ES2312997T3 - Complejo de chaperonina-proteina diana,procedimiento de produccion del mismo,procedimiento de estabilizacion de roteina diana, procedimientode analisis de estructura de proteina diana, preparacion de liberacionprolongada y procedimeinto de anticuerpo contra la proteina diana. - Google Patents
Complejo de chaperonina-proteina diana,procedimiento de produccion del mismo,procedimiento de estabilizacion de roteina diana, procedimientode analisis de estructura de proteina diana, preparacion de liberacionprolongada y procedimeinto de anticuerpo contra la proteina diana. Download PDFInfo
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Abstract
Complejo de chaperonina-proteína diana, que comprende: una proteína de fusión que comprende una subunidad de chaperonina y una etiqueta de afinidad unida a la subunidad de chaperonina mediante un enlace peptídico; y una proteína diana para la que la etiqueta de afinidad presenta una afinidad específica, en el que la proteína diana está unida a la etiqueta de afinidad mediante la afinidad específica, formando así una estructura de anillo de chaperonina constituida por una pluralidad de subunidades de chaperonina y en el que la proteína diana está alojada en la estructura de anillo de chaperonina de la proteína de fusión.
Description
Complejo de chaperonina-proteína
diana, procedimiento de producción del mismo, procedimiento de
estabilización de la proteína diana, procedimiento de inmovilización
de la proteína diana, procedimiento de análisis de la estructura de
la proteína diana, preparación de liberación prolongada y
procedimiento de producción de un anticuerpo contra la proteína
diana.
La presente invención se refiere a un complejo
de chaperonina-proteína diana y a un procedimiento
de producción del mismo, y a un procedimiento de estabilización de
la proteína diana, a un procedimiento de inmovilización de la
proteína diana, a un procedimiento de análisis de la estructura de
la proteína diana, a una formulación de liberación prolongada y a
un procedimiento de producción de un anticuerpo contra la proteína
diana. Más específicamente, se refiere a un complejo de
chaperonina-proteína diana en el que una proteína
diana está unida a una chaperonina mediante una etiqueta de
afinidad y a un procedimiento de producción del mismo, y a un
procedimiento de estabilización de la proteína diana, a un
procedimiento de inmovilización de la proteína diana, a un
procedimiento de análisis de la estructura de la proteína diana, a
una formulación de liberación prolongada y a un procedimiento de
producción de un anticuerpo contra la proteína diana, utilizando
cada uno el complejo de chaperonina-proteína
diana.
Se ha completado un análisis de la secuencia
completa del genoma de varios organismos incluyendo seres humanos,
ratón y levadura, y se considera que una tendencia de investigación
en biotecnología está evolucionando desde un análisis génico hacia
una investigación comprensiva de las proteínas. Como consecuencia de
dicha investigación, cabe esperar que el descubrimiento de
proteínas que se relacionan con enfermedades y la resolución de la
interacción entre las proteínas in vivo conduzca a un
desarrollo de un nuevo fármaco. Recientemente, se han desarrollado y
utilizando ampliamente herramientas de investigación tales como un
procedimiento de dos híbridos para la detección de la interacción
entre las proteínas y los chips de proteína para la detección de la
expresión proteica. Hasta ahora, aunque los chips de ADN se han
utilizado para identificar genes relacionados con enfermedades, la
traducción génica no siempre se ha correlacionado bien con la
expresión proteica. De este modo, una herramienta de investigación
que utiliza proteínas como muestra que incluye chips de proteína
atrae la atención como nuevo procedimiento
alternativo.
alternativo.
Las proteínas deben manipularse con precaución
para protegerlas de su desnaturalización. Uno de los factores
importantes por los cuales las proteínas se caracterizan es su
estructura de orden superior. Sin embargo, los cambios en el medio
externo tales como el calor o el pH rompen la estructura de orden
superior de las proteínas con la consecuencia de la reducción de
una actividad de la proteína. Los problemas para la aplicación
industrial de las proteínas son cómo mantener su estructura de
orden superior y evitar su desnaturalización. Por ejemplo, en el
caso de la aplicación de proteínas inmovilizadas en un portador o
soporte de poliestireno o similar, debe apreciarse que no presentar
una estructura de orden superior de las proteínas cambió debido a la
interacción hidrófoba implicada con inmovilización del portador o
similar. La inmovilización de las proteínas en un portador presenta
otro problema de modo que una zona activa de las proteínas está
frente al portador, lo que da como resultado prevenir su actividad
del funcionamiento propiamente. Por consiguiente, se ha deseado
también un procedimiento de control para la inmovilización de las
proteínas o un portador que mantenga su orientación.
Por otra parte, un determinado tipo de proteínas
atrae la atención en la aplicación como sonda para identificar un
nuevo fármaco. Más específicamente, algunas proteínas en las
células se unen específicamente a diferentes tipos de sustancias
fisiológicamente activas, relacionándose de este modo a una
transmisión de su acción. Un agonista y un antagonista que actúan
contra ellos pueden ser sustancias experimentales para un nuevo
fármaco destinadas a controlar la transmisión de la acción, de modo
que la identificación de las proteínas y sus estereoestructuras
suscitan considerable interés. Aunque existen el procedimiento RMN
y el análisis cristalográfico por rayos X para analizar las
estereoestructuras de las proteínas, generalmente es difícil para el
procedimiento RMN analizar las proteínas con peso molecular de 50
kDa y superior. Como para el otro procedimiento, el análisis
cristalográfico de rayos X, no hay limitación por encima del peso
molecular de las proteínas, pero este procedimiento necesita
consideración de varias condiciones para la cristalización en cada
proteína, resultando que es limitante de velocidad para el análisis
de alta resolución, lo que se ve con recelo. En las proteínas, como
se ha mencionado anteriormente, su estructura terciaria y estructura
cuaternaria son muy importantes para la determinación de su
naturaleza y calidad.
Recientemente, se ha reparado en que una mejora
de una tecnología de producción recombinante de proteínas permite
que se produzcan proteínas fisiológicamente activas tales como las
citocinas y las proteasas en gran cantidad para aplicar como un
nuevo fármaco. Sin embargo, muchas de estas proteínas son
descompuestas por las proteasas, dando como resultado un tiempo de
residencia sumamente breve in vivo. Se considera que la
mayoría de las proteínas descompuestas como se acaba de describir
incluyen una proteína constituida por un dominio funcional de las
proteínas fisiológicamente activas o una proteína con diferentes
estructuras de las naturales, dando como resultado que son
vulnerables a la destrucción por la proteasa. Dicho esfuerzo como
implantación de proteínas fisiológicamente activas con polímeros
solubles en agua se realiza para alargar el tiempo de residencia
in vivo, pero los problemas que implica un proceso incómodo
y complicado permanecen, de modo que se ha requerido un
procedimiento más sencillo.
Un fármaco de anticuerpo ha atraído también la
atención como uno de los fármacos de proteínas. Con el fin de
obtener un anticuerpo que se puede convertir en un fármaco, es
necesario inmunizar un animal con un antígeno que provoque una
enfermedad, para recuperar los anticuerpos, sus genes e hibridomas y
para evaluarlos y mejorarlos. Sin embargo, en el caso de que el
antígeno sea fácil de descomponerse en la sangre de los animales
inoculados, es imposible provocar una respuesta inmunitaria
suficiente y no puede obtenerse un anticuerpo diana.
Tal como se describe, las proteínas tienen
potencial ilimitado, pero un procedimiento mediante el que las
proteínas se manipulan y controlan más fácilmente y de manera más
eficaz se ha deseado generalmente.
El documento WO 99/42121 da a conocer un
procedimiento de purificación de proteínas segregables del choque
térmico que comprende una etiqueta con afinidad.
Kirschner Marc et al., Plant
Journal, vol. 24, n° 3, noviembre 2000
(2000-11), páginas 397-411, da a
conocer las proteínas vegetales del choque térmico de la familia
hsp20 de la chaperona fusionadas a etiquetas de afinidad.
El documento WO 97/06821 da a conocer
composiciones inmunógenas que comprenden por lo menos una proteína
del choque térmico y uno o más antígenos diana híbridos que tienen
un dominio de unión de la proteína del choque térmico.
El documento WO 01/79259 da a conocer un
complejo que comprende una proteína del choque térmico y uno o más
epítopos fusionados por enlace covalente a una molécula de ligadura
(denominada "jabalina") con afinidad para dicha proteína del
choque térmico.
Por lo tanto un objetivo de la presente
invención consiste en el contexto de los problemas e inconvenientes
mencionados anteriormente en proporcionar un complejo de
chaperonina-proteína diana mediante el cual la
proteína diana se manipula más fácilmente y un procedimiento para
producir la misma, y un procedimiento de estabilización de la
proteína diana, un procedimiento de inmovilización de la proteína
diana, un procedimiento de análisis de la estructura de la proteína
diana, una formulación de liberación prolongada y un procedimiento
de producción de un anticuerpo contra la proteína diana, utilizando
cada uno el complejo de chaperonina-proteína
diana.
La presente invención propuesta para conseguir
el objetivo descrito anteriormente consiste en alojar y mantener
una proteína diana mediante una etiqueta de afinidad en una
estructura cuaternaria de una proteína chaperonina (denominada
también proteína del choque térmico de 60 kDa o termosoma).
