DE2548427A1 - Als einheit ausgebildete immunoanalysenausruestung in fester phase und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Als einheit ausgebildete immunoanalysenausruestung in fester phase und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Anwaltsakte 26 412
Be/Sch
Be/Sch
Monsanto Company St. Louis, Missouri / USA
"Als Einheit ausgebildete Immunoanalysenausrüstung in fester Phase und Verfahren zu ihrer Herstellung"
Die Radioimmunanalyse (ebenso RIA. bezeichnet) ist
ein sehr empfindliches Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern. So ge-
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ringe Mengen wie 10 g können festgestellt werden. Das
Verfahren beruht auf der Konkurrenz zwischen radiomarkiertem und nicht markiertem Antigen für eine fixierte und limi-
11-21-O24-3A GW . -2-
9 (089) 988272 Telegramme: BERGSTAPFPATENT München Banken: Bayerische Vereinsbank München 453lOO
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§09819/0009
254842?
tierte Menge Antikörper, wie von R. Yalow u.a. in J. Clin.
Invest., 39, 1157 (1960) beschrieben. Die Menge des nicht markierten Antigens beeinflußt die Verteilung des markierten
Antigens in Antikörper-gebundenes und Antikörper-freies markiertes Antigen. Das heißt, daß je mehr nicht markiertes
Antigen vorliegt, um so weniger markiertes Antigen die Möglichkeit hat, sich mit Antikörpern zu verbinden.
In den begleitenden Zeichnungen stellen die Figuren 1 bis Standardkurven dar, die durch Messen von Standardkonzentrationen
bestimmter Antigene nach der vorliegenden Erfindung erhalten wurden. In den Figuren 4 und 5 ist ein Untersuchungsrohrchen
der Untersuchungsausstattung nach der vorliegenden
Erfindung erläutert.
Unter der Bezeichnung "Ausrüstung", wie sie hier verwendet wird, ist eine Zusammenstellung aller oder einiger chemischer
Mittel, einschließlich der Untersuchungsrohrchen und der erforderlichen Anweisungen zur Durchführung einer Radioimmunanalyse
zu verstehen.
Die Bezeichnung "Antikörper" wird hier so verwendet, daß darunter eine Gruppe von Serumproteinen zu verstehen ist,
die ebenso als gamma-Globuline oder Immunoglobuline bezeichnet
werden, die spezifisch mit einem Antigen oder Hapten reagieren können. Die meisten dieser Antikörper gehören zu
der IgG-Klasse, während die anderen Klassen als IgA, IgM,
IgD und IgE bezeichnet werden. Die hier verwendete Bezeich-
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_ 3 —
nung beinhaltet ebenso bestimmte Bindeproteine, die bestimmte Antigene kenntlich machen, beispielsweise Proteine für
cyclisches AIiP und für Cortison.
Die Bezeichnung "Antigen" wird hier so verwendet, daß darunter eine Substanz zu verstehen ist, die mit einem Antikörper
reagieren kann. Antigene sind häufig dadurch gekennzeichnet, daß sie die Bildung eines Antikörpers einleiten
und mit diesem Antikörper reagieren. Es ist jedoch im Falle von "Haptenen" notwendig, daß diese mit einem Träger gekuppelt
sind, wie beispielsweise inerten adsorbierenden Partikeln, synthetischen Peptiden oder natürlichen Protein—
molekülen, um die Antikörperbildung einzuleiten. Zu Materialien, die herkömmlicherweise als Träger verwendet werden,
gehören beispielsweise die Albumine (Humaa-, Rinder- oder Kaninchen-), synthetische Peptide (beispielsweise Polylysin),
inerte adsorbierende Partikel (beispielsweise Dextran-beschichtete Holzkohle) und Polymerisate (beispielsweise PoIyvinylpyrollidon).
Es können jedoch die Haptene auch ohne einen Träger mit Antikörpern reagieren und sie können in
den Antigen-Antikörperreaktionsanalysen der vorliegenden Erfindung entweder mit oder ohne Träger verwendet werden.
Ein wesentliches Erfordernis für schlüssige Ergebnisse des Radioimmunanalysenverfahrens ist die Trennung des Antikörpergebundenen und Antikörper-freien Antigens. Durch die Entwicklung
verschiedener fester-Phasen-Verfahren ist eine schnelle und wirksame Trennung möglich. Bei der Analyse des
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festen Phasentyps ist der Antikörper oder das Antigen an ein Adsorbens gebunden oder fixiert, das die Abtrennung oder
Ausfällung gebundener oder freier Fraktionen erleichtert. Siehe beispielsweise K.J. Catt, U.S.-Patentschrift 3 64-6 34-6
und K. Catt u.a., Science, 158, 1570 (1967).
Die Antikörperverfahren in fester Phase verwenden Antikörper, die kovalent verbunden oder fixiert sind mit unlöslichen
Polymerisaten, kovalent vernetzt oder physikalisch adsorbiert art einem Material, wie beispielsweise Kunststoffen,
Glas oder frisch ausgefällten Metallen. Zu unlöslichen Trägern oder Immunoadsorbentien gehören Bentonitpartikel, Bromäthylcellulose,
vernetzte Dextrane (Sephadex) und geperlte Agarose (Sepharose).
