JP5174464B2 - 非細胞傷害性タンパク質結合体 - Google Patents
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Description
(i)ターゲティング部分(TM)であって、該TMが、該侵害受容感覚求心性細胞上に存在するレセプターのアゴニストであり、そして該レセプターが、エンドサイトーシスを受けて該侵害受容感覚求心性細胞内のエンドソームに取り込まれる、TM;
(ii)非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントであって、該侵害受容感覚求心性細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る、プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメント;および
(iii)トランスロケーションドメインであって、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートする、トランスロケーションドメイン、
を含む。
[2]Maileら, 2003, Neurosci. Lett., 350, 190-192
[3]Rizziら, 2002, J. Pharmacol. Exp. Therap., 300, 57-63
[4]Okadaら, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 278, 493-498
[5]Zaveri, 2003, Life Sci., 73, 663-678.
[6]Dooleyら, 1997, J Pharmacol Exp Ther. 283(2), 735-41。
・ノシセプチンにより誘導される応答は、特異的NK1レセプター(サブスタンスPレセプター)アンタゴニストによって廃止される;および
・カプサイシンでの細胞の前処理(これは、小さな直径の一次求心性神経細胞からサブスタンスPを枯渇させる)は、ノシセプチンで誘導される応答を減弱させる。
ボツリヌス菌A型神経毒素−アミノ酸残基(449〜871)
ボツリヌス菌B型神経毒素−アミノ酸残基(441〜858)
ボツリヌス菌C型神経毒素−アミノ酸残基(442〜866)
ボツリヌス菌D型神経毒素−アミノ酸残基(446〜862)
ボツリヌス菌E型神経毒素−アミノ酸残基(423〜845)
ボツリヌス菌F型神経毒素−アミノ酸残基(440〜864)
ボツリヌス菌G型神経毒素−アミノ酸残基(442〜863)
破傷風菌神経毒素−アミノ酸残基(458〜879)。
(A)推定アゴニスト分子またはアゴニストが、非細胞傷害性プロテアーゼ(またはそのフラグメント)および必要に応じてトランスロケーションドメインに結合して、本発明の結合体を形成し得ることを確認する工程;および/または
(B)該推定アゴニスト分子またはアゴニストが、レセプターがレセプター媒介エンドサイトーシスを受けやすい、痛みを感じる標的細胞上のレセプターに結合することを確認する工程;および/または
(C)該推定アゴニスト分子またはアゴニストが、痛みを感じる標的細胞のサイトゾルへの非細胞傷害性プロテアーゼ(またはそのフラグメント)を送達し得ることを確認する工程。
Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press;
Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press;
Thorpeら (1987), Cancer Res, 1987, 47, 5924-31。この文献は、SMBT(S-4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチルベンジルチオ硫酸ナトリウム)およびSMPT(4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α(2-ピリジルジチオ)トルエン)の使用を記載する;および
Peetersら (1989), J Immunol Methods. 1989, 120, 133-43。この文献は、4つのカップリング試薬:MHS(スクシンイミジル6-(N-マレイミド)-n-ヘキサノエート)、SMCC(スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート)、MBS(スクシンイミジルm-マレイミドベンゾエート)、およびSPDPの使用を記載する。
(I)選択したTMに関するDNA配列データ;
(II)プロテアーゼ構成部分に関するDNA配列データ;
(III)トランスロケーションドメインに関するDNA配列データ;および
(IV)(I)、(II)および(III)を含む構築物の構築および発現を可能にするためのプロトコル。
Lorberboum-Galski, H., FitzGerald, D., Chaudhary, V., Adhya, S., Pastan, I. (1988), Cytotoxic activity of an interleukin 2-Pseudomonas exotoxin chimeric protein produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(6):1922-6;
Murphy, J.R. (1988), Diphtheria-related peptide hormone gene fusions: a molecular genetic approach to chimeric toxin development. Cancer Treat. Res.; 37:123-40;
Williams, D.P., Parker, K., Bacha, P., Bishai, W., Borowski, M., Genbauffe, F., Strom, T.B., Murphy, J.R. (1987), Diphtheria toxin receptor binding domain substitution with interleukin-2: genetic construction and properties of a diphtheria toxin-related interleukin-2 fusion protein. Protein Eng;1(6):493-8;
Arora, N., Williamson, L.C., Leppla, S.H., Halpern, J.L. (1994), Cytotoxic effects of a chimeric protein consisting of tetanus toxin light chain and anthrax toxin lethal factor in non-neuronal cells J. Biol. Chem., 269(42):26165-71;
Brinkmann, U., Reiter, Y., Jung, S.H., Lee, B., Pastan, I. (1993), A recombinant immunotoxin containing a disulphide-stabilized Fv fragment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(16):7538-42;および
O'Hare, M., Brown, A.N., Hussain, K., Gebhardt, A., Watson, G., Roberts, L.M., Vitetta, E.S., Thorpe, P.E., Lord, J.M. (1990), Cytotoxicity of a recombinant ricin-A-chain fusion protein containing a proteolytically-cleavable spacer sequence. FEBS Lett 10月29日;273(1-2):200-4。
(i)ターゲティング部分(TM)であって、該TMが、該侵害受容感覚求心性細胞上に存在するレセプターのアゴニストであり、そして該レセプターが、エンドサイトーシスを受けて該侵害受容感覚求心性細胞内のエンドソームに取り込まれる、TM;
(ii)非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントをコードするDNA配列であって、該侵害受容感覚求心性細胞において発現可能であり、そして発現した場合に、該侵害受容感覚求心性細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得るプロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメント提供する、DNA配列;および
(iii)トランスロケーションドメインであって、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性細胞へと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをコードする該DNA配列をトランスロケートする、トランスロケーションドメイン、
を含む。
エキソサイトーシス融合は、細胞内分子が、痛みを感じる標的細胞のサイトゾルからその原形質(すなわち、細胞)膜へ輸送されるプロセスである。その後、細胞内分子は、原形質膜の外表面上に提示されるようになり得るか、または細胞外環境中に分泌され得る。
エンテロキナーゼ (DDDDK↓)
第Xa因子 (IEGR↓/IDGR↓)
TEV(タバコエッチウイルス) (ENLYFQ↓G)
トロンビン (LVPR↓GS)
PreScission (LEVLFQ↓GP)。
大腸菌からのrecLHN/Bの発現および精製のSDS−PAGE分析である。図1において、recLHN/Bは、実施例3に記載のように3カラムの方法を用いて細胞ペーストから精製する。タンパク質試料を、SDS−PAGEによって分離し、そしてシンプリーブルーセーフステインクマシー試薬での染色によって可視化する。浄化した抽出物内に含まれる粗可溶性MBP−LHN/B融合タンパク質(レーン2)を、Q−セファロースFFアニオン交換樹脂に供する。レーン3は、150〜200mMの塩でカラムから溶出した組換えMBP−LHN/B融合物を示す。この試料を、第Xa因子プロテアーゼで処理してMBPアフィニティータグを除去し(レーン4)、そして切断した混合物をより低い塩濃度に希釈して、Q−セファロースFFアニオン交換カラムに供する。120〜170mMの塩で溶出した材料は、LHN/Bリッチであった(レーン5)。レーン6および8のタンパク質は、それぞれ非還元および還元条件下で、エンテロキナーゼでの処理およびベンズアミジンセファロースを用いる最終精製後に収穫したLHN/Bを示す。レーン1および7は、分子量マーカー[Mark 12(Invitrogen)]を示す。
大腸菌からのLHN/Cの発現および精製のSDS−PAGE分析である。図2において、recLHN/Cは、実施例4に記載の2段階方法を用いて大腸菌細胞ペーストから精製する。タンパク質試料を、SDS−PAGEによって分離し、そしてクマシーブルーでの染色によって可視化する。浄化した粗細胞溶解物(レーン2)を、Q−セファロースFFアニオン交換樹脂に供する。融合タンパク質であるMBP−LHN/Cを、0.1MのNaClで溶出する(レーン3)。溶出した材料を、第Xa因子プロテアーゼ(New England Biolabs)とともに22℃にて16時間インキュベートして、融合タグMBPを切断しそしてリンカー部位でrecLHN/Cに切り目を入れる。目的のタンパク質を、切断した融合産物(レーン4)からQ−セファロースFFを用いてさらに精製する。レーン5および7は、それぞれ非還元条件および10mMのDTTでの還元条件下で精製したrecLHN/Cを示し、第Xa因子で切り目を入れた後にLCドメインとHNドメインとの間のリンカー領域でのジスルフィド結合を示す。レーン1および6は、分子量マーカー、Mark 12(Invitrogen)を示す(KDaで示す)。
大腸菌からのN[1−17]−LHN/Aの発現および精製のSDS−PAGE分析である。図3において、N[1−17]−LHN/Aは、実施例9に概説する方法を用いて大腸菌BL21細胞ペーストから精製する。簡単に言えば、細胞破壊後に得た可溶性産物を、ニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Xa因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質(MBP)タグを除去し、次いで第2のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS−PAGE(パネルA)およびウェスタンブロッティング(パネルB)によって評価した。抗ノシセプチン抗血清(Abcamから入手)をウェスタンブロッティングの一次抗体として用いた。還元剤の不在下および存在下での最終精製物をそれぞれ[−]および[+]で記したレーン中に同定する。
実施例26に概説する方法を用いて、LC/A−ノシセプチン−HN/A融合タンパク質を大腸菌BL21細胞から精製した。簡単に言えば、細胞破壊後に得た可溶性産物を、ニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Xa因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質(MBP)タグを除去し、次いで第2のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS−PAGE(パネルA)およびウェスタンブロッティング(パネルB)によって評価した。抗ノシセプチン抗血清(Abcamから入手)をウェスタンブロッティングの一次抗体として用いた。還元剤の不在下および存在下での最終精製物をそれぞれ[−]および[+]で記したレーン中に同定する。
実施例26に概説する方法を用いて、ノシセプチン−LC/A−HN/A融合タンパク質を大腸菌BL21細胞から精製した。簡単に言えば、細胞破壊後に得た可溶性産物を、ニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Xa因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質(MBP)タグを除去し、次いで第2のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS−PAGE(パネルA)およびウェスタンブロッティング(パネルB)によって評価した。抗ノシセプチン抗血清(Abcamから入手)をウェスタンブロッティングの一次抗体として用いた。還元剤の不在下および存在下での最終精製物をそれぞれ[−]および[+]で記したレーン中に同定する。
実施例26に概説する方法を用いて、LC/C−ノシセプチン−HN/C融合タンパク質を大腸菌BL21細胞から精製した。簡単に言えば、細胞破壊後に得た可溶性産物を、ニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Xa因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質(MBP)タグを除去し、次いで第2のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS−PAGE(パネルA)およびウェスタンブロッティング(パネルB)によって評価した。抗ノシセプチン抗血清(Abcamから入手)をウェスタンブロッティングの一次抗体として用いた。還元剤の不在下および存在下での最終精製物をそれぞれ[−]および[+]で記したレーン中に同定する。
実施例26に概説する方法を用いて、LC/A−metエンケファリン−HN/A融合タンパク質を大腸菌BL21細胞から精製した。簡単に言えば、細胞破壊後に得た可溶性産物を、ニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Xa因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質(MBP)タグを除去し、次いで第2のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS−PAGEによって評価した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物をそれぞれ[−]および[+]で記したレーン中に同定する。
ノシセプチン融合物がORL1レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節(DRG)の初代培養物を1nM[3H]−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射標識リガンドの特異的結合の減少を、シンチレーション計数により評価し、そして非標識リガンド(Tocrisノシセプチン)の効率と比較してプロットした。LC/A−ノシセプチン−HN/A融合物が、ORL1レセプターとの相互作用においてノシセプチン−LC/A−HN/A融合物よりもはるかに優れていることが明らかである。
精製したLC/A−ノシセプチン−HN/A融合タンパク質のインビトロエンドペプチダーゼ活性を、本質的にChaddockら 2002, Prot. Express Purif. 25, 219-228に記載のように決定した。簡単に言えば、ELISAプレートに固定したSNAP−25ペプチドを、種々の濃度の融合タンパク質に37℃にて1時間曝露した。一連の洗浄後、切断されたSNAP−25ペプチドの量を、特異的抗血清との反応性によって定量した。
実施例26に概説する方法を用いて、LC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合タンパク質を大腸菌BL21細胞から精製した。簡単に言えば、細胞破壊後に得た可溶性産物を、ニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Xa因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質(MBP)タグを除去し、次いで第2のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS−PAGEによって評価した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物をそれぞれ[−]および[+]で記したレーン中に同定する。
ノシセプチン融合物がORL1レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節(DRG)の初代培養物を1nM[3H]−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射標識リガンドの特異的結合の減少を、シンチレーション計数により評価し、そして非標識リガンド(Tocrisノシセプチン)の効率と比較してプロットした。LC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合物(CPNv−LHA)が、ORL1レセプターとの相互作用においてLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(CPN−LHA)よりも優れていることが明らかである。
実施例26に概説する方法を用いて、GS10、GS30およびHX27からなるLC/A−CPN−HN/A融合物の改変体を大腸菌細胞ペーストから精製する。LC/A−CPN(GS10)−HN/A、LC/A−CPN(GS15)−HN/A、LC/A−CPN(GS25)−HN/A、LC/A−CPN(GS30)−HN/A、およびLC/A−CPN(HX27)−HN/Aの精製からの試料を、SDS−PAGEに供してクマシーブルーでの染色によって評価した。電気泳動プロフィールは、CPBE−Aの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。上のパネル:M=分子量マーカー標線;S=大腸菌タンパク質全可溶性画分;FT=Ni2+荷電セファロースカラムに結合しなかったタンパク質;FUSION=イミダゾールの添加により溶出した融合タンパク質。下のパネル:レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン3=Ni2+荷電セファロースでの最初の捕捉後の精製物;レーン4=Ni2+荷電セファロースでの最終捕捉前の第Xa因子処理物;レーン5=第Xa因子での活性化後の精製した最終物(5μl);レーン6=第Xa因子での活性化後の精製した最終物(10μl);レーン7=第Xa因子での活性化後の精製した最終物(20μl);レーン8=第Xa因子での活性化後の精製した最終物+DTT(5μl);レーン9=第Xa因子での活性化後の精製した最終物+DTT(10μl);レーン10=第Xa因子での活性化後の精製した最終物+DTT(20μl)。
簡単に言えば、背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPN−Aに24時間曝露した。細胞タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合を、デンシトメトリー分析によって算定し、そして融合物濃度に対してプロットした(破線)。また、物質を回収して、特異的EIAキットを用いてサブスタンスP含量を分析した。サブスタンスP放出の阻害を実線で示す。50%最大SNAP−25切断に達するのに必要な融合物濃度は、6.30±2.48nMであると概算される。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPN−Aに24時間曝露した。ボツリヌス神経毒素(BoNT/A)をコントロールとして用いた。この最初の曝露後、細胞外物質を洗浄により除去し、そして細胞を37℃にて種々の時間インキュベートした。特定の時点で、細胞タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合を、デンシトメトリー分析によって算定し、そして点線で示した。また、物質を回収して、特異的EIAキットを用いてサブスタンスP含量を分析した。サブスタンスPの放出の阻害を実線で示す。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPNv−Aに24時間曝露した。細胞タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合を、デンシトメトリー分析によって算定した。50%最大SNAP−25切断に達するのに必要な融合物濃度は、1.38±0.36nMであると概算される。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPNv−Aに24時間曝露した。CPN−Aをコントロールとして用いた。この最初の曝露後、細胞外物質を洗浄により除去し、そして細胞を37℃にて種々の時間インキュベートした。特定の時点で、細胞タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合を、デンシトメトリー分析によって算定した。
ノシセプチン融合物がORL1レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節(DRG)の初代培養物を1nM[3H]−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射標識リガンドの特異的結合の減少を、シンチレーション計数により評価し、そして非標識リガンド(Tocrisノシセプチン)の効率と比較してプロットした。LC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合物(CPNv−LHnAと表示)が、ORL1レセプターとの相互作用においてLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(CPN−LHnAと表示)よりも優れていることが明らかである。
タンパク質をSDS−PAGEに供して、クマシーブルーで染色した。電気泳動プロフィールは、CPNv(Ek)−Aの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン3=Ni2+荷電セファロースでの最初の捕捉後の精製物;レーン4=エンテロキナーゼでの活性化後の精製した最終物(5μl);レーン5=エンテロキナーゼでの活性化後の精製した最終物(10μl);レーン6=エンテロキナーゼでの活性化後の精製した最終物(20μl);レーン7=エンテロキナーゼでの活性化後の精製した最終物+DTT(5μl);レーン8=エンテロキナーゼでの活性化後の精製した最終物+DTT(10μl);レーン9=エンテロキナーゼでの活性化後の精製した最終物+DTT(20μl)。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPNv(Ek)−Aに24時間曝露した。細胞タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合を、デンシトメトリー分析によって算定した。実施例26で調製したCPNv−Aを比較の目的で用いた。CPNv(Ek)−A(En活性化と表示)およびCPNv−A(Xa活性化と表示)によるSNAP−25の切断割合を示す。
タンパク質をSDS−PAGEに供して、クマシーブルーで染色した。電気泳動プロフィールは、CPNv−Cの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン3=Ni2+荷電セファロースでの最初の捕捉後の精製物;レーン4=Ni2+荷電セファロースでの最終の捕捉前の第Xa因子処理物;レーン5=Ni2+荷電セファロースでの第2の捕捉後の精製物;レーン6=最終精製物;レーン7=最終精製物+DTT;レーン8=分子量マーカー標線。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPNv−Cに24時間曝露した。細胞タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗シンタキシンでプローブしてシンタキシン切断の評価を容易にした。切断されたシンタキシンの割合をデンシトメトリー分析によって算定した。50%最大シンタキシン切断に達するのに必要な融合物濃度は、3.13±1.96nMであると概算される。
LC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(CPN/A)がカプサイシン誘発機械的異痛を阻害する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注射により評価した。試験動物を、研究に参加させる前(処置前);CPN/Aでの皮下足底内処置後カプサイシン投与前(CAP前);およびCPN/Aの注射後カプサイシン追加投与後(15分および30分での応答の平均;CAP)に、10gのVon Freyフィラメントによる一連の刺激(10刺激×3試行)に応じた足逃避率(PWF%)について評価した。カプサイシン追加投与を10μLの0.3%溶液の注射によって行った。試料希釈液を、0.5%BSA/生理食塩水中で調製した。
Sprague-Dawley雄ラット(250〜300g)をクエン酸緩衝液中65mg/kgのSTZで(静脈内)処置し、そして血中のグルコースおよび脂質を毎週測定して、モデルの準備ができていることを確認する。足逃避閾値(PWT)を所定の期間にわたるVon Freyフィラメントによる一連の刺激に応じて測定する。異痛は、2日の連続した試験日(1週間空ける)におけるPWTがスケールの上で6gを下回って測定する場合に確立されるといわれる。この時点で、ラットを生理食塩水群(陰性効力コントロール)、ガバペンチン群(陽性効力コントロール)または試験群(CPN/A)に無作為に振り分ける。試験物質(20〜25μl)を1回の注射で皮下注射し(ガバペンチンを除く)、PWTを処置後1日目およびその後2週間にわたって定期的に測定する。ガバペンチン(3ml/kg注入容量で30mg/kg腹腔内)は、PWT試験開始の2時間前に毎日注射する。
LC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合物(CPNv/A)がカプサイシン誘発機械的異痛を阻害する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注射により評価した。試験動物を、研究に参加させる前(処置前);CPNv/Aでの皮下足底内処置後カプサイシン投与前(CAP前);およびCPNv/Aの注射後カプサイシン追加投与後(15分および30分での応答の平均;CAP)に、10gのVon Freyフィラメントによる一連の刺激(10刺激×3試行)に応じた足逃避率(PWF%)について評価した。カプサイシン追加投与を10μLの0.3%溶液の注射によって行った。試料希釈液を、0.5%BSA/生理食塩水中で調製した。これらのデータを、正規化した足逃避率差として表す。ここでは、ピーク応答(カプサイシン後)とベースライン応答(カプサイシン前)との間の差を百分率にて示す。この分析にて、CPNv/Aは、CPN/Aよりも強力であることが理解され得る。これは、CPNv/Aは、CPN/Aで見られるのと同様の鎮痛効果を生じるのに必要とする投薬量が、より少ないからである。
タンパク質をSDS−PAGEに供して、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、CPLE−Aの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン3=Ni2+荷電セファロースの最初の捕捉後の精製物;レーン4=Ni2+荷電セファロースの最終捕捉前の第Xa因子処理物;レーン5=Ni2+荷電セファロースの第2の捕捉後の精製物;レーン6=最終精製物;レーン7=最終精製物+DTT。
タンパク質をSDS−PAGEに供して、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、CPBE−Aの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン2=Ni2+荷電セファロースでの最初の捕捉後の精製物;レーン3=Ni2+荷電セファロースでの最終捕捉前の第Xa因子処理物;レーン4=第Xa因子での活性化後の精製した最終物(5μl);レーン5=第Xa因子での活性化後の精製した最終物(10μl);レーン6=第Xa因子での活性化後の精製した最終物(20μl);レーン7=第Xa因子での活性化後の精製した最終物+DTT(5μl);レーン8=第Xa因子での活性化後の精製した最終物+DTT(10μl);レーン9=第Xa因子での活性化後の精製した最終物+DTT(20μl);レーン10=分子量マーカー標線。
タンパク質をSDS−PAGEに供して、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、CPOP−Aの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=Ni2+荷電セファロースでの最初の捕捉後の精製物;レーン3=Ni2+荷電セファロースでの最終捕捉前の第Xa因子処理物;レーン4=Ni2+荷電セファロースでの第2の捕捉後の精製物;レーン5=第Xa因子での活性化後の精製した最終物(5μl);レーン6=第Xa因子での活性化後の精製した最終物(10μl);レーン7=第Xa因子での活性化後の精製した最終物(20μl);レーン8=第Xa因子での活性化後の精製した最終物+DTT(5μl);レーン9=第Xa因子での活性化後の精製した最終物+DTT(10μl);レーン10=第Xa因子での活性化後の精製した最終物+DTT(20μl)。
タンパク質をSDS−PAGEに供して、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、CPOPv−Aの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン3=Ni2+荷電セファロースでの最初の捕捉後の精製物;レーン4=Ni2+荷電セファロースでの最終捕捉前の第Xa因子処理物;レーン5=第Xa因子での活性化後の精製した最終物(5μl);レーン6=第Xa因子での活性化後の精製した最終物(10μl);レーン7=第Xa因子での活性化後の精製した最終物(20μl);レーン8=第Xa因子での活性化後の精製した最終物+DTT(5μl);レーン9=第Xa因子での活性化後の精製した最終物+DTT(10μl);レーン10=第Xa因子での活性化後の精製した最終物+DTT(20μl)。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度のCPOPv−Aに24時間曝露した。細胞タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合を、デンシトメトリー分析によって算定した。
タンパク質をSDS−PAGEに供して、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、CPNv−A−FXa−HTの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン1=分子量マーカー標線;レーン2=大腸菌タンパク質全可溶性画分;レーン3=Ni2+荷電セファロースの最終捕捉前の第Xa因子処理物;レーン4=第Xa因子での活性化後の精製した最終物;レーン5=第Xa因子での活性化後の精製した最終物+DTT。
可変スペーサー長のLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物がORL1レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節(DRG)の初代培養物を、1nMの[3H]−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射標識リガンドの特異的結合の減少をシンチレーション計数によって評価し、そして非標識リガンド(Tocrisノシセプチン)の効力に比較してプロットした。上のパネルは、GS0、GS20、GS30およびHx27のスペーサーの置換特性を示しているが、下のパネルは、GS10、GS15、およびGS25のスペーサーによる融合タンパク質により生じた置換を示している。ORL1レセプターからノシセプチンを置き換えるのに、GS0およびGS30スペーサーは無効であり、そしてGS10は有効性に乏しいと結論される。
背根神経節(DRG)の初代培養物を、種々の濃度の(可変スペーサー長の)CPN−Aに24時間曝露した。細胞タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗SNAP−25でプローブしてSNAP−25切断の評価を容易にした。切断されたSNAP−25の割合を、デンシトメトリー分析によって算定した。GS10スペーサーによる融合タンパク質の乏しい効果の結合特性(図28を参照のこと)は、細胞内SNAP−25の切断を生じるのに必要とされる融合物の濃度がより高いことに反映されている。GS0およびGS30スペーサーによる融合タンパク質は、全く無効であった(データは示さず)。GS15、20、および25スペーサーによる融合タンパク質は、同様に有効であった。
配列番号1 N[1−17]のDNA配列
配列番号2 N[1−17]のタンパク質配列
配列番号3 N[1−11]のDNA配列
配列番号4 N[1−11]のタンパク質配列
配列番号5 N[[Y10]1−11]のDNA配列
配列番号6 N[[Y10]1−11]のタンパク質配列
配列番号7 N[[Y11]1−11]のDNA配列
配列番号8 N[[Y11]1−11]のタンパク質配列
配列番号9 N[[Y14]1−17]のDNA配列
配列番号10 N[[Y14]1−17]のタンパク質配列
配列番号11 N[1−13]のDNA配列
配列番号12 N[1−13]のタンパク質配列
配列番号13 Nv(N[[R14K15]1−17]としても公知)のDNA配列
配列番号14 Nv(N[[R14K15]1−17]としても公知)のタンパク質配列
配列番号15 N[1−17]−LHN/A融合タンパク質のDNA配列
配列番号16 N[1−17]−LHN/A融合タンパク質のタンパク質配列
配列番号17 N[[Y11]1−11]−LHN/A融合タンパク質のDNA配列
配列番号18 N[[Y11]1−11]−LHN/A融合タンパク質のタンパク質配列
配列番号19 N[1−13]−LHN/A融合タンパク質のDNA配列
配列番号20 N[1−13]−LHN/A融合タンパク質のタンパク質配列
配列番号21 LHN/A−N[1−17]融合タンパク質のDNA配列
配列番号22 LHN/A−N[1−17]融合タンパク質のタンパク質配列
配列番号23 LHN/C−N[1−11]融合タンパク質のDNA配列
配列番号24 LHN/C−N[1−11]融合タンパク質のタンパク質配列
配列番号25 N[[Y14]1−17]−LHN/C融合タンパク質のDNA配列
配列番号26 N[[Y14]1−17]−LHN/C融合タンパク質のタンパク質配列
配列番号27 LC/AのDNA配列
配列番号28 HN/AのDNA配列
配列番号29 LC/BのDNA配列
配列番号30 HN/BのDNA配列
配列番号31 LC/CのDNA配列
配列番号32 HN/CのDNA配列
配列番号33 CPN−AリンカーのDNA配列
配列番号34 AリンカーのDNA配列
配列番号35 N末端側提示ノシセプチン挿入片のDNA配列
配列番号36 CPN−CリンカーのDNA配列
配列番号37 CPBE−AリンカーのDNA配列
配列番号38 CPNvar−AリンカーのDNA配列
配列番号39 LC/A−CPN−HN/A融合物のDNA配列
配列番号40 LC/A−CPN−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号41 N−LC/A−HN/A融合物のDNA配列
配列番号42 N−LC/A−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号43 LC/C−CPN−HN/C融合物のDNA配列
配列番号44 LC/C−CPN−HN/C融合物のタンパク質配列
配列番号45 LC/C−CPN−HN/C(Aリンカー)融合物のDNA配列
配列番号46 LC/C−CPN−HN/C(Aリンカー)融合物のタンパク質配列
配列番号47 LC/A−CPME−HN/A融合物のDNA配列
配列番号48 LC/A−CPME−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号49 LC/A−CPBE−HN/A融合物のDNA配列
配列番号50 LC/A−CPBE−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号51 LC/A−CPNv−HN/A融合物のDNA配列
配列番号52 LC/A−CPNv−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号53 LC/A−CPN[1−11]−HN/A融合物のDNA配列
配列番号54 LC/A−CPN[1−11]−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号55 LC/A−CPN[[Y10]1−11]−HN/A融合物のDNA配列
配列番号56 LC/A−CPN[[Y10]1−11]−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号57 LC/A−CPN[[Y11]1−11]−HN/A融合物のDNA配列
配列番号58 LC/A−CPN[[Y11]1−11]−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号59 LC/A−CPN[[Y14]1−17]−HN/A融合物のDNA配列
配列番号60 LC/A−CPN[[Y14]1−17]−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号61 LC/A−CPN[1−13]−HN/A融合物のDNA配列
配列番号62 LC/A−CPN[1−13]−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号63 ノシセプチン−スペーサー−LC/A−HN/A融合物のDNA配列
配列番号64 ノシセプチン−スペーサー−LC/A−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号65 CPN−A GS10リンカーのDNA配列
配列番号66 CPN−A GS15リンカーのDNA配列
配列番号67 CPN−A GS25リンカーのDNA配列
配列番号68 CPN−A GS30リンカーのDNA配列
配列番号69 CPN−A HX27リンカーのDNA配列
配列番号70 LC/A−CPN(GS15)−HN/A融合物のDNA配列
配列番号71 LC/A−CPN(GS15)−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号72 LC/A−CPN(GS25)−HN/A融合物のDNA配列
配列番号73 LC/A−CPN(GS25)−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号74 CPNvar−Aエンテロキナーゼ活性化リンカーのDNA配列
配列番号75 LC/A−CPNv(Ek)−HN/A融合物のDNA配列
配列番号76 LC/A−CPNv(Ek)−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号77 CPNvar−AリンカーのDNA配列
配列番号78 LC/C−CPNv−HN/C融合物(act.A)のDNA配列
配列番号79 LC/C−CPNv−HN/C融合物(act.A)のタンパク質配列
配列番号80 LC/A−CPLE−HN/A融合物のDNA配列
配列番号81 LC/A−CPLE−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号82 LC/A−CPOP−HN/A融合物のDNA配列
配列番号83 LC/A−CPOP−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号84 LC/A−CPOPv−HN/A融合物のDNA配列
配列番号85 LC/A−CPOPv−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号86 IgAプロテアーゼのDNA配列
配列番号87 IgA−CPNv−HN/A融合物のDNA配列
配列番号88 IgA−CPNv−HN/A融合物のタンパク質配列
配列番号89 FXa−HTのDNA配列
配列番号90 CPNv−A−FXa−HTのDNA配列
配列番号91 CPNv−A−FXa−HT融合物のタンパク質配列
配列番号92 DTトランスロケーションドメインのDNA配列
配列番号93 CPLE−DT−AのDNA配列
配列番号94 CPLE−DT−A融合物のタンパク質配列
配列番号95 TeNT LCのDNA配列
配列番号96 CPNv−TENT LCのDNA配列
配列番号97 CPNV−TeNT LC融合物のタンパク質配列
配列番号98 CPNvar−CリンカーのDNA配列
配列番号99 LC/C−CPNv−HN/C融合物(act.C)のDNA配列
配列番号100 LC/C−CPNv−HN/C融合物(act.C)のタンパク質配列
(材料)
サブスタンスP EIAを、R&D Systems, UKから入手する。
eDRGの初代神経細胞培養物を、既述(Dugganら, 2002)のようにして樹立させる。この培養物からのサブスタンスP放出を、本質的には、既述(Dugganら, 2002)のようにして、EIAによって評価する。目的のTMを(処理前に少なくとも2週間樹立させた)神経細胞培養物に添加する;TMの代わりにビヒクルを添加することにより、コントロール培養を並行して行う。サブスタンスPの刺激された(100mMのKCl)放出および基礎の放出を、全細胞溶解物含量とともに、コントロール培養およびTM処理培養物の両方について得る。サブスタンスP免疫反応性を、サブスタンスP酵素免疫アッセイキット(Cayman Chemical Company, USAまたはR&D Systems, UK)を製造者の指示書に従って用いて測定する。
(材料)
合成DNAをSigma Genosysから入手。
制限酵素をNew England Biolabsから入手。
触媒活性LHN/Aの発現および精製を、本質的に、Suttonら, (2005), Prot. Express. Purif., 40, 31-41頁に記載のように行った。
(5'-tccaaaactaaatctctgATAGAAGGTAGAaacaaagcgctgaacgac)と(5'-CTTGATGTACTCTGTGAACGTGCTC);および
(5'-gtcgttcagcgctttgttTCTACCTTCTATcagagatttagttttgga)と(5'-ATGGAGTTCGTTAACAAACAGTTC)。
以下に記載の方法は、LHN/Bポリペプチドをコードする適切なプラスミドで形質転換した大腸菌から触媒活性なLHN/Bプロテアーゼを精製する。適切なLHN/Bポリペプチドの種々の配列が、PCT/GB97/02273、US6461617特許、および米国特許出願10/241596(参照文献として本明細書中に援用する)に記載されていることに留意されたい。
LHN/Bのコード領域を、発現ベクターpMAL(New England Biolabs)中のマルトース結合タンパク質(MBP)をコードする遺伝子の3’側にフレームを合わせて挿入し、pMAL-c2x-LHN/Bを作出する。この構築物では、発現されるMBPポリペプチドおよびLHN/Bポリペプチドは、第Xa因子切断部位によって分離され、そしてLCドメインおよびHNドメインは、エンテロキナーゼでの切断を受けやすいペプチドによって分離されている。発現クローンをpMAL-c2X-synLHN/Bと称する。
