1-11]-HN/A SEQ ID 31 Sequência de ADN da fusão LC/A-CPN[[Yll] 1-11]-HN/A SEQ ID 32 Sequência proteica da fusão LC/A-CPN[[Yll]1-11]-HN/A SEQ ID 33 Sequência de ADN da fusão LC/A-CPN[[Y14]1-17]HN/A SEQ ID 34 Sequência proteica da fusão LC/A-CPN[[Y14]1-17]-HN/A SEQ ID 35 Sequência de ADN da fusão LC/A-CPN[1-13]-HN/A SEQ ID 36 Sequência proteica da fusão LC/A-CPN[1-13]-HN/A SEQ ID 37 Sequência de ADN de CPN[1-17] SEQ ID 38 Sequência proteica de CPN[1-17] SEQ ID 39 Sequência de ADN de CPN[1-11] SEQ ID 40 Sequência proteica de CPN[1-11] SEQ ID 41 Sequência de ADN de CPN [ [Y10]1-11] SEQ ID 42 Sequência proteica de CPN[ [Y10]1-11] SEQ ID 43 Sequência de ADN de CPN[[Yll]1-11] SEQ ID 44 Sequência proteica de CPN[[Yll]1-11] SEQ ID 45 Sequência de ADN de CPN[[Y14]1-17] SEQ ID 46 Sequência proteica de CPN[[Y14]1-17] SEQ ID 47 Sequência de ADN de CPN [1-13] SEQ ID 48 Sequência proteica de CPN[1-13] SEQ ID 49 Sequência de ADN de CPNv (também conhecida como N[(R14K15)1-17] SEQ ID 50 Sequência proteica de CPNv (também conhecida como N[(R14K15)1-17]

SEQ ID 51 Sequência de ADN da fusão nociceptina-espaçador-LC/A-HN/A

SEQ ID 52 Sequência proteica da fusão nociceptina-espaçador-LC/A-HN/A SEQ ID 53 Sequência de ADN do ligante CPN-A GS10 SEQ ID 54 Sequência de ADN do ligante CPN-A GS15 SEQ ID 55 Sequência de ADN do ligante CPN-A GS25 SEQ ID 56 Sequência de ADN do ligante CPN-A GS30 SEQ ID 57 Sequência de ADN do ligante CPN-A HX27

SEQ ID 58 Sequência de ADN da fusão LC/A-CPN(GS15)-HN/A SEQ ID 59 Sequência proteica da fusão LC/A-CPN(GS15)-HN/A SEQ ID 60 Sequência de ADN de fusão de LC/A-CPN(GS25)-HN/A SEQ ID 61 Sequência proteica da fusão LC/A-CPN(GS25)-HN/A SEQ ID 62 Sequência de ADN do ligante activável de

enterocinase CPNvar-A

SEQ ID 63 Sequência de ADN da fusão LC/A-CPNv(Ek)-HN/A SEQ ID 64 Sequência proteica da fusão LC/A-CPNv(Ek)-HN/A SEQ ID 65 Sequência de ADN do ligante de CPNvar-A SEQ ID 66 Sequência de ADN da fusão LC/C-CPNv-Hn/C (act. A) SEQ ID 67 Sequência da proteína de fusão de LC/C-CPNv-Hn/C (act. A)

SEQ ID 68 Sequência de ADN da fusão LC/A-CPLE-Hn/A

SEQ ID 69 Sequência proteica da fusão LC/A-CPLE-HN/A

SEQ ID 70 Sequência de ADN da fusão de LC/A-CPOP-HN/A

SEQ ID 71 Sequência proteica da fusão LC/A-CPOP-HN/A

SEQ ID 72 Sequência de ADN da fusão de LC/A-CPOPv-HN/A

SEQ ID 73 Sequência proteica da fusão LC/A-CPOPv-HN/A

SEQ ID 74 Sequência de ADN da protease IgA

SEQ ID 75 Sequência de ADN da fusão IgA-CPNv-HN/A

SEQ ID 76 Sequência proteica da fusão IgA-CPNv-HN/A

SEQ ID 77 Sequência de ADN da FXa-HT

SEQ ID 78 Sequência de ADN da CPNv-A-FXa-HT

SEQ ID 79 Sequência proteica da fusão CPNv-A-FXa-HT

SEQ ID 80 Sequência de ADN do domínio de translocação DT

SEQ ID 81 Sequência de ADN da CPLE-DT-A

SEQ ID 82 Sequência da proteína de fusão de CPLE-DT-A

SEQ ID 83 Sequência de ADN da TeNT LC

SEQ ID 84 Sequência de ADN da CPNv-TENT LC

SEQ ID 85 Sequência proteica da fusão CPNv-TENT LC

SEQ ID 86 Sequência de ADN do ligante CPNvar-C SEQ ID 87 Sequência de ADN da fusão LC/C-CPNv-Hn/C (act. C) SEQ ID 88 Sequência proteica da fusão LC/C-CPNv-Hn/C (act. C)

Exemplos

Exemplo 1 - Preparação de clones estruturais de LC/A e HN/A 0 procedimento seguinte produz os fragmentos LC e HN para utilização como a estrutura do componente para a expressão da fusão multi-domínio. Este exemplo é baseado na preparação de um clone baseado em serotipo A (SEQ ID 1 e SEQ ID 2), embora os procedimentos e métodos sejam igualmente aplicáveis aos outros serotipos [ilustrados pela listagem de sequências para o serotipo B (SEQ ID 3 e SEQ ID 4) e serotipo C (SEQ ID 5 e SEQ ID 6)].

Preparação de vectores de expressão e clonagem pCR 4 (Invitrogen) é o vetor de clonagem padrão escolhido, selecionado devido à falta de sequências de restrição dentro do vetor e sítios de iniciadores de sequenciação adjacentes para confirmação fácil da construção. 0 vetor de expressão é baseado no vetor de expressão pMAL (NEB) , o qual tem as sequências de restrição desejadas dentro do local de clonagem múltiplo na orientação correta para inserção da construção (BamRI-SalI-PstI-

HindIII). Um fragmento do vetor de expressão foi removido para produzir um plasmideo não mobilizável e foi inserida uma variedade de diferentes marcadores de fusão para aumentar as opções de purificação.

Preparação de inserção de protease (e. g. , LC/A) A LC/A (SEQ ID 1) é produzida por um de dois modos:

A sequência de ADN é concebida por tradução inversa da sequência de aminoácidos de LC/A [obtida de fontes de dados gratuitamente disponíveis, tais como GenBank (número de acesso P10845) ou Swissprot (locus de acesso BXA1_CL0B0) utilizando um de uma variedade de ferramentas de software de tradução inversa (por exemplo, melhor tradução inversa de E. coli EditSeq (DNASTAR Inc.) ou ferramenta de Tradução inversa v2.0 (Entelechon)]. As sequências de reconhecimento BamRl/Sal são incorporadas nas extremidades 5' e 3', respetivamente, da sequência, mantendo a correta grelha de leitura. A sequência de ADN é rastreada (utilizando software, tal como MapDraw DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem com enzimas de restrição incorporadas durante a tradução inversa. Quaisquer sequências de clivagem que se verifica serem comuns às exigidas pelo sistema de clonagem são removidas manualmente a partir da sequência de codificação proposta garantindo que a utilização comum do codão de E. coli é mantida. A utilização do codão de E. coli é avaliada por referência aos programas de software, tais como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e a % de conteúdo GC e proporção de utilização de codão avaliados por referência às tabelas publicadas de utilização de codão (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de ADN otimizada contendo a grelha de leitura aberta (ORF) de LC/A é então sintetizada comercialmente (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vetor pCR 4.

O método alternativo é utilizar a amplificação de PCR de uma sequência de ADN existente com as sequências das enzimas de restrição BamRI e SalI incorporadas nos iniciadores de PCR 5' e 3', respetivamente. Os iniciadores oligonucleotidicos complementares são quimicamente sintetizados por um fornecedor (por exemplo, MWG ou Sigma-Genosys) , de modo que cada par tem a capacidade de hibridar para as cadeias opostas (extremidades 3' apontando "viradas" umas para as outras) que flanqueiam o fragmento de ADN alvo de Clostridium, um oligonucleótido para cada uma das duas cadeias de ADN. Para produzir um produto de PCR, o par de iniciadores oligonucleótidos curtos específicos para a sequência de ADN de Clostridium é misturado com o molde de ADN de Clostridium e outros componentes de reação e colocados numa máquina (a "máquina de PCR"), a qual pode mudar a temperatura de incubação do tubo de reação automaticamente, variando entre aproximadamente 94 °C (por desnaturação), 55 °C (por emparelhamento de oligonucleótidos) e 72 °C (por síntese). Outros reagentes necessários para a amplificação de um produto da PCR incluem uma polimerase de ADN (tal como polimerase Taq ou Pfu), cada dos quatro blocos de construção nucleotídicos dNTP de ADN em quantidades equimolares (50-200 μΜ) e um tampão apropriado para a enzima otimizada para concentração de Mg2+ (0,5-5 mM) . O produto de amplificação é clonado em pCR 4 utilizando clonagem TOPO TA para produtos de PCR Taq ou clonagem Zero Blunt TOPO para produtos de PCR Pfu (ambos os kits disponíveis comercialmente de Invitrogen). O clone resultante é verificado por sequenciação. Quaisquer sequências de restrição adicionais que não sejam compatíveis com o sistema de clonagem, são então removidas utilizando mutagénese sitio-dirigida [por exemplo, utilizando Quickchange (Stratagene Inc.)].

Preparação de inserção de translocação (e. g., HN) A Hn/A (SEQ ID 2) é produzida por um de dois modos:

A sequência de ADN é concebida por tradução inversa da sequência de aminoácidos de HN/A [obtida de fontes de dados gratuitamente disponíveis, tais como GenBank (número de acesso P10845) ou Swissprot (locus de acesso BXA1_CL0B0) utilizando uma de várias ferramentas de software de tradução inversa (por exemplo, melhor tradução inversa de E. coll EditSeq (DNASTAR Inc.) ou ferramenta de Tradução inversa v2.0 (Entelechon)] . Uma sequência de restrição Pst I é adicionada ao N-terminal e Xbal-codão de terminação-Hindi II ao C-terminal, garantindo que a grelha de leitura correta é mantida. A sequência de ADN é rastreada (utilizando software como o MapDraw, DNASTAR Inc.), para sequências de clivagem com enzimas de restrição incorporadas durante a tradução inversa. Quaisquer sequências de clivagem que se verifica serem comuns às exigidas pelo sistema de clonagem são removidas manualmente a partir da sequência de codificação proposta garantindo que a utilização comum do codão de E. coli é mantida. A utilização do codão de E. coli é avaliada por referência aos programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e a % de conteúdo GC e proporção de utilização de codão avaliados por referência às tabelas publicadas de utilização de codão (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de ADN otimizada é então sintetizada comercialmente (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vetor pCR 4 . 0 método alternativo é a utilização de amplificação por PCR de uma sequência de ADN existente com sequências de enzimas de restrição Pst I e XfoaJ-codão de terminação-Hindi II incorporadas nos iniciadores de PCR 5' e 3', respetivamente. A amplificação por PCR é realizada como descrito acima. 0 produto de PCR é inserido no vetor pCR 4 e verificado por sequenciação. Quaisquer sequências de restrição adicionais que não sejam compatíveis com o sistema de clonagem são então removidas utilizando mutagénese sitio-dirigida [por exemplo, utilizando Quickchange (Stratagene Inc.)].

Exemplo 2 - Preparação de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A (nociceptina é N-terminal da cadela de HN)

Preparação de inserção de ligante-nocicpetina-espaçador 0 ligante LC-HN pode ser concebido a partir do primeiro principio, utilizando a informação da sequência existente para o ligante como o molde. Por exemplo, o ligante do serotipo A (neste caso, definido como a região polipeptídica inter-dominio que existe entre as cisteinas da ponte dissulfureto entre LC e Hn) tem 23 aminoácidos de comprimento e tem a sequência VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL. Dentro desta sequência, entende-se que a ativação proteolítica na natureza leva a um domínio HN que tem um N-terminal da sequência ALNDL. Esta informação de sequência está disponível gratuitamente de bases de dados disponíveis, tais como GenBank (número de acesso P10845) ou Swissprot (locus de acesso BXAl_CLOBO). Dentro deste ligante é incorporado um local de Fator Xa, nociceptina e espaçador; e utilizando uma variedade de ferramentas de software de tradução inversa [por exemplo, melhor tradução reversa de E. coli EditSeq (DNASTAR Inc.) ou ferramenta de Tradução inversa v2.0 (Entelechon)], a sequência de ADN que codifica a região ligante-ligando-espaçador é determinada. Os sítios de restrição são depois incorporados na sequência do ADN e podem ser dispostos como BamHI-Sall-ligante-local de protease-nociceptina-A/hel-espaçador-Spel-Pstl-Xfoal-codão de terminação-Hindi 11 (SEQ ID 7) . É importante assegurar que a grelha de leitura correta seja mantida para o espaçador, nociceptina e sequências de restrição e que a sequência Xbal não seja precedida pelas bases, TC, o que resultaria na metilação de DAM. A sequência de ADN é rastreada para incorporação da sequência de restrição e quaisquer sequências adicionais são removidas manualmente da sequência restante assegurando que a utilização do codão de E. coli comum é mantida. A utilização do codão de E. coli é avaliada por referência aos programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e a % de conteúdo GC e proporção de utilização de codão avaliados por referência às tabelas publicadas de utilização de codão (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de ADN otimizada é então sintetizada comercialmente (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vetor pCR 4.

Preparação da fusão LC/ A-nociceptina-RN/A

De modo a produzir a construção LC-ligante-nociceptina-espaçador-HN (SEQ ID 13) , o vetor pCR 4 que codifica o ligante (SEQ ID 7) é clivado com as enzimas de restrição BamHI + SalI.

Este vetor clivado é depois utilizado como o vetor recetor para inserção e ligação do ADN de LC/A (SEQ ID 1) clivado com BamRI + Sail. O ADN plasmídeo resultante é depois clivado com as enzimas de restrição PstI + Xbal e é utilizado como o vetor recetor para inserção e ligação do ADN de HN/A (SEQ ID 2) clivado com PstI + Xbal. A construção final contém a ORF de LC-ligante-nociceptina-espaçador-HN (SEQ ID 13) para transferência dentro de vectores de expressão para expressão, para resultar numa proteína de fusão da sequência ilustrada na SEQ ID 14.

Exemplo 3 - Preparação de uma proteína de fusão nociceptina-LC/A-Hn/A (nociceptina é N-terminal da cadeia de LC) A estrutura de LC/A-HN/A é construída como descrito no Exemplo 2, utilizando o ligante de serotipo A sintetizado com a adição de um local de Fator Xa para ativação, disposto como BamHI-SalI-ligante-local de protease-ligante-Pstl-Xbal-codão de terminação-Bindl 11 (SEQ ID 8) . A estrutura de LC/A-HN/A e a inserção de nociceptina de apresentação N-terminal sintetizada (SEQ ID 9) são clivadas com as enzimas de restrição BamRI + HindIII, purificadas com gel e ligadas uma à outra para produzir um nociceptina-espaçador-LC-ligante-HN. A ORF (SEQ ID 15) é depois cortada utilizando as enzimas de restrição Aval + Xbal para transferência dentro de vetores de expressão para expressão, para resultar numa proteína de fusão da sequência ilustrada na SEQ ID 16.

Exemplo 4 - Preparação de uma proteína de fusão LC/C-

nociceptina-HN/C

Seguindo os métodos utilizados nos Exemplos 1 e 2, as LC/C (SEQ ID 5) e HN/C (SEQ ID 6) são produzidas e inseridas no ligante de serotipo C disposto como BamHI-SalI-ligante-local de protease-nociceptina-A/hel-espaçador-Spel-Pstl-Xfoal-codão de terminação-Hindi 11 (SEQ ID 10). A construção final contém a ORF de LC-ligante-nociceptina-esspaçador-HN (SEQ ID 17) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 18.

Exemplo 5 - Preparação de uma proteína de fusão LC/C-

nociceptin-HN/C com uma sequência de ativação de serotipo A

Seguindo os métodos utilizados nos Exemplos 1 e 2, as LC/C (SEQ ID 5) e HN/C (SEQ ID 6) são produzidas e inseridas no ligante de serotipo C disposto como BamHI-SalI-ligante-local de protease-nociceptina-A/hel-espaçador-Spel-Pstl-Xfoal-codão de terminação-Hindi 11 (SEQ ID 7) . A construção final contém a ORF de LC-ligante-nociceptina-esspaçador-HN (SEQ ID 19) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 20.

Exemplo 6 - Preparação de uma proteína de fusão LC/A-met-encefalina-HN/A

Devido ao pequeno tamanho, cinco aminoácidos, do ligando met-encefalina, a fusão LC/A-met-encefalina-HN/A é produzida por mutagénese sitio-dirigida [por exemplo, utilizando Quickchange (Stratagene Inc.)] utilizando a fusão LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID 13) como um molde. Os oligonucleótidos são concebidos para codificar o péptido de met-encefalina YGGFM, assegurando que é mantida a utilização de codão padrão de E. coli e não são incorporados sítios de restrição adicionais, flanqueados por sequências complementares à região do ligante da fusão LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID 13) em cada lado da secção de nociceptina. 0 produto de SDM é verificado por sequenciação e a construção final contendo a ORF de LC-ligante-met-encefalina-espaçador-HN (SEQ ID 21) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID22.

Exemplo 7 - Preparação de uma proteína de fusão LC/Α-β

endorfina-HN/A

Seguindo os métodos utilizados nos Exemplos 1 e 2, as LC/A (SEQ ID 1) e HN/A (SEQ ID 2) são produzidas e inseridas no ligante de endorfina β de serotipo A dispostas como BamRI-SalI-ligante-local de protease-endorf ina β-Λ/iieI-espaçador-SpeI-PstI-Xfoal-codão de terminação-Hindi 11 (SEQ ID 11) . A construção final contém a ORF de LC-ligante-endorfina β-espaçador-HN (SEQ ID 23) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 24.

Exemplo 8 - Preparação de uma proteína de fusão

LC/A-nociceptina variante-HN/A

Seguindo os métodos utilizados nos Exemplos 1 e 2, as LC/A (SEQ ID 1) e HN/A (SEQ ID 2) são produzidas e inseridas no ligante de nociceptina variante de serotipo A dispostas como BamHI-SalI-ligante-local de protease-nociceptina variante-A/Ael-espaçador-Spel-Pstl-Xfoal-codão de terminação-Hindi 11 (SEQ ID 12) . A construção final contém a ORF de LC-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN (SEQ ID 25) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID26.

Exemplo 9 - Método de purificação para proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A

Descongela-se tubo falcon contendo 25 mL de HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM e, aproximadamente, 10 g de pasta celular de E. coli BL21. Prepara-se a pasta celular descongelada até 80 mL com HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM e sonica-se em gelo durante 30 segundos, ligado, 30 segundos, desligado, durante 10 ciclos a uma potência de 22 mícrones assegurando que a amostra permanece fria. Agitam-se as células lisadas a 18000 rpm, 4 °C, durante 30 minutos. Carrega-se o sobrenadante numa coluna Chelating carregada com NÍSO4 0,1 M (coluna de 20-30 mL é suficiente) equilibrada com HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM. Utilizando um gradiente sequencial de imidazole 10 e 40 mM, lava-se a proteína ligada não específica e elui-se a proteína de fusão com imidazole 100 mM. Dialisa-se a proteína de fusão eluída contra 5 L de HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM, a 4 °C, de um dia para o outro, e mede-se o OD da proteína de fusão dialisada.

Adiciona-se 1 unidade de fator Xa por 100 yg de proteína de fusão e incuba-se a 25 °C estáticos, de um dia para o outro. Carrega-se numa coluna Chelating carregada com N1SO4 0,1 M (coluna de 20-30 mL é suficiente) equilibrada com HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM. Lava-se a coluna para valores iniciais de 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM. Utilizando um gradiente sequencial de imidazole 10 e 40 mM, lava-se a proteína ligada não específica e elui-se a proteína de fusão com imidazole 100 mM.

Dialisa-se a proteína de fusão eluída contra 5 L de HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM, a 4 °C, de um dia para o outro e concentra-se a fusão a cerca de 2 mg/mL, alíquota-se a amostra e congela-se a -20 °C. Testa-se a proteína purificada utilizando avaliações de OD, BCA, análise de pureza e SNAP-25.

Exemplo 10 - Confirmação da Atividade Agonistica de TM por medição da libertação de substância P de culturas celulares neuronals

Materiais O EIA da substância P é obtido de R&D Systems, RU. Métodos

As culturas neuronais primárias de eDRG são estabelecidas como descrito anteriormente (Duggan et al., 2002) . A libertação da substância P das culturas é avaliada por EIA, essencialmente como descrito anteriormente (Duggan et al., 2002) . A TM de interesse é adicionada às culturas neuronais (estabelecidas durante, pelo menos, 2 semanas antes do tratamento); em paralelo são realizadas culturas de controlo, por adição de veículo em vez de TM. É obtida a libertação estimulada (KCI 100 mM) e

basal, em conjunto com o teor de lisado celular total de substância P, para culturas de controlo e tratadas com TM. A imunorreatividade da substância P é medida utilizando Kits de Imunoensaio Enzimático de Substância P (Cayman Chemical Company, EUA ou R&D Systems, UK) de acordo com instruções do fabricante. A quantidade de Substância P libertada pelas células neuronais na presença da TM de interesse é comparada com a libertação obtida na presença e ausência de KCI 100 mM. A estimulação da libertação de Substância P pela TM de interesse acima da libertação basal estabelece que a TM de interesse é um "ligando agonista" como definido nesta descrição. Se desejado, a estimulação da libertação de Substância P pela TM de interesse pode ser comparada com uma curva de libertação de Substância P padrão produzida utilizando o ligando do recetor ORL-1 natural, nociceptina (Tocris).

Exemplo 11 - Confirmação de ativação do recetor ORLi por medição da produção de AMPc estimulada por forskolina A confirmação de que uma dada TM actua por meio do recetor ORLi é proporcionada pelo seguinte teste, no qual a capacidade das TM para inibir a produção de AMPc estimulada por forskolina é avaliada.

Materiais [3H]adenina e [14C] AMPc são obtidos de GE Healthcare Métodos O teste é conduzido essencialmente como descrito anteriormente por Meunier et al., [Isolation e structure of the endogenous agonist of opioid recetor-like ORLI recetor. Nature 377: 532-535, 1995] em células CHO transfetadas intactas plaqueadas em placas plásticas de 24 poços. Às células é adicionada [3H]adenina (1,0 yCi) em 0,4 mL de meio de cultura. As células permanecem a 37 °C durante 2 h, para permitir à adenina incorporar-se no agrupamento de ATP intracelular. Após 2 h, as células são lavadas uma vez com tampão de incubação contendo: NaCl 130 mM, KC1 4,8 mM, KH2PO4 1,2 mM, CaCÍ2 1,3 mM, MgSCb 1,2 mM, glucose 10 mM, 1 mg/mL de albumina sérica bovina e HEPES 25 mM, pH 7,4 e substituídas com tampão contendo forskolina (10 μΜ) e isobutilmetilxantina (50 μΜ) com ou sem a TM de interesse. Após 10 min, o meio é aspirado e substituído com 0,5 mL de HC1 0,2 M. São adicionados aproximadamente, 1000 cpm de [14C]AMPc a cada poço e utilizados como um padrão interno. Os conteúdos dos poços são depois transferidos para colunas de 0,65 g de pó de alumina seca. As colunas são eluídas com 4 mL de HC1 5 mM, 0,5 mL de acetato de amónio 0,1 M, depois, dois mililitros adicionais de acetato de amónio. O eluato final é recolhido em frasquinhos de cintilação e contado para 14C e trítio. As quantidades recolhidas são corrigidas para recuperação de [14C]AMPc. As TM que são agonistas no recetor ORLi provocam uma redução no nível de AMPc produzido em resposta a forskolina.

Exemplo 12 - Confirmação de ativação do recetor ORLi

utilizando vim ensaio funcional de ligação a GTPyS A confirmação que de que uma dada TM atua por meio do recetor ORLi é, também proporcionada pelo seguinte teste, um ensaio funcional de ligação a GTPyS.

Materiais [35S]GTPyS é obtido de GE Healthcare

Esferas revestidas com aglutinina de Gérmen de Trigo (SPA) são obtidas de GE Healthcare Métodos

Este ensaio é realizado essencialmente como descrito por Traynor e Nahorski [Modulation by μ-opioid agonists of guanosine-5 -0-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47: 848-854, 1995].

As células são raspadas de placas de cultura de tecido em HEPES 20 mM, ácido etilenodiaminotetracético 1 mM, depois, centrifugadas a 500 x g durante 10 min. As células são ressuspensas neste tampão e homogeneizadas com um Homogeneizador Polytron. O homogenato é centrifugado a 27000 χ g durante 15 min e o sedimento ressuspenso em tampão A, contendo: HEPES 20 mM, MgCÍ2 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4. A suspensão é centrifugada novamente a 20000 χ g e suspensa mais uma vez em tampão A. Para o ensaio de ligação, as membranas (8-15 yg de proteína) são incubadas com [35S]GTP S (50 pM) , GDP (10 μΜ) , com e sem a TM de interesse, num volume total de 1,0 mL, durante 60 min, a 25 °C. As amostras são filtradas por filtros de fibra de vidro e contadas como descrito para os ensaios de ligação.

Exemplo 13 - Preparação de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A (nociceptina é N-terminal da cadeia de HN) A inserção ligante-nociceptina-espaçador é preparada como descrito no Exemplo 2.

Preparação da fusão LC/A-nociceptina-HN/A

De modo a produzir a construção LC-ligante-nociceptina-espaçador-HN (SEQ ID 13) , o vetor pCR 4 que codifica o ligante (SEQ ID 7) é clivado com as enzimas de restrição BamRI + Sail. Este vetor clivado é depois utilizado como o recetor para inserção e ligação do ADN de LC/A (SEQ ID 1) também clivado com as enzimas de restrição BamRI + Sail e o fragmento LC/A-ligante inserido num vetor clivado de um modo semelhante, contendo um único local de clonagem múltipla para BamRI, Sail, Pst I e Hindi 11, tal como o vetor pMAL (NEB) . 0 ADN de HN/A (SEQ ID 2) é depois clivado com as enzimas de restrição Pst I + HindIII e inserido na construção pMAL-LG/A-ligante clivada de um modo semelhante. A construção final contém a ORF de LC-ligante-nociceptina-espaçador-HN (SEQ ID 13) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 14.

Exemplo 14 - Preparação de uma proteína de fusão nociceptina-LC/A-HN/A (nociceptina é N-terminal da cadeia de LC)

De modo a produzir a construção nociceptina-espaçador-LC/A-Hn/A, é sintetizado um ligante de serotipo A com a adição de um local de Fator Xa para ativação, disposto como BamRI-Sail- ligante-local de protease-ligante-Pstl-Xbal-codão de terminação-HindlII (SEQ ID 8), como descrito no Exemplo 13. O vetor pCR 4 que codifica o ligante é clivado com as enzimas de restrição BamRI + Sail. Este vetor clivado é utilizado então como o recetor recipiente para inserção e ligação do ADN de LC/A (SEQ ID 1) também clivado com BamRI + SalI. 0 ADN plasmidico resultante é depois clivado com as enzimas de restrição BamRI + Sail e o fragmento LC/A-ligante inserido num vetor clivado de um modo semelhante contendo um único local de clonagem múltipla para BamRI, Sail, Pst I e HindIII, tal como o vetor pMAL (NEB) . 0 ADN de Hn/A (SEQ ID 2) é depois clivado com as enzimas de restrição Pst I + HindIII e inserido na construção pMAL-nociceptina-LC/A-ligante clivada de um modo semelhante. A construção final contém a ORF de nociceptina-espaçador-LC/A-HN/A (SEQ ID 51) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 52.

Exemplo 15 - Preparação e purificação de uma familia de proteína de fusão LC/A-nociceptina-HN/A com comprimento variável de espaçador

Utilizando a mesma estratégia como empregue no Exemplo 2, foi preparada uma gama de ligantes de ADN que codificou a nociceptina e teor de espaçador variável. Utilizando uma de várias ferramentas de software de tradução inversa [por exemplo, melhor tradução reversa de E. coll EditSeq (DNASTAR Inc.) ou ferramenta de Tradução inversa v2.0 (Entelechon)] , a sequência de ADN que codifica a região ligante-ligando-espaçador é determinada. Os sítios de restrição são depois incorporados na sequência do ADN e podem ser dispostos como BamRI-SalI- ligante-local de protease-nociceptina-A/hel-espaçador-Spel-Pstl-

Xbal-codão de terminação-ífi/idlll (SEQ ID 53 a SEQ ID 57) . É importante assegurar que a grelha de leitura correta seja mantida para o espaçador, nociceptina e sequências de restrição e que a sequência Xbal não seja precedida pelas bases, TC, o que resultaria na metilação de DAM. A sequência de ADN é rastreada para incorporação da sequência de restrição e quaisquer sequências adicionais são removidas manualmente da sequência restante, assegurando que a utilização do codão de E. coli comum é mantida. A utilização do codão de E. coli é avaliada por referência aos programas de software, tal como Graphical Codon

Usage Analyser (Geneart) e a % de conteúdo GC e proporção de utilização de codão avaliados por referência às tabelas publicadas de utilização de codão (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de ADN otimizada é então sintetizada comercialmente (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vetor pCR 4.

Os espaçadores que foram produzidos incluem:

A título exemplificativo, de modo a produzir a construção de fusão LC/A-CPN (GS15)-Hn/A (SEQ ID 58), o vetor pCR 4 que codifica o ligante (SEQ ID 54) é clivado com as enzimas de restrição BamRI + Sail. Este vetor clivado é depois utilizado como o vetor recetor para inserção e ligação do ADN de LC/A (SEQ ID 1) também clivado com as enzimas de restrição BamRI + Sail. 0 ADN plasmídico resultante é depois clivado com as enzimas de restrição BamRI + Hindlll e o fragmento LC/A-ligante inserido num vetor clivado de um modo semelhante, contendo um único local de clonagem múltipla para BamRI, Sail, Pst I e

Hindi 11, tal como o vetor pMAL (NEB) . 0 ADN de HN/A (SEQ ID 2) é depois clivado com as enzimas de restrição PstI + Hindlll e inserido na construção pMAL-LG/A-ligante clivada, de um modo semelhante. A construção final contém a ORF de LC/A-CPN(GS15)-Hn/A (SEQ ID 58) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 59.

Como um outro exemplo, para produzir a construção de fusão LC/A-CPN (GS25)-Hn/A (SEQ ID 60), o vetor pCR 4 que codifica o ligante (SEQ ID 54) é clivado com as enzimas de restrição BamRI + Sail. Este vetor clivado é depois utilizado como o vetor recetor para inserção e ligação do ADN de LC/A (SEQ ID 1) clivado com BamRI + Sail. O ADN plasmídico resultante é depois clivado com as enzimas de restrição BamRI + Hindlll e o fragmento LC/A-ligante inserido num vetor clivado de um modo semelhante contendo um único local de clonagem múltipla para BamRI, Sail, PstI e Hindlll, tal como o vetor pMAL (NEB) . O ADN de Hn/A (SEQ ID 2) é depois clivado com as enzimas de restrição PstI + Hindlll e inserido na construção pMAL-LC/A-ligante clivada de um modo semelhante. A construção final contém a ORF de LC/A-CPN (GS25)-Hn/A (SEQ ID 60) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 61.

As variantes da fusão LC/A-CPN-Hn/A consistindo de GS10, GS30 e HX27 são produzidas de um modo semelhante. Utilizando a metodologia de purificação descrita no Exemplo 9, a proteína de fusão é purificada de pasta celular de E. coli. A Figura 9 ilustra o produto purificado obtido no caso de LC/A-CPN(GS10)-Hn/A, LC/A-CPN(GS15)-Hn/A. LC/A-CPN(GS25)-HN/A, LC/A-CPN (GS30)-Hn/A e LC/A-CPN(HX27)-Hn/A.

Exemplo 16 - Avaliação da eficácia in vitro de uma fusão LC/A-nociceptina-HN/A A proteína de fusão preparada de acordo com os Exemplos 2 e 9 foi avaliada no modelo celular neuronal de eDRG.