Obgleich große Mengen an Antikörpern bei den Antikörpersystemen in der festen Phase erforderlich sind, haben sie
doch bestimmte Vorteile. Die Bindung des Antigens erfolgt schnell, ist tatsächlich nicht umkehrbar und die beiden
Phasen können durch einfaches Dekantieren oder durch Zentrifugieren bei niederer Geschwindigkeit voneinander getrennt
werden. In vielen Fällen können Antikörperlösungen zur Adsorption wiederverwendet werden.
Polymerisierte Antikörper, kovalent vernetzt mit Äthylchlorformiat
oder Glutaraldehyd, ermöglichen ein praktisches und genaues Verfahren für Analysen. Das Verfahrei>beinhaltet
jedoch das Zentrifugieren mir hoher Geschwindigkeit
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zur Ausfällung des Antigen-Antikörperkomplexes.
Das Antikörperverfahren in fester Phase durch Bindungsadsorption beinhaltet die Verwendung von Poly-(tetrafluoräthylen-g-aminostyrol)-("Protapol")-Pulver,
Poly-(tetrafluoräthylen-g-isothiocyanatstyrol)-Pulver
("Protapol DI/1") oder Polypropylen-beschichtete Scheiben und Polypropylenoder Polystyrol-Kunststoffröhren. Die Herstellung von Antikörper-beschichteten
Scheiben oder Röhren kann durch den PH-Wert , die Molarität, Temperatur und die Proteinkonzentration
der Inkubationslösung beeinträchtigt werden. Jedoch ermöglicht dieses Verfahren viele Bestimmungen schnell
durchzuführen und es ist sehr empfindlich und leicht reproduzierbar.
Bei einer Modifizierung des festen Phasenverfahrens, wie
von T. Goodfriend u.a., Immunochemistry, 6, 484· (1969) beschrieben,
verwendet man ein Acrylamidgel, das die Antikörper einzuschließen scheint, aber die Diffusion von Antigenen
mit niederem Molekulargewicht ermöglicht.
Weitere Informationen hinsichtlich der Radioimmunanalyse
sind bei D.S. Shelley u.a. Clin. Chem., 19, 146 (1973) zu
finden.
Während die Radioimmunanalyse ein wertvolles Verfahren in
der klinischen Praxis darstellt, ist ihre Verwendung relativ eingeschränkt. Ein Grund besteht dafür möglicherweise
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darin, daß es schwierig ist, sie durchzuführen, besonders bei einer Nicht-Routineuntersuchung. Weiterhin sind die im
Handel erhältlichen Ausrüstungen häufig unzuverlässig, haben geringe Stabilität und kurze Lagerdauer, sind schwierig
durchzuführen und benötigen für ihre Durchführung ein fachlich geeignetes Personal.
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, daß sie eine geeignete Vorrichtung für die Immunanalyse einer Komponente
der Antikörper-Antigenreaktion zur Verfügung stellt. Ein weiterer- Gegenstand der Erfindung ist eine verbesserte
Ausrüstung für das Radioimmunanalysenverfahren, das nicht die Nachteile der oben erwähnten bisherigen Verfahren aufweist.
Es wurde überraschend gefunden, daß man dies vorzugsweise dadurch erreichen kann, daß man alle zur Radioimmunanalyse
erforderlichen Reagentien in ein einziges Röhrchen in der
Weise einbringt, daß der Antikörper an wenigstens einen Teil der Oberfläche gebunden und das Antigen in fester Form
über wenigstens einen Teil der Oberfläche dispergiert, jedoch nicht damit, noch mit dem Antikörper verbunden ist.
Die als Einheit ausgebildete Radioimmunanalysen-Ausrüstung
in fester Phase hat verschiedene Vorteile gegenüber den anderen Radioimmunanalysen-Ausrüstungen. Hierzu gehört, daß
(1) der Techniker nicht mehr das radioaktive Material zum Kombinieren der Komponenten in dem Analysenverfahren ver-
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dünnen oder pipettieren muß, woraus sich eine erhöhte Sicherheit für das Untersuchungspersonal ergibt, (2) dieses
nicht mehr irgendein Material, ausgenommen die Probe des Patienten,verdünnen oder pipettieren muß, wodurch die Irrtumsmöglichkeit
verringert und die Untersuchungszeit verkürzt
wird und (3) die Stabilität und Lagerdauer erhöht ist.
Es ermöglicht daher die als Einheit ausgebildete Radioimmunanalysen-Ausrüstung in fester Phase der vorliegenden
Erfindung wesentliche Einsparungen an Zeit für das Laboratoriumpersonal,
an Ausrüstungskosten für das Laboratorium und Untersuchungskosten für den Patienten.