Más específicamente, un aspecto de la presente
invención se refiere a:
- (1)
- Un complejo de chaperonina-proteína diana que incluye una proteína de fusión que incluye una subunidad de chaperonina y una etiqueta de afinidad unida a la subunidad de chaperonina mediante un enlace peptidico y una proteína diana para la que la etiqueta de afinidad presenta una afinidad específica, en el que la proteína diana está unida a la etiqueta de afinidad mediante la afinidad específica, formando de este modo una estructura de anillo de chaperonina constituida por una variedad de subunidades de chaperonina y en el que la proteína diana está adaptada en la estructura de anillo de chaperonina de la proteína de fusión;
- (2)
- El complejo de chaperonina-proteína diana descrito en (1) en el que la proteína de fusión incluye una subunidad de chaperonina, y en el que la etiqueta de afinidad está unida mediante el enlace peptídico del terminal N y/o el terminal C de la subunidad de chaperonina;
- (3)
- El complejo de chaperonina-proteína diana descrito en (1) en el que la proteína de fusión incluye un enlace de la subunidad de chaperonina compuesto de 2 a 20 subunidades de chaperonina unidas en serie entre sí y en el que la etiqueta de afinidad está unida a por lo menos una zona seleccionada de un grupo constituido por el terminal N del enlace de la subunidad de chaperonina, el terminal C del enlace de la subunidad de chaperonina y un punto de enlace de las subunidades de chaperonina;
- (4)
- El complejo de chaperonina-proteína diana descrito en (1), (2) o (3) en el que la relación del número de unidades de chaperonina al número de etiqueta de afinidad está comprendido en el intervalo entre 1:2 a 9:1;
- (5)
- El complejo de chaperonina-proteína diana descrito en (3) o (4) que está provisto de una secuencia que debe escindirse por una proteína específica del sitio entre las subunidades del enlace de la subunidad de chaperonina;
- (6)
- Complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (5) que tiene dos anillos de chaperonina asociados por enlace no covalente en el plano del anillo entre sí con el fin de formar una estructura de anillo de chaperonina de dos capas; y
- (7)
- Complejo de chaperonina-proteína diana descrito en (6) que presenta dos anillos de chaperonina asociados por enlace no covalente en el plano del anillo entre sí o al lado entre sí para formar una estructura de anillo de chaperonina fibrosa.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a:
- (8)
- El complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (7) en el que el ser vivo del que procede la chaperonina se selecciona de entre un grupo constituido por bacterias, arqueas y eucariotas;
- (9)
- Complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (8) en el que la etiqueta de afinidad es la seleccionada de entre un grupo constituido por un anticuerpo, estreptavidina, proteína A, proteína G, proteína L, péptido S, proteína S y un fragmento parcial de los mismos;
- (10)
- Complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (9) en el que la proteína diana es un polipéptido que incluye un fragmento de seis o más restos de aminoácido e incluye una etiqueta acompañante con afinidad específica para la etiqueta de afinidad;
- (11)
- Complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (10) en el que la proteína diana se selecciona de entre un grupo constituido por una cadena pesada de un anticuerpo, una cadena ligera de un anticuerpo, y un polipéptido que incluye un fragmento de 6 o más restos de aminoácido del mismo e incluye una etiqueta acompañante con afinidad específica para la etiqueta de afinidad;
- (12)
- Complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (10) en el que la proteína diana incluye una seleccionada de un grupo constituido por un antígeno vírico, un receptor siete transmembranario, una citocina, una proteína cinasa, una fosfoproteína fosfatasa y un fragmento parcial de los mismos;
- (13)
- Procedimiento de producción del complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (12) incluyendo el procedimiento las etapas de mezclado de la proteína de fusión compuesta de la subunidad de chaperonina y la etiqueta de afinidad con la proteína diana que incluye la etiqueta acompañante con afinidad para la etiqueta de afinidad, y unir la proteína de fusión a la proteína diana mediante una afinidad específica entre la etiqueta de afinidad y la etiqueta acompañante;
- (14)
- Procedimiento de producción del complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (12) en el que la etiqueta acompañante con afinidad específica para la etiqueta de afinidad es un polipéptido, y el procedimiento que incluye una etapa de transcripción y traducción en el mismo hospedador tanto de un gen que contiene un gen que codifica la subunidad de chaperonina como un gen que codifica la etiqueta de afinidad y un gen que contiene un gen que codifica la proteína diana y un gen que codifica la etiqueta acompañante, uniendo de este modo la proteína diana a la proteína de fusión de la chaperonina;
- (15)
- Procedimiento de producción del complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (12) en el que la etiqueta acompañante con afinidad específica para la etiqueta de afinidad es un polipéptido, y el procedimiento que incluye una etapa de transcripción y traducción en los mismos tres genes del hospedador constituidos por un gen que contiene un gen que codifica la subunidad de chaperonina y un gen que codifica la etiqueta de afinidad, un gen que contiene un gen que codifica la proteína diana y un gen que codifica la etiqueta acompañante, y un gen que codifica la subunidad de chaperonina o su enlace, uniendo de este modo la proteína diana, la proteína de fusión de la chaperonina y la subunidad de chaperonina o su enlace; y
- (16)
- Procedimiento descrito en los apartados (14) o (15) en el que el complejo proteico se produce en un hospedador seleccionado de entre un grupo constituido por bacterias, levaduras, células animales, células vegetales, células de insectos, animales, vegetales e insectos.
Todavía otro aspecto de la presente invención se
refiere a:
- (17)
- Procedimiento descrito en los apartados (14) o (15) en el que el complejo proteico se produce en un sistema de traducción exento de células;
- (18)
- Procedimiento de estabilización de la proteína diana, incluyendo el procedimiento una etapa de unión de la proteína diana mediante la etiqueta de afinidad a la proteína de fusión incluida en el complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (9) para que la proteína diana se aloje en la estructura de anillo de chaperonina;
- (19)
- Procedimiento de inmovilización de la proteína diana, incluyendo el procedimiento las etapas de inmovilización en un portador para la inmovilización de la proteína de fusión incluida en el complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (9) y la unión de la proteína diana mediante la etiqueta de afinidad a la proteína de fusión para que la proteína diana se aloje en el anillo de chaperonina.
- (20)
- Procedimiento de análisis de la estructura de la proteína diana, incluyendo el procedimiento las etapas de cristalización de un complejo proteico obtenido adaptando la proteína diana unida mediante la etiqueta de afinidad a la proteína de fusión incluida en el complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (9) y obtener información sobre la estructura tridimensional de la proteína diana de una imagen por difracción de rayos X obtenida irradiando un cristal obtenido por cristalización;
- (21)
- Formulación de liberación lenta para una proteína fisiológicamente activa o un fármaco de bajo peso molecular en la que la proteína fisiológicamente activa o el fármaco de bajo peso molecular se aloja en la proteína de fusión incluida en el complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (9) mediante la etiqueta acompañante para la etiqueta de afinidad;
- (22)
- Formulación de liberación lenta descrita en el apartado (21) en la que la chaperonina procede de un ser humano; y
- (23)
- Procedimiento de producción de un anticuerpo contra una proteína de antígeno diana, incluyendo el procedimiento las etapas de unión de la proteína del antígeno diana a la proteína de fusión incluida en el complejo de chaperonina-proteína diana descrito en uno de los apartados (1) a (9) e inmunizar un animal con éste como inmunógeno.
El complejo de
chaperonina-proteína diana en la invención realiza
más fácilmente la estabilización de la proteína diana, la
inmovilización de la proteína diana en un portador, un análisis
estructural de la proteína diana, la formulación de la proteína
diana de liberación lenta y la producción de un anticuerpo contra
la proteína diana.
Según el procedimiento de estabilización de la
proteína diana en la invención, la proteína diana se estabiliza más
fácilmente.
Según el procedimiento de inmovilización de la
proteína diana en la invención, la proteína diana está ordenada,
mostrando de este modo una característica de la proteína diana de
manera más eficaz.
Según el procedimiento de análisis de la
estructura de la proteína diana en la invención, el análisis por
rayos X se realiza con suficiente facilidad para prescindir de
consideración de una condición de cristalización dependiendo de la
natural de la proteína diana.
Según la formulación de liberación lenta en la
invención, la proteína diana no se descompone rápidamente en la
sangre para ejercer la eficacia del fármaco en una zona específica
afectada.
Según el procedimiento de producción de un
anticuerpo en la invención, la proteína diana no se descompone
rápidamente en la sangre del animal inmunizado para producir la
respuesta inmunitaria de manera más eficaz.
La figura 1 es una ilustración esquemática de la
estereoestructura de la chaperonina de Escherichia coli
(GroEL);
La figura 2A es una ilustración esquemática que
presenta un estado en el que dos proteínas de fusión compuesta cada
una por un enlace de 4 veces una subunidad de chaperonina y una
etiqueta de afinidad forman una estructura de anillo;
la figura 2B es una ilustración esquemática de
una proteína de fusión compuesta por un enlace de 4 veces una
subunidad de chaperonina y una etiqueta de afinidad;
la figura 3A es un esquema conceptual que
presenta un estado en el que un enlace de chaperonina está
inmovilizado en un portador;
la figura 3B es un esquema conceptual que
presenta un estado en el que la proteína de fusión
chaperonina-etiqueta de afinidad está inmovilizada
en un portador;
la figura 3C es un esquema conceptual que
presenta un estado en el que la proteína diana está inmovilizada en
un portador mediante una proteína de fusión
chaperonina-etiqueta de afinidad;
la figura 4 es una ilustración que presenta la
constitución de una parte principal de un vector de expresión
pETD_{2} (TCP\beta)_{8};
la figura 5 es una fotografía de una proteína de
fusión compuesta por una chaperonina arqueal que tiene ocho
subunidades y una proteína A bajo un microscopio electrónico de
transmisión;
la figura 6 es una fotografía de un complejo de
chaperonina-anticuerpo monoclonal obtenido por
actuación de un anticuerpo monoclonal en una proteína de fusión
compuesta de una chaperonina arqueal que presenta ocho subunidades y
una proteína A bajo un microscopio electrónico de transmisión;
la figura 7 es una fotografía de un complejo de
chaperonina-GFP obtenido por actuación de una
etiqueta GFP-S en una proteína de fusión compuesta
de una chaperonina arqueal que tiene ocho subunidades y una
proteína A bajo un microscopio electrónico de transmisión;
la figura 8A es un gráfico para comparar una
actividad del anticuerpo de un anticuerpo monoclonal de ratón
inmovilizado en un portador;
la figura 8B es un gráfico para comparar la
estabilidad térmica de un anticuerpo monoclonal de ratón
inmovilizado.
Un complejo de
chaperonina-proteína diana en la presente invención
incluye una proteína de fusión en la que una etiqueta de afinidad
está unida a una unidad de chaperonina mediante un enlace peptídico
y una proteína diana para la que la etiqueta de afinidad presenta
una afinidad específica, en la que la proteína diana está unida a la
etiqueta de afinidad por medio de la afinidad específica, formando
de este modo una estructura de anillo de chaperonina constituida
por muchas subunidades de chaperonina y en la que la proteína diana
está adaptada en la estructura de anillo de chaperonina de la
proteína de fusión.
Una chaperonina natural, una de las chaperonas
moleculares que ayuda al plegamiento de la proteína, tiene una
estructura en dos capas formada por dos anillos (anillos de
chaperonina), que tienen cada uno siete a nueve subunidades con un
peso molecular de aproximadamente 60 kDa, que es una proteína
enorme con un peso molecular de 1.000 kDa. La chaperonina se
encuentra en todos los seres vivos tales como bacterias, arqueas y
eucariotas, y ayuda al plegamiento de la proteína y contribuye a la
estabilización de la estructura en presencia o ausencia de una
sustancia energética ATP en las células. La chaperonina de
Escherichia coli (GroEL), por ejemplo, presenta una cavidad
con un diámetro interno de 4,5 nm y una altura de 14,5 nm en cada
capa de un anillo de dos capas (véase la figura 1). La cavidad del
anillo de chaperonina de una capa tiene un espacio en la que una
proteína globular con un peso molecular de 60 kDa está
suficientemente adaptada. Es bien conocido que el complejo de
chaperonina funciona en los intermedios plegados que se adaptan
temporalmente de varias proteínas o proteínas desnaturalizadas en
la cavidad, y una vez se forma una estructura plegada de la
proteína, el complejo se conjuga con descomposición de ATP para
liberar la proteína adaptada de la cavidad.
En la presente invención, se produce una
proteína de fusión (denominada en adelante proteína de fusión
chaperonina-etiqueta de afinidad o simplemente
proteína de fusión de chaperonina) en la que una etiqueta de
afinidad del polipéptido está unidad a la subunidad de chaperonina
mediante el enlace peptídico para formar la estructura de anillo
ensamblando las subunidades de chaperonina. En ese momento, la
etiqueta de afinidad unida a la chaperonina se adapta
preferentemente en el anillo de chaperonina. La proteína diana
necesita incluir una etiqueta acompañante con afinidad específica
para la etiqueta de afinidad. La etiqueta acompañante está unida a
la etiqueta de afinidad, asegurando de este modo que la proteína
diana se adapta en el anillo de chaperonina (en adelante el
complejo resultante compuesto por la chaperonina y la proteína diana
se denomina complejo de chaperonina-proteína diana
o simplemente complejo de chaperonina).
En la presente memoria, la "etiqueta de
afinidad" y la "etiqueta acompañante" son expresiones
utilizadas para designar dos tipos de sustancias con afinidad
específica entre sí tal como una hormona y un receptor, un antígeno
y un anticuerpo y una enzima y un sustrato que se utilizan como
etiquetas, refiriéndose a una como etiqueta de afinidad y a la otra
como etiqueta acompañante. Específicamente, el complejo de
chaperonina-proteína diana en la presente invención
se aplica a una de las dos etiquetas que ha de unirse a la
subunidad de chaperonina para formar la proteína de fusión y la
fusionada a la subunidad de chaperonina se denomina etiqueta de
afinidad y la otra se denomina etiqueta acompañante. Una afinidad
específica entre la etiqueta de afinidad y la etiqueta acompañante
está compuesta por una interacción no covalente tal como un enlace
de hidrógeno, una interacción hidrófoba y una fuerza
intermolecular.
En cuanto a una combinación de la etiqueta de
afinidad y la etiqueta acompañante, puede aplicarse cualquier
combinación si la combinación tiene afinidad por medio de una
interacción específica entre las dos etiquetas. Sin embargo, la
etiqueta de afinidad está preferentemente realizada a partir de un
polipéptido ya que necesita ser expresada como proteína de fusión
con la subunidad de chaperonina.
Una combinación de proteína A o proteína G y la
zona Fc de IgG se toma como ejemplo de combinación de la etiqueta
de afinidad y la etiqueta acompañante. La proteína A (Bridigo, M.
M., J. Basic. Microbiology, 31, 337, 1991) constituida por
aproximadamente 470 restos de aminoácidos y procedente de
Bacillus sp. o Staphylococcus sp. es bien conocida y
con frecuencia se utiliza para la purificación de IgG de antisueros.
El dominio de unión a IgG de la proteína G procedente de
Staphylococcus aureus constituido por aproximadamente 60
restos de aminoácidos (Saito, A., Protein Eng. 2, 481, 1989).
La proteína G constituida por aproximadamente 450 restos de
aminoácidos y procedente de Streptococcus sp. (Frahnestock,
S. R., J. Bacteriol. 167, 870, 1986) es bien conocida y con
frecuencia se utiliza para la purificación de IgG así como la
proteína A. Se ha demostrado ya que una zona de unión con IgG está
constituida por aproximadamente 50 a 60 aminoácidos (Gronenborn, A.
M., Science, 253, 657, 1991).
Otro ejemplo de la combinación de la etiqueta de
afinidad y la etiqueta acompañante incluye una combinación de
proteína L y las cadenas ligeras \kappa de la inmunoglobulina. La
proteína L es una proteína unida específicamente a las cadenas
ligeras \kappa de varias clases de inmunoglobulina tales como IgG,
IgM, IgA, IgE e IgD y sus subclases sin interferir con su zona de
unión al antígeno. La proteína L que es conocida hasta ahora está
constituida por aproximadamente 720 restos de aminoácidos y procede
de Finegoldia magna (Kastern, W., Infect. Immun. 58,
1217, 1990). Un dominio de unión con la cadena ligera \kappa que
está constituido por aproximadamente 80 aminoácidos ha sido ya
estudiado con detalle (Wikstron, M., Biochemistry 32, 3381,
1993).
Otro ejemplo incluso de una combinación de la
etiqueta de afinidad y la etiqueta acompañante incluye una
combinación de la proteína S y del péptido S. Es sabido que la
proteína S y el péptido S, los cuales son parte de las
ribonucleasas, están unidos entre sí con el fin de presentar
actividad de ribonucleasa. Asimismo tienen una gran afinidad
específica entre sí, para ser utilizados con frecuencia para la
purificación de proteínas. En el péptido S, la etiqueta S
constituida por 15 restos de aminoácidos se utiliza para la
investigación. La SEC. ID. n°: 3 designa una secuencia de ADN que
codifica la proteína S y la SEC. ID. n°: 4 designa una secuencia de
ADN que codifica la etiqueta S.
Todavía otro ejemplo de una combinación de la
etiqueta de afinidad y la etiqueta acompañante incluye una
combinación de un péptido FLAG y un anticuerpo que utiliza el
péptido FLAG como epítopo. El péptido FLAG se utiliza con frecuencia
para la purificación de las proteínas. Por ejemplo, el péptido FLAG
constituido por 11 aminoácidos se fusiona al terminal N de un
factor de transcripción de levadura, purificando de este modo una
proteína de fusión mediante sus anticuerpos (Witzgall, R.,
Biochem., 223, 291, 1994). Ejemplos de los péptidos FLAG
para aplicación general incluyen un péptido constituido por DYKDDDDK
(SEC. ID. n°: 5), un péptido constituido por DYKD (SEC. ID. n°: 6),
un péptido constituido por MDFKDDDDK (SEC. ID. n°: 7) y un péptido
constituido por MDYKAFDNL (SEC. ID. n°: 8). Estos péptidos
presentan respectivamente una afinidad por el anticuerpo monoclonal
M1, el anticuerpo monoclonal M5 y el anticuerpo monoclonal M2. Estos
anticuerpos están disponibles en un productor de reactivos tal como
Sigma.
La etiqueta de afinidad que aporta el complejo
de chaperonina-proteína diana en la presente
invención puede utilizar no solamente la longitud total de la
proteína A, proteína G, proteína L, péptido S, proteína S
mencionados anteriormente, y similares, sino también sus fragmentos
incluyendo una zona de unión con la etiqueta acompañante. Además,
las combinaciones mencionadas anteriormente de la etiqueta de
afinidad y de la etiqueta acompañante pueden ser combinaciones
complementarias de la misma. Por ejemplo, la zona Fc de IgG como
etiqueta de afinidad se expresa como proteína de fusión con la
chaperonina, mientras que la proteína A o la proteína G como
etiqueta acompañante se expresa como proteína de fusión con la
proteína diana. El complejo de chaperonina-proteína
diana puede prepararse por medio de la afinidad específica entre la
etiqueta de afinidad y la etiqueta acompañante.
La presente invención hace uso no solamente de
la afinidad específica entre los péptidos mencionados
anteriormente, sino también de una afinidad específica entre el
péptido y un compuesto de bajo peso molecular. Se menciona como
ejemplo una afinidad entre la estreptavidina y la biotina. Más
específicamente, la longitud completa de la estreptavidina o de un
fragmento parcial que presenta una actividad de unión a la biotina
seleccionada como etiqueta de afinidad está unida a la subunidad de
chaperonina mediante un enlace peptídico, con el fin de producir
una proteína de fusión chaperonina-etiqueta de
afinidad, mientras que la biotina como etiqueta acompañante está
unida a la proteína diana. En la presente memoria, la biotina se
une fácilmente mediante la utilización de un kit en el mercado. De
esta manera, la proteína diana se adapta en el anillo de
chaperonina por medio de una afinidad específica entre la biotina y
la estreptavidina.
La etiqueta acompañante puede ser parte de la
proteína diana o una sustancia diferente de la proteína diana. El
ejemplo anterior incluye tal combinación que la etiqueta de
afinidad es la proteína A, la proteína diana es IgG y la etiqueta
acompañante es la zona Fc de IgG. Este último ejemplo incluye tal
combinación que la etiqueta de afinidad es la proteína S, la
etiqueta acompañante es el péptido S y la proteína diana está unida
al péptido S.
El complejo de
chaperonina-proteína diana que aporta la chaperonina
en la presente invención puede ser naturalmente una proteína de
fusión en la que la etiqueta de afinidad está fusionada a una
subunidad de chaperonina, pero también una proteína de fusión que
incluye un enlace de la subunidad de chaperonina (por ejemplo, el
enlace de la chaperonina) compuesto de 2 a 20 subunidades de
chaperonina unidas en serie una a otra, y en la que la etiqueta de
afinidad está fusionada mediante un enlace peptídico a por lo menos
una zona seleccionada de entre el grupo constituido por el terminal
N del enlace de la subunidad de chaperonina, el terminal C del
enlace de la subunidad de chaperonina y una zona de unión de las
subunidades de chaperonina. Según la estructura de la chaperonina
revelada por análisis cristalográfico de rayos X, la estructura es
muy flexible tanto con el terminal N como con el terminal C de la
chaperonina situados al lado de la cavidad. En particular, por lo
menos 20 aminoácidos del terminal C presentan una estructura muy
flexible (George, Cell 100, 561, 2000). Consecuentemente, el
enlace de la subunidad de chaperonina con el terminal C de una
subunidad de chaperonina y el terminal N de la otra subunidad de
chaperonina unida mediante un polipéptido que tiene una longitud
apropiada forma una estructura de anillo de chaperonina así como
subunidades monoméricas.
La relación del número de la chaperonina y el
número de la etiqueta de afinidad puede estar comprendida en el
intervalo entre 1:2 a 20:1, preferentemente entre 1:2 a 9:1. Si el
número es superior a este intervalo, la formación de la estructura
del anillo puede resultar difícil. En la presente invención, si la
capacidad de una chaperonina a autounirse en una estructura se
mantiene, no solamente una chaperonina natural sino también una
chaperonina con un mutante aminoácido puede utilizarse también.
El complejo de
chaperonina-proteína diana en la presente invención
no proporciona solamente un espacio separado del medio externo,
sino que funciona también en el plegamiento de la proteína,
permitiendo de este modo plegar la proteína normalmente y
simultáneamente cabe esperar que estabilice la estructura de la
proteína. La reacción de plegamiento de la proteína del complejo de
chaperonina con una proteína sustrato como único polipéptido se
produce habitualmente en la proporción de 1:1. En consecuencia, en
la presente invención, la proteína de fusión se diseña
preferentemente de modo que una molécula de la etiqueta de afinidad
esté adaptada en el anillo de chaperonina o en el complejo de
chaperonina, con el fin de expresar la función de plegamiento de la
chaperonina. Sin embargo, dependiendo del peso molecular de la
etiqueta, la etiqueta puede plegarse correctamente incluso si se
adaptan dos o más moléculas.
La chaperonina que aporta el complejo de
chaperonina-proteína diana en la presente invención
puede proceder de bacterias, arqueas y eucariotas. Sin embargo, la
formación de la estructura de la chaperonina varía dependiendo del
ser vivo del que procede la chaperonina. Por ejemplo, el número de
subunidades de chaperonina que constituye un anillo de chaperonina
es siete en el caso de la chaperonina procedente de bacterias,
mientras que el número de ésta es ocho a nueve en el caso de la
chaperonina procedente de arqueas, mientras que el número de ésta
es ocho en el caso de la chaperonina procedente de eucariotas. En
la presente invención, la proporción del número de subunidades de
chaperonina al número de etiquetas de afinidad en las proteínas de
fusión se selecciona preferentemente dependiendo del origen de la
chaperonina utilizada. Específicamente, cuando se utiliza una
chaperonina bacteriana una proteína de fusión en la que el número
de subunidades de chaperonina: número de etiquetas de afinidad es
7:1 es preferentemente para la formación fácil de una estructura
muy ordenada de la chaperonina, y cuando una chaperonina arqueal en
la que el número de subunidades que constituye el anillo de
chaperonina es ocho, se utiliza, una proteína de fusión en la que el
número de subunidades de chaperonina: número de etiquetas de
afinidad es 1:1, 2:1, 4:1 ó 8:1 resulta preferido para la fácil
formación de una estructura muy ordenada de la chaperonina. Por
ejemplo, cuando se expresa una etiqueta de afinidad en una proteína
de fusión que utiliza una chaperonina arqueal en la que las
subunidades han formado un enlace que tiene ocho subunidades unidas
en ésta, una molécula de un enlace de 8 veces la subunidad de
chaperonina forma una estructura de anillo y adapta la etiqueta de
afinidad en su cavidad. Un ejemplo tomado como chaperonina arqueal y
sus subunidades de chaperonina incluye una chaperonina procedente
de la cepa KS-1 de Thermococcus sp. (TCP) y
una subunidad \beta de chaperonina (TCP\beta) que es un tipo de
sus subunidades. En resumen, TCP es un complejo compuesto de ocho
TCP\beta. Un enlace de 8 veces la subunidad \beta de
chaperonina ((TCP\beta)_{8}) con ocho TCP\beta unidos
en serie forma un complejo que presenta una estructura de anillo
así como un TCP
natural.
natural.
Una proteína de fusión que incluye una subunidad
de chaperonina y una etiqueta de afinidad unida a la subunidad de
chaperonina se produce en un sistema de expresión
hospedador-vector convencional. Por ejemplo, con el
fin de preparar una proteína de fusión en la que el número de
subunidades de chaperonina: número de etiquetas de afinidad es 2:1,
un gen de fusión en el que el gen de la etiqueta de afinidad está
unido a dos genes de chaperonina se prepara, y a continuación se
transcribe y se traduce. Más específicamente, un gen que codifica
una subunidad de chaperonina está unido corriente abajo de un
activador, con lo cual un gen que codifica una chaperonina en el que
un marco del codón se diseña con el fin de que sea el mismo marco
de lectura abierto está dispuesto corriente abajo posterior de
éste. En este momento, cuando estos genes de chaperonina se
traducen en el mismo marco de lectura abierto, la secuencia de ADN
que se convierte en un enlazador polipeptídico apropiado
constituido por aproximadamente 10 a 30 aminoácidos está
preferentemente dispuesta entre estos genes. También, en una
corriente abajo adicional de éstos, se diseña un gen que codifica un
enlazador polipeptídico que un marco del codón con el fin de que
esté en el mismo marco de lectura abierto y un gen que codifica una
etiqueta de afinidad están dispuestos. En dicha disposición, se
prepara una proteína de fusión en la que el número de subunidades de
chaperonina: número de etiquetas de afinidad es 2:1. Las proteínas
de fusión con otras relaciones se preparan de la misma manera, y
como se describió anteriormente, la etiqueta de afinidad puede
estar dispuesta en cualquier zona selecciona de entre un grupo
constituido por el terminal N del enlace de la subunidad de
chaperonina, el terminal C del enlace de la subunidad de
chaperonina y la zona enlace entre las unidades de chaperonina, y
puede además estar dispuesta en dos o más zonas.
Una zona de digestión de una proteína específica
del sitio puede estar dispuesta en una zona enlazadora del péptido
entre las subunidades de chaperonina o en un sitio de enlace entre
la chaperonina y la etiqueta de afinidad. Los ejemplos de proteasas
incluyen las proteasas de restricción tal como una trombina, una
enterocinasa y un factor X de coagulación sanguínea activado.
La proteína de fusión expresada de la manera
mencionada anteriormente forma una estructura de anillo y además
forma una estructura de dos capas asociada por enlace no covalente
en cada uno de los demás planos del anillo, estando de este modo
estabilizada. En el caso de la expresión de fusión de la etiqueta de
afinidad y un enlace de cuatro veces la subunidad de chaperonina
arqueal, dos moléculas del enlace de 4 veces la subunidad de
chaperonina forman una estructura de anillo y adaptan la etiqueta de
afinidad en su cavidad. Su ilustración esquemática se presenta en
la figura 2. En la figura 2, un círculo blanco indica una subunidad
de chaperonina, un círculo negro indica una proteína diana, una
línea recta que conecta los círculos blanco o el círculo negro y el
círculo blanco indica el enlace peptídico que incluye un enlace por
el enlazador peptídico. "CPN" en la figura 2 indica la
subunidad de chaperonina. Se da también el caso en el que otras
proporciones son adecuadas dependiendo de una forma o de un peso
molecular de la proteína diana. Por ejemplo, aun si el número de
chaperoninas procedentes de E. coli: número de proteína
diana es 3:1, la proteína de fusión puede estar asociada para formar
una estructura en anillo constituida por dos o tres moléculas de la
proteína de fusión.
Cuando la chaperonina está presente a una
concentración elevada no inferior a 1 mg/ml en presencia de
Mg-ATP, los anillos de dos capas de chaperonina
pueden además estar unidos reversiblemente uno a otro en cada uno
de los demás planos del anillo para reunirse en una estructura
fibrosa (Trent, J. D., et al., 1997, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 94, 5383-5388: Furutani, M. et
al., 1998, J. Biol. Chem. 273,
28399-28407). Debido a que la proteína de fusión en
la presente invención se expresa a una concentración elevada en el
cuerpo vivo, la proteína puede montarse en una estructura fibrosa.
Todavía si la proteína de fusión se monta en una estructura fibrosa,
la estructura puede disociarse en cada estructura del anillo de dos
capas por dilución. Dicha proteína de fusión que se monta en la
estructura fibrosa es también un aspecto de la presente
invención.
La invención presenta una proteína diana
adaptada y mantenida en una estructura en anillo de chaperonina
mediante afinidad entre una etiqueta de afinidad y una etiqueta
acompañante. La proteína diana utilizada en la presente invención no
está particularmente limitada, y ejemplos de la misma incluyen
proteínas completas de inmunoglobulinas tales como IgG, IgM, IgA,
IgE e IgD o proteínas que incluyen fragmentos de las mismas. Cuando
la proteína diana es IgG, se utiliza la proteína A o la proteína G
como etiqueta de afinidad a la que se fusiona una chaperonina para
dar una proteína de fusión. La zona Fc de IgG tiene una afinidad
específica para la proteína A o similar, mediante la que la
proteína diana, IgG, se adapta en el anillo de chaperonina. Cuando
la proteína diana es Fab o scFv (por ejemplo Fv monocatenario)
ambos que son fragmentos parciales de IgG, la proteína L se utiliza
como etiqueta de afinidad, mediante la cual la proteína diana está
adaptada en el anillo de chaperonina sobre el mismo
principio.
principio.
Recientemente, una técnica de banco de fagos
para identificar un polipéptido específicamente unido a un antígeno
deseado y su gen desplazando una secuencia aleatoria en una
proteína estructural del fago ha atraído la atención (Kumagai et
al., PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, 1998, 43,
159-167). Existe dicha técnica similar como cribado
de Escherichia coli o un polipéptido unido a un antígeno
diana y presentando una secuencia aleatoria de aminoácidos en una
proteína flagelar en la Escherichia coli. El polipéptido
obtenido a partir de estos procedimientos promete una aplicación
industrial como mímico del anticuerpo. En la presente invención,
cualquier péptido con actividades fisiológicas tal como capacidad
de unión al antígeno es adaptable como proteína diana. La proteína
diana es preferentemente un polipéptido constituido de seis o más
restos de aminoácidos para mantener una actividad
diana.
diana.
Otras proteínas diana que deben adaptarse en el
anillo de chaperonina incluyen las proteínas codificadas en un
genoma de virus patógenos tales como el virus de la hepatitis B, el
virus de la hepatitis C, VIH o el virus de la gripe (proteína de
recubrimiento, proteína del núcleo, proteasa, transcriptasa
inversa, integrasa y similares), la proteína siete del receptor de
transmembrana (receptor acoplado a la proteína G), las proteínas que
pertenecen a factores de crecimiento tal como el factor de
crecimiento de plaquetas, el factor de crecimiento de células madre
hematopoyéticas, el factor de crecimiento de hepatocitos, el factor
de crecimiento transformante, el factor trófico de crecimiento de
nervios, el factor de crecimiento de fibroblastos y el factor de
crecimiento de tipo insulina, y proteínas tales como el factor de la
necrosis tumoral, interferón, interleucina, eritropoyetina, el
factor estimulante de colonias de granulocitos, el factor
estimulante de colonias de macrófagos, albúmina, la hormona de
crecimiento humana, proteína cinasa y fosfoproteína fosfatasa. La
proteína diana puede ser además cualquiera de los productos génicos
relacionados con la enfermedad, procedentes de animales superiores
tales como el ser humano y el ratón. Algunas enzimas y proteínas
útiles en los procedimientos químicos, tratamiento de alimentos y
otras industrias puede ser también la proteína diana que constituye
el complejo de chaperonina-proteína diana en la
invención.
Como para un procedimiento de producción del
complejo de chaperonina-proteína diana en la
presente invención, es sólo necesario mezclar in vitro la
proteína de fusión de chaperonina con la proteína diana incluyendo
la etiqueta acompañante en un tampón bioquímico apropiado. Este
forma el complejo de chaperonina-proteína diana
mediante la etiqueta de afinidad incluida en la proteína de fusión
de chaperonina y la etiqueta acompañante incluida en la proteína
diana. Especialmente, resulta preferido que un factor que relaciona
la estabilización de la chaperonina tal como el ión magnesio, el ión
potasio y el trifosfato de nucleótido incluyendo el ATP se añada en
una solución de reacción. Además, la subunidad individual de
chaperonina o el enlace de la subunidad de chaperonina que no se
fusiona a la etiqueta de afinidad puede añadirse para formar el
complejo de chaperonina-proteína diana.
También es posible preparar el complejo de
chaperonina-proteína diana in vivo mediante
un sistema de expresión hospedador-vector. Más
específicamente, la transcripción y traducción (por ejemplo,
coexpresión) tanto de un gen que codifica la proteína de fusión de
la chaperonina-etiqueta de afinidad como un gen que
contiene un gen que codifica la proteína diana y un gen que
codifica la etiqueta acompañante en el mismo hospedador une la
proteína diana a la etiqueta de afinidad mediante una afinidad
específica para la etiqueta acompañante, formando así el complejo de
chaperonina-proteína diana en el hospedador. En la
presente memoria, el gen que codifica la proteína de fusión
chaperonina-etiqueta de afinidad y el gen que
codifica la proteína diana puede estar dispuesto bajo el control
del mismo activador o puede estar expresado bajo el control de
diferentes activadores. Bajo el control de diferentes activadores,
ambas unidades de expresión pueden estar dispuestas en el mismo
plásmido o en diferentes plásmidos.
En la disposición en los diferentes plásmidos,
en el caso de utilizar Escherichia coli, por ejemplo, como
hospedador, es sólo necesario introducir una unidad en una corriente
abajo de un activador de expresión en un plásmido P15A tal como
pACYC184 y la otra unidad en un vector de expresión con una zona de
partida de replicación de ADN de colE1 tal como pET. Como los
plásmidos de los dos son capaces de coexistencia en el mismo
hospedador, ambos genes coexisten en el hospedador solamente
obteniendo cada plásmido que tiene un marcador de resistencia al
fármaco diferente. Ambos genes se expresan bajo el control de los
activadores respectivos. Un plásmido cuya zona de replicación
procede de R6K (Kolter, R., Plasmid 1, 157, 1978) puede ser
aplicable, ya que es capaz de coexistencia con el plásmido P15A
mencionado anteriormente o con el plásmido colE1 en el
hospedador.
Como para el otro procedimiento de preparación
del complejo de chaperonina-proteína diana in
vivo, la expresión simultánea de tres genes que incluyen un gen
que codifica solamente una subunidad de chaperonina individual o el
enlace de la subunidad de chaperonina así como tanto el gen que
codifica la proteína de fusión chaperonina-etiqueta
de afinidad como el gen que contiene el gen que codifica la proteína
diana y el gen que codifica la etiqueta acompañante descritos
anteriormente asocia tres de éstos constituidos por la proteína de
fusión chaperonina-etiqueta de afinidad, la
subunidad de chaperonina individual o el enlace de la subunidad de
chaperonina, y la proteína diana, formando de este modo el complejo
de chaperonina-proteína diana en el hospedador.
Este procedimiento disminuye el número de subunidades de chaperonina
en la proteína de fusión chaperonina-etiqueta de
afinidad, con la consecuencia de que el peso molecular de la
proteína de fusión chaperonina-etiqueta de afinidad
disminuye. De este modo, la proteína de fusión
chaperonina-etiqueta de afinidad se expresa más
fácilmente, de modo que el complejo de
chaperonina-proteína de afinidad se produce más
eficazmente.
Tres genes constituidos por el gen que codifica
la proteína de fusión chaperonina-etiqueta de
afinidad, el gen que codifica el enlace de chaperonina y el gen que
codifica la proteína diana pueden estar dispuestos bajo el control
del mismo activador o pueden expresarse bajo el control de
diferentes activadores. Además, como se describió anteriormente,
pueden estar dispuestos en dos o más plásmidos capaces de
coexistencia en el mismo hospedador. La preparación de estos
plásmidos se diseña fácilmente y se produce por medio de una
ingeniería genética normal.
Generalmente, cuando el tamaño de un plásmido de
expresión es de 10 kb o más, el número de copias puede disminuir en
E. coli y similares, dando como resultado una reducción en
la cantidad de la proteína de fusión de chaperonina expresada. Por
ejemplo, cuando se produce una proteína de fusión de chaperonina
que presenta un enlace de 8 veces la chaperonina, el tamaño de un
plásmido de expresión para ésta es de 15 kbp o más. Como
contramedida, el mismo gen que expresa la misma proteína de fusión
de chaperonina se introduce en dos vectores con diferentes zonas de
replicación y diferentes genes resistentes al fármaco y E.
coli o similar se transforma con los dos vectores en presencia
de los dos fármacos. Por lo tanto, la alta producción de una
proteína de fusión de chaperonina se consigue expresando estos
genes en el transformante.
Los hospedadores que producen la proteína de
fusión de chaperonina o la chaperonina-proteína
diana incluyen, pero no se limitan a, bacterias tales como E.
coli, otras células procarióticas, levaduras, células de
insectos, células de animales, células de plantas, animales,
vegetales e insectos. En particular, resultan preferidas las
bacterias o las levaduras debido al bajo costo de cultivo, al
número reducido de días de cultivo y a las fáciles operaciones de
cultivo. Además, la proteína de fusión de chaperonina puede también
expresarse como proteína soluble en un sistema de traducción sin
células utilizando dicho extracto de bacterias o eucariotas
(Spirin, A.S., 1991, Science 11, 2656-2664:
Falcone, D. et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11,
2656-2664).
El complejo de
chaperonina-proteína diana se purifica, por ejemplo,
según el procedimiento siguiente. Una vez que la proteína de fusión
de chaperonina y la proteína diana se expresan en el hospedador, se
recogen las células y se destruyen para recuperar el sobrenadante.
A continuación, la chaperonina-proteína diana se
precipita a aproximadamente 40% de saturación de sulfato de amonio.
Se recupera la fracción precipitada, se disuelve en un tampón
apropiado y se somete a filtración en gel, cromatografía hidrófoba,
cromatografía de intercambio iónico y similares para recuperar las
fracciones que contienen el complejo de
chaperonina-proteína diana, mediante el cual se
obtiene la chaperonina-proteína diana
purificada.
El complejo de
chaperonina-proteína diana obtenido mediante la
invención es aplicable a varias utilizaciones. Una de ellas es la
estabilización de las proteínas. Generalmente, una proteína resulta
afectada por el calor y similares, por lo que su estructura de
orden superior se destruye al tener un núcleo hidrófobo alojado en
la estructura de orden superior expuesta en la superficie de la
proteína. La proteína desnaturalizada a causa de la interacción por
el núcleo hidrófobo forma un agregado irreversible, inhibiendo de
esta forma la recuperación espontánea de una estructura natural.
Mediante la utilización de la chaperonina-proteína
diana en la invención, la proteína diana se aloja en el anillo de
chaperonina, de modo que una formación de agregado irreversible no
se produce aun si la estructura superior se rompe al tener el
núcleo hidrófobo expuesto en la superficie de la proteína. Una
chaperonina esencialmente tiene una función de asistir al
plegamiento de la proteína, con el fin de tener también un efecto
inhibidor en la propia desnaturalización de una proteína diana. Si
una proteína diana es una enzima que utiliza un compuesto de peso
molecular bajo como un sustrato, cuyo compuesto se adapta para
pasar entre una cavidad en una chaperonina y el exterior, se
asegura la estabilidad de una proteína diana que se adapta en la
chaperonina y ejerce completamente la característica innata de una
proteína tal como una reacción enzimática.
La chaperonina-proteína diana en
la invención es aplicable para inmovilizar la proteína diana en un
portador. Generalmente, una chaperonina reconoce una superficie
hidrófoba de una proteína desnaturalizada, de modo que una parte
superior de un anillo de chaperonina forma un grupo hidrófobo. Por
consiguiente, si y cuando la chaperonina es accionada con un
soporte de materiales hidrófobos tal como el poliestireno, la parte
superior del anillo de chaperonina está unida a la superficie del
soporte (figura 3A). Una chaperonina presenta dos anillos
dispuestos simétricamente en uno de los dos lados de un plano
ecuatorial, con lo que un plano del primer anillo está unido a un
soporte con la consecuencia de que una parte superior del segundo
anillo se enfrenta en una dirección vertical. Además, la
cristalización en dos dimensiones de la chaperonina en el soporte
dispone la chaperonina más exactamente en el soporte. De esta
manera, todas las chaperoninas que se ponen en contacto con el
soporte son controladas en una dirección uniforme, y a continuación
se inmovilizan. De la misma manera, incluso si una proteína de
fusión chaperonina-etiqueta de afinidad que presenta
una etiqueta de afinidad en un anillo está accionada con un
soporte, se inmoviliza uniformemente en una dirección vertical en
el soporte como el complejo de chaperonina-proteína
diana en la invención (figura 3B). La proteína diana incluye una
etiqueta acompañante que tiene una afinidad para una etiqueta de
afinidad, de modo que la proteína diana está inmovilizada en el
soporte mediante la proteína de fusión de chaperonina por medio de
la afinidad específica entre las dos etiquetas (figura 3C). Como se
acaba de describir, la proteína diana inmovilizada no se
desnaturaliza como resultado de un cambio en la estructura de orden
superior mediante interacción hidrófoba con un portador en
comparación con una proteína directamente inmovilizada para un
portador por medios convencionales. Mediante un procedimiento de
inmovilización en la presente invención, la etiqueta de afinidad
está orientada uniformemente por la chaperonina, de modo que la
proteína diana está inmovilizada en orden. De este modo, una zona
activa de la proteína diana se enfrenta a una interfase reactiva,
ejerciendo de este modo eficazmente una característica de la
proteína diana inmovilizada (figura 3-3). El
procedimiento de inmovilización en la presente invención presenta
una ventaja de la proteína diana que está protegida, siendo
resistente a la desnaturalización y asegurando elevada estabilidad
debido a una parte de la proteína inmovilizada o la totalidad de la
molécula está alojada en el anillo de
chaperonina.
chaperonina.
Un análisis cristalográfico por rayos X de una
proteína se realiza además utilizando el complejo de
chaperonina-proteína diana en la presente invención.
La invención está basada en un concepto de una chaperonina como
recipiente molecular para el análisis cristalográfico. Con el fin
de cristalizar una proteína, se supone originalmente examinar una
condición de cristalización debido a la naturaleza de la superficie
molecular es diferente dependiendo de cada proteína. Sin embargo,
mediante un procedimiento de análisis de una estructura en la
presente invención, el análisis comprende un complejo que aloja la
totalidad de una proteína diana en una molécula de chaperonina, y
mediante el cual una condición para analizar el complejo está
controlada por la naturaleza de la superficie molecular de la
chaperonina, no por la naturaleza de la proteína diana. Por
consiguiente, cualquier proteína, si únicamente está adaptada en la
molécula de chaperonina, puede cristalizarse bajo una condición
uniforme para cristalizar una chaperonina y someterse a un análisis
de rayos X. El cristal obtenido se analiza por medio de rayos X
característicos generados en la preparación de un choque electrónico
con una radiación de cobre o molibdeno o de un sincrotrón. Se
realiza una medición de la intensidad de la difracción por rayos X
mediante una película de rayos X o un detector bidimensional tal
como una placa de diagnóstico por imagen. Se rota un cristal con los
rayos X irradiados para generar un número de líneas de difracción.
En el caso de la película para diagnóstico por imagen, se escanea
un modelo de difracción registrado que debe digitalizarse. Según el
procedimiento de análisis de la estructura en la invención,
cualquier proteína se cristaliza en una condición uniforme, con el
fin de acelerar un análisis estructural.
Además, puede utilizarse el complejo de
chaperonina-proteína diana en la invención para
preparar una formulación de liberación lenta de un fármaco proteico.
Más específicamente, un complejo de
chaperonina-proteína diana en el que la proteína
diana es un interferón, un anticuerpo, un factor citotóxico o
similares se forma y se adapta en la molécula de chaperonina para
proporcionar la formulación. Muchos fármacos proteicos descritos
anteriormente tienen tiempos de residencia sumamente cortos in
vivo con la consecuencia de que pueden ser descompuestos por
proteasas en la sangre antes de la llegada a un área afectada.
Mientras tanto, estas proteínas actúan no solamente en el área
afectada sino también en tejidos corporales normales, dando como
resultado una incidencia mayor de efectos secundarios inesperados.
Como en la presente invención, una chaperonina recubre una proteína
fisiológicamente activa, protegiendo de este modo la proteína diana
de ser descompuesta por proteasas y también protegiendo los tejidos
celulares normales de ser accionados. Cuando la formulación de
liberación lenta en la invención que circula en la sangre se
aproxima a un área específica afectada, las proteasas producidas en
el área descomponen la chaperonina y liberan la proteína
fisiológicamente activa adaptada en ésta para ejercer la eficacia
del fármaco. En el caso que proporciona la presente invención a
animales hospedadores, es necesario utilizar una chaperonina
procedente de animales para prevenir la reacción inmunitaria.
Especialmente, con el fin de proporcionar la invención a seres
humanos, resulta preferido utilizar una chaperonina procedente de
seres humanos tal como CCT (chaperonina que contiene el polipéptido
1 del complejo t; Kubota, H., Eur. J. Biochem., 230, 3,
1995).
Todavía más, el complejo de
chaperonina-proteína diana en la invención se aplica
como inmunógeno para producir un anticuerpo contra la proteína
diana. Más específicamente, cuando se inocula la proteína a un
animal como inmunógeno con el fin de producir un anticuerpo contra
una proteína diana, la proteína diana puede descomponerse
rápidamente en la sangre del animal inoculado antes que se provoque
una respuesta inmunitaria. Sin embargo, utilizando la
chaperonina-proteína diana en la invención, la
proteína diana se aloja en la chaperonina para mantener un tiempo de
residencia in vivo como antígeno. Por consiguiente, se
realiza una respuesta inmunitaria contra la proteína diana de
manera más eficaz. La utilización de una chaperonina procedente de
un ser vivo distinto del animal inoculado promete también un efecto
adyuvante. En la presente memoria, con el fin de controlar la
velocidad para descomponer el complejo de
chaperonina-proteína diana mediante proteasas, una
zona de reconocimiento de la proteasa puede disponerse en un punto
de unión entre las subunidades de chaperonina o en un punto de
unión entre el antígeno diana y la subunidad de chaperonina. Los
animales inmunizados con el complejo de
chaperonina-proteína diana incluyen ratón, rata,
hámster, marmota, conejo, perro, oveja, cabra, caballo, cerdo,
pollo y mono.
Tras la inmunización de un animal con el
complejo de chaperonina-proteína diana en la
invención como inmunógeno, se obtiene un anticuerpo de la manera
conocida. Por ejemplo, se obtiene un anticuerpo policlonal a partir
de un antisuero de un animal inmunizado. Se obtiene un anticuerpo
monoclonal a partir del cultivo de hibridoma en el que el hibridoma
que produce un anticuerpo que reconoce una proteína diana se
selecciona de las células preparadas por fusión celular de una
célula que produce anticuerpos y un mieloma.
Estos procedimientos se llevan a cabo según los
procedimientos generalmente conocidos tales como el procedimiento
desarrollado de Kohler y Milstein (Kohler, G. y Milstein, C.,
Nature 256, 459, 1975).
\vskip1.000000\baselineskip
En adelante, la presente invención se describe
con mayor detalle haciendo referencia a los Ejemplos, pero esta
invención no se limita a los Ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Con el fin de preparar un ADN bicatenario, se
hibridaron un enlazador F1 mostrado en la SEC. ID. n°: 9 y un
enlazador R1 mostrado en la SEC. ID. n°: 10 que son secuencias
nucleotídicas complementarias. El ADN bicatenario incluye un sitio
NcoI, un sitio XhoI, una secuencia nucleotídica que se traduce para
convertirse en un sitio de proteasa PreScission, un sitio SpeI, un
sitio HpaI, una secuencia nucleotidica que se traduce para
convertirse en una etiqueta de histidina y un codón de terminación.
El ADN bicatenario se trató con NcoI/XhoI y se ligó a pET21d
(Novagen) tratado con antelación con enzimas de restricción. Un
plásmido obtenido de este modo se denominó pETD_{2}.
Mientras tanto, un gen de la subunidad \beta
de chaperonina (TCP\beta) mostrado en la SEC. ID. n°: 1 se clonó
por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) utilizando ADN
genómico de la cepa KS-1 de Thermococcus como
plantilla. El ADN genómico de la cepa KS-1 de
Thermococcus se preparó mediante un tratamiento con
fenol/cloroformo y un procedimiento de precipitación en etanol
utilizando granulados recubiertos procedentes de la suspensión de
las cepas (JCM n° 1 11816) adquiridos en RIKEN. Se llevó a cabo la
PCR utilizando el ADN genómico como plantilla y el cebador F1 de
TCP\beta como se muestra en la SEC. ID. n°: 11 y el cebador R1 de
TCP\beta como se muestra en la SEC. ID. n°: 12 como conjunto de
cebador, por lo que se amplió un fragmento de ADN que contiene un
gen de TCP\beta como se muestra en la SEC. ID. n°: 1. En la
presente memoria, una secuencia Bg1II y un sitio BamHI procedente
de los cebadores se introdujeron en cada extremo del fragmento de
ADN ampliado. Se preparó el pT7(TCP\beta) mediante la
introducción del fragmento de ADN ampliado en el vector pT7BlueT por
clonación de TA. Como resultado de la determinación de una
secuencia nucleotídica del fragmento de ADN introducido en el
pT7(TCP\beta), fue la misma que la secuencia nucleotídica
mostrada en la SEC. ID. n°: 1. A continuación se trató el
pT7(TCP\beta) con las enzimas de restricción Bg1II y BamHI
para recuperar un fragmento de ADN que contiene un gen de
TCP\beta. Se introdujo el fragmento de ADN en un plásmido
pETD_{2} escindido con antelación por BamHI para dar
pETD_{2}(TCP\beta)_{1}. En la presente memoria,
el fragmento de ADN se unió en una dirección tal que el gen
TCP\beta en el fragmento de ADN estaba traducido propiamente como
TCP\beta por el activador. Además, el fragmento de ADN que
contiene el gen TCP\beta en el que el fragmento fue recuperado
por tratamiento con Bg1II/BamHI se introdujo en el
pETD_{2}(TCP\beta)_{1} tratado con antelación
con BamHI para dar pETD_{2}(TCP\beta)_{2}. En la
presente memoria, el TCP\beta está unido en la misma dirección
que se acaba de describir anteriormente. De la misma manera, se
trató el pETD_{2}(TCP\beta)_{2} con las enzimas
de restricción Bg1II y BamHI, de modo que se recuperaron los
fragmentos de ADN que contienen cada uno un gen
(TCP\beta)_{2}. Se introdujeron los fragmentos de ADN en
el pETD_{2}(TCP\beta)_{2} tratado con
antelación con BamHI para dar _{2}(TCP\beta)_{4}
en el que se unieron cuatro genes de TCP\beta uno a otro en la
misma dirección.
También, con el fin de recuperar los fragmentos
de ADN que contiene cada uno un gen (TCP\beta)_{4}, se
trató el pETD_{2}(TCP\beta)_{4} con las enzimas
de restricción Bg1II y BamHI. Se introdujeron los fragmentos de ADN
en pETD_{2}(TCP\beta)_{4} tratado con antelación
con BamHI para dar el pETD_{2}(TCP\beta)_{8} en
el que ocho genes de TCP\beta se unieron uno a otro en la misma
dirección. La figura 4 ilustra una estructura del
pETD_{2}(TCP\beta)_{8}. Es decir, el
pETD_{2}(TCP\beta)_{8} incluye el activador T7,
y corriente debajo de éste, una secuencia de unión del ribosoma
(RBS), los genes de (TCP\beta)_{8}
en los que ocho genes que codifican a TCP\beta están dispuestos en tándem (representados como (CPN)_{8} en la figura 4), una secuencia de reconocimiento de la proteasa PreScission, un gen 6His que codifica seis restos de histidina, y un codón de terminación. Además, es posible introducir un gen que codifica cualquier etiqueta de afinidad entre el sitio SpeI y el sitio HpaI con el fin de expresar una proteína de fusión compuesta de (TCP\beta)_{8} y la etiqueta de
afinidad.
en los que ocho genes que codifican a TCP\beta están dispuestos en tándem (representados como (CPN)_{8} en la figura 4), una secuencia de reconocimiento de la proteasa PreScission, un gen 6His que codifica seis restos de histidina, y un codón de terminación. Además, es posible introducir un gen que codifica cualquier etiqueta de afinidad entre el sitio SpeI y el sitio HpaI con el fin de expresar una proteína de fusión compuesta de (TCP\beta)_{8} y la etiqueta de
afinidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Por otra parte, con el fin de clonar un gen de
la proteína A como etiqueta de afinidad, el gen de la proteína A
representado en la SEC. ID. n°: 2 se clonó por PCR utilizando ADN
genómico de Staphylococcus aureus como plantilla. El ADN
genómico de Staphylococcus aureus se preparó de manera
similar a la del Ejemplo 1 utilizando granulados recubiertos
procedentes de la suspensión de las cepas (DSM 20231) adquiridas en
DSM en Alemania. El cebador pro-F1 representado en
la SEC. ID. n°: 13 y el cebador pro-R1 como se
representa en la SEC. ID. n°: 14 se utilizaron como un conjunto
cebador para la PCR. En la presente memoria, un sitio SpeI y un
sitio HpaI se proporcionaron respectivamente en el cebador
pro-F1 y en el cebador pro-R1.
Además en el Ejemplo 1, un ADN ampliado se introdujo en el vector
pT7BlueT mediante clonación por TA, con el resultado de la
confirmación de su secuencia nucleotídica que es la misma que la
secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. n°: 2. A
continuación, un fragmento de ADN que contiene un gen de la
proteína A se escindió y se recuperó mediante el tratamiento con
SpeI/HpaI. El fragmento de ADN se introdujo en el
pETD_{2}(TCP\beta)_{8} tratado con antelación
con Spe/HpaI, de modo que un vector de expresión para una proteína
de fusión compuesto por un enlace de 8 veces TCP\beta y un protón
A, se construyó el
pETD_{2}(TCP\beta)_{8}-ptnA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se introdujo el
pETD_{2}(TCP\beta)_{8}-ptnA en
la cepa BL21 (DE3) de Escherichia coli para dar un
transformante. Con el fin de expresar un enlace
(TCP\beta)_{8} de 8 veces la subunidad de chaperonina,
se cultivó el transformante a 35°C en medio 2xYT (16 g de
Bacto-triptona, 10 g de extracto de levadura y 5
g/l de NaCl) que contiene carbenicilina (100 \mug/ml), en donde
IPTG se añadió con el fin de obtener una concentración final de 1 mM
en el momento cuando se alcance una D.O.600 de 0,7. Una vez
cultivado el transformante durante aproximadamente 16 horas más, se
recogieron las células y se destruyeron mediante tratamiento con
ultrasonidos para recuperar el sobrenadante con centrifu-
gación.
gación.
Se sometió el sobrenadante a una columna de
quelación de níquel equilibrada con antelación con una solución A
(Tris-HCl 25 mM/NaCl 0,5 M/imidazol 1 mM (pH 7,0)),
en la que una proteína de fusión enlace de 8 veces una subunidad
\beta de chaperonina-proteína A se eluyó mediante
un gradiente lineal utilizando la solución B
(Tris-HCl 25 mM/NaCl 0,5 M/imidazol 100 mM (pH
7,0)). Se sometió la fracción eluida a una columna Toyopearl con
DEAE (16 mm \times 60 cm) equilibrada con antelación con un tampón
HEPES-KOH 25 mM (pH 6,8), en el que se eluyó una
proteína de fusión mediante un gradiente lineal utilizando solución
B (HEPES-KOH 25 mM/tampón de NaCl 0,5 M (pH 6,8)).
En último lugar, la fracción que contiene la proteína de fusión de
chaperonina se concentró para someterse a una columna HiLoad 26/60
Superdex 200 pg (26 mm \times 60 cm) equilibrada con antelación
con un tampón de fosfato 100 mM (pH 7,0) que contenía NaCl 0,15 M en
la que una proteína de fusión enlace de 8 veces la subunidad \beta
de chaperonina-proteína A se eluyó mediante el
tampón. Como resultado de la observación de la muestra purificada
por un procedimiento de filtrado negativo con acetato de uranilo al
0,2% bajo un microscopio electrónico de transmisión, se había
formado una estructura de anillo única para una chaperonina (figura
5).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se mezclaron 0,6 mg de la proteína de fusión
chaperonina-proteína A purificada en el Ejemplo 3 y
0,2 mg de IgG procedente de ratones en 0,5 ml de solución y se
incubaron a 30°C durante 2 horas. Una vez acabada la reacción, como
resultado de la observación por un método de filtrado negativo con
acetato de uranilo al 0,2% bajo un microscopio electrónico de
transmisión, se había formado una estructura de anillo única para
una chaperonina y los anticuerpos se habían adaptado en el anillo
(figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Una zona de la proteína A unida a la zona Fc de
IgG se denomina etiqueta ZZ. Se trató de fusionar la etiqueta ZZ
como etiqueta de afinidad con el enlace de 8 veces la subunidad
\beta de chaperonina. Más específicamente, la PCR que utiliza el
vector de fusión A de la proteína 18 pEZZ (Amersham Bioscience)
como plantilla y el cebador ZZ-F se presenta en la
SEC. ID. n°: 15 y el cebador ZZ-R como se muestra en
la SEC. ID. n°: 16 como conjunto de cebador se llevó a cabo, por lo
que se amplió un fragmento de ADN que contiene un gen con etiqueta
ZZ como se presenta en la SEC. ID. n°: 17. En la presente memoria,
el cebador ZZ-F tiene un sitio BamHI y el cebador
ZZ-R tiene una secuencia Bg1II. Se recuperó el
producto de la PCR mediante la utilización de electroforesis en
agarosa y a continuación se digirió con BamHI/Bg1II. Mientras tanto,
se introdujo el producto de la digestión en
pETD_{2}(TCP\beta)_{8}
tratado con antelación con BamHI, de modo que un vector de expresión para una proteína de fusión compuesto por (TCP\beta)_{8} y la etiqueta ZZ, pETD_{2}(TCP\beta)_{8}-ZZ se construyó.
tratado con antelación con BamHI, de modo que un vector de expresión para una proteína de fusión compuesto por (TCP\beta)_{8} y la etiqueta ZZ, pETD_{2}(TCP\beta)_{8}-ZZ se construyó.
\newpage
Ejemplo
6
Con el fin de expresar una proteína de fusión
compuesta de (TCP\beta)_{8} y proteína S, un gen con
proteína S procedente de bovino como se muestra en la SEC. ID. n°: 3
se clonó por PCR utilizando un banco de ADNc bovino
(DupLEX-AcDNALibrary, Origene) como plantilla. El
cebador Spro-F1 tal como se presenta en la SEC. ID.
n°: 18 y el cebador Spro-R1 como se presenta en la
SEC. ID. n°: 19 se utilizaron como conjunto cebador para PCR. En la
presente memoria, un sitio SpeI y una secuencia SmaI se
proporcionaron respectivamente en el cebador
Spro-F1 y en el cebador Spro-R1. Así
como en el Ejemplo 1, a continuación el ADN ampliado se introdujo
en el vector pT7BlueT por clonación de TA, con la consecuencia de
la confirmación de su secuencia nucleotídica que es la misma que
una secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. n°: 3. A
continuación, se digirió el plásmido con SpeI/SmaI, por lo que un
fragmento de ADN que contiene un gen con proteína S se recuperó. El
fragmento de ADN se introdujo en
pETD_{2}(TCP\beta)_{8} tratado con antelación
con SpeI/HpaI, de modo que un vector de expresión para una proteína
de fusión compuesta de (TCP\beta)_{8} y proteína S, se
construyó el
pETD_{2}(TCP\beta)_{8}-Sptn.
Mientras tanto, además de lo expuesto
anteriormente, en cuanto a la proteína verde fluorescente (GFP) que
codifica el ADN, la unidad de expresión GFP que contiene un gen con
GFP y un activador T7 corriente arriba del mismo se clonó por PCR
utilizando el vector pQBI T7 sgGFp (Funakoshi) como plantilla. El
cebador GFP-stagF1 mostrado en la SEC. ID. n°: 20 y
el cebador GFP-stagR1 mostrado en la SEC. ID. n°: 21
se utilizaron como conjunto cebador para PCR. En la presente
memoria se proporcionaron la secuencia SphI y un sitio XhoI
respectivamente corriente arriba del activador T7 del producto de
ampliación y corriente abajo del gen GFP. Se purificó un fragmento
ampliado de ADN por digestión con SphI/XhoI. A continuación se
sintetizaron un oligonucleótido que se convierte en etiqueta S por
traducción como se muestra en la SEC. ID. n°: 22 y un
oligonucleótido que es su cadena complementaria como se muestra en
la SEC. ID. n°: 23. Estos oligonucleótidos se hibridaron para
proporcionar un ADN bicatenario. En la presente memoria, el ADN
bicatenario presenta un sitio XhoI y una secuencia BamHi en cada
extremo. El ADN bicatenario y el producto de digestión con las
enzimas de restricción se mezclaron y ligaron de tal manera que se
dispusieron en orden del gel GFP-Stag en el ADN
plásmido pACYC184 (Wako Pure Chemical Industries) digerido con
antelación con SphI/BamHI. Un plásmido de expresión de GFP obtenido
de esta manera se denominó pACGFPstag.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Tanto los plásmidos
pETD_{2}(TCP\beta)_{8}-Sptn como
pACGFPstag obtenidos en el Ejemplo 6 se añadieron a una célula
competitiva de la cepa BL21 (DE3) de Escherichia coli para
dar un transformante, que se cultivó en un medio de
agar-agar que contenía 100 \mug/ml de ampicilina
y 100 \mug/ml de cloranfenicol. Una colonia obtenida de este modo
se inoculó a 700 ml de medio 2\timesYT que contenía 100 \mug/ml
de ampicilina y 100 \mug/ml de cloranfenicol. Después del cultivo
rotativo (100 rpm) a 35°C, se añadió IPTG con el fin de obtener una
concentración final de 1 mM en el momento en que se alcanzó una D.O.
600 de 0,7, induciendo de este modo una expresión de una proteína
de fusión chaperonina-proteína S y una etiqueta
GFP-s. Se recogieron las células por centrifugación
(10.000 rpm \times 10 minutos), se pusieron en suspensión en 20
ml de tampón HEPES 25 mM (pH 6,8) que contenía EDTA 1 mM y se
conservó en frío a -20°C. Una vez mezclada la suspensión celular,
se obtuvo la fracción sobrenadante por medio de descomposición por
tratamiento con ultrasonidos.
El sobrenadante obtenido se añadió a una butil
Toyopearl (Tosoh) equilibrado con antelación con tampón fosfato 50
mM (pH 7,0) que contenía sulfato amónico 1 M, con lo cual una
fracción que contenía la proteína de fusión
chaperonina-proteína S se recuperó utilizando
solución B (tampón fosfato 50 mM (pH 7,0)). A continuación, se
sometió la fracción a cromatografía de intercambio aniónico y
filtración en gel de la misma manera que en el Ejemplo 3, en donde
una fracción en la que la proteína de fusión de chaperonina se
eluyó y se recuperó. Se irradió con ultravioleta, la fracción
obtenida emitía fluoresceína de GFP. Como resultado de la
observación de la fracción obtenida por un procedimiento de
filtrado negativo con acetato de uranilo 0,2% bajo un microscopio
electrónico de transmisión, se había formado una estructura de
anillo única para una chaperonina y se adaptaron los GFP en el
anillo (figura 7).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se añadieron 50 \mul de la proteína de fusión
chaperonina-proteína A (1 mg/ml) obtenida en el
Ejemplo 3 a una placa de microvaloración de 96 pocillos, seguido de
incubación a 30°C durante 3 horas, con lo que la proteína de fusión
se inmovilizó en la placa. Después de lavarse con PBS, se bloqueó
la placa con Block Ace (Dainippon Pharmaceutical) al 50% y se lavó
otra vez con PBS. Después, se añadieron 50 \mul de anticuerpo
anti-HBs monoclonal de ratón de 0,1 mg/ml a la
placa, seguido de incubación a 30°C durante 2 horas, con lo que el
anticuerpo monoclonal de ratón se inmovilizó mediante la proteína
de fusión chaperonina-proteína A. Una vez eliminado
el anticuerpo monoclonal de ratón lavando con PBS, se añadieron 100
\mul de PBS, seguido de incubación a 50°C.
