CZ20004161A3 - Hybridní protein pro zabránění granulace žírných buněk a jeho použití - Google Patents

Hybridní protein pro zabránění granulace žírných buněk a jeho použití Download PDF

Info

Publication number
CZ20004161A3
CZ20004161A3 CZ20004161A CZ20004161A CZ20004161A3 CZ 20004161 A3 CZ20004161 A3 CZ 20004161A3 CZ 20004161 A CZ20004161 A CZ 20004161A CZ 20004161 A CZ20004161 A CZ 20004161A CZ 20004161 A3 CZ20004161 A3 CZ 20004161A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
protein
hybrid protein
basophils
fragment
mast cell
Prior art date
Application number
CZ20004161A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ294376B6 (cs
Inventor
Hans Bigalke
Jürgen FREVERT
Original Assignee
BioteCon Gesellschaft für Biotechnologische Entwicklung und Consulting mbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BioteCon Gesellschaft für Biotechnologische Entwicklung und Consulting mbH filed Critical BioteCon Gesellschaft für Biotechnologische Entwicklung und Consulting mbH
Publication of CZ20004161A3 publication Critical patent/CZ20004161A3/cs
Publication of CZ294376B6 publication Critical patent/CZ294376B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Fire-Extinguishing Compositions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Oblast_techniky , ;
Vynález se týká hybridního proteinu pro zabránění granulace žirných buněk a jeho použití.
Dosavadní stav_techniky
Alergické reakce okamžitého typu jsou charakteristické·.tím, že dotyční pacienti vytvořili antitělíska typu IgR vůči alergenům /naoříklad pylům, roztočům v domácím prachu, zvířecím chlupům/. Tato antitělíska necirkulují oouze v krvi, ale jsou vázána také na buňky tkání, které mají specifický receotor pro část IgE-molekuly, Fc-fragment, v membráně plasmy /Fishman a. Lorberboum-Galski, 1997; Hamawy, M.M. 1997/. Buňky s IgE-receptory jsou výlučně žirné buňky a basofily. Tyto buňky jsou buňky efektoru pro alergická reakce okamžitého tvou. Tyto Tyto hromadí vesikula, která obsahují vasoaktivní aminy, stejně tak jako prostaglandiny a leukotriny/ deriváty kyseliny arachová/. Uvolňování těchto látek, které vede k degranulaci žirných buněk, se děje specifickým a nespecifickým mechanismem. Jestliže se buňky mechanicky rozruší, například škrábnutím na kůži, uvolní se nespecificky histamin. Kůže rány zčervená. Tvoří se otoky /edemy/ a kůže svědí /triple resoonse/. Látky, které uvolňují specificky histamin jsou účinné v relativně malých koncentracích a vyvolávají následující řetězec symptomů: aktivaci fosfolipázy C, - tvorbu second messenger diacylglycerolu*a ZIP3Z-, mobilizaci vápníku z buněčných zásob, splynutí granulí s membránoujbuňky- exocytózu granulí bez cytolýzy- výměnu sodíku za pozitivně nabitý histamin z komplexu s heparinem a zásaditým proteinem - uvolňování histaminu z matrice granule. Jestliže dojde ke styku mezi žirnými buňkami alergika a alergenem, tak se IgE-molekuly navážou na povrch buňky tohoto alergenu. Jestliže se naváže dostatečný počet molekul alergenu dojde k agregaci receptorů v membráně plasmy. Agregace je specifickým popudem pro vyvolání výše popsané kaskády signálů uvnitř buňky. Uvolněné látky vyvolají alergické n^íznaky /zánět spojivek, rýmu, astma, otok hrdla, ’jopřivku, snížení tlaku krve až do výrazného anafylaktického šoku/. Peotidy, která jsou obsaženy ve včelím jedu, jako například mast cell degranulating peptide /MOD/, vyvolávají rovněž degranulaci žirných buněk. I některá léčiva způsobují specifické uvolnění histaminu jako nežádoucí účinek. U lidí je uvolňování histaminu ponsáno pro oro prostředky oro uvolňování svalů, dextrany, kyselinu acetylosalicylovou /Aspirin/, morfin, antibiotika, kontrastní prostředky pro rtg, cizí séra atd.
Jestliže se zabrání splynutí vesikul s membránou plasmy, tak nedojde k uvolnění aminů a kyseliny arachové. Následně se nespustí žádné alergické reakce. Procesu sekrece popřípadě uvolňování se účastní *ada proteinů / fúzní proteiny/, které mohou být vázány na membrány sekrečních vesikul a/nebo na membránu plasmy. Mohou se také nacházet v cytosolu. K těmto nroteinem patří SNAP 25, synaptobrevin /VAMP/ a syntaxin oopříoadě jejich isoformy. Tyto proteiny tvoří komolex /fúzní komolex/, který fixuje sekreční vesikul na vnitrní straně membrány plasmy. Fixace předchází splynutí vesikula s membránou plasmy, která byla vyvolána vtokem Ca++ zorostředkovaným IgE. Inaktivaci jednoho z proteinů, patrně proteolytickým štěpením, se zabrání tomu, aby se vytvořil komolex.