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Immunanalyse
einer Komponente der Antigen-Antikörperreaktion, bei der eine der Komponenten an eine feste Oberfläche gebunden und
eine der Komponenten markiert und in fester Phase aber ungebunden
vorhanden ist. Eine der Komponenten kann an eine Kunststoffoberfläche adsorbiert sein, während die andere
markierte Komponente in fester Phase an der Oberfläche, aber nicht mit dieser, noch mit den anderen Komponenten,
gebunden oder verbunden, dispergiert ist. In einer Hinsicht betrifft die Erfindung die Lagerung der Vorrichtung unter
einer inerten Atmosphäre vor ihrer Verwendung zum Erreichen einer guten Stabilität. In spezifischer Hinsicht ist
ein Antikörper an die feste Oberfläche adsorbiert und markiertes Antigen ist in fester Phase, aber nicht gebunden,
mit der Oberfläche vorhanden. Die Erfindung betrifft wei-
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terhin ein Verfahren zur Herstellung einer Analysenvorrichtung, wozu man eine Komponente an wenigstens einem Teil
einer Oberfläche aufträgt und bindet und dann die Oberfläche mit der markierten Komponente so in Kontakt bringt, daß
eine Dispersion der markierten Komponente in fester Phase übe:ijwenigstens einen Teil der Oberfläche gebildet wird. In
noch spezifischerer Hinsicht besteht das Verfahren darin, daß man eine Komponente aus einer Lösung auf die Oberfläche
als Schicht aufträgt und eine Lösung einer anderen Komponente in markierter Form einbringt und die Lösung einer schnellen
Gefriertrocknung unterwirft. Die Erfindung beinhaltet weiterhin ein Verfahren zur Analyse von Antigen oder Antikörpern,
bei dem man eine Oberfläche verwendet, die ausgestattet ist mit einer der Komponenten, die damit verbunden
sind, und einer markierten Komponente, die in fester Phase, jedoch ungebunden, vorhanden ist, wozu man die Oberfläche
mit einer Lösung, die die zur Bestimmung vorgesehene Komponente enthält, in Kontakt bringt, die Lösung von der
Oberfläche abtrennt und die markierte Komponente an der Oberfläche oder in der Lösung mißt. Das Verfahren beinhaltet
in einer noch spezifischeren Hinsicht, daß man ein Kunststoffuntersuchungsröhrchen (Schale oder Cuvette) vorsieht,
bei dem an einem Teil seiner Innenfläche Antikörper adsorbiert sind und radioaktiv markiertes Antigen in fester
Form, jedoch nicht verbunden, mit dessen Oberfläche oder mit den Antikörpern vorhanden ist und daß man die Innenoberfläche
mit einer Lösung, die die zur Bestimmung vorge-
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sehene Komponente enthält, in Kontakt bringt unter Bildung
eines Zweiphasensystems, das eine feste Phase (Untersuchungsröhrchen
und damit verbundenes Material) und eine flüssige Phase umfaßt, die beiden Phasen voneinander abtrennt
und die Strahlung von wenigstens einer dieser Phasen mißt. In diesem Verfahren, wie es gewöhnlich verwendet wird,
wird die Probe Antigen enthalten, sodaß die Menge der markierten, mit dem Feststoff verbundenen Komponente durch die
Konkurrenz zwischen dem markierten Antigen und dem Antigen in der Probe bestimmt wird. In weiterer Hinsicht kann das
Analysenverfahren so angesehen werden, daß es die Stufen,
der Herstellung der Analysenvorrichtung, wie oben beschrieben, umfaßt.
Die Erfindung beinhaltet die Verwendung einer gebundenen
Komponente und einer nicht gebundenen festen markierten Komponente in Nachbarschaft als Teile einer Analysenvorrichtung,
jedoch unter Vermeidung einer vorzeitigen Reaktion zwischen den Komponenten. Die Analyse hängt natürlich
von der Tatsache ab, daß die Komponenten, d.h. ein gebundener Antikörper und ein markiertes Antigen, reagieren können.
Es wurde festgestellt, daß es erreichbar ist, das markierte
Antigen in festem Zustand an der gleichen Oberfläche
wie den gebundenen Antikörper vorhanden zu haben, ohne daß eine Bindung oder Reaktion eintritt, die eine geeignete
Analyse verhindern würde. Die Tatsache, daß derartige Komponenten zusammen in einer Analysenvorrichtung vorverpackt
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werden können, erhöht wesentlich die Zweckmäßigkeit der Verwendung einer derartigen Analysenvorrichtung. Zur Verwendung
ist es nur notwendig, die Probe des Patienten, die die zur Bestimmung vorgesehene Komponente enthält, zuzugeben.
Nach einer geeigneten Inkubationsdauer kann eine vollständige und schnelle Abtrennung der gebundenen Komponente,
sowohl der markierten als auch nicht markierten, von der freien Komponente durch Dekantieren und Waschen erzielt
werden, sodaß die Aktivität der festen Phase gemessen werden kann, wobei der Wert der Aktivität eine Funktion der
Konzentration der zur Bestimmung vorgesehenen Komponente in der Probe ist.