Se evaluó la actividad restante del anticuerpo
mediante la utilización de ELISA en sándwich. Más específicamente,
se añadieron 50 \mul de 100 \mug/ml de HB a la placa en la que
se inmovilizó el anticuerpo monoclonal de ratón, y a continuación se
hizo un sándwich entre el anticuerpo monoclonal de ratón y el
anticuerpo anti-HBs de conejo una vez lavada la
placa con PBS. El anticuerpo anti-HBs de conejo
unido a éste se detectó mediante la utilización de un anticuerpo
IgG anticonejo conjugado con peroxidasa con
2,2'-azido-di
(3-etil-benztiazolina-6-sulfonato)
como sustrato. Aparte de esto, se evaluó también un experimento
para comparar la inmovilización del anticuerpo monoclonal de ratón
directamente en una placa sin la proteína de fusión
chaperonina-proteína A.
La figura 8A presenta un gráfico para comparar
una actividad de anticuerpo inmediatamente después por
inmovilización del anticuerpo monoclonal de ratón. La figura 8B
presenta un gráfico para comparar la estabilidad térmica del
anticuerpo monoclonal de ratón inmovilizado. Como consecuencia de
las comparaciones, la IgG inmovilizada mediante la proteína de
fusión chaperonina-proteína A tenía una capacidad
mayor de unión al anticuerpo que la IgG directamente inmovilizada
en el momento inmediatamente después de la inmovilización. Además,
la IgG inmovilizada mediante la proteína de fusión
chaperonina-proteína A tuvo mayor estabilidad
térmica que la IgG inmovilizada directamente.
<110> Sekisui Chemical Co., Ltd.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPLEJO DE
CHAPERONINA-PROTEÍNA DIANA, PROCEDIMIENTO DE
PRODUCCIÓN DEL MISMO, PROCEDIMIENTO DE ESTABILIZACIÓN DE LA PROTEÍNA
DIANA, PROCEDIMIENTO DE INMOVILIZACIÓN DE LA PROTEÍNA DIANA,
PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA DE LA PROTEÍNA DIANA,
PREPARACIÓN DE LIBERACIÓN PROLONGADA Y PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN
DE UN ANTICUERPO CONTRA LA PROTEÍNA DIANA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 471-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 04 730 054.6
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2004-04-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/JP2004/006189
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-04-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2003-124352
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-04-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1641
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermococcus sp.
KS-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,4cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1685
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN que codifica la
proteína-S
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,2cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> ADN que codifica la etiqueta S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagaaaccg ctgctgctaa attcgaacgc cagcacatgg acagc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ligador de oligonucleótido
diseñado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,6cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ligador de oligonucleótido
diseñado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido diseñado
para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacagatctat ggcccagct
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido diseñado
para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggatccgt cgagatcg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido diseñado
para PCR
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<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacactagtat ggcccagctt g
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido diseñado
para PCR
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<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggttaactc agtcgagatc gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>15
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido diseñado
para PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskipagcggatccg acaacaaatt caacaaagaa c
\hfill31
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<210> 16
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador de oligonucleótido diseñado
para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagatctcta ttatactttc ggcgcctgag c
\hfill31
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<210> 17
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<211> 348
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<212> ADN
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido diseñado
para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacactagtat gtcatcttcg aat
\hfill23
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<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido diseñado
para PCR
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<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcccgggaa gtgaaccg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido diseñado
para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgcatgcta atacgactca c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido diseñado
para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacctcgaggt tgtacagttc at
\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
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<211> 51
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN que codifica la etiqueta S
(sentido)
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<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgagaaaga aaccgctgct gctaaattcg aacgccagca catggacagc g
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
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<211> 51
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<212> ADN
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> ADN que codifica la etiqueta S
(antisentido)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccgctgt ccatgtgctg gcgttcgaat ttagcagcag cggtttcttt c
\hfill51
Claims (25)
1. Complejo de
chaperonina-proteína diana, que comprende:
una proteína de fusión que comprende una
subunidad de chaperonina y una etiqueta de afinidad unida a la
subunidad de chaperonina mediante un enlace peptídico; y
una proteína diana para la que la etiqueta de
afinidad presenta una afinidad específica, en el que la proteína
diana está unida a la etiqueta de afinidad mediante la afinidad
específica, formando así una estructura de anillo de chaperonina
constituida por una pluralidad de subunidades de chaperonina y en
el que la proteína diana está alojada en la estructura de anillo de
chaperonina de la proteína de fusión.
2. Complejo de
chaperonina-proteína diana según la reivindicación
1, en el que la proteína de fusión comprende una subunidad de
chaperonina, y en el que la etiqueta de afinidad está enlazada
mediante el enlace peptídico del terminal N y/o del terminal C de la
subunidad de chaperonina.
3. Complejo de
chaperonina-proteína diana según la reivindicación
1, en el que la proteína de fusión comprende un enlace de la
subunidad de chaperonina compuesto de 2 a 20 subunidades de
chaperonina enlazadas en serie entre sí y en el que la etiqueta de
afinidad está enlazada a por lo menos un sitio seleccionado de entre
un grupo constituido por el terminal N del enlace de la subunidad
de chaperonina, el terminal C del enlace de la subunidad de
chaperonina y un sitio de enlace de las subunidades de
chaperonina.
4. Complejo de
chaperonina-proteína diana según la reivindicación
1, 2 ó 3, en el que la relación del número de unidades de
chaperonina al número de la etiqueta de afinidad está comprendido
en el intervalo de 1:2 a 9:1.
5. Complejo de
chaperonina-proteína diana según la reivindicación 3
ó 4, que está provisto de una secuencia que debe ser escindida por
una proteína específica del sitio entre las subunidades del enlace
de la subunidad de chaperonina.
6. Complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 5, que presenta dos anillos de chaperonina
asociados de manera no covalente en el plano del anillo entre sí
con el fin de formar una estructura de anillo de chaperonina de dos
capas.
7. Complejo de
chaperonina-proteína diana según la reivindicación
6, que presenta dos anillos de chaperonina asociados de manera no
covalente en el plano del anillo entre sí o en el lado entre sí
para formar una estructura de anillo fibrosa de chaperonina.
8. Complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el ser vivo del que procede la
chaperonina es uno seleccionado de entre un grupo constituido por
bacterias, arqueas y eucariotas.
9. Complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la etiqueta de afinidad es una
seleccionada de entre un grupo constituido por un anticuerpo,
estreptavidina, proteína A, proteína G, proteína L, péptido S,
proteína S y un fragmento parcial de los mismos.
10. Complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la proteína diana es un
polipéptido que incluye un fragmento de seis o más restos de
aminoácidos, e incluye una etiqueta acompañante que presenta una
afinidad específica para la etiqueta de afinidad.
11. Complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que la proteína diana es una
seleccionada de entre un grupo constituido por una cadena pesada de
un anticuerpo y una cadena ligera de un anticuerpo y un polipéptido
que incluye un fragmento de 6 o más de sus restos de aminoácido, e
incluye una etiqueta acompañante que presenta afinidad específica
para la etiqueta de afinidad.
12. Complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que la proteína diana incluye una
seleccionada de entre un grupo constituido por un antígeno vírico,
un receptor siete transmembranario, una citocina, una proteína
cinasa, una fosfoproteína fosfatasa, y un fragmento parcial de los
mismos.
13. Procedimiento de producción del complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 12, comprendiendo el procedimiento las etapas
que consisten en:
mezclar la proteína de fusión compuesta de la
subunidad de chaperonina y la etiqueta de afinidad con la proteína
diana que incluye la etiqueta acompañante que presenta una afinidad
para la etiqueta de afinidad; y
unir la proteína de fusión a la proteína diana
mediante una afinidad específica entre la etiqueta de afinidad y la
etiqueta acompañante.
14. Procedimiento de producción del complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que la etiqueta acompañante que
presenta una afinidad específica para la etiqueta de afinidad es un
polipéptido, y comprendiendo el procedimiento una etapa de
transcripción y traducción en el mismo hospedador tanto de un gen
que contiene un gen que codifica la subunidad de chaperonina como un
gen que codifica la etiqueta de afinidad y un gen que contiene un
gen que codifica la proteína diana y un gen que codifica la
etiqueta acompañante, uniendo así la proteína diana a la proteína
de fusión de la chaperonina.
15. Procedimiento de producción del complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que la etiqueta acompañante que
presenta una afinidad específica para la etiqueta de afinidad es un
polipéptido, y comprendiendo el procedimiento una etapa de
transcripción y traducción en los mismos tres genes del hospedador
constituidos por un gen que contiene un gen que codifica la
subunidad de chaperonina y un gen que codifica la etiqueta de
afinidad, un gen que contiene un gen que codifica la proteína diana
y un gen que codifica la etiqueta acompañante, y un gen que
codifica la subunidad de chaperonina o su enlace, uniendo así la
proteína diana, la proteína de fusión de la chaperonina y la
subunidad de chaperonina o su enlace.
16. Procedimiento según la reivindicación 14 ó
15, en el que el complejo proteico se produce en un hospedador
seleccionado de entre un grupo constituido por bacterias,
levaduras, células animales, células de plantas, células de
insectos, animales, plantas, e insectos.
17. Procedimiento según la reivindicación 14 ó
15, en el que el complejo proteico se produce en un sistema de
traducción exento de células.
18. Procedimiento de estabilización de la
proteína diana, comprendiendo el procedimiento una etapa de unión
de la proteína diana mediante la etiqueta de afinidad a la proteína
de fusión incluida en el complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 9 para que la proteína diana sea alojada en la
estructura de anillo de chaperonina.
19. Procedimiento de inmovilización de la
proteína diana, comprendiendo el procedimiento las etapas que
consisten en:
inmovilizar en un portador para la
inmovilización de la proteína de fusión incluida en el complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 9, y
unir la proteína diana mediante la etiqueta de
afinidad a la proteína de fusión para que la proteína diana sea
alojada en el anillo de chaperonina.
20. Procedimiento de análisis de la estructura
de la proteína diana, comprendiendo el procedimiento las etapas que
consisten en:
cristalizar un complejo proteico obtenido
alojando la proteína diana unida mediante la etiqueta de afinidad a
la proteína de fusión incluida en el complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 9, y
obtener información sobre la estructura
tridimensional de la proteína diana de una imagen por difracción de
rayos X obtenida irradiando un cristal obtenido por
cristalización.
21. Formulación de liberación lenta para una
proteína fisiológicamente activa o un fármaco de bajo peso
molecular, en la que la proteína fisiológicamente activa o el
fármaco de bajo peso molecular están alojados en la proteína de
fusión incluida en el complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 9 mediante la etiqueta acompañante para la
etiqueta de afinidad.
22. Formulación de liberación lenta según la
reivindicación 21, en la que la chaperonina procede de un
humano.
23. Procedimiento de producción de un anticuerpo
contra una proteína de antígeno diana, comprendiendo el
procedimiento las etapas que consisten en:
unir la proteína del antígeno diana a la
proteína de fusión incluida en el complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 9, e inmunizar un animal con éste como
inmunógeno.
24. Complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 12, para su utilización como inmunógeno
destinado a producir un anticuerpo contra la proteína diana.
25. Utilización de un complejo de
chaperonina-proteína diana según una de las
reivindicaciones 1 a 12, para inmunizar un animal.
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