LHN/Cのコード領域を、発現ベクターpMAL(New England Biolabs)中のマルトース結合タンパク質(MBP)をコードする遺伝子の3’側にフレームを合わせて挿入し、pMAL-c2x-LHN/Cを作製する。この構築物では、発現されるMBPポリペプチドおよびLHN/Cポリペプチドは、第Xa因子切断部位によって分離されている。
(材料)
C末端伸長したノシセプチンペプチドをSigma Genosysから入手。
結合用化学物質をPierceから入手。
C末端Cysを介してノシセプチンペプチドを結合するために、まず、最後のC末端アミノ酸としてCysを含むように、ペプチドを(市販で入手可能な、標準的手順により)合成した。
簡単に言えば、約2つの反応脱離基を、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)との反応によって、LHN/Aに導入した(リン酸緩衝化生理食塩水中5mg/ml)。
(材料)
C末端伸長したノシセプチンペプチドをSigma Genosysから入手。
結合用化学物質をPierceから入手。
凍結乾燥したノシセプチンを、水の添加によって溶解し、そしてMES緩衝液(0.1MのMES、0.1MのNaCl、pH5.0)中に透析した。この溶液(約0.3mg/mlの濃度)に、最終濃度1mg/mlまでPDPH(DMF中100mg/ml)を添加した。混合した後、固体のEDACを添加して、約0.2mg/mlの最終濃度にした。反応を、室温にて少なくとも30分間行った。次いで、過剰のPDPHを、MES緩衝液で予め平衡化したPD−10カラム(Pharmacia)上で脱塩することによって除去した。
(材料)
C末端伸長したノシセプチン1−11ペプチドをSigma Genosysから入手。
結合用化学物質をPierceから入手。
C末端Cysを介してノシセプチン1−11ペプチドを結合するために、まず、最後のC末端アミノ酸としてCysを含むように、ペプチドを(市販で入手可能な、標準的手順により)合成した。
(材料)
C末端伸長したノシセプチンN[[Y14]1−17]ペプチドをSigma Genosysから入手。
結合用化学物質をPierceから入手。
C末端Cysを介してペプチドを結合するために、まず、最後のC末端アミノ酸としてCysを含むように、ペプチドを(市販で入手可能な、標準的手順により)合成した。
ノシセプチン−LHN/AのDNA配列を、LC/A、HN/A、およびノシセプチンのアミノ酸配列の逆翻訳により設計した。ノシセプチン−LC/A−活性化ループ−HN/A配列を含む完全なORFを、標準的なDNA配列操作ソフトウエア(EditSeq)内で組み立てた。LC/AのシステインとHN/Aのシステインとの間の活性化ループ(CVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLC)を改変して、第Xa因子プロテアーゼ認識部位を組み込んだ。
(ノシセプチン1−11)−LHN/BのDNA配列を、LC/B、HN/B、およびノシセプチン1−11のアミノ酸配列の逆翻訳により設計した。(ノシセプチン1−11)−LC/B−活性化ループ−HN/B配列を含む完全なORFを、標準的なDNA配列操作ソフトウエア(EditSeq)内で組み立てた。LC/BのシステインとHN/Bのシステインとの間の活性化ループを改変して、第Xa因子プロテアーゼ認識部位を組み込んだ。
ノシセプチンN[[Y14]1−17]のDNA配列を、LC/C、HN/C、およびノシセプチンN[[Y14]1−17]のアミノ酸配列の逆翻訳により設計した。(ノシセプチンN[[Y14]1−17])−LC/C−活性化ループ−HN/C配列を含む完全なORFを、標準的なDNA配列操作ソフトウエア(EditSeq)内で組み立てた。LC/CのシステインとHN/Cのシステインとの間の活性化ループを改変して、第Xa因子プロテアーゼ認識部位を組み込んだ。
LHN/C−(ノシセプチン1−11)のDNA配列を、LC/C、HN/C、およびノシセプチン1−11のアミノ酸配列の逆翻訳により設計した。LC/C−活性化ループ−HN/C−フレキシブルスペーサー−(ノシセプチン1−11)を含む完全なORF(配列番号23)を、標準的なDNA配列操作ソフトウエア(EditSeq)内で組み立てた。
ノシセプチン−HN−[LC/C]結合体の構築を以下に説明する。ここで、[LC/C]は、ボツリヌス神経毒素C型の軽鎖をコードするポリリジン凝縮DNAを示す。
SPDPは、Pierce Chemical Co.から入手する。
他の試薬は、Sigma Ltd.から入手する。
CMV(前初期)プロモーターの制御下にLC/Cをコードする遺伝子を含むプラスミドを用いて、DNAの凝縮を、1ポリリジンに対して2DNAの比になるようにSPDP誘導体化ポリリジンを用いて行った。次いで、凝縮したDNA(0.4mg/ml)をHN−ノシセプチン(100μg/ml)と25℃にて16時間混合することによって結合体を調製した。SPDP誘導体化ポリリジンとHNドメイン上に存在する遊離のSH基とを結合させて、DNAとタンパク質との共有結合を容易にする。
(ノシセプチン1−11)−HN−[LC/B]結合体の構築を以下に説明する。ここで、[LC/B]は、ボツリヌス神経毒素B型の軽鎖をコードするポリリジン凝縮DNAを示す。
SPDPは、Pierce Chemical Co.から入手する。
他の試薬は、Sigma Ltd.から入手する。
CMV(前初期)プロモーターの制御下にLC/Bをコードする遺伝子を含むプラスミドを用いて、DNAの凝縮を、1ポリリジンに対して2DNAの比になるようにSPDP誘導体化ポリリジンを用いて行った。次いで、凝縮したDNA(0.4mg/ml)をHN−(ノシセプチン1−11)(100μg/ml)と25℃にて16時間混合することによって結合体を調製した。SPDP誘導体化ポリリジンとHNドメイン上に存在する遊離のSH基とを結合させて、DNAとタンパク質との共有結合を容易にする。
Dugganら, (2002, J. Biol. Chem., 277, 34846-34852)に記載の方法を用いて、ブスタンスP放出神経細胞におけるノシセプチン−LHN/Aの活性を評価した。
所与のTMがORL1レセプターを介して作用することの確認は、以下の試験によって提供される。ここでは、TMがフォルスコリン刺激cAMP生産を阻害する能力を評価する。
[3H]アデニンおよび[14C]cAMPはGE Healthcareから入手する。
この試験は、本質的には、Meunierら[Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature 377: 532-535, 1995]によって既述のようにして、24ウェルプラスチックプレート上に播種した無傷のトランスフェクトCHO細胞において行う。
所与のTMがORL1レセプターを介して作用することの確認は、以下の試験、GTPγS結合機能アッセイによっても提供される。
[35S]GTPγSはGE Healthcareから入手する。
小麦胚凝集素コーティング(SPA)ビーズはGE Healthcareから入手する。
このアッセイは、本質的には、TraynorおよびNahorski[Modulation by μ-opioid agonists of guanosine-5-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47: 848-854, 1995]に記載されるようにして行う。
以下の手順によって、マルチドメイン融合物発現用の構成部分バックボーンとして使用するためのLCフラグメントおよびHNフラグメントを作製する。本実施例は、血清型Aベースのクローン(配列番号27および配列番号28)の調製に基づいているが、手順および方法は他の血清型にも同等に適用可能である[血清型B(配列番号29および配列番号30)ならびに血清型C(配列番号31および配列番号32)については配列表に図示]。
pCR 4(Invitrogen)は、構築物の確認を容易にするために、ベクター内の制限配列の欠損および隣接する配列決定プライマー部位によって選択した、選り抜きの標準的なクローニングベクターである。この発現ベクターは、pMAL(NEB)発現ベクターに基づいており、これは、構築物の挿入のために正しい方向でマルチプルクローニング部位内に所望の制限配列を有する(BamHI−SalI−PstI−HindIII)。非動員性プラスミドを作製するために、発現ベクターのフラグメントが除去されており、そして精製の選択肢を増大させるために、種々の異なる融合タグが挿入されている。
LC/A(配列番号27)を、二通りの方法の一方によって作製する:
DNA配列を、[種々の逆翻訳ソフトウエアツール(例えば、EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon))の1つを用いて、GenBank(アクセッション番号P10845)またはSwissprot(アクセッション位置BXA1_CLOBO)のような自由に利用可能なデータベースソースから得られる]LC/Aアミノ酸配列の逆翻訳によって設計する。BamHI/SalI認識配列を、配列の5’末端および3’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み取り枠を維持する。DNA配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について(MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウエアを用いて)スクリーニングする。クローニング系によって必要とされる配列と共通であることが見出されている任意の切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、LC/Aオープンリーディングフレーム(ORF)を含有するこの最適化したDNA配列を商業的に合成し(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター中に提供する。
HN/A(配列番号28)を、二通りの方法の一方によって作製する:
DNA配列を、種々の逆翻訳ソフトウエアツール[例えば、EditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon)]の1つを用いて、[GenBank(アクセッション番号P10845)またはSwissprot(アクセッション位置BXA1_CLOBO)のような自由に利用可能なデータベースソースから得られる]HN/Aアミノ酸配列の逆翻訳によって設計する。N末端にPstI制限配列を、そしてC末端にXbaI−停止コドン−HindIIIを付加し、正しい読み取り枠を維持するようにする。DNA配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について(MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウエアを用いて)スクリーニングする。クローニング系によって必要とされる配列と共通であることが見出されている任意の配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、この最適化したDNA配列を商業的に合成し(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター中に提供する。
(リンカー−ノシセプチン−スペーサー挿入片の調製)
LC−HNリンカーを、鋳型としてリンカーについての既存配列情報を用いて、第一の原則から設計し得る。例えば、血清型Aリンカー(この場合、LCとHNとの間のジスルフィド架橋のシステイン間に存在するドメイン間ポリペプチド領域として定義される)は、23アミノ酸長であり、そして配列VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLを有する。この配列内で、天然でのタンパク質分解活性化により、配列ALNDLのN末端を有するHNドメインが生じることが理解される。この配列情報は、GenBank(アクセッション番号P10845)またはSwissprot(アクセッション位置BXA1_CLOBO)のような利用可能なデータベースソースから自由に入手可能である。このリンカーに、第Xa因子部位、ノシセプチンおよびスペーサーを組み込み、そして種々の逆翻訳ソフトウエアツール[例えば、EditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0(Entelechon)]の1つを用いて、リンカー−リガンド−スペーサー領域をコードするDNA配列を決定する。次いで、制限部位をこのDNA配列に組み込み、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号33)として配置させ得る。スペーサー、ノシセプチン、および制限配列について正しい読み枠を維持すること、そしてDAMメチル化を生じ得る塩基TCがXbaI配列の前にならないようにすることが重要である。このDNA配列を、制限配列の組み込みについてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から任意の付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、この最適化したDNA配列を商業的に合成し(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター中に提供する。
LC−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−HN構築物(配列番号39)を作製するために、リンカー(配列番号33)をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、BamHIおよびSalIで切断したLC/AのDNA(配列番号27)の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。次いで、得られたプラスミドDNAをPstIおよびXbaI制限酵素で切断し、そしてPstIおよびXbaIで切断したHN/AのDNA(配列番号28)の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−HNのORF(配列番号39)を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号40に示される配列の融合タンパク質が発現される。
LC/A−HN/Aバックボーンを、活性化のために第Xa因子部位を付加し、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−リンカー−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号34)として配置させた、合成血清型Aリンカーを用いて、実施例19に記載のように構築する。LC/A−HN/Aバックボーンおよび合成したN末端側提示ノシセプチン挿入片(配列番号35)を、BamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、ゲル精製し、そして一緒に連結してノシセプチン−スペーサー−LC−リンカー−HNを作製する。次いで、ORF(配列番号41)を制限酵素AvaIおよびXbaIを用いて切断し、これは、発現ベクターに移入され、配列番号42に示される配列の融合タンパク質が発現される。
実施例1および2で使用した方法に従って、LC/C(配列番号31)およびHN/C(配列番号32)を作製し、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号36)として配置させた血清型Cリンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−HNのORF(配列番号43)を含んでおり、これは、配列番号44に示される配列のタンパク質として発現する。
実施例1および2で使用した方法に従って、LC/C(配列番号31)およびHN/C(配列番号32)を作製し、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号33)として配置させた血清型Aリンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−HNのORF(配列番号45)を含んでおり、これは、配列番号46に示される配列のタンパク質として発現する。
metエンケファリンリガンドのサイズが小さい(5アミノ酸)ため、LC/A−metエンケファリン−HN/A融合物を、鋳型としてLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(配列番号39)を用いる部位特異的変異誘発[例えば、Quickchange(Stratagene Inc.)を用いて]によって作製する。YGGFM metエンケファリンペプチドをコードし、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(配列番号39)のリンカー領域に相補的な配列が隣接するオリゴヌクレオチドを設計する。SDM産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、LC−リンカー−metエンケファリン−スペーサー−HNのORF(配列番号47)を含んでおり、これは、配列番号48に示される配列のタンパク質として発現する。
実施例1および2で使用した方法に従って、LC/A(配列番号27)およびHN/A(配列番号28)を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−βエンドルフィン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号37)として配置させた血清型Aのβエンドルフィンリンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−βエンドルフィン−スペーサー−HNのORF(配列番号49)を含んでおり、これは、配列番号50に示される配列のタンパク質として発現する。
実施例1および2で使用した方法に従って、LC/A(配列番号27)およびHN/A(配列番号28)を作製し、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号38)として配置させた血清型Aのノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−HNのORF(配列番号51)を含んでおり、これは、配列番号52に示される配列のタンパク質として発現する。
25mlの50mM HEPES(pH7.2)、200mMのNaClおよび約10gの大腸菌BL21細胞ペーストを含むファルコン管を解凍する。この融解した細胞ペーストを50mM HEPES(pH7.2)、200mMのNaClで80mlにし、そして氷上にて、22ミクロンのパワーで30秒間オン、30秒間オフを10サイクルで超音波処理し、試料を冷却したままにする。溶解した細胞を18,000rpmで4℃にて30分間遠心分離する。この上清を、50mMのHEPES(pH7.2)、200mMのNaClで平衡化した0.1M NiSO4荷電キレートカラム(20〜30mlカラムが十分である)に供する。10mMおよび40mMのイミダゾールの段階グラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を100mMイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を5Lの50mMのHEPES(pH7.2)、200mMのNaClに対して4℃にて終夜透析し、そして透析した融合タンパク質のODを測定する。100μg融合タンパク質当たり1単位の第Xa因子を添加し、そして25℃にて終夜静置インキュベートする。50mM HEPES(pH7.2)、200mM NaClで平衡化しておいた0.1M NiSO4荷電キレートカラム(20〜30mlカラムが十分である)に供する。50mMのHEPES(pH7.2)、200mMのNaClでベースラインまでカラムを洗浄する。10mMおよび40mMのイミダゾールの段階グラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を100mMイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を5Lの50mMのHEPES(pH7.2)、200mMのNaClに対して4℃にて終夜透析し、そしてこの融合物を約2mg/mlに濃縮し、試料を小分けし、そして−20℃にて凍結する。OD、BCA、純度分析、およびSNAP−25評価を用いて精製タンパク質を試験する。
リンカー−ノシセプチン−スペーサー挿入片を、実施例19に記載のように調製する。
LC−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−HN構築物(配列番号39)を作製するために、リンカー(配列番号33)をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、同様にBamHIおよびSalIで切断したLC/AのDNA(配列番号27)の挿入および連結用のレシピエントとして使用する。次いで、得られたプラスミドDNAをBamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてpMALベクター(NEB)のようなBamHI、SalI、PstI、およびHindIIIに対する独自のマルチプルクローニング部位を含むベクターを同様に切断して、これにLC/A−リンカーフラグメントを挿入する。次いで、HN/AのDNA(配列番号28)をPstIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてこれを同様に切断したpMAL−LC/A−リンカー構築物に挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−HNのORF(配列番号39)を含んでおり、これは、配列番号40に示される配列のタンパク質として発現する。
ノシセプチン−スペーサー−LC/A−HN/A構築物を作製するために、活性化のために第Xa因子部位を付加し、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−リンカー−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号34)として配置させた血清型Aリンカーを、実施例27に記載のように合成する。このリンカーをコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、同様にBamHIおよびSalIで切断したLC/AのDNA(配列番号27)の挿入および連結用のレシピエントとして使用する。次いで、得られたプラスミドDNAをBamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、そして合成したN末端提示ノシセプチン挿入片(配列番号35)を含む同様に切断したベクターにLC/A−リンカーフラグメントを挿入する。次いで、この構築物をAvaIおよびHindIIIで切断し、そしてpMALプラスミド(NEB)のような発現ベクターに挿入する。次いで、HN/AのDNA(配列番号28)を、PstIおよびHindIII制限酵素で切断し、そして同様に切断したpMAL−ノシセプチン−LC/A−リンカー構築物に挿入する。最終構築物は、ノシセプチン−スペーサー−LC/A−HN/AのORF(配列番号63)を含んでおり、これは、配列番号64に示される配列のタンパク質として発現する。