Es wurde gefunden, daß eine gewöhnliche relativ glatte und undurchdringliche feste Oberfläche beider Analysenvorrichtung
verwendet werden kann, wie (unter Druck) geformte KunststoffOberfläche, beispielsweise Oberflächen, wie sie
in gewöhnlichen Kunststoff-Laboratoriums-Untersuchungsröhrchen anzutreffen sind, und daß eine Flüssigkeit in
zweckmäßiger Weise von der Oberfläche durch einfaches Dekantieren abgetrennt werden kann, ohne daß man Zentrifugieren,
Absaugen oder ähnliche Verfahren anwenden muß. Die zur Herstellung der Analysenvorrichtung verwendeten Verfahren
machen es möglich, die markierte Komponente in fester Form auf der Oberfläche anzubringen, ohne daß eine Reaktion eintritt,
besonders durch Verfahren, bei denen die Oberfläche auf niedere Temperaturen, die nahe dem Gefrierpunkt liegen,
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vorgekühlt wird, bevor man den Kontakt mit der Lösung der markierten Komponente herstellt, und bei dem die Lösung
dann schnell gefroren wird, wie beispielsweise durch schnelles Abkühlen auf Temperaturen von -50°C oder darunter. Sowohl
die niedere Temperatur als auch die schnelle Umwandlung in die feste Form tragen zum Vermeiden der Reaktion
bei. Nach Lyophilisieren ist die markierte Komponente als Feststoff, dispergiert über die Oberfläche des Untersuchungsröhrchens,
vorhanden. Es kann eine gewisse Anziehung zwischen der Oberfläche und der markierten Komponente vorliegen,
die markierte Komponente ist aber in dem Sinne ungebunden, daß sie leicht von der Oberfläche unter Anwendung
von Flüssigkeiten, wie Probenlösungen, entfernt werden kann.
Die als Einheit ausgebildete Radioimmunanalysen-Ausrüstung in fester Phase der vorliegenden Erfindung ist besonders
geeignet zur Bestimmung jeder Komponente der Antigen-Antikörperreaktion.
Während die Erfindung aus Zweckmäßigkeitsgründen in besonderer Weise im Hinblick auf die Bestimmung
der Antigenkomponente erläutert wird, ist darauf hinzuweisen, daß das Verfahren in ähnlicher Weise anwendbar ist
zur Bestimmung von Antikörpern. In ähnlicher Weise wird das Untersuchungsröhrchen für die Zwecke der beispielhaften
Beschreibung der festen Oberflächen des Bindematerials verwendet,
wobei jedoch andere Formgebungen der Oberflächen verwendet werden können.
Bei der Durchführung des Herstellungsablaufs der vorliegen-
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den Erfindung kann das nachfolgende Verfahren verwendet
werden. Die innere Oberfläche eines Untersuchungsröhrchens
aus einem Material, das geeignet ist, Antikörper gegen das zu bestimmende Antigen zu binden, wird mit einer verdünnten
Lösung von Antikörpern (Antiserum) in Kontakt gebracht. Die Flüssigkeit wird durch Absaugen entfernt und die Röhrchen
nacheinander mit einer verdünnten Lösung von Natriumbicarbonatpuffer,
einer verdünnten Lösung, die Natriumphosphat und eine geringe Menge reines Protein enthält, um die nicht
spezifische Bindung des Antigens zu verringern, und schließlich einer verdünnten Lösung von Natriumphosphatpuffer gewaschen.
Die Bezeichnung "reines Protein" oder vereinfachend "Protein"
wird hier so verwendet, daß darunter Proteine und Polypeptide zu verstehen sind, die frei sind von Verunreinigungen
und es ist bei der Durchführung zweckmäßig, derartige reine Materialien zu verwenden, um unnötige beeinträchtigende
Faktoren zu vermeiden.
Nach der Beendigung der Waschvorgänge werden die Röhrchen
auf eine Temperatur zwischen etwa -100G und etwa 5°C gekühlt
und hierzu eine verdünnte Lösung des radioaktiven Antigens zugegeben. Der Inhalt wird bei einer festen Kohlendioxidtemperatur,
etwa -780C, sehr schnell, vorzugsweise innerhalb von 5 bis 15 Sekunden, gefroren. Die Lyophilisierung
der Röhren während etwa 8 bis 16 Stunden beendet
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den Herstellungsablauf. Die Röhrchen können sicher in einer inerten und feuchtigkeitsfreien Atmosphäre, wie beispielsweise
in Stickstoff, mehrere Monate oder mehr ohne einen bedeutenden Verlust an Aktivität gelagert werden. Die Temperatur,
bei der die Röhren sicher gelagert werden können, liegt im Bereich von unter O0C bis etwa 400C oder sogar
höher. Ein zweckmäßiger Temperaturbereich ist jedoch etwa 40C bis etwa 25°C.
