ES2730377T3 - Uso de la ruta reductora de la glicina para generar microorganismos formatótrofos y autótrofos - Google Patents

Uso de la ruta reductora de la glicina para generar microorganismos formatótrofos y autótrofos Download PDF

Info

Publication number
ES2730377T3
ES2730377T3 ES13759023T ES13759023T ES2730377T3 ES 2730377 T3 ES2730377 T3 ES 2730377T3 ES 13759023 T ES13759023 T ES 13759023T ES 13759023 T ES13759023 T ES 13759023T ES 2730377 T3 ES2730377 T3 ES 2730377T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
format
microorganism
glycine
route
enzymes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13759023T
Other languages
English (en)
Inventor
Arren Bar-Even
Ron Milo
Elad Noor
Oren Yishai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yeda Research and Development Co Ltd
Original Assignee
Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yeda Research and Development Co Ltd filed Critical Yeda Research and Development Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2730377T3 publication Critical patent/ES2730377T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01002—Formate dehydrogenase (1.2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
    • C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
    • C12Y105/01005—Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (NADP+) (1.5.1.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
    • C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
    • C12Y105/01015—Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (NAD+) (1.5.1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04009—Methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase (3.5.4.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/04—Other carbon-nitrogen ligases (6.3.4)
    • C12Y603/04003—Formate--tetrahydrofolate ligase (6.3.4.3)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Electromagnetism (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Una bacteria de Escherichia aislada que está genéticamente modificada para expresar formato deshidrogenasa dependiente de NAD que es capaz de oxidar el formato a dióxido de carbono; y formato-tetrahidrofolato ligasa.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de la ruta reductora de la glicina para generar microorganismos formatótrofos y autótrofos
Campo y antecedentes de la invención
La presente invención en general se refiere al uso de la ruta reductora de la glicina para la generación de microorganismos formatótrofos y autótrofos.
El concepto de biorefinerías ha llegado a ser una idea muy extendida en la última década. Depende de la premisa de que los organismos vivos se pueden y se deberían usar para suministrar la demanda creciente por la humanidad de compuestos químicos especializados, incluyendo combustibles, disolventes, plásticos, compuestos farmacéuticos, etc. Hoy en día, la mayoría de estos compuestos químicos están derivados, directa o indirectamente, de carburos fósiles. Sin embargo, con el agotamiento inminente de estos carburos fósiles y el incremento del CO2 atmosférico ha llegado a ser esencial encontrar fuentes alternativas para estos importantes materiales.
Las materias primas sugeridas para la mayoría de las biorefinerías propuestas son azúcares simples, almidón, o biomasa lignocelulósica. Aunque la última alternativa tiene una clara ventaja sobre la anterior por no competir con las necesidades de consumo humano, aún presenta numerosas dificultades, incluyendo una tecnología de fermentación problemática y disponibilidad de materia prima y transporte. Una materia prima alternativa fascinante sería la corriente eléctrica. Los electrones se pueden trasladar desde un electrodo a células vivas, proporcionando los equivalentes de reducción necesarios y la energía para soportar el crecimiento autótrofo y la electrosíntesis de los productos deseados (1-5). Puesto que la electricidad está muy disponible, la electrosíntesis microbiana se puede separar espacial y temporalmente de la producción de energía y puede tener lugar en cualquier localización y momento conveniente.
La electrosíntesis microbiana puede ser especialmente útil para el mercado de la energía renovable. Una desventaja principal de la mayoría de las fuentes de energía renovables, incluyendo la solar, el viento, hidro y nuclear, es que son difíciles de almacenar de una manera conveniente. La electrosíntesis microbiana de combustibles, por lo tanto, puede servir para abordar este problema de manera eficaz, convirtiendo la energía eléctrica en enlaces químicos cinéticamente estables.
Se sugirieron varios métodos de transferencia de equivalentes reductores de un electrodo a células vivas y se aplicaron (revisado en 1-5). El hidrógeno molecular es uno de los portadores de electrones más antiguos usados de esta manera puesto que la electrolisis del agua es una tecnología relativamente madura que puede soportar la producción de hidrógeno eficiente a alta densidad de corriente. Sin embargo, el uso de hidrógeno tiene numerosos problemas incluyendo su baja solubilidad y el riesgo de explosión. Además, las enzimas hidrogenasa que transfieren los electrones de hidrógeno a los porteadores celulares son en general complejas, proteínas sensibles a oxígeno, las cuales son difíciles de expresar de manera recombinante y consumen una fracción significativa de las fuentes celulares. Como alternativa al hidrógeno molecular, varios compuestos inorgánicos, tales como el ion férrico o el nitrato, pueden servir como transportadores de electrones, soportando el cultivo dependiente de electricidad (5). Sin embargo, puesto que los potenciales de reducción de estos compuestos son considerablemente mayores que el de NAD(P)H, el flujo de electrones inverso debe tener lugar durante el crecimiento de estos sustratos, limitando la electroforesis a organismos específicos que son menos adecuados para el uso industrial. Una opción adicional es la transferencia directa de electrones del cátodo a los microbios. Aunque se propusieron varias ventajas de esta opción (revisado en 2-5) este planteamiento está limitado a un pequeño grupo de organismos o requiere adaptación compleja de otros.
Como alternativa a todos los métodos anteriores, el CO2 se puede reducir directamente en el cátodo (los electrones se derivan de la división del agua en el ánodo) (6), proporcionando compuestos orgánicos que pueden ser usados por células vivas como fuente de equivalentes reductores, energía e incluso carbono. De esta manera se puede producir un grupo diverso de compuestos (6-9). La producción de alcoholes simples, tales como metanol, etanol y propanol, hidrocarburos, tales como metano y etileno, o ácidos con más de un carbono, tales como ácido acético o ácido oxálico, tiene la ventaja de suministrar microbios con compuestos relativamente simples para metabolizar y/o que son ricos en equivalentes reductores. Sin embargo, la producción electrocatalítica de todos estos compuestos es en general ineficaz (no específica a un producto único y/o que requiere alto sobrepotencial), requiriendo catalizadores costosos y/o soportando baja densidad de corriente (revisado en 6, 7). Por el contrario, hay dos compuestos que se pueden producir por reducción directa de CO2 a eficacia relativamente alta (aunque menor que la del hidrógeno molecular) y una densidad de corriente aceptable: monóxido de carbono y ácido fórmico (6-13). Puesto que el monóxido de carbono es un gas tóxico e inflamable con baja solubilidad, el ácido fórmico, que es fácilmente soluble y de baja toxicidad, es un mediador preferido de electrones. De hecho, recientemente se propuso una economía basada en formato como alternativa a los conceptos de economía basada en hidrógeno o economía basada en metanol (14-17).
Diversos organismos metilótrofos pueden crecer sobre formato como una fuente única de carbono, electrones y energía (18-21). Dichos organismos se pueden usar para la electrosíntesis microbiana dependiente de formato (19, 22). Sin embargo, en comparación con los organismos modelo ampliamente usados en la bioindustria, tales como S.cerevisiae o E. coli, el metabolismo de estos microbios está mucho menos entendido, su cultivo en masa está limitado y su manipulación genética está considerablemente menos optimizada. Como consecuencia, el uso biotecnológico de estos metilótrofos naturales está normalmente limitado a la producción de productos simples. Sumario de la invención
La presente invención proporciona una bacteria de Escherichia aislada que está genéticamente modificada para expresar formato deshidrogenasa dependiente de NAD que es capaz de oxidar el formato a dióxido de carbono; y formato-tetrahidrofolato ligasa.
La presente invención además proporciona un cultivo que comprende esta bacteria de Escherichia aislada y un medio que comprende formato.
La presente invención además proporciona un método de generación de una bacteria de Escherichia genéticamente modificada que comprende expresar en la bacteria de Escherichia formato deshidrogenasa dependiente de NAD que es capaz de oxidar el formato a dióxido de carbono; y formato-tetrahidrofolato ligasa.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la cual pertenece la invención. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o en el ensayo de las realizaciones de la invención, a continuación, se describen métodos y materiales ilustrativos. En caso de conflicto, dominará la memoria de patente, que incluye las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean necesariamente limitantes.
Breve descripción de los dibujos
A continuación, con referencia específica a los dibujos en detalle, se insiste que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de discusión ilustrativa de la invención. En este sentido, la descripción tomada con los dibujos hace evidente a los expertos en la técnica cómo se pueden poner en práctica las realizaciones de la invención. En los dibujos:
La Figura 1 es un diagrama que ilustra la ruta reductora de la glicina, produciendo piruvato.
La Figura 2 es un diagrama que ilustra la ruta reductora de la glicina, produciendo glicerato.
La Figura 3 es un diagrama que ilustra la ruta reductora de la glicina, en la que la glicina - y no serina - se asimila dentro del metabolismo central.
Descripción de las realizaciones específicas de la invención
La presente invención en general se refiere al uso de la ruta reductora de la glicina para la generación de microorganismos y, más particularmente, pero no exclusivamente, a microorganismos formatótrofos y autótrofos. Después de explicar al menos una realización en detalle, debe entenderse que la invención no se limita necesariamente en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ilustrados por los Ejemplos. La invención es capaz de otras realizaciones o de practicarse o llevarse a cabo de diversas maneras.
La electrosíntesis ha recibido recientemente mucha atención para ser un planteamiento prometedor para el uso de una energía renovable para la producción de productos por células vivas. Se propusieron diversas técnicas para mediar la transferencia de electrones del cátodo a las células vivas. De estas, la electroproducción de formato como mediador parece ser especialmente interesante: el formato es fácilmente soluble, de baja toxicidad y se puede producir a alta eficacia y a densidad de corriente razonable.