U nervových buněk jsou jak je známo uvedené fúzní pro• · • ··
-3• ta ·· · · · · • ta « ta · · • · · · · · ta • ta · · · · ··· ··· ·· ·· teiny cílové molekuly /substráty/ lehkých řetězců neurotoxinů, které jsou vyráběny bacilem Clostridium botulinum /Ahnert-Hilger a. Bigalke, 1995 und Bigalke, 1999 in press/. V této době je také známo sedm typů toxinů botulinu /A,B,C1, D, E, F a G/. Zmíněný synaptobrevin je kromě toho i cílovou molekulou pro TeNT /Link et al.,1993/, který je orodukován Clostridium tetani, stejně tak jako oro proteázu z Meisseria gonorrhoae /Binscheck et al., 1995/. Toxiny, kromě těch, které byly jmenovány jako poslední, sestávají nejméně ze dvou funkčních domén. C-terminální část proteinu /těžký řetězec/ je žodoovědná za svou vazbu na nervovou buňku, zatím co M-terminální část /lehký řetězec/ se vyznačuje výše popsanou vysoce specifickou proteolytickou aktivitou. Toxiny se vážou přes svůj těžký řetězec na nerovové buňky a následující translokacť do cytosolu, kjSe se štěpí jeden nebo více uvedených fúzních oroteinů, která jsou konstituční pro fúzní komplex. Po štěnení stávajícího proteinu se zabrání sekreci acetylcholinu poo^ípadě jiných přenašečů z nervových buněk /Binscheck und Wellhoner, 1997/.
Zábrana vyt^eDání přenašeče se již terapeuticky využívá pro léčení dystonických ooruch hybnosti stejně tak jako pro Dotlačení nadměrných oarasymoatických aktivit /Benecke und Kessler, 1995/. Pro Clostridien-neurotoxiny nejsou známy žádné jiné biologické substráty kromě fúzních proteinů. Těžké *etězce mají vysokou afinitu k periferním nervovým buňkám, takže se s nimi svázané lehká řetězce se dostanou pouze do těchto buněk a v nich jsou účinné- ačkoliv jiné typy buněk, ve kterých probíhají sekreční procesy, mají výše uvedené substráty, ale žádný mechanismus pro přijmutí oroteázy /Marxen et al.,1989/. například žírné buňky a basofily.
··· ·· ·· · · · · • ··· · · ···♦ ···· · · · · · · · ··· · · ···· ··· ·· ··· *·· · · ··
-4Podstata_vynálezu
Jedna forma provedení vynálezu se týká hybridního proteinu zahrnujícího nebo sestávajícího z /i/ jednoho o sobě známého proteinu, který se váže o sobě známým způsobem na žírné buňky a/nebo basofily a/nebo je jimi zachycován, /ii/ o sobě známé proteázy, která štěpí jeden nebo několik nroteinu sekrečního aparátu žírných buněk a/nebo basofilyDalší forma vynálezu se týká hybridního proteinu zahrnujícího nebo sestávajícího z /i/ oroteinu, který se váže na Žírné buňky a/nebo basofily a/nebo je jimi zachycován, přičemž protein /i/ je vybrán z následující skupiny:
IgE:
fragment IeG, zejména fragment IgE-Fc;
antitělíska vůči IgE-receptoru žírných buněk a/nebo basofil;
Fragment antitělíska proti IgE-receptoru žírných buněk a/nebo basofil, zejména Fab-fragment;
Antitělíska proti kanálu draslíku specifickém pro Žírné buňky; a inaktivní, ale navazující se MCD-peDtid, a /ii/ oroteázy , zejména o sobě známé proteázy, která štěpí jeden nebo několik proteinů sekrečního aparátu žírných buněk a/nebo basofil:
Další forma provedení vynálezu se týká hybridního proteinu, zahrnujícího nebo sestávajícího z:
/i/ proteinu, zejménao sobě známého nroteinu, který se váže na Žírné buňky a/nebo basofily a/nebo je jimi zachycován, zejména o sobě známým způsobem, a /íí/ proteázy, která štěpí jeden nebo několik proteinů sekrečního aparátu žirných buněk a/nebo basofil, při čemž proteáza /ii/ je vybrána z následující skupiny:
lehký řetězec toxínu Clostridium botulinum, zejména typu A, B, Cl, D, E, F nebo G;
katalytický aktivní fragment lehkého řetězce toxínu
Clostridium botulinum, zejména typu A, B, C, D, E, F nebo G;
lehký řetězec toxínu tetanu /TeNT/;
katalyticky aktivní fragment lehkého *etězce toxínu tetanu;
IgA-proteáza Neisseria gonorrhoae; a katalytické domény IgA-proteázy Neisseria gonorrhoae.
Hybridní protein podle vynálezu může být charakterizován tím, že protein /i/ je vybrán z výše uvedené skupiny proteinu a Droteéza /ii/ je vybrána rovněž z výše uvedené skuoiny proteáz.
Hybridní protein podle vynálezu může být dále charakterizován tím, že dodatečně k lehkému řetězci toxinu Clostridium botulinu nebo toxinu tetanu je i N-terminální část těžkého řetězce dotyčného toxinu /H^-fagment/ nebo jeho fragment částí hybridního proteinu.
Konečně se forma provedení vynálezu týká použití hybridního proteinu podle vynálezu pro zabránění granulace žirných buněk.