Die als Einheit ausgebildete Radioimmunanalysen-Ausrüstung in fester Phase der vorliegenden Erfindung ist wenigstens
fünf Monate stabil, wie sich dies aus dem Verlauf der Standardkurve
bei Zeituntersuchungen ergibt, die dann abgebrochen wurden. Der Verlauf der Standardkurve senkt sich
während lang dauernder Lagerung, aber niemals auf einen Punkt, daß die Röhrchen nicht weiterhin für eine gute Analyse
geeignet wären. Beispielsweise wurde im Falle von Digoxin eine Standardserumreferenzprobe von 3i3 Nanogramm
pro ml jede Woche über zwei Monate lang untersucht. Der während dieser Zeit erreichte Durchschnittswert betrug 3,1
Nanogramm pro ml mit einer Standardabweichung von 0,3 und einem Schwankungskoeffizienten von 9,6$. Natürlich müssen
Toleranzen für den normalen radioaktiven Zerfall vorgesehen werden. Das Antigen kann iijnerkömmlicher Weise mit irgendeinem
Markierungsmaterial, das für Immunanalysen geeignet ist, beispielsweise mit radioaktiven Isotopen, Enzymen,
fluoreszierenden Gruppen und Spin. -Markierungsgruppen mar-
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kiert werden. Zu den häufig für diesen Zweck verwendeten
Isotopen gehören Jod-125 (J125), Jod-131 (J151)» Kohlenstoff-14
(C ), und Wasserstoff-3 (H*), allgemein als
Tritium bekannt. Eine besonders geeignete radioaktive Iso-
12S
topenmarkierung ist J .Es hat eine Halbwertzeit von etwa 60 Tagen und reagiert leicht mit den meisten Antigenen. Es
topenmarkierung ist J .Es hat eine Halbwertzeit von etwa 60 Tagen und reagiert leicht mit den meisten Antigenen. Es
3 hat weiterhin eine höhere spezifische Aktivität als H ,
C oder J . Weiterhin hat es eine geringere gamma-Ener-
AZ,A
gie als J^ und das Fehlen von beta-Strahlung verringert
das Potential zur Selbstkennzeichnung des markierten Antigens.
Einige Analysen von erwiesenem klinischem Viert, die typisch sind für solche Untersuchungen, für die das Einstufensystem
in fester Phase mit Einzelröhre nach der vorliegenden Erfindung geeignet ist, sind in der Tabelle I angegeben.
Tabelle I
Einige AisLysen von nachgewiesenem klinischem Wert
Peptid- und Proteinhormone Hypophysenvorderlappen Luteinisierungshormon (LH);
Reifungshormon (FSH) ; ThyroieL-stimulierendes
Hormon (TSH); Wachstumshormon (HGH); Prolactin; Corticotrophin (ACTH)
Hyp ophysenhinterlappen Arginin-vasopressin (AVP)
Parathyroid Parathyroidhormon (PTH)
-15-
Pankreas Placenta
Andere
Insulin
Humanpiacentares Lactogen (HPL);
Humanchoriongonatropin (HGG) Angiotensin I und II; Renin;
Gastrin
Plasmaprot eine
Mikrobenantigene
Spezifische Tumorantigene
Immunoglobulin (IgE); Fibrinogen;
andere Gerinnungsfaktoren
Mit Hepatitis in Verbindung stehende Antigene
alpha-Fetoprotein; Carcinoembryonantigen
Mit Hepatitis in Verbindung stehende Antigene
alpha-Fetoprotein; Carcinoembryonantigen
Thyroid Adrenal
Gonadal
Arzneimittel Andere
Thyroxin (T^); Trijodthyromin (T^)
Cortison-deoxycorticosteron; Aldosteron;
Testosteron; Progesteron; verschiedene Oestrogene
Weitere Haptene
Weitere Haptene
Digoxin; Morphin; Cannabis (Hanf); Diphenylhydant oin
Folsäure; cyclisches Adenosinmonophosphat (G-AMP); Vitamin Vitamin D
Folsäure; cyclisches Adenosinmonophosphat (G-AMP); Vitamin Vitamin D
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Die vorliegende Erfindung beinhaltet ebenso ein Verwendungsverfahren.
Dieses Verfahren besteht darin, daß man die nicht markierten Antigenkomplexlosungen und die Standard-Referenzprobenlösungen
in die Analysenröhrchen gibt, sie gewünscht
lange bei der gewünschten Temperatur bebrütet, wäscht, die Lösungen entfernt und die Radioaktivität der gebundenen
markierten Antigenprobe in einem analytischen gamma-Spektrometer zählt. Wahlweise wird die Aktivität der Lösung gezählt.
Die Anzahl der Zählungen pro Zeit der Standardröhrchen wird umgewandelt in Prozent gebundenes (#B) Antigen-
125
J J bezogen auf die Gesamtmenge den Röhrchen zugeführtes
J J bezogen auf die Gesamtmenge den Röhrchen zugeführtes
125
Antigen - J . Die erhaltenen Prozentsätze werden zur Bildung
der Standardkurve aufgetragen, wie dies in den Figuren 1,2 und 3 dargestellt ist. Aus der Standardkurve kann
die Antigenkonzentratxon in der unbekannten Probe leicht durch unmittelbaren Vergleich bestimmt werden.
In den begleitenden Zeichnungen sind Beispiele von Standardkurven gezeigt, die bei der Durchführung der vorliegenden
Erfindung bestimmt wurden. Es folgt eine kurze Beschreibung der verschiedenen Figuren:
Figur 1 zeigt eine Standardkurve, die man dadurch erhält, daß man den Prozentsatz gebundenes Digoxin-J ^ an der
Ordinate gegen den Logarithmus der Konzentration von Digoxin in Nanogramm pro ml an der Abszisse aufträgt (siehe nachfolgendes
Beispiel 1);
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Figur 2 zeigt eine Standardkurve, die man dadurch erhält,
daß man den Prozentsatz gebundenes (cyclisches Adenosinmonophosphat)-J12^
/Cc-AMP)-^ _7 an der Ordinate gegen
den Logarithmus der Konzentration von C-AMP in Picomol pro ml an der Abszisse aufträgt (siehe nachfolgendes Beispiel
2) und
Figur 3 zeigt eine Standardkurve, die man dadurch erhält,
daß man den- Prozentsatz gebundenes (Humanwachstumshormon)-J^
/CHGH)-J _7 an der Ordinate gegen den Logarithmus
der Konzentration von HGH in Nanogramm pro ml an der Abszisse aufträgt (siehe Beispiel $).