Os ensaios para a inibição da libertação de substância P e clivagem de SNAP-25 foram referidos anteriormente (Duggan et al.r 2002, J. Biol. Chem., 277, 34846-34852). Resumidamente, neurónios dos gânglios da raiz dorsal são recolhidos de ratos Sprague-Dawley com 15 dias de idade fetal e as células dissociadas foram plaqueadas em placas de 24 poços revestidas com Matrigel a uma densidade de 1 x 106 células/poço. Um dia após plaqueamento, as células são tratadas com citosina-p-D-arabinofuranosido 10 μΜ durante 48 h. As células são mantidas em meio essencial mínimo de Dulbecco suplementado com 5% de soro bovino fetal inativado pelo calor, L-glutamina 5 mM, 0,6% de D-glucose, 2% de suplemento B27 e 100 ng/mL de fator de crescimento nervoso de rato 2.5S. As culturas são mantidas durante 2 semanas, a 37 °C, em 95% de ar/5% de CO2 antes da adição de materiais de teste. A libertação de substância P de eDRG é avaliada por ensaio imunossorvente ligado a enzima. Resumidamente, células eDRG são lavadas duas vezes com solução salina equilibrada com níveis baixos de potássio (BSS: KCI 5 mM, NaCl 137 mM, MgCl2 1,2 mM, glucose 5 mM, KH2P04 0,44 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4, CaCl2 2 mM) . As amostras basais são obtidas por incubação de cada poço durante 5 min., com 1 mL de BSS com níveis baixos de potássio. Após remoção deste tampão, as células são estimuladas para libertação por incubação com 1 mL de tampão com níveis elevados de potássio (BSS como acima, com modificação para incluir KCI 100 mM isotonicamente equilibrado com NaCl) durante 5 min. Todas as amostras são removidas para tubos em gelo antes do ensaio da substância P. Os lisados celulares totais são preparados por adição de 250 pL de 0,1% de ácido acético/ácido trifluoroacético 2 M para lisar as células, evaporação centrífuga e ressuspensão em 500 pL de tampão de ensaio. As amostras diluídas foram avaliadas para o teor de substância P. A imunorreat ividade da substância P é medida utilizando Kits de Imunoensaio Enzimático de Substância P (Cayman Chemical Company ou R&D Systems), de acordo com as instruções do fabricante. A substância P é expressa em pg/mL relativamente a uma curva padrão de substância P corrida em paralelo.

As análises de SDS-PAGE e transferência de Western foram realizadas utilizando protocolos padrão (Novex). As proteínas SNAP-25 foram resolvidas num gel de poliacrilamida Tris/glicina a 12% (Novex) e, subsequentemente, transferidas para membrana de nitrocelulose. As membranas foram sondadas com anticorpo monoclonal (SMI-81) que reconhece a clivagem de SNAP-25 e intactas. A ligação específica foi visualizada utilizando anticorpos secundários conjugados a peroxidase e um sistema de detecção quimiluminescente. A clivagem de SNAP-25 foi quantificada por densitometria de varrimento (Molecular Dynamics Personal SI, software de analise de dados ImageQuant). A percentagem de clivagem de SNAP-25 foi calculada de acordo com a fórmula: (Clivagem de SNAP-25/(Clivagem de SNAP-25 + Intacta)) x 100 .

Após exposição de neurónios eDRG a uma fusão LC/A-nociceptina-HN/A (denominada CPN-A), é observada a inibição da substância P e clivagem de SNAP-25 (Figura 10) . Após 24 h de exposição à fusão, é obtido o máximo de 50% de clivagem de SNAP-25 por uma concentração de fusão de 6,312,5 nM. O efeito da fusão também é avaliado em pontos temporais definidos após uma exposição de 16 h de eDRG a CPN-A. A Figura 11 ilustra a duração prolongada da ação da proteína de fusão CPN-A, sendo ainda observada atividade mensurável 28 dias após exposição.

Exemplo 17 - Avaliação da eficácia in vitro de uma fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A A proteína de fusão preparada de acordo com os Exemplos 8 e 9 foi avaliada no modelo de células neuronais eDRG utilizando o método descrito no Exemplo 16.

Após exposição de neurónios eDRG a uma fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A (denominada CPNv-A), é observada a inibição de libertação de substância P e clivagem de SNAP-25. Após 24 h de exposição à fusão, é obtido 50% do máximo de clivagem de SNAP-25 por uma concentração de fusão de 1,410,4 nM (Figura 12) . 0 efeito da fusão também é avaliado em pontos temporais definidos após uma exposição de 16 h de eDRG a CPN-A. A Figura 13 ilustra a duração prolongada da ação da proteína de fusão CPN-A, sendo ainda observada atividade mensurável 24 dias após exposição. A capacidade de ligação da proteína de fusão CPNv-A também é avaliada em comparação com a fusão CPN-A. A Figura 14 ilustra os resultados de uma experiência de competição para determinar a eficácia de ligação no recetor ORL-1. Demonstra-se que CPNv-A desloca a [3H]-nociceptina, confirmando desse modo que é possível o acesso ao recetor com o ligando no formato de apresentação central.

Exemplo 18 - Preparação de uma proteína de fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A que é activada por tratamento com enterocinase

Seguindo os métodos utilizados nos Exemplos 1 e 2, a LC/A (SEQ ID 1) e HN/A (SEQ ID 2) são produzidas e inseridas no ligante nociceptina variante de serotipo A disposto como BamRI-Sall-ligante-local de protease de enterocinase-nociceptina variante-Nhel-espaçador-Spel-Pstl-Xfoal-codão de terminação-HindlII (SEQ ID 62) . A construção final contém as sequências da ORF de LC-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN (SEQ ID 63) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 64. A proteína de fusão é denominada CPNv(Ek)-A. A Figura 15 ilustra a purificação de CPNv(Ek)-A de E. coli seguindo os métodos utilizados no Exemplo 9, mas utilizando enterocinase para ativação a 0,00064 yg por 100 yg de proteína de fusão.

Exemplo 19 - Avaliação da eficácia in vitro de uma fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A que foi activada por tratamento com enterocinase A CPNv(Ek)-A preparada no Exemplo 18 é obtida numa forma purificada e aplicada ao modelo celular eDRG para avaliar a clivagem de SNAP-25 (utilizando metodologia do Exemplo 16) . A Figura 16 ilustra a clivagem de SNAP-25 após exposição de 24 h de eDRG a CPNv(Ek)-A. A eficiência de clivagem é observada como sendo semelhante à obtida com o material clivado com Fator Xa, como registado no Exemplo 17.

Exemplo 20 - Preparação de uma proteína de fusão LC/C-nociceptina variante-HN/C com vim ligante de ativação de Fator Xa derivado de serotipo A

Seguindo os métodos utilizados no Exemplo 4, as LC/C (SEQ ID 5) e HN/C (SEQ ID 6) são produzidas e inseridas no ligante nociceptina variante de serotipo A disposto como BamRI-SalI-ligante-nociceptina variante-Nhel-espaçador-Spel-Pstl-Xfoal-codão de terminação-HindIII (SEQ ID 65) . A construção final contém as sequências da ORF de LC-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN (SEQ ID 66) para expressão como uma proteína de sequência ilustrada na SEQ ID 67. A proteína de fusão é denominada CPNv-C (act. A). A Figura 17 ilustra a purificação de CPNv-C (act. A) a partir de E. coli, seguindo os métodos utilizados no Exemplo 9.

Exemplo 21 - Avaliação da eficácia in vitro de uma proteína

de fusão LC/C-nociceptina variante-HN/C

Seguindo os métodos utilizados no Exemplo 9, a CPNv-C (act. A) preparada no Exemplo 20 é obtida numa forma purificada e aplicada ao modelo celular eDRG para avaliar a clivagem de SNAP-25 (utilizando a metodologia do Exemplo 16). Após exposição de 24 h à fusão, é atingido o máximo de 50% de clivagem de sintaxina por uma concentração de fusão de 3,112,0 nM. A Figura 18 ilustra a clivagem de sintaxina após exposição de 24 h de eDRG a CPNv-C (act. A).

Exemplo 22 - Avaliação da eficácia in vivo de uma fusão LC/A-nociceptina-HN/A A capacidade de uma fusão LC/A-nociceptina-HN/A (CPN/A) para inibir alodinia mecânica aguda induzida por capsaicina é avaliada após injeção intraplantar subcutânea na pata posterior do rato. Os animais de teste são avaliados para frequência de retirada de pata (% de PWF) em resposta a uma série de estímulos dos filamentos Von Frey de 10 g (10 estímulos x 3 ensaios) antes do recrutamento para o estudo, após o tratamento subcutâneo com CPN/A mas antes da capsaicina e após desafio com capsaicina pós-injeção de CPN/A (média de respostas a 15' e 30') . O desafio com capsaicina é obtido por injeção de 10 yL de uma solução a 0,3%. As diluições da amostra são preparadas em 0,5% de BSA/solução salina. A Figura 19 ilustra o inverso da alodinia mecânica que é obtida por pré-tratamento dos animais com uma gama de concentrações de fusão LC/A-nociceptina-HN/A. É avaliada a capacidade de uma fusão LC/A-nociceptina-HN/A (CPN/A) para inibir alodínia mecânica (tátil) induzida por estreptozotocina (STZ) em ratos. A alodínia mecânica induzida por STZ em ratos é obtida por injeção de estreptozotocina (i.p. ou i.v.), a qual produz destruição de células β pancreáticas levando a perda de produção de insulina, com stress metabólico concomitante (hiperglicemia e hiperlipidemia). Como tal, a STZ induz diabetes Tipo I. Além disso, o tratamento com STZ conduz a desenvolvimento progressivo de neuropatia, o qual é utilizado como um modelo de dor crónica com hiperalgesia e alodínia que pode refletir sinais observados em humanos diabéticos (neuropatia diabética periférica).

Ratos machos Sprague-Dawley (250-300 g) , são tratados com 65-mg/kg de STZ em tampão citrato (I.V.) e a glicose e lípidos no sangue são medidos semanalmente para definir a prontidão do modelo. O Limite de Retirada da Pata (PWT) é medido em resposta a uma série de estímulos de filamentos Von Frey durante um período de tempo. Refere-se que a alodínia é estabelecida quando o PWT em duas datas de teste consecutivas (separadas por uma semana) se situam abaixo de 6 g na escala. Neste ponto, os ratos são aleatorizados para um grupo de solução salina (controlo de eficácia negativo), grupo de gabapentina (controlo de eficácia positivo) ou um grupo de teste (CPN/A). Os materiais de ensaio (20-25 pL) são injetados subcutaneamente como uma única injeção (exceto a gabapentina) e o PWT é medido 1 dia após o tratamento e depois periodicamente durante um período de 2 semanas. A gabapentina (30 mg/kg i.p. @ 3 mL/kg de volume de injeção) é injetada diariamente, duas horas antes do início dos testes de PWT. A Figura 20 ilustra a reversão da alodínia obtida pelo pré-tratamento dos animais com 750 ng de CPN/A. Os dados foram obtidos ao longo de um período de 2 semanas após uma única injeção de CPN/A.

Exemplo 23 - Avaliação da eficácia in vivo de uma fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A A capacidade de uma fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A (CPNv/A) para inibir a alodínia mecânica induzida por capsaicina é avaliada após injeção intraplantar subcutânea na pata posterior de rato. Os animais de teste foram avaliados quanto à frequência de retirada da pata (% de PWF) em resposta a uma série de estímulos de filamentos de Von Frey de 10 g (10 estímulos x 3 ensaios) antes do recrutamento para o estudo (Pré-tratamento); após o tratamento intraplantar subcutâneo com CPNv/A mas antes da capsaicina (Pré-CAP); e após o desafio de capsaicina pós-injeção de CPNv/A (média de respostas a 15' e 30'; CAP). O desafio de capsaicina é obtido por injeção de 10 pL de uma solução a 0,3%. As diluições da amostra foram preparadas em 0,5% de solução salina/BSA. A Figura 21 ilustra a reversão da alodínia que é obtida por pré-tratamento dos animais com uma gama de concentrações de fusão LC/A-nociceptina variante-N/A em comparação com o inverso obtido com a adição de fusão LC/A-nociceptina-HN/A. Estes dados são expressos como um diferencial de frequência normalizado de retirada de pata, no qual a diferença entre o pico da resposta (pós-capsaicina) e a resposta de base (pré-capsaicina) é expressa como uma percentagem. Com esta análise, pode observar-se que a CPNv/A é mais potente do que a CPN/A, uma vez que é necessária uma dose menor de CPNv/A para conseguir um efeito analgésico semelhante ao observado com CPN/A.

Exemplo 24 - Preparação de uma proteína de fusão

LC/A-leu-encefalina-HN/A

Devido ao pequeno tamanho, cinco aminoácidos, do ligando leu-encefalina, a fusão LC/A-leu-encefalina-HN/A é produzida por mutagénese sitio-dirigida [por exemplo, utilizando Quickchange (Stratagene Inc.)] utilizando a fusão LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID 13) como um molde. Os oligonucleótidos são concebidos para codificar o péptido de leu-encefalina YGGFL, assegurando que é mantida a utilização de codão padrão de E. coli e não são incorporados sítios de restrição adicionais, flanqueados por sequências complementares à região do ligante da fusão LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID 13) em cada lado da secção de nociceptina. 0 produto de SDM é verificado por sequenciação e a construção final contendo a ORF de LC-ligante-leu-encefalina-espaçador-HN (SEQ ID 68) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 69. A proteína de fusão é denominada CPLE-A. A Figura 22 ilustra a purificação de CPLE-A a partir de E. coli, seguindo os métodos utilizados no Exemplo 9.

Exemplo 25 - Expressão e purificação de uma proteína de fusão LC/A-beta-endorfina-HN/A

Seguindo os métodos utilizados no Exemplo 9 e com a proteína de fusão LC/A-beta-endorfina-HN/A (denominada CPBE-A) produzida no Exemplo 7, a CPBE-A é purificada a partir de E. coli. A Figura 23 ilustra a proteína purificada com analisada por SDS-PAGE.

Exemplo 26 - Preparação de uma proteína de fusão

LC/A-nociceptina mutante-HN/A

Devido à única modificação de aminoácido necessária para mutar a sequência de nociceptina na posição 1 de uma Phe para uma Tyr, a fusão LC/A-nociceptina mutante-HN/A é produzida por mutagénese sitio-dirigida [por exemplo, utilizando

Quickchange (Stratagene Inc.)] utilizando a fusão LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID 13) como um molde. Os oligonucleótidos são concebidos para codificar o péptido de leu-encefalina YGGFL, assegurando que é mantida a utilização de codão padrão de E. coli e não são incorporados sitios de restrição adicionais, flanqueados por sequências complementares à região do ligante da fusão LC/A-nociceptina-HN/A (SEQ ID 13) em cada lado da secção de nociceptina. 0 produto de SDM é verificado por sequenciação e a construção final contendo a ORF de fusão LC/A-nociceptina mutante-espaçador-HN/A (SEQ ID 70) para expressão como uma proteina da sequência ilustrada na SEQ ID 71. A proteina de fusão é denominada CPOP-A. A Figura 24 ilustra a purificação de CPOP-A a partir de E. coli, seguindo os métodos utilizados no Exemplo 9.

Exemplo 27 - Preparação e avaliação de uma proteina de fusão LC/A-mutante nociceptina variante-HN/A

Devido à única modificação de aminoácido necessária para mutar a sequência de nociceptina na posição 1 de uma Phe para uma Tyr, a fusão LC/A-mutante nociceptina variante-HN/A é produzida por mutagénese sitio-dirigida [por exemplo, utilizando Quickchange (Stratagene Inc.)] utilizando a fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A (SEQ ID 25) como um molde. Os oligonucleótidos são concebidos para codificar tirosina na posição 1 da sequência de nociceptina, assegurando que é mantida a utilização de codão padrão de E. coli e não são incorporados sítios de restrição adicionais, flanqueados por sequências complementares à região do ligante da fusão LC/A-nociceptina variante-HN/A (SEQ ID 25) em cada lado da secção de nociceptina. 0 produto de SDM é verificado por sequenciação e a construção final contendo a ORF da fusão LC/A-nociceptina mutante- espaçador-HN/A (SEQ ID 72) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 73. A proteína de fusão é denominada CPOPv-A. A Figura 25 ilustra a purificação de CPOPv-A a partir de E. coli, seguindo os métodos utilizados no Exemplo 9.

Utilizando a metodologia descrita no Exemplo 16, CPOPv-A é avaliada para a sua capacidade de clivar SNAP-25 no modelo celular eDRG. A Figura 26 ilustra que a CPOPv-A é capaz de clivar SNAP-25 no modelo eDRG, obtendo clivagem de no máximo de 50% de SNAP-25 após exposição das células a, aproximadamente, 5,9 nM de fusão durante 24 h.

Exemplo 28 - Preparação de uma proteína de fusão protease de IgA-nociceptina variante-HN/A A sequência de aminoácidos da protease de IgA foi obtida de fontes de bases de dados disponíveis gratuitamente, tal como GenBank (número de acesso P09790). A informação relativa à estrutura do gene da protease de IgA de N. Gonorrhoeae está disponível na literatura (Pohlner et al., Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease, Nature, 1987, 325(6103), 458-62). Utilizando a ferramenta de

Tradução inversa v2.0 (Entelechon), foi determinada a sequência de ADN que codifica a protease de IgA modificada por expressão de E. coli. Uma sequência de reconhecimento BamRI foi incorporada na extremidade 5' e um codão que codifica um aminoácido cisteina e uma sequência de reconhecimento Sail foi

incorporada na extremidade 3' do ADN de IgA. A sequência de ADN foi rastreada utilizando MapDraw, (DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem de enzima de restrição incorporadas durante a tradução inversa. Quaisquer sequências de clivagem que se verifica serem comuns àquelas necessárias para clonagem foram removidas manualmente da sequência de codificação proposta, assegurando que a utilização de codão de E. coli comum é mantida. A utilização do codão de E. coli é avaliada por referência aos programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e a % de conteúdo GC e proporção de utilização de codão, avaliados por referência às tabelas publicadas de utilização de codão. Esta sequência de ADN otimizada (SEQ ID 74) contendo a grelha de leitura aberta (ORF) de IgA é então sintetizada comercialmente. A IgA (SEQ ID 74) é inserida na ORF de LC-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN (SEQ ID 25) utilizando as enzimas de restrição BamRI e SalI para substituir o LC com o ADN da protease de IgA. A construção final contém a ORF de IgA-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN (SEQ ID 75) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 76.

Exemplo 29 - Preparação e avaliação de uma proteína de fusão de endopeptidase dirigida a nociceptina com um marcador de purificação de histidina removível.

Foi preparada ADN que codifica um marcador de his (his6) removível de Fator Xa, embora seja claro que também são possíveis sítios de proteases alternativos, tais como enterocinase e marcadores de purificação alternativos, tal como marcadores de histidina mais longos. Utilizando uma de várias ferramentas de software de tradução inversa (por exemplo, melhor tradução inversa de E. coli EditSeq (DNASTAR Inc.) ou ferramenta de Tradução inversa v2.0 (Entelechon)], é determinada a sequência de ADN que codifica a região de marcador de his removível. Os sítios de restrição são, depois, incorporados na sequência de ADN e podem ser dispostos como Nhel-ligante-Spel-Pstl-HN/A-XbaI-LEIEGRSGHHHHHH-codão de terminação-Hindi 11 (SEQ ID 77). A sequência de ADN é rastreada para sequência de restrição incorporada e quaisquer sequências adicionais são removidas manualmente da restante sequência, assegurando que a utilização comum do codão de E. coli é mantida. A utilização do codão de E. coli é avaliada por referência aos programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e a % de conteúdo GC e proporção de utilização de codão avaliados por referência às tabelas publicadas de utilização de codão (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de ADN otimizada é então sintetizada comercialmente (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vetor pCR 4. De modo a produzir CPNv-A-FXa-HT (SEQ ID 78, construção de marcador de his removível), o vetor pCR 4 que codifica o marcador de his removível é clivado com NheI e HindIII. O fragmento Nhel-HindIII é depois inserido no vetor LC/A-CPNv-HN/A (SEQ ID 25) , o qual também foi clivado por

NheI e Hindlll. A construção final contém as sequências da ORF de LC/A-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN-FXa-marcador de His-HindIII (SEQ ID 78) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 79. A Figura 27 ilustra a purificação de CPNv-A-FXa-HT a partir de E. coli, seguindo os métodos utilizados no Exemplo 9.

Exemplo 30 - Preparação de uma proteína de fusão de endopeptidase dirigida a leu-encefalina contendo vim domínio de translocação derivado da toxina de difteria A sequência de ADN é concebida por tradução inversa da sequência de aminoácidos do domínio de translocação da toxina de difteria (obtida de fontes de base de dados disponíveis gratuitamente, tal como GenBank (número de acesso 1XDTT), utilizando uma de várias ferramentas de software de tradução inversa (por exemplo, melhor tradução inversa de E. coli EditSeq (DNASTAR Inc.) ou ferramenta de Tradução inversa v2.0 (Entelechon)]. Os sítios de restrição são depois incorporados na sequência de ADN e depois dispostos como Nhel-liqante-Spel-Pstl-domínio de translocação de difteria-Xfoal-codão de terminação-HindlII (SEQ ID 80) . As sequências de reconhecimento PstI/Xbal são incorporadas nas extremidades 5' e 3' do domínio de translocação respetivamente da sequência, mantendo a grelha de leitura correta. A sequência de ADN é rastreada (utilizando software, tal como MapDraw, DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem de enzima de restrição incorporadas durante a tradução inversa. Quaisquer sequências de clivagem que se verifica serem comuns àquelas necessárias pelo sistema de clonagem são removidas manualmente a partir da sequência de codificação proposta garantindo que a utilização comum do codão de E. coli é mantida. A utilização do codão de E. coli é avaliada por referência aos programas de software, tais como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e a % de conteúdo GC e proporção de utilização de codão, avaliados por referência às

tabelas publicadas de utilização de codão (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de ADN contendo o domínio de translocação de difteria é depois sintetizado comercialmente como Nhel-ligante-Spel-Pstl-domínio de translocação de difteria-XfoaJ-codão de terminação-Hindi 11 (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionado no vetor pCR 4 (Invitrogen) . O vetor pCR 4 que codifica o domínio de translocação de difteria é clivado com NheI e Xfoal. O fragmento Nhel-Xbal é depois inserido no vetor LC/A-CPLE-Hn/A (SEQ ID 68) que foi também clivado por Nhe I e

Xfoal. A construção final contém as sequências da ORF de LC/A-leu-encefalina-espaçador-domínio de translocação de difteria (SEQ ID 81) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 82.

Exemplo 31 - Preparação de uma proteína de fusão de endopeptidase dirigida a nociceptina variante contendo um domínio LC derivado da toxina do tétano. A sequência de ADN é concebida por tradução inversa da sequência de aminoácidos LC da toxina do tétano (obtida de fontes de base de dados disponíveis gratuitamente, tal como GenBank (número de acesso 1XDTT), utilizando uma de várias ferramentas de software de tradução inversa (por exemplo, melhor tradução inversa de E. coli EditSeq (DNASTAR Inc.) ou ferramenta de Tradução inversa v2.0 (Entelechon)] . As sequências de reconhecimento BamRI/SalI são incorporadas nas extremidades 5' e 3', respetivamente, da sequência mantendo a grelha de leitura correta (SEQ ID 83) . A sequência de ADN é rastreada (utilizando software, tal como MapDraw, DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem de enzima de restrição incorporadas durante a tradução inversa. Quaisquer sequências de clivagem que se verifica serem comuns àquelas necessárias pelo sistema de clonagem são removidas manualmente a partir da sequência de codificação proposta garantindo que a utilização comum do codão de E. coli é mantida. A utilização do codão de E. coli é avaliada por referência aos programas de software, tal como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart) e a % de conteúdo GC e proporção de utilização de codão, avaliados por referência às tabelas publicadas de utilização de codão (por exemplo, GenBank Release 143, 13 de Setembro de 2004) . Esta sequência de ADN otimizada contendo a grelha de leitura aberta (ORF) de LC de toxina do tétano é depois sintetizada comercialmente (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionado no vetor pCR 4 (invitrogen) . O vetor pCR 4 que codifica a TeNT LC é clivado com BamRI e Sail. O fragmento BamRI-Sail é depois inserido no vetor LC/A-CPNv-HN/A (SEQ ID 25) que foi também clivado por BamRI e Sail. A construção final contém as sequências de ORF de TeNT LC-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN (SEQ ID 84) para expressão como uma proteína da sequência ilustrada na SEQ ID 85.

Exemplo 32 - Preparação de uma proteína de fusão LC/C-nociceptina variante-HN/C com vim ligante de serotipo C nativo que é suscetível a clivagem de Fator Xa

Seguindo os métodos utilizados no exemplo 4, as LC/C (SEQ ID 5) e HN/C (SEQ ID 6) são produzidas e inseridas no ligante nociceptina variante de serotipo C disposto como BamRI-Sall-ligante-nociceptina variante-A/hel-espaçador- Spel- Pstl-Xbal-codão de terminação-Hindi 11 (SEQ ID 86) . A construção final contém as sequências de ORF de LC-ligante-nociceptina variante-espaçador-HN (SEQ ID 87) para expressão como uma proteina da sequência ilustrada na SEQ ID 88. A proteina de fusão é denominada CPNv-C (act. C).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Health Protection Agency Allergan, Inc. <120> Proteínas de Fusão

<130> P2 68 85EP-D1-PCT <140> EP10166556.0 <141> 2005-12-01 <150> EPO581010 3.1 <151> 2005-12-01 <150> GB050 4 9 64.8 <151> 2005-03-10 <150> GB042 63 94.3 <151> 2004-12-01 <160> 88 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 1302 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 Ο 0> 1 ggateeatgg agttcgtteaa caaagagtte aagtataaag aaccagttaa eggtgttgae· 60 attg-ettaca tcaa.aa.tccc.· gaacgstggc cagatgcagc cggtaaagge atteaaaatc 120 cacaacaaaa tcfcgggfc.tat cocggaacgt gataccttta ctsmccGgga agaaggtgac 160 ctgaacccge caccggaage gaaaeaggtg ccggtatctt aetatgaetç· eacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga .eaaetatetg aaaggfcgtta etaaactgtt egagcgtatt 3O0: tactccaecg acctgggccg tatgctgctg aetagcatcg ttcgcggtat ecogfc.tctgg '360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaacfcgcat caaQgttatt -4f0 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 54 0: ggctacggtt ccactcagta catecgtttG totccggact teaoctt.egg tttigaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgeaac tgatcctgcg 660

gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 72 Q cegaaccgtg tettcaaagt taacaecaac gcgtattacg agatgtcegg tctggaagtt 780 agcttcgaag aaetgcgt-ac: ttttggcggt casgacgcta aattcatega etctetgeaa 840 gaaaacgagt tgcgtctgta otattataa# aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900

aaagcgaaat eçatcgtgfg: taccasstget tctctccagt: aeatgaagaa egtttttaaa 96G gaaaaatacc tgctcagcga aga&acctst .ggeaaattct. ctgtagacaa gttgaaattc: 1.020

gataaacttt aeaaaafcget gactgaaatt tacaccgaag- acaaattcgt taagttcttt 10SG aaagttétga aecgeaaaac ctatgtgaac ttcgasaagg1 cagtattcaa aatGaacatc 1:1,40 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 getaatttta acggecagaa cacggaaatc aacaaca.tga, actteacaaa actgaaaaac: 1260 ttcactggtc: tgttcgagtt, ttacaagctg ctgtgegfccg ac 1302 <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 2 <211> 1257 <212> ADN <223> Sintética <400> 2 ctgcagtgta tcaaggttaa caactgggat ttattcttca gcccgagtga agacaacttc 60 accaacgacc tgaacaaagg tgaagaaatc acctcagata ctaacatcga agcagccgaa 120 gaaaacatct cgctggacct gatccagcag tactacctga cctttaattt cgacaacgag 180 ccggaaaaca tttctatcga aaacctgagc tctgatatca tcggccagct ggaactgatg 240 ccgaacatcg aacgtttccc aaacggtaaa aagtacgagc tggacaaata taccatgttc 300 cactacctgc gcgcgcagga atttgaacac ggcaaatccc gtatcgcact gactaactcc 360 gttaacgaag ctctgctcaa cccgtcccgt gtatacacct tcttctctag cgactacgtg 420 aaaaaggtca acaaagcgac tgaagctgca atgttcttgg gttgggttga acagcttgtt 480 tatgatttta ccgacgagac gtccgaagta tctactaccg acaaaattgc ggatatcact 540 atcatcatcc cgtacatcgg tccggctctg aacattggca acatgctgta caaagacgac 600 ttcgttggcg cactgatctt ctccggtgcg gtgatcctgc tggagttcat cccggaaatc 660 gccatcccgg tactgggcac ctttgctctg gtttcttaca ttgcaaacaa ggttctgact 720 gtacaaacca tcgacaacgc gctgagcaaa cgtaacgaaa aatgggatga agtttacaaa 780 tatatcgtga ccaactggct ggctaaggtt aatactcaga tcgacctcat ccgcaaaaaa 840 atgaaagaag cactggaaaa ccaggcggaa gctaccaagg caatcattaa ctaccagtac 900 aaccagtaca ccgaggaaga aaaaaacaac atcaacttca acatcgacga tctgtcctct 960 aaactgaacg aatccatcaa caaagctatg atcaacatca acaagttcct gaaccagtgc 1020 tctgtaagct atctgatgaa ctccatgatc ccgtacggtg ttaaacgtct ggaggacttc 1080 gatgcgtctc tgaaagacgc cctgctgaaa tacatttacg acaaccgtgg cactctgatc 1140 ggtcaggttg atcgtctgaa ggacaaagtg aacaatacct tatcgaccga catccctttt 1200 cagctcagta aatatgtcga taaccaacgc cttttgtcca ctctagacta gaagctt 1257

<210> 3 <211> 1323 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 3 ggatccatgc oggttaecat caacaasttc aactacaaGg· accegatcga caaGaacaac 60:

atcattatga tggaaeogce gttGgeacgt ggtaccggac fttaGtacaa. ggcttttaag izO atcaccgacc gfeatstggat Gatceeggaa cgttacacct fcggttaGaa,· aectgaggaq 180' ttcaacaaga gtagcgggat fettcaategt gacgtctgcg agtaGtatga tceagattat 240': ctgaatacca acgataagaa gaaGatafctc etteagacta tgattaaact cttGaaGGgt ,300 atcaaaagca aaGcgGtcgg tga«a;aaGtG :ctcgaaatga ttatGaaGgg tatcccgtac 36:0' ctcggtgsee gtcgtgtCGG gettgaagag tteaacacca acatcgeaag cgtcaccgtc 42£}: aaeaaaGtea tcagcaaocc aggtgaagtG gaacgtaaaa aaggtatctt çgcaaacGtG 460: atcatcttcg gfcccgggtcc ggtcctcaac gaaaacgaaa ccatcgacat cggtatccag 540 aaccacttcg caagccgtga aggtttcggt ggtatcatgc agatgaaatt ctgcccggaa 600 taegteagtg" tettGaacaa cgteeaggaa aacaaaggtg Gaagcatott caaGegtGgt. ffttacttGa gcgaGGGggc aetcatcctc atgeatgaac tcatGoacgt ectceaeggt 720 etctacggta tcaaagttga sgacctcccg atcgtcecga aegagaagaa attctteatg 780 cagagcaccg acgcaat.cea ggctga.gg.aa GtetaGacGt tcggtggGoa agacccaagt #40,

atcataaçGG cgtcGaGcga e.aaaagcatc taGgaca&ag tcctccagaa cttcaggggt yOO atGgtgptóa gaGtGaaGsa agtcctcgtc fgeateagGg acccgaacat caatatcaac #60 atatacaaga acaagttcaa agacaagtac aaattcgtcg aggacagcga aggcaaatac 1020 agcatcgacg tagaaagttt cgacaagctc tacaaaagcc tcatgttcgg tttcaccgaa 1080 accaacatcg ccgagaacta caagatcaag acaagggcaa gttacttcag cgacagcctc 1140 ccgcctgtca aaatcaagaa cctcttagac aacgagattt acacaattga agagggcttc 1200 aacatcagtg acaaagacat ggagaaggaa tacagaggtc agaacaaggc tatcaacaaa 1260 caggcatacg aggagatcag caaagaacac ctcgcagtct acaagatcca gatgtgcgtc 1320 gac 1323 <210> 4 <211> 1260

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 4 sfcgGagtgea tcgacgtOga eaacgaagac etgttcttGa tcgctgaeaa aaacagcttc 60 agtgaGfacc tgagcaaaaa cgaacgtafcc gaatacaaea cccagagciaa ctaeatggaa 1.20 aacgacttcc cgatcaacga actgatcctg gacaccgacc tgataagtaa aatcgaactg 100 ccgagcgaaa acaccgaaag tctgaccgac ttcaacgttg acgttccggt ttacgaaaaa 240 eagccggeta tsaagaaaat. cttcaccgac gaaaaoacea tcttocagta iCEtgtaeagc 300 eagascttec cgctggaeat ccgtgacatc agtefcga.cea geaffettisga cjgacgctetg 360 etgttcagca aeaa&gttta gagtttcttc ageat-.gga.Gt aeatcaaaae cge.taacaaa 420 gttgttgaag eagggetgtt. cgctggttgg gttaaacaga fccgttaaega etiegttate 4S0. gaagetaaea aaagcaacac tatggacaaa atcgstgaca. tcagtctgat cgttcegt-ac 540 afccgrgtetgg gtgtgaaegt: fggtaacgaa accgstsaag gtaactttga aaacgctttc 600 gagafqgetg gtgcaagcat eqtgetggag ttGatcqegg aãetgctgat gceggttgtt 660 ggfcgcGttce fcgetggáââg fctaeatcgáe aseaaaasea agateatcaa âaccategae 720 •aacgctetga GGâàâ.cgt.aa Ggaaâaatgg agtgatãtgt acggtetgâfc egfc.tge.teag 780 tggGtgagca cegtcaaeac ecagfctGtac aceatcaaag aaggtatgfca caaagGfccfcg 84Θ aacfcaccagg ctcaggctct ggaagagafcc afcca&a'taee gfcta.caaG.at cfcacagfcgag 900 aaggaaaaga gtaacatcaa catcgacttc aacgacatça acagcaaact gaacgaaggt fê0 atcaaccagg ctatcgacaa catcaacaac ttcatcaacg gttgcagtgt tagctacctg 1020 atgaagaaga tgatcccgct ggctgttgaa aaactgctgg acttcgacaa caccctgaaa 1080 aagaacctgc tgaactacat cgacgaaaac aagctgtacc tgatcggtag tgctgaatac 1140 gaaaaaagta aagtgaacaa atacctgaag accatcatgc cgttcgacct gagtatctac 1200 accaacgaca ccatcctgat cgaaatgttc aacaaataca actctctaga ctagaagctt 1260

<210> 5 <211> 1329 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 5 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataac 60 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccq qtccqcqcqa aaacattatt qatccqqaaa ccaqcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataecccggt. gaengcgaat atfectigstg ataacgtgta cgatatccag 120(3 saeggcttta acatc.ocg.aa aagemsotg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260: cgtaatciagg: ògGtgógl*aa agtgga&eqg· .gaâáagateg© tgtâeetgtt. esceaaattt 1320 tgcgtcgac .132 9

<210> 6 <211> 1263 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 6 ctgcagtgtc gtgaactgct ggtgaaaaac accgatctgc cgtttattgg cgatatcagc 60 gatgtgaaaa ccgatatctt cctgcgcaaa gatatcaacg aagaaaccga agtgatctac 120 tacccggata acgtgagcgt tgatcaggtg atcctgagca aaaacaccag cgaacatggt 180 cagctggatc tgctgtatcc gagcattgat agcgaaagcg aaattctgcc gggcgaaaac 240 caggtgtttt acgataaccg tacccagaac gtggattacc tgaacagcta ttactacctg 300 gaaagccaga aactgagcga taacgtggaa gattttacct ttacccgcag cattgaagaa 360 gcgctggata acagcgcgaa agtttacacc tattttccga ccctggcgaa caaagttaat 420 gcgggtgttc agggcggtct gtttctgatg tgggcgaacg atgtggtgga agatttcacc 480 accaacatcc tgcgtaaaga taccctggat aaaatcagcg atgttagcgc gattattccg 540 tatattggtc cggcgctgaa cattagcaat agcgtgcgtc gtggcaattt taccgaagcg 600 tttgcggtta ccggtgtgac cattctgctg gaagcgtttc cggaatttac cattccggcg 660 ctgggtgcgt ttgtgatcta tagcaaagtg caggaacgca acgaaatcat caaaaccatc 720 gataactgcc tggaacagcg tattaaacgc tggaaagata gctatgaatg gatgatgggc 780 acctggctga gccgtattat cacccagttc aacaacatca gctaccagat gtacgatagc 840 ctgaactatc aggcgggtgc gattaaagcg aaaatcgatc tggaatacaa aaaatacagc 900 ggcagcgata aagaaaacat caaaagccag gttgaaaacc tgaaaaacag cctggatgtg 960 aaaattagcg aagcgatgaa taacatcaac aaattcatcc gcgaatgcag cgtgacctac 1020 ctgttcaaaa acatgctgcc gaaagtgatc gatgaactga acgaatttga tcgcaacacc 1080 aaagcgaaac tgatcaacct gatcgatagc cacaacatta ttctggtggg cgaagtggat 1140 aaactgaaag cgaaagttaa caacagcttc cagaacacca tcccgtttaa catcttcagc 1200 tataccaaca acagcctgct gaaagatatc atcaacgaat acttcaatct agactagaag 1260 ctt 1263

<210> 7 <211> 207 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 7 ggatccacgc acgtcgacgg cãtcattacc: tccaaaacta aatctctgat .cgsaggtcgt 60 tttggcggtt tcacgggcgc aegoaaatca gcgcgtaaat tagetaacca ggcgstagcg 120 ggcggtggcg gtagcggcgg tggcggtaf'O ggcggtggGg gtagcgcact agtgctgcag 180 acgcacggtc tagaatgata agagctt 207

<210> 8 <211> 108 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 8 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga 60 aacaaagcgc tgaacctgca gacgcacggt ctagaatgat aaaagctt 108

<210> 9 <211> 186 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 Ο Ο> 9 catatgaata acctcgggat tgagggtcgt tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca 60 gcgcgtaaat tagctaacca gactagtggc ggtgggggta gtggcggtgg cggttcgggc 120 gggggtggga gccctagggg atccgtcgac ctgcagggtc tagaagcgct agcgtgataa 180 aagctt 186

<210> 10 <211> 180 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 10 ggatccacgc acgtcgacgc gattgatggt cgttttggcg gtttcacggg cgcacgcaaa 60 tcagcgcgta aattagctaa ccaggcgcta gcgggcggtg gcggtagcgg cggtggcggt 120 agcggcggtg gcggtagcgc actagtgctg cagacgcacg gtctagaatg ataaaagctt 180

<210> 11 <211> 249 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 Ο 0> 11 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat cgaaggtcgt 60 tacggtggtt tcatgacctc tgaaaaatct cagaccccgc tggttaccct gttcaaaaac 120 gctatcatca aaaacgctta caaaaaaggt gaagcgctag cgggtggtgg tggttctggt 180 ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctgca ctagtgctgc agacgcacgg tctagaatga 240 taaaagctt 249

<210> 12 <211> 207 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 0 0> 12 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat cgaaggtcgt 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaac gtaagaacca ggcgctagcg 120 ggcggtggcg gtagcggcgg tggcggtagc ggcggtggcg gtagcgcact agtgctgcag 180 acgcacggtc tagaatgata aaagctt 207

<210> 13 <211> 2709 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 Ο 0> 13 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaattagcta accaggcgct agcgggcggt ggcggtagcg gcggtggcgg tagcggcggt 1440 ggcggtagcg cactagtgct gcagtgtatc aaggttaaca actgggattt attcttcagc 1500 ccgagtgaag acaacttcac caacgacctg aacaaaggtg aagaaatcac ctcagatact 1560 aacatcgaag cagccgaaga aaacatctcg ctggacctga tccagcagta ctacctgacc 1620 tttaatttcg acaacgagcc ggaaaacatt tctatcgaaa acctgagctc tgatatcatc 1680 ggccagctgg aactgatgcc gaacatcgaa cgtttcccaa acggtaaaaa gtacgagctg 1740 gacaaatata ccatgttcca ctacctgcgc gcgcaggaat ttgaacacgg caaatcccgt 1800 atcgcactga ctaactccgt taacgaagct ctgctcaacc cgtcccgtgt atacaccttc 1860 ttctctagcg actacgtgaa aaaggtcaac aaagcgactg aagctgcaat gttcttgggt 1920 tgggttgaac agcttgttta tgattttacc gacgagacgt ccgaagtatc tactaccgac 1980 aaaattgcgg atatcactat catcatcccg tacatcggtc cggctctgaa cattggcaac 2040 atgctgtaca aagacgactt cgttggcgca ctgatcttct ccggtgcggt gatcctgctg 2100 gagttcatcc cggaaatcgc catcccggta ctgggcacct ttgctctggt ttcttacatt 2160 gcaaacaagg ttctgactgt acaaaccatc gacaacgcgc tgagcaaacg taacgaaaaa 2220 tgggatgaag tttacaaata tatcgtgacc aactggctgg ctaaggttaa tactcagatc 2280 gacctcatcc gcaaaaaaat gaaagaagca ctggaaaacc-aggcggaagc taccaaggca 2340 atcattaact accagtacaa ccagtacacc gaggaagaaa aaaacaacat caacttcaac 2400 atcgacgatc tgtcctctaa actgaacgaa tccatcaaca aagctatgat caacatcaac 2460 aagttcctga accagtgctc tgtaagctat ctgatgaact ccatgatccc gtacggtgtt 2520 aaacgtctgg aggacttcga tgcgtctctg aaagacgccc tgctgaaata catttacgac 2580 aaccgtggca ctctgatcgg tcaggttgat cgtctgaagg acaaagtgaa caatacctta 2640 tcgaccgaca tcccttttca gctcagtaaa tatgtcgata accaacgcct tttgtccact 2700 ctagactag 2709

<210> 14 <211> 902 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 Ο 0> 14

Gly Ser Met Glu Phe Vai Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val 15 10 15

Asn Gly Val Asp lie Ala Tyr lie Lys lie Pro Asn Ala Gly Gin Met 20 25 30

Gin Pro Val Lys Ala Phe Lys lie His Asn Lys lie Trp Val lie Pro 35 40 45

Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro 50 55 60

Pro Glu Ala Lys Gin Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu 65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu 85 90 95

Phe Glu Arg lie Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser 100 105 110 lie Val Arg Gly lie Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr lie Asp Thr Glu 115 120 125

Leu Lys Val lie Asp Thr Asn Cys lie Asn Val He Gin Pro Asp Gly 130 135 140

Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val lie He Gly Pro Ser Ala 145 150 155 160

Asp He He Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn 165 170 175 lea Thr .Arg isn Gly Ayr My Ser Thr Gin Tyr lie Arg Phe Ser fro 180 185 190 as© Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser leu Glu Val Asp Iter Ash Pr<a IfS 200 205 leu leu Gly Ala- Gly lys Phe Ala Thr Asp :P'ro Ala Yal Iter leu Ala 210 :21.5 22 0:

His Glu Leu lie His Ala Gly His, Arg Leu Tyr Gly lie Ala lie Asn 225 230 235 24u

Pro Asn Arg Val, Phe: Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 24:5 250 255

Gly leu Glu val Ser Phe Si.u Glu. leu Arg Thr Ptee Gly Gly His Asp 260 265 2.10

Ala lys: Phe lie Asp Ser leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr 275 28Q 285

Tyr Asn lys she Ays Asp lie Ala Ser Thr leu Asn lys Ala lys Ser 2. tO 205 300 lie vai Gly Thr Thr Ala Ser leu Gin Tyr Met lys.· Asn Val phe lys: 305 310 315 320

Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp 325 330 335

Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu lie Tyr Thr 340 345 · 350

Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr 355 360 365

Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys lie Asn lie Val Pro Lys Val 370 375 380

Asn Tyr Thr lie Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 385 390 395 400

Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu lie Asn Asn Met Asn Phe Thr 405 410 415

Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 420 425 430

Val Asp Gly lie lie Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu lie Glu Gly Arg 435 440 445

Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ala Asn 450 455 460

Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480

Gly Gly Ser Ala Leu Val Leu Gin Cys lie Lys Val Asn Asn Trp Asp 485 490 495

Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys 500 505 510

Gly Glu Glu lie Thr Ser Asp Thr Asn lie Glu Ala Ala Glu Glu Asn 515 520 525 lie Ser Leu Asp Leu lie Gin Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp 530 535 540

Asn Glu Pro Glu Asn lie Ser lie Glu Asn Leu Ser Ser Asp lie He 545 550 555 560

Gly Gin Leu Glu Leu Met Pro Asn lie Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys 565 570 575

Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gin 580 585 590

Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg lie Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn 595 600 605

Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp 610 615 620

Tyr Val Lys Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly 625 630 635 640

Trp Val Glu Gin Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val 645 650 655

Ser Thr Thr Asp Lys lie Ala Asp lie Thr lie lie lie Pro Tyr lie 660 665 670

Gly Pro Ala Leu Asn lie Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val 675 680 685

Gly Ala Leu lie Phe Ser Gly Ala Val He Leu Leu Glu Phe lie Pro 690 695 700

Glu He Ala He Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr He 705 710 715 720

Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gin Thr He Asp Asn Ala Leu Ser Lys 725 730 735

Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr He Val Thr Asn Trp 740 745 750

Leu Ala Lys Val Asn Thr Gin lie Asp Leu He Arg Lys Lys Met Lys 755 760 765

Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala Glu Ala Thr Lys Ala lie Ile Asn Tyr 770 775 780

Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn 785 790 795 800 lie Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser lie Asn Lys Ala Met 805 810 815 lie Asn lie Asn Lys Phe: Leu Asa G,ln Cys Ser Vai Ser Tyr Leu Met 820 82 5: @30

Asn Ser Met Tie Pro Tyr Gly Vai Lys Arg· Leu Glu Asp She Asp. Ala 835 840 845

Sex Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr lie Tyr Asp Asn Arg Gly Thr 850 S:5S @60

Leu He Sly Gin Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asa Asn Thr Leu 8:05 870 875 @80

Ser Thr Asp He Pro Phe Gin Leu Sex Lys Tyr val Asp Asn Gin Arg 885 890 895

Leu Leu Sex Thr Leu Asp. 900

<210> 15 <211> 2736 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 Ο 0> 15

Gtcgggattg agggtGgttt: tggGggtttc acgggcgcae: geaaafcaagc gGgláaàftla 6C gçtaaccaga etagtgfGgg t.gggggtagt ggcggtggcg gttcgggcgg gggtgggagc 120 Gçjtaggggat; oeafcggagtt: GgfciagGaaa: gagttsaaet ataaagacçc agittageggl 18 0 gtÊgaçattg ettaeateta aâtBecgaae getggceaga tgeagcGgit aaaggcati.e 240· aaaatGeaca asaaaafcctg ggttatcGcg gaacgtgata cGtttactaa cccggaagaa 300 ggtgaeefega acocgccacs ggaagcgaaa G-aggtgcGgg tatefctaGta tgacteeaGc 36© fca-ccfcgtcta GGgataa.ega aaaggacaac tacctgaaag gtgttactaà aGfcgÊtGfàg 420 cgtatttaQt ccaccgacct gggccgtatg ctgctgacta gcatcgttcg cggtatcccg 480 mçlggggeg gttctaceai cgataççgaa- otgaaagtaa tegacactaa -GtgcatGaae '34#' gttattgagp sggacggfctg Gfcafccgttee gaagaaGtga aeGtggtgafc Gatcggcecg 6ΘΘ tGtgctgata tsatccagtt egagtgtaag agetttggtc: aegaagttct gaaectcacc 660 egtaacgget aeggt.fcc-cao tcagtacatG cgtttcfcatc: cggacfelísaG cttcggtttt 720 gaagaatccq tggaagfeaga caEfaace:ea G'tgGfcgggeg GlggeaaalC GfsaaGtgat ?#0 cctgcggtta ccctggctca ègaactgatfc Gatgcagge© aGGgcctgfca cggtat.Gg;eG 840 atcaatccga accgtgtctt caaagttaac: aGcaãcgGgt atfcacgaga.t. gfcccggtctg 80Θ gaagttagct tegaagaact gGgt.actttt ggeggtcaGg aGgetaaatt Gatcgastct 860

Gtgcaagaaa aGgagttccg t:etgtacteaG: feataacaagt tcaaagatat: êfeáfeègàcc 10-20

etgaacaaag cgaaatccat cgtgggtacc actgcttctc tccagtacat gaagaaggit lOSO fefctaaagaaá aatáGG^ggt aagcgaaga# aGGtécggea aatt'fegtgtgt agaeaagttg 1,140 aaattcgata aactttacaa aatgctgact gaaatttãGá ocgaágacaa cttegttaag 1200 ttcttlaaag ttctgaaccg caaaacctat c-tgaacttcg aeaaggcaft atteaaaafcc 1260 aacatcgtgc cgaaagtt.aa ctacactat©: tacgatggtfc tecaacc&gcg: táâGá©GàaG 1320 etggctge.ta attttaacgg GGagaacacg gaaatcaaca acatgaactt cacaaaactg 1380 aaaaacSlGa: ctggtctgtt cgagttttac aagctgctgt gcgtcgacgg catcattacc 1440 tGGaaaaeta aatetefegat agaaggtaga aacaaagcgG tgaacgaect: GtgtatGaag 1500 gttaacaact gggatttatt ctteagcccg agtgaagaca aattcacGaa cgacctgaac 15:60 aaaggfcgaag aaatcaGctG agat-actaaGi atGgaageag cGga-agaaaa catctcgctg 1620 •gaGGfegatG-G· agcagtac-tea scafc.gaG.cfcfct· aattfeegaca aogagGcgga aaaeatfjtste- 1:68:0: atcgaaaaGG- tgagetctga tatcatsgge cagctggaac tgatgccgaa catcgaacgt 1740 ttcegaaaGg gfcaaaaagta cgagctggac aaatatacca tgttccacta cctgcgcgcg 1800: caggaatttg aacacggcaa atgeegtaCc geãGtgáeta âctGegttaa- cgaagctctg i860:

ctcaacccgt cccgtgtata Gaccttcttc tGtâgegaofc acgtgaaaaa .ggtcaacaaa. 1B2Q .gegâGtgaag ctgcaatgtt cttgggttgg gttgaacagc ttgttfcatga 'ttttaGcgae 1.:980: gagacgtccg aagtatctac taGGgaGaaa attgoggata fccactatcat eatGeegtae 2040 atcggtccgg ctctgaacat tggcaaGâtg títgtâcaaag aegacttcgt tggcgcactg 2100 atottatccg gtgcggtgât eétgGtggag ttcatcccgg aaafccgccat c.ccggtaGfcg 2160: ggcaGct.ttg etctggttfcc ttaeattgGa aacaaggttc tígaetgtaea aaccatcgac 2220 aaEgegG-tga geaaaegtaa Ggàaaaa^gg gáfigaaffttt: aeaaatatat cgtgaccaac 2280: 'tfgetgg&tâ .aggfeèaataG tGagafcGga© GtGatGggGa aaaaaatgaa 'agaageaGfeg·' 284 Θ gaaaaceagg cggaagctac caaggcaatc atfcaacfcacc agtacaacca gtacaccgag 2400: gaagaaaaam acaacatcaa cttcaacatc gaGgafGfeg.t: cctctaaact gaâGgaâtoG 2460 atèâaôaaag efeatgatpaa. catcaacaag tt-GÇtgâaoe agtgGtetgt aagctatGtg 2:520 âtgaaGtcca tgatcc-Ggta eggtgfctaaa cgtctggagg acttcgatgc gtctGtgaaa 2580: gacgccetgc igaaataeat ttac;ga:.caae cgtggcactc tgatGggtca ggttgatcgt 2640

Gigaaggaca aagtgaaqaa tacGttateg accgacatcc atfttcaget -Gagtsaa-tat 2700- gtcgataacc aacgpetttt: gte-eacEsta gaefcag 2736

<210> 16 <211> 911 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 Ο 0> 16

Leu Gly lie Glu Gly Arg Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser 15 10 15

Ala Arg Lys Leu Ala Asn Gin Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg Gly Ser Met Glu Phe Val 35 40 45

Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly Val Asp lie Ala 50 55 60

Tyr lie Lys lie Pro Asn Ala Gly Gin Met Gin Pro Val Lys Ala Phe 65 70 75 80

Lys lie His Asn Lys lie Trp Val lie Pro Glu Arg Asp Thr Phe Thr 85 90 95

Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu Ala Lys Gin Val 100 105 110

Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr Asp Asn Glu Lys 115 120 125

Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu Árg lie Tyr Ser 130 135 140

Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser lie Val Arg Gly lie Pro 145 150 155 160

Phe Trp Gly Gly Ser Thr lie Asp Thr Glu Leu Lys Val lie Asp Thr 165 170 175 Ãsn Cys lie Asn Val lie Gin fee Asp Sly Ser Tyr Arg Ser Gin Glu 180 185 190 ley ash Leu yal xle lie Giy Pro Sir αΙα Asp: iie lie Gin Phe Glu 19^ 200 205

Cys Lys Ser Hie Sly Bis Glu 'Val Lea Asn: Lem Thr .Arg Asn Sly Tyr 210 2 IS 2:20

Sly Ser Thr Sift Tyr lie Arg Phe Ser Pro Asp Phe Thr Pile Sly Phe 225 :230 2:35 24 0

Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu. Leu Gly Ala Gly Lys 245 250 255

Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu Leu lie His Ala 260' 265 270

Gly His Arg Leu Tyr Gly lie Ala lie Asn Pro Asn Arg Val Phe Lys 275 280 285

Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu Glu Val Ser Phe 290 295 300

Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys Phe lie Asp Ser 305 310 315 320

Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn Lys Phe Lys Asp 325 330 335 lie Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser lie Val Gly Thr Thr Ala 340 345 350

Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Vai Phe Lys Glu Lys Tyr Leu Leu Ser 355 360 365

Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Vai Asp Lys Leu Lys Phe Asp Lys 370 375 380

Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu lie Tyr Thr Glu Asp Asn Phe Vai Lys 385 390 395 400

Phe Phe Lys Vai Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn Phe Asp Lys Ala 405 410 415

Vai Phe Lys lie Asn lie Vai Pro Lys Vai Asn Tyr Thr Ile Tyr Asp 420 425 430

Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn Phe Asn Gly Gin 435 440 445

Asn Thr Glu lie Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu Lys Asn Phe Thr 450 455 460

Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Vai Asp Gly Ile Ile Thr 465 470 475 480

Ser Lys Thr Lys Ser Leu Ile Glu Gly Arg Asn Lys Ala Leu Asn Asp 485 490 495

Leu Cys Ile Lys Vai Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu 500 505 510

Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp 515 520 525

Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gin 530 535 540

Gin Ty® Tyr Leu Thr Phe Asn Phé Asp Asa Glu Prõ. Glu. .Asn.. Ile Ser 545 550 555 560 lie Glu Asn Leu Ser Ser Asp Tie Tie Gly Gin Leu Glu Leu Met .Pr© 565 570 575

Asn lie Glu Arg PLe PP© Asn Sly Lys Ays Tyr Glu Léu Asp 'Lys Tyr S|Q: 585 5S>0

Thr Met Phe Eis Tyr Leu Axg Ala Gin Glu Ph© Glu His Gly :Lys. Ser 5:§5 SOO 605

Arg lie Ala Leu Thr Asn Ser Vai Asn Glu Ala: Leu. Leu. Asn Pr© Ser 610 615 620

Arg Vai Tyr Thr Pb®: Phe Ser Ser ..Asp Tyr Vai Lys Lys Vai Asn Lys 625 6:30 635 640

Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu. Gly Trp Vai Glu Gin Leu Vai Tyr 645 650 655

Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu. Vai Ser Thr Thr Asp. Lys Tie Ala 660 665 670

Asp lie Thr lie He lie Pr© Tyr lie Gly Pr© Ala. Leu Asn Ile Gly 675 610 685

Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Ph© Vai Gly Ala Leu lie Phe Ser Gly 6f:0 695 700

Ala Vai Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pr© Glu 11:¾ Ala lie Pro Vai Leu 705 710 715 720

Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr lie Ala Asn Lys Val Leu Thr Val 725 730 735

Gin Thr lie Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu 740 745 750

Val Tyr Lys Tyr lie Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gin 755 760 765 lie Asp Leu lie Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala 770 775 780

Glu Ala Thr Lys Ala lie lie Asn Tyr Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu 785 790 795 800

Glu Glu Lys Asn Asn lie Asn Phe Asn lie Asp Asp Leu Ser Ser Lys 805 810 815

Leu Asn Glu Ser lie Asn Lys Ala Met lie Asn lie Asn Lys Phe Leu 820 825 830

Asn Gin Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met lie Pro Tyr Gly 835 840 ' 845

Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu 850 855 860

Lys Tyr lie Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu lie Gly Gin Val Asp Arg 865 870 875 880

Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp lie Pro Phe Gin 885 890 895

Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser Thr Leu Asp 900 905 910 <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 17 <211> 2715 <212> ADN <223> Sintética <4 0 0> 17 ggatccga&t tcatgccgat caccatcaac aacttcaãèfc acagcgatcc ggtggataae: €0 .aaaaacateq tgtacqtggà taGeeatctg' aatacGctgg cgaaSgaafiG ggaaaaagog 120 ttfecgtiatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagcqgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tft:tac.cage. cGgaaaagcg gtta.t.t.aqga tccgaactat 240 stgageageg atagcgataa. agataqéttG ctgaaagaaa tcatcaaact gtteaasqgP 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt J60 ccgggcaaca acaacaccec gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt eaacagegtt: 42 0 gáfcgttaaàa cccgccaggg taagaattgg' gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 afctattaccg gtccgcgcga aaapattatt gatccggaaa ccagcaGett taaactgacc 540 aasaacacet; fefgqggcgea. ggaagftftt ggcgcgctga gcattaftaf GattfagqGçg #00 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggiseg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aaetgaaeoa tgcgatgcat 720 aace.tgtatg· gcatcgpgat tecgaacgat cagaccatta. geagGgtgaP Gageaaçate. 380 ttttacagcc agtaeaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tetatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 aqcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 aacfgcttta acatcGcgaa. aageaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 sgtaatgcgg; Ggetgcgtaa agtgaaecGg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgGgtggaeg: Ggatagaligg tagatttgg© ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaattageta acGaggcgsit. agcgggcggt. ggeggtagcg gcggtggcgg tagcggcggt 144:0 ggcggtagcg: G:actag:tg.Gt gcagtgtGgt gaaGtgctgg tgaaaaaGaç cgatctgccg 1500 ttfeafctggfeg atatGagaga: Êglgàaa&GG ga6a6:G66GG: tgegcaHaga fca&GaaGgàa 1560 gaàaçcgâag; tgatçtactã GceggataaG. gtgagcgttg' atG-aggtgat Ge.tgagcaaa 1620 aaGaccagcg aseatggtGa gGtggatctg' ctgtatccga gcattgatag cgaaagGgaa 1680 attctgccgg gcgaaaacca ggtgttttac gataaccgta cccagaacgt ggattacctg 1740 aacagctatt actacctgga aagccagaaa ctgagcgata acgtggaaga ttttaccttt 1800 acccgcagca ttgaagaagc gctggataac agcgcgaaag tttacaccta ttttccgacc 1860 ctggcgaaca aagttaatgc gggtgttcag ggcggtctgt ttctgatgtg ggcgaacgat 1920 gtggtggaag atttcaccac caacatcctg cgtaaagata ccctggataa aatcagcgat 1980 gttagcgcga ttattccgta tattggtccg gcgctgaaca ttagcaatag cgtgcgtcgt 2040 ggcaatttta ccgaagcgtt tgcggttacc ggtgtgacca ttctgctgga agcgtttccg 2100 gaatttacca ttccggcgct gggtgcgttt gtgatctata gcaaagtgca ggaacgcaac 2160 gaaatcatca aaaccatcga taactgcctg gaacagcgta ttaaacgctg gaaagatagc 2220 tatgaatgga tgatgggcac ctggctgagc cgtattatca cccagttcaa caacatcagc 2280 taccagatgt acgatagcct gaactatcag gcgggtgcga ttaaagcgaa aatcgatctg 2340 gaatacaaaa aatacagcgg cagcgataaa gaaaacatca aaagccaggt tgaaaacctg 2400 aaaaacagcc tggatgtgaa aattagcgaa gcgatgaata acatcaacaa attcatccgc 2460 gaatgcagcg tgacctacct gttcaaaaac atgctgccga aagtgatcga tgaactgaac 2520 gaatttgatc gcaacaccaa agcgaaactg atcaacctga tcgatagcca caacattatt 2580 ctggtgggcg aagtggataa actgaaagcg aaagttaaca acagcttcca gaacaccatc 2640 ccgtttaaca tcttcagcta taccaacaac agcctgctga aagatatcat caacgaatac 2700 ttcaatctag actag 2715 <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 18 <211> 904 <212> PRT <223> Sintética <4 0 0> 18

Sly Ser Glu Phe Met Fro lie Thr lie Asn Asn Rhe Asn Tyr Ser Asp 1. ' 6 1:0 15

Pro Val Asp Asn Lys Asa lie Leu Tyr Leu Asp Thr 8is: Leu Asn Thr 20 IS 30

Leu Ala Asn Glu Fro: Glu Lys Ala Phe- Arg He Thr Sly Asn He Tip 35 40 45

Val lie Pro Asp Arcr Phe Ser Srg Asn Ser Asn Pro Asn Leu. Ash Lys 50 51 60

Pro Pro Arg val Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asti Tyr 65 70 75 80

Leu Ser Thr Asp Ser Asp; Lys Asp Thr Phe Leu Lys: Glu He He Lys: 85 90 95

Leu Phe Lys Arg Hi Asn. Ser Arg; Glu He 'Sly Glu Glu Leu lie: Tyr 100 105 110

Arg Leu Ser Thr Asp lie Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro lie 115 120 125

Asn Thr Phe Asp Phe Asp Val Asp Phe Asn Ser Val Asp Val Lys Thr 130 135 140

Arg Gin Gly Asn Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser lie Asn Pro Ser Val 145 150 155 160 lie lie Thr Gly Pro Arg Glu Asn lie lie Asp Pro Glu Thr Ser Thr 165 170 175

Phe Lys Leu Thr Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gin Glu Gly Phe Gly Ala 180 185 190

Leu Ser lie lie Ser lie Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn 195 200 205

Ala Thr Asn Asp Val Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys 210 215 220

Met Asp Pro lie Leu lie Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His 225 230 235 240

Asn Leu Tyr Gly lie Ala lie Pro Asn Asp Gin Thr lie Ser Ser Val 245 250 255

Thr Ser Asn lie Phe Tyr Ser Gin Tyr Asn Val Lys Leu Glu Tyr Ala 260 265 270

Glu lie Tyr Ala Phe Gly Gly Pro Thr lie Asp Leu lie Pro Lys Ser 275 280 285

Ala Arg Lys Tyr Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser He 290 295 300

Ala Lys Arg Leu Asn Ser Tie Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn 305 310 315 320

Lys Tyr lie Gly Glu Tyr Lys Gin Lys Leu He Arg Lys Tyr Arg Phe 325 330 335 Vâl Vai Glu Ser Ser Gly Glu Vâl Thr Vai Asti Arg; Asn. lys Phe Vai 340 345 350

Glu Leu Tyr As» Glu Leu Thr Gin Ile Phe Thr glu Phe As® Tyr Ala 35S 360 365

Lys I-lé: Tyr As® Vâl Gin Asn Arg Lys He Tyr Leu: Ser Asn Vai Tyr 370 315. 38 õ:

Thr Pro Vai Thr Ala Asn Tle: Leu Asp Asp Asn Vai Tyr Asp Ile Gin 383 3S0 .335: 400; A®n Gly Phe Asn lie Pro Lys Ser As® Leu Asn Vai leu. Phe. Met gly 405 410 415

Glú As®. Leu Ser £rg Asn pre Α;1® Leu Arg Lys: Vâl Asn Pro Glu Asn 420 425 430

Met. Leu Tyr Leu Phe Thr Lys Phe Gys Vai. Asp Ala Tie Asp Gly Arg 435 440 445

Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala. Arg Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ala Ash 450 ’ 455 460

Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 47 5 48.0:

Gly Gly Ser Ala Leu Vai. Leu Gin Cys Arg Glu Leu Leu. Vai Lys Asn 485 490 495

Thr Asp Leu Pro Phe lie Gly Asp Ile Ser Asp Vai Lys Thr Asp Ile 500 505 510

Phe Leu Arg Lys Asp lie Asn Glu Glu Thr Glu Vai lie Tyr Tyr Pro 515 520 525

Asp Asn Vai Ser Vai Asp Gin Vai Ile Leu Ser Lys Asn Thr Ser Glu 530 535 540

His Gly Gin Leu Asp Leu Leu Tyr Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu 545 550 555 560 lie Leu Pro Gly Glu Asn Gin Vai Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gin Asn 565 570 575

Vai Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr Tyr Leu Glu Ser Gin Lys Leu Ser 580 585 590

Asp Asn Vai Glu Asp Phe Thr Phe Thr Arg Ser Ile Glu Glu Ala Leu 595 600 605

Asp Asn Ser Ala Lys Vai Tyr Thr Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn Lys 610 615 620

Vai Asn Ala Gly Vai Gin Gly Gly Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp 625 630 635 640

Vai Vai Glu Asp Phe Thr Thr Asn Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp 645 650 655

Lys Ile Ser Asp Vai Ser Ala lie lie Pro Tyr lie Gly Pro Ala Leu 660 665 670

Asn Ile Ser Asn Ser Vai Arg Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala 675 680 685

Vai Thr Gly Vai Thr lie Leu Leu Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile 690 695 700

Pro Ala Leu Gly Ala Phe Vai Ile Tyr Ser Lys Vai Gin Glu Arg Asn 705 710 715 720

Glu lie lie Lys Thr lie Asp Asn Cys Leu Glu Gin Arg lie Lys Arg 725 730 735

Trp Lys Asp Ser Tyr Glu Trp Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg lie 740 745 750 lie Thr Gin Phe Asn Asn lie Ser Tyr Gin Met Tyr Asp Ser Leu Asn 755 760 765