実施例19で用いたのと同じストラテジーを用いて、ノシセプチンおよび可変スペーサー内容物をコードする種々のDNAリンカーを調製した。種々の逆翻訳ソフトウエアツール[例えば、EditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0(Entelechon)]の1つを用いて、リンカー−リガンド−スペーサー領域をコードするDNA配列を決定する。次いで、制限部位をDNA配列に組み込み、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号65〜配列番号69)として配置させ得る。スペーサー、ノシセプチン、および制限配列について正しい読み枠を維持すること、そしてDAMメチル化を生じる塩基TCがXbaI配列の前にならないようにすることが重要である。このDNA配列を、制限配列の組み込みについてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から任意の付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、この最適化したDNA配列を商業的に合成し(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター中に提供する。
実施例2および9に従って調製した融合タンパク質をeDRG神経細胞モデルにおいて評価した。
実施例8および9に従って調製した融合タンパク質を、実施例30に記載の方法を用いて、eDRG神経細胞モデルにおいて評価した。
実施例1および2で使用した方法に従って、LC/A(配列番号27)およびHN/A(配列番号28)を作製し、BamHI−SalI−リンカー−エンテロキナーゼプロテアーゼ部位−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号74)として配置させた血清型Aのノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−HNのORF配列(配列番号75)を含んでおり、これは、配列番号76に示される配列のタンパク質として発現する。この融合タンパク質をCPNv(Ek)−Aと称する。図18は、活性化のために100μgの融合タンパク質当たり0.00064μgでエンテロキナーゼを用いたこと以外は実施例26で使用した方法に従った、大腸菌からのCPNv(Ek)−Aの精製を示している。
実施例32で調製したCPNv(Ek)−Aを精製形態で得て、eDRG細胞モデルに適用してSNAP−25の切断を評価する(実施例30からの方法を用いる)。図19は、CPNv(Ek)−AへのeDRGの24時間曝露後のSNAP−25の切断を示している。切断の効率は、実施例31に記載したように、第Xa因子切断物で得られるのと同様であることが観察されている。
実施例21で使用した方法に従って、LC/C(配列番号31)およびHN/C(配列番号32)を作製し、BamHI−SalI−リンカー−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号77)として配置させた血清型Aのノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−HNのORF配列(配列番号78)を含んでおり、これは、配列番号79に示される配列のタンパク質として発現する。この融合タンパク質をCPNv−C(act.A)と称する。図20は、実施例26で使用した方法に従った、大腸菌からのCPNv−C(act.A)の精製を示している。
実施例26で使用した方法に従って、実施例34で調製したCPNv−C(act.A)を精製形態で得て、eDRG細胞モデルに適用してSNAP−25の切断を評価する(実施例30からの方法を用いる)。融合物への24時間曝露後、3.1±2.0nMの融合物濃度で、最大の50%のシンタキシン切断が生じている。図21は、CPNv−C(act.A)へのeDRGの24時間曝露後のシンタキシンの切断を示している。
LC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(CPN/A)が急性カプサイシン誘発機械的異痛を阻害する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注射により評価する。試験動物を、研究に参加させる前、CPN/Aでの皮下処置後カプサイシン投与前、およびCPN/Aの注射後カプサイシン追加投与後(15分および30分での応答の平均)に、10gのVon Freyフィラメントによる一連の刺激(10刺激×3試行)に応じた足逃避率(PWF%)について評価する。カプサイシン追加投与を10μLの0.3%溶液の注射によって行う。試料希釈液を、0.5%BSA/生理食塩水中で調製する。図22は、LC/A−ノシセプチン−HN/A融合物の種々の濃度での動物の前処置により得られる機械的異痛の逆転を示している。
LC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合物(CPNv/A)がカプサイシン誘発機械的異痛を阻害する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注射により評価する。試験動物を、研究に参加させる前(処置前);CPNv/Aでの皮下足底内処置後カプサイシン投与前(CAP前);およびCPNv/Aの注射後カプサイシン追加投与後(15分および30分での応答の平均;CAP)に、10gのVon Freyフィラメントによる一連の刺激(10刺激×3試行)に応じた足逃避率(PWF%)について評価する。カプサイシン追加投与を10μLの0.3%溶液の注射によって行う。試料希釈液を、0.5%BSA/生理食塩水中で調製する。
leuエンケファリンリガンドのサイズが小さい(5アミノ酸)ため、LC/A−leuエンケファリン−HN/A融合物を、鋳型としてLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(配列番号39)を用いる部位特異的変異誘発[例えば、Quickchange(Stratagene Inc.)を用いて]によって作製する。YGGFL leuエンケファリンペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを設計し、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(配列番号39)のリンカー領域に相補的な配列を隣接させる。SDM産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、LC−リンカー−leuエンケファリン−スペーサー−HNのORF(配列番号80)を含んでおり、これは、配列番号81に示される配列のタンパク質として発現する。この融合タンパク質をCPLE−Aと称する。図25は、実施例26で使用した方法に従った、大腸菌からのCPLE−Aの精製を示している。
実施例26で使用した方法に従って、そして実施例24で作製したLC/A−βエンドルフィン−HN/A融合タンパク質(CPBE−Aと称する)を用いて、CPBE−Aを大腸菌から精製する。図26は、SDS−PAGEにより分析した精製したタンパク質をSDS−PAGEによる分析にて示している。
ノシセプチン配列を1位でPheからTyrに変異させるのに必要な単一アミノ酸改変のために、LC/A−ノシセプチン変異体−HN/A融合物を、鋳型としてLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(配列番号39)を用いる部位特異的変異誘発[例えば、Quickchange(Stratagene Inc.)を用いて]によって作製する。ノシセプチン配列の1位でチロシンをコードするオリゴヌクレオチドを設計し、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のLC/A−ノシセプチン−HN/A融合物(配列番号39)のリンカー領域に相補的な配列を隣接させる。SDM産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、LC/A−ノシセプチン変異体−スペーサー−HN/A融合物のORF(配列番号82)を含んでおり、これは、配列番号83に示される配列のタンパク質として発現する。この融合タンパク質をCPOP−Aと称する。図27は、実施例26で使用した方法に従った、大腸菌からのCPOP−Aの精製を示している。
ノシセプチン配列を1位でPheからTyrに変異させるのに必要な単一アミノ酸改変のために、LC/A−ノシセプチン改変体変異体−HN/A融合物を、鋳型としてLC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合物(配列番号51)を用いる部位特異的変異誘発[例えば、Quickchange(Stratagene Inc.)を用いて]によって作製する。ノシセプチン配列の1位でチロシンをコードするオリゴヌクレオチドを設計し、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のLC/A−ノシセプチン改変体−HN/A融合物(配列番号51)のリンカー領域に相補的な配列を隣接させる。SDM産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、LC/A−ノシセプチン変異体−スペーサー−HN/A融合物のORF(配列番号84)を含んでおり、これは、配列番号85に示される配列のタンパク質として発現する。この融合タンパク質をCPOPv−Aと称する。図28は、実施例26で使用した方法に従った、大腸菌からのCPOPv−Aの精製を示している。
IgAプロテアーゼアミノ酸配列を、自由に利用可能なデータベース供給源(例えば、GenBank(アクセッション番号P09790))から入手した。N. GonorrhoeaeIgAプロテアーゼ遺伝子の構造に関する情報は、文献で入手可能である(Pohlnerら, Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease, Nature, 1987, 325(6103), 458-62)。Backtranslation tool v2.0(Entelechon)を用いて、大腸菌発現のために改変したIgAプロテアーゼをコードするDNA配列を決定した。BamHI認識配列をIgAのDNAの5’末端に組み込み、システインアミノ酸をコードするコドンおよびSalI認識配列を3’末端に組み込んだ。DNA配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について、MapDraw(DNASTAR Inc.)を用いてスクリーニングした。クローニングに必要とされる配列と共通であることが見出されている任意の切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)によって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表を参照することによって評価した。次いで、IgAオープンリーディングフレーム(ORF)を含むこの最適化したDNA配列(配列番号86)を商業的に合成する。
第Xa因子の除去可能なhisタグ(his6)をコードするDNAを調製したが、エンテロキナーゼのような別のプロテアーゼ部位およびもっと長いヒスチジンタグのような別の精製タグもまた可能であることが明らかである。種々の逆翻訳ソフトウエアツール[例えば、EditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0(Entelechon)]の1つを用いて、第Xa因子の除去可能なhisタグ領域をコードするDNA配列を決定する。次いで、制限部位をこのDNA配列に組み込み、そしてNheI−リンカー−SpeI−PstI−HN/A−XbaI−LEIEGRSGHHHHHH停止コドン−HindIII(配列番号89)として配置させ得る。このDNA配列を、組み込まれた制限配列についてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から任意の付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、この最適化したDNA配列を商業的に合成し(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター中に提供する。CPNv−A−FXa−HT(配列番号90、除去可能なhisタグ構築物)を作製するために、除去可能なhisタグをコードしているpCR 4ベクターをNheIおよびHindIIIで切断する。次いで、NheI−HindIIIフラグメントを、同様にNheIおよびHindIIIによって切断しておいたLC/A−CPNv−HN/Aベクター(配列番号51)に挿入する。最終構築物は、LC/A−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−HN−FXa−Hisタグ−HindIIIのORF配列(配列番号90)を含んでおり、これは、配列番号91に示される配列のタンパク質として発現する。図30は、実施例26で使用した方法に従った、大腸菌からのCPNv−A−FXa−HTの精製を示している。
DNA配列を、種々の逆翻訳ソフトウエアツール[例えば、EditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0(Entelechon)]の1つを用いるジフテリア毒素のトランスロケーションドメインのアミノ酸配列(GenBank(アクセッション番号1XDTT)のような自由に利用可能なデータベースソースから入手)の逆翻訳によって設計する。次いで、制限部位をこのDNA配列に組み込み、そしてNheI−リンカー−SpeI−PstI−ジフテリアトランスロケーションドメイン−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号92)として配置させ得る。PstI/XbaI認識配列を、配列のトランスロケーションドメインの5’末端および3’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み枠を維持する。このDNA配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について、(MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウエアを用いて)スクリーニングする。クローニング系に必要とされる配列と共通であることが見出されている任意の切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、ジフテリアトランスロケーションドメインを含むこの最適化したDNA配列を、NheI−リンカー−SpeI−PstI−ジフテリアトランスロケーションドメイン−XbaI−停止コドン−HindIIIとして商業的に合成し(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター(Invitrogen)中に提供する。ジフテリアトランスロケーションドメインをコードしているpCR 4ベクターをNheIおよびXbaIで切断する。次いで、NheI−XbaIフラグメントを、同様にNheIおよびXbaIによって切断しておいたLC/A−CPLE−HN/Aベクター(配列番号80)に挿入する。最終構築物は、LC/A−leuエンケファリン−スペーサー−ジフテリアトランスロケーションドメインのORF配列(配列番号93)を含んでおり、これは、配列番号94に示される配列のタンパク質として発現する。
DNA配列を、種々の逆翻訳ソフトウエアツール[例えば、EditSeq best E. coli reverse translation(DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0(Entelechon)]の1つを用いて、破傷風菌毒素LCアミノ酸配列(GenBank(アクセッション番号X04436)のような自由に利用可能なデータベースソースから入手)の逆翻訳によって設計する。BamHI/SalI認識配列を、配列の5’末端および3’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み枠を維持する(配列番号95)。このDNA配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について、(MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウエアを用いて)スクリーニングする。クローニング系に必要とされる配列と共通であることが見出されている任意の切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser(Geneart)のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてGC含量%およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照することによって評価する。次いで、破傷風菌毒素LCのオープンリーディングフレーム(ORF)を含むこの最適化したDNA配列を、商業的に合成し(例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる)、そしてpCR 4ベクター(Invitrogen)中に提供する。TeNT LCをコードしているpCR 4ベクターをBamHIおよびSalIで切断する。次いで、BamHI−SalIフラグメントを、同様にBamHIおよびSalIによって切断しておいたLC/A−CPNv−HN/Aベクター(配列番号51)に挿入する。最終構築物は、TeNT LC−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−HNのORF配列(配列番号96)を含んでおり、これは、配列番号97に示される配列のタンパク質として発現する。
実施例21で使用した方法に従って、LC/C(配列番号31)およびHN/C(配列番号32)を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII(配列番号98)として配置させた血清型Cノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、LC−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−HNのORF配列(配列番号99)を含んでおり、これは、配列番号100に示される配列のタンパク質として発現する。この融合タンパク質をCPNv−C(act.C)と称する。
Claims (13)
- 侵害受容感覚求心性細胞におけるエキソサイトーシス融合の阻害または低減のための非細胞傷害性タンパク質結合体であって、
(i)ノシセプチンターゲティング部分(TM)であって、該ノシセプチンTMが、該侵害受容感覚求心性細胞上に存在するレセプターのアゴニストであり、そして該レセプターが、エンドサイトーシスを受けて該侵害受容感覚求心性細胞内のエンドソームに取り込まれる、TM;
(ii)非細胞傷害性プロテアーゼであって、
該プロテアーゼが該侵害受容感覚求心性細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得、該非細胞傷害性プロテアーゼがクロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼまたはIgAプロテアーゼから選択される、プロテアーゼ;および
(iii)トランスロケーションドメインであって、
該トランスロケーションドメインが、ボツリヌスHNドメインであるか、または該トランスロケーションドメインが、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素のドメインII、炭疽菌毒素、インフルエンザウイルスヘマグルチニンに由来する融合性および/または両親媒性のペプチド、セムリキ森林ウイルス融合性タンパク質、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質G、SERウイルスFタンパク質および泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質より選択されるトランスロケーションドメインであり、
エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼをトランスロケートする、トランスロケーションドメイン、
を含み、
該非細胞傷害性タンパク質結合体が、該非細胞傷害性プロテアーゼ、該ノシセプチンTM、該トランスロケーションドメインの順、または、該ノシセプチンTM、該非細胞傷害性プロテアーゼ、該トランスロケーションドメインの順で配置されている、
非細胞傷害性タンパク質結合体。 - 前記レセプターが、ORL1レセプターである、請求項1に記載の非細胞傷害性結合体。
- 前記ノシセプチンTMが、配列番号2である、請求項1または2に記載の非細胞傷害性結合体。
- 前記ノシセプチンTMが、配列番号4、6、8、10、12、14からなる群より選択される、請求項1または2に記載の非細胞傷害性結合体。
- 前記侵害受容感覚求心性細胞が、一次侵害受容感覚求心性細胞である、請求項1から4のいずれかの項に記載の非細胞傷害性結合体。
- 前記結合体が、配列番号16、18、20、22、24、および26からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の非細胞傷害性結合体。
- 前記ノシセプチンTM、前記トランスロケーションドメイン、および前記プロテアーゼが、共有結合される、請求項1から6のいずれかの項に記載の非細胞傷害性結合体。
- 請求項1から7のいずれかの項に記載の結合体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
- 請求項1から7のいずれかの項に記載の結合体をコードする、DNA構築物。
- 前記構築物が、配列番号15、17、19、21、23、および25から選択されるDNA配列を含む、請求項9に記載のDNA構築物。
- 宿主細胞において請求項9に記載のDNA構築物を発現させる工程を含む、請求項1から7のいずれかの項に記載の結合体の調製方法。
- 請求項1から7のいずれかの項に記載の結合体または請求項8に記載の組成物を含む、疼痛の治療用組成物。
- 疼痛の治療用の医薬品の製造のための、請求項1から7のいずれかの項に記載の結合体または請求項8に記載の組成物の使用。
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