Im allgemeinen beruht die Analysenvorrichtung der vorliegenden Erfindung auf der Konkurrenz zwischen einer markierten
Komponente und einer Komponente der Probe, die durch eine Komponente gebunden werden sollen, die mit der festen
Oberfläche verbunden ist. Es ist daher die gebundene Kom-
• ponente in einer zur Bindung der Probenpomponente und markierten
Komponente nicht ausreichenden Menge vorhanden.
Die geeigneten Mengen der Komponenten für ein solches Verhältnis können leicht durch Versuche und Ermitteln
der Fehlergrenzen bestimmt werden. Für eine zweckmäs-
125 sige Ablesung ist besonders bei J ^ eine Strahlung mit
einer Zählrate im Bereich von 2000 bis 60 000 Impulsen pro Minute (Counts/Min^' (C/Min.) geeignet. Die Menge der markierten
Komponente von 10 000 C/Min. bei Beginn der üntersuchung sorgt für eine geeignete Flexibilität, und es isir
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oftmals wünschenswert sein, viel Höhere Mengen zu verwenden,
um Analysenröhrchen herzustellen, die den radioaktiven
Zerfall während einer längeren Lagerzeit erlauben. Die radic aktiv markierte Komponente in Lösung kann so verdünnt werden,
daß etwa 1/10 ml die geeignete Menge für die gewünschte Zählrate C/Min. enthält, und der 1/10 ml kann dann dem
Untersuchungsrohrchen zum Zwecke der Beschichtung zugeführt
werden. Die Menge der gebundenen Komponente in dem Untersuchungsrohrchen
kann so eingestellt werden, daß eine wesentliche Fraktion der markierten Komponente, etwa 40 bis
60$, gebunden werden kann, obgleich andere Mengen, wie Mengen von 20 bis 80$ oder sogar breitere Bereiche, verwendet
v/erden können. Eine Menge, die zur Bindung von etwa 5C$ äer
markierten Komponente führt, ermöglicht das Analysenverfah—
ren flexibel durchzuführen. Beispielsweise ist für Digoxinbestimmungen
etwa 1 Picogramm Digoxin-Antikörper, gebunden in dem Untersuchungsrohrchen, eine zweckmäßige Menge. Das
Analysenverfahren wird dann gewöhnlich für Analysen von Proben verwendet, die Konzentrationen der unbekannten Komponente
enthalten, sodaß man Prozentsätze der gebundenen markierten Komponente im Bereich von 10 bis 20 bis zu 50
oder etwa' % erhält, je nach der besonderen unbekannten Komponente
und der Breite des Bereichs, in dem sie gewöhnlich in der biologischen oder anderen, zur Analyse aiEbehenden
Flüssigkeit auftritt. Wenn gewünscht, kann die zur Analyse vorgesehene Flüssigkeit verdünnt oder konzentriert werden,
um die Konzentration für eine geeignete Bestimmung einzu-
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stellen. Jedoch liegt beispielsweise der normale Serumbereich für Digoxin bei digitalisierten Patienten im Bereich
von 0,8 bis 2,4 Nanogramm pro ml und der toxische Bereich von 2,4 bis 8,5 Nanogramm pro ml, sodaß ein wirksamer Analysenbereich von 0,2 bis 10 Nanogramm pro ml geeignet
ist.
Zur Herstellung der hier vorgesehenen Analysenvorrichtung sollten bestimmte fixierte Mengen der Komponenten verwendet
werden, wobei es erwünscht ist, Standardverfahren für
Aufbereitungen zu verwenden, um Analysenergebnisse zu erhalten, die sich zu Vergleichszwecken mit Bezugssystemen,
usw. eignen, wie dies dem Fachmann bekannt ist. Nachdem daher geeignete Mengen bestimmt sind, sollten die gleichen bestimmten
Mengen für einen jeweiligen Satz Untersuchungsröhrchen
vorgesehen werden. Solche Aufbereitungen können nach den hier erläuterten Verfahren hergestellt werden. Es
ist nicht notwendig, die Mengen numerisch, wie beispielsweise durch Analyse, zu bestimmen, da solche Mengen unter
Verwendung besonderer Aufbereitungsverfahren festgelegt
werden können. Beispielsweise können geeignet identische Mengen an Antikörpern in einem Satz von Röhrchen dadurch
erhalten werden, daß man die gleiche Menge verdünntes Antikörperserum einführt, eine Standardzeit bebrütet, absaugt
und wäscht. Das Absaugen des Serums hinterläßt einen Film und die Menge der auf diese Weise adsorbierten Antikörper
ist gewöhnlich so gering, daß ein Antikörperserum von aus-
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reichender Konzentration so verwendet werden kann, daß das abgesaugte Serum zur Beschichtung weiterer Röhrchen verwendet
werden kann. Die markierte Komponente, wenn sie in einer geringen Menge Flüssigkeit zugeführt wird, wird gewöhnlich
so eingeführt, daß sie auf den Teil des Röhrchens beschränkt wird, der vorausgehend mit Antikörpern beschichtet wurde.
Es kann jedoch die markierte Komponente auch an einem anderen Teil des Röhrchens oder an irgendeiner anderen Oberfläche
vorhanden sein, solange sie für den Kontakt mit der Probenlösung vorhanden ist und zur Verfügung steht, wenn
diese in das Röhrchen eingeführt wird.
In den hier beschriebenen Verfahren werden puffernde Proteinbeschichtungslösungen
und andere dem Fachmann bekannte Hilfsmittel verwendet, wobei deren Definition in dieser Hinsicht
für die Erfindung nicht wesentlich ist. Geeignete puffernde und ähnliche Lösungen werden sich mit dem jeweiligen Antikörper-Antigensystem,
wie dies dem Fachmann bekannt ist, ändern. Der Zweck der Verwendung von Protexnbeschichtungen,
wie beispielsweise von Serumalbumin, ist die nicht-spezifische Bindung von ungebundenen Komponenten während der Analyse
zu begrenzen, wobei jedoch dieser individuelle Gegenstand als solcher alt und dem Fachmann bekannt ist. Darüberhinaus
können jedoch Toleranzen für nicht-spezifische Bindungen beim Eichen der Analysen vorgesehen werden. Weiterhin
haben einige Komponenten, wie beispielsweise Digoxin, nur sehr geringe Neigung an Kunststofflächen zu adsorbieren
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und es bringt daher in solchen Fällen die Verwendung von
Beschichtungen zum Vermeiden nicht-spezifischer Bindungen
nur wenig Nutzen. Protein oder andere verwendete maskierende Beschichtungen können im wesentlichen die in Betracht
kommenden Oberflächen abdecken, jedoch ist dies nicht wesentlich, da nur die nicht-spezifische Bindung verringert
werden soll und es nicht notwendig ist, sie vollkommen zu eliminieren. Darüberhinaus ist, wenn hier in allgemeiner
Weise Materialien angesprochen werden, die mit Oberflächen von Untersuchungsrohrchen oder anderen Substraten verbunden
sind oder mit diesen in Kontakt stehen, dies so zu verstehen, daß intermediäre Schichten oder Teile derselben
oder Partikel zwischen der Oberfläche und den in Betracht kommenden Materialien vorliegen können und es wird eine
blanke Oberfläche oder eine solche, die verschiedene Schichten enthält, in gleicher Weise hier als Oberfläche bezeichnet.
Die hier verwendeten Puffer, Waschlösungen usw. werden als biologisch geeignete Träger und dergleichen verwendet, die
die Wirksamkeit und die Eigenschaften der in Betracht kommenden Komponenten erhalten. In ähnlicher Weise sind häufig
pharmazeutisch verträgliche Träger und mild basische Puffer im allgemeinen für die hier vorgesehenen Zwecke geeignet.
Die markierte Komponente der vorliegenden Erfindung wird
im allgemeinen durch das hier beschriebene schnelle Ge-
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frier- und Lyophilisierungsverfahren eingeführt. Es ist
dies ein sehr geeignetes Verfahren, um die markierte Komponente, ohne daß eine Reaktion derselben eintritt, einzuführen.
Jedoch können auch andere Verfahren verwendet werden, die sicherstellen, daß die markierte Komponente in
fester ungebundener und nicht reagierter Form vorliegt. Theoretisch könnte die Komponente als festes Pulver zugegeben
werden, jedoch wäre dies nicht praktisch, weil Probleme hinsichtlich des Messens der sehr geringen Mengen eintreten
wurden. Weiterhin kann die markierte Komponente gelöst in einem nieder siedenden Lösungsmittel, das dann
schnell verdampft wird, eingeführt werden. In Abhängigkeit von der Aktivität der jeweiligen Antikörper-Antigenreaktion
kann die Verdampfung schnell genug erfolgen, um eine wesentliche Reaktion zu vermeiden. Vakuum kann zweckmäßigerweise
verwendet werden, um die Verdampfung zu unterstützen. Alkohole können als Lösungsmittel in solchen Verfahren dienen,
vorausgesetzt daß die Löslichkeit ausreichend ist und keine Denaturierung erfolgt. Im allgemeinen können nieder
siedende Lösungsmittel, die die markierte Komponente ohne Änderung ihrer Eigenschaften lösen, verwendet werden. Jedoch
ist es gewöhnlich zweckmäßiger und zufriedenstellender, Schnellgefrier- und Lyophilisierungsverfahren, wie hier beschrieben,
zu verwenden.
Es wurde gefunden, daß die hier beschriebenen Analysenvorrichtungen,
bei denen sowohl Antikörper als auch Antigen
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in festen Zustand vorhanden -und eines von diesen markiert
ist, nicht nur zur Verwendung und Vorausaufbereitung geeignet
und fähig, sondern auch erstaunlich bei Lagerung über längere Zeit stabil sind. Es ist möglich, diese Vorrichtungen
bis zu drei oder sechs Monate oder mehr in einer inerten Atmosphäre, zum Beispiel unter Stickstoff, und ohne
Feuchtigkeit zu lagern. Es wurde weiterhin gefunden, daß niedere Temperaturen für eine solche Stabilität nicht notweidLg
sind, da Temperaturen wie 25°C und 37°C zur Lagerung als geeignet befunden wurden. Es ist daher möglich durch
Vakuumverpackung, hermetischem Verschluß, usw. die Analysenvorrichtungen der vorliegenden Erfindung in ungekühlten
Packungen zu versenden und ihre Wirksamkeit trotz möglicherweise langer Beförderungsverzögerungen, usw. beizubehalten.
Als Vorsichtsmaßnahme kann es wünschenswert sein, die Analysenvorrichtungen gekühlt zu halten, möglicherweise nahe
dem Gefrierpunkt oder etwa 40C, jedoch ist die Stabilität
bei gewöhnlichen Temperaturen noch vorteilhaft, da die Analysenvorrichtungen möglicherweise solchen Temperaturen
vor der Verwendung ausgesetzt sein können oder wegen des wirtschaftlichen Vorteils, daß sie ohne Kühlung zum
Versand gebracht werden können. Die Untersuchungsröhrchen
können einzeln unter Vakuum oder Stickstoff verschlossen werden, wozu man Abdicht- oder Verschlußvorrichtungen verwendet,
die üblicherweise verwendet werden, um den Inhalt von Untersuchungsröhrchen oder Ampullen gegenüber der Atmosphäre
zu schützen. Die einzelnen Röhrchen können dann
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in geeigneter Weise in einem geschlossenen Behälter verpackt werden, der zusätzlich zu den Analysenrohrchen Antigen-
oder Antikörper-Standardlösungen und Anweisungen zur Verwendung enthalten kann. Gummi oder ähnliche Verschlußmittel
können beispielsweise zum hermetischen Abschließen der Röhrchen verwendet werden. Ein zweckmäßiges Verschlußmittel
ist ein geschlitzter Gummipfropfen, der so in das Röhrchen
eingefügt werden kann, daß der Schlitz oder die Schlitze Zugang zum Inneren ermöglichen. Ein Satz von Röhrchen,
die solche Pfropfen aufweisen, kann in Behältern unter Stickstoff angeordnet werden und es verschließt dann eine
Druckleiste die Pfropfen vollständig unter Bildung eines hermetischen Abschlußes und der Behälter kann weiterhin unter
Stickstoff verschlossen werden.
Der größte Teil der Beschreibung betrifft in besonderer Weise ein System, bei dem der Antikörper an eine unlösliche
Oberfläche gebunden, das Antigen markiert ist und die Antigenmenge
in einer unbekannten Probe bestimmt wird. Es beinhaltet jedoch die Erfindung ebenso Vorrichtungen und Verfahren
für andere Bestimmungen, beispielsweise Vorrichtungen, bei denen Antigen an eine Oberfläche gebunden und
markierte Antikörper in fester Form aber ungebunden vorliegen,
sowie die Verwendung derartiger Vorrichtungen zur Analyse von Antikörpern in einer Probe. Beispielsweise kann
Human-Wachstumshormon (HGH) als Schicht auf ein Polystyrolröhrchen
aus einer Lösung nach den hier beschriebenen Ver-
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fahren, zur Beschichtung mit Antikörpern, aufgetragen werden und Antikörper, die man aus HGH-Antiserum erhalten hat, können
radiojodiert und in das Untersuchungsröhrchen nach den
Schnellgefrier- und Lyophilisierungsverfahren, wie sie hier
beschrieben wurden, eingeführt werden und es wird dann das Untersuchungsröhrchen HGH gebunden an die Oberfläche des
Röhrchens und die festen markierten Antikörper ungebunden
enthalten.
Die Analysenvorrichtung der vorliegenden Erfindung wird im allgemeinen verwendet, um die Komponente der Antigen-Antikörperreaktion,
die markiert ist, zu bestimmen, sie kann aber auch zum Messen der anderen Komponente verwendet v/erden.
Beispielsweise kann bei gebundenen Antikörpern und markiertem Antigen eine Probe unbekannter Antikörper eingeführt
werden und das markierte Antigen wird sich dann als solches über den gebundenen Antikörper und den freien Antikörper
verteilen und es können dann die festen und^flüssigen
Phasen getrennt und die Markierung von wenigstens einer derselben gemessen werden. Bei diesem Verfahren werden sich
die Konzentrationen insoweit unterscheiden, als die Menge an markiertem Antigen nicht ausreichend sein sollte, um
mit den gesamten Antikörpern zu reagieren. Wenn die Analysenvorrichtung so hergestellt wurde, daß die Antikörper
ausreichend sind, um 50$ des markierten Antigens zu binden,
können die Antikörperproben bei einer solchen Verdünnung verwendet werden, daß ihre Antikörper im Überschuß gegen-
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über den gebundenen Antikörpern der Analysenvorrichtung vorliegen und das markierte Antigen wird dann nicht ausreichend
sein, mit allen Antikörpern zu reagieren, was man zu erreichen wünscht.
In ähnlicher Weise kann, wenn das Antigen gebunden und markierter Antikörper vorhