CN1241945C - 用于抑制肥大细胞脱粒的杂合蛋白质及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种杂合蛋白质，其包括下列物质或由下列物质所组成：(i)一种已知蛋白质，该蛋白质能以已知方式结合到肥大细胞及/或嗜碱细胞及/或被这些细胞所摄入，(ii)一种已知的蛋白酶，该蛋白酶可切割肥大细胞及/或嗜碱细胞的分泌装置所含一或数种蛋白质。

Description

用于抑制肥大细胞脱粒的杂合蛋白质及其用途
技术领域
本发明涉及一种杂合蛋白质。具体而言，本发明涉及抑制能够抑制肥大细胞脱颗粒的杂合蛋白质及其用途。所述杂合蛋白质结合到肥大细胞及/或嗜碱细胞及/或被这些细胞所摄入后，可切断这些细胞中的分泌装置所含一或数种蛋白质。
发明背景
速发型过敏反应的特征在于有关的患者都会形成针对过敏原(例如花粉、屋内粉尘、小虫、动物毛)的IgE型抗体。这些抗体不仅会在血液内循环而且也会结合到组织中所含的细胞，该等细胞在其质膜上展现出针对一部分IgE分子的特异性受体，Fc片段(Fishman & Lorberboum-Galski 1997；Hamawy 1997)。带有IgE受体的细胞完全都是肥大细胞和嗜碱细胞而无他。这些细胞都是促成速发型过敏反应的细胞。它们会贮存含有血管活性胺类(vasoactive amines)和前列腺素以及白三烯类(leukotrienes)(花生四烯酸衍生物)的小泡。这些物质的释放会导致肥大细胞的脱粒，其可透过一种特异性机制与非特异性机制而发生。一旦细胞受到机械性破坏之后，例如，经由在皮肤上刮擦，及非特异性地释出组织胺。在伤口处，皮肤会变红。形成荨麻疹(水肿)且皮肤会痒(三联反应)。会特异性地释出组织胺的物质于相当低浓度下就有效应且会触发下列反应级联(信号级联)：磷脂酶C的活化---第二信使″二酰基甘油″和″IP3″之形成---钙从细胞贮存处的移动---颗粒与细胞膜的融合---颗粒的外胞饮作用而无细胞溶解---针对肝素和碱蛋白的复合物所含荷正电组织胺进行钠交换---从颗粒基质释出组织胺。于过敏者与过敏原之间有接触之下，细胞表面上的IgE分子会结合此过敏原。一旦过敏原分子经结合到充分的量时，质膜中的受体即发生聚集现象。该聚集现象即为上文所述在细胞内部的信号级联之特异性刺激。释出的物质即诱发出过敏性征候(结合膜炎、鼻炎、气喘、喉水肿、荨麻疹、血压降低到显著的过敏性休克)。在蜂毒素中所含的肽类例如肥大细胞脱粒肽(MCD)也会促成肥大细胞的脱粒。此外，某些医药品会以非合意效应之方式引起组织胺之特异性释出。人体内的组织胺释出业经对肌肉松弛剂、聚葡糖、乙酰基水杨酸(阿斯匹灵)、吗啡、抗生素、X射线摄影术中的对比剂、外来血清等述说过。
若小泡与质膜的融合经成功地抑制时，就不会释出胺类和花生四烯酸衍生物。其结果就不会诱发出过敏反应。有数种蛋白质(融合蛋白质)分别涉及分泌程序和释出，这些蛋白质可结合到分泌小泡的膜及/或质膜上。同样地这些也可能出现在胞液中。这些蛋白质的代表性例子分别地为SNAP 25，小突触泡蛋白(synaptobrevin)(VAMP)，突触融合蛋白(syntaxine)和其同种型。这些蛋白质会形成复合物(融合复合物)而将分泌小泡固定到质膜的内侧。该固定化促使小泡与质膜的融合提早发生，而该融合则受到IgE触发的Ca++流入所诱发。经由将这些蛋白质之一失活，例如经由蛋白质水解性切割，可以抑制该复合物的形成。
所提及的诸融合蛋白质系已知为肉毒梭菌(Clostridium botulinum)在神经细胞内产生的神经毒素的轻链之靶分子(底物)(Ahnert-Hilger &Bigalke，1995；Bigalke 1999付印中)。目前已知有七种不同类型的肉毒梭菌毒素(A、B、C1、D、E、F和G)。所提及的小突触泡蛋白另外还是破伤风梭菌(Clostridium tetani)所产生的TeNT之靶分子(Link et al.，1993)且也为产自淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的蛋白酶之靶分子(Binscheck et al.，1995)。除了后者之外，该等毒素都包括至少两个功能结构域。蛋白质(重链)的C端部分负责其对神经细胞的结合而其N端(轻链)的特征在于上文所述的高特异性蛋白质分解活性。该等毒素系透过它们的重链结合到神经细胞并透过受体介导的细胞摄入作用及随后的转位到达胞液内，于该处这些毒素会切割一或多种所提及的融合蛋白质，其转而为融合复合物所必要者。在切割个别蛋白质之后，乙酰胆碱和其他递质从神经细胞的分泌即分别受到抑制(Binscheck andWellhoner，1997)。
对递质释出的抑制已在过去以治疗方式用来治疗肌紧张不足运动障碍即用来压抑副交感神经活性(Benecke and Kessler，1995)。对于梭菌神经毒素，尚未知晓该等融合蛋白质以外的生物底物。重链对于周围神经细胞具有高亲和性使得与其连接的轻链只能到达这些细胞且只在这些细胞中有效用---虽则有发生分泌程序的其他细胞类型，例如肥大细胞和嗜碱细胞，也拥有上文所提及的底物，但是这些并不拥有摄入蛋白酶所用的机制(Marxen et al.，1989)。
发明描述
本发明提供了一种杂合蛋白质，其由通过化学合成或遗传工程技术所形成的化学连键连接的以下成分(i)和成分(ii)组成，其中成分(i)是结合到肥大细胞及/或嗜碱细胞及/或被这些细胞所摄入的一种蛋白质，其中所述蛋白质选自如下一组：IgE；IgE Fc片段和所述Fc片段的结构域；抗肥大细胞及/或嗜碱细胞所含IgE受体的抗体；抗肥大细胞及/或嗜碱细胞所含IgE受体的抗体的Fab片段和所述Fab片段的结构域；抗肥大细胞特异性钾通道的抗体；和无活性但具有结合性的MCD肽，以及其中成分(ii)是切割肥大细胞及/或嗜碱细胞的分泌装置所含的一或数种蛋白质的一种蛋白酶，其中所述蛋白酶选自如下一组：肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)毒素的轻链；肉毒梭菌毒素的轻链之催化活性片段；破伤风毒素TeNT的轻链；破伤风毒素的轻链的催化活性片段；淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的IgA蛋白酶；和淋病奈瑟氏球菌的IgA蛋白酶的催化结构域。
本发明的一个实施方案涉及一种杂合蛋白质，其包括下列物质或由下列物质所组成：
(i)一种已知蛋白质，该蛋白质能以已知方式结合到肥大细胞及/或嗜碱细胞及/或被这些细胞所摄入，
(ii)一种已知的蛋白酶，该蛋白酶可切割肥大细胞及/或嗜碱细胞的分泌装置所含一或数种蛋白质。
本发明另一实施方案涉及一种杂合蛋白质，其包括下列物质或由下列物质所组成：
(i)一种蛋白质，该蛋白质能结合到肥大细胞及/或嗜碱细胞及/或被这些细胞所摄入，其中该蛋白质(i)选自如下一组：
IgE；
IgE片段，特别是IgEFc片段；
抗肥大细胞及/或嗜碱细胞所含IgE受体的抗体；抗肥大细胞及/或嗜碱细胞所含IgE受体的抗体之片段，特别是Fab片段；抗肥大细胞特异性钾通道的抗体；及
无活性但具有结合性的MCD肽；及
(ii)一种蛋白酶，特别是已知的蛋白酶，其可切割肥大细胞及/或嗜碱细胞的分泌装置所含一或数种蛋白质。
本发明的又一实施方案涉及一种杂合蛋白质，其包括下列物质或由下列物质所组成：
(i)一种蛋白质，特别是已知的蛋白质，其能特别是以已知的方式结合到肥大细胞及/或嗜碱细胞及/或被这些细胞所摄入；及
(ii)一种蛋白酶，该蛋白酶可切割肥大细胞及/或嗜碱细胞的分泌装置所含一或数种蛋白质，其中该蛋白酶(ii)选自如下一组：
肉毒梭菌毒素特别是A、B、C1、D、E、F和G型的毒素的轻链；
肉毒梭菌毒素特别是A、B、C1、D、E、F和G型的毒素的轻链之催化活性片段；
破伤风毒素(TeNT)的轻链；
破伤风毒素的轻链的催化活性片段；
淋病奈瑟氏球菌的IgA蛋白酶；及
淋病奈瑟氏球菌的IgA蛋白酶的催化结构域。
本发明杂合蛋白质的特征在于该蛋白质(i)与蛋白酶(ii)系分别选自上述蛋白质和蛋白酶的组。
本发明杂合蛋白质的另一特征在于除了肉毒梭菌毒素的轻链或破伤风毒素的轻链之外，这些毒素的重链的N-端部分(HN片段)，或其片段都可为该杂合蛋白质的一部分。
最后，本发明一个实施方案涉及本发明杂合蛋白质在抑制肥大细胞脱粒中的用途。
若肥大细胞被杀死，则会有下述危险存在，亦即，正在死亡中的肥大细胞释放出所贮存的内源胺时会诱导出过敏性休克。此外，肥大细胞数目的下降会刺激这些细胞的重新合成，其转而再度用于过敏性反应。因此本发明杂合蛋白质在基本上不同于经由ADP核糖基化活性抑制蛋白质合成因而促成细胞死亡的IgE-Fc/假单孢菌外毒素缀合物(Fishman &Lorberboum-Galski，1997)。颇为相反者，本发明杂合蛋白质并不用来杀死肥大细胞。反而，在接受本发明杂合蛋白质处理之后该细胞仍存活且只丧失其释出血管收缩性胺类的活性。
其中没有发生重新合成之刺激。在以治疗方式使用时，可避免使用以完全胞毒性假单胞菌毒素或相称的毒素为基础的缀合物所预期的可想像出之毒性副效应。
本发明的主题因而为一种缀合物(杂合蛋白质)，其由下列物质所组成(i)一种蛋白质或肽(转运蛋白质或肽)，其展现出对肥大细胞及/或嗜碱细胞的高度亲和性，及(ii)一种特异性蛋白酶，该缀合物可分别阻断细胞的脱粒与分泌机制。该缀合物可用于速发型过敏反应的治疗/预防。
(i)该缀合物所含高度亲合性肥大细胞结合性成分为E型免疫球蛋白(IgE)和其片段(如Fc片段)。此外，也可以使用抗肥大细胞/嗜碱细胞所含特异性表面分子的抗体，该等抗体可选择性地结合到这些细胞的质膜上。最重要者，抗IgE受体的抗体可满足此目的。再者，也使用肥大细胞脱粒肽的无活性但具结合性突变体作为该杂合蛋白质中的转运肽/蛋白质。这些转运肽/蛋白质可用来将蛋白酶经通道送入细胞内。该蛋白酶可用高度特异性方式切割肥大细胞所含融合复合物中的起始该等细胞的脱粒机制的蛋白质。
(ii)可用为高度特异性蛋白酶者为一种金属蛋白酶，如，A、B、C1、D、E、F和G型肉毒梭菌毒素(BoNT/X)的轻链以及破伤风毒素(TeNT)的轻链或淋病奈瑟氏球菌的IgA蛋白酶。这些蛋白酶可切割突触小体相关蛋白(MR25,000)(SNAP25)，小突触泡蛋白或突触融合蛋白。若这些蛋白质/肽中只有一者被切割，则肥大细胞的脱粒会被抑制。其结果，组织胺、前列腺素和白三烯的分泌就不会发生，且因而不再可能发生过敏性征候。
于本发明中，可将诸毒素的无毒性轻链分别附着到只结合肥大细胞和嗜碱细胞的转运蛋白质上，如此，使其只被这些细胞所摄取，其中该轻链---如同旅客般被携带著---会到达细胞。这些不会侵入到神经细胞与其他类型生物细胞之内使得其效应只限制在肥大细胞和嗜碱细胞。若其中有一底物受到蛋白分解性破坏，则在这些载有IgE的细胞与过敏原或上文所提诸医药品之一接触后不会发生过敏性征候。
可用为能特异性地结合肥大细胞的蛋白质有
1)E型免疫球蛋白和其Fc型片段；
2)抗IgE受体的抗体；
3)肥大细胞脱粒肽；及
4)抗肥大细胞特异性钾通道的抗体。
有关上列蛋白质可参考下列文章：
-IgE          Helman(1995)
-IgE-Fc片段   Helman(1995)
-抗肥大细胞/嗜碱细胞所含IgE受体的抗体；抗肥大细胞特异性钾通道的抗体；该抗体的Fab片段；这些皆为标准程序，载于Liddel& Weeks(1995)之中
-MCD肽      Gmachel & Krell(1995)
-无活性但具结合性的突变体
该突变肽系根据标准程序制备：
Nichol D.S.T.(1995)
-各种A-G型肉毒梭菌毒素的轻链：
Binz et al.(1990)
-破伤风毒素的轻链
Eisel et al.(1989)
-IgA蛋白酶Bruscheck et al.(1995)
两种成分(转运蛋白与蛋白酶)的连接系透过多种不同途径而发生的。首先，将毒素的轻链以层析术纯化。该轻链系完全无毒性者，因为在将轻链从重链，亲神经性转运蛋白，分离出之后，其就不能到达神经细胞且不存在细胞外底物。然后将该轻链以化学方式结合到四种肥大细胞结合性蛋白质中的一种以形成缀合物其转而会被摄取到肥大细胞的胞液之内。该轻链会在该处切割其底物，该切割作用可抑制组织胺和其他物质的分泌。第二种制备缀合物的方法为将该轻链的基因与该四种肥大细胞结合性蛋白质中的一种的基因融合在一起以使得可在适当宿主细胞内表达出杂合蛋白质。这种经生物技术方式产生的杂合蛋白质应该可经由类似于从两种蛋白质成分所制得的缀合物之方式阻断从肥大细胞的分泌程序。杂合蛋白质的制备系一种本身为已知的程序，特别是在肿瘤治疗领域中(Vogel，1987；Magerstadt，1991)。于这种治疗概念中，系将抗肿瘤细胞所含表面抗原的抗体附着到一胞毒性蛋白质，如蓖麻毒素或白喉毒素，以杀死癌症细胞。本发明方法的新颖方面为在杂合蛋白质中分别使用特异性蛋白酶和蛋白分解性结构域来抑制肥大细胞的脱粒及，因而，用于抗过敏治疗中。这些杂合蛋白质不仅可用来避免严重损害性过敏征候(乾草热，气喘，神经性皮炎)。而且这些也可以预防性地服用以在使用救命性医药品治疗中避免过敏性反应。再者，这些可在脱敏化过程中避免过敏性征候。
实施例1：用IgE和BoNT/A的轻链合成杂合蛋白质
将经纯化的A型肉毒梭菌毒素(5.0毫克)置于15mM四硼酸钠和30mM磷酸盐pH8.4中平衡之后，施加到也在相同的缓冲液中平衡过的QAE Sephadex管柱(1.0×3.0公分)上。随后用10毫升120mM二硫赤藓糖醇，2M尿素和1mM EDTA并保温过夜。其后，利用10mM硼酸盐缓冲液从该管注洗提出该轻链并相对于20mM磷酸盐pH7.0进行透析。
购得免疫球蛋白E(大鼠)。用50微克木瓜酵素在1毫升磷酸盐缓冲液中切割10毫克该免疫球蛋白(4℃整个晚上)。于凝胶过滤管柱(Sephacryl S200)上纯化出Fc片段。将3.0毫克的该经纯化Fc片段与3.0毫克经纯化的肉毒梭菌毒素轻链在含10mM二硫代双丁二酰亚胺基丙酸酯(双官能剂)的2毫升磷酸钠，pH7.0中温浸16时。经由凝胶过滤(Sephacryl S200)纯化出经如此合成所得之杂合蛋白质并透过SDS凝胶电泳分析其纯度。
肥大细胞脱粒的抑制系以两种实验方法予以探讨。于第一种方法中系将经分离出的大鼠肥大细胞与杂合蛋白质一起保温。其后刺激组织胺的释放。该刺激系分别经由使用特异性组织胺释放剂例如MCD肽和刀豆素A(后者为实验使用的物质)及经由直接增加细胞内钙浓度而发生的。后者系经由将钙注射到个别的肥大细胞内而达成的。如此，随著钙浓度的增加，上文所述信号级联的短路系在分泌过程中的一步骤，随后是小泡融合。反映出组织胺释出的肥大细胞脱粒系在相对比显微镜中予以追踪。随后可以利用萤光测量定出组织胺的释出量。最后，可以使用电生理学方法测定出在脱粒的过程中将小泡膜掺加到质膜中所引起的肥大细胞之扩大。于使用杂合蛋白质处理过的细胞中，与对照细胞相异者，其(1)没有发生态学变化，(2)细胞上清液中的萤光没有增强，且(3)细胞没有扩大。由此可以证明组织胺的释出被该杂合蛋白质所阻断。
于第二种实验方法中，系将该杂合蛋白质注射到活的大鼠体内。数天之后将该大鼠杀死并以习用方式将其肥大细胞分离出。依上文所述分别测定脱粒与组织胺的释出。于此方法中系探讨该缀合物是否也能够到达活的动物体内该肥大细胞所在的格区中，及该缀合物是否能够在活的动物体内将肥大细胞抑活化。
实施例2：经由将编码A型肉毒梭菌毒素轻链的基因分别可操纵地连接到编码免疫球蛋白E和其一片段(Fc片段)的基因以产生重组杂合蛋白质
编码A型肉毒梭菌毒素轻链的基因系利用适当的引物经由PCR(聚合酶链反应)分离出的。制备A型肉毒梭菌培养物并由此制备出DNA。从已公开的毒素基因序列(Binz et al.)导出一对引物并透过PCR扩增轻亚单位(subunit)的基因。其后将该基因根据制造商的方法克隆到市售的表达载体(expression vector)pQE中。
编码人类免疫球蛋白E的Fc片段之基因(Helman L.)系透过PCR从市售的cDNA库分离出的且与编码A型肉毒梭菌毒素轻链的基因融合到载体构建体中。
使用此构建体来转化感受态M15细胞(大肠杆菌)。由于在此表达系统中嵌入的基因带有一″his标签″，因此重组蛋白质可经由一Ni亲和性管柱予以纯化。蛋白质高度纯化程序后进行Sephacryl S300的凝胶过滤。
生物活性的测量系在体外于分离出的肥大细胞上实施。
实施例3：经由将编码破伤风毒素轻亚单位的基因可操纵地连接到编码肥大细胞脱粒肽(MCD)的突变基因以制备重组杂合蛋白质
″肥大细胞脱粒肽″的序列，22mer，系已知者(Gmachl and Kreil)。据此合成一相应的寡核苷酸。
为了分离出破伤风毒素所含轻亚单位的序列，制备一破伤风梭菌(C.tetani)培养物并从该培养物收取DNA。从已知的破伤风毒素核酸序列取得一引物以供PCR所用且因而得到该毒素所含轻亚单位的基因。
如实施例1中所述，将两种核酸序列融合到表达载体pQU内且随后在大肠杆菌中予以表达。将转而带有一his标签的该杂合蛋白质透过亲和性层析术及随后凝胶过滤予以纯化出。将经纯化出的编码肥大细胞脱粒肽之基因以化学方式予以合成，其中包括在该肽所含活性结构域内的一点突变。将该基因以可操纵的形式连接到编码破伤风毒素轻链的基因。于大肠杆菌中表达该杂合蛋白质并予以纯化。将如此制得的杂合蛋白质以肥大细胞脱粒检定进行体外试验。
实施例4：经由将编码IgE所含Fc片段的基因分别可操纵地连接到编码IgA蛋白酶的基因以产生重组杂合蛋白质
按实施例1中所述分离出编码IgE所含Fc片段的基因。
得自淋病奈瑟氏球菌的编码IgA蛋白酶之基因系已知者。从该基因导出引物，并利用PCR从得自淋病奈瑟氏球菌的核酸制备物收取编码特异性蛋白酶的基因。
将两种核酸依照制造商所给的方法整合到一市售载体之内并用亲合性层析术纯化杂合蛋白质(参看实施例2)。
再度地于分离的肥大细胞中证明活体外抑制活性。
实施例5：由抗IgE受体的抗体所含Fab片段与B型肉毒梭菌毒素的轻链组成的杂合蛋白质之制备
购得抗肥大细胞上的IgE受体之单株抗体并用层析术再予以纯化。将0.5毫克的该抗体与0.4克经纯化的肉毒梭菌毒素F的轻链缀合。该轻亚单位系在根据实施例1中的程序进行该神经毒素的制备之后，经由将该神经毒素切割并随后透过离子交换层析术予以纯化而分离出者。
用双官能剂将两种蛋白质(毒素F所含轻亚单位与单诸抗体)彼此键联在一起。将分离出的蛋白质与10mM用于此目的之顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基-丁二酰亚胺基酯一起温浸。随后使用在Sephacryl S300上的凝胶过滤将杂合蛋白质从未拼合的蛋白质分离出。
再度地，使用分离的肥大细胞证实所合成的杂合蛋白质能够抑制组织胺的分泌。
对其他专利的参照：
专利号4902495
IgEFc介导的输送系统
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Claims (5)

1.一种杂合蛋白质，其由通过化学合成或遗传工程技术所形成的化学连键连接的以下成分(i)和成分(ii)组成，
其中成分(i)是结合到肥大细胞及/或嗜碱细胞及/或被这些细胞所摄入的一种蛋白质，其中所述蛋白质选自如下一组：
IgE；
IgE Fc片段和所述Fc片段的结构域；
抗肥大细胞及/或嗜碱细胞所含IgE受体的抗体；
抗肥大细胞及/或嗜碱细胞所含IgE受体的抗体的Fab片段和所述Fab片段的结构域；
抗肥大细胞特异性钾通道的抗体；和
无活性但具有结合性的MCD肽，以及
其中成分(ii)是切割肥大细胞及/或嗜碱细胞的分泌装置所含的一或数种蛋白质的一种蛋白酶，其中所述蛋白酶选自如下一组：
肉毒梭菌(Clostridium botulinum)毒素的轻链；
肉毒梭菌毒素的轻链之催化活性片段；
破伤风毒素TeNT的轻链；
破伤风毒素的轻链的催化活性片段；
淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的IgA蛋白酶；和
淋病奈瑟氏球菌的IgA蛋白酶的催化结构域。
2.如权利要求1之杂合蛋白质，其中所述肉毒梭菌毒素选自A、B、C1、D、E、F或G型的毒素。
3.如权利要求1或2之杂合蛋白质，其中所述化学连键是肽键或连接蛋白。
4.如权利要求1或2之杂合蛋白质，其中除了肉毒梭菌毒素的轻链或破伤风毒素的轻链之外，这些毒素的重链的N-端部分或其片段为该杂合蛋白质的一部分。
5.一种如权利要求1至4中任一项所述杂合蛋白质在制备用于抑制肥大细胞脱颗粒的药物中的用途。
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