Tyr Gin Ala .Gly Ala lie Lys Ala Lys lie Asp Leu Glu Tyr Lys Lys 770 775 780

Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn lie Lys Ser Gin Val Glu Asn Leu 785 790 795 800

Lys Asn Ser Leu Asp Val Lys lie Ser Glu Ala Met Asn Asn lie Asn 805 810 815

Lys Phe lie Arg Glu Cys Ser Val Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu 820 825 830

Pro Lys Val lie Asp Glu Leu Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala 835 840 845

Lys Leu lie Asn Leu lie Asp Ser His Asn lie lie Leu Val Gly Glu 850 855 860

Val Asp Lys Leu Lys Ala Lys Val Asn Asn Ser Phe Gin Asn Thr lie 865 870 875 880

Pro Phe Asn lie Phe Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp lie 885 890 895 lie Asn Glu Tyr Phe Asn Leu Asp 900 <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 19 <211> 2742 <212> ADN <223> Sintética <4 0 0> 19 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataac 60 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga teegaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 aacggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgcgtcgacg gcatcattac ctccaaaact aaatctctga tagaaggtag atttggcggt 1380 ttcacgggcg cacgcaaatc agcgcgtaaa ttagctaacc aggcgctagc gggcggtggc 1440 ggtagcggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcgcac tagtgctgca gtgtcgtgaa 1500 ctgctggtga aaaacaccga tctgccgttt attggcgata tcagcgatgt gaaaaccgat 1560 atcttcctgc gcaaagatat caacgaagaa accgaagtga tctactaccc ggataacgtg 1620 agcgttgatc aggtgatcct gagcaaaaac accagcgaac atggtcagct ggatctgctg 1680 tatccgagca ttgatagcga aagcgaaatt ctgccgggcg aaaaccaggt gttttacgat 1740 aaccgtaccic agaacgtgga ttacctgaae: agctattact acctggaaag ccagaaactg 1800 agcgataacg tggaagat.tt tacctttacc cgcagcattg aagaagcgct ggataacagc i860 gcgaaagttt acacctattt teggaçggCg gcgãacãàag ttaatgGggg fcgttGâgggG 112 0: ggtctgtttc tgatgtgggc gaaegstgtg gtggaagatt tcaccaccaa catGctgcgt 1.I8Q aasgatacec tggataaaat eagcgatgtt agcgcga.tta ttccgtatat tggfcGGggcg 204 0: otgaaeatta geaatagcgt gegtcgtgge: aattttaccg aagcgtttgc ggt®aGGfg£ 210Q: gtgaGGattec: tgcfcggaàgc gtttccggaa tttaccattc cggcgctggg tgcgtttgtg 2160 aGeta-Çagca aàgfcgGaggà aGgcaaegaa atcatoaaaa: GGatagataa etgcGtggaa 2:22 0: Gagcgt-atta âacgctggaa agatagctat gaatggatga fcgggcaGGtg gctgagccgt 2280 at-tatoaCGG agttGaaoaa oatcagetac cagatgtacg atagGctgaa ctatcaggcg 23:40 ggtgcgatta aagGgaaaate cgaÈG^ggàa 'tàGaaaaaat· âGagGggGag egaCaaagas 2:400: aacatcaaaa gccaggttga aaacctgaaa aaGageetgg atgtgaaaat tagcgaagcg 2460 atgaataaca tGaacaâafct eateegcgaa tgeagcgtga CGtaccfcgtt GaaaaaGatg 252C1 Gtgccgaaag tgatcgaGga astgaacgaa tttgafcGgGa aGaGGaaagè gasaGtegaEG 2:58(3 aaGGtgatcg atagccacaa cattattctg gtgggcgaag tggataaact gaàagegáâa 2640 gfetaaGaaGa gcttccagaa GaGGaG&cçg· ttiaaeatet: teagetataG saaeaaGagG 2700 GGgeligaâag atafccatGaa Ggaatasttc; aaGctagaGt. ag 2:742 <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 20 <211> 913 <212> PRT <223> Sintética <400> 20

Gly Ser Glu Phe Met Pro lie Thr lie Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp 15 10 15

Pro Val Asp Asn Lys Asn lie Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr 20 25 30

Leu Ala Asn Glu Pro Glu Lys Ala Phe Arg lie Thr Gly Asn He Trp 35 40 45

Val lie Pro Asp Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys 50 55 60

Pro Pro Arg Val Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr 65 70 75 80

Leu Ser Thr Asp Ser Asp Lys Asp Thr Phe Leu Lys Glu lie lie Lys 85 90 95

Leu Phe Lys Arg He Asn Ser Arg Glu He Gly Glu Glu Leu lie Tyr 100 105 110

Arg Leu Ser Thr Asp lie Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro lie 115 120 125

Asn Thr Phe Asp Phe Asp Val Asp Phe Asn Ser Val Asp Val Lys Thr 130 135 140

Arg Gin Gly Asn Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser lie Asn Pro Ser Val 145 150 155 160 lie lie Thr Gly Pro Arg Glu Asn lie lie Asp Pro Glu Thr Ser Thr 165 170 175

Phe Lys Leu Thr Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gin Glu Gly Phe Gly Ala 180 185 190

Leu Ser lie lie Ser lie Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn 195 200 205

Ala Thr Asn Asp Val Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys 210 215 220

Met Asp Pro lie Leu lie Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His 225 230 235 240

Asn Leu Tyr Gly lie Ala lie Pro Asn Asp Gin Thr lie Ser Ser Val 245 250 255

Thr Ser Asn lie Phe Tyr Ser Gin Tyr Asn Val Lys Leu Glu Tyr Ala 260 265 270

Glu lie Tyr Ala Phe Gly Gly Pro Thr lie Asp Leu lie Pro Lys Ser 275 280 285

Ala Arg Lys Tyr Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser lie 290 295 300

Ala Lys Arg Leu Asn Ser lie Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn 305 310 315 320

Lys Tyr lie Gly Glu Tyr Lys Gin Lys Leu lie Arg Lys Tyr Arg Phe 325 330 335

Val Val Glu Ser Ser Gly Glu Val Thr Val Asn Arg Asn Lys Phe Val 340 345 350

Glu Leu Tyr Asn Glu Leu Thr Gin lie Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala 355 360 365

Lys lie Tyr Asn Val Gin Asn Arg Lys lie Tyr Leu Ser Asn Val Tyr 370 375 380

Thr Pro Val Thr Ala Asn lie Leu Asp Asp Asn Val Tyr Asp lie Gin 385 390 395 400

Asn Gly Phe Asn lie Pro Lys Ser Asn Leu Asn Val Leu Phe Met Gly 405 410 415

Gin Asn Leu Ser Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Val Asn Pro Glu Asn 420 425 430

Met Leu Tyr Leu Phe Thr Lys Phe Cys Val Asp Gly lie lie Thr Ser 435 440 445

Lys Thr Lys Ser Leu lie Glu Gly Arg Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala 450 455 460

Arg Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ala Asn Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly 465 470 475 480

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Val Leu 485 490 495

Gin Cys Arg Glu Leu Leu Val Lys Asn Thr Asp Leu Pro Phe lie Gly 500 505 510

Asp: -lie Ser Asp Val. Lys Thr Asp lie Pile leu Arp Lys .Asp lie Asn 5i 5 525

Glu Glu Thr Glu Val lie Tyr Tyr Pro Asp Asa Val Ger Val Asp Gin '530 535 54 Q

Val lie Leu Sèr Lys Asn Thr Ser Glu Bis Gly Gin Leu Asp Leu Leu 545 550 555 560

Tyr Pre S'er Lie Asp Sar Glu Per Glu lie Leu Pro Gly Glu Assn Gin 565 570: 57:5:

Val Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gin Asn Val Asp Tyr Leu Asn Se:r Tyr 580 585 590

Tyr Tyr Leu Glu Sesr Gin Lys Leu Per Asp. Asn Val Glu Asp Ph.e- Thr 595 GOO 605

Phe Thr Arg Ser lie Glu Glu Ala Leu Asp Asn. Ser Ala Lys Val Tyr 610 615 620

Thr Tyr phe Pre Thr Leu Ala Ash Lys Va 1 Asn Ala. Gly Vàl Gin Gly 625 630 635 640

Gly Leu. Phe Leu Met Trp Ala. Asn Asp Val Val, Glu Asp Phe Thr Thr 64 5 65G; 65:5

Asn lie Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys: Lie: Ser Asp Val Ser Ala-£οϋ 665 6 70

Lie lie Pro Tyr He Gly Pro- Ala Leu Asn: lie: Ser Asn Per Val. Arg 67:5: 6 SO 685

Arg Gly Ash phe Thr Glu Ala Phe Ala Val Thr Gly Val Thr I.le: Leu 690 695 700

Leu Glu Ala Phe Pro Glu. Phe Thr lie Pro:: Ala Leu Gly Ala Phe Val 705 710; H5 72 0 lie Tyr Ser Lys Val Gin Glu Arg Ahh Glu lie Lie Lys Thr Lie· Asp Ή 5 7,3 0: 1,35

As®: Gys, Lea βία Sin ,Arg 11¾ 1¾¾ Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Glu Trp 740 745 750 ;Mes:t· Met Gly Thr Trp Leii Ser Arg lie lie Tht: Gin Phe As® As® lie 7 55 760 Ό5

Set. Tyr Gin Met Tyr Asp Ser Leu As® Tyr Gin Ala Gly Ala lie Lys: 770 775 78 0

Ala lys- lie Asp; Leu Glu Tyr' Lys lys Tyr Ser Gly Get Asp Lys Glu 785 730 795 800

As®: lie. Lys Set SI® ¥al Glu ^sn. Leu Lys As® Ser Leu Asp ¥al Lys: SO 5 810 111

He Ser Glu Ala Met Asn As®; H© Asn Lys PL® lie Arg Glu Gys Ser 820 825 830 ¥al Thr Tyr Leu She Lys Asn Met Leu Pro Lys ¥al He Asp Glu Leu. 83:5 140 84:3

As® Glu Phe Asp: Arg As® Thr Lys Ala Lys Leu He Asn Leu lie Asp 850 855 860

Ser fils As® He He Leu ¥al Gly Glu W1 Asp Lys Leu Lys Ala Lys 865 870 875 880

Val; Asa. Asn Ser Phe Gin Asn Thr Lie Pro Phe As® He Phe Ser Tyr 885 880 895

Thr As® As® Ser Leu Leu Lys Asp: He He As® Glu. Tyr Phe As® Leu 900 905 910

Asp <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 21 <211> 2673 <212> ADN <223> Sintética <400> 21 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcate eacectgaac &ΘΟ

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<210> 22 <211> 890 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 22

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<210> 24 <211> 916 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 24

Gly Set Met Glu Phe Val Asa Lys :Gln Phe Asa Tyr Ays Asp Hr® Val :1 S 10 15

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Asp lie Pro Phe Gin Leu Ser Lys Tyr Vai Asp Asn Gin Arg Leu Leu 900 905 910

Ser Thr Leu Asp 915

<210> 25 <211> 2709 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 25 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaacgtaaga accaggcgct agcgggcggt ggcggtagcg gcggtggcgg tagcggcggt 1440 ggcggtagcg cactagtgct gcagtgtatc aaggttaaca actgggattt attcttcagc 1500 ccgagtgaag acaacttcac caacgacctg aacaaaggtg aagaaatcac ctcagatact 1560 aacatcgaag cagccgaaga aaacatctcg ctggacctga tccagcagta ctacctgacc 1620 tttaatttcg acaacgagcc ggaaaacatt tctatcgaaa acctgagctc tgatatcatc 1680 ggccagctgg aactgatgcc gaacatcgaa cgtttcccaa acggtaaaaa gtacgagctg 1740 gacaaatata ccatgttcca ctacctgcgc gcgcaggaat ttgaacacgg caaatcccgt 1800 atcgcactga ctaactccgt taacgaagct ctgctcaacc cgtcccgtgt atacaccttc 1860 ttctctagcg actacgtgaa aaaggtcaac aaagcgactg aagctgcaat gttcttgggt 1920 tgggttgaac agcttgttta tgattttacc gacgagacgt ccgaagtatc tactaccgac 1980 aaaattgcgg atatcactat catcatcccg tacatcggtc cggctctgaa cattggcaac 2040 atgctgtaca aagacgactt cgttggcgca ctgatcttct ccggtgcggt gatcctgctg 2100 gagttcatcc cggaaatcgc catcccggta ctgggcacct ttgctctggt ttcttacatt 2160 gcaaacaagg ttctgactgt acaaaccatc gacaacgcgc tgagcaaacg taacgaaaaa 2220 tgggatgaag tttacaaata tatcgtgacc aactggctgg ctaaggttaa tactcagatc 2280 gacctcatcc gcaaaaaaat gaaagaagca ctggaaaacc aggcggaagc taccaaggca 2340 atcattaact accagtacaa ccagtacacc gaggaagaaa aaaacaacat caacttcaac 2400 atcgacgatc tgtcctctaa actgaacgaa tccatcaaca aagctatgat caacatcaac 2460 aagttcctga accagtgctc tgtaagctat ctgatgaact ccatgatccc gtacggtgtt 2520 aaacgtctgg aggacttcga tgcgtctctg aaagacgccc tgctgaaata catttacgac 2580 aaccgtggca ctctgatcgg tcaggttgat cgtctgaagg acaaagtgaa caatacctta 2640 tcgaccgaca tcccttttca gctcagtaaa tatgtcgata accaacgcct tttgtccact 2700 ctagactag 2709 <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 26 <211> 902 <212> PRT <223> Sintética <400> 26

Gly $0x Met: Glu Phe Val Asn Lys Sin Phe &sn pyr- Lys Asp Pro Val 1 5 :o " Μ

Ash. Gly Val Asp lie Ala Tyr lie Lys lie Pro Asft Ala Sly Gin Met 20 2j 30: (Sin. Pro Val Lys Ala Phe Ays lie His Asn· Ays lie Trp Val lie Pro .35 40; 45

Glti Arg Asp Thr Phé Thr Asn Pro <3l:U Glu Gly Asp Lèú Asn Pro Pro d0 55 SO

Pro Glu Ala Lys Gin Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu 65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu 85 90 95

Phe Glu Arg lie Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser 100 105 110 lie Val Arg Gly lie Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr lie Asp Thr Glu 115 120 125

Leu Lys Val lie Asp Thr Asn Cys lie Asn Val lie Gin Pro Asp Gly 130 135 140

Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Vai lie lie Gly Pro Ser Ala 145 150 155 160

Asp lie Ile Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Vai Leu Asn 165 170 175

Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr Ile Arg Phe Ser Pro 180 185 190

Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Vai Asp Thr Asn Pro 195 200 205

Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Vai Thr Leu Ala 210 215 220

His Glu Leu lie His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn 225 230 235 240

Pro Asn Arg Vai Phe Lys Vai Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 245 250 255

Gly Leu Glu Vai Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 260 265 270

Ala Lys Phe Ile Asp Ser Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr 275 280 285

Tyr Asn Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser 290 295 300

Ile Vai Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Vai Phe Lys 305 310 315 320

Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser (Gly Lys Bh.e ier Vai Asp. 325 330 335

Lys Léu Lys Phe Asp .Lys Léu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr 340 345 350

Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr 355 360 365

Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys lie Asn lie Val Pro Lys Val 370 375 380

Asn Tyr Thr lie Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 385 390 395 400

Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu lie Asn Asn Met Asn Phe Thr 405 410 415

Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 420 425 430

Val Asp Gly lie lie Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu lie Glu Gly Arg 435 440 445

Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Arg Lys Asn 450 455 460

Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480

Gly Gly Ser Ala Leu Val Leu Gin Cys lie Lys Val Asn Asn Trp Asp 485 490 495

Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys 500 505 510

Gly Glu Glu lie Thr Ser Asp Thr Asn lie Glu Ala Ala Glu Glu Asn 515 520 525 lie Ser Leu Asp lieu lie Gin Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe. Asn Phe Asp 530 535 .530

Asn Glu P«o GLu Asn lie Set Tie· Glu Asa Leu Ser Set Asp lie lie 545 550 555 560

Gly Gin Leu Glu Leu Met Pro: Asn lie Glu Arg Phe: Pro A.sn Gly Lys :565 57 0 575 lys Tyr' Gin Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gin 580 585 590

Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg lie Ala Leu Thr Asn Ser Val Asa 595 600 605

Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser .Arg Val Tyr Tip Phe Phe Ser Ser Asp 610 615 62 0

Tyr Val Lys Lys: Val Asn Lys: Ala Thr Glu Ala Ala. Met Phe Leu Gly 625 630 635: 630

Tpp Val Glu Gin Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu. Thr Ser Glu Val 645 650 655

Ser Thr Thr Asp Lys lie Ala Asp. lie Thr Tie Tie lie Pro Tyr Tie 660. 66:5 670:

Gly Pro Ala Leu .Asa lie Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe· Val 675 680 685

Gly Ala Leu Tie Phe Ser Gly· Ala Val lie Leu Leu Glu Phe Tie Pro SS0 695 7Q0

Glu Lie Ala Tie Pro Val Leu Gly Thr Phe Al* Leu Val Ser Tyr lie 705 710 715 720

Ala Ash Lys Val Leu Thr Val Gin Thr Tie Asp ,Asn Ala Leu Ser Lys 725 7.30 7.35

Arg Asn Glu Lys Trp. Asp Glu Val Tyr: Lys Tyr lie Val Thr Asn Trp 74 0: 7:45 /50

Leu Ala Lys Val Asn Thr Gin lie Asp Leu lie Arg Lys Lys Met Lys 755 760 765

Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala Glu Ala Thr Lys Ala lie lie Asn Tyr 770 775 780

Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn lie Asn Phe Asn 785 790 795 800 lie Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser lie Asn Lys Ala Met 805 810 815 lie Asn lie Asn Lys Phe Leu Asn Gin Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met 820 825 830

Asn Ser Met lie Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala 835 840 845

Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr lie Tyr Asp Asn Arg Gly Thr 850 _ 855 860

Leu lie Gly Gin Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu 865 870 875 880

Ser Thr Asp lie Pro Phe Gin Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gin Arg 885 890 895

Leu Leu Ser Thr Leu Asp 900

<210> 27 <211> 2691 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 27 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcggcg 1380 ctagcgggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcggcg gtggcggtag cgcactagtg 1440 ctgcagtgta tcaaggttaa caactgggat ttattcttca gcccgagtga agacaacttc 1500 accaacgacc tgaacaaagg tgaagaaatc acctcagata ctaacatcga agcagccgaa 1560 gaaaacatct cgctggacct gatccagcag tactacctga cctttaattt cgacaacgag 1620 ccggaaaaca tttctatcga aaacctgagc tctgatatca tcggccagct ggaactgatg 1680 ccgaacatcg aacgtttccc aaacggtaaa aagtacgagc tggacaaata taccatgttc 1740 cactacctgc gcgcgcagga atttgaacac ggcaaatccc gtatcgcact gactaactcc 1800 gttaacgaag ctctgctcaa cccgtcccgt gtatacacct tcttctctag cgactacgtg 1860 aaaaaggtca acaaagcgac tgaagctgca atgttcttgg gttgggttga acagcttgtt 1920 tatgatttta ccgacgagac gtccgaagta tctactaccg acaaaattgc ggatatcact 1980 atcatcatcc cgtacatcgg tccggctctg aacattggca acatgctgta caaagacgac 2040 ttcgttggcg cactgatctt ctccggtgcg gtgatcctgc tggagttcat cccggaaatc 2100 gccatcccgg tactgggcac ctttgctctg gtttcttaca ttgcaaacaa ggttctgact 2160 gtacaaacca tcgacaacgc gctgagcaaa cgtaacgaaa aatgggatga agtttacaaa 2220 tatatcgtga ccaactggct ggctaaggtt aatactcaga tcgacctcat ccgcaaaaaa 2280 atgaaagaag cactggaaaa ccaggcggaa gctaccaagg caatcattaa ctaccagtac 2340 aaccagtaca ccgaggaaga aaaaaacaac atcaacttca acatcgacga tctgtcctct 2400 aaactgaacg aatccatcaa caaagctatg atcaacatca acaagttcct gaaccagtgc 2460 tctgtaagct atctgatgaa ctccatgatc ccgtacggtg ttaaacgtct ggaggacttc 2520 gatgcgtctc tgaaagacgc cctgctgaaa tacatttacg acaaccgtgg cactctgatc 2580 ggtcaggttg atcgtctgaa ggacaaagtg aacaatacct tatcgaccga catccctttt 2640 cagctcagta aatatgtcga taaccaacgc cttttgtcca ctctagacta g 2691

<210> 28 <211> 896 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 28

Gly Ser Met Glu Phe Val Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val 15 10 15

Asn Gly Val Asp lie Ala Tyr lie Lys lie Pro Asn Ala Gly Gin Met 20 25 30

Gin Pro Val Lys Ala Phe Lys lie His Asn Lys lie Trp Val lie Pro 35 40 45

Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro 50 55 60

Pro Glu Ala Lys Gin Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu 65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu 85 90 95

Phe Glu Arg lie Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser 100 105 110 lie Val Arg Gly lie Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr lie Asp Thr Glu 115 120 125

Leu Lys Val lie Asp Thr Asn Cys lie Asn Val lie Gin Pro Asp Gly 130 135 140

Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val lie lie Gly Pro Ser Ala 145 150 155 160

Asp lie lie Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn 165 170 175

Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr lie Arg Phe Ser Pro 180 185 190

Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro 195 200 205

Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala 210 215 220

His Glu Leu lie His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly lie Ala lie Asn 225 230 235 240

Pro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 245 250 255

Gly Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 260 265 270

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Tyr Asn Lys Phe Lys Asp lie Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser 290 295 300 lie Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys 305 310 315 320

Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp 325 330 335

Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu lie Tyr Thr 340 345 350

Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr 355 360 365

Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys lie Asn lie Val Pro Lys Val 370 375 380

Asn Tyr Thr lie Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 385 390 395 400

Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu lie Asn Asn Met Asn Phe Thr 405 410 415

Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 420 425 430

Val Asp Gly lie lie Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu lie Glu Gly Arg 435 440 445

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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Val 465 470 475 480

Leu Gin Cys lie Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser 485 490 495

Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu lie Thr Ser 500 505 510

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Ser lie Glu Asn Leu Ser Ser Asp lie Ile Gly Glh Leu Glu Leu Met, 545 550 555 560 Píf& Asn lie Glu Ar# She, Ero Asn Gly Lys Lys^ Tyr Glu Leu Asp; Lys, 565 57 0 515

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Ser Arg Ire Alá Leu Thr Asn Ser Vai A$fi Glu^ Ala. Leu Leu Asia Pre 1 595 500 605

Ser Arg Val Tyr Thr She She- Ser Ser Asp Tyr Vial Lys Lys Vai .Asn.. 610 515 620

Lys Ala Th:r Glu Ala Ala Met she Leu Gly Trp Vai Glu Gin Leu Vai 625 630 635 640

Tyr Asp She Thr Asp Glu Thr Ser Glu Vai Ser Thr Thr Asp Lys: lie: 645 650; 655

Ala Asp lie Thr lie lie Lie: Erò Tyr 1,1# Gly Pr# Ala Leu Asn lie 660 665 670

Gly Ash Met Leu Tyr Lya: Asp Asp She Vai Gly Ala, Leu lie She Ser 675 680 685

Gly Ala Vai lie teu Leu Glu She lie Em Glu Ile Alá lie Sro Vál 690 695 700

Leu Gly Thr She Ala Leu Va I Sex Tyr He Ala Asa Lys Val. Leu Thr

7 05 7 ID! 715 72 Q

Val Gin Thr He Asp Asp; Ala Leu Ser Byis Ar# Ash Glu ays Trp Asp 126 ISO 735

Glu Val Tyr Lys Tyr Tie: val Thr Asa Trp Leu Ala Lys Val Asa Thr 740 745 750

Gin lie Asp Leu. lie Arg. Lys Lys Met Lys: Glu, Ala Leu Glu Asn Glh 755 710 765

Ala Glu Ala Thr Lys Ala lie lie Asn Tyr Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr 770 775 780

Glu Glu Glu Lys Asn Asn lie Asn Phe Asn lie Asp Asp Leu Ser Ser 785 790 795 800

Lys Leu Asn Glu Ser lie Asn Lys Ala Met lie Asn lie Asn Lys Phe 805 810 815

Leu Asn Gin Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met lie Pro Tyr 820 825 830

Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu 835 840 845

Leu Lys Tyr lie Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu lie Gly Gin Val Asp 850 855 860

Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp lie Pro Phe 865 870 875 880

Gin Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser Thr Leu Asp 885 890 895

<210> 29 <211> 2691 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 29 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgaGtc caectacctg 240 tetaccgata aegaasagga caaetacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 3ÔÓ feagfcggagGg a©cit;ggggg:g: feàtgfetogtg^g aGiaggatiGg tijGgGggGat:; ©cegttgtgg 360 ggcggttcta eGat-Ggata© Ggâaetgaaá gtaatcgaca ctaa.ctgGãt eaacgttat.t 4-20 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atatgcggcg 1380 ctagcgggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcggcg gtggcggtag cgcactagtg 1440 ctgcagtgta tcaaggttaa caactgggat ttattcttca gcccgagtga agacaacttc 1500 accaacgacc tgaacaaagg tgaagaaatc acctcagata ctaacatcga agcagccgaa 1560 gaaaacatct cgctggacct gatccagcag tactacctga cctttaattt cgacaacgag 1620 ccggaaaaca tttctatcga aaacctgagc tctgatatca tcggccagct ggaactgatg 1680 ccgaacatcg aacgtttccc aaacggtaaa aagtacgagc tggacaaata taccatgttc 1740 cactacctgc gcgcgcagga atttgaacac ggcaaatccc gtatcgcact gactaactcc 1800 gttaacgaag ctctgctcaa cccgtcccgt gtatacacct tcttctctag cgactacgtg 1860 aaaaaggtca acaaagcgac tgaagctgca atgttcttgg gttgggttga acagcttgtt 1920 tatgatttta ccgacgagac gtccgaagta tctactaccg acaaaattgc ggatatcact 1980 atcatcatcc cgtacatcgg tccggctctg aacattggca acatgctgta caaagacgac 2040 ttcgttggcg cactgatctt ctccggtgcg gtgatcctgc tggagttcat cccggaaatc 2100 gccatcccgg tactgggcac ctttgctctg gtttcttaca ttgcaaacaa ggttctgact 2160 gtacaaacca tcgacaacgc gctgagcaaa cgtaacgaaa aatgggatga agtttacaaa 2220 tatatcgtga ccaactggct ggctaaggtt aatactcaga tcgacctcat ccgcaaaaaa 2280 atgaaagaag cactggaaaa ccaggcggaa gctaccaagg caatcattaa ctaccagtac 2340 aaccagtaca ccgaggaaga aaaaaacaac atcaacttca acatcgacga tctgtcctct 2400 aaactgaacg aatccatcaa caaagctatg atcaacatca acaagttcct gaaccagtgc 2460 tctgtaagct atctgatgaa ctccatgatc ccgtacggtg ttaaacgtct ggaggacttc 2520 gatgcgtctc tgaaagacgc cctgctgaaa tacatttacg acaaccgtgg cactctgatc 2580 ggtcaggttg atcgtctgaa ggacaaagtg aacaatacct tatcgaccga catccctttt 2640 cagctcagta aatatgtcga taaccaacgc cttttgtcca ctctagacta g 2691

<210> 30 <211> 896 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 30

Gly Ser Met Glu Phe Val Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val 15 10 15

Asn Gly Val Asp lie Ala Tyr lie Lys lie Pro Asn Ala Gly Gin Met 20 25 30

Gin Pro Val Lys Ala Phe Lys lie His Asn Lys lie Trp Val lie Pro 35 40 45

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Leu Lys Val lie Asp Thr Asn Cys lie Asn Val lie Gin Pro Asp Gly 130 135 140

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Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala 210 215 220

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Leu Gin Cys lie Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser 485 490 495

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Gin Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn lie 530 535 540

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Lys Leu Asn Glu Ser lie Asn Lys Ala Met lie Asn lie Asn Lys Phe 805 810 815

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Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu 835 840 845

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Gin Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser Thr Leu Asp 885 890 895

<210> 31 <211> 2691 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 31 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcats© agttsgagtg taagagettt ggtGasgaag ttstgaaset sassegtaac ,540 ggctacggtt ceaetsagta satcsgtttc tctcsggact teaGsttcgg ttttgaagaa 6Θ0 tccetggaaf tagacasgaa sscaotg ctg ggcgstgffôa aaftsggaae tgatèetgef .6f0 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcatatgcg 1380 ctagcgggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcggcg gtggcggtag cgcactagtg 1440 ctgcagtgta tcaaggttaa caactgggat ttattcttca gcccgagtga agacaacttc 1500 accaacgacc tgaacaaagg tgaagaaatc acctcagata ctaacatcga agcagccgaa 1560 gaaaacatct cgctggacct gatccagcag tactacctga cctttaattt cgacaacgag 1620 ccggaaaaca tttctatcga aaacctgagc tctgatatca tcggccagct ggaactgatg 1680 ccgaacatcg aacgtttccc aaacggtaaa aagtacgagc tggacaaata taccatgttc 1740 cactacctgc gcgcgcagga atttgaacac ggcaaatccc gtatcgcact gactaactcc 1800 gttaacgaag ctctgctcaa cccgtcccgt gtatacacct tcttctctag cgactacgtg 1860 aaaaaggtca acaaagcgac tgaagctgca atgttcttgg gttgggttga acagcttgtt 1920 tatgatttta ccgacgagac gtccgaagta tctactaccg acaaaattgc ggatatcact 1980 atcatcatcc cgtacatcgg tccggctctg aacattggca acatgctgta caaagacgac 2040 ttcgttggcg cactgatctt ctccggtgcg gtgatcctgc tggagttcat cccggaaatc 2100 gccatcccgg tactgggcac ctttgctctg gtttcttaca ttgcaaacaa ggttctgact 2160 gtacaaacca tcgacaacgc gctgagcaaa cgtaacgaaa aatgggatga agtttacaaa 2220 tatatcgtga ccaactggct ggctaaggtt aatactcaga tcgacctcat ccgcaaaaaa 2280 atgaaagaag cactggaaaa ccaggcggaa gctaccaagg caatcattaa ctaccagtac 2340 aaccagtaca ccgaggaaga aaaaaacaac atcaacttca acatcgacga tctgtcctct 2400 aaaetgasW aateea:tcaa tfã&agffitatg atcaaeatea aqaagfctcct gaaooagtge 24 60; cctgtaaigt atetgatgaa eteeatgatG ccgtaeggtg ttaaacgtct ggaggacttc 2420 gatgegtcts tgaaagaogc cctgctgaaa taQatttaeg aeaaccgtgg cactctgatc 2580. ggtcaggttg afccgtçtgaa ggaeaaagfcg aacaatacct tatcgaccga cateèetttt 2640 cagctcagta aatatgfccga taaccaacgc cttttgtcca ctctagacta g 2691

<210> 32 <211> 896 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 32

Gly Ser Met Glu Phe Vai Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Vai 15 10 15

Asn Gly Vai Asp lie Ala Tyr lie Lys lie Pro Asn Ala Gly Gin Met 20 25 30

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Gin Leu Ser Lys Tyr Vai Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser Thr Leu Asp 885 890 895

<210> 33 <211> 2709 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 33

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<210> 34 <211> 902 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 34

Gly Ser Met Glu Phe Vai Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val 15 10 15

Asn Gly Val Asp lie Ala Tyr lie Lys lie Pro Asn Ala Gly Gin Met 20 25 30

Gin Pro Val Lys Ala Phe Lys lie His Asn Lys lie Trp Val lie Pro 35 40 45

Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro 50 55 60

Pro Glu Ala Lys Gin Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu 65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu 85 90 95

Phe Glu Arg lie Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser 100 105 110 lie Val Arg Gly lie Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr lie Asp Thr Glu 115 120 125

Leu Lys Val lie Asp Thr Asn Cys lie Asn Val lie Gin Pro Asp Gly 130 135 140

Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val lie lie Gly Pro Ser Ala 145 150 155 160

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Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu He Tyr Thr 340 34,5 350

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Gly Pro Ala Leu Asn lie Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val 675 680 685

Gly Ala Leu lie Phe Ser Gly Ala Val lie Leu Leu Glu Phe lie Pro 690 695 700

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Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gin Thr lie Asp Asn Ala Leu Ser Lys 725 730 735

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Leu Ala Lys Val Asn Thr Gin lie Asp Leu lie Arg Lys Lys Met Lys 755 760 765

Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala Glu Ala Thr Lys Ala lie lie Asn Tyr 770 775 780

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Asn Ser Met lie Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala 835 840 845

Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr lie Tyr Asp Asn Arg Gly Thr 850 855 860

Leu Ile Gly Gin Vai Asp Arg Leu Lys Asp Lys Vai Asn Asn Thr Leu 865 870 875 880

Ser Thr Asp lie Pro Phe Gin Leu Ser Lys Tyr Vai Asp Asn Gin Arg 885 890 895

Leu Leu Ser Thr Leu Asp 900

<210> 35 <211> 2697 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 35 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggeggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacqgtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc Igctcagcga agacaeci# ggcaaattct ctgtagacaa fttgaaatte 10:20 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 10:80 aaagGlGfcga accgcaaaaâ: GtatGtgaac: ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacate 1140 gtgccgaaag tfcaaetaGao tatGtaogat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 12:00 gctaatttta. acggeGagaa. ea:eggaaat:e: aaeaaGatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttGa.efcggfee: fegtfeegaffct tteacaagelg' acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaagcgctag cgggcggtgg cggtagcggc ggtggcggta gcggcggtgg cggtagcgca 1440 fetagtgctgc: agtgtatcaa. ggttaacaaé: tgggatttat tcttcagcGc: gagtgaagac 15:00 aacttcacm acgâcctgiaa caaaggtgaa gaaatcacct cagatactaa catcgaagca 1560 gcggaagaaa aGatetcgct ggacctgatc cagcagtact acctgacctt taatttcgac 1620 aacgagccgg aaaacatttc tatcgaaaac ctgagctctg atateatcgg cgagetggaa 168:0 ctgatgccga acatcgaacg tttcccaaac ggtaaaaagt acgagctgga GaaatálíáGe: 1740 atgttccact acctgcgcgc gcaggaattt gaacacggca aatcccgtat GgGactgagt 1800 aaGtcegtta aGgaagctGt getGaaGOGg tccGgtgfcat aeaectkctt etctagcgac 1860 tacgtgaaaa aggtcaacaa agcgactgaa gGtgeaãtgt tGttgggttf ggttgaaeag 1920: cttgtttatg atlttaGcga ggagacgteG gaagtatc.ta etaccgacaa aatfcgcggat 1980 atcaetatca tcatcGsgta eatcggtceg gctctgaaca ttggcaacal gotgtacaaa 2040 gangaGfcteg ttggcgcacfc gatcttctcc ggtgcggtga tcctgctgga gttcatcccg 21:00 gaaatcgcca tcccggtael gggcaccttt gctctggttt cttacattgc aaacaaggtt 2:160

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<210> 37 <211> 51 <212> ADN <223> Sintética <400> 37 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gegcgtaãat tâgctaacca g 51

<210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 38

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<210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 40

Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala 15 10

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Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Tyr Ala 15 10

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Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Tyr 15 10 <210> 45 <211> 51

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Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Tyr Ala Asn 1 5 10 15

Gin

<210> 47 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 47 tttggcgqtt tcacgggcgc acgcaaatea. gcgeqtaaa 39

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Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Arg Lys Asn 15 10 15

Gin

<210> 51 <211> 2736 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 51 ctcgggattg agggtcgttt tggcggtttc acgggcgcac gcaaatcagc gcgtaaatta 60 gctaaccaga ctagtggcgg tgggggtagt ggcggtggcg gttcgggcgg gggtgggagc 120 cctaggggat ccatggagtt cgttaacaaa cagttcaact ataaagaccc agttaacggt 180 gttgacattg cttacatcaa aatcccgaac gctggccaga tgcagccggt aaaggcattc 240 aaaatccaca acaaaatctg ggttatcccg gaacgtgata cctttactaa cccggaagaa 300 ggtgacctga acccgccacc ggaagcgaaa caggtgccgg tatcttacta tgactccacc 360 tacctgtcta ccgataacga aaaggacaac tacctgaaag gtgttactaa actgttcgag 420 cgtatttact ccaccgacct gggccgtatg ctgctgacta gcatcgttcg cggtatcccg 480 ttctggggcg gttctaccat cgataccgaa ctgaaagtaa tcgacactaa ctgcatcaac 540 gttattcagc cggacggttc ctatcgttcc gaagaactga acctggtgat catcggcccg 600 tctgctgata tcatccagtt cgagtgtaag agctttggtc acgaagttct gaacctcacc 660 cgtaacggct acggttccac tcagtacatc cgtttctctc cggacttcac cttcggtttt 720 gaagaatccc tggaagtaga cacgaaccca ctgctgggcg ctggtaaatt cgcaactgat 780 cctgcggtta ccctggctca cgaactgatt catgcaggcc accgcctgta cggtatcgcc 840 atcaatccga accgtgtctt caaagttaac accaacgcgt attacgagat gtccggtctg 900 gaagttagct tcgaagaact gcgtactttt ggcggtcacg acgctaaatt catcgactct 960 ctgcaagaaa acgagttccg tctgtactac tataacaagt tcaaagatat cgcatccacc 1020 ctgaacaaag cgaaatccat cgtgggtacc actgcttctc tccagtacat gaagaacgtt 1080 tttaaagaaa aatacctgct cagcgaagac acctccggca aattctctgt agacaagttg 1140 aaattcgata aactttacaa aatgctgact gaaatttaca ccgaagacaa cttcgttaag 1200 ttctttaaag ttctgaaccg caaaacctat ctgaacttcg acaaggcagt attcaaaatc 1260 aacatcgtgc cgaaagttaa ctacactatc tacgatggtt tcaacctgcg taacaccaac 1320 ctggctgcta attttaacgg ccagaacacg gaaatcaaca acatgaactt cacaaaactg 1380 aaaaacttca ctggtctgtt cgagttttac aagctgctgt gcgtcgacgg catcattacc 1440 tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga aacaaagcgc tgaacctgca gtgtatcaag 1500 gttaacaact gggatttatt cttcagcccg agtgaagaca acttcaccaa cgacctgaac 1560 aaaggtgaag aaatcacctc agatactaac atcgaagcag ccgaagaaaa catctcgctg 1620 gacctgatcc agcagtacta cctgaccttt aatttcgaca acgagccgga aaacatttct 1680 atcgaaaacc tgagctctga tatcatcggc cagctggaac tgatgccgaa catcgaacgt 1740 ttcccaaacg gtaaaaagta cgagctggac aaatatacca tgttccacta cctgcgcgcg 1800 caggaatttg aacacggcaa atcccgtatc gcactgacta actccgttaa cgaagctctg 1860 ctcaacccgt cccgtgtata caccttcttc tctagcgact acgtgaaaaa ggtcaacaaa 1920 gcgactgaag ctgcaatgtt cttgggttgg gttgaacagc ttgtttatga ttttaccgac 1980 gagacgtccg aagtatctac taccgacaaa attgcggata tcactatcat catcccgtac 2040 atcggtccgg ctctgaacat tggcaacatg ctgtacaaag acgacttcgt tggcgcactg 2100 atcttctccg ;gtgéggtg§t cctgctggag ttSstgçegg aaategeeat ceeggfcactg :216:0 ggcacctttg ctctggtttc ttacattgca aacaaggttc tgactgtaca aaccatcgae 2220 aacgcgctga gcaaacgtaa cgaaaaatgg gatgaagttt acasatatat egigaccaac: 22 80 tggctggcta aggttaatae tcagatcgac; ctcatccgca aaaaaatgaa agaagcactg 2340: gaaaaccagg cggaagctac ©aaggeaatc attaactacc agtacaacca gtacaccgag 2400 faagaaaáàá afôaaéafcòàa etteaâc&t® gàggafcôtgt cctctaaact gãaegâatce 2460' atcaacaaag ctatgatcaa eãtcaacaag ttcctgaacc .agtgct.ctgt aagctafcctg 2520 atgaactcca tgatcccgta eggtgttâaa cgtctggagg acttogatgc gteteitgaaa. 2580 gacgcGct-ga tgaaatacat tiacgaeaac sgtggeaeto tgaLcggtca ggtlgafc©gt 2640 ctgaaggaca aagtgaacaa fcaecttatcg accgacatcc cttttcagct cagtaaatat 2700 gtcgataacc aacgcctttt gtccactcta gactag 2736

<210> 52 <211> 911 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 52

Leu Gly XI© Glu Gly Arg ;Bhe Gly Gly l%e Thi Cly Ala Arg Lys Ser: 1 5 ’ 10 15

Ala Arg Lys Leu Ala Asa Gin Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20: 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg GÍy Ser Mec Glu lhe Vai 35 40 45

Asn Lys Gl« Ifee Asa, !yr Lys Asp: Ire W Asa Gly Vai Asp Ile Ala 50 55 60

Tyr lie Lys lie Pro Asn Ala Gly Gin Met Gin Pro Val Lys Ala Phe 65 70 75 80

Lys lie His Asn Lys lie Trp Val He Pro Glu Arg Asp Thr Phe Thr 85 90 95

Asn Pro' Glu Glu Sly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu Ala Lys Gin Val 100 105 110

Pro Val Sex Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr Asp Asn Glu Lys 115 120 125

Asp Asa Tyr Lett Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu Arg lie Tyr .Ser 1.3 Q: 115 140

Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser He Val, Arg Gly Ho Pro

1.45' 150 155 HO

Phe Trp Gly Gly Ser Thr lie Asp: Thr Glu Leu Lys Val lie Asp Thr 165 170 175 .Asn Gys lie Asn Val He Gin Pro. Asp Gly Ser Tyr Arg Ser Glu Glu ISO: 185 190

Leu Asn Leu Val lie lie Gly Pro Ser Ala Asp He Tie Gin Phe Glu 195 .200 205

Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr Arg Asn Gly Tyr 210 215 220

Gly Ser Thr Gin Tyr He Arg Phe Ser Pro Asp Phe Thr Phe Gly Phe 225 230 235 240

Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu Gly Ala Gly Lys 245 250 255

Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu Leu lie His Ala 260 265 270

Gly His Arg Leu Tyr Gly lie Ala lie Asn Pro Asn Arg Val Phe Lys 275 280 285

Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu Glu Val Ser Phe 290 295 300

Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys Phe lie Asp Ser 305 310 315 320

Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn Lys Phe Lys Asp

MS :3 3:0: MS lie ala Set Thr Leu .Asn Lys Ala Lys Ser lie Val. Gly Thr Thr Ala 340 345 350

Ger Leu. Gin Tyr let Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys Tyr Leu Leu let 355 360 365

Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys: Leu Lys Phe Asp Lys: 370 375 380

Leu Tyr "Lys Met Leu. Thr Glu lie. Tyr Thr Glu Asp Asn Phe Val Lys ,385 3:90: 395 400 .Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn Phe Asp Lys Ala. 405 410 415

Val Phe Lys He Asn lie Val Pro Lys Val Asn Tyr Thr He Tyr Asp 420 425 430

Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn Phe Asn Gly Gin 435 440 445

Asn Thr Glu He Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu Lys Asn Phe Thr 450 455 460

Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Asp Gly He He Thr 465 470 475 480

Ser Lys Thr Lys Ser Leu lie Glu Gly Arg Asn Lys Ala Leu Asn Leu 485 490 495

Gin Cys lie Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu 500 505 510

Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu lie Thr Ser Asp 515 520 525

Thr Asn He Glu Ala Ala Glu . Glu Asn He Ser Leu Asp Leu lie Gin 530 535 540

Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe: .Asp: Asn Glu Pro Glu Ash lie Ser 545: 550 555 560

He Glu, Asn Leu Ser Ser Asp Tie He Gly Gin Leu Glu Leu Met Pro 565 57Çt 575

Ash lie Glu Arg Phe Pro Ash Gly Lys LyS Tyr Glu Leu As;p Lys Tyr 580 585 590

Thr Met Phe Mis Tyr Leu Arg Ala Gin Glu Phe: Glu Mis Gly Lys Ser 555: §0:0 605

Arg lie Ala Leu Thr Asn 5er ?al Asn Glu Ala Leu Leu Ash Lro Ser 610 615 620

Arg Val Tyr Thr' Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys Lys Val Ash Lys 625 630 635 640

Ala Thr Glu Ala Ala Met ®he Leu Sly Trp Val Glu Gin Leu Val Tyr 6.:45 65 Õ 655

Asp Phe: Thr Asp Glu. Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr As:p Lys lie AÍA 660 665 670

Asp He Thr lie He He Pro Tyr He Gly Pro Ala Leu Asn He Gly 675 680 685

Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu He Phe Ser Gly 690 695 700

Ala Val He Leu Leu Glu Phe He Pro Glu He Ala He Pro Val Leu 705 710 715 720

Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr He Ala Asn Lys Val Leu Thr Val 725 730 735

Gin Thr He Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu 740 745 750

Val Tyr Lys Tyr He Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gin 755 760 765

He Asp Leu He Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala 770 775 780

Glu Ala Thr Lys Ala. lie lie Asn Tyr Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu 78.5: 7 SO 7 95 800

Glu GlU Lys Asn Asn T'ie Asn Phé Asn lie As:p; Asp. Leu Ser Ser Lys: 805 810 815;

Leu Asn Glu Ser Tl©: Asn Lys: .Ala Met lie Asn lie Asn. lys Phe Leu 815 830

Asn Gin Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met lie Pro Tyr Gly 835 840 845

Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu 850 855 860

Lys Tyr He Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu He Gly Gin Val Asp Arg 865 870 875 880

Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp lie Pro Phe Gin 885 890 895

Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser Thr Leu Asp 900 905 910

<210> 53 <211> 177 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 53 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat tagctaacca ggcgctagcg 120 ggtggtggtg gttctgcact agtgctgcag acgcacggtc tagaatgata aaagctt 177

<210> 54 <211> 192 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 54 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat tagctaacca ggcgctagcg 120 ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct gcactagtgc tgcagacgca cggtctagaa 180 tgataaaagc tt 192

<210> 55 <211> 222 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 55 ggatqcacge acgtcgacgg eatcattace: tcGãaaacta aatctetgat. agaaggtaga 60 tttggeggtt tcacgggGgq acgqaaatca gcgqgtaaat tagctaacca ggcgctagcg 120 ggtggtggtf gtfcctggtgg trggtggttct ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct 100 gcaqfagtgg tgqagaqgqa gggtcfágâa tgatááaagc ft 222

<210> 56 <211> 237 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 56 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat tagctaacca ggcgctagcg 120 ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct 180 ggtggtggtg gttctgcact agtgctgcag acgcacggtc tagaatgata aaagctt 237 <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 57 <211> 228 <212> ADN <223> Sintética <400> 57 ggatecagg© acgfccgaegg oafccattasc tccaaaacta aafccfcctgat agaaggtaga 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaat tagctaacca ggcgctagcg 120 gctgaagctg ctgctaaaga agctgctgct aaagaagctg ctgctaaagc tggtggcggt 180 ggttccgcac tagtgctgca gacgcacggt ctagaatgat aaaagctt 228

<210> 58 <211> 2694 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 58 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaattagcta accaggcgct agcgggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctgcacta 1440 gtgctgcagt gtatcaaggt taacaactgg gatttattct tcagcccgag tgaagacaac 1500 ttcaccaacg acctgaacaa aggtgaagaa atcacctcag atactaacat cgaagcagcc 1560 gaagaaaaca tctcgctgga cctgatccag cagtactacc tgacctttaa tttcgacaac 1620 gagccggaaa acatttctat cgaaaacctg agctctgata tcatcggcca gctggaactg 1680 atgccgaaca tcgaacgttt cccaaacggt aaaaagtacg agctggacaa atataccatg 1740 ttccactacc tgcgcgcgca ggaatttgaa cacggcaaat cccgtatcgc actgactaac 1800 tccgttaacg aagctctgct caacccgtcc cgtgtataca ccttcttctc tagcgactac 1860 gtgaaaaagg tcaacaaagc gactgaagct gcaatgttct tgggttgggt tgaacagctt 1920 gtttatgatt ttaccgacga gacgtccgaa gtatctacta ccgacaaaat tgcggatatc 1980 actatcatca tcccgtacat cggtccggct ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac 2040 gacttcgttg gcgcactgat cttctccggt gcggtgatcc tgctggagtt catcccggaa 2100 atcgccatcc cggtactggg cacctttgct ctggtttctt acattgcaaa caaggttctg 2160 actgtacaaa ccatcgacaa cgcgctgagc aaacgtaacg aaaaatggga tgaagtttac 2220 aaatatatcg tgaccaactg gctggctaag gttaatactc agatcgacct catccgcaaa 2280 aaaatgaaag aagcactgga aaaccaggcg gaagctacca aggcaatcat taactaccag 2340 tacaaccagt acaccgagga agaaaaaaac aacatcaact tcaacatcga cgatctgtcc 2400 tctaaactga acgaatccat caacaaagct atgatcaaca tcaacaagtt cctgaaccag 2460 tgctctgtaa gctatctgat gaactccatg atcccgtacg gtgttaaacg tctggaggac 2520 ttcgatgcgt ctctgaaaga cgccctgctg aaatacattt acgacaaccg tggcactctg 2580 atcggtcagg ttgatcgtct gaaggacaaa gtgaacaata ccttatcgac cgacatccct 2640 tttcagctca gtaaatatgt cgataaccaa cgccttttgt ccactctaga ctag 2694

<210> 59 <211> 897 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 59

Gly Ser Met Glu Phe Val Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val 15 10 15

Asn Gly Val Asp lie Ala Tyr lie Lys lie Pro Asn Ala Gly Gin Met 20 25 30

Gin Pro Val Lys Ala Phe Lys lie His Asn Lys lie Trp Val lie Pro 35 40 45

Glu Arp Asp. Thr Phe Th r Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Proi Pro 50: 55 60

Pro Glu Ala Lys Gin Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu 65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu 85 90 95

Phe Glu Arg lie Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser 100 105 110 lie Val Arg Gly lie Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr lie Asp Thr Glu 115 120 125

Leu Lys Val lie Asp Thr Asn Cys lie Asn Val lie Gin Pro Asp Gly 130 135 140

Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val lie lie Gly Pro Ser Ala 145 150 155 160

Asp lie lie Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn 165 170 175

Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr lie Arg Phe Ser Pro 180 185 190

Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro 195 200 205

Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala 210 215 220

His Glu Leu lie His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly lie Ala lie Asn 225 230 235 240

Pro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 245 250 255

Gly Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 260 265 270

Ala Lys Phe lie Asp Ser Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr 275 280 285

Tyr Asn Lys Phe Lys Asp lie Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser 290 295 300 lie Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys 305 310 315 320

Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp 325 330 335

Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu lie Tyr Thr 340 345 350

Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr 355 360 365

Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys lie Asn lie Val Pro Lys Val 370 375 380

Asn Tyr Thr lie Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 385 390 395 400

Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu lie Asn Asn Met Asn Phe Thr 405 410 415

Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 420 425 430

Val Asp Gly lie He Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu lie Glu Gly Arg 435 440 445

Ph© Gly Gly Phe Thr Gly Ala· Arg Lys: Ser Ala. Arg Lys leu. Ala Asa, 450 455 460

Gin Ala Leu Ala Gly .Gly Gly Gly Ser Gly Gly: Gly Glv Ser Ala Lett 46.5 410: 47 § 400 vai Lett Gin Çys IIe LygTval Asn Asn Trp Asp Leu Lhe Phe Ser Pro 485 490 495

Ser Glu Asp Asa. Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly G1 u Glu He Thr 500 5 05: 510

Ser Asp Thr Asa Ile Glu Ala Ala Glu Glu: Asn. He Ser Leu Asp Leu 515 520: SM

Ile Gin Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn 530 535 540

He Ser Ile Glu Asn Leu Ser' Ser Asp Ile: Ile Gly Gin Leu Glu Leu 545 550: 555 560 .Met Pro Asn Ile Glu Arg Phé Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Gltt Lett Asp 565 570 575

Lys Tyr: Thr Met Phe Mis: Tyr Leu Arg Ala. Gin. Glu Phe Glu ais Gly 58 0 5 8c 590

Lys Ser Arg He Ala Lett. Thr Asn Ser Vai ASA Glu Alá Leu Lett Asa 595. 60:0: 605

Pro Ser: Arg Vai Tyr Thr Phe Ph© Ser Ser Asp Tyr Vai Lys Lys Vai 610 615 620

Asn Lys: Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Vai Glu Gin Leu 625 630: 635 640

Vai Tyr. Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Sltt Vai Ser Thr Thr A:Sp Lys 645 650 655

He Ala Asp Π© Thr lie lie lie Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu. Asn 660 665 670 lie Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu lie Phe 675 680 685

Ser Gly Ala Val lie Leu Leu Glu Phe lie Pro Glu lie Ala lie Pro 690 695 700

Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr lie Ala Asn Lys Val Leu 705 710 715 720

Thr Val Gin Thr lie Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp 725 730 735

Asp Glu Val Tyr Lys Tyr lie Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn 740 745 750

Thr Gin lie Asp Leu lie Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn 755 760 765

Gin Ala Glu Ala Thr Lys Ala lie lie Asn Tyr Gin Tyr Asn Gin Tyr 770 775 780

Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn lie Asn Phe Asn lie Asp Asp Leu Ser 785 790 795 800

Ser Lys Leu Asn Glu Ser lie Asn Lys Ala Met lie Asn lie Asn Lys 805 810 815

Phe Leu Asn Gin Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met lie Pro 820 825 830

Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala 835 840 845

Leu Leu Lys Tyr lie Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu lie Gly Gin Val 850 855 860

Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp He Pro 865 870 875 880

Phe Gin Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser Thr Leu 885 890 895

Asp <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 60 <211> 2724 <212> ADN <223> Sintética <400> 60 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttegaaf aaGtgggtac ttttggeggt ©aegacgcta aattcatega ctctGtgeaa ΜΘ gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 000 aaagcgaaat: ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 060 gaaaaatacc fgctQâfSga agaeaqGteo ggcaaattct étgtagâcaa gttgaaâtte 1020 gataaacttt âeaaaatgct gactgaaatt taeaccgaag aeaacttcgt taagttcttt 1080

aaagttctga accgeaaaaò etatGtgsac ttGgaeaagg eagtatteaa. aatcaacatc IMO gtgGasgaaag ttaagtagac tateetaGgat ggtfteaacG tgegtaacaG· caaGGtggGt 1:208 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaattagcta accaggcgct agcgggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctggtggt 1440 ggtggttctg gtggtggtgg ttctgcacta gtgctgcagt gtatcaaggt taacaactgg 1500 gatttattct tcagcccgag tgaagacaac ttcaccaacg acctgaacaa aggtgaagaa 1560 atcacctcag atactaacat cgaagcagcc gaagaaaaca tctcgctgga cctgatccag 1620 cagtactacc tgacctttaa tttcgacaac gagccggaaa acatttctat cgaaaacctg 1680 agctctgata tcatcggcca gctggaactg atgccgaaca tcgaacgttt cccaaacggt 1740 aaaaagtacg agctggacaa atataccatg ttccactacc tgcgcgcgca ggaatttgaa 1800 cacggcaaat cccgtatcgc actgactaac tccgttaacg aagctctgct caacccgtcc 1860 cgtgtataca ccttcttctc tagcgactac gtgaaaaagg tcaacaaagc gactgaagct 1920 gcaatgttct tgggttgggt tgaacagctt gtttatgatt ttaccgacga gacgtccgaa 1980 gtatctacta ccgacaaaat tgcggatatc actatcatca tcccgtacat cggtccggct 2040 ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gacttcgttg gcgcactgat cttctccggt 2100 gcggtgatcc tgctggagtt catcccggaa atcgccatcc cggtactggg cacctttgct 2160 ctggtttctt acattgcaaa caaggttctg actgtacaaa ccatcgacaa cgcgctgagc 2220 aaacgtaacg aaaaatggga tgaagtttac aaatatatcg tgaccaactg gctggctaag 2280 gttaatactc agatcgacct catccgcaaa aaaatgaaag aagcactgga aaaccaggcg 2340 gaagctacca aggcaatcat taactaccag tacaaccagt acaccgagga agaaaaaaac 2400 aacatcaact tcaacatcga cgatctgtcc tctaaactga acgaatccat caacaaagct 2460 atgatcaaca tcaacaagtt cctgaaccag tgctctgtaa gctatctgat gaactccatg 2520 atcccgtacg gtgttaaacg tctggaggac ttcgatgcgt ctctgaaaga cgccctgctg 2580 aaatacattt acgacaaccg tggcactctg atcggtcagg ttgatcgtct gaaggacaaa 2640 gtgaacaata ccttatcgac cgacatccct tttcagctca gtaaatatgt cgataaccaa 2700 cgccttttgt ccactctaga ctag 2724 <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 61 <211> 907 <212> PRT <223> Sintética <400> 61

Gly Ser Met Glu Phe Val Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val 15 10 15

Asn Gly Val Asp lie Ala Tyr lie Lys lie Pro Asn Ala Gly Gin Met 20 25 30

Gin Pro Val Lys Ala Phe Lys lie His Asn Lys lie Trp Val He Pro 35 40 45

Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro 50 55 60

Pro Glu Ala Lys Gin Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu 65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu 85 90 95

Phe Glu Arg lie Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser 100 105 110

He Val Arg Gly lie Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr lie Asp Thr Glu 115 120 125

Leu Lys Val lie Asp Thr Asn Cys lie Asn Val lie Gin Pro Asp Gly 130 135 140

Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val lie lie Gly Pro Ser Ala 145 150 155 160

Asp lie lie Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn 165 170 175

Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr lie Arg Phe Ser Pro 180 185 190

Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro 195 200 205

Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala 210 215 220

His Glu Leu lie His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly lie Ala lie Asn 225 230 235 240

Pro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 245 250 255

Gly Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 260 265 270

Ala Lys Phe lie Asp Ser Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr 275 280 285

Tyr Asn Lys Phe Lys Asp lie Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser 290 295 300 lie Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys 305 310 315 320

Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp 325 330 335

Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu lie Tyr Thr 340 345 350

Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr 355 360 365

Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys lie Asn lie Val Pro Lys Val 370 375 380

Asn Tyr Thr lie Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 385 390 395 400

Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu lie Asn Asn Met Asn Phe Thr 405 410 415

Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 420 425 430

Val Asp Gly lie lie Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu lie Glu Gly Arg 435 440 445

Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ala Asn 450 455 460

Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Val Leu Gin Cys lie Lys 485 490 495

Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr 500 505 510

Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu 515 520 525

Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gin Gin Tyr Tyr Leu 530 535 540

Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu 545 550 555 560

Ser Ser Asp lie lie Gly Gin Leu Glu Leu Met Pro Asn lie Glu Arg 565 570 575

Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His 580 585 590

Tyr Leu Arg Ala Gin Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu 595 600 605

Thr Asn Ser Vai Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Vai Tyr Thr 610 615 620

Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Vai Lys Lys Vai Asn Lys Ala Thr Glu Ala 625 630 635 640

Ala Met Phe Leu Gly Trp Vai Glu Gin Leu Vai Tyr Asp Phe Thr Asp 645 650 655

Glu Thr Ser Glu Vai Ser Thr Thr Asp Lys lie Ala Asp Ile Thr Ile 660 665 670 lie lie Pro Tyr lie Gly Pro Ala Leu Asn lie Gly Asn Met Leu Tyr 675 680 685

Lys Asp Asp Phe Vai Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Vai Ile Leu 690 695 700

Leu Glu Phe lie Pro Glu He Ala lie Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala 705 710 715 720

Leu Val Ser Tyr He Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gin Thr lie Asp 725 730 735

Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr 740 745 750

He Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gin He Asp Leu lie 755 760 765

Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala Glu Ala Thr Lys 770 775 780

Ala He He Asn Tyr Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn 785 790 795 800

Asn He Asn Phe Asn He Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser 805 810 815 lie Asn Lys Ala Met lie Asn He Asn Lys Phe Leu Asn Gin Cys Ser 820 825 830

Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met He Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu 835 840 845

Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr He Tyr 850 855 860

Asp Asn Arg Gly Thr Leu lie Gly Gin Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys 865 870 875 880

Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp He Pro Phe Gin Leu Ser Lys Tyr 885 890 895

Val Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser Thr Leu Asp 900 905 <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 62 <211> 207 <212> ADN <223> Sintética <400> 62 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctgacga tgacgataaa 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaac gtaagaacca ggcgctagcg 120 ggcggtggcg gtagcggcgg tggcggtagc ggcggtggcg gtagcgcact agtgctgcag 180 acgcacggtc tagaatgata aaagctt 207

<210> 63 <211> 2709 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 63 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct fcetctccagt acatgaagaa cgttt.t.taaa 960: gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggeaaattct cfegtagacaa gttgaaattc 1020 gafca&agt'tt aGaaaãt-gefc gastgaaatt taGaGGgaag· acaactteegt taagfctcttt 1080 aaagttctga accgcaaaaG etatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaact.aeao fc.afcctacgat ggtttcaacc fcgGgfcaaGâG caacctggct 1200 gG-fcaatfct't-a. acggcGagaa. cacggaaatlG. aáèaãeaÊga. aGfctiGaca-aa- act-ga&aaaG -1.260: tteactggtG tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 aGtaaaÈGtg a-QgatgaGga taaatttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaacgtaaga accaggcgct agcgggcggt ggcggtageg geggtggegg tageggcggt 1440 ggcggtagcg GaGtagtgGt gcagtgtatc aaggttaaGa aetgggattt attct.tcagc 1.500 GGgagtgaag aoaae:tt.c«G caaGgacctg' aacaaaggtg- aagaaatcaG GteagafaGt. 1560' aaG.atcgaag cagccgaaga aaacatGtcg ctggaGctga tccagcagta ctacctgacc 1620 tttaattteg acaacgagcc ggaaaacatt tGfcatcgaaa. acGtgagGtG: tgatatcatc 1680 ggG-GagGfegg aactgafcgçG gaacatcgaa cgtttoèGáS:: aGggiaaaaà gmGgagGtg -1740: gacaaatatá; ccatgttcca ctacctgcgc gcgcaggaat ttgaaoaegg ca:a.atc:cegt 1800 atcgcactga ctaactccgt taacgaagct ctgctcaacc cgtcccgtgt atacaccttc 1860 ttctctagcg actacgtgaa aaaggtcaac aaagcgactg aagctgcaat gttcttgggt 1920 tgggttgaac agcttgttta tgattttacc gacgagacgt ccgaagtatc tactaccgac 1980 aaaattgcgg atatcactat catcatcccg tacatcggtc cggctctgaa cattggcaac 2040 atgctgtaca aagacgactt cgttggcgca ctgatcttct ccggtgcggt gatcctgctg 2100 gagttcatcc cggaaatcgc catcccggta ctgggcacct ttgctctggt ttcttacatt 2160 gcaaacaagg ttctgactgt acaaaccatc gacaacgcgc tgagcaaacg taacgaaaaa 2220 tgggatgaag tttacaaata tatcgtgacc aactggctgg ctaaggttaa tactcagatc 2280 gacctcatcc gcaaaaaaat gaaagaagca ctggaaaacc aggcggaagc taccaaggca 2340 atcattaact accagtacaa ccagtacacc gaggaagaaa aaaacaacat caacttcaac 2400 atcgacgatc tgtcctctaa actgaacgaa tccatcaaca aagctatgat caacatcaac 2460 aagttcctga accagtgctc tgtaagctat ctgatgaact ccatgatccc gtacggtgtt 2520 aaacgtctgg aggacttcga tgcgtctctg aaagacgccc tgctgaaata catttacgac 2580 aaccgtggca ctctgatcgg tcaggttgat cgtctgaagg acaaagtgaa caatacctta 2640 tcgaccgaca tcccttttca gctcagtaaa tatgtcgata accaacgcct tttgtccact 2700 ctagactag 2709

<210> 64 <211> 902 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 64 ©i;f Ser Met Glu Rhe· Val Asa Lys Sin Fhe Asn. Tyx Lys' -Asp Fro; Val. 1 5 10: 15.

Asn; Gly Val Asp lie Ala; Tyr lie Lys lie Ftp Asp Ala Gly Sin Met. 20 25 30 ©1& Pro Val Lys Alá: Fhe; Lys lie -His Asn Lys lie ϊχρ Val- lie -P£Q 35 40 45

Glu Arg Asp: Thr Pha; Thr Asa Pro: Glu 6¾ G:ly Asp Leu Asa -Pap Sap: 50 55 60

Pro.· Siu Ala Ays Ola Val Pa© Val Oar Tyr Tyr Asp Bar Thr Tyr Leu 65 7 0 75 50

Ser Thr Asp Asn Glu Lys: Asp Asa Tyr Leu Lys Gly Vai Thr nys Léu 85 90 95

:pfe-@ Siu Ar©: lie Tyr Ser Thr Asp Leu Sly Are Met Leu Leu Thr Sec 100 105 HO

Lie: Val Arg Gly lie Pro Phe: Trp Gly Gly Ser Thr Lie Asp Thr Glu, 115 120 125

Leu Lys Val 'Lie; Asp Thr Asn Cys He Asa Val He Glu Pro; Asp Sly· l50 135 140

Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Léu Ash: Lèu VaL H# He Gly Pro Ser Ala- 145 150 155. 160

Asp He He Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn 165 170 175

Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr He Arg Phe Ser Pro 180 185 190

Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro 195 200 205

Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala 210 215 220

His Glu Leu lie His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly lie Ala lie Asn 225 230 235 240

Pro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 245 250 255

Gly Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 260 265 270

Ala Lys Phe lie Asp Ser Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr 275 280 285

Tyr Asn Lys Phe Lys Asp He Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser 290 295 300 lie Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys 305 310 315 320

Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp 325 330 335

Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu He Tyr Thr 340 345 350

Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr 355 360 365

Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys lie Asn He Val Pro Lys Val 370 375 380

Asn Tyr Thr He Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 3S5 330 33S 400

Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu He Asn Asn Met Asn Phe Thr 405 410 415

Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 420 425 430

Val Asp Gly lie lie Thr Ser Lys Thr Lys Ser Asp Asp Asp Asp Lys 435 440 445

Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Arg Lys Asn 450 455 460

Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480

Gly Gly Ser Ala Leu Val Leu Gin Cys lie Lys Val Asn Asn Trp Asp 485 490 495

Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys 500 505 510

Gly Glu Glu lie Thr Ser Asp Thr Asn lie Glu Ala Ala Glu Glu Asn 515 520 525 lie Ser Leu Asp Leu lie Gin Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp 530 535 540

Asn Glu Pro Glu Asn lie Ser lie Glu Asn Leu Ser Ser Asp lie lie 545 550 555 560

Gly Gin Leu Glu Leu Met Pro Asn lie Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys 565 570 575

Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gin 580 585 590

Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg lie Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn 595 600 605

Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp 610 615 620

Tyr Val Lys Lys V&l Asn LyS Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly oz5 630 6:35 640

Tip Val Glu ©In Leu Val Tyr Asp Ahe: T:h.r Asp Gin Thr Sen Glu Val 6:45 $:50 655

Ser Thr Thr Asp Lys lie Ala Asp lie Thr lie lie lie Pro Tyr He 660 665 670

Gly Are Ala Leu Asa lie Gly Asn, Met. Leu Tyr :Lys Asp Asp Bhe Val 675 680 685'

Gly Ala Leu He Phe Ser G.ly Ala Val lie. Leu Leu Glu Phe lie Fro 690 695 7 00

Glu Tie Ala. Tie Tiro. Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr lie 705 710 715 720

Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gin Thr Lie Asp Ash Ala Leu Ser Lys 725 730 735

Arg Asn Glu Lys Trp Asp: Glu Val Tyr Lys Tyr lie Val Thr Asn Trp 740 745 7:5:0

Leu Ala Lys Val Asn Thr Gin lie Asp Leu lie Arg Lys Lys Met Lys 755 760 765

Glu Ala. Leu Glu Asn Gin Ala Glu Ala Thr Lys Ala Lie He Asn Tyr 770. 775 780

Gin Tyr Ash Gin Tyr Thr Glu Glu Glu. Lys Asn Asn He Asa, Bhe Asa 785 790 795 800 lie Asp .Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser lie Asa Lys A La Met 80S 810 815 lie Asn. Xle Asn Ays Bhe Leu Ash Gin Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met 820 82 5 830

Asn Ser Met lie Pro Tyr Gly Val Lys, Arg Leu Glu Asp; Phe Asp Ala 83 5 840 145

Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr lie Tyr Asp Asn Arg Gly Thr 850 855 860

Leu Ile Gly Gin Vai Asp Arg Leu Lys Asp Lys Vai Asn Asn Thr Leu 865 870 875 880

Ser Thr Asp lie Pro Phe Gin Leu Ser Lys Tyr Vai Asp Asn Gin Arg 885 890 895

Leu Leu Ser Thr Leu Asp 900

<210> 65 <211> 207 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 65 ggatccacgc acgtcgacgg catcattacc tccaaaacta aatctctgat agaaggtaga 60 tttggcggtt tcacgggcgc acgcaaatca gcgcgtaaac gtaagaacca ggcgctagcg 120 ggcggtggcg gtagcggcgg tggcggtagc ggcggtggcg gtagcgcact agtgctgcag 180 acgcacggtc tagaatgata aaagctt 207

<210> 66 <211> 2742 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 Ο Ο> 66 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataac 60 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240 ctgagcaccg atagcgataa agataccttc ctgaaagaaa tcatcaaact gttcaaacgc 300 atcaacagcc gtgaaattgg cgaagaactg atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 ccgggcaaca acaacacccc gatcaacacc tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 420 gatgttaaaa cccgccaggg taacaattgg gtgaaaaccg gcagcattaa cccgagcgtg 480 attattaccg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa ccagcacctt taaactgacc 540 aacaacacct ttgcggcgca ggaaggtttt ggcgcgctga gcattattag cattagcccg 600 cgctttatgc tgacctatag caacgcgacc aacgatgttg gtgaaggccg tttcagcaaa 660 agcgaatttt gcatggaccc gatcctgatc ctgatgcatg aactgaacca tgcgatgcat 720 aacctgtatg gcatcgcgat tccgaacgat cagaccatta gcagcgtgac cagcaacatc 780 ttttacagcc agtacaacgt gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 accattgatc tgattccgaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 tatcgcagca ttgcgaaacg tctgaacagc attaccaccg cgaatccgag cagcttcaac 960 aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat atcgctttgt ggtggaaagc 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtacaacga actgacccag 1080 atcttcaccg aatttaacta tgcgaaaatc tataacgtgc agaaccgtaa aatctacctg 1140 agcaacgtgt ataccccggt gaccgcgaat attctggatg ataacgtgta cgatatccag 1200 aacggcttta acatcccgaa aagcaacctg aacgttctgt ttatgggcca gaacctgagc 1260 cgtaatccgg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc tgtacctgtt caccaaattt 1320 tgcgtcgacg gcatcattac ctccaaaact aaatctctga tagaaggtag atttggcggt 1380 ttcacgggcg cacgcaaatc agcgcgtaaa cgtaagaacc aggcgctagc gggcggtggc 1440 ggtagcggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcgcac tagtgctgca gtgtcgtgaa 1500 ctgctggtga aaaacaccga tctgccgttt attggcgata tcagcgatgt gaaaaccgat 1560 atcttcctgc gcaaagatat caacgaagaa accgaagtga tctactaccc ggataacgtg 1620 àgcgttfãtc asgtgatGct gagcasffiaa.c: acGagcgaac atggtcagct ggatctgctg 1680 tatcegagca ttgstagcga aagcgaaatt: ctgcegggcg aasaGGaggt gfctÈtaogat 134(1 aaecgtacKc agaacgtgga ttaoctgaac- agctattact aGGtggãaag geagaaastg 1800 agcgataacg tggaagattt taccttta-cg eggageattg aagaagegct ggataacagc I860 gcgaaagttt acacctattt tccgac.GGtg gcgaacaaag ttaatgeggg tgttcagggc 192 0 ggtctgtttc tgatgtgggc gaáogatgtg gtggaagatt tesaceagcaa ©atGetgcgt 1980 aaagatagçç: tggataaaat eagegatgtt agegcgatta ttecgtatat tggtcGggcg 2040 ©tgaasatta: gcaatagcgt gcgtcgtggc aattttaGcg aagcgtfctgc ggt:fcaec:ggi 2100 gtgaccattc tgctggaagc gtttccggaa tttaccattc cggcgctggg tgcgtttgtg 2160 atctatagca aagtgcagga acgcaacgaa atcatcaaaa ccatcgataa ctgcctggaa 2220 cagcgtatta aacgctggaa agatagctat gaatggatga tgggcacctg gctgagccgt 2280 attatcaccc agttcaacaa catcagctac cagatgtacg atagcctgaa ctatcaggcg 2340 ggtgcgatta aagcgaaaat cgatctggaa tacaaaaaat acagcggcag cgataaagaa 2400 aacatcaaaa gccaggttga aaacctgaaa aacagcctgg atgtgaaaat tagcgaagcg 2460 atgaataaca tcaacaaatt catccgcgaa tgcagcgtga cctacctgtt caaaaacatg 2520 ctgccgaaag tgatcgatga actgaacgaa tttgatcgca acaccaaagc gaaactgatc 2580 aacctgatcg atagccacaa cattattctg gtgggcgaag tggataaact gaaagcgaaa 2640 gttaacaaca gcttccagaa caccatcccg tttaacatct tcagctatac caacaacagc 2700 ctgctgaaag atatcatcaa cgaatacttc aatctagact ag 2742

<210> 67 <211> 913 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 67

Gly Ser Glu Phe Met Pro lie Thr lie Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp 15 10 15

Pro Val Asp Asn Lys Asn lie Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr 20 25 30

Leu Ala Asn Glu Pro Glu Lys Ala Phe Arg lie Thr Gly Asn lie Trp 35 40 45

Val lie Pro Asp Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys 50 55 60

Pro Pro Arg Val Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr 65 70 75 80

Leu Ser Thr Asp Ser Asp Lys Asp Thr Phe Leu Lys Glu lie lie Lys 85 90 95

Leu Phe Lys Arg lie Asn Ser Arg Glu lie Gly Glu Glu Leu lie: Tyr 110 105 110

Arg Leu Ser Thr Asp lie Pro Phe Pro: Gly Asn Asn Asn Thr Pro lie 115: 120 125

Asn Thr Phe Asp Phe Asp Val Asp Phe Agn Ser Val Asp Val Lys Thr 130 135 140

Arg Gin; Gly Ash Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser lie: Asn Pro: Ser Val 145 150 155 160 lie lie Thr Gly Pro Arg: Glu Asn lie lie. Asp 'Pro: Glu Thr Ser Thr 165 170 175

Phe Ays; Leu Thr Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gin Glu Gly Phe Gly Ala 180 185 190

Leu Ser lie lie Ser lie Ser Ere Arg Phe Met. leu Thr Tyr Ser Asn 195 2 0 0 205

Ala Thr Ash Asp Val Sly Glu ©ly Arg Phe Ser Lys Ser Glu. Phe Gys 210 215 220

Met Asp Pro He leu X:le .Lea Met His Glu Lea Asn. His Ala Met His 225 23® 235 240

Asn Leu Tyr ©ly lie Alia lie Ere Ash. Asp Gin Thr He Heir Ser Val 245 25:0 2 55

Thr Ser Asn He Phe Tyr Ser Gin. Tyr Asn Val Lys Leu Glu Tyr Ala MO 265 270

Glu lie Tyr Ala Phe- Gly Gly Pro Thr He Asp Leu He Pro Lya Ser 273 M® 2-:8:5

Ala Arg Lys Tyr Eh® Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser lie 2 9® 2 95 3: GO

Ala Lys Arg Leu Asn Ser He Thr Thr Ala Asn Pro Ser Set Phe Asn 505 310 315 320

Lys Tyr lie Gly Glu Tyr Lys: Gin Lys Leu life: Arg Lys Tyr Arg iPhe 325 330 335 %ai Vail Glu Ser Ser Gly Glu Val Thr Val Asn Arg Asn Lys Phe Val 340 345 j50

Glu Leu Tyr Agn Glu Leu Thr Gin. lie PL© Thr Glu Phe Asn Tyr Ala 355 3:6® 365

Lys I'l,e Tyr Asn. Val Gin Asn Arg Lys Lie Tyr Leu Sier Asn Val Tyr 370 375 31®

Thr Prg Vai Thr Ala Asn lie Leu Mw Asp: Asn Vai Tyr Asp Ile Gm 385 390 395 400 Αδη Gly píaé Asei I e :Pri> Lys Ser Asn. Leu. Αδη Vai 'Leu Phe· Met Gly 4 05 410 415

Gin Asn leu Ser Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Vai Asn Pro Glu, Αδη 42:0 425 430

Met: leu Tyr Leu Phè Ifer Lys Phe Cys Vai Asp Gly lie: Ile Ifrr Ser 435 440- 4 4g

Lys Thr Lys Ser Leu I1b; Gin Gly Arg Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala 450; 455 460

Arg Lys Ser Ala Arg Lys Arg Lys Asn Gin. Ala Leu Ala Gly Sly Gly 465 470 475 480

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly" Gly Gly Ser Ala. Leu Vai Leu 485 4#0 495

Gin Cys Arg Glu Leu Leu Vai Lys Asn Thr Asp Leu Pro: Phe Tie Gly 500 505 510

Asp Ile Ser- Asp Vai Lys Thr Asp Ile·. Phe Leu Arg Lys Asp lie Aah 515 520 525

Glu Glu Thr Glu Vai Ile Tyr Tyr Prg Asp Asa Vai Ser Vai Asp Gin 530 535 540:

Vai Ile Leu Ser Lys Asn Thr Ser Glu His Gly Gin; Leu Asp: Leu Leu 545 550 555 560

Tyr Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu He Leu Pro Gly Glu Asn Gin 565 570 575

Vai Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gin Asn Val Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr 580 585 590

Tyr Tyr Leu Glu Ser Gin Lys Leu Ser Asp Asn Val Glu Asp Phe Thr 595 600 605

Phe Thr Arg Ser lie Glu Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala Lys Val Tyr 610 615 620

Thr Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn Lys Val Asn Ala Gly Val Gin Gly 625 630 635 640

Gly Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp Val Val Glu Asp Phe Thr Thr 645 650 655

Asn lie Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys lie Ser Asp Val Ser Ala 660 665 670 lie lie Pro Tyr lie Gly Pro Ala Leu Asn lie Ser Asn Ser Val Arg 675 680 685

Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala Val Thr Gly Val Thr lie Leu 690 695 700

Leu Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr lie Pro Ala Leu Gly Ala Phe Val 705 710 715 720 lie Tyr Ser Lys Val Gin Glu Arg Asn Glu lie lie Lys Thr lie Asp 725 730 735

Asn Cys Leu Glu Gin Arg lie Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Glu Trp 740 745 750

Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg lie lie Thr Gin Phe Asn Asn lie 755 760 765

Ser Tyr Gin Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gin Ala Gly Ala lie Lys 770 775 780

Ala Lys lie Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu 785 790 795 800

Asn lie Lys Ser Gin Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp Val Lys 805 810 815 lie Ser Glu Ala Met Asn Asn lie Asn Lys Phe lie Arg Glu Cys Ser 820 825 830

Val Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val lie Asp Glu Leu 835 840 845

Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu lie Asn Leu lie Asp 850 855 860

Ser His Asn lie lie Leu Val Gly Glu Val Asp Lys Leu Lys Ala Lys 865 870 875 880

Val Asn Asn Ser Phe Gin Asn Thr lie Pro Phe Asn lie Phe Ser Tyr 885 890 895

Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp lie lie Asn Glu Tyr Phe Asn Leu 900 905 910

Asp

<210> 68 <211> 2673 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 68 :ggatc:eat.gg .agttcgttaa .oaaacagt'to sastataasg. acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaa.aatGscc gaacgctggç: cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 1.20

eaeaaéaaaa tçtgggttat cceggaacgt gataccttta ctaaecegga agaaggtgac ISO ctgaacccgc caecggaago g&áacaggig ccggtatett aetatgagte cacctacctg 240 tctaccga-ta acgaaaagga oaãQ.tacctg aaaggtgtta. etaaactgtt cgagcgtatt 300 tactcsaccg acctgggccg tatgctgcfcg: actagcafccg ttôgeggtat eécgttetgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatacggt ggtttcctgg cgctagcggg cggtggcggt 1380 agcggcggtg gcggtagcgg cggtggcggt agcgcactag tgctgcagtg tatcaaggtt 1440 aacaactggg atttattctt cagcccgagt gaagacaact tcaccaacga cctgaacaaa 1500 ggtgaagaaa tcacctcaga tactaacatc gaagcagccg aagaaaacat ctcgctggac 1560 ctgatccagc agtactacct gacctttaat ttcgacaacg agccggaaaa catttctatc 1620 gaaaacctga gctctgatat catcggccag ctggaactga tgccgaacat cgaacgtttc 1680 ccaaacggta aaaagtacga gctggacaaa tataccatgt tccactacct gcgcgcgcag 1740 gaatttgaac acggcaaatc ccgtatcgca ctgactaact ccgttaacga agctctgctc 1800 aacccgtccc gtgtatacac cttcttctct agcgactacg tgaaaaaggt caacaaagcg 1860 actgaagctg caatgttctt gggttgggtt gaacagcttg tttatgattt taccgacgag 1920 acgtccgaag tatctactac cgacaaaatt gcggatatca ctatcatcat cccgtacatc 1980 ggtccggctc tgaacattgg caacatgctg tacaaagacg acttcgttgg cgcactgatc 2040 ttctccggtg cggtgatcct gctggagttc atcccggaaa tcgccatccc ggtactgggc 2100 acctttgctc tggtttctta cattgcaaac aaggttctga ctgtacaaac catcgacaac 2160 gcgctgagca aacgtaacga aaaatgggat gaagtttaca aatatatcgt gaccaactgg 2220 ctggctaagg ttaatactca gatcgacctc atccgcaaaa aaatgaaaga agcactggaa 2280 aaccaggcgg aagctaccaa ggcaatcatt aactaccagt acaaccagta caccgaggaa 2340 gaaaaaaaca acatcaactt caacatcgac gatctgtcct ctaaactgaa cgaatccatc 2400 aacaaagcta tgatcaacat caacaagttc ctgaaccagt gctctgtaag ctatctgatg 2460 aactccatga tcccgtacgg tgttaaacgt ctggaggact tcgatgcgtc tctgaaagac 2520 gccctgctga aatacattta cgacaaccgt ggcactctga tcggtcaggt tgatcgtctg 2580 aaggacaaag tgaacaatac cttatcgacc gacatccctt ttcagctcag taaatatgtc 2640 gataaccaac gccttttgtc cactctagac tag 2673

<210> 69 <211> 890 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4 Ο Ο> 69

Gly Ser Met· Glu Phe Val Asn Ays Sin Phe Asn Tyr Ayo Asp Pro Val 1 5 10 15

Asn Sly Val Asp lie: Ala Tyr lie· Lys lie Pro Asa Ala Giy Sin Met

20 2d H

Gin Pro- Val lys Ala iPtee Ays lie His Asn Lys lie :Trp Val He Pro · 35 40 ' 45

Glu Arg Asp Thr Phe. Thr Asn Pro: Glu Glu Gly Asp Am Asn Pro Pro SO 55 60

Pro Glu Ala Ays Gin val Pro Val Her Tyr Ayr Asp Sex Thr Tyr leu d5 70 75 80

Sex Thr Asp- Asn Glu Ays Asp Asn Ayr Leu. Ays Gly Val Air Lys Leu f5 90 95

Phe Glu Arg lie Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser 100 105 110 lie Val Arg Gly lie Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr lie Asp Thr Glu 115 120 125

Leu Lys Val lie Asp Thr Asn Cys lie Asn Val lie Gin Pro Asp Gly 130 135 140

Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val lie He Gly Pro Ser Ala 145 150 155 160

Asp lie lie Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn 165 170 175

Leu Thr Arq Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr He Arg Phe Ser Pro 180 185 190

Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro 195 200 205

Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala 210 215 220

His Glu Leu lie His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly lie Ala lie Asn 225 230 235 240

Pro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 245 250 255

Gly Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 260 265 270

Ala Lys Phe He Asp Ser Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr 275 280 285

Tyr Asn Lys Phe Lys Asp lie Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser 290 295 300 lie Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys 305 310 315 320

Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp 325 330 335

Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Pfet Leu Thr Glu He Tyr Thr 340 345 350 :Glu Asp Asn Phfe Val. Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr 355 360 365

Leu Asn Phe Asp Lys. Ala Val Phe' Lys lie Asn lie Val Pro Lys Val. 370 o 380

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Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu lie Asn Asn Met Asn Phe Thr 405 410 415

Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 420 425 430

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Val Leu Gin Cys He Lys Val 465 470 475 480

Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn 485 490 495

Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu lie Thr Ser Asp Thr Asn lie Glu Ala 500 505 510

Ala Glu Glu Asn lie Ser Leu Asp Leu lie Gin Gin Tyr Tyr Leu Thr 515 520 525

Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn lie Ser He Glu Asn Leu Ser 530 535 540

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Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr 565 570 575

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Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe 595 600 605

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Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr Asp Lys lie Ala Asp lie Thr lie lie 645 650 655 lie Pro Tyr lie Gly Pro Ala Leu Asn lie Gly Asn Met Leu Tyr Lys 660 665 670

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Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala Glu Ala Thr Lys Ala 755 760 765 lie lie Asn Tyr Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn 770 775 780 lie Asn Phe Asn lie Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser lie 785 790 795 800

Asn Lys Ala Met lie Asn lie Asn Lys Phe Leu Asn Gin Cys Ser Val 805 810 815

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Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp lie Pro Phe Gin Leu Ser Lys Tyr Val 865 870 875 880

Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser Thr Leu Asp 885 890

<210> 70 <211> 2709 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 70 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatatggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaattagcta accaggcgct agcgggcggt ggcggtagcg gcggtggcgg tagcggcggt 1440 ggcggtagcg cactagtgct gcagtgtatc aaggttaaca actgggattt attcttcagc 1500 ccgagtgaag acaacttcac caacgacctg aacaaaggtg aagaaatcac ctcagatact 1560 aacatcgaag cagccgaaga aaacatctcg ctggacctga tccagcagta ctacctgacc 1620 tttaatttcg acaacgagcc ggaaaacatt tctatcgaaa acctgagctc tgatatcatc 1680 ggccagctgg aactgatgcc gaacatcgaa cgtttcccaa acggtaaaaa gtacgagctg 1740 gacaaatata ccatgttcca ctacctgcgc gcgcaggaat ttgaacacgg caaatcccgt 1800 atcgcactga ctaactccgt taacgaagct ctgctcaacc cgtcccgtgt atacaccttc 1860 ttctctagcg actacgtgaa aaaggtcaac aaagcgactg aagctgcaat gttcttgggt 1920 tgggttgaac agcttgttta tgattttacc gacgagacgt ccgaagtatc tactaccgac 1980 aaaattgcgg atatcactat catcatcccg tacatcggtc cggctctgaa cattggcaac 2040 atgctgtaca aagacgactt cgttggcgca ctgatcttct ccggtgcggt gatcctgctg 2100 gagttcatcc cggaaatcgc catcccggta ctgggcacct ttgctctggt ttcttacatt 2160 gcaaacaagg ttctgactgt acaaaccatc gacaacgcgc tgagcaaacg taacgaaaaa 2220 tgggatgaag tttacaaata tatcgtgacc aactggctgg ctaaggttaa tactcagatc 2280 gacctcatce gcaaaaaaat gaaagaagea. ctggaaaaec sggeggaage taocaaggea 2340 atcattaaet aceagtacaa ceagtaeace gaggaagaaa aaaacaaeat caactte.aae 2400 ategaegate tgtPPtctaa actgaaegaa tecataaaca sagetatgat caacateaaG 24f0 aagttcetga accagtgctc fcgtaagcfeãfc ctgatgaact ccatgatccc gtacggtgtt 2520.

aaaegtetgg aggaettega tgcgtctctg aaagacgccc tgctgaaata catttacgac 2S8Q aacegfefgca etotgategg tcaggttgat egtctgaagg aeaaagtgaa caataectta 2640 tcgaoc.gaea tcccttttca gctcagtaaa tatgtegata accaacgcct tttgtccact 2700 etagaefeag 27Q9

<210> 71 <211> 902 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 71

Gly Ser Met Glu Phe Val Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val 15 10 15

Asn Gly Val Asp lie Ala Tyr lie Lys lie Pro Asn Ala Gly Gin Met 20 25 30

Gin Pro Val Lys Ala Phe Lys lie His Asn Lys lie Trp Val He Pro 35 40 45

Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro 50 55 60

Pro Glu Ala Lys Gin Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu 65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu 85 90 95

Phe Glu Arg lie Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser 100 105 110

He Val Arg Gly He Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr He Asp Thr Glu 115 120 125

Leu Lys Val lie Asp Thr Asn Cys He Asn Val lie Gin Pro Asp Gly 130 135 140

Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val He lie Gly Pro Ser Ala 145 150 155 160

Asp He He Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn 165 170 175

Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr lie Arg Phe Ser Pro 180 185 190

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Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala 210 215 220

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Pro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 245 250 255

Gly Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 260 265 270

Ala Lys Phe lie Asp Ser Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr 275 280 285

Tyr Asn Lys Phe Lys Asp He Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser 290 295 300

He Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys 305 310 315 320

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Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu He Tyr Thr 340 345 350

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Asn Tyr Thr lie Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 385 390 395 400

Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu He Asn Asn Met Asn Phe Thr 405 410 415

Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 420 425 430

Val Asp Gly lie lie Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu lie Glu Gly Arg 435 440 445

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Gly Gly Ser Ala Leu Val Leu Gin Cys lie Lys Val Asn Asn Trp Asp 485 490 495

Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys 500 505 510

Gly Glu Glu lie Thr Ser Asp Thr Asn lie Glu,Ala Ala Glu Glu Asn 515 520 525 lie Ser Leu Asp Leu lie Gin Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp 530 535 540

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Gly Gin Leu Glu Leu Met Pro Asn lie Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys 565 570 575

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Leu Ala Lys Val Asn Thr Gin lie Asp Leu lie Arg Lys Lys Met Lys 755 760 765

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He Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser lie Asn Lys Ala Met 805 810 815 lie Asn lie Asn Lys Phe Leu Asn Gin Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met 820 825 830

Asn Ser Met lie Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala 835 840 845

Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr lie Tyr Asp Asn Arg Gly Thr 850 855 860

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Ser Thr Asp lie Pro Phe Gin Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gin Arg 885 890 895

Leu Leu Ser Thr Leu Asp 900

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<210> 73 <211> 902 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 73

Gly Ser Met Glu Phe Val Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val 15 10 15

Asn Gly Val Asp lie Ala Tyr lie Lys lie Pro Asn Ala Gly Gin Met 20 25 30

Gin Pro Val Lys Ala Phe Lys lie His Asn Lys lie Trp Val lie Pro 35 40 45

Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro 50 55 60

Pro Glu Ala Lys Gin Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu 65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu 85 90 95

Phe Glu Arg lie Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser 100 105 110 lie Val Arg Gly lie Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr lie Asp Thr Glu 115 120 125

Leu Lys Val He Asp Thr Asn Cys lie Asn Val He Gin Pro Asp Gly 130 135 140

Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val lie He Gly Pro Ser Ala 145 150 155 160

Asp He He Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn 165 170 175

Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr He Arg Phe Ser Pro 180 185 190

Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro 195 200 205

Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala 210 215 220

Hrs Glu Leu lie Sis .Ala Gly Sis Arg 'Leu Tyr Gly Ile Ala Tla Asn 225 OO 233: 240

Fro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 24 5 250: 255

Gly Leu GXu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 260 265 270

Ala Lys Phe lie Asp Ser Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr 275 280 285

Tyr Asn Lys Phe Lys Asp lie Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser 290 295 300 lie Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys 305 310 315 320

Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp 325 330 335

Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu lie Tyr Thr 340 345 350

Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr 355 360 365

Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys lie Asn lie Val Pro Lys Val 370 375 380

Asn Tyr Thr lie Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 385 390 395 400

Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu lie Asn Asn Met Asn Phe Thr 405 410 415

Lys Leu Lys^Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 420 425 430

Val Asp Gly lie lie Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu He Glu Gly Arg 435 440 445

Tyr Gly Gly Phe Thr Gif Ala Atg Lys Ser Ala Arg Lys Arg Lys Asn 450 455 460

Gin Ala Lem Ala Gif Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gl^ 465 4?0 475 480

Gly Gly Ser' Ala Leu Val Lem Sin Cys lie. Lys Val Asm Asn Trp Asp 485 490 495

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Gly Gin: Leu, Glu Leu Met Pro Asn lit Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys 565 510 575

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Ser Thr Asp lie Pro Phe Gin Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gin Arg 885 890 895

Leu Leu Ser Thr Leu Asp 900

<210> 74 <211> 2889 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 74 ggatccttgg tacgagatga cgttgactat caaattttcc gcgactttgc ggaaaataaa 60 ggtaagtttt tcgtcggcgc cacagacctg tccgtcaaaa ataagagagg ccagaacatc 120 ggtaacgcac tgagcaacgt ccctatgatt gattttagtg tagcggacgt taataaacgg 180 attgcaaccg tcgttgatcc gcagtatgct gtcagcgtca aacatgctaa agcggaagtt 240 catacgttct attacgggca atataacggc cataacgatg tggctgataa agaaaatgaa 300 tatcgcgtgg tcgagcagaa caattacgaa ccgcacaaag cgtggggcgc gagtaattta 360 ggccgcctgg aggactataa catggcccgt ttcaataaat tcgtgaccga ggtagcaccg 420 atcgccccca cagatgctgg tgggggcctg gatacctaca aagataaaaa ccgcttctct 480 agcttcgtgc gcattggcgc cggtcgtcag ctcgtgtacg agaagggtgt ctatcaccag 540 gaaggtaatg aaaaggggta cgacctccgt gatttgtccc aggcgtatcg ctacgctatt 600 gccggaaccc cgtataaaga tattaatatc gatcaaacca tgaataccga aggcctaatt 660 ggtttcggga atcataataa gcaatatagc gcagaagagc taaagcaggc cctcagccaa 720 gatgcgttaa ccaattacgg agtgttaggc gatagcggca gtccgctgtt tgccttcgat 780 aaacagaaaa atcaatgggt gtttctgggc acttatgatt attgggccgg atatggtaaa 840 aagagctggc aggaatggaa tatttataaa aaggaattcg cagacaaaat caagcagcat 900 gacaacgcag gtacggtgaa ggggaacggc gaacatcact ggaagacgac cggcacgaat 960 agtcatatcg gatcgacggc cgttcgcctg gcgaacaatg agggcgatgc aaacaatggg 1020 caaaacgtga cctttgagga caacggtacc ctggtcctta accagaacat aaatcagggc 1080 gcgggaggct tgttctttaa aggcgactat actgttaagg gagcaaacaa tgacatcacc 1140 tggttagggg ccggtattga cgttgcggat ggaaaaaagg tggtttggca ggttaaaaac 1200 cctaacgggg accggctggc aaaaatcggc aaagggacat tggaaattaa tggtaccggt 1260 gtgaatcagg gtcagctgaa agtgggagat gggaccgtga ttctgaacca gaaagcagac 1320 gctgacaaaa aggtgcaagc ctttagccaa gtaggaattg ttagtggtcg tggcacactc 1380 gtcttgaact caagcaacca aataaatccg gataacctgt actttggatt tcgtggcgga 1440 cgcctggatg ctaacgggaa tgatctgacc tttgaacata tccgtaacgt tgacgagggt 1500 gcgcgcatag ttaatcataa tactgaccat gcatcaacta tcaccttgac cgggaaaagt 1560 ctgattacaa acccaaactc tctgtcagta cattccatcc agaatgatta tgatgaagac 1620 gattactcat actattaccg gccgcgtaga ccaattccac aaggtaaaga tctttattac 1680 aaaaattacc gttattacgc attaaaatcc ggagggcggc tgaatgcacc tatgccggaa 1740 aatggcgtgg ccgaaaacaa tgactggatt tttatgggtt atactcaaga agaggctcgc 1800 aaaaatgcaa tgaaccataa aaataaccga aggatcggtg atttcggcgg atttttcgat 1860 gaggaaaatg gtaaaggtca caatggtgcg ctgaatctaa attttaacgg caaaagtgcc 1920 cagaaacgtt tccttctgac tggtggcgct aatctgaatg gtaaaatcag tgtgacgcag 1980 ggtaacgtgc tgctttctgg ccggccaact ccgcatgcac gtgattttgt aaataaatcg 2040 agcgctcgta aagatgcgca tttttctaaa aataacgagg tcgtgtttga agatgactgg 2100 ataaatcgca cctttaaagc ggcagaaatc gcggttaatc agagtgcgag cttttcatcg 2160 ggtaggaatg tatctgatat tacagcaaac attacagcca ctgataatgc gaaggtcaac 2220 ctgggttata aaaacggtga tgaagtttgt gttcgatcgg attacacggg ctatgttacc 2280 tgcaacactg gcaatctgtc tgataaagcg cttaactctt ttgacgccac gcgcattaac 2340 gggaatgtga acctgaacca aaacgctgcc ttggtacttg gtaaggccgc gttgtggggt 2400 aaaattcagg gccagggcaa ctcccgtgtg tctctgaacc agcactcgaa gtggcacctg 2460 acgggggact cgcaggtgca caacttgtcc ctggccgata gccatattca ccttaacaat 2520 gcgtccgatg cccagtcagc taataaatat catacgatca aaatcaatca cctctctggc 2580 aacggtcact ttcactactt aacggattta gcaaaaaact taggggataa agtcctggta 2640 aaagaatcag cgagcggaca ttatcagtta catgtacaga acaaaacagg cgagccaaat 2700 caggaaggcc ttgacttatt tgatgcttca tcggtacaag atcgttccag actgttcgtt 2760 tcactcgcga atcactacgt tgatctgggt gcgctgcgct atactataaa gacggaaaat 2820 ggcataacac gcctctataa tccctatgcc ggtaacggcc gtccggtgaa acctgctccc 2880 tgcgtcgac 2889

<210> 75 <211> 4296 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 75 ggatccttgg tacgagatga cgttgactat caaattttcc gcgactttgc ggaaaataaa 60 ggtaagtttt tcgtcggcgc cacagacctg tccgtcaaaa ataagagagg ccagaacatc 120 ggtaacgcac tgagcaacgt ccctatgatt gattttagtg tagcggacgt taataaacgg 180 attgcaaccg tcgttgatcc gcagtatgct gtcagcgtca aacatgctaa agcggaagtt 240 catacgttct attacgggca atataacggc cataacgatg tggctgataa agaaaatgaa 300 tatcgcgtgg tcgagcagaa caattacgaa ccgcacaaag cgtggggcgc gagtaattta 360 ggccgcctgg aggactataa catggcccgt ttcaataaat tcgtgaccga ggtagcaccg 420 atcgccccca cagatgctgg tgggggcctg gatacctaca aagataaaaa ccgcttctct 480 agcttcgtgc gcattggcgc cggtcgtcag ctcgtgtacg agaagggtgt ctatcaccag 540 gaaggtaatg aaaaggggta cgacctccgt gatttgtccc aggcgtatcg ctacgctatt 600 gccggaaccc cgtataaaga tattaatatc gatcaaacca tgaataccga aggcctaatt 660 ggtttcggga atcataataa gcaatatagc gcagaagagc taaagcaggc cctcagccaa 720 gatgcgttaa ccaattacgg agtgttaggc gatagcggca gtccgctgtt tgccttcgat 780 aaacagaaaa atcaatgggt gtttctgggc acttatgatt attgggccgg atatggtaaa 840 aagagctggc aggaatggaa tatttataaa aaggaattcg cagacaaaat caagcagcat 900 gacaacgcag gtacggtgaa ggggaacggc gaacatcact ggaagacgac cggcacgaat 960 agtcatatcg gatcgacggc cgttcgcctg gcgaacaatg agggcgatgc aaacaatggg 1020 caaaacgtga cctttgagga caacggtacc ctggtcctta accagaacat aaatcagggc 1080 gcgggaggct tgttctttaa aggcgactat actgttaagg gagcaaacaa tgacatcacc 1140 tggttagggg ccggtattga cgttgcggat ggaaaaaagg tggtttggca ggttaaaaac 1200 cctaacgggg accggctggc aaaaatcggc aaagggacat tggaaattaa tggtaccggt 1260 gtgaatcagg gtcagctgaa agtgggagat gggaccgtga ttctgaacca gaaagcagac 1320 gctgacaaaa aggtgcaagc ctttagccaa gtaggaattg ttagtggtcg tggcacactc 1380 gtcttgaact caagcaacca aataaatccg gataacctgt actttggatt tcgtggcgga 1440 cgcctggatg ctaacgggaa tgatctgacc tttgaacata tccgtaacgt tgacgagggt 1500 gcgcgcatag ttaatcataa tactgaccat gcatcaacta tcaccttgac cgggaaaagt 1560 ctgattacaa acccaaactc tctgtcagta cattccatcc agaatgatta tgatgaagac 1620

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tgoíaacaetg gcaatctgtc tgataaagcg cttaactctt ttgacgccac gcgcattaac 2MD gggaabfbgá acctgaacca aaacgctgcc ttggtacttg gtaaggccgc gttgtpggggt 2400 aaaattcagg gccagggcaa ctcccgtgtg tet.etgaaee ageaetegfia gtggc&ectg 246Ô: acgggggact cgcaggtgca caacttgtcc etggeegatâ geGatattea eettaaeaat 2520 gegteegatg eecagtcagc taataaatat cataGgatca aaatcaatoa sctetGfcggG 2580 aacggtcact tteaetaett aacggattta gcaaaaaact taggggataa agtcctggta 2640 aaagaatcag cgagcggaca ttatcagtta catgtacaga acaaaacagg cgagccaaat 2700 caggaaggcc ttgacttaiet tgiatgettea beggtâéaâg' âtegttGçag aetgttGgtt 22:60 tcactcgcga ateaetaegt. tgatotgggt gegetgoget ataGtataaa gaeggaaaat 2:820 ggcataacac geetefcataa tceGtatgcG: ggtaaeggee gtceggtgaa aeetgctece 288:0 tgegtcgacg gcatcattac: ctecaaaaet aaatetetga feagaaggtag atttggeggt 2040 tteacgggcg eacgcaaatc agegegtaaa cgtaagaaesc aggsgetage gggeggtgga 3000 ggtagcggcg gtggcggtsg cggcggtgge: ggtagegeae. bagtgctgsa gtgtatcaag 3:060 gttaaeaaefc gggatttatt ettcãgGGcg agtgaafaea acttcaccaa egaeetgaae 3120 aaaggtgaag aaatcacctc agatactaac ategaageag pcgaagaaaa cafcetcsgefcg 3:1:80 gacetgatee agcagLacta CGtgaccttt aatttcgaea aegageegga. aaacatttct 32:40 ategaaaacc' tgagctetga tateategge. eagctggaac tgatgeegaa. catcgaaegt 3:3:00 ttGccaaaGg gtaaaaagta. egagetggac. aaatatacca tgttecacta ectgegGgGg 3:360 caggaatttg aacacggcaa ateeogtate gcaetgaeta. aetGegttaa cgaagctctg 3420 ctcaacccgt cccgtgtata caccttcttc tctagcgact acgtgaaaaa ggtcaacaaa 3480 gcgactgaag ctgcaatgtt cttgggttgg gttgaacagc ttgtttatga ttttaccgac 3540 gagaegteeg aagtatctac taccgacaaa attgeggata tcactatcat catcccgtac 3600 ateggteegg ctctgaacat tggcaacatg, ctgtacaaag aegaettegt tggcgcactg 3660 atcttctccg gtgcggtgat cctgctggag ttcatcccgg aaatcgccat cccggtactg 3720 ggcacctttg ctctggtttc ttacattgca aacaaggttc tgactgtaca aaccatcgac 3780 aacgcgctga gcaaacgtaa cgaaaaatgg gatgaagttt acaaatatat cgtgaccaac 3840 tggctggcta aggttaatac tcagatcgac ctcatccgca aaaaaatgaa agaagcactg 3900 gaaaaccagg cggaagctac caaggcaatc attaactacc agtacaacca gtacaccgag 3960 gaagaaaaaa acaacatcaa cttcaacatc gacgatctgt cctctaaact gaacgaatcc 4020 atcaacaaag ctatgatcaa catcaacaag ttcctgaacc agtgctctgt aagctatctg 4080 atgaactcca tgatcccgta cggtgttaaa cgtctggagg acttcgatgc gtctctgaaa 4140 gacgccctgc tgaaatacat ttacgacaac cgtggcactc tgatcggtca ggttgatcgt 4200 ctgaaggaca aagtgaacaa taccttatcg accgacatcc cttttcagct cagtaaatat 4260 gtcgataacc aacgcctttt gtccactcta gactag 4296

<210> 76 <211> 1431 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 76 #l,y ;S;er Leu 3%2. Arg Asp Asp: ^al Asp Tyr Gin τ e Phe Arg Asp Ph© 1 5 10 15

Ala Glu. Asn Ays Sly Lys Phe Bhe ¥al Gl^ Ala Thr Asp .Leu Sex Val 20 |5 " |-p:

Lys Asn Ays’Arg Gly Gin Asia lie Sly Asn Ala Leu Set Asn ¥al B.rp 35: 40 4 5

Met He Asp Phe Sex ¥a.l Ala Asp :¥al Asn Lys Arg lie Ala Thr ¥al m 5.5 50

Vai As:f> Pr© Gift Tyr Ala Vâl Sèr Vai Lys His Ala Ly'S Ala Gift. Vai 65 70 75 80

His Thr She Tyr Tyr Gly Gin. Tyr Asn Gly His Asn Agp Vai Ala Asp 85 90 95

Lys Gift Agft Gift Tyr Arg vai vai Glu Gift: Asft A&ft Tyr Glu Pr© His 10:0 105 110

Lys Ala. Trp Gly Alá Ser As π L^a Gly Arg Léu Gift Asp Tyr· Asn. Mét 1.15 12 0 125

Ala Arg She Asn Lys Piie: Vai Thr Glu Vai Ala Sro Ile Ala Pr© Thr 13® 1.3:3 14 0:

Asp Ala Gly Gly Gly Leu Asp Thr Tyr Lys Asp Lys Asn Arg Phe Ser 145 150 155 160

Ser Phe: Vai Arg II e Gly Ala Gly Arg Gin 'Leu Vâl Tyr Glu Lys Gly 165 170 175

Vai Tyr His Gin Glu Gly Asn Glu Lys Gly Tyr Asp Leu Arg Asp Leu 180 185 190

Ser Gin Ala Tyr Arg Tyr Ala lie Ala Gly Thr Pro Tyr Lys Asp Ile 195 200 205

Asn lie Asp Gin Thr Met Asn Thr Glu Gly Leu Ile Gly Phe Gly Asn 210 215 220

His Asn Lys Gin Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Lys Gin Ala Leu Ser Gin 225 230 235 240

Asp Ala Leu Thr Asn Tyr Gly Vai Leu Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu 245 250 255

Phe Ala Phe Asp Lys Gin Lys Asn Gin Trp Val Phe Leu Gly Thr Tyr 260 265 270

Asp Tyr Trp Ala Gly Tyr Gly Lys Lys Ser Trp Gin Glu Trp Asn lie 275 280 285

Tyr Lys Lys Glu Phe Ala Asp Lys lie Lys Gin His Asp Asn Ala Gly 290 295 300

Thr Val Lys Gly Asn Gly Glu His His Trp Lys Thr Thr Gly Thr Asn 305 310 315 320

Ser His lie Gly Ser Thr Ala Val Arg Leu Ala Asn Asn Glu Gly Asp 325 330 335

Ala Asn Asn Gly Gin Asn Val Thr Phe Glu Asp Asn Gly Thr Leu Val 340 345 350

Leu Asn Gin Asn lie Asn Gin Gly Ala Gly Gly Leu Phe Phe Lys Gly 355 360 365

Asp Tyr Thr Val Lys Gly Ala Asn Asn Asp He Thr Trp Leu Gly Ala 370 375 380

Gly lie Asp Val Ala Asp Gly Lys Lys Val Val Trp Gin Val Lys Asn 385 390 395 400

Pro Asn Gly Asp Arg Leu Ala Lys He Gly Lys Gly Thr Leu Glu He 405 410 415

Asn Gly Thr Gly Val Asn Gin Gly Gin Leu Lys Val Gly Asp Gly Thr 420 425 430

Val He Leu Asn Gin Lys Ala Asp Ala Asp Lys Lys Val Gin Ala Phe 435 440 445

Ser Gin Val Gly He Val Ser Gly Arg Gly Thr Leu Val Leu Asn Ser 450 455 460

Ser Asn Gin lie Asn Pro Asp Asn Leu Tyr Phe Gly Phe Arg Gly Gly 465 470 475 480

Arg Leu Asp Ala Asn Gly Asn Asp Leu Thr Phe Glu His Ile Arg Asn 485 490 495

Vai Asp Glu Gly Ala Arg lie Vai Asn His Asn Thr Asp His Ala Ser 500 505 510

Thr Ile Thr Leu Thr Gly Lys Ser Leu lie Thr Asn Pro Asn Ser Leu 515 520 525

Ser Vai His Ser Ile Gin Asn Asp Tyr Asp Glu Asp Asp Tyr Ser Tyr 530 535 540

Tyr Tyr Arg Pro Arg Arg Pro lie Pro Gin Gly Lys Asp Leu Tyr Tyr 545 550 555 560

Lys Asn Tyr Arg Tyr Tyr Ala Leu Lys Ser Gly Gly Arg Leu Asn Ala 565 570 575

Pro Met Pro Glu Asn Gly Val Ala Glu Asn Asn Asp Trp Ile Phe Met 580 585 590 :Gly Tyr Thr Gin Gin Glu Ala Arg Lys Asn Ala Met Asn His Lys Asn 595 600 605

Asn Arg Arg lie Gly Asp· Phe Gly Gly Phe Phe Asp Glu Glu Ash Gly 610 615 €20

Lys Sly His Asn Gly Ala Leu Asn Leu Asn Phe Asn Gly Lys Ser Ala 625: 630 6,35: 64 0

Gin Lys: Arg Phe Leu Leu Thr Gly Gly Ala Asn Leu Asn Gly Lys lie 645 650 655

Ser Val Thr Gin Gly Asn Val Leu Leu Ser Gly Arf Pr© Thr Pro His 660 ’ 665 6/0

Ala Arg Asp Phe Val Asn Lys Ser Ser Ala Arg Lys Asp Ala His Phe 675 680 685

Ser Lys Asn Asn Glu Val Val Phe Glu Asp Asp Trp lie Asn Arg Thr 690 695 700

Phe Lys Ala Ala Glu lie Ala Val Asn Gin Ser Ala Ser Phe Ser Ser 705 710 715 720

Gly Arg Asn Val Ser Asp lie Thr Ala Asn lie Thr Ala Thr Asp Asn 725 730 735

Ala Lys Val Asn Leu Gly Tyr Lys Asn Gly Asp Glu Val Cys Val Arg 740 745 750

Ser Asp Tyr Thr Gly Tyr Val Thr Cys Asn Thr Gly Asn Leu Ser Asp 755 760 765

Lys Ala Leu Asn Ser Phe Asp Ala Thr Arg lie Asn Gly Asn Val Asn 770 775 780

Leu Asn Gin Asn Ala Ala Leu Val Leu Gly Lys Ala Ala Leu Trp Gly 785 790 795 800

Lys lie Gin Gly Gin Gly Asn Ser Arg Val Ser Leu Asn Gin His Ser 805 810 815

Lys Trp His Leu Thr Gly Asp Ser Gin Val His Asn Leu Ser Leu Ala 820 825 830

Asp Ser His lie His Leu Asn Asn Ala Ser Asp Ala Gin Ser Ala Asn 835 840 845

Lys Tyr His Thr lie Lys lie Asn His Leu Ser Gly Asn Gly His Phe 850 855 860

His Tyr Leu Thr Asp Leu Ala Lys Asn Leu Gly Asp Lys Val Leu Val 865 870 875 880

Lys Glu Ser Ala Ser Gly His Tyr Gin Leu His Val Gin Asn Lys Thr 885 890 895

Gly Glu Pro Asn Gin Glu Gly Leu Asp Leu Phe Asp Ala Ser Ser Val 900 905 910

Gin Asp Arg Ser Arg Leu Phe Val Ser Leu Ala Asn His Tyr Val Asp 915 920 925

Leu Gly Ala Leu Arg Tyr Thr lie Lys Thr Glu Asn Gly lie Thr Arg 930 935 940

Leu Tyr Asn Pro Tyr Ala Gly Asn Gly Arg Pro Val Lys Pro Ala Pro 945 950 955 960

Cys Val Asp Gly lie lie Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu lie Glu Gly 965 970 975

Arg Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Arg Lys 980 985 990

Asn Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 995 1000 1005

Gly Gly Gly Ser Ala Leu Val Leu Gin Cys lie Lys Val Asn Asn 1010 1015 1020

Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp 1025 1030 1035

Leu Asn Lys Gly Glu Glu lie Thr Ser Asp Thr Asn lie Glu Ala 1040 1045 1050

Ala Glu Glu Asn lie Ser Leu Asp Leu lie Gin Gin Tyr Tyr Leu 1055 1060 1065

Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn lie Ser lie Glu Asn 1070 1075 1080

Leu Ser Ser Asp lie lie Gly Gin Leu Glu Leu Met Pro Asn lie 1085 1090 1095 |

Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr 1100 1105 1110

Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gin Glu Phe Glu His Gly Lys Ser 1115 1120 1125

Arg lie Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro 1130 1135 1140

Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys Lys Val 1145 1150 1155

Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu Gin 1160 1165 1170

Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr 1175 1180 1185

Asp Lys lie Ala Asp lie Thr lie lie He Pro Tyr lie Gly Pro 1190 1195 1200

Ala Leu Asn He Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly 1205 1210 1215

Ala Leu lie Phe Ser Gly Ala Val lie Leu, Leu Glu Phe lie Pro 1 z0 1225 1230

Glu lie Ala lie Pro Val Leu Gly Thr Phe Àla Leu Val Gar" Tyr 1235 1240 1245

He Ala Asn Lys: Val Leu Thr Val Gin Thr He Asp Asn Ala Leu 1250 1255 12*0

Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Vai Tyr Lys Tyr Ile Vai 1255 1270 1275

Thr Asn Trp Leu Ala Lys. Vai Asn Thr Gin lie Asp Leu Ile Arg 1280 1285 1290

Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala Glu Ala Thr Lys 1295 1300 1305

Ala Ile Ile Asn Tyr Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu Glu Glu Lys 1310 1315 1320

Asn Asn lie Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn 1325 1330 1335

Glu Ser lie Asn Lys Ala Met lie Asn lie Asn Lys Phe Leu Asn 1340 1345 1350

Gin Cys Ser Vai Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met lie Pro Tyr Gly 1355 1360 1365

Vai Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu 1370 1375 1380

Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gin Vai 1385 1390 1395

Asp Arg Leu Lys Asp Lys Vai Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile 1400 1405 1410

Pro Phe Gin Leu Ser Lys Tyr Vai Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser 1415 1420 1425

Thr Leu Asp 1430 <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 77 <211> 1357 <212> ADN <223> Sintética <400> 77 gctagcgggc ggtggcggta gcggcggtgg cggtagcggc ggtggcggta gcgcactagt 60 gctgcagtgt atcaaggtta acaactggga tttattcttc agcccgagtg aagacaactt 120 caccaacgac ctgaacaaag gtgaagaaat cacctcagat actaacatcg aagcagccga 180 agaaaacatc tcgctggacc tgatccagca gtactacctg acctttaatt tcgacaacga 240 gccggaaaac atttctatcg aaaacctgag ctctgatatc atcggccagc tggaactgat 300 gccgaacatc gaacgtttcc caaacggtaa aaagtacgag ctggacaaat ataccatgtt 360 ccactacctg cgcgcgcagg aatttgaaca cggcaaatcc cgtatcgcac tgactaactc 420 cgttaacgaa gctctgctca acccgtcccg tgtatacacc ttcttctcta gcgactacgt 480 gaaaaaggtc aacaaagcga ctgaagctgc aatgttcttg ggttgggttg aacagcttgt 540 ttatgatttt accgacgaga cgtccgaagt atctactacc gacaaaattg cggatatcac 600 tatcatcatc ccgtacatcg gtccggctct gaacattggc aacatgctgt acaaagacga 660 cttcgttggc gcactgatct tctccggtgc ggtgatcctg ctggagttca tcccggaaat 720 cgccatcccg gtactgggca cctttgctct ggtttcttac attgcaaaca aggttctgac 780 tgtacaaacc atcgacaacg cgctgagcaa acgtaacgaa aaatgggatg aagtttacaa 840 atatatcgtg accaactggc tggctaaggt taatactcag atcgacctca tccgcaaaaa 900 aatgaaagaa gcactggaaa accaggcgga agctaccaag gcaatcatta actaccagta 960 caaccagtac accgaggaag aaaaaaacaa catcaacttc aacatcgacg atctgtcctc 1020 taaactgaac gaatccatca acaaagctat gatcaacatc aacaagttcc tgaaccagtg 1080 ctctgtaagc tatctgatga actccatgat cccgtacggt gttaaacgtc tggaggactt 1140 cgatgcgtct ctgaaagacg ccctgctgaa atacatttac gacaaccgtg gcactctgat 1200 cggtcaggtt gatcgtctga aggacaaagt gaacaatacc ttatcgaccg acatcccttt 1260 tcagctcagt aaatatgtcg ataaccaacg ccttttgtcc actctagaaa tagaaggtag 1320 aagtgggcac catcaccatc accattaatg aaagctt 1357

<210> 78 <211> 2745 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 78 ggatccatgg agttcgttaa caaacagttc aactataaag acccagttaa cggtgttgac 60 attgcttaca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgcagc cggtaaaggc attcaaaatc 120 cacaacaaaa tctgggttat cccggaacgt gataccttta ctaacccgga agaaggtgac 180 ctgaacccgc caccggaagc gaaacaggtg ccggtatctt actatgactc cacctacctg 240 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatoctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcqaag aactgcgtac ttttqgcqgt cacgacgcta aattcatcqa ctctctqcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaacgtaaga accaggcgct agcgggcggt ggcggtagcg gcggtggcgg tagcggcggt 1440 ggcggtagcg cactagtgct gcagtgtatc aaggttaaca actgggattt attcttcagc 1500 ccgagtgaag acaacttcac caacgacctg aacaaaggtg aagaaatcac ctcagatact 1560 aacatcgaag cagccgaaga aaacatctcg ctggacctga tccagcagta ctacctgacc 1620 tttaatttcg acaacgagcc ggaaaacatt tctatcgaaa acctgagctc tgatatcatc 1680 ggccagctgg aactgatgcc gaacatcgaa cgtttcccaa acggtaaaaa gtacgagctg 1740 gacaaatata ccatgttcca ctacctgcgc gcgcaggaat ttgaacacgg caaatcccgt 1800 atcgcactga ctaactccgt taacgaagct ctgctcaacc cgtcccgtgt atacaccttc- 1860 ttctctagcg actacgtgaa aaaggtcaac aaagcgactg aagctgcaat gttcttgggt 1920 tgggttgaac agcttgttta tgattttacc gacgagacgt ccgaagtatc tactaccgac 1980 aaaattgcgg atatcactat catcatcccg tacatcggtc cggctctgaa cattggcaac 2040 afcggtgfcaea gsga:©gae:tt cgt'tggcgGa Gfegatsttoct eeggtgeggt gafcectgetg 2:100 gagtliGàteG; Gggaag.fecg.e eat-cGGggtà Gtgggoftcel; -ttgGtetggt ttettacatt 2,160 gcaaacaagg ttctgactgt agaaaéçafce gacaacgcgc iggagcaaaGg taaGgaaaaa 222 0 tgggatgaag fcttaoaaata tatcgtgacc aactggctgg etaaggfetsa tacfeGagafg 2280 gacsteatcG geaaaaaaat gaaagaagG-a etggaaaaeG aggcggaagc taGGaaggea 2:340 .atcattaac.t accsgtacaa ceagtacacc gaggaagaaa aaaacaacat eaacfcteaa® 2400 atcgasgatc fegtocfeataa actgaaogaa tssatGaaca aagctatgat caa.cat.eaac 24:60 aagttcctga aeeagtgGtG: tgtaagGtiat· ctgatgaact GGatgatGGC gtacggtgfct 2:52-0 aaacgtctgg aggaãfcGçgg tgcgtctclg aaagacgccc fegctgaaata catttacgac 2580 aaecgtggGa GtGtgatcgg tGaggttgat ggtGtg&agg àGãaâgGgaá çàataGGfeta 2640 tagacegasa tcGcttfetca gcfcaagtaa-a tatgtegata acGaacgesà tttgtcsatót 2100 otagaaatag aaggtagaag tgggcaeeat oaoeatoaoc attaa 274$:

<210> 79 <211> 914 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 79

Gly Ser Met Glu Phe Val Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val 15 10 15

Asn Gly Val Asp lie Ala Tyr lie Lys lie Pro Asn Ala Gly Gin Met 20 25 30

Gin Pro Val Lys Ala Phe Lys lie His Asn Lys He Trp Val lie Pro 35 40 45

Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro 50 55 60

Pro Glu Ala Lys Gin Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu 65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu 85 90 95 iphe. Glu Arg H® Tyr Her Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu: Thr Ser 100 105 1I0:

He Val Ara Gly' llê ppp Phe Trp Gly Gly 8<sr Thr He Asp- Thr Glu 115 120 125

Leu Lys Val lie Asp Thr Asn Cys lie Asn Val lie Gin Pro Asp Gly 130 135 140

Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val lie lie Gly Pro Ser Ala 145 150 155 160

Asp lie lie Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn 165 170 175

Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr lie Arg Phe Ser Pro 180 185 190

Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro 195 200 205

Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala 210 215 220

His Glu Leu lie His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly lie Ala lie Asn 225 230 235 240

Pro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 245 250 255

Gly Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 260 265 270

Ala Lys Phe lie Asp Ser Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr 275 280 285

Tyr Asn Lys Phe Lys Asp lie Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser 290 295 300 lie Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gin Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys 305 310 315 320

Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp 325 330 335

Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu He Tyr Thr 340 345 350

Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr 355 360 365

Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys lie Asn He Val Pro Lys Val 370 375 380

Asn Tyr Thr He Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 385 390 395 400

Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu He Asn Asn Met Asn Phe Thr 405 410 415

Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 420 425 430

Val Asp Gly He He Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu lie Glu Gly Arg 435 440 445

Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Arg Lys Asn 450 455 460

Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480

Gly Gly Ser Ala Leu Val Leu Gin Cys He Lys Val Asn Asn Trp Asp 485 490 495

Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys 500 505 510

Gly Glu Glu He Thr Ser Asp Thr Asn He Glu Ala Ala Glu Glu Asn 515 520 525

He Ser Leu Asp Leu He Gin Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp 530 535 540

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Gl.y Gin Leu Glu Leu Met Pr© -Asn lie Glu Ar§' phe Pro Asn Gly Lys 565 570 575

Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Set PAe Bis Tyr Leu Ar§ Ala Gin 5bQ ,585: 590

Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg 11©' Al&: Leu Thr Asn Ser Uai Asn 595 600 605

Glu Ala Leu Leu Asn, Pro Ser Arg; Uai Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp 610: 615 620

Tyr Vai Lys Lys Vai, Asn Lys Ala, Tkr Glu Ala Ala, Met Phe Leu Gly 625 630 635 640

Trp. VAX Giui Gin Leu Vai Tyr A.s,p· Phe Thr Asp; Glu Thr Ser Glu Vál 645 650 655

Ser- Thr Thr Asp Lys lie Ala Asp Ile Thr lie lie lie Pro Tyr- He 660 665 670

Gly Pro Ala LèU Asn Ile Gly- Asn Met: Leu Tyr Lys Asp Asp: Phe Vai 675 68 Q 685

Gly Ala Leu He Phe Ser' Gly Ala Vai Tie Leu Leu Glu Phe LI© Pro 690 696 700

Glu lie: Ala lie Pro Vai Leu Gly Thr Phe Ala Leu Vai Ser Tyr Ile 705 710 715 720

Ala Asn Lys Vai. Leu. Thr Vai Gin, Thr Ile Asp Á:s.n Ala L.eu Ser Lys 726 - 730 735 Árg Asn Glu Lys Trp- Asp Glu Vai Tyr Lys Tyr lie Vai Thr Asn. Trp 740 745 750:

Leu Ala Lys Val Asn Thr Gin lie Asp Leu lie Arg Lys Lys Met Lys 755 760 765

Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala Glu Ala Thr Lys Ala lie lie Asn Tyr 770 775 780

Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn lie Asn Phe Asn 785 790 795 800 lie Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser lie Asn Lys Ala Met 805 810 815 lie Asn lie Asn Lys Phe Leu Asn Gin Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met 820 825 830

Asn Ser Met lie Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala 835 840 845

Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr lie Tyr Asp Asn Arg Gly Thr 850 855 860

Leu lie Gly Gin Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu 865 870 875 880

Ser Thr Asp lie Pro Phe Gin Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gin Arg 885 890 895

Leu Leu Ser Thr Leu Glu lie Glu Gly Arg Ser Gly His His His His 900 905 910

His His

<210> 80 <211> 619 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 80 gctagcgggc ggtggcggta gcggcggtgg cggtagcggc ggtggcggta gcgcactagt 60 gctgcagtgt atcaatctgg attgggacgt aatccgtgat aagaccaaaa caaaaatcga 120 gtctttgaaa gaacacggcc cgatcaaaaa taagatgtct gaatcaccca ataaaactgt 180 ttcggaggaa aaagcgaaac agtatttgga agagtttcat caaaccgcgc ttgaacatcc 240 ggagctcagt gaactgaaaa cagtgacggg aacgaatcct gtttttgcag gcgcaaacta 300 tgcggcttgg gccgtgaatg ttgcccaagt aattgatagt gagaccgcag acaacctgga 360 aaagacgacc gcagcgttaa gcattttacc ggggattggt tccgtgatgg gtatagcgga 420 tggagcggtc caccataaca ctgaggaaat tgtcgcccag tcaatcgctc tgagttccct 480 gatggttgca caggctatcc cactcgtggg ggaactggtt gacataggtt tcgccgccta 540 caacttcgta gaaagcatta ttaatctttt tcaggtggtg cataacagct acaaccgccc 600 tctagaatga taaaagctt 619

<210> 81 <211> 1971 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 81 >ggateeatgg agttegttaa çaaàcagtte aâqfataáag accqagttM tggtgtfg&é· 60 attgc.tta.ca tcaaaatccc gaacgctggc cagatgeagc eggtaaagge atfceaaaatc 120 cáGâacaaaa tctgggttat cccggaaegt gataccttta c.taaccegga agaaggtgac 180 ctgaacccgc çacçggaage· gaaacaggt.g gcgf.tatctt actatgacfcG ;C:a,cctac-.ctg 2:40 tctaccgata acgaaaagga caactacctg aaaggtgtta ctaaactgtt cgagcgtatt 300 tactccaccg acctgggccg tatgctgctg actagcatcg ttcgcggtat cccgttctgg 360 ggcggttcta ccatcgatac cgaactgaaa gtaatcgaca ctaactgcat caacgttatt 420 cagccggacg gttcctatcg ttccgaagaa ctgaacctgg tgatcatcgg cccgtctgct 480 gatatcatcc agttcgagtg taagagcttt ggtcacgaag ttctgaacct cacccgtaac 540 ggctacggtt ccactcagta catccgtttc tctccggact tcaccttcgg ttttgaagaa 600 tccctggaag tagacacgaa cccactgctg ggcgctggta aattcgcaac tgatcctgcg 660 gttaccctgg ctcacgaact gattcatgca ggccaccgcc tgtacggtat cgccatcaat 720 ccgaaccgtg tcttcaaagt taacaccaac gcgtattacg agatgtccgg tctggaagtt 780 agcttcgaag aactgcgtac ttttggcggt cacgacgcta aattcatcga ctctctgcaa 840 gaaaacgagt tccgtctgta ctactataac aagttcaaag atatcgcatc caccctgaac 900 aaagcgaaat ccatcgtggg taccactgct tctctccagt acatgaagaa cgtttttaaa 960 gaaaaatacc tgctcagcga agacacctcc ggcaaattct ctgtagacaa gttgaaattc 1020 gataaacttt acaaaatgct gactgaaatt tacaccgaag acaacttcgt taagttcttt 1080 aaagttctga accgcaaaac ctatctgaac ttcgacaagg cagtattcaa aatcaacatc 1140 gtgccgaaag ttaactacac tatctacgat ggtttcaacc tgcgtaacac caacctggct 1200 gctaatttta acggccagaa cacggaaatc aacaacatga acttcacaaa actgaaaaac 1260 ttcactggtc tgttcgagtt ttacaagctg ctgtgcgtcg acggcatcat tacctccaaa 1320 actaaatctc tgatagaagg tagatacggt ggtttcctgg cgctagcggg cggtggcggt 1380 agcggcggtg gcggtagcgg cggtggcggt agcgcactag tgctgcagtg tatcaatctg 1440 gattgggacg taatccgtga taagaccaaa acaaaaatcg agtctttgaa agaacacggc 1500 ccgatcaaaa ataagatgtc tgaatcaccc aataaaactg tttcggagga aaaagcgaaa 1560 cagtatttgg aagagtttca tcaaaccgcg cttgaacatc cggagctcag tgaactgaaa 1620 acagtgacgg gaacgaatcc tgtttttgca ggcgcaaact atgcggcttg ggccgtgaat 1680 gttgcccaag taattgatag tgagaccgca gacaacctgg aaaagacgac cgcagcgtta 1740 agcattttae: cggggattgg ttccgtgatg ggfcatagcgg atggagoggt ocaccafcaatí IQ 00 aGtgaggaaa fctgfesgoeca gfccaatgggt -etgàgttcGé :tgatgf:ttge a:caggc;ta't<g IS 6© ccactcgtgg gggaactggt tgacataggt ttcgccgcct acaacttcgt agaaagcatt 1920 attaatcttt ttcaggtggt gcataacagc tacaaccgcc ctctagaatg a 1971

<210> 82 <211> 656 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 82

Gly Ser Met. Glu phe Ifal Asn Lys Gin Phe Asn Tyr Lys Asp Pro W1 1 5 10 15

Asm Gly ¥al. Asp. lie Ala Tyr lie Lys lie PrP Asm Ala Gly Gin Met. 20 25 30

Gin Pro ¥al. Lys Ale Phe Lys lie Mis Asm Lys lie Trp ¥ãl lie Pro 35 40 45

Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Lem Asn Pro: Pro 50 55 60

Pro; Glu Ala Lys Gin. ¥al Pro ¥a.l Ser Tyr- Tyr Asp Se.r Thr Tyr Leu 65: 70 lc 80

Set :®hf· Asp Asm Glu Lys Asp Asm Tyr Leu Lys Gly 7ml Thr Ly:s leu P5 90 95

Bihe Glu. Arg lie Tyr Ser Thr: Asp Leu Gly Arg Met. Leu Leu Thr Ser 100: 1:05 " 110 lie. 7al Arc? Gly lie Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr lie Asp Thr Glu 115 120 125

Leu Lys Val lie Asp Thr Asn Cys lie Asn Val lie Gin Pro Asp Gly 130 135 140

Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val lie lie Gly Pro Ser Ala 145 150 155 150

Asp lie lie Gin Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn 165 170 175

Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gin Tyr He Arg Phe Ser Pro 180 185 190

Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro 195 200 205

Leu .Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala 210 215 220

His Glu Leu lie His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly lie Ala He Asn 225 230 235 240

Pro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser 245 250 255

Gly Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp 260 265 270

Ala Lys Phe He Asp Ser Leu Gin Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr 275 280 285

Tyr Ash: Lys Phe Lys Asp He Ala Sex Thr Leu Asn Lys Ala. Lys Ser 290: 2 95 300

He Val Gly Thr Thr Ala. Ser Leu Gin, Tyx Meh Lys Asn Val Phe Lys? 305 3:10 315 320

Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp 325 330 335

Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu lie Tyr Thr 340 345 350

Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr 355 360 365

Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys lie Asn lie Val Pro Lys Val 370 375 380

Asn Tyr Thr lie Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala 385 390 395 400

Ala Asn Phe Asn Gly Gin Asn Thr Glu lie Asn Asn Met Asn Phe Thr 405 410 415

Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys 420 425 430

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Val Leu Gin Cys lie Asn Leu 465 470 475 480

Asp Trp Asp Val lie Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys lie Glu Ser Leu 485 490 495

Lys Glu His Gly Pro lie Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys 500 505 510

Thr Vai Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gin Tyr Leu Glu Glu Phe His Gin 515 520 525

Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Vai Thr Gly 530 535 540

Thr Asn Pro Vai Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Vai Asn 545 550 555 560

Vai Ala Gin Vai lie Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr 565 570 575

Thr Ala Ala Leu Ser lie Leu Pro Gly Ile Gly Ser Vai Met Gly Ile 580 585 590

Ala Asp Gly Ala Vai His His Asn Thr Glu Glu Ile Vai Ala Gin Ser 595 600 605

Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Vai Ala Gin Ala lie Pro Leu Vai Gly 610 615 620

Glu Leu Vai Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Vai Glu Ser Ile 625 630 635 640

Ile Asn Leu Phe Gin Vai Vai His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Leu Glu 645 650 655

<210> 83 <211> 1329 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <4Ο0> 83 ggatccatgc ctattactat taacaatttt cgttatagcg atcccgtcaa caatgacacc 60 attatcatga tggaaccgcc atattgcaaa ggactggaca tttactataa agccttcaag 120 attactgacc gcatttggat tgttccagag cgttacgagt tcgggacgaa accagaagat 180 tttaacccgc cttcatcgct gatcgaagga gcatcagagt attacgatcc gaactatctg 240 cgtacggaca gcgataaaga ccgcttctta cagaccatgg tcaaactttt taaccgtatt 300 aagaacaatg tggccggaga agcactcttg gataagatta tcaacgcgat tccatacctg 360 ggcaattctt acagcctgct ggataaattt gacacaaata gtaattcagt cagctttaac 420 ctgttagaac aagatccgag tggcgcaacc acgaagtctg ccatgctgac aaatctgatc 480 atttttggtc caggtcctgt actgaataaa aatgaagtac gcggcatcgt tctccgcgtg 540 gacaataaga actacttccc atgccgtgac ggcttcggtt cgatcatgca gatggctttc 600 tgtccggagt acgttccgac gtttgataat gttattgaga atatcacgag tttaacaatc 660 ggtaagtcaa aatattttca agatccggcc cttctcctta tgcatgaact gattcacgtg 720 ctgcacggct tatatggtat gcaagtgtcc tcgcatgaaa tcattccgtc caaacaggaa 780 atttatatgc agcataccta cccgatttca gctgaagagt tgtttacgtt tggtggccag 840 gacgcgaatt tgatctccat cgacatcaaa aacgatctgt atgagaaaac attaaatgac 900 tataaagcga ttgcgaacaa actgtctcag gtgactagct gcaacgatcc taacattgat 960 attgattcct acaaacaaat ttatcaacag aaataccagt tcgataaaga cagcaatggt 1020 cagtatatcg taaacgaaga taaatttcag atcctgtata acagcattat gtatggcttt 1080 accgaaattg agttggggaa gaaatttaac attaaaaccc gtctgtctta ttttagtatg 1140 aaccatgatc cggtgaaaat ccccaatctg cttgatgata ccatttatáa tgataccgaa 1200 gggttcaaca ttgaatctaa ggatctgaaa tccgaataca aaggccaaaa tatgcgtgtt 1260 aatactaacg ctttccgtaa tgttgatggt agtggactcg tctcgaaact gattgggttg 1320 tgtgtcgac 1329

<210> 84 <211> 2736 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 84 ggatccatgc ctattactat taacaatttt cgttatagcg atcccgtcaa caatgacacc 60 attatcatga tggaaccgcc atattgcaaa ggactggaca tttactataa agccttcaag 120 attactgacc gcatttggat tgttccagag cgttacgagt tcgggacgaa accagaagat 180 tttaacccgc cttcatcgct gatcgaagga gcatcagagt attacgatcc gaactatctg 240 cgtacggaca gcgataaaga ccgcttctta cagaccatgg tcaaactttt taaccgtatt 300 aagaacaatg tggccggaga agcactcttg gataagatta tcaacgcgat tccatacctg 360 ggcaattctt acagcctgct ggataaattt gacacaaata gtaattcagt cagctttaac 420 ctgttagaac aagatccgag tggcgcaacc acgaagtctg ccatgctgac aaatctgatc 480 atttttggtc caggtcctgt actgaataaa aatgaagtac gcggcatcgt tctçcgcgtg 540 gacaataaga actacttccc atgccgtgac ggcttcggtt cgatcatgca gatggctttc 600 tgtccggagt acgttccgac gtttgataat gttattgaga atatcacgag tttaacaatc 660 ggtaagtcaa aatattttca agatccggcc cttctcctta tgcatgaact gattcacgtg 720 ctgcacggct tatatggtat gcaagtgtcc tcgcatgaaa tcattccgtc caaacaggaa 780 atttatatgc ageataccta cecgatttca gctgaagagt: tgttfcacgtt tggtggoeag· S40'

gaggçgaatt tgatetgcafc ggaGatcaga aaGgatGtgf afegagaa.a.á<3 af.taaatgac 90 O tataaaggga ttgcgaacaa actgtctcag gtgactagct gcaacgatcc taacattgat 96u attga.ttccÊ acaaacaaat ttatcaacag aaà.tacGâgt tégatáaagà cagcaatggt 1020 cagtatatcg taaacgsaga taaattfcoag atcctgtata aeagGattat gtatggcttr 1180 accgaaattg agttggggaa gaaattta-ac attaaaaccc: gtctgtctta ttttagta.tg 114-0 aaccatgatc cggtgaaaat Gcccaatctg cttgatgata ccattfcataa tgatacEgaa 1.210 gggttcaaca ttgaatctaa ggatctgaaa tccgaataca aaggccaaaa tatgcgtgtt 12:00 aatactaacg ctttccgtaa tgttgatggt agtggactcg tctcgaaact gattgggtfeg 1321 tgtgtcgacg gcatcattac ctccaaaact aaatctctga tagaaggtag atttggcggt 1380 ttcacgggcg cacgcaaatc agcgcgtaaa cgtaagaacc aggcgctagc gggcggtggc 1440 ggtagcggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcgcac tagtgctgca gtgtatcaag 1500 gttaacaact gggatttatt cttcagcccg agtgaagaca acttcaccaa cgacctgaac 1560 aaaggtgaag aaatcacctc agatactaac atcgaagcag ccgaagaaaa catctcgctg 1620 gacctgatcc agcagtacta cctgaccttt aatttcgaca acgagccgga aaacatttct 1680 atcgaaaacc tgagctctga tatcatcggc cagctggaac tgatgccgaa catcgaacgt 1740 ttcccaaacg gtaaaaagta cgagctggac aaatatacca tgttccacta cctgcgcgcg 1800 caggaatttg aacacggcaa atcccgtatc gcactgacta actccgttaa cgaagctctg 1860 ctcaacccgt cccgtgtata caccttcttc tctagcgact acgtgaaaaa ggtcaacaaa 1920 gcgactgaag ctgcaatgtt cttgggttgg gttgaacagc ttgtttatga ttttaccgac 1980 gagacgtccg aagtatctac taccgacaaa attgcggata tcactatcat catcccgtac 2040 atcggtccgg ctctgaacat tggcaacatg ctgtacaaag acgacttcgt tggcgcactg 2100 atcttctccg gtgcggtgat cctgctggag ttcatcccgg aaatcgccat cccggtactg 2160 ggcacctttg ctctggtttc ttacattgca aacaaggttc tgactgtaca aaccatcgac 2220 aacgcgctga gcaaacgtaa cgaaaaatgg gatgaagttt acaaatatat cgtgaccaac 2280 tggctggcta aggttaatac tcagatcgac ctcatccgca aaaaaatgaa agaagcactg 2340 gaaaaccagg cggaagctac caaggcaatc attaactacc agtacaacca gtacaccgag 2400 gaagaaaaaa acaacatcaa cttcaacatc gacgatctgt cctctaaact gaacgaatcc 2460 atcaacaaag ctatgatcaa catcaacaag ttcctgaacc agtgctctgt aagctatctg 2520 atgaactcca tgatcccgta cggtgttaaa cgtctggagg acttcgatgc gtctctgaaa 2580 gacgccctgc tgaaatacat ttacgacaac cgtggcactc tgatcggtca ggttgatcgt 2640 ctgaaggaca aagtgaacaa taccttatcg accgacatcc cttttcagct cagtaaatat 2700 gtcgataacc aacgcctttt gtccactcta gactag 2736

<210> 85 <211> 911 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 85

Gly Ser Met Pro lie Thr lie Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val 1 5 10 15

Asn Asn Asp Thr lie lie Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu 20 25 30

Asp lie Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys lie Thr Asp Arg lie Trp lie Val 35 40 45

Pro Glu Arg Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro 50 55 60

Ser Ser Leu lie Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu 65 70 75 80

Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gin Thr Met Val Lys Leu 85 90 95

Phe Asn Arg lie Lys; Asn Asn Val. Ala Gly Glu Ala. Leu Leu Asp Lys 100: 1:05 110 II© Lie Asn Ala lie Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp 115 120 125

Lys Ph:© Asp Thr Asti Ser Asn Ser Vãí Sep :.Pli.© Asn Leu Leu Slu Sin. 130 135 140

Asp Pro Ser Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu lie 145 150 155 160

Xis .Eliê Gly Pxò Gly Pro Vâl Leu Agn Lys Asm Gin Vâl. Arg Gly lie 163 170 175

Vai Leu Arg- vai Asp Asia Lys Asn Tyr Phe; Er© éys Ârg Asp Sly? Pile 180 185 19ϋ

Gly Sex He Met Gin Met Ala Phe Oys Pro Glu Tyr Vâl Pro Thr Phe 1-95 200 205

Asp Asn Val. Ik Glu Asn Ik Thr Ser Leu Thr lie Gly lys Ger Lys 210 215 22 0: T^.r Phe Gin asp Pro Ala leu leu Leu Met His Glu Leu lie His val '7o 230 235 240

Leu His Gly leu Tyr Gly Met. Gin Val Ser Ser His Glu lie lie Pro.: 245 250 255 #er lys Gin Glu lie Tfr Met. Gin His Thr Tyr Pro lie Ser Ala Glu 260 265 270

Glu leu Phe Thr Phe Gly Gly Gin Asp Ala Asn :Leu lie Ser lie Asp 275 2SO 285 lie Lys Asn Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala lie 290 295 300

Ala Asn Lys Leu Ser Gin Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn lie Asp 305 310 315 320 lie Asp Ser Tyr Lys Gin lie Tyr Gin Gin Lys Tyr Gin Phe Asp Lys 325 330 ' 335

Asp Ser Asn Gly Gin Tyr lie Val Asn Glu Asp Lys Phe Gin lie Leu 340 345 350

Tyr As:a Ser lie Hah: Tyr Sly· Phe :Thr Glu lie Glu Leu Gly Ays Ays 355 36® 365

Phe Asn lie· Ays 1¾¾ Arg· Leu Ger Ayr Fite Set Met Asa His Asp Pro 370 375 380

Val Lys lie. Pro Asa Leu. 'leu Asp Asp Thr lie Tyr Asa Asp Thr Glu 385 .390 3#:5; 400 GAy Phe Asa III Glu Ser Ays Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys: Gly Gin 405 410 415 .Asa Met Arg Val Asa Thr Asa Ala Phe Arg Asa Val Asp Sly Ser Gly 4m 4m no

Leu Val. Ser Ay©: Aeu lie Gly AêU Oys Val Asp Gly Ale He Thr Ser 435 44Q 445

Ays: Hr Ays Ser Aeu He Glu Gly Arg Phe Gly Gly Pie Air Gly Ala 450 455 460

Arg Ays Ser Ala Arg Ays Arg Ays Asa Gin Ala Aeu Ala Gly Gly Gly 465 470 47| 480

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Aeu Val Aeu 485 490 49¾

Glu. Cys lie Ays Val Asa Asa. Txp Asp Aeu Phe Phe Ser Pro Ser Slu 500 505 510

Asp: Asa phe Thr Asn Asp Aeu Asn Ays Gly Glu Glu. lie Thr ser Asp 515 o2C 5¾

Thr Asn lie Glu Ala Ala Glu Glu Asn lie Ser Leu Asp Leu lie Gin 530 535 540

Gin Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn lie Ser 545 550 555 560 lie Glu Asn Leu Ser Ser Asp lie lie Gly Gin Leu Glu Leu Met Pro 565 570 575

Asn lie Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr 580 585 590

Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gin Glu Phe Glu His Gly Lys Ser 595 600 605

Arg lie Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser 610 615 620

Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys Lys Val Asn Lys 625 630 635 640

Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu Gin Leu Val Tyr 645 650 655

Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr Asp Lys lie Ala 660 665 670

Asp lie Thr lie lie lie Pro Tyr He Gly Pro Ala Leu Asn lie Gly 675 680 685

Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu He Phe Ser Gly 690 695 700

Ala Val lie Leu Leu Glu Phe He Pro Glu He Ala He Pro Val Leu 705 710 715 720

Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr He Ala Asn Lys Val Leu Thr Val 725 730 735

Gin Thr lie Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu 740 745 750

Val Tyr Lys Tyr lie Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gin 755 760 765 lie Asp Leu lie Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gin Ala 770 775 780

Glu Ala Thr Lys Ala lie lie Asn Tyr Gin Tyr Asn Gin Tyr Thr Glu 785 790 795 800

Glu Glu Lys Asn Asn lie Asn Phe Asn lie Asp Asp Leu Ser Ser Lys 805 810 815

Leu Asn Glu Ser lie Asn Lys Ala Met lie Asn lie Asn Lys Phe Leu 820 825 830

Asn Gin Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met lie Pro Tyr Gly 835 840 845

Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu 850 855 860

Lys Tyr lie Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu lie Gly Slh Val Asp Arg 865 870 875 880

Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp lie Pro Phe Gin 885 890 895

Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gin Arg Leu Leu Ser Thr Leu Asp 900 905 910 <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 86 <211> 180 <212> ADN <223> Sintética <400> 86 gfatcea&ge acgtcga&gq gattgatggt cgfettiggeg gfettcacggg cgeaGgcsaaa 60 tsagcgcgta aaegtaagaa Gcaggegeta gcgggcggtg geggtagcgg eggtggcggfc 120

agcggcggtg gcggtagcgc: actagtgctg cagacgcacg gtçtagaatg afeaaaagçtt ISO

<210> 87 <211> 2715 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 87 ggatccgaat tcatgccgat caccatcaac aacttcaact acagcgatcc ggtggataac 60 aaaaacatcc tgtacctgga tacccatctg aataccctgg cgaacgaacc ggaaaaagcg 120 tttcgtatca ccggcaacat ttgggttatt ccggatcgtt ttagccgtaa cagcaacccg 180 aatctgaata aaccgccgcg tgttaccagc ccgaaaagcg gttattacga tccgaactat 240

GtgágGâGDg atâgsgafeâa agataGG't'GG stgaâagaãà GG&tGaaacfc gfitcaaaGgG :3QQ at.çaacagçc gfcgaaatfcgg cgaagaaGt.g atctatcgcc tgagcaccga tattccgttt 360 GGgggGaaGg aeaacaccGC: gatcaacaec tttgatttcg atgtggattt caacagcgtt 42 0 gafegtGaaaa GGGgçcaggg. tasGaattgg gtgaaaaGGg gcagcattaa CGogagcgtg 48© attaKtaGcg gtccgcgcga aaacattatt gatccggaaa GQagGàGGtfe taaaetgacc 54© aaGaacaGGt ttgcggcgca ggaaggttft ggcgcgctga geàlitafcÊag catq.agcGfef ê©© cgctttatge. tgaGçtatag caaGgcgaGG; aacgatgttg gíigaaggccg t&tc&gçàáà §6© agogaattt-t gcatggacQC gafcoctgatG ctgatgcatg aactgaacca tegcgatgcat 52© aaG:GfcgC:a:;fg: gcatcgcgat ©Gqgaacgat oagaqeaqta gcagcgtgac qaqeaaqgtG 780: ttttacagGG ãgtaeaaogt; gaaactggaa tatgcggaaa tctatgcgtt tggcggtccg 840 acG.attgatG tgattGegaa aagcgcgcgc aaatacttcg aagaaaaagc gctggattac 900 taGcgcagGa ttgegsaaeg 'tctgaasagc attacGaecg GgaatGqgag qagG'ttqeae: .MO: aaatatatcg gcgaatataa acagaaactg atccgcaaat: atcgctt.tgG ggtggaaage 1020 agcggcgaag ttaccgttaa ccgcaataaa ttcgtggaac tgtaGaaGga aGtgaeGcag 1080 atetteaccg aattt:aact,a fcgegaâaatc t,aqa.aggtgq agââGqgÇaa aatctacctg ill© agGaacgtgt atacccGggt gaGcgcgaat attGtggatg ataacgtgtia cgatatccag 1200 aacfgGttta aGatGGGgaa aagcaacotg aaGgttGtgt fctatgggcea gaaectgagc 1260 cgtaatGegg cgctgcgtaa agtgaacccg gaaaacatgc: tgfcacGfcgtt cae:caaattt 132:0 tgegtcgacg cgattgatgg tcgttttggc ggtttcacgg gcgcacgcaa atcagcgcgt 1380 aaaGgtaaga acqaggggct agcgggcggt ggGggtageg· gcggtggGgg tsgGggqggt 1440 ggcggtagcg cactagtgct gcagtgtcgt gaactgc.tgg tgaaaaacaG egatctgGGg. .1500' tttattggcg atatcagcga tgtgaaaace ga.tatGt.tGG tgcgeaa.aga tatGaaGgaa 1560 gaaaecgaag tgatcGae'tM: Gcggga.t.aaq gtgagGgGtg· atGaggtgat GG©ga:gcaaa. 1620 aaoa.ccag.cg aaGatggtGa gGtggafeGtg ctgtatccga gcattgatag cgaaagcgaa 16§©: attctgccgg gcgaaaacca ggtgttttac gataaccgta cccagaacgt ggattacctg 1740 aacagctatt actacctgga aagccagaaa ctgagcgata acgtggaaga ttttaccttt 1800 acccgcagca ttgaagaagc gctggataac agcgcgaaag tttacaccta ttttccgacc 1860 çtggcsglàòs áagttaatgB: gggtgttGag· gfGgfi-Gtgfc: ttetgatgtg ggGgaaogafc 1520 gtggtggaag atttcaGGác GaaGatcGfeg cgtaaagata ccctggataa aatcagcgat 158:® gtfcagcgoga ttattacgta tattggteog gcgetgaaca ttagcaatag cgtgcgtcgfe 2040 ggGaafctfcta ecgaagcgtt tgcggttacc ggtgtgacea ttctgctgga agegtttGeg 210:0 gaatttacca ttccggcgst gggtgcgttt gtgatctata gcaaagtgea ggaacgcaae 2160 gaaatcatca aaaccatcga taactgcctg gaacagcgta fcfcaaacgotg gaaagafcagc: 2220;

tatgaatgga tgatgggcao gtggGtggge .Ggfãttatca eocagthgaa. eaacafcGBge. 22 gQ taGGagatgt acgatagoct gaactafccag gcgggtgcga ttBaagogaa aategatcmg 2340' gáataGaaaa aatagagegg eagcgataaa gasaasatca aaagccaggt tgaaaacetg 2400: aaaaacagcc tggatgtgaa aattagcgaa gcgatgaata acatcaacaa attcatcc.gc 2460- gaatgcagcg tgacctacct gttcaaaaac atgctgccga aagtgatcga tgaaetgaac 2:520 gaatttgatc goaaeaGeaa agogaaaótg atgaaogtga tcgatagcca çaaòatf-ãht 2:58® ctggtgggcg aagtggataa, actgaaageg aaagtfcaaca acagctteca g.aacaGGatç 2:640 ccgtttaaca tcttcagcta táoGaa:caac agGshgotga aagatatcat caaGgaatac 2700 ttcàatètâg aetgg 2:715

<210> 88 <211> 904 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sintética <400> 88

Gly Ser Glu Phe Met Pro lie Thr lie Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp 1 5 10 15

Pro Val Asp Asn Lys Asn lie Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr 20 25 30

Lesa Ala Asa GLu P:io: Glu lys Ala Phe Arg lie Thr Gly Asn Il.i Trp 35 '40 45

Val lie Pro Asp Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asm lys 50 55 60

Pro Pro Arg Val Thr Ser Pro Ays Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr 65 10 15 80

Leu Ser Thr Asp Ser· Asp- lys Asp Thr Phe leu lys; Glu lie He lys m m m léu Ph©: lys Arg He Asn. ser Arg Glu He Gly Glu Glu leu He Tyr 100 105 110

Arg leu Ser Thr Asp: He Pro: Phe· Pro Gly Asn Asn- Asn Thr Pro He , 115 120 115 ASn Thr Phe Asp phe Asp Val Asp Phe Asn. Ser- Val Asp Val lys: Thr 130 135 140

Arg Gin Gly Asn ,As:n. Trp Val. lys Thr Gly Ser' He Asn Pro Set Val 14 5 150 155- 16 0^ III He Thr Gly Pro Arg Glu Asn He; He Asp Pro Glu Thr Her Thr 165 .110 111

Phe lys leu Thr Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gin Glu Gly Phe Gly Ala 180 185 190 leu Ser He He Ser He Ser Pro Arg Phe Met leu Thr Tyr Ser Asn 195 200 205

Ala Thr Asn Asp Val Gly Glu Gly Arg Phe Ser lys Ser Glu Phe Cys 210 215 220

Met Asp Pro lie Leu lie Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His 225 230 235 240

Asn Leu Tyr Gly lie Ala lie Pro Asn Asp Gin Thr lie Ser Ser Val 245 250 255

Thr Ser Asn He Phe Tyr Ser Gin Tyr Asn Val Lys Leu Glu Tyr Ala 260 265 270

Glu He Tyr Ale Ms# Gly Gly Pro Thr lie Asp Leu lie Pro Lys; Ser 275 280 285

Ala Arg Lys Tyr Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Ar.g Ser He 290 295 Í00

Ala Lys Arg .Leu Asr Ser lie Thr· Thr Ala Asn pro: Ser Ser Phe Asn 305 31© MS 320

Lys Tyr Tie Gly Glu Tyr Lys· Gin Lys Leu lie Arg Lys Tyr Arg; Phe-

325 330 MS

Val Val Glu Ser Ser Gly Glu Val Thr Val Asn Arg Asn Lys Phe Val 340 345 350

Glu Leu Tyr Asn Glu Leu Thr Gin lie Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala 355' 3:60 365

Lys lie Tyr Asa. Val Gin Asn Arg Lys: lie Tyr Leu Ser Asn Val Tyr 370 375 380

Thr Pro val Thr Ala Ash He Leu Asp Asp Asn Val Tyr Asp lie Gin 285 390 395 400

Asn Gly Phe Asn He Pro Lys Ser Asn Leu Asn Val Leu Phe Met Gly 405 410 415

Gin Asn Leu Ser Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Val Asn Pro Glu Asn 420 425 430

Met Leu Tyr Leu Phe Thr Lys Phe Cys Val Asp Ala lie Asp Gly Arg 435 440 445

Phe Gly Gly Phe Thr Gly Ala Arg Lys Ser Ala Arg Lys Arg Lys Asn 450 455 460

Gin Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 465 470 475 480

Gly Gly Ser Ala Leu Val Leu Gin Cys Arg Glu Leu Leu Val Lys Asn 485 490 495

Thr Asp Leu frp Phe lie Gly Asp- Us Ser Asp Val Lys Thr Asp lie 5 00 505 510.

Phe Leu Arg Lys Asp lie Asn Glu Glu Thr Glu Val lie Tyr Tyr Pro. 515 520 525

Asp Asn Val Ser Val Asp Gin Val lie Leu Ser Lys Asn Thr Ser Glu 530 535 540

His Gly Gin Leu Asp Leu Leu Tyr Pro Ser lie A.sp Ser Glu Ser Glu. 545 550 555 560 lie Leu Pro: Gly Glu Asn Gin. Val Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gin Asa 565 570 575

Val Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr Tyr Leu Glu. Ser Gin Lys Leu. Ser 580 58:5 5 90

Asp Ash Val Glu Ahp Phe Thr Phe Thr Arg Ser Tie Glu Glu Ala Leu 595 600 . 005

Asp Asn Ser Ala. Lys Val Tyr Thr Tyr' Phe. Pro Thr Leu Ala Asn Lys 610 615 620

Val Asn Ala Sly Val. Gin. Gly Gly Lea Phe Leu Met Trp: Ala Asn. Asp 62.5 630 635 64:0

Val Val Glu. Asp Phe Thr Thr Asn; He Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp 645 650 655

Lys lie Ser Asp Val Ser Ala 'lie; lie Pro Tyr lie Gly Pro Ala Leu 660 665 670

Asn lie Ser Asn Sen Val Arg 4rg Gly Asn Phe Thr Glu Ala, Phe Ala 675 680 685

Val Thr Gly Val Thr lie Leu Leu Glu Alá -Phe: Prg. Glu, Phe Thr lie 690 695 7:00

Pro Ala Leu Sly Ala Phe Val lie Tyr Ser Lys Val Gin Glu Arg Asn 705 710. 715 ' 720

Glu He He Lys Thr lie Asp Asn Cys Leu Glu Gin Arg lie Lys Arg 725 730 735

Trp Lys Asp Ser Tyr Glu Trp Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg He 740 745 750

He Thr Gin Phe Asn Asn He Ser Tyr Gin Met Tyr Asp Ser Leu Asn 755 760 765

Tyr Gin Ala Gly Ala He Lys Ala Lys He Asp Leu Glu Tyr Lys Lys 770 775 780

Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn lie Lys Ser Gin Val Glu Asn Leu 785 790 795 800

Lys Asn Ser Leu Asp Vai Lys Ile Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn 805 810 815

Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser Vai Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu 820 825 830

Pro Lys Vai lie Asp Glu Leu Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala 835 840 845

Lys Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ser His Asn lie Ile Leu Vai Gly Glu 850 855 860

Vai Asp Lys Leu Lys Ala Lys Vai Asn Asn Ser Phe Gin Asn Thr Ile 865 870 875 880

Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile 885 890 895

Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Leu Asp 900

Lisboa, 14 de julho de 2015

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de fusão polipeptídica, de cadeia única, compreendendo: a. uma protease não citotóxica ou um seu fragmento, cuja protease ou fragmento de protease é capaz de clivar uma proteína do aparelho de fusão exocítica de um aferente sensorial nociceptivo; b. uma Unidade de Direcionamento que é capaz de se ligar a um Local de Ligação no aferente sensorial nociceptivo, cujo Local de Ligação é capaz de sofrer endocitose para ser incorporado num endossoma dentro do aferente sensorial nociceptivo; c. um local de clivagem de protease, em cujo local a proteína de fusão é clivável por uma protease, em que o local de clivagem de protease está localizado entre a protease não citotóxica ou seu fragmento e a Unidade de Direcionamento; d. um domínio de translocação que é capaz de translocar a protease ou fragmento de protease de dentro de um endossoma, através da membrana endossomal e para o citosol do aferente sensorial nociceptivo; em que a Unidade de Direcionamento está localizada entre o local de clivagem de protease e o domínio de translocação e em que a protease (ou seu fragmento) e o domínio de translocação estão afastados um do outro por um máximo de 100 resíduos de aminoácidos.
2. 2. Proteína de fusão de acordo com a Reivindicação 1, em que a Unidade de Direcionamento e o local de clivagem de protease estão separados por no máximo 10 resíduos de aminoácidos, de um modo preferido, por, no máximo, 5 resíduos de aminoácidos e, de um modo mais preferido, por, no máximo, zero resíduos de aminoácidos.
3. 3. Proteína de fusão de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a protease não citotóxica é uma neurotoxina clostridial de cadeia L ou uma protease de IgA.
4. 4. Proteína de fusão de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o domínio de translocação é o domínio HN de uma neurotoxina clostridial.
5. 5. Proteína de fusão de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a Unidade de Direcionamento compreende no máximo 50 resíduos de aminoácidos, de um modo preferido, no máximo 40 resíduos de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, 30 resíduos de aminoácidos e, de um modo muito preferido, no máximo 20 resíduos de aminoácidos.
6. 6. Proteína de fusão de acordo com qualquer das Reivindicações 1-5, em que a Unidade de Direcionamento: (i) é um opióide; (ii) é um agonista de um recetor presente num aferente sensorial nociceptivo, de um modo preferido, em que a Unidade de Direcionamento é um agonista de um recetor presente numa aferente sensorial nociceptivo primário; (iii) liga-se ao recetor ORLi, de um modo preferido, em que a Unidade de Direcionamento liga-se especif icamente ao recetor ORLi, de um modo mais preferido, em que a Unidade de Direcionamento é um agonista do recetor ORLi.
7. 7. Proteína de fusão de acordo com a Reivindicação 6, em que a Unidade de Direcionamento tem, pelo menos, 70% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID N° 38 ou um seu fragmento ou em que a Unidade de Direcionamento tem, pelo menos, 80% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID N° 38 ou um seu fragmento ou em que a Unidade de Direcionamento tem, pelo menos, 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID N° 38 ou um seu fragmento ou em que a Unidade de Direcionamento tem, pelo menos, 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID N° 38 ou um seu fragmento ou em que a Unidade de Direcionamento é a SEQ ID N° 38 ou um seu fragmento ou em que a Unidade de Direcionamento é uma de SEQ ID N° 40, 42, 44, 46, 48 ou 50 ou em que a Unidade de Direcionamento é nociceptina.
8. 8. Proteína de fusão de acordo com qualquer das Reivindicações 1-5, em que a Unidade de Direcionamento é selecionada do grupo consistindo de nociceptina, β-endorfina, endomorfina-1, endomorfina-2, dinorfina, met-encefalina, leu-encefalina, galanina e péptido PAR-2.
9. 9. Proteína de fusão de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a proteína de fusão compreende um marcador de purificação; de um modo preferido, em que a proteína de fusão compreende um marcador de purificação, o qual está presente na extremidade N-terminal e/ou C-terminal da proteína de fusão; de um modo mais preferido, em que o marcador de purificação está ligado à proteína de fusão por uma molécula espaçadora peptídica.
10. 10. Proteína de fusão de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o domínio de translocação está separado da Unidade de Direcionamento por uma molécula espaçadora peptídica.
11. 11. Sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão polipeptídica de acordo com qualquer Reivindicação anterior.
12. 12. Vetor de ADN, o qual compreende um promotor, uma sequência de ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 11, em que a referida sequência de ADN está localizada a jusante do promotor e um terminador está localizado a jusante da construção de ADN.
13. 13. Método para preparar uma proteína de fusão polipeptídica, de cadeia única, de acordo com qualquer das Reivindicações 1-10, compreendendo a expressão de uma sequência de ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 11 ou um vetor de ADN de acordo com a Reivindicação 12, numa célula hospedeira.
14. 14. Método de preparação de um agente não citotóxico, compreendendo: a. contactar uma proteína de fusão polipeptídica de cadeia única de acordo com qualquer das Reivindicações 1-10 com uma protease capaz de clivar o local de clivagem da protease; b. clivar o local de clivagem da protease; e desse modo formar uma proteína de fusão de cadeia dupla.
15. 15. Polipéptido não citotóxico, obtenível pelo método da Reivindicação 14, em que o polipéptido é um polipéptido de cadeia dupla e em que: a. a primeira cadeia compreende a protease não citotóxica ou um seu fragmento, cuja protease ou fragmento de protease é capaz de clivar uma proteína do aparelho de fusão exocítica de um aferente sensorial nociceptivo; b. a segunda cadeia compreende a TM e o domínio de translocação que é capaz de translocar a protease ou fragmento de protease de dentro de um endossoma, através da membrana endossomal e para o citosol do aferente sensorial nociceptivo; e a primeira e segunda cadeias são ligadas uma à outra por dissulfureto.
16. 16. Utilização de uma proteína de fusão de acordo com qualquer das Reivindicações 1-10 ou um polipéptido de acordo com a Reivindicação 15, para o fabrico de um medicamento para tratar, prevenir ou amenizar a dor; de um modo preferido, em que a dor é dor crónica.
17. 17. Proteína de fusão de acordo com qualquer das Reivindicações 1-10 ou um polipéptido de acordo com a Reivindicação 15, para utilização no tratamento, prevenção ou alívio da dor; de um modo preferido, em que a dor é dor crónica. Lisboa, 14 de julho de 2015