Jestliže by se usmrtily· všechny žirné buňky, vyvstalo by nebezpečíže dojde k alergickému šoku, když by odumřelé žirné buňky uvolnily nahromaděné endogenní aminy. Dále simuluje úbytek počtu Žirných buněk novou syntézu těchto buněk, které jsou potom opět k dispozici pro alergické reakce. Hybridní protein podle vynálezu se tím liší
-6základně od známého konjugátu IgE-Fc/pseudomonas-exotoxinu, který inhibuje svou ADP-ribosylilovou aktivitou syntézu proteinu a tím vyvolává smrt buněk /Fishman a. Lorberboum-Galski, 1997/. Naproti tomu flÚDslóíáŽÍ hybridní protein podle, vynálezu pro usmrcení žirných buněk. Buňky zůstávají spíše po působení vitální a ztrácí pouze schopnost uvolňovat vasokonstriktivní aminy. Nedochází ke stimulaci nové syntézy. Při terapeutickém použití se zabrání možným toxickým vedlejším účinkům, které je možné očekávat u konjugátu, který je založ* na kompletním cytotoxickém toxinu Pseudomonas nebo ne srovnatelném cytotoxinu.
Předmětem vynálezu může být tedy konjugát /hybridní protein/, sestávající z /i/ proteinu nebo peptidu /transportní protein/peptid/ s vysokou afinitou k žirným buňkám/basofilům a /ii/ specifické proteázy, který blokuje degranulaci popřípadě sekreční mechanismus buněk. Konjugát slouží k léčení/ /profylaxi alergických reakcí.okamžitého typu, /i/ Jako vysoce af/inní, žírné buňky vázající složka konjugátu se používá zejména Immunglobulin typu E /IgE/ popřípadě jeho fragmenty / například Fc-fragment/. Dále se používají i antitělíska proti specifickým povrchovým molekulám Žirných buněk/basofil, které se vážou selektivně na jejich membránu plasmy. Především splňují tento účel ajtitělíska pro ti IgE-receotoru. Dále se mají používat inaktivní, ale vázající mutanty mast cell-degranulating peptidu jako transportní peptid v hybridním proteinu. Tyto transportní peptidy/-pro teiny slouží k tomu, aby vyplavily proteázu do buněk. Tato oroteáza štěpí ve fúzním komplexu žirných buněk vysoce specifické proteiny, které zavádějí degranulační mechanismus buněk.
/ii/ Jako vysoce specifická proteáza slouží metallopro teináza, například lehký řetězec toxinu botulinu typu A, B,
-7C,D.E.F nebo G /BoNT/X/ stejně tak jako toxin tetanu /TeNT/ nebo IgA-proteáza z Neidseria gonorrhoae. Tyto proteázy štěpí synaptosomal-associated protein /MR 25.000/ /SNAP 25/, Synaptobrevin nebo Syntaxin. Jestliže se štěpí pouze jeden ze jmenovaných proteinů/peotidů, zabrání se degranulaci žírných buněk. Potom nedojde již k žádné sekreci histaminu, prostaglandinů a leukotrienů, a nemůže již dojít k alergickým symptomům.
V předloženém vynálezu se mohou netoxické lehké řetězce toxinů spojovat s transportními proteiny, které se vážou výlučně na žírné buňky pop*íoadě basofily a proto jsou pouze těmito zachyceny, přičemž lehké řetězce se tak řečeno dostanou současně do takovýchto buněk jako jezdci po skluzavce·»· lío nervových buněk nebo jiných typů buněk organismu nemohou vnikout, takže účinek na žírné buňky a basofily zůstane omezehý. Jestliže je jeden z těchto substrátů proteologicky rozrušen, neobjeví se po styku této IgE obsahujících buněk s alergeny nebo jedním ze shora uvedených léčiv žádné alergické symptomy.
Jako proteiny vázaj.ící specificky žírné buňky se používají:
1/ immunoglobuliny tyou E, jejich fragmenty·typu Fc,
2/ antitělíska oroti receptoru IgE,
3/ mast cell-degranulating peptide a
4/ antitělíska proti kanálu draslíku specifickém pro žírné buňky.
K uvedeným proteinům lze poukázat na následující stav techniky:
- IgE
- fragment IgS-Fc
Helman /1995/ Helman /1995/
-8~
- antitělíska proti IgE-receptoru žírných buněk/basofil, antitělíska proti kanálu draslíku specifickém pro žírné buňky, Fab-fragment antitělíska; při tom se jedná o standardní způsoby, které jsou popsány v:
MCD oeotid
Gmachel a. Krell /1995/
- inaktivní ale vázající mutanty
Mutovaný peptid se vyrobí standardním způsobem:
Nichol D.S.T. /1995/
- lehké *etězce různých toxinů botulinp tyou A až G:
Binz et al. /1990/
- lehký %etězec toxinu tetanu
Eis«l et al. /1989/
- IgA-p^oteáza
Bruscheck et al. /1995/
Spojení obou složek / transportního proteinu a proteázy/ se provádí různými způsoby:
Nejdříve se lejký *etězec toxinu chromatograficky čistí. Lehký řetězec je zcela netoxický, protože po oddělení od těžkého řetězce, neurotropního transportního proteinu, se nemůže dostat do nervových buněk a extracelulární / mimobuněčný/ extrakt není přítomný. Lehký řetězec se potom soojí chemicky s proteiny čtyř vázajících žirných buněk na konjugát, který se dostane do cytosolu žírných buněk. Tam štěpí lehký řetězec jejich substrát, načež je blokována sekrece histaminu a jiných látek. Druhá cesta syntézy konjugátu spočívá v tom, že gen pro lehký řetězec se spojí s genem pro jeden ze čtyř proteinů spojujících Žírnou buňku, takže se ve vhodných hostitelských buňkách exprimuje hybridní protein. Tento biotechnologicky vy• ·
-9ft ft • ft ráběný hybridní protein by měl analogicky jako konjugát vyrobený ze dvou proteinových složek blokovat sekreční proces ze žirných baněk.
Výroba hybridních proteinů je sama o sobě známým způsobem, zejména v oblasti léčení nádorů /Vogel, C.W.,
1987; Magerstadt, M., 1991/. V tomto terapeutickém konceptu se antitělísko proti povrchovým proteinům buněk nádoru spojí s cytotoxickým proteinem, například ricinem, toxinem záškrtu, aby se usmrtily rakovinové buňky. Nové na tomto představeném způsobu podle vynálezu je použití specifických proteáz poo^ínadě proteoly tických domén v hybrid nich proteinech pro' zabránění degranulace žirných buněk a tím oro antialergickou terapii. S těmito hybridními proteiny se dá nejenom zabránit silně ovlivňujícím alergickým symntomům /senné rýmě, astmatu a neurodermitidám / vleklým ohraničeným svědivým zánětům kůže//, tyto by se mohly také podávat i profylakticky pro zabránění alergických reakcí v rámci teraoie pomocí Život zabraňujících léčiv. Kromě to ho by mohly zabránit alergickým symptomům, ke kterým dochází při desenbilizaci.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1:
Syntéza hybridního proteinu z IgE a lehkého řetězce SoNT/ A
Vyčištěný toxin botulinu /5,0 mg/ typu A byl po ekvilibraci v 15 mM tetraboritanu sodného a 30 mM fosforečnanu, pH=8,4, nanesen na QAE-seohadexový sloupec /1,0x3,O cm/, ekvilibrovaný stejným pufrem. Sloupec byl potom oromyt 10 ml 120 mM dithioerythrolu, 2 M močoviny a 1 mM EDTA a přes noc inkubovány. Potom se lehký řetězec
0
00
-10eluoval ze sloupce 10 mM borátového pufru a dialyzovén oroti 20 mM fosforečnanu, pH = 7,0«
Immunoglobulin E /Ratte/ se koupil. 10 mg immunoglobulinu se štěpily 50 ug papainu v 1 ml fosforečnanového pufru /4 °C p*-es noc/. Fc-fragment se čistil přes gelový filtrační sloupec Sephakryl S200, 3,0 mg vyčištěného Fcfragmentu se inkubovaly 16 hodin se 3,0 ng vyčištěného lehkého *etězce toxinu botulinu s 10 mM bifunkČního agens dithiobissukcinimidylpropionátu ve 2 ml fosforečnanu sodného, oH=7,0. Takto zesyntetizovaný hybridní protein se čistil gelovou filtrací /Sephacryl S200/ a jeho čistota se analyzovala SDS-gelovou elektroforézou.
Zábrana degranulace žirných buněk se zkouší ve dvou Dokusných vsázkách. V první vsázce se inkubují žírné buňky z krys s hybridní molekulou, a potom se stimulovalo uvolňování histaminu. Stimulace se provádí specifickými liberatory histaminu, jako MCD-peptidem a Concanavalinem A / poslední je poukusně vyuřitá látka/, popřípadě přímým zvýšením intracelulární koncentrace vápníku. Poslední se získá injekcí vápníku do jednotlivé žírné buňky. Tím se zostří výše oopsaná kaskáda signálů, neboň zvýšení koncentrace vápníku je krokem v sekrečním procesu, oo kterém následuje fúze vesikul. Degranulace žírné buňky, které zobrazuje ooět uvolňování histaminu, se sleduje ve fázově kontrastním mikroskoou. Dále se uvolněný histamin může kvantifikovat pomocí měření fluorescence. Konečně se může stabovit elektrofyziologicky zvětšení žírné buňky, které je způsobeno uložením membrán vesikula do membrány plasmy při degranulaci. V buňkách ošetřených hybridním proteinem nedojde v protikladu ke kontrolním buňkám 1. Žádná morfologická změna, 2. nedojde k žádnému zesílení fluorescence v přesahu buněk a 3. nedojde k Žádnému zvětšení buněk. Tím se může φ φ φ
φφφ • ·
-11• φ φ φ φ φ φ φ prokázat, že uvolňování histaminu je blokováno hybridním proteinem.
Ve druhá vsázce se hybridní protein injikuje: Živým krysám. Krysy se po několika dnech usmrtí a jejich žirné buňky se získají obvyklými metodami. Degranulace popřípadě uvolňování histaminu se stanovuje stejně jako je to výše poosáno. V táto vsázce se zkouší, jestli se konjugát může i v živám zvířeti dostat do kompartimentu, ve kterém se nacházejí žírné buňky, a zda je tam inaktivuje.
Příklad 2
Výroba rekombinantního hybridního proteinu spojením genu pro lehký řetězec Clostridium botulinum typ A s genem pro immunoglobulin E popřípadě jeho fragmenty /Fc-fragment/
Gen pro lehký řetězec toxinu botulinu A se izoluje pomocí vhodného primeru př»s PCR / polymerace chain reaction/. K tomu se použije kultura Clostridium botulinum typu A, ze které se preparuje DNA. Z publikované sekvence genu toxinu /Hinz et al./ se odvozuje orimerní pár a nomocí PCR se amplifikuje gen pro lehkou podjednotku. Potom se tento gen klonuje oodle údajů výrobce v komerčním expresním vektoru pQS.
Gen pro F -fragment humánního immunoglobulinu E /Helc man L·./, se izoloval pomocí PCR z komerční banky cDNA a v konstruktu vektoru se fúzuje s genem pro lehký řetězec toxinu A botulinu.
S tímto konstruktem se transformují kompetentní M15 buňky /E. coli/. Vzhledem k tomu, že tomto expresním systému jsou insertované geny opatřeny his-tag, čistí se rekombinantní protein přes Mi-afinitní sloupec. Na důklad»00 • 0 0 0
0 0 * * 0 0 0 » * 0 0 0
0 00
-12né čištění navazuje gelová filtrace přes Sephacryl 5300. Testování biologické aktivity se provádělo opět na izolovaných řirných buňkách in vitro.
Příklad 3
Výroba rekombinantního hybridního proteinu spojením genu pro lehkou podjednotku toxinu tetanu s mutovaným genem pro mast cell degranulating peotide /MCD/
Sekvence pro Mast Cell Degranulating Peptide, 22mer je známa /Gmachl/, M, und Kreil, G./. Na základě toho se syntetizuje koresoondující oligonukleotid.
Pro izolaci sekvence lehké podjednotky toxinu tetanu byla vytvořena kultura C-r tetani a z té byla získána DNA. Ze známé sekvence kyseliny nukleové toxinu tetanu byl získán orimér oro PCR a tím gen pro lehkou podjednotku toxinu.
Jak je poosáno v příkladu 1, byly obě sekvence kyseliny nukleové fúzovány v expresním vektoru oQU a potom v E. coli. Hybridní protein, který byl opět opatřen his-, tag se čistil afinitní chromatografií a následující gelovou chromatografií. Vyčištěný gen pro Mast Cell Degranulating Peotide se chemicky syntetizoval s bodovou mutací v aktivní doméně peptidu. Gen se soojil s genem pro lehký řetězec toxinu tetanu. Hybridní protein se exprimoval v E. coli a čistil. Takto vyrobený hybridní protein se zkoušel v Mastcell-Degranulating-Assay.
Příklad 4
Výroba rekombinantního hybridního proteinu pomocí soojení genu pro Fc-fragment IgE s genem pro IgA-rproteázu • to
-13• ·· toto ·· · ·· ·· • toto» · to • · · to · to • · · · · ···> ·» ·*» to»» to« to • to to • to · ·· to
Gen pro F -fragment IgE, se izoluje stejně jako to byL·· lo popsáno v příkladu 1.
Gen pro IgA-proteázu z N-gonorrhoae je znám. Z toho se odvodí primer, a z preparace kyseliny nukleové z N-gonorrhoae byl pomocí PCR získán gen pro specifickou proteázu.
Obě kyseliny byly intergrovány v komerčním vektoru podle údajů výrobce a hybridní protein se čistil afinitní chromatografií /viz Dříklad 2/.
Inhibitorická aktivita se prokazovala opět na izolovaných žirných buňkách /viz výše/.
Příklad 5
Výroba hybridního proteinu, který sestává z Fab-fragmentu antitělíska proti IgE-receptoru a lehkého řetězce toxinu typů''B..botulinu.
Monoklonované antitělísko proti IgE-receptoru na žírných buňkách se koupilo a chromatograficky se dočistilo.
0,5 mg antitělíska se konjugovalo s 0,4 g vyčištěného lehkého řetězce toxinu B botulinu. Lehká podjednotka byla po preparaci neurotoxinu , stejným způsobem jako to bylo popsáno v příkladu 1, izolována štěpením neurotoxinu a následujícím čištěním přes iontoměničovou chromatografií.
Oba proteiny / lehká podjednotka toxinu typu F a monoklonované antitělísko/ se spolu spojily s bifunkčním činidlem. Za tím účelem se izolované proteiny inkubovaly s 10 mM maleinimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidoesteru. Hybridní protein se potom čistil geniovou filtrací p*es Sephacryl S300 aby se zbavil nekonjugovaných proteinů.
Na izolovaných Žirných buňkách se opět ukázalo, že syntetizovaný hybridní protein inhibuje sekreci histaminu.
- 2/vztah k jiným patentům___‘
Patent No. 4902495 ................
IgE Fc directed delivery systems
Novel Agent Controlling Cell Activity
PCT Anmeldung WO 94/21300
Literatura·' !
i
1) Ahnert-Hilger G., Bigalke H. (1995 )
Molecular aspects of tetanus and botulinum neurotoxin poisoning. Progress in Neurobiology 46: 83-96
2) Benecke R., Kessler K.R. (1995)
Botulinumtoxin A
Akt. Neurol. 22: 209-213
3) Bigalke, H.(1999 in press)
Clostridial Toxins, Handbook of Experimental Pharmacology and Toxicology, Ed.,Jusť & Aktories, Springer Verlag.
4) Binscheck T., Bartels F., Bergel H., Bigalke H., Yamasaki S., Hayashi T.,
Niemann H., Polner J. (1995)
IgA protease from Neisseria gonorrhoeae inhibits exocytosis in bovine chromaffin cells like tetanus toxin.
J. biol. Chem. 270: 1770-1774
5) Binscheck T., Wellhóner H.H. (1997)
Tetanus and botulinum toxins - zinc proteases - synaptotagmin exocytosis.
In: Toxins and signál transduction (Eds.: Gutman Y., Lazarovici Ρ.) 1: 457-487
6) Binz, T. , Kurazono, Η.', M., Frevert, J. , Wernars,K. & Niemann, H. (1990)
The complete sequence of botulinum toxin’ A and comparison with other clostridial neurotoxins • · ·
PCT/EP99/03272
WO 99/58571
J.Biol.Chem. 265: 9153-9158 ,
7) Cardoso, F. & Jancovic, J. (1995) .......'
Clinical use of botulinum neurotoxins
Current Topics Microbiol.Imunol. 195: 123-141
8) Fishman, A., Lorberboum-Galski, H. (1997)
Targeted elimination of cells expr.essing the high-affinity receptor for IgE (Fc epsilon Rl)· by a Pseudomonas exotoxin-based chimeric protein
Eur.J.Immunol., 27:486-494
9) Gmachl, M. & Kreil, G. (1995)
The precursors of the bee venom constituents apamin and MCE peptide are encoded by two genes in tandem which share the same 3'-exon
J.Biol;Chem. 270 (21): 12704-12708
10) Helman, L. (1995)
Characteriziation of four novel epsilon chain mRNA and a comparative analysis of genes for immunoglobulin E in rodents and man i
Eur. J. Immunol. 23 (1):, 159-167
11) Liddel & Weeks (1995)
Antikórper-Techniken
Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg
12) Link E., Edelmann 1., Chou J., Binz T., Yamasaki S., Eisel U., Baumert M.,
SOdhof T.C., Niemann H.& Jahn R. (1992)
Tetanus toxin action: Inhibition of neurotransmitter release linked to synaptobrevin proteolysis.
Biochem. Biophys. Res. Comm. 189; 18423-26
13) Magerstadt, M. (1991)
Antibody conjugates and malignant diseases
CRC Press
14) Hamawy, M.M. (Ed.) 1997)
IgE‘Receptor (FceRI) Function
In: Mast Cells and Basophils
Springer Verlag
15) Marxen P., Fuhrmann U., Bigalke H. (1989)
Gangliosides mediate inhibitory effects of tetanus and botulinum
A neurotoxins on exocytosis in chromaffin cells.
Toxicon 27: 849-859
»» • · * 4
PCJ/EP99/03272
9
WO 99/58571
16) Nichol D.S.T. (1995)
Gentechnische Methoden
Spektrum Akademischer Verlag
17) Vogel, C.-W. (Ed.) (1987)
Immunoconjugates: Antibody conjugates in radio-immagining anth therapy of cancer Oxford UP lne.

Claims (6)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Hybridní protein zahrnující nebo sestávající z /i/ z jednoho o sobě známého oroteinu, který se váže o sobě známým způsobem na žirné buňky a/nebo basofily a/ /nebo je jimy zachycen a /ii/ o sobě známé proteázy, která štěpí jeden nebo několik proteinů sekrečního aparátu žírných buněk a/nebo basofilů.
  2. 2. Hybridní protein, zahrnující nebo sestávající z /i/ proteinu, který se váže na žírné buňky a/nebo basofily a/nebo je jimi zachycen, přičemž protein /i/ je vybrán z následující skuniny
    IgE, fragmentu IgE, zejména fragmentu IgE-Fc, antitělísek proti IgE-receptoru žírných buněk a/nebo basofilům, fragment antitělíska proti IgE-receptoru žírných buněk a/nebo basofilům, zejména Fab-fragment, antitělíska proti kanálu draslíku specifickém pro Žírné buňky a inaktivního, ale vázajícího MCD-peptidu a /ii/ proteázy, zejména o sobě známé proteázy, která štěpí jeden nebo několik proteinů sekrečního aparátu žírných buněk a/nebo basofil
  3. 3. Hybridní protein, zahrnující nebo sestávající z /i/ proteinu, zejména o sobě známého proteinu, který se váže na Žírné buňky a/nebo basofily a/nebo je jimi zachycen, zejména o sobě známým způsobem, a /ii/ proteázy, která štěpí jeden nebo několik proteinů sekr^č nťho aparátu žírných buněk a/nebo basofily, přičemž pro teáza /ii/ je vybrána z následující skupiny:
    rt
    -U?~ lehký řetězec toxinu Clostridium botulinum, zejména typu A, B, C, L, E, P nebo G, lehký řetězec toxinu tetanu /TeNT/, katalyticky aktivní fragment lehkého řetězce toxinu tetanu,
    IgA-proteáza Neisseria gonorrhoae, a katalytické domény IgA-proteázy Neisseria gonorrhoae.
  4. 4. Hybridní protein podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že se protein /i/ vybere ze skuoiny podle nároku 2 a proteáza se vybere ze skupiny podle nároku3.
  5. 5. Hybridní protein podle nároku 4, vyznačující se tím, že dodatečně k lehkému řetězci toxinu Clostridium botulinum nebo toxinu tetanu je i N-terminální část těžkého řetězce dotyčného toxinu /H^-fragment/ nebo jeho fragment Částí hybridního proteinu.
  6. 6. Použití hybridního proteinu podle jednoho z nároků 1 až 5 pro inhibici degranulace žirných buněk.
CZ20004161A 1998-05-13 1999-05-12 Hybridní protein a léčivo pro inhibici degranulace žírných buněk CZ294376B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19821285 1998-05-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20004161A3 true CZ20004161A3 (cs) 2001-04-11
CZ294376B6 CZ294376B6 (cs) 2004-12-15

Family

ID=7867540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20004161A CZ294376B6 (cs) 1998-05-13 1999-05-12 Hybridní protein a léčivo pro inhibici degranulace žírných buněk

Country Status (22)

Country Link
EP (1) EP1084146B1 (cs)
JP (1) JP4549533B2 (cs)
KR (1) KR100580541B1 (cs)
CN (1) CN1241945C (cs)
AT (1) ATE227739T1 (cs)
AU (1) AU755513B2 (cs)
BR (1) BR9910359A (cs)
CA (1) CA2331274C (cs)
CU (1) CU22997A3 (cs)
CZ (1) CZ294376B6 (cs)
DE (1) DE59903410D1 (cs)
DK (1) DK1084146T3 (cs)
ES (1) ES2187200T3 (cs)
HK (1) HK1036994A1 (cs)
HU (1) HUP0103601A3 (cs)
IL (2) IL139478A0 (cs)
MX (1) MXPA00011148A (cs)
NO (1) NO328361B1 (cs)
PL (1) PL201879B1 (cs)
PT (1) PT1084146E (cs)
RU (1) RU2214420C2 (cs)
WO (1) WO1999058571A2 (cs)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9721189D0 (en) 1997-10-08 1997-12-03 Speywood Lab The Limited Analgesic conjugates
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
US20040071736A1 (en) 1998-08-25 2004-04-15 Health Protection Agency Methods and compounds for the treatment of mucus hypersecretion
US20080038274A1 (en) 1999-09-23 2008-02-14 Foster Keith A Inhibition of secretion from non-neuronal cells
GB9922554D0 (en) * 1999-09-23 1999-11-24 Microbiological Res Authority Inhibition of secretion from non-neuronal cells
MXPA03000014A (es) * 2000-06-28 2004-09-13 Ira Sanders Metodos para utilizar con fines beneficiosos toxina tetanica en animales.
GB0321344D0 (en) * 2003-09-11 2003-10-15 Health Prot Agency Re-targeted toxin conjugates
GB0426394D0 (en) 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
KR100845278B1 (ko) * 2006-08-04 2008-07-09 포항공과대학교 산학협력단 비만 세포의 활성을 유도하는 펩타이드 및 이를 포함하는면역조절제
WO2009150470A2 (en) 2008-06-12 2009-12-17 Syntaxin Limited Suppression of cancers
EP2310028B1 (en) 2008-06-12 2016-11-16 Ipsen Bioinnovation Limited Fusion proteins for use in the treatment of acromegaly
JP2011529336A (ja) * 2008-07-31 2011-12-08 トータル エス．アー． ポリペプチドを産生及び分泌させるための構築物及び方法
GB0820970D0 (en) 2008-11-17 2008-12-24 Syntaxin Ltd Suppression of cancer
CN102241774B (zh) * 2010-05-27 2014-05-14 四川大学 重组IgE-Fc-抗EGFR单链抗体融合蛋白及其制备方法和用途
GB201108108D0 (en) 2011-05-16 2011-06-29 Syntaxin Ltd Therapeutic fusion proteins
US20140056870A1 (en) 2012-08-27 2014-02-27 Allergan, Inc. Fusion proteins
GB201312317D0 (en) 2013-07-09 2013-08-21 Syntaxin Ltd Cationic neurotoxins
US10647750B2 (en) 2015-01-09 2020-05-12 Ipsen Bioinnovation Limited Cationic neurotoxins
GB201517450D0 (en) 2015-10-02 2015-11-18 Ipsen Biopharm Ltd Method
EP3263710A1 (en) 2016-07-01 2018-01-03 Ipsen Biopharm Limited Production of activated clostridial neurotoxins
GB201815817D0 (en) 2018-09-28 2018-11-14 Ispen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising and exogenous activation loop
GB201900621D0 (en) 2019-01-16 2019-03-06 Ipsen Biopharm Ltd Labelled polypeptides
GB201914034D0 (en) 2019-09-30 2019-11-13 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of neurological disorders
GB202100566D0 (en) 2021-01-15 2021-03-03 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of brain damage
GB202104294D0 (en) 2021-03-26 2021-05-12 Ipsen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an exogenous activation loop
EP4297773A1 (en) 2021-03-30 2024-01-03 Ipsen Biopharm Limited Catalytically inactive clostridial neurotoxins for the treatment of pain & inflammatory disorders
JP2024513191A (ja) 2021-03-30 2024-03-22 イプセン バイオファーム リミテッド 疼痛及び炎症性障害の処置
GB202116795D0 (en) 2021-11-22 2022-01-05 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of visceral pain
PL244930B1 (pl) 2021-12-08 2024-04-02 Gdanski Univ Medyczny Zastosowanie 2-metoksyestradiolu w leczeniu mastocytozy
GB202214232D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Ispen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an activating exogenous protease cleavage site
GB202214229D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Ipsen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an activating endosomal protease cleavage site

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9305735D0 (en) * 1993-03-19 1993-05-05 North John R Novel agent for controlling cell activity
IL116436A (en) * 1995-12-18 2006-12-31 Yissum Res Dev Co Fc?Á-PE CHIMERIC PROTEIN FOR TARGETED TREATMENT OF ALLERGY RESPONSES AND

Also Published As

Publication number Publication date
NO20005637L (no) 2000-11-08
CN1300295A (zh) 2001-06-20
AU4260599A (en) 1999-11-29
EP1084146A2 (de) 2001-03-21
NO20005637D0 (no) 2000-11-08
ES2187200T3 (es) 2003-05-16
IL139478A0 (en) 2001-11-25
DK1084146T3 (da) 2003-02-03
MXPA00011148A (es) 2003-04-22
BR9910359A (pt) 2001-01-09
PL201879B1 (pl) 2009-05-29
CN1241945C (zh) 2006-02-15
JP4549533B2 (ja) 2010-09-22
AU755513B2 (en) 2002-12-12
HUP0103601A3 (en) 2004-06-28
EP1084146B1 (de) 2002-11-13
HUP0103601A2 (hu) 2002-01-28
WO1999058571A2 (de) 1999-11-18
CZ294376B6 (cs) 2004-12-15
HK1036994A1 (en) 2002-01-25
PL344752A1 (en) 2001-11-19
IL139478A (en) 2008-06-05
NO328361B1 (no) 2010-02-01
ATE227739T1 (de) 2002-11-15
PT1084146E (pt) 2003-02-28
KR20010042825A (ko) 2001-05-25
WO1999058571A3 (de) 2000-02-03
KR100580541B1 (ko) 2006-05-16
DE59903410D1 (de) 2002-12-19
CA2331274C (en) 2010-04-06
CU22997A3 (es) 2004-10-12
CA2331274A1 (en) 1999-11-18
RU2214420C2 (ru) 2003-10-20
JP2002514659A (ja) 2002-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20004161A3 (cs) Hybridní protein pro zabránění granulace žírných buněk a jeho použití
JP7337864B2 (ja) マトリプターゼ及びｕ‐プラスミノーゲン活性化因子の基質及び他の切断可能部分、並びにその使用方法
JP6889199B2 (ja) ｐ９７のフラグメントおよびその使用
JP5357425B2 (ja) 神経細胞に化合物を導入するために用いられる輸送タンパク質
US7456272B2 (en) Neurotoxins with enhanced target specificity
CZ332297A3 (cs) Deriváty klostridiových toxinů, které jsou schopny modifikovat funkce periferního senzorického aferentního neuronu
US20050249738A1 (en) Immunotoxins directed against malignant cells
KR20040105818A (ko) 심혈관 질환의 처치에 사용되는 보툴리눔 독소
CN108135968A (zh) 嵌合多肽组装体及其制备和使用方法
JPH09509053A (ja) Ｔ−細胞抗原、並びにｔ−細胞介在状態の診断及び処理へのそれらの使用
JP2015231378A (ja) 短い生物学的活性を示す神経毒
JP2012511033A (ja) 多価化合物の可逆阻害用マスキングリガンド
WO2018109447A1 (en) Neurotoxins
JP2020143084A (ja) 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート
EP1663286B1 (en) In vivo modulation of neuronal transport
US6822076B2 (en) Hybrid protein for inhibiting the degranulation of mastocytes and the use thereof
WO2018231661A1 (en) Methods and reagents to treat tumor and cancer
US7193066B1 (en) Preparation of highly pure toxin fragments
Bouquier et al. Gelatinase biosensor reports cellular remodeling during epileptogenesis
Stábeli et al. Antibodies to a fragment of the Bothrops moojeni L-amino acid oxidase cross-react with snake venom components unrelated to the parent protein
Brown et al. A novel in vivo model using immunotoxin in the absence of p-glycoprotein to achieve ultra selective depletion of target cells: applications in trogocytosis and beyond
EP4159237A1 (en) Improved granzyme b variant
NO168989B (no) Fremgangsmaate for aa oeke loeseligheten av f. eks. immunokonjugatpreparater
Leese et al. Duplication of clostridial binding domains for enhanced macromolecular delivery into neurons
Montecucco et al. Clostridial neurotoxins as enzymes: structure and function

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20100512