Hay numerosas rutas metabólicas que, una vez expresadas en un microorganismo, pueden soportar potencialmente el crecimiento formatótrofo. Los presentes inventores aplicaron diversos métodos computacionales para analizar y comparar estas rutas según diversos criterios incluyendo el rendimiento de biomasa, favorabilidad termodinámica, fuerza motriz química, cinéticas y pautas de expresión y encontraron que la ruta reductora de la glicina, compuesta del sistema de tetrahidrofolato, el sistema de escisión de glicina, la serina hidroximetiltransferasa y la serina desaminasa, manifiesta características superiores y es el candidato más prometedor para mediar la electrosíntesis usando bacterias, y más específicamente, E. coli como hospedador.
Aunque los organismos que son capaces del crecimiento formatótrofo, es decir, crecimiento sobre formato, existen de manera natural, son en general menos adecuados para la modificación por ingeniería metabólica y el cultivo en masa. Además, no hay indicio de que cualquier organismo use esta ruta para soportar el crecimiento metilótrofo o autótrofo. Los microorganismos que usan la ruta reductora de la glicina tal como se muestra en la Figura 1, la usan para generar un degradado de electrones, reciclando los portadores de electrones reducidos que se generan durante la fermentación de purinas y aminoácidos (23).
Por lo tanto, se describe un microorganismo aislado que expresa enzimas de la ruta reductora de la glicina, en donde el microorganismo es capaz de convertir el formato en piruvato o glicerato por la formación de glicina y serina. Tal como se usa en el presente documento, el término "microorganismo" se refiere a cualquier organismo de tamaño microscópico. Ejemplos no limitantes de microorganismos como el término usado en el presente documento incluyen microorganismos tanto procariotas como eucariotas, tales como bacterias, protozoos, hongos, mohos, levaduras, algas etc. El microorganismo puede ser aeróbico o anaeróbico.
El término "aislado" tal como se usa en el presente documento se refiere a un microorganismo que está al menos parcialmente separado del ambiente natural, por ejemplo, de otros microorganismos que no son capaces de usar formato como fuente de carbono, poder reductor y energía (por ejemplo, purificada o semipurificada). Las poblaciones contempladas de microorganismos son unas que están enriquecidas para el microorganismo descrito en el presente documento, por ejemplo, en donde al menos el 30 % de las mismas comprende el microorganismo, al menos el 40 % de las mismas comprende el microorganismo, al menos el 50 % de las mismas comprende el microorganismo, al menos el 60 % de las mismas comprende el microorganismo, al menos el 70 % de las mismas comprende el microorganismo, al menos el 80 % de las mismas comprende el microorganismo, al menos el 90 % de las mismas comprende el microorganismo, al menos el 95 % de las mismas comprende el microorganismo.
Los organismos puede ser organismos fermentativos. Los microorganismos ilustrativos incluyen, por ejemplo, Clostridium (por ejemplo, C. acetobutylicum, C. Beijerinckii, C. saccharoperbutylacetonicum, C. saccharobutylicum, C. aurantibutyricum, C. tetanomorphum), Zymomonas, Escherichia (e.g., E. coli), Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula, Zymomonas y Saccharomyces, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces lactis.
Las bacterias pueden ser gram positivas y gram negativas. Ejemplos de bacterias incluyen, pero sin limitación, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Phormidium, Pseudomonas, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodococcus, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphlococcus, Strepromyces, Synnecoccus, y Zymomonas.
Ejemplos de hongos incluyen, pero sin limitación, Aspergillus, Candida, Chlamydomonas, Chrysosporium, Cryotococcus, Fusarium, Kluyveromyces, Neotyphodium, Neurospora, Penicillium (por ejemplo. P. chrysogenum), Pichia, Saccharomyces, Trichoderma y Xanthophyllomyces.
Ejemplos de algas incluyen, pero sin limitación, una diatomea o una cianobacteria.
La diatomea puede ser una microalga de la clase Coscinodiscophyceae, Fragilariophyceae o Bacillariophyceae. La cianobacteria puede incluir, por ejemplo, Botryococcus braunii, Chlorella, Dunaliella tertiolecta, Gracilaria, Pleurochrysis carterae, Sargassum o Ulva.
El microorganismo puede ser metilótrofo - es decir, es capaz de crecer sobre compuestos C1 orgánicos como su fuente única de carbono, poder reductor y energía.
El microorganismo metilótrofo puede ser formatótrofo - es decir, usa formato como una fuente de carbono, poder reductor y energía. Se apreciará que los organismos formatótrofos de la presente invención también pueden ser capaces de crecer sobre fuentes de carbono adicionales - tales como glucosa, glicerol celulosa, acetato, butirato, lactato, propionato o valerato.
El formatótrofo puede usar formato como su fuente única de carbono.
El microorganismo puede ser autótrofo. Un tipo de microorganismo autótrofo es un organismo fotótrofo (uno que requiere luz para conseguir el poder reductor y la energía para la fijación de dióxido de carbono). La fuente de electrones para la fotosíntesis puede ser, por ejemplo, agua, sulfuro de hidrógeno, azufre elemental o ion de hierro (Fe2+).
Otro tipo de microorganismo autótrofo es un microorganismo quimiótrofo (uno que requiere una fuente de electrones externa [por ejemplo, hidrógeno molecular, monóxido de carbono (CO), sulfuro de hidrógeno H2S), azufre elemental (S), sulfito SO32-), fosfito (PO32"), amoníaco (NH4+), nitrato (NO22'), hidróxido de amonio (NH2OH), ion ferroso (Fe2+), ion de Mn2+] para conseguir el poder reductor y la energía para la fijación del dióxido de carbono). Posibles receptores de electrones terminales incluyen oxígeno molecular, dióxido de carbono (CO2), sulfato (SO42'), azufre elemental (S), nitrato (NO32'), ion férrico (Fe3+).
Tal como se menciona los microorganismos expresan, o bien de manera natural o están modificados por ingeniería genética para expresar, enzimas de la ruta reductora de la glicina de modo que el microorganismo es capaz de convertir el formato en piruvato por la formación de glicina y serina (Figura 1) o es capaz de convertir formato en glicerato por la formación de glicina y serina (Figura 2). Una alternativa adicional es usar las enzimas de la ruta reductora de la glicina de modo que el microorganismo sea capaz de convertir el formato en acetil-CoA, glicerato u oxaloacetato por la formación de glicina, pero sin la formación de serina (Figura 3).
El microorganismo puede usar la enzima serina desaminasa para la conversión de la serina (generada por la ruta reductora de la glicina, Figura 1) en piruvato. Como alternativa, el microorganismo puede usar una enzima serina transaminasa (o serina deshidrogenasa) e hidroxipiruvato reductasa (o hidroxipiruvato isomerasa y tartronato semialdehído reductasa) para la conversión de la serina (generada por la ruta reductora de la glicina) en glicerato (Figura 2). Como alternativa, el microorganismo puede asimilar directamente glicina dentro del metabolismo central sin producir serina, ta como se muestra en la Figura 3.
La Figura 1 ilustra las enzimas de la ruta reductora de la glicina en la que el producto es piruvato. La ruta está compuesta del sistema de tetrahidrofolato, el sistema de escisión de glicina, la serina hidroximetiltransferasa y la serina desaminasa.
Por lo tanto, los microorganismos pueden expresar formato tetrahidrofolato ligasa (EC 6.3.4.3, THFS); meteniltetrahidrofolato ciclohidrolasa (EC 3.5.4.9, folD); metilenotetrahidrofolato deshidrogenasa (EC 1.5.1.5/15, folD); aminometiltransferasa (EC 2.1.2.10, gcvT); dihidrolipoil deshidrogenasa (EC1.8.1.4, Ipd); glicina deshidrogenasa (descarboxilación; EC 1.4.4.2, gcvP); serina hidroximetiltransferasa (EC2.1.2.1, glyA); y L-serina desaminasa (EC 4.3.1.17, sdaA).
El microorganismo puede ser capaz de convertir formato en piruvato por una actividad de la serina desaminasa o el microorganismo puede ser capaz de convertir formato en glicerato por una actividad de una enzima serina desaminasa (por ejemplo, EC 2.6.1.45, 2.6.1.51) e hidroxipiruvato reductasa (EC 1.1.1.82 o 1.1.1.29).
Las enzimas meteniltetrahidrofolato ciclohidrolasa y metilenotetrahidrofolato deshidrogenasa se pueden reemplazar por una enzima bifuncional meteniltetrahidrofolato ciclohidrolasa/metilenotetrahidrofolato deshidrogenasa. Además, la enzima formato tetrahidrofolato ligasa y la enzima bifuncional meteniltetrahidrofolato ciclohidrolasa/metilenotetrahidrofolato deshidrogenasa se pueden reemplazar por una enzima trifuncional que porta actividades de formil-THF sintetasa, meteniltetrahidrofolato ciclohidrolasa y metilenotetrahidrofolato deshidrogenasa. Se apreciará que la enzima formato tetrahidrofolato ligasa se puede evitar haciendo funcionar enzimas cuya reacción neta es idéntica a la de formato tetrahidrofolato ligasa (por ejemplo, el funcionamiento secuencial de purT (glicinamida ribonucleótido transformilasa dependiente de formato) en la dirección directa y PurN (glicinamida ribonucleótido transformilasa dependiente de formil-THF) en la dirección inversa; otro ejemplo es el funcionamiento secuencial de purP (aminoimidazol carboxamida ribonucleótido transformilasa dependiente de formato) en la dirección directa y PurH (aminoimidazol carboxamida ribonucleótido transformilasa dependiente de formil-THF) en la dirección inversa).
También se puede expresar la proteína H del sistema de escisión de glicina. Además, también se pueden expresar las enzimas que convierten el ácido octanoico en ácido lipoico unido a la proteína H (por ejemplo LipA, LipB y/o LpIA).
Se apreciará que para la generación de microorganismos formatótrofos, también es necesario la expresión de una formato deshidrogenasa (EC 1.2.1.2 o 1.2.1.43; por ejemplo, GenBank CAB54834.1 - SEQ ID NO: 12) que es capaz de oxidar el formato para obtener dióxido de carbono. Los electrones que se liberan sirven como el poder reductor requerido para el funcionamiento de la ruta reductora de la glicina y para generar ATP (por ejemplo, por fosforilación oxidativa).
Para la generación de microorganismos autótrofos, también es necesario la expresión de una formato deshidrogenasa que sea capaz de reducir dióxido de carbono a ácido fórmico (EC 1.2.1.2, 1.2.1.43 o 1.1.99.33; por ejemplo GenBank AAB18330.2 (SEQ ID NO: 13) y AAB18329.1 (SEQ ID NO: 14).
También se pueden expresar enzimas adicionales en los microorganismos autótrofos dependiendo de la fuente de electrones externa. Por lo tanto, por ejemplo, si la fuente de electrones es hidrógeno, se contempla en general la expresión de una enzima hidrogenasa. Detalles adicionales sobre la expresión de la hidrogenasa en células E. coli se pueden en encontrar en [24, 25].
La Figura 2 ilustra las enzimas de la ruta reductora de la glicina en la que el producto es glicerato.
Por lo tanto, los microorganismos pueden expresar formato tetrahidrofolato ligasa (EC 6.3.4.3, THFS); meteniltetrahidrofolato ciclohidrolasa (EC 3.5.4.9, folD); metilenotetrahidrofolato deshidrogenasa (EC 1.5.1.5/15, folD); aminometiltransferasa (EC 2.1.2.10, gcvT); dihidrolipoil deshidrogenasa (EC 1.8.1.4, Ipd); serina hidroximetiltransferasa (EC2.1.2.1, glyA); serina deshidrogenasa (EC2.6.1.45) o serina-glioxilato transaminasa (EC 2.6.1.51) o cualquier otra enzima transaminasa (EC 2.6.1X); e hidroxipiruvato reductasa (EC 1.1.1.26/19/79/81) o hidroxipiruvato isomerasa (EC 5.3.1.22) tartronato semialdehído reductasa (EC 1.1.1.60).
La Figura 3 ilustra las enzimas de la ruta reductora de la glicina en la que los productos son metabolitos del metabolismo central. En estos microorganismos, la enzima serina hidroximetiltransferasa (EC2.1.2.1, glyA) no se expresa.
Por lo tanto, los microorganismos pueden expresar formato tetrahidrofolato ligasa (EC 6.3.4.3, THFS); meteniltetrahidrofolato ciclohidrolasa (EC 3.5.4.9, folD); metilenotetrahidrofolato deshidrogenasa (EC 1.5.1.5/15, folD); aminometiltransferasa (EC 2.1.2.10, gcvT); dihidrolipoil deshidrogenasa (EC1.8.1.4, Ipd). Cuando se produce acetil-CoA como metabolito central, el microorganismo expresa la enzima glicina reductasa (EC 1.4.1.10) y fosfato acetiltransferasa EC 2.3.1.8. Como alternativa, la glicina se puede convertir en glioxilato y antes de ser asimilada dentro del metabolismo central (tal como se muestra en la Figura 3). Esto requiere la expresión de glicina deshidrogenasa (EC 1.4.1.10) o una transaminasa (EC 2.6.1.51). Cuando se produce oxaloacetato como metabolito, el microorganismo expresa enzimas EC 4.1.3.14 y 4.3.1.20. Como alternativa, la glicina se puede convertir en oxaloacetato por el ciclo reductor TCA y el ciclo del glioxilato (tal como se muestra en la Figura 3). Cuando se producen glicerato 2-fosfato o glicerato 3-fosfato, se expresan las enzimas EC4.1.1.47, EC1.1.1.60 y EC 2.7.1.31/165. Tal como se muestra en la Figura 3, en lugar de EC1.1.1.60, se pueden expresar las enzimas EC 5.3.1.22 y EC 1.1.1.26/29/79/81.
El término "enzima" tal como se usa en el presente documento se refiere a una "biomolécula catalíticamente funcional", que incluye tanto moléculas nativas (o de tamaño nativo) como derivados (por ejemplo, modificaciones genéticas) de la misma.
Por lo tanto, una enzima también se refiere a homólogos y otras modificaciones incluyendo adiciones o deleciones de aminoácidos específicos a la secuencia (por ejemplo, polipéptidos que son al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 87 %, al menos 89 %, al menos 91 %, al menos 93 %, al menos 95 % o más es decir 100 % homólogos a las secuencias de aminoácidos lisosomales enumeradas en la Tabla 1, en el presente documento más adelante tal como se determina usando el programa informático BlastP del "National Center of Biotechnology Information" (NCBI) usando los parámetros por defecto). El homólogo también se puede referir a un ortólogo, una deleción, inserción, o variante de sustitución, incluyendo una sustitución de aminoácidos, de la misma y fragmentos de polipéptidos biológicamente activos de la misma.
Tabla 1
Figure imgf000006_0001
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las enzimas se pueden optimizar para la expresión para un microorganismo particular. Ejemplos de dichas modificaciones de secuencia incluyen, pero sin limitación, un contenido de G/C alterado para acercarse mucho más al generalmente encontrado en la especie de microorganismo de interés, y la retirada de codones encontrados de manera atípica en la especie de microorganismo comúnmente referido como optimización de codón.
La expresión "optimización de codón" se refiere a la selección de nucleótidos de ADN apropiados para su uso dentro de un gen estructural o fragmento del mismo que aborda el uso de codón dentro del microorganismo de interés. Por tanto, un gen optimizado o secuencia de ácidos nucleicos se refiere a un gen en el que la secuencia de nucleótidos de un gen nativo o de origen natural se ha modificado para utilizar codones estadísticamente preferidos o estadísticamente favoritos dentro del microorganismo. La secuencia de nucleótidos generalmente se examina al nivel de ADN y la región codificante optimizada para la expresión en la especie de microorganismo determinada usando cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo tal como se describe en Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). En este método, la desviación típica del uso de codón, una medida del sesgo de uso de codón, se puede calcular primero encontrando la desviación proporcional cuadrática del uso de cada codón del gen nativo en relación a la de los genes altamente expresados, seguido por un cálculo de la desviación cuadrática media. La fórmula usada es: 1 SDCU = n = 1 N[(Xn - Yn)/Yn]2/N, en donde Xn se refiere a la frecuencia de uso de codón n en genes altamente expresados, en donde Yn a la frecuencia de uso de codón n en el gen de interés y N se refiere al número total de codones en el gen de interés.
Un método de optimización de la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con el uso de codón preferido para un tipo de célula particular se basa en el uso directo, sin realización de ningún cálculo estadístico extra, de tablas de optimización de codón tales como aquellas proporcionadas on-line en la Base de Datos de Uso de Codón del banco de ADN del NIAS ("National Institute of Agrobiological Sciences") en Japón (worldwidewebdotkazusadotordotjp/codon/). La Base de Datos de Uso de Codón contiene las tablas de uso de codón para un número de diferentes especies, habiendo sido cada tabla de uso de codón determinada estadísticamente basándose en los datos presentes en Genbank.
Usando las tablas anteriores para determinar los codones más preferidos o más favoritos para cada aminoácido en una especie particular (por ejemplo, E. coli), una secuencia de nucleótidos de origen natural que codifica una proteína de interés se puede someter a optimización de codón para esa especie particular. Esto se efectúa reemplazando codones que pueden tener una baja incidencia estadística en el genoma de la especie particular con los codones correspondientes, con respecto a un aminoácido, que son estadísticamente más favoritos. Sin embargo, se pueden seleccionar uno o más codones menos favoritos para delecionar los sitios de restricción existentes, para crear unos nuevos en uniones potencialmente útiles (extremos 5' y 3' para añadir péptido señal o casetes de terminación, sitios internos que se podrían usar para cortar y empalmar segmentos juntos para producir una secuencia de longitud completa correcta), o para eliminar las secuencias de nucleótidos que pueden afectar negativamente a la estabilidad o expresión del ARNm.
La secuencia de nucleótidos codificantes de origen natural puede ya, con antelación a cualquier modificación, contener un número de codones que corresponden a un codón estadísticamente favorito en una especie particular. Por tanto, la optimización de codón de la secuencia de nucleótidos nativa puede comprender determinación de aquellos codones, dentro de la secuencia de nucleótidos nativa, que no son estadísticamente favoritos con respecto a la planta particular, y modificar estos codones de acuerdo con una tabla de uso de codón de la especie particular para producir un derivado optimizado por codón. Una secuencia de nucleótidos modificada se puede optimizar completa o parcialmente para el uso de codón de microorganismo siempre que la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos modificada se produzca a un nivel mayor que la proteína codificada por el correspondiente gen de origen natural o nativo. La construcción de los genes sintéticos alterando el uso de codón se describe en, por ejemplo, la Solicitud de Patente PCT 93/07278.
Para expresar las enzimas usando tecnología recombinante, polinucleótidos que codifican las enzimas se pueden ligar en un vector de expresión de ácido nucleico, bajo el control transcripcional de una secuencia reguladora en cis (por ejemplo, secuencia promotor) adecuada para dirigir la transcripción constitutiva o inducible de las enzimas en el microorganismo.
La expresión "un polinucleótido aislado" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos monocatenaria o bicatenaria que está aislada y se proporciona en la forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótidos complementaria (ADNc), una secuencia de polinucleótidos genómica y/o una secuencia de polinucleótidos compuesta (por ejemplo, una combinación de las anteriores).
Tal como se usa en el presente documento la expresión "secuencia de polinucleótidos complementaria" se refiere a una secuencia, la cual resulta de la transcripción inversa del ARN mensajero usando una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. Dicha secuencia se pueden amplificar posteriormente in vivo o in vitro usando una ADN polimerasa dependiente de ADN.
Tal como se usa en el presente documento la expresión "secuencia de polinucléotidos genómica" se refiere a una secuencia derivada (aislada) de un cromosoma y, por lo tanto, representa una porción contigua de un cromosoma. Tal como se usa en el presente documento la expresión "secuencia de polinucleótidos compuesta" se refiere a una secuencia, la cual es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genómica. Una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias de exón requeridas para codificar el polipéptido, así como algunas secuencias intrónicas interpuestas entre las mismas. Las secuencias intrónicas pueden ser de cualquier fuente, incluyendo de otros genes, y generalmente incluirán secuencias de señal de corte y empalme conservadas. Dichas secuencias intrónicas además pueden incluir elementos reguladores de la expresión que actúan en cis.
El vector de expresión incluye secuencias adicionales que interpretan este vector adecuado para la replicación e integración en los procariotas, eucariotas, o preferentemente ambos (por ejemplo, vectores lanzaderas). Vectores clonantes normales contienen secuencias de iniciación de la transcripción y la traducción (por ejemplo, promotores, potenciadores) y terminadores de la transcripción y la traducción (por ejemplo, señales de poliadenilación).
Se pueden usar diversos métodos para introducir el vector de expresión dentro del sistema celular hospedador. Tales métodos se describen en general en Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989 1992), en Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., "Somatic Gene Therapy", CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., "Gene Targeting", CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), "Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses", Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa et al. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Además, véanse los documentos de Patente de EE.UU. N.° 5.464.764 y 5.487.992 para métodos de selección positivo-negativo.
Sistemas de expresión basados en bacterias ilustrativos se divulgan en Baneyx et al., Current Opinión in Biotechnology, 1999; 10, 411-421 y Macrides et al, Microbiol Rev 1996, 60: 512-538.
Los microorganismos se pueden transformar estable o transitoriamente con las construcciones de ácidos nucleicos. En la transformación estable, la molécula de ácido nucleico se integra en el genoma del microorganismo y como tal representa un rasgo estable y hereditario. En la transformación transitoria, la molécula de ácido nucleico se expresa por la célula transformada pero no está integrada en el genoma y como tal representa un rasgo transitorio.
En general está contemplado usar secuencias de polinucleótidos que codifican las enzimas de la ruta reductora de la glicina de cualquier organismo - por ejemplo, secuencias humanas, secuencias vegetales, secuencias bacterianas, secuencias fúngicas, secuencias de levadura.
Se apreciará que el número de enzimas adicionales que tienen que ser expresadas exógenamente en un microorganismo particular dependerá de las enzimas que se expresan de manera natural en ese tipo natural sobre la localización subcelular del mismo.
Por lo tanto, en el presente caso de E. coli, se usan medios recombinantes para expresar:
1. Formato deshidrogenasa dependiente de NAD que es capaz de oxidar formato a dióxido de carbono; y 2. Formato-tetrahidrofolato ligasa.
Las células transformadas se cultivan bajo condiciones eficaces, que permiten la expresión de altas cantidades de las enzimas recombinantes. Las condiciones de cultivo eficaces incluyen, pero sin limitación, medios eficaces, biorreactor, temperatura, condiciones de pH y oxígeno que permiten la producción de la proteína. Un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el que una célula se cultiva para producir el polipéptido recombinante. Dicho medio generalmente incluye una solución acuosa que tiene fuentes de carbono asimilables, de nitrógeno y fosfato, y sales apropiadas, minerales, metales y otros nutrientes, tales como vitaminas. Las células se pueden cultivar en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas Petri. El cultivo se puede llevar a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para una célula recombinante. Dichas condiciones de cultivo pertenecen a la experiencia de los expertos en la técnica.
Se apreciará que hasta el microorganismo se transforma de ser un microorganismo heterótrofo a un microorganismo formatótrofo o microorganismo autótrofo, el microorganismo se cultiva en un medio de cultivo que comprende otras fuentes de carbono tales como glucosa o glicerol.
Después de la generación de los microorganismos tal como se describe en el presente documento, preferentemente se seleccionan por crecimiento (es decir, cultivo) sobre un sustrato particular. Preferentemente, los microorganismos se cultivan durante al menos un día, al menos dos días, al menos tres días, al menos una semana, al menos un mes, al menos tres meses en donde algunas células viables restantes después de dicho tiempo son el microorganismo seleccionado.
Por lo tanto, por ejemplo, en el caso de generar un microorganismo formatótrofo, el microorganismo se debería cultivar en un medio de cultivo que comprenda formato como fuente de carbono. En el caso de un microorganismo autótrofo, el microorganismo se debería cultivar en un medio de cultivo que comprenda dióxido de carbono como fuente de carbono y una fuente de electrones externa tal como se ha descrito además anteriormente en el presente documento.
El formato que se usa puede venir de cualquier fuente - por ejemplo, formato de sodio, formato de potasio, ácido fórmico o anhídrido de ácido fórmico etc.
Como alternativa, y/o además, el formato se puede generar usando electricidad. El CO2 se puede reducir directamente en el cátodo (los electrones se derivan de la división del agua en el ánodo) para generar formato a eficacia relativamente alta.
Para generar el formato para su uso por el microorganismo, el microorganismo se coloca en un biorreactor en un fluido (por ejemplo, agua). El cátodo se puede colocar opcionalmente dentro del biorreactor en contacto con el microorganismo. Como alternativa, el cátodo se puede colocar en un recipiente separado al biorreactor y el formato se puede encauzar a la cámara que comprende el microorganismo. El fluido puede contener otros elementos requeridos por el microorganismo para el crecimiento incluyendo, por ejemplo, sales, minerales, metales y otros nutrientes, tales como vitaminas.
Ejemplos de dichos biorreactores y métodos adicionales se proporcionan en Li et al. Science, 2012, Vol. 335, página 1.596, Rabaey et al, Current Opinión in Biotechnology, 2011, 22: 371-377; Lovley et al., Current Opinión in Biotechnology, 2011, 22: 441-448; Lovley D.R., Environmental microbiology reports, 2011, 3(1), 27-35; Nevin et al., Microbiology, mayo/junio de 2010 Volumen 1 artículo 2; Rabaey et al, Applied and Industrial Microbiology, Nature Reviews, octubre de 2010, Volumen 8, páginas 706-716.
Los electrodos se pueden fabricar a partir de dichos polímeros conductivos y materiales metálicos incluyendo óxido de indio y estaño (ITO), grafito, platino y plata.
Por lo tanto, se contempla un sistema para el microorganismo descrito en el presente documento y un electrodo para proporcionar electrones para generar formato. El sistema además puede comprender mecanismo(s) para la separación, recolección, y/o recuperación del biocombustible que es generado por el microorganismo (como se detalla más, a continuación).
Para confirmar que el microorganismo formatótrofo o autótrofo está usando la ruta reductora de la glicina para la generación de piruvato o glicerato, se contempla el análisis de los metabolitos de la ruta reductora de la glicina. Dichos metabolitos incluyen 10-formil-tetrahidrofolato, 5,10-meteniltetrahidrofolato, 5,10-metilenotetrahidrofolato, aminometil-dihidrolipoilproteína, dihidrolipoilproteína, lipoilproteína, glicina, serina y piruvato (o hidroxipiruvato y glicerato).
Preferentemente, el análisis comprende el análisis de marcación con 13C o 14C durante el tiempo tomado para producir cada metabolito marcado a partir del formato marcador, de modo que es evidente que la producción de 10-formil-tetrahidrofolato precede la de 5,10-metileno-tetrahidrofolato, de modo que la producción de 5,10-metilenotetrahidrofolato precede la de aminometildihidrolipoil, de modo que la producción de aminometil-dihidrolipoil precede la de glicina, de modo que la producción de glicina precede la de serina y la producción de serina precede la de piruvato.
Preferentemente, la formación de cada uno de los metabolitos precede a la siguiente en la cadena por al menos un segundo, al menos 10 segundos y lo más preferentemente al menos 20 segundos.
Un método ilustrativo para analizar el ritmo de la producción de metabolitos es por análisis de pulso y caza ("pulsechase"). Un análisis de pulso-caza es un método para examinar un proceso celular que se da a lo largo del tiempo exponiendo sucesivamente las células a un compuesto marcado (pulso) y, a continuación, al mismo compuesto en una forma no marcada (caza). La radioactividad es un marcador comúnmente usado.
En un método ilustrativo, los microorganismos primero se exponen a formato marcado (el pulso). A continuación, el formato marcado atraviesa las rutas metabólicas y se usa en la síntesis de piruvato. Poco después de la introducción del formato marcado (normalmente aproximadamente 5 minutos), se introduce exceso del mismo formato, pero no marcado, (la caza) en el ambiente. La producción de piruvato continuará, pero no contendrá más el marcador radioactivo del formato introducido en la fase de pulso y no será visible usando métodos de detección radioactiva. En otro método ilustrativo, los compuestos especificados anteriormente se pueden analizar para encontrar cuál de sus átomos de carbono está marcado. Si en realidad se producen por la ruta reductora de la glicina radioactiva se espera un patrón de marcación de carbono indicativo.
La cantidad y/o la actividad de las enzimas de la ruta se pueden analizar en el nivel de ARN o proteína usando métodos conocidos en la técnica. Por lo tanto, en el nivel de ARN, métodos que incluyen RT-PCR, análisis de transferencia Northern, micromatriz de oligonucleótidos. En el nivel de proteína, métodos que incluyen ELISA, transferencia Western, radioinmunoensayo, ensayo de actividad in situ, ensayo de actividad in vitro y análisis inmunohistoquímico todos están contemplados. Un indicio del funcionamiento de la ruta es si todas las enzimas de la ruta muestran actividad suficiente para soportar el crecimiento celular a la tasa que ha sido mostrada para crecer. Métodos adicionales para analizar la producción de los metabolitos de la ruta reductora de la glicina se encuentran en Hugler et al., 2005, Methods In Enzymology, Vol. 397, pág. 212-221; Berg et al., Science 318, 1.782 (2007); Strauss et al., Eur. J. Biochem. 205, 853-866 (1992); Hertner et al., Journal Of Bacteriology, Vol. 183, N.° 14, julio de 2001, pág. 4.305-4.316; Jahn et al., Journal Of Bacteriology, junio de 2007, pág. 4.108-4.119 Vol. 189, N.° 11; y Huber et al., PANS, 3 de junio de 2008, Vol. 105, N.°22, 7.851-7.856.
De acuerdo con una posibilidad, el microorganismo es uno que produce un producto industrialmente importante - por ejemplo, un biocombustible. Como alternativa o además, el microorganismo expresa enzimas de modo que es capaz de producir un producto industrialmente importante - por ejemplo, un biocombustible. Se apreciará que la elección precisa de las enzimas se selecciona según el microorganismo particular a usar. Como alternativa o además, el microorganismo expresa un producto industrialmente importante - por ejemplo, una proteína recombinante. Productos importantes industriales adicionales incluyen antibióticos u otros farmaceúticos, disolventes, pigmentos, aditivos alimenticios, monómeros para la industria del plástico y polímeros industrialmente valiosos.
Biocombustibles incluyen, por ejemplo, un alcohol (por ejemplo, metanol, etanol, propanol, isobutanol, y n-butanol etc.), un hidrocarburo (por ejemplo, un alcano tal como metano, etano, propano, butano, un alqueno tal como etileno, propileno, isoprenos, un alquino tal como acetileno, etc.) hidrógeno, un biodiésel (alquil (metil, propil o etil) ésteres de cadena larga), un aldehído o cetonas (por ejemplo, acetona, formaldehído, 1-propanal, etc.). El biocombustible puede ser un sólido, un líquido o un gas.
Los microorganismos industrialmente útiles incluyen la producción de etanol por Saccharomyces y la producción de butanol por Clostridium.
La proteína recombinante puede ser cualquier proteína - por ejemplo, una proteína humana usada con fines medicinales. Ejemplos de dichas proteínas incluyen anticuerpos, insulina, interferón, hormona de crecimiento, eritropoyetina, hormona de crecimiento, hormona folículo estimulante, factor VIII, receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) alfa galactosidasa A y glucocerebrosidasa.
Tal como se ha mencionado, para expresar las proteínas recombinantes en el microorganismo, se insertan en vectores de expresión secuencias de polinucleótidos que codifican la misma tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
Se apreciará que a parte de contener los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificante insertada (que codifica el polipéptido industrialmente útil), la construcción de expresión para la expresión del polipéptido industrialmente útil también puede incluir secuencias modificadas por ingeniería para optimizar la estabilidad, producción, purificación, rendimiento o actividad del polipéptido expresado.
Dependiendo del vector y del sistema hospedador usado para la producción, los polipéptidos resultantes pueden o bien permanecer dentro de la célula recombinante, secretados dentro del medio de fermentación, secretados en un espacio entre dos membranas celulares, tal como el espacio periplasmático en E. coli; o retenidos sobre la superficie exterior de una célula o membrana viral.
Después de un tiempo predeterminado en cultivo, se efectúa la recuperación del péptido recombinante.
La expresión "recuperación del polipéptido recombinante" usada en el presente documento se refiere a recoger todo el medio de fermentación que contiene el polipéptido y no necesita implicar etapas adicionales de separación o purificación.
Por lo tanto, los polipéptidos se pueden purificar usando una diversidad de técnicas de purificación de proteína convencionales, tales como, pero sin limitación, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía con concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial.
Para facilitar la recuperación, la secuencia codificante expresada se puede modificar por ingeniería para codificar el polipéptido y fusionar el resto escindible. Dicha proteína de fusión se puede diseñar de manera que el polipéptido se puede aislar fácilmente mediante cromatografía de afinidad; por ejemplo, mediante inmovilización sobre una columna específica para el resto escindible. Cuando un sitio de escisión se modifica por ingeniería entre el polipéptido y el resto escindible, el polipéptido se puede liberar de la columna cromatográfica mediante tratamiento con una enzima apropiada o agente que escinde específicamente la proteína de fusión en este sitio (por ejemplo, 26, 27).
La recuperación de biocombustibles se puede recuperar según métodos conocidos en la técnica. Se pueden recuperar alcoholes tales como etanol, metanol, y/o butanol del material líquido por tamices moleculares, destilación, y/o otras técnicas de separación. Por ejemplo, el etanol se puede concentrar mediante destilación fraccional a aproximadamente 90 % o aproximadamente 95 % en peso. Hay varios métodos disponibles para purificar más el etanol más allá de los límites de la destilación, y estos incluyen secado (por ejemplo, con óxido de calcio o sal de roca), la adición de pequeñas cantidades de benceno o ciclohexano, tamiz molecular, membrana, o mediante reducción por presión.
El gas producto, por ejemplo, tal como se produce mediante metabolismo anaeróbico o fotosíntesis, se puede procesar para separar el metano y/o componentes de hidrógeno. El metano, hidrógeno, o biogas se pueden retirar del sistema como gas de tubería.
El metano y/o el hidrógeno se pueden recuperar como un producto de biocombustible. El metano se puede recuperar y/o purificar del biogas mediante métodos conocidos y sistemas que están comercialmente disponibles, incluyendo sistemas de membrana conocidos para separar gases basándose en diferentes permeabilidades. Véase, por ejemplo, el documento de la Patente de EE.UU. N.° 6.601.543. Como alternativa, se pueden usar diversos métodos de adsorción para separar metano e hidrógeno.
Otros modos de recoger los productos biocombustible que incluyen centrifugación, fraccionalización por temperatura, métodos cromatográficos y métodos electroforéticos.
En determinadas realizaciones, los componentes de recuperación/purificación de biocombustible se pueden integrar dentro del sistema de cultivo de microorganismo (por ejemplo, biorreactor), por ejemplo, conectando el respectivo dispositivo o aparato a los efluentes de gas o líquido de los biorreactores. Los biocombustibles purificados y los productos de bioenergía se pueden cebar en un recipiente(s) separarado(s).
Se apreciará que determinadas características de la invención, que, para mayor claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. A la inversa, diversas características de la invención, que, para mayor brevedad, se describen en el contexto de una única realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como adecuado en cualquier otra realización descrita de la invención. Determinadas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no son para ser consideradas características esenciales de aquellas realizaciones, a menos que la realización sea inoperante sin aquellos elementos.
Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención tal como se han definido anteriormente en el presente documento y tal como se reivindica en la sección reivindicaciones encuentran, a continuación, soporte calculado en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
A continuación, se hace referencia a los siguientes ejemplos, los cuales junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención de una manera no limitante.
En general, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en el contexto de la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican por completo en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Son, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vol. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); las metodologías expuestas en los documentos de patente de EE.UU. N.° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J.E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Tercera Edición; "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8° Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles están descritos ampliamente en la patente y la bibliografía científica, véase, por ejemplo, los documentos de Patente de EE.u U. N.° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B.D., and Higgins S.J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B.D., and Higgins S.J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Otras referencias generales se proporcionan por todo este documento. Los procedimientos en el presente documento se cree que son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector.
Ejemplo 1
Selección de una ruta óptima para soportar el crecimiento sobre formato
Para elegir qué ruta de las anteriormente descritas es la más adecuada para soportar el crecimiento sobre formato se compararon según varios criterios (28). En primer lugar, se calculó el rendimiento de biomasa esperado sobre formato para cada una de las diferentes rutas (21,29, 30).
Se usaron dos métodos cuantitativos para estimar el rendimiento de biomasa sobre formato de cada una de las rutas. En el método "conversión de fuente de carbono" (21), los presentes inventores primero calcularon el rendimiento de la conversión de formato en un metabolito punto de referencia designado, Yformato->metaboi¡to, en unidades de mol/mol. Tomando el rendimiento de biomasa experimentalmente medido sobre ese metabolito, Ymetaboiito->biomasa, en unidades de gCDW/mol (siendo CDW peso seco celular), a continuación, se puede estimar el rendimiento de biomasa sobre el formato, en unidades de gCDW/mol de formato, como Yformato->biomasa= Yformato->metabolito Ymetabolito->biomasa.
Por ejemplo, los presentes inventores calcularon el número de moléculas de formato necesarias de ser investigadas para generar una molécula de piruvato. Lo recíproco de este número es el rendimiento de piruvato sobre formato en unidades de mol de piruvato/mol de formato. Multiplicar el rendimiento de piruvato sobre formato con rendimiento de biomasa sobre piruvato - 14.7 gCDW/mol, tal como se mide experimentalmente (31) - proporcionó a los inventores una estimación del rendimiento de biomasa sobre formato en unidades de gCDW/mol de formato. A continuación, se repitió el mismo proceso para la glucosa, tomando el rendimiento de biomasa experimentalmente medido sobre glucosa, 70,8 gCDW/mol (3l). En ambos casos se asumió que ATP se produce por NADH y fosforilación oxidativa y que la relación P/O (que mide cuántas moléculas de ATP se producen por un átomo de oxígeno que está siendo reducido) es de 1,5, tal como es relevante para E. coli (32). A continuación, la segunda y la tercera columna de la Tabla 2 en el presente documento exponen el rendimiento de biomasa estimado calculado mediante la elección de o bien piruvato o glucosa como el producto de la fijación de carbono y las rutas de asimilación de formato.
Figure imgf000013_0001
Los resultados mostrados en la Tabla 2 en el presente documento sugiere que las rutas asimiladoras de formato son en general más eficaces que unas de fijación de carbono, con la excepción de aquellas rutas de fijación de carbono que evitan las etapas de carboxilación acopladas a ATP. No obstante, estos resultados también sugieren que este tipo de análisis es problemático puesto que la elección del metabolito específico para servir como el producto de las rutas puede influir la estimación enormemente: asumir la glucosa como producto de las rutas dio mucho mayor estimación para el rendimiento de biomasa sobre formato (aproximadamente 1,5 veces de diferencia promedio) justo debido a que el rendimiento de biomasa de E. coli sobre glucosa es mayor que la de sobre piruvato.
Un planteamiento alternativo para estimar el rendimiento de biomasa es usar métricas de análisis de equilibrio de flujo (33,34) tal como se implementa por (30). La ventaja de este planteamiento es que no se desvía por la elección de metabolito en el que el formato se convierte y que luego se usa como fuente de carbono, sino que trata la biomasa celular entera como el producto de la fijación de carbono o la asimilación de formato (30). El modelo metabólico de E. coli central se selecciona (35) sobre el modelo metabólico completo puesto que los presentes inventores querían mantener el análisis más general y menos específico a E. coli y puesto que querían evitar la complejidades de la regulación que pueden dar como resultado soluciones defectuosas que usan el modelo metabólico completo. Se usó análisis de equilibrio de flujo para calcular el rendimiento del crecimiento en lugar de la tasa de crecimiento. Por lo tanto, las unidades de entrada de formato eran en mmol y el rendimiento de biomasa se dio en gDW. Puesto que el mantenimiento de ATP no se pueden estimar a priori para el crecimiento sobre formato los rendimientos de biomasa se calcularon de dos modos diferentes, uno retirando el mantenimiento de ATP en total y uno asumiendo el mantenimiento de ATP idéntico al de la glucosa. Las columnas quinta y cuarta en la Tabla 2 exponen los resultados de este análisis.
De manera importante, aunque los métodos de cálculo de rendimiento de biomasa sobre formato difieren sustancialmente y dieron como resultado hasta 6 veces de diferencia en el rendimiento de biomasa estimado (Tabla 2), sugieren rendimientos de biomasa relativos muy similares de las rutas. De hecho, la correlación entre los rendimientos de biomasa calculados asumiendo piruvato o glucosa como el producto de las rutas y aquellos calculados usando análisis de equilibrio de flujo es R2 > 0,6. Considerando todos los métodos usados, el ciclo TCA reductor, la ruta reductora de acetil-CoA, la ruta de ribulosa monofosfato y la ruta reductora de la glicina son las rutas que soportan el mayor rendimiento de biomasa sobre formato.
Ejemplo 2
Favorabilidad termodinámica
No todas las rutas metabólicas que funcionan en un organismo son termodinámicamente favorables en otros, en los que las condiciones celulares (pH, fuerza iónica, etc.) podrían diferir considerablemente (28, 36, 37). Por tanto, los presentes inventores comprobaron si todas las rutas discutidas anteriormente son termodinámicamente favorables dentro de E. coli (pH aproximadamente 7,5, I aproximadamente 0,2 M). No ensayaron solamente la favorabilidad de la reacción neta de la ruta (28, 38) sino también analizaron embotellamientos termodinámicos distribuidos compuestos de un subconjunto de reacciones dentro de las rutas (28, 39). En particular, la CO-deshidrogenasaacetil-CoA-sintasa y el sistema de escisión de glicina son complejos de varias enzimas. Por lo tanto, Las reacciones que se dan dentro de estos complejos probablemente se acoplan una a otra, superando cualquier barrera termodinámica interna (37). Para rutas que contienen estos complejos se consideraron ambos escenarios - las reacciones internas dentro del complejo están acopladas o están desacopladas.
Se encontraron dos rutas que se prevé que son termodinámicamente desfavorables puesto que contienen conjuntos de reacción que no pueden proceder en la dirección directa en las condiciones celulares de E. coli y bajo concentraciones reactivas fisiológicas (se usó el intervalo 1 |jM-10mM para metabolitos no co-factor) (37,40-42). Estos son el ciclo reductor TCA y la ruta reductora de acetil-CoA en los que la reducción de CO2 a CO y la síntesis de acetil-CoA no están acopladas. Ambas rutas se marcan como "desfavorables" en la sexta columna de la Tabla 2. El funcionamiento reductor secuencial de la 2-cetoglutarato sintasa y la isocitrato deshidrogenasa (parte del ciclo reductor TCA), que cataliza la reacción global succinil-CoA 2 ferredoxinared NADPH 2 CO2 <=> isocitrato CoA 2 ferredoxinaox NADP+, parece ser desfavorable en E. coli. Incluso si se asume que se mantiene la concentración de CO2 disuelto a 1 mM (-100 veces mayor que el ambiente), [NADPH]=10[NADP+], [ferredoxinared]~[ferredoxina°x], [CoA]=1 mM (la menor concentración celular de este cofactor (40) y los otros metabolitos están en sus valores extremos posibles, [succinil-CoA]=10 mM e [isocitrato]=1 pM, el cambio en la energía de Gibbs (ArG') durante la reacción global es aún positiva a pH 7,5 y 1=0,2 M. Este razonamiento probablemente descarta el ciclo reductor TCA de servir como una ruta de fijación de carbono en E. coli.
La barrera energética de la ruta reductora de acetil-CoA es el resultado de la reducción altamente desfavorable de CO2 a CO con ArG’° = 46 kJ/mol cuando ferredoxina sirve como donante de electrones (43). Sin embargo, esta gran barrera energética se puede nivelar en total si la reacción de hecho se acopla a la reacción muy favorable que lo permite dentro del mismo complejo, Acetil-CoA sintasa (37). En tal caso la reacción completa, metil-THF CO2 + 2 ferredoxinared CoA <=> acetil-CoA 2 ferredoxina™ THF, tendrá ArG’° aproximadamente -25 kJ/mol (43), haciendo la ruta entera favorable.
Ejemplo 3
Fuerza motriz química
Ser termodinámicamente favorable no es suficiente. La energía disipada durante una reacción (ArG') puede tener un efecto sustancial sobre sus cinéticas. De hecho, AGr' dicta que la fracción de la maquinaria enzimática cataliza la reacción directa (38,44-46): AGr' =-RTln(J+/J-), donde J+ es el flujo directo, J- es el flujo inverso, R es la constante de gas y T es la temperatura en grados Kelvin. Por lo tanto, un valor de AGr' bajo (negativo), correspondiente a una alta fuerza motriz química, indica que la mayoría de la maquinaria enzimática está catalizando la reacción directa y por lo tanto se puede alcanzar una alta tasa metabólica. Asumiendo la saturación de sustrato y cinéticas similares en la dirección directa e inversa, AGr' de -7.5 kJ/mol corresponde a una reacción que procede a 90 % de su velocidad máxima: 95 % de las enzimas catalizan la reacción directa mientras que el 5 % catalizan la reacción inversa.
Los presentes inventores se cuestionaron qué ruta de las analizadas puede, en principio, soportar alto flujo en términos de la fuerza motriz química sostenida por cada una de sus reacciones. Para cada ruta se usó una herramienta de optimización lineal para cuestionarse si existe un conjunto de concentración de metabolito, dentro del intervalo fisiológico, de modo que cada reacción de la ruta no es solamente favorable sino también funciona a AGr' < -3 kJ/mol, correspondiente a al menos el 55 % de su tasa máxima (asumiendo la saturación de sustrato y cinéticas similares en la dirección directa e inversa). La sexta columna en la Tabla 2 expone los resultados. Las rutas marcadas con "baja CMF" (baja fuerza motriz química ) son termodinámicamente favorables pero cinéticamente más escasas puesto que no hay conjunto de concentración de metabolito, dentro del intervalo fisiológico, que pueda soportar AGr' < -3 kJ/mol para todas sus reacciones. Las rutas marcadas como "alta CMF" son aquellas para las que existe dicho conjunto de concentración de metabolito y por lo tanto, en potencial, puede sostener una alta fuerza motriz química a través de la ruta.
Ejemplo 4
Cinéticas de la ruta
La fuerza motriz química no es el único parámetro que determina el flujo de reacción. Los parámetros cinéticos, es decir, la velocidad máxima (Vmax) y las afinidades hacia los sustratos (constantes de Michaelis, Km), juegan un papel no menos importante.
Los presentes inventores estimaron cuál es la máxima tasa de crecimiento para una bacteria que utiliza formato solamente como una fuente de electrones y depende de rutas de fijación de carbono para el carbono. Consideran el límite de la tasa de crecimiento impuesto por la tasa de la formato deshidrogenasa. Puesto que la formato deshidrogenasa cumple solamente el papel auxiliar en bacterias que emplean una de las rutas asimiladoras de formato (incrementando la disponibilidad celular del poder reductor y ATP), el análisis presentado a continuación no se mantiene en estos casos.
Suponer que las células expresan una formato deshidrogenasa con una actividad especifica de 10 pmol/min/mg (velocidad máxima para las variantes de enzima simple, véase anteriormente) a 20 % de su proteína total (más de lo que se espera que sea dañino). Asumiendo que aproximadamente el 50 % del peso seco celular es proteínas (47), se calcula que el 10 % del peso seco celular es formato deshidrogenasa y por lo tanto la actividad específica es aproximadamente 1 pmol/min/mgCDW. Si la ruta reductora de pentosa fosfato sirve como la ruta de fijación de carbono, 12 moléculas de NAD(P)H y 18 de ATP se requieren para fijar seis moléculas de CO2 a glucosa. Asumiendo una relación de P/O de 1,5 (32), 12+18/1,5 = 24 moléculas de formato se deberían oxidar para soportar la formación de una molécula de glucosa. Por lo tanto, la tasa de formación de glucosa será de 1/24 aproximadamente 0,042 pmol de Glucosa/min/mg CDW. Puesto que el rendimiento de biomasa experimentalmente medido sobre glucosa es de 70,8 gDW/mol (31) se calcula que esta tasa es igual a 0,042-70,8-10‘6 aproximadamente 310-6 gCDW/min/mgCDW o 0,003 mgCDW/min/mgCDW. Por lo tanto, la tasa de crecimiento es igual a 0,0031/min y el tiempo de duplicación es de ln(2)/0,003 aproximadamente 230 min aproximadamente 4 horas.
Este cálculo sugiere que el tiempo de duplicación de una bacteria autótrofa que metaboliza formato usando una formato deshidrogenasa del tipo "simple" no puede ser menor que 4 horas. Por supuesto, esto es solamente un límite inferior y el tiempo de duplicación se podría limitar muy bien por otros factores, tales como la tasa de fijación de carbono. Además, incluso el límite aproximado de 4 horas puede cambiar cuando se consideran rutas de fijación de carbono con diferentes requerimientos de ATP o si se restringe la expresión de formato deshidrogenasa a menor que el 20 % de la proteína total.
Un tipo similar de análisis puede producir más resultados definitivos. Por ejemplo, uno puede cuestionarse si una bacteria puede usar las rutas de la ribulosa monofosfato o la xilulosa 5-fosfato para la asimilación de formato cuando se limita por la tasa de escisión espontánea de metileno-THF a formaldehído y THF. Según las constantes de equilibrio y cinéticas publicadas en (48) y asumiendo un alto [metileno-THF] de aproximadamente 10 mM, la tasa máxima de escisión de metileno-THF se puede calcular para ser de 0,027 mM/s. Puesto que el volumen celular de E. coli que crece lentamente es de aproximadamente 1 |jm3 (49) esta tasa es igual a 2,7-10'17mmol/s/célula o 1,6-10'12jimol/min/célula. Puesto que se requieren seis de tales reacciones para la producción de una molécula de glucosa la tasa de producción de glucosa se limita a 1,610-12/6 = 2,710-13 jmol de Glucosa/min/célula. El peso seco de una célula de E. coli con un volumen de aproximadamente 1 jm 3 es de aproximadamente 200 fg (50) y por lo tanto la tasa anterior es igual a 0,0014 jmol de Glucosa/min/mgCDW. Según el rendimiento de biomasa anterior esta tasa corresponde a 9,610-8 gCDW/min/mgCDW que es 9,6-10-5mgCDW/min/mgCDW. Por tanto, la tasa de crecimiento es igual a 9,6 10-51/min y el tiempo de duplicación es de ln(2)/(9,6-10-5) > 7.200 min = 120 horas = 5 días.
Por tanto, este cálculo sugiere que, considerando solamente una reacción única, dos rutas asimiladoras de formato son cinéticamente no factibles y no pueden sostener ni siquiera una tasa de crecimiento mínimamente aceptable. De hecho, un estudio anterior ha demostrado que la reacción inversa - la condensación de THF con formaldehído - es demasiado lenta para tener cualquier significancia metabólica in vivo (51).
Ejemplo 5
Pautas de expresión de la ruta
Por último, los presentes inventores se cuestionaron cómo se espera que sea la pauta de la expresión de una ruta activa dentro de E. coli. Un aspecto que afecta la dificultad de expresión es el número de enzimas extrañas que se deberían expresar para posibilitar la actividad de ruta. La séptima columna en la Tabla 2 expone este número para cada una de las alternativas metabólicas. En particular, todas las rutas requieren, o se están beneficiando fuertemente de, la expresión de la formato deshidrogenasa para suministrar la célula con poder reductor y energía. La ruta reductora de la pentosa fosfato y la ruta de la xilulosa 5-fosfato parecen imponer una barrera de expresión pequeña, necesitando solamente tres enzimas extrañas. La ruta reductora de la glicina presenta la barrera de expresión más pequeña: solamente se necesitan formato deshidrogenasa extraña y formato-tetrahidrofolato ligasa para el funcionamiento de la ruta.
También se contemplaron la sensibilidad de oxígeno de alguna de las enzimas que funcionan en alguna de las rutas (38, 52). Específicamente, el ciclo reductor de TCA y las rutas de dicarboxilato-4-hidroxipropionato emplean varias enzimas sensibles a oxígeno (38-52). Asimismo, la ruta reductora de acetil-CoA hace funcionar alguna de las enzimas más sensibles a oxígeno conocidas (38, 52, 53). Por tanto, estas rutas no son adecuadas si la bacteria es a cultivar bajo condiciones aeróbicas.
Observaciones finales
La revisión de todos los criterios sugiere que una ruta destaca sobre las otras. La ruta reductora de la glicina requiere la expresión de solamente dos enzimas extrañas, no contiene enzima sensible a oxígeno, soporta alto rendimiento de biomasa, es capaz de sostener alta fuerza motriz química a través del conjunto entero de reacción y no se restringe cinéticamente seriamente por ninguna reacción (Tabla 1). Esta ruta parece ser la ruta más prometedora para establecer una E. coli. formatótrofa.
Alguna de las rutas analizadas por los presentes inventores tienen varias variantes, cada una con sus propias características, ventajas e inconvenientes. Por ejemplo, el ciclo reductor TCA probablemente no es un buen candidato puesto que contiene una gran barrera termodinámica a condiciones celulares de E. coli. Sin embargo, Hydrogenobacter thermophilus ha desarrollado un mecanismo dependiente de ATP para empujar la ruta en la dirección reductora: la enzima 2-cetoglutarato carboxilasa cataliza la carboxilación dependiente de ATP de 2-cetoglutarato a oxalosuccinato en un mecanismo dependiente de biotina, mientras que el oxalosuccinato se reduce más a isocitrato por una isocitrato deshidrogenasa no carboxilante (54, 55). Esta variante de ruta es termodinámicamente favorable e incluso soporta alta fuerza motriz química para cada uno de sus componentes enzimáticos. Sin embargo, el oxalosuccinato intermedio soluble es inestable y fácilmente se somete a descarboxilación, por lo tanto creando un ciclo fútil que reduce la eficacia global de la fijación de carbono (54).
Por último, la evolución enzimática puede proporcionar numerosas soluciones metabólicas a las pautas surgidas por los presentes inventores. Por ejemplo, la enzima que cataliza la condensación reversible del formaldehído y tetrahidrometanopterina a metileno-tetrahidrometanopterina (56) se puede desarrollar para aceptar THF en lugar de tetrahidrometanopterina, levantando de ese modo la barrera cinética impuesta mediante la escisión espontánea de metileno-THF. De especial importancia es el diseño de una enzima que pueden condensar dos moléculas de formato en glioxilato que, a continuación, se puede asimilar directamente dentro del metabolismo central. Aunque dicha enzima se sugirió previamente para funcionar en el cloroplasto de tubérculos de patata verde (57-59), la energética de esta condensación inactivada es extremadamente desfavorable, indicando que el informe es probablemente erróneo (38). Por tanto, cualquier intento de diseñar una enzima que cataliza esta condensación debe primero activar el formato (con un grupo fosfato, por ejemplo).
Referencias
[1] K. Rabaey, R.A. Rozendal, Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production, Nat Rev Microbiol, 8 (2010) 706-716.
[2] D.R. Lovley, Powering microbes with electricity: direct electron transfer from electrodes to microbes, Env Microbilo Rep, 3 (2011) 27-35.
[3] D.R. Lovley, K.P. Nevin, A shift in the current: new applications and concepts for microbe-electrode electron exchange, Curr Opin Biotechnol, 22 (2011) 441-448.
[4] K. Rabaey, P. Girguis, L.K. Nielsen, Metabolic and practical considerations on microbial electrosynthesis, Curr Opin Biotechnol, 22 (2011) 371-377.
[5] J.C. Thrash, J.D. Coates, Review: Direct and Indirect Electrical Stimulation of Microbial Metabolism, Environ Sci Technol., 42 (2008) 3.921-3.931.
[6] D.T. Whipple, J.A. Kenis, Prospects of CO2 Utilization via Direct Heterogeneous Electrochemical Reduction, J Phys Chem Lett., 1 (2010) 3.451-3.458.
[7] W. Li, Electrocatalytic Reduction of CO2 to Small Organic Molecule Fuels on Metal Catalysts, en: Advances in c O2 Conversion and Utilization, 2010, pág. 55-76.
[8] K.P. Kuhl, E.R. Cave, D.N. Abram, T.F. Jaramillo, New insights into the electrochemical reduction of carbon dioxide on metallic copper surfaces, Energy Environ Sci., 5 (2012) 7.050-7.059.
[9] E.A. Quadrelli, G. Centi, J.L. Duplan, S. Perathoner, Carbon dioxide recycling: emerging large-scale technologies with industrial potential, ChemSusChem, 4 (2011) 1.194-1.215.
[10] T. Reda, C.M. Plugge, N.J. Abram, J. Hirst, Reversible interconversion of carbon dioxide and formate by an electroactive enzyme, Proc Natl Acad Sci USA, 105 (2008) 10.654-10.658.
[11] R.P.S. Chaplin, A.A. Wragg, Effects of process conditions and electrode material on reaction pathways for carbon dioxide electroreduction with particular reference to formate formation, J Appl Electrochem., 33 (2003) 1.107-1.123.
[12] B. Innocent, D. Liaigre, D. Pasquier, F. Ropital, J.-M. Léger, K.B. Kokoh, Electro-reduction of carbon dioxide to formate on lead electrode in aqueous medium, J Appl Electrochem., 39 (2009) 227-232.
[13] C. Oloman, H. Li, Electrochemical processing of carbon dioxide, ChemSusChem, 1 (2008) 385-391.
[14] S. Enthaler, J. von-Langermann, T. Schmidt, Carbon dioxide and formic acid-the couple for environmentalfriendly hydrogen storage?, Energy Environ Sci., 3 (2010) 1.207-1.217.
[15] J.H. Hull, Y. Himeda, W.-H. Wang, B. Hashiguchi, R. Periana, D.J. Szalda, J.T. Muckerman, E. Fujita, Reversible hydrogen storage using CO2 and a proton-switchable iridium catalyst in aqueous media under mild temperatures and pressures, Nature Chemistry, 4 (2012) 383-388.
[16] F. Joo, Breakthroughs in hydrogen storage--formic Acid as a sustainable storage material for hydrogen, Chem-SusChem, 1 (2008) 805-808.
[17] B. Loges, A. Boddien, F. Gartner, H. Junge, M. Beller, Catalytic Generation of Hydrogen from Formic acid and its Derivatives: Useful Hydrogen Storage Materials Top Catal, 53 (2010) 902-914.
[18] M.E. Lidstrom, Aerobic Methylotrophic Prokaryotes, en: M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.H. Schleifer, E. Stackebrandt (Eds.) The Prokaryotes, Springer, Nueva York, 2006, pág. 618-634.
[19] J. Schrader, M. Schilling, D. Holtmann, D. Sell, M.V. Filho, A. Marx, J.A. Vorholt, Methanol-based industrial biotechnology: current status and future perspectives of methylotrophic bacteria, Trends Biotechnol, 27 (2009) 107-115.
[20] L. Chistoserdova, M.G. Kalyuzhnaya, M.E. Lidstrom, The expanding world of methylotrophic metabolism, Annu Rev Microbiol, 63 (2009) 477-499.
[21] C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, Academic Press, Londres; Nueva York, 1982.
[22] H. Li, P.H. Opgenorth, D.G. Wernick, S. Rogers, T.Y. Wu, W. Higashide, P. Malati, Y.X. Huo, K.M. Cho, J.C. Liao, Integrated electromicrobial conversion of CO2 to higher alcohols, Science, 335 (2012) 1596.
[23] G. Fuchs, CO2 fixation in acetogenic bacteria: variations on a theme, FEMS Microbiology Letters, 39 (1985) 181-213.
[24] A. Veit, M.K. Akhtar, T. Mizutani, P.R. Jones, Constructing and testing the thermodynamic limits of synthetic NAD(P)H:H2 pathways, Microb Biotechnol, 1 (2008) 382-394.
[25] M.K. Akhtar, P.R. Jones, Construction of a synthetic YdbK-dependent pyruvate:H2 pathway in Escherichia coli BL21(DE3), Metab Eng, 11 (2009) 139-147.
[26] R.J. Booth, P.M. Grandison, R.L. Prestidge, J.D. Watson, The use of a 'universal' yeast expression vector to produce an antigenic protein of Mycobacterium leprae, Immunol Lett, 19 (1988) 65-69.
[27] T.J. Gardella, D. Rubin, A.B. Abou-Samra, H.T. Keutmann, J.T. Potts, Jr., H.M. Kronenberg, S.R. Nussbaum, Expression of human parathyroid hormone-(1-84) in Escherichia coli as a factor X-cleavable fusion protein, J Biol Chem, 265 (1990) 15.854-15.859.
[28] A. Bar-Even, E. Noor, N.E. Lewis, R. Milo, Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways, Proc Natl Acad Sci USA, 107 (2010) 8.889-8.894.
[29] I. Goldberg, J.S. Rock, A. Ben-Bassat, R.I. Mateles, Bacterial yields on methanol, methylamine, formaldehyde, and formate, Biotechnol Bioeng, 18 (1976) 1.657-1.668.
[30] N.R. Boyle, J.A. Morgan, Computation of metabolic fluxes and efficiencies for biological carbon dioxide fixation, Metab Eng, 13 (2011) 150-158.
[31] K.B. Andersen, K. von Meyenburg, Are growth rates of Escherichia coli in batch cultures limited by respiration?, J Bacteriol, 144 (1980) 114-123.

Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Una bacteria de Escherichia aislada que está genéticamente modificada para expresar formato deshidrogenasa dependiente de NAD que es capaz de oxidar el formato a dióxido de carbono; y formato-tetrahidrofolato ligasa.
2. Un cultivo que comprende la bacteria de Escherichia de la reivindicación 1 y un medio que comprende el formato.
3. Un método de generación de una bacteria de Escherichia genéticamente modificada que comprende expresar en la bacteria de Escherichia formato deshidrogenasa dependiente de NAD que es capaz de oxidar el formato a dióxido de carbono; y formato-tetrahidrofolato ligasa.
ES13759023T 2012-07-29 2013-07-29 Uso de la ruta reductora de la glicina para generar microorganismos formatótrofos y autótrofos Active ES2730377T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261676962P 2012-07-29 2012-07-29
PCT/IL2013/050643 WO2014020599A1 (en) 2012-07-29 2013-07-29 Use of the reductive glycine pathway for generating formatotrophic and autotrophic microorganisms

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2730377T3 true ES2730377T3 (es) 2019-11-11

Family

ID=49117916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13759023T Active ES2730377T3 (es) 2012-07-29 2013-07-29 Uso de la ruta reductora de la glicina para generar microorganismos formatótrofos y autótrofos

Country Status (5)

Country Link
US (2) US10155933B2 (es)
EP (2) EP2880155B1 (es)
DK (1) DK2880155T3 (es)
ES (1) ES2730377T3 (es)
WO (1) WO2014020599A1 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10155933B2 (en) 2012-07-29 2018-12-18 Yeda Research And Development Co., Ltd. Use of the reductive glycine pathway for generating formatotrophic and autotrophic microorganisms
US20150050708A1 (en) * 2013-03-15 2015-02-19 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for producing butadiene and related compounds by formate assimilation
WO2015087327A1 (en) * 2013-12-10 2015-06-18 Yeda Research And Development Co. Ltd. Use of enzymes which catalyze pyruvate synthesis from formate and acetyl-coa and bacteria expressing same
KR102000755B1 (ko) * 2016-12-27 2019-07-17 한국과학기술원 외부 유전자가 도입된 재조합 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 개미산과 이산화탄소로부터 유용물질을 제조하는 방법
WO2018124475A2 (ko) * 2016-12-27 2018-07-05 한국과학기술원 외부 유전자가 도입된 재조합 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 개미산과 이산화탄소로부터 유용물질을 제조하는 방법
US20240117386A1 (en) 2019-10-31 2024-04-11 Yeda Research And Development Co. Ltd. Engineered autotrophic bacteria for co2 conversion to organic materials
WO2021116330A1 (en) * 2019-12-10 2021-06-17 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Novel genetically engineered microorganism capable of growing on formate, methanol, methane or co2

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
DE10047264B4 (de) 2000-09-23 2006-05-04 G.A.S. Energietechnologie Gmbh Verfahren zur Nutzung von methanhaltigem Biogas
MX2010005061A (es) * 2007-11-10 2010-09-09 Joule Unltd Inc Organismos hiperfotosinteticos.
US8349587B2 (en) * 2011-10-31 2013-01-08 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods and systems for chemoautotrophic production of organic compounds
US10155933B2 (en) 2012-07-29 2018-12-18 Yeda Research And Development Co., Ltd. Use of the reductive glycine pathway for generating formatotrophic and autotrophic microorganisms
US20150050708A1 (en) 2013-03-15 2015-02-19 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for producing butadiene and related compounds by formate assimilation

Also Published As

Publication number Publication date
DK2880155T3 (da) 2019-07-15
EP3594331A1 (en) 2020-01-15
EP2880155A1 (en) 2015-06-10
WO2014020599A1 (en) 2014-02-06
US20190032027A1 (en) 2019-01-31
EP2880155B1 (en) 2019-04-17
US10377994B2 (en) 2019-08-13
US20150218528A1 (en) 2015-08-06
US10155933B2 (en) 2018-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Claassens et al. Replacing the Calvin cycle with the reductive glycine pathway in Cupriavidus necator
ES2730377T3 (es) Uso de la ruta reductora de la glicina para generar microorganismos formatótrofos y autótrofos
Panich et al. Metabolic engineering of Cupriavidus necator H16 for sustainable biofuels from CO2
Tashiro et al. Electrical-biological hybrid system for CO2 reduction
Liu et al. Third-generation biorefineries as the means to produce fuels and chemicals from CO2
Bar-Even et al. Design and analysis of metabolic pathways supporting formatotrophic growth for electricity-dependent cultivation of microbes
Yishai et al. The formate bio-economy
Liang et al. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis
Whitaker et al. Synthetic methylotrophy: engineering the production of biofuels and chemicals based on the biology of aerobic methanol utilization
Hawkins et al. Biological conversion of carbon dioxide and hydrogen into liquid fuels and industrial chemicals
Bar-Even et al. A survey of carbon fixation pathways through a quantitative lens
ES2580959T3 (es) Cepa de Methanothermobacter thermautotrophicus y variantes de la misma
Antonovsky et al. Engineering carbon fixation in E. coli: from heterologous RuBisCO expression to the Calvin–Benson–Bassham cycle
Hawkins et al. Extremely thermophilic routes to microbial electrofuels
US20240117386A1 (en) Engineered autotrophic bacteria for co2 conversion to organic materials
Chistoserdova Applications of methylotrophs: can single carbon be harnessed for biotechnology?
ES2697757T3 (es) Uso de enzimas que catalizan la síntesis de piruvato a partir de formiato y acetil-CoA y bacterias que expresan la misma
Claassens et al. Synthetic methanol and formate assimilation via modular engineering and selection strategies
Nagy et al. Application of gene-shuffling for the rapid generation of novel [FeFe]-hydrogenase libraries
US8637283B2 (en) Production of hydrocarbons in microorganisms
Higo et al. Anaerobic butanol production driven by oxygen-evolving photosynthesis using the heterocyst-forming multicellular cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120
US20100041121A1 (en) Metabolically engineered organisms for the production of hydrogen and hydrogenase
Zhong et al. Design and construction of artificial biological systems for one-carbon utilization
KR101743603B1 (ko) 개량된 슈와넬라 오네이덴시스로부터 아이소부탄올 생산 방법
US20230242947A1 (en) Genetically engineered rhodopseudomonas palustris