CZ294376B6 - Hybridní protein a léčivo pro inhibici degranulace žírných buněk - Google Patents

Hybridní protein a léčivo pro inhibici degranulace žírných buněk Download PDF

Info

Publication number
CZ294376B6
CZ294376B6 CZ20004161A CZ20004161A CZ294376B6 CZ 294376 B6 CZ294376 B6 CZ 294376B6 CZ 20004161 A CZ20004161 A CZ 20004161A CZ 20004161 A CZ20004161 A CZ 20004161A CZ 294376 B6 CZ294376 B6 CZ 294376B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
fragment
hybrid protein
protein
ige
cells
Prior art date
Application number
CZ20004161A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20004161A3 (cs
Inventor
Hans Bigalke
Jürgen FREVERT
Original Assignee
Biotecon Gesellschaft Für Biotechnologische Entwic
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotecon Gesellschaft Für Biotechnologische Entwic filed Critical Biotecon Gesellschaft Für Biotechnologische Entwic
Publication of CZ20004161A3 publication Critical patent/CZ20004161A3/cs
Publication of CZ294376B6 publication Critical patent/CZ294376B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Hybridní protein zahrnující nebo sestávající z (i) z jednoho o sobě známého proteinu, který se váže o sobě známým způsobem na žírné buňky a/nebo basofily a/nebo je jimi zachycen, a (ii) o sobě známé proteázy, která štěpí jeden nebo několik proteinů sekrečního aparátu žírných buněk a/nebo basofilů. Použití tohoto hybridního proteinu pro výrobu léčiva pro inhibici degranulace žírných buněk.ŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká hybridního proteinu a léčiva pro inhibici degranulace žírných buněk.
Dosavadní stav techniky
Alergické reakce okamžitého typu jsou charakteristické tím, že dotyční pacienti vytvářejí protilátky typu IgE proti alergenům (například pylům, roztočům v domácím prachu, zvířecím chlupům). Tyto protilátky necirkulují pouze v krvi, nýbrž jsou vázány také na buňky tkání, které mají specifický receptor pro část IgE-molekuly, Fc-fragment, v plasmatické membráně (Fishman. A., Lorberboum-Galski. H. (1997) Targeted elimination of cells expressing the high-affinity receptor for IgE (Fc epsilon RI) by a Pseudomonas exotoxinbase chimeric protein Eur. J. Immunol., 27:486-494; Hamawy. M.M. (Ed.) (1997) IgE Receptor (FceRI) Function v: Mast Cells and Basophils Springer Verlag). Buňky s IgE-receptory jsou výlučně žímé buňky a basofily. Tyto buňky jsou efektorové buňky pro alergické reakce okamžitého typu. Hromadí vesikula, která obsahují vasoaktivní aminy, jakož i prostaglandiny a leukotrieny (deriváty kyseliny arachidonové). Uvolňování těchto látek, které vede k degranulaci žírných buněk, se děje specifickým a nespecifickým mechanismem. Jestliže se buňky mechanicky rozruší, například škrábnutím na kůži, uvolní se nespecificky histamin. Kůže rány zčervená. Tvoří se otoky (edemy) a kůže svědí (trojnásobná odpověď). Látky, které uvolňují specificky histamin, jsou účinné v relativně nízkých koncentracích a vyvolávají následující řetězec symptomů: aktivaci fosfolipázy C, - tvorbu druhého posla, diacylglycerolu a IP3'-, mobilizaci vápníku z buněčných zásob - fúzi granul s buněčnou membránou - exocytózu granul bez cytolýzy - výměnu sodíku za pozitivně nabitý histamin z komplexu s heparinem a zásaditým proteinem - uvolňování histaminu z granulámí matrice. Jestliže dojde ke styku mezi žímými buňkami alergika s alergenem, tak se IgE-molekuly navážou na povrch buňky tohoto alergenu. Jestliže se naváže dostatečný počet molekul alergenu, dojde k agregaci receptorů v plasmatické membráně. Agregace je specifickým popudem pro vyvolání výše popsané kaskády signálů uvnitř buňky. Uvolněné látky vyvolají alergické příznaky (zánět spojivek, rýmu, astma, otok hrtanu, kopřivku, pokles krevního tlaku až do výrazného anafylaktického šoku). Peptidy, které jsou obsaženy ve včelím jedu, jako například degranulační peptid žírných buněk (mast cell degranulating peptide - MCD), vyvolávají rovněž degranulaci žírných buněk. I některá léčiva způsobují specifické uvolnění histaminu jako nežádoucí účinek. U lidí je uvolňování histaminu popsáno v případě prostředků pro uvolňování svalů, dextranů, kyseliny acetylosalicylové (aspirin), morfinu, antibiotik, rentgenokontrastních prostředků, cizích sér atd.
Jestliže se zabrání fúzi vesikul s plasmatickou membránou, tak nedojde k uvolnění aminů a kyseliny arachidonové. Následně se nespustí žádné alergické reakce. Procesu sekrece, popřípadě uvolňování, se účastní řada proteinů (fúzní proteiny), které mohou být vázány na membrány sekrečních vesikul a/nebo na plasmatickou membránu. Mohou se také nacházet v cytosolu. K těmto proteinům patří protein asociovaný se synaptosomem SNAP 25, synaptobrevin (VAMP) a syntaxin, popřípadě jejich isoformy. Tyto proteiny tvoří komplex (fúzní komplex), který fixuje sekreční vesikulu na vnitřní straně plasmatické membrány. Fixace předchází splynutí vesikuly s plasmatickou membránou, která byla vyvolána přísunem Ca++ jenž je zprostředkován IgE. Inaktivací jednoho z proteinů, patrně proteolytickým štěpením, se zabrání tomu, aby se vytvořil komplex.
U nervových buněk jsou, jak známo, uvedené fúzní proteiny cílovými molekulami (substráty) lehkých řetězců neurotoxinů, které jsou vyráběny bacilem Clostridium botulinum (Ahnert-Hilger G., Bigalke H. (1995) Molecular aspects of tetanus and botulinum neurotoxin poisoning. Progress in Neurobiology 46:83-96). V současné době je známo sedm typů botulotoxinů (A, B,
- 1 CZ 294376 B6
Cl, D, E, F a G). Zmíněný synaptobrevin je kromě toho i cílovou molekulou pro lehký řetězec tetanového toxinu (TENT) (Link E., Edelmann I., Chou J., Binz T., Yamasaki S., Eisel U., Baumert M., Siidhof T.C., Niemann H. & Jahn R. (1992) Tetanus toxin action: Inhibition of neurotransmitter release linked to synaptobrevin proteolysis. Biochem. Biophys. Res. Comm.
189:18423-26), který je produkován Clostridium tetani, jakož i pro proteázu z Neisseria gonorrhoeae (Binscheck T., Bartels F., Bergel H., Bigalke H, Yamasaki S., Hayashi T., Niemann H., Polner J. (1995) IgA protease from Neisseria gonorrhoeae inhibits exocytosis in bovine chromaffin cells like tetanus toxin. J. biol. Chem. 270:1770-1774). Toxiny, kromě těch, které byly jmenovány jako poslední, sestávají nejméně ze dvou funkčních domén. C-Terminální část pro10 teinu (těžký řetězec) je zodpovědná za vazbu na nervovou buňku, zatímco N-terminální část (lehký řetězec) se vyznačuje výše popsanou vysoce specifickou proteolytickou aktivitou. Toxiny se vážou přes svůj těžký řetězec na nervové buňky a endocytosou zprostředkovanou receptory a následující translokací se dostávají do cytosolu, kde štěpí jeden nebo více uvedených fúzních proteinů, které jsou konstitutivní pro fůzní komplex. Po štěpení každého z těchto proteinů se 15 zabrání sekreci acetylcholinu, popřípadě jiných přenašečů z nervových buněk (Binscheck T.,
Wellhoner H.H. (1997) Tetanus and botulinum toxins - zinc proteases - synaptotagmin - exocytosis, v: Toxins and signál transduction (Eds.: Gutman Y., Lazarovici P.) 1:457-487).
Zábrany sekrece přenašeče se již terapeuticky využívá pro léčení dystonických poruch hybnosti 20 nebo pro potlačení nadměrných parasympatických aktivit (Benecke R., Kessler K. R. (1995)
Botulinumtoxin A Akt. Neurol. 22:209-213). Pro neurotoxiny z Clostridinum nejsou známy žádné jiné biologické substráty kromě fúzních proteinů. Těžké řetězce mají vysokou afinitu k periferním nervovým buňkám, takže se s nimi svázané lehké řetězce dostanou pouze do těchto buněk a v nich jsou účinné. I jiné typy buněk, ve kterých probíhají sekreční procesy, mají sice výše uve25 děné substráty, nemají však žádný mechanismus pro přijetí proteázy (Marxen P., Fuhrmann U.,
Bigalke H. (1989) Gangliosides mediate inhibitory effects of tetanus and botulinum A neurotoxins on exocytosis in chromaffin cells Toxicon 27:849-859), jako například žímé buňky a basofily.
Podstata vynálezu
V základním provedení a) je předmětem vynálezu hybridní protein zahrnující nebo sestávající z (i) z jednoho o sobě známého proteinu, který se váže o sobě známým způsobem na žímé buňky a/nebo basofily a/nebo je jimi zachycen, a (ii) o sobě známé proteázy, která štěpí jeden nebo několik proteinů sekrečního aparátu žímých buněk a/nebo basofilů.
Ve výhodném provedení b) je předmětem vynálezu hybridní protein základního provedení, kde protein (i) je vybrán z IgE; fragmentu IgE, zejména fragmentu IgE-Fc; protilátky proti fragmentu IgE-receptoru žímých buněk a/nebo basofilů, fragmentu protilátky proti IgE-receptoru žímých buněk a/nebo basofilů, zejména Fab-fragment; protilátky proti kanálu draslíku specifickému pro 45 žímé buňky, a inaktivního, ale vázajícího MCD-peptidu.
Ve výhodném provedení c) je předmětem vynálezu hybridní protein podle provedení a) nebo b), kde proteáza (ii) je vybrána z lehkého řetězce toxinu Clostridium botulinum, zejména typu A, B, Cl, D, E, F nebo G, katalyticky aktivního fragmentu lehkého řetězce toxinu Clostridium botuli50 num, zejména typu A, B, Cl, D, E, F nebo G, lehkého řetězce toxinu tetanu (TeNT); katalyticky aktivního fragmentu lehkého řetězce toxinu tetanu. IgA-proteázy Neisseria gonorrhoeae, a katalytické domény IgA-proteázy Neisseria gonorrhoeae.
-2CZ 294376 B6
Ve výhodném provedení d) je předmětem vynálezu hybridní protein podle provedení b) nebo c), kde protein (i) je vybrán z látek uvedených v provedení b) a proteáza je vybrán z látek uvedených v provedení c).
Ve výhodném provedení e) je předmětem vynálezu hybridní protein podle provedení d), který kromě lehkého řetězce toxinu Clostridium botulinum zahrnuje také N-terminální část těžkého řetězce tohoto toxinu (HN fragment) nebo jeho fragment.
Předmětem vynálezu je dále také použití hybridního proteinu podle některého z výše uvedených provedení a) až e) pro výrobu léčiva pro inhibici degranulace žímých buněk.
Při usmrcení žímých buněk, vyvstává nebezpečí, že dojde k alergickému šoku, když se z odumřelých žímých buněk uvolní nahromaděné endogenní aminy. Úbytek počtu žímých buněk kromě toho stimuluje novou syntézu těchto buněk, které jsou potom opět k dispozici pro alergické reakce. Hybridní protein podle vynálezu se tím liší základně od známého konjugátu IgE-Fc/pseudomonas-exotoxin, který inhibuje svou ADP-ribosylační aktivitou syntézu proteinu a tím vyvolává smrt buněk (Fishman. A., Lorberboum-Galski. H. (1997) Targeted elimination of cells expressing the high-affinity receptor for IgE (Fc epsilon Rl) by a Pseudomonas exotoxinbase chimeric protein Eur. J. Immunol., 27:486-494). Naproti tomu hybridní protein podle vynálezu nevyvolává usmrcení žímých buněk. Buňky zůstávají většinou po působení vitální a ztrácí pouze schopnost uvolňovat vasokonstrikční aminy. Nedochází ke stimulaci nové syntézy. Při terapeutickém použití se zabrání možným toxickým vedlejším účinkům, které je možné očekávat u konjugátu, založeného na kompletním cytotoxickém toxinu z Pseudomonas nebo srovnatelném cytotoxinu.
Předmětem vynálezu může být tedy konjugát (hybridní protein), sestávající z (i) proteinu nebo peptidu (transportního proteinu peptidu) s vysokou afinitou k žímým buňkám/basofilům a (ii) specifické proteázy, který blokuje degranulaci, popřípadě sekreční mechanismus buněk. Konjugát slouží k léčení/profylaxi alergických reakcí okamžitého typu.
(i) Jako žímé buňky vázající složky konjugátu s vysokou afinitou se používá zejména imunoglobulinu typu E (IgE), popřípadě jeho fragmentů (například Fc-fragmentu). Dále se používá i protilátek proti specifickým povrchovým molekulám žímých buněk (basofilům), které se vážou selektivně na jejich plasmatickou membránu. Především splňují tento účel protilátky proti IgEreceptoru. Jako transportního peptidu v hybridním proteinu je dále vhodné používat inaktivních, ale vázajících mutantů degranulačního peptidu žímých buněk. Tyto transportní peptidy/proteiny slouží k tomu, aby vyplavily proteázu do buněk. Tato proteáza štěpí ve fúzním komplexu žímých buněk vysoce specifické proteiny, které zavádějí degranulační mechanismus buněk.
(ii) Jako vysoce specifická proteáza slouží metalloproteáza, například lehký řetězec botulotoxinu typu A, B, Cl, D, E, F nebo G (BONT/X) nebo tetanového toxinu (TeNT) nebo IfAproteáza z Neisseria gonorrhoeae. Tyto proteázy štěpí protein asociovaný se synaptosomem (MR 25, 000) (SNAP 25), synaptobrevin nebo syntaxin. Jestliže se štěpí pouze jeden ze jmenovaných proteinů/peptidů, zabrání se degranulaci žímých buněk. Potom nedojde již k žádné sekreci histaminu, prostaglandinů a leukotrienů a nemůže již dojít k alergickým symptomům.
Podle předloženého vynálezu se mohou netoxické lehké řetězce toxinů spojovat s transportními proteiny, které se vážou výlučně na žímé buňky nebo basofily, a proto jsou zachyceny pouze těmito buňkami, přičemž lehlé řetězce se takříkajíc dostanou současně do takovýchto buněk jako jezdci po skluzavce. Do nervových buněk nebo jiných typů buněk organismu nemohou proniknout, takže účinek zůstane omezen na žímé buňky a basofily. Jestliže je jeden z těchto substrátů proteologicky rozrušen, neobjeví se při styku buněk obsahujících IgE s alergeny nebo s některým ze shora uvedených léčiv žádné alergické symptomy.
-3CZ 294376 B6
Jako proteiny vázající specificky žímé buňky se používají:
1) imunoglobuliny typu E, jejich fragmenty typu Fc,
2) protilátky proti receptorů IgE,
3) degranulační peptid žímých buněk a
4) protilátky proti draslíkovému kanálu specifickému pro žímé buňky.
K uvedeným proteinům lze poukázat na následující stav techniky:
- IgE
Helman. L. (1995) Characteriztion of four novel epsilon chain mRNA and a comparative analysis of genes for immunoglobulin E in rodents and man Eur. J. Immunol. 23 (1) : 159167 fragment IgE-Fc
Helman (1995) dtto.
protilátky proti IgE-receptoru žímých buněk/basofilů, protilátky proti draslíkovému kanálu specifickému pro žímé buňky, Fab-fragmenty protilátek;
standardní způsoby jsou popsány v Liddel & Weeks (1995) Antikórper-Techniken Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg
MCD peptid (degranulační peptid žímých buněk)
Gmachl. M. & Kreil. G. (1995) The precursors of the bee venom constituents apamin and MCE peptide are encoded by two genes in tandem which share the same 3'-exon, J. Biol. Chem. 270 (21): 12704-12708 inaktivní, ale vázající mutanty standardním způsoby výroby jsou popsány v Nichol D. S.T. (1995) Gentechnische Methoden Spektrum Akademischer Verlag lehké řetězce různých botulotoxinů typu A až G:
Binz. T., Kurazono. H., Frevert. J., Wemars. K. & Nieman. H. (1990) The complete sequence of botulinum toxin A and comparison with other clostridial neurotoxins J. Biol. Chem. 265:9153-9158 lehký řetězec tetanového toxinu
Eisel et al. (1989)
IgA-proteáza
Bruscheck et al. (1995)
-4CZ 294376 B6
Spojení obou složek (transportního proteinu a proteázy) se provádí různými způsoby:
Nejdříve se lehký řetězec toxinu chromatograficky čistí. Lehký řetězec je zcela netoxický, protože po oddělení od těžkého řetězce, neurotropního transportního proteinu, se nemůže dostat do nervových buněk a extracelulámí (mimobuněčný) extrakt není přítomný. Lehký řetězec se potom chemicky spojí s jedním ze čtyř proteinů vázajících žímé buňky za vzniku konjugátu, který se dostane do cytosolu žímých buněk. Tam štěpí lehký řetězec, svůj substrát, čím je blokována sekrece histaminu a jiných látek. Druhá cesta syntézy konjugátu spočívá v tom, že gen pro lehký řetězec se spojí s genem pro jeden ze čtyř proteinů vázajících žímou buňku, takže se ve vhodných hostitelských buňkách exprimuje hybridní protein. Tento biotechnologicky produkovaný hybridní protein by měl analogicky jako konjugát vyrobený ze dvou proteinových složek blokovat proces sekrece ze žímých buněk.
Výroba hybridních proteinů je sama o sobě známým způsobem, zejména v oblasti léčení nádorů (Vogel. C.-W. (Ed.) (1987) Immunoconjugates: Antibody conjugates in radio-immaging anth therapy of cancer Oxford UP lne., Magerstadt. M. (1991) Antibody conjugates and malignant diseases CRC Press). V tomto terapeutickém konceptu se protilátka proti povrchovým proteinům buněk nádoru spojí s cytotoxickým proteinem, například ricinem, toxinem záškrtu, aby se usmrtily rakovinové buňky. Nové na způsobu podle vynálezu je použití specifických proteáz, popřípadě proteolytických domén v hybridních proteinech pro inhibici degranulace žímých buněk a tím pro antialergickou terapii. Za použití hybridních proteinů se dá nejen zabránit silně ovlivňujícím alergickým symptomům (senné rýmě, astmatu a neurodermitidám, tj. vleklým ohraničeným svědivým zánětům kůže), nýbrž se také mohou podávat profylakticky pro zabránění alergickým reakcím v rámci terapie léčivy zachraňujícími život. Hybridní proteiny kromě toho také mohou zabraňovat alergickým symptomům, ke kterým dochází při desenbilizaci.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Syntéza hybridního proteinu z IgE a lehkého řetězce BoNT/A
Vyčištěný botulotoxin typu A (5,0 mg) se po ekvilibraci v 15mM tetraboritanu sodném a 30 mM fosforečnanu, pH=8,4, nanese na QAE-sephadexový sloupec (1,0x3,0 cm), ekvilibrovaný stejným pufrem. Sloupec se potom promyje 10 ml 120mM dithioerythrolu, 2M močoviny a lmM ethylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA) a přes noc inkubuje. Potom se lehký řetězec eluuje ze sloupce lOmM borátovým pufrem a dialyzuje proti 20mM fosforečnanu, pH=7,0.
Imunoglobulin E (potkan) byl zakoupen. 10 mg imunoglobulinu se štěpí 50 pg papainu v 1 ml fosforečnanového pufru (4 °C přes noc). Fc-fragment se čistí přes gelový filtrační sloupec Sephacryl 3200. 3,0 mg vyčištěného lehkého řetězce botulotoxinu se inkubuje s lOmM bifunkčním činidlem, dithiobissukcinimidylpropio- nátem, ve 2 ml fosforečnanu sodného, pH=7,0. Takto syntetizovaný hybridní protein se čistí gelovou filtrací (Sephacryl S200) a jeho čistota se analyzuje SDS-gelovou elektroforézou.
Inhibice degranulace žímých buněk se zkouší ve dvou pokusných vsázkách. V první vsázce se inkubují žímé buňky z potkana s hybridní molekulou a potom se stimuluje uvolňování histaminu. Stimulace se provádí specifickými uvolňovači histaminu, jako MCD-peptidem a konkanavalinem A (poslední je pokusně používaná látka), popřípadě přímým zvýšením intracelulámí koncentrace vápníku. Toho se dosahuje injekcí vápníku do jednotlivé žímé buňky. Tím se zintenzivní výše popsaná kaskáda signálů, neboť zvýšení koncentrace vápníku je krokem v sekrečním procesu, po
-5CZ 294376 B6 kterém následuje fúze vesikul. Degranulace žímé buňky, která odráží uvolňování histaminu, se sleduje ve fázově kontrastním mikroskopu. Dále se uvolněný histamin může kvantifikovat pomocí měření fluorescence. Konečně se může stanovit elektrofyziologicky zvětšení žímé buňky, které je způsobeno uložením vesikulámí membrány do plasmatické membrány při degranulaci. V buňkách ošetřených hybridním proteinem nedojde v protikladu ke kontrolním buňkám 1, k žádné morfologické změně, 2. k žádnému zesílení fluorescence v přesahu buněk a 3. k žádnému zvětšení buněk. Tím se může prokázat, že uvolňování histaminu je blokováno hybridním proteinem.
Ve druhé vsázce se hybridní protein vstříkne živým potkanům. Potkani se po několika dnech usmrtí a jejich žímé buňky se získají obvyklými metodami. Degranulace, popřípadě uvolňování histaminu se stanovuje stejně, jak je popsáno výše. V této vsázce se zkouší, zda se konjugát může i v živém zvířeti dostat do prostoru, ve kterém se nacházejí žírné buňky, a zda je tam inaktivuje.
Příklad 2
Výroba rekombinantního hybridního proteinu spojením genu pro lehký řetězec Clostridium botulinum typu A s genem pro imunoglobulin E, popřípadě jeho fragmenty (Fe-fragment)
Gen pro lehký řetězec botulotoxinu A se izoluje pomocí vhodného primeru pomocí PCR (řetězové reakce iniciované polymerázou). K tomu se použije kultura Clostridium botulinum typu A, ze které se preparuje DNA. Z publikované sekvence genu toxinu (Binz. T., Kurazono. H., Frevert. J., Wemars. K. & Nieman. H. (1990) The complete sequence of botulinum toxin A and comparison with other clostridial neurotoxins J. Biol. Chem. 265:9153-9158) se získá dvojice primerů a pomocí PCR se amplifikuje gen pro lehkou podjednotku. Potom se tento gen klonuje podle údajů výrobce v komerčním expresním vektoru pQE.
Gen pro Fc-fragment humánního imunoglobulinu E (Helman. L. (1995) Characterization of four novel epsilon chain mRNA and a comparative analysis of genes for immunoglobulin E in rodents and man Eur. J. Immunol. 23 (1): 159-167) se izoluje pomocí PCR z komerční banky cDNA a ve vektorovém konstruktu se fúzuje s genem pro lehký řetězec botulotoxinu A.
Tímto konstruktem se transformují kompetentní M15 buňky (E. coli). Vzhledem k tomu, že v tomto expresním systému jsou insertované geny opatřeny značkami his-tag, čistí se rekombinantní protein přes Ni-afinitní sloupec. Na důkladné čištění navazuje gelová filtrace přes Sephacryl 5300. Testování biologické aktivity se provádí opět na izolovaných žímých bíňkách in vitro.
Příklad 3
Výroba rekombinantního hybridního proteinu spojením genu pro lehkou podjednotku toxinu tetanu s mutovaným genem pro degranulační peptid žímých buněk (MCD)
Sekvence pro degranulační peptid žímých buněk, 22mer, je známa (Gmachl. M. & Kreil. G. (1995) The precursors of the bee venom constituents apamin and MCE peptide are encoded by two genes in tandem which share the same 3'-exon J. Biol. Chem. 270 (21) : 12704-12708). Na základě toho se syntetizuje odpovídající oligonukleotid.
Pro izolaci sekvence lehké podjednotky toxinu tetanu se vytvoří kultura C. tetani a z té se získá DNA. Ze známé sekvence nukleové kyseliny toxinu tetanu se získá primer pro PCR a tím gen pro lehkou podjednotku toxinu.
-6CZ 294376 B6
Jak je popsáno v příkladu 1, obě sekvence nukleové kyseliny se fúzují v expresním vektoru poU a potom exprimují v E. coli. Hybridní protein, který je opět opatřen značkou his-tag, se čistí afinitní chromatografií a následující gelovou chromatografií. Vyčištěný gen pro degranulační peptid žímých buněk se chemicky syntetizuje s bodovou mutací v aktivní doméně peptidu. Gen se spojí s genem pro lehký řetězec toxinu tetanu. Hybridní protein se exprimuje v E. coli a čistí. Takto vyrobený hybridní protein se zkouší in vitro zkouškou degranulace žrných buněk.
Příklad 4
Výroba rekombinantního hybridního proteinu pomocí spojení genu pro Fc-fragment IgE s genem pro IgA-proteázu
Gen pro Fc-fragment IgE se izoluje stejně, jak bylo popsáno v příkladu 1.
Gen pro IgA-proteázu z N-gonorrhoeae je znám. Z toho se odvodí primer a z preparátu nukleové kyseliny z N-gonorrhoeae se pomocí PCR získá gen pro specifickou proteázu.
Obě nukleové kyseliny se integrují do komerčního vektoru podle údajů výrobce a hybridní protein se čistí afinitní chromatografií (viz příklad 2).
Inhibiční aktivita se prokazuje opět na izolovaných žímých buňkách (viz výše).
Příklad 5
Výroba hybridního proteinu, který sestává z Fab-fragmentu protilátky proti IgE-receptoru a lehkého řetězce botulotoxinu typu B
Monoklonální protilátka proti IgE-receptoru na žímých buňkách byla zakoupena a chromatograficky se dočistí. 0,5 mg protilátky se konjuguje s 0,4 g vyčištěného lehkého řetězce botulotoxinu B. Lehká podjednotka se po preparaci neurotoxinu, stejným způsobem jako v příkladu 1, izoluje štěpením neurotoxinu a následujícím čištěním ionexovou chromatografií.
Oba proteiny (lehká podjednotka toxinu typu F a monoklonální protilátka) se spolu spojí pomocí bifunkčního činidla. Za tím účelem se izolované proteiny inkubují s lOmM maleinimidobenzoylN-hydroxysukcinimidoesterem. Hybridní protein se potom čistí gelovou filtrací přes Sephacryl S300, aby se zbavil nekonjugovaných proteinů.
Na izolovaných žímých buňkách se opět ukazuje, že syntetizovaný hybridní protein inhibuje sekreci histaminu.

Claims (6)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    5 1. Hybridní protein zahrnující nebo sestávající z (i) z jednoho o sobě známého proteinu, který se váže o sobě známým způsobem na žírné buňky a/nebo basofily a/nebo je jimi zachycen, a
    10 (ii) o sobě známé proteázy, která štěpí jeden nebo několik proteinů sekrečního aparátu žímých buněk a/nebo basofilů.
  2. 2. Hybridní protein podle nároku 1, kde protein (i) je vybrán z IgE, fragmentu IgE, zejména fragmentu IgE-Fc; protilátky proti fragmentu IgE-receptoru žírných buněk a/nebo basofilů,
    15 fragmentu protilátky proti IgE-receptoru žímých buněk a/nebo basofilů, zejména Fab-fragment; protilátky proti kanálu draslíku specifickému pro žírné buňky, a inaktivního, ale vázajícího MCD-peptidu.
  3. 3. Hybridní protein podle nároku 1 nebo 2, kde proteáza (ii) je vybrána z lehkého řetězce
    20 toxinu Clostridium botulinum, zejména typu A, B, Cl, D, E, F nebo G, katalyticky aktivního fragmentu lehkého řetězce toxinu Clostridium botulinum, zejména typu A, B, Cl. D, E, F nebo G, lehkého řetězce toxinu tetanu (TeNT); katalyticky aktivního fragmentu lehkého řetězce toxinu tetanu; IgA-proteázy Neisseria gonorrhoeae, a katalytické domény IgA-proteázy Neisseria gonorrhoeae.
  4. 4. Hybridní protein podle nároku 2 nebo 3, kde protein (i) je vybrán z látek uvedených v nároku 2 a proteáza je vybrána z látek uvedených v nároku 3.
  5. 5. Hybridní protein podle nároku 4, který kromě lehkého řetězce toxinu Clostridium botulinum
    30 zahrnuje také N-terminální část těžkého řetězce tohoto toxinu (HN fragment) nebo jeho fragment.
  6. 6. Použití hybridního proteinu podle jednoho z nároků 1 až 5 pro výrobu léčiva pro inhibici degranulace žímých buněk.
CZ20004161A 1998-05-13 1999-05-12 Hybridní protein a léčivo pro inhibici degranulace žírných buněk CZ294376B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19821285 1998-05-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20004161A3 CZ20004161A3 (cs) 2001-04-11
CZ294376B6 true CZ294376B6 (cs) 2004-12-15

Family

ID=7867540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20004161A CZ294376B6 (cs) 1998-05-13 1999-05-12 Hybridní protein a léčivo pro inhibici degranulace žírných buněk

Country Status (22)

Country Link
EP (1) EP1084146B1 (cs)
JP (1) JP4549533B2 (cs)
KR (1) KR100580541B1 (cs)
CN (1) CN1241945C (cs)
AT (1) ATE227739T1 (cs)
AU (1) AU755513B2 (cs)
BR (1) BR9910359A (cs)
CA (1) CA2331274C (cs)
CU (1) CU22997A3 (cs)
CZ (1) CZ294376B6 (cs)
DE (1) DE59903410D1 (cs)
DK (1) DK1084146T3 (cs)
ES (1) ES2187200T3 (cs)
HK (1) HK1036994A1 (cs)
HU (1) HUP0103601A3 (cs)
IL (2) IL139478A0 (cs)
MX (1) MXPA00011148A (cs)
NO (1) NO328361B1 (cs)
PL (1) PL201879B1 (cs)
PT (1) PT1084146E (cs)
RU (1) RU2214420C2 (cs)
WO (1) WO1999058571A2 (cs)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9721189D0 (en) 1997-10-08 1997-12-03 Speywood Lab The Limited Analgesic conjugates
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
US20040071736A1 (en) 1998-08-25 2004-04-15 Health Protection Agency Methods and compounds for the treatment of mucus hypersecretion
US20080038274A1 (en) 1999-09-23 2008-02-14 Foster Keith A Inhibition of secretion from non-neuronal cells
GB9922554D0 (en) * 1999-09-23 1999-11-24 Microbiological Res Authority Inhibition of secretion from non-neuronal cells
MXPA03000014A (es) * 2000-06-28 2004-09-13 Ira Sanders Metodos para utilizar con fines beneficiosos toxina tetanica en animales.
GB0321344D0 (en) * 2003-09-11 2003-10-15 Health Prot Agency Re-targeted toxin conjugates
GB0426394D0 (en) 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
KR100845278B1 (ko) * 2006-08-04 2008-07-09 포항공과대학교 산학협력단 비만 세포의 활성을 유도하는 펩타이드 및 이를 포함하는면역조절제
WO2009150470A2 (en) 2008-06-12 2009-12-17 Syntaxin Limited Suppression of cancers
EP2310028B1 (en) 2008-06-12 2016-11-16 Ipsen Bioinnovation Limited Fusion proteins for use in the treatment of acromegaly
JP2011529336A (ja) * 2008-07-31 2011-12-08 トータル エス．アー． ポリペプチドを産生及び分泌させるための構築物及び方法
GB0820970D0 (en) 2008-11-17 2008-12-24 Syntaxin Ltd Suppression of cancer
CN102241774B (zh) * 2010-05-27 2014-05-14 四川大学 重组IgE-Fc-抗EGFR单链抗体融合蛋白及其制备方法和用途
GB201108108D0 (en) 2011-05-16 2011-06-29 Syntaxin Ltd Therapeutic fusion proteins
US20140056870A1 (en) 2012-08-27 2014-02-27 Allergan, Inc. Fusion proteins
GB201312317D0 (en) 2013-07-09 2013-08-21 Syntaxin Ltd Cationic neurotoxins
US10647750B2 (en) 2015-01-09 2020-05-12 Ipsen Bioinnovation Limited Cationic neurotoxins
GB201517450D0 (en) 2015-10-02 2015-11-18 Ipsen Biopharm Ltd Method
EP3263710A1 (en) 2016-07-01 2018-01-03 Ipsen Biopharm Limited Production of activated clostridial neurotoxins
GB201815817D0 (en) 2018-09-28 2018-11-14 Ispen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising and exogenous activation loop
GB201900621D0 (en) 2019-01-16 2019-03-06 Ipsen Biopharm Ltd Labelled polypeptides
GB201914034D0 (en) 2019-09-30 2019-11-13 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of neurological disorders
GB202100566D0 (en) 2021-01-15 2021-03-03 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of brain damage
GB202104294D0 (en) 2021-03-26 2021-05-12 Ipsen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an exogenous activation loop
EP4297773A1 (en) 2021-03-30 2024-01-03 Ipsen Biopharm Limited Catalytically inactive clostridial neurotoxins for the treatment of pain & inflammatory disorders
JP2024513191A (ja) 2021-03-30 2024-03-22 イプセン バイオファーム リミテッド 疼痛及び炎症性障害の処置
GB202116795D0 (en) 2021-11-22 2022-01-05 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of visceral pain
PL244930B1 (pl) 2021-12-08 2024-04-02 Gdanski Univ Medyczny Zastosowanie 2-metoksyestradiolu w leczeniu mastocytozy
GB202214232D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Ispen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an activating exogenous protease cleavage site
GB202214229D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Ipsen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an activating endosomal protease cleavage site

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9305735D0 (en) * 1993-03-19 1993-05-05 North John R Novel agent for controlling cell activity
IL116436A (en) * 1995-12-18 2006-12-31 Yissum Res Dev Co Fc?Á-PE CHIMERIC PROTEIN FOR TARGETED TREATMENT OF ALLERGY RESPONSES AND

Also Published As

Publication number Publication date
NO20005637L (no) 2000-11-08
CN1300295A (zh) 2001-06-20
AU4260599A (en) 1999-11-29
EP1084146A2 (de) 2001-03-21
NO20005637D0 (no) 2000-11-08
ES2187200T3 (es) 2003-05-16
IL139478A0 (en) 2001-11-25
DK1084146T3 (da) 2003-02-03
MXPA00011148A (es) 2003-04-22
BR9910359A (pt) 2001-01-09
PL201879B1 (pl) 2009-05-29
CN1241945C (zh) 2006-02-15
JP4549533B2 (ja) 2010-09-22
AU755513B2 (en) 2002-12-12
HUP0103601A3 (en) 2004-06-28
EP1084146B1 (de) 2002-11-13
HUP0103601A2 (hu) 2002-01-28
CZ20004161A3 (cs) 2001-04-11
WO1999058571A2 (de) 1999-11-18
HK1036994A1 (en) 2002-01-25
PL344752A1 (en) 2001-11-19
IL139478A (en) 2008-06-05
NO328361B1 (no) 2010-02-01
ATE227739T1 (de) 2002-11-15
PT1084146E (pt) 2003-02-28
KR20010042825A (ko) 2001-05-25
WO1999058571A3 (de) 2000-02-03
KR100580541B1 (ko) 2006-05-16
DE59903410D1 (de) 2002-12-19
CA2331274C (en) 2010-04-06
CU22997A3 (es) 2004-10-12
CA2331274A1 (en) 1999-11-18
RU2214420C2 (ru) 2003-10-20
JP2002514659A (ja) 2002-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ294376B6 (cs) Hybridní protein a léčivo pro inhibici degranulace žírných buněk
US7456272B2 (en) Neurotoxins with enhanced target specificity
JP5357425B2 (ja) 神経細胞に化合物を導入するために用いられる輸送タンパク質
CN112105379A (zh) 神经毒素样毒素及其用途
KR20180050679A (ko) 통증 치료용 조성물 및 방법
JP2012511033A (ja) 多価化合物の可逆阻害用マスキングリガンド
AU2014372689B2 (en) Multiprotease therapeutics for chronic pain
JP2020143084A (ja) 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート
EP1663286B1 (en) In vivo modulation of neuronal transport
US6822076B2 (en) Hybrid protein for inhibiting the degranulation of mastocytes and the use thereof
Foster Engineered toxins: New therapeutics
US20160361429A1 (en) Regulation of Specific Spinal Neurons Regulating Pain Transmission
Stábeli et al. Antibodies to a fragment of the Bothrops moojeni L-amino acid oxidase cross-react with snake venom components unrelated to the parent protein
US20230028019A1 (en) Bonded neurotoxins
US20210388085A1 (en) Site-specific conjugation of glycosylated monoclonal antibodies with transglutaminase
Leese et al. Duplication of clostridial binding domains for enhanced macromolecular delivery into neurons
Yabbarov et al. Obtaining and Purifying the Recombinant Domain III of Human Alpha-Fetoprotein
ES2705485T3 (es) Medios y métodos para fabricar una neurotoxina altamente pura
Montecucco et al. Clostridial neurotoxins as enzymes: structure and function
AU2002228684A1 (en) Neurotoxins with enhanced target specificity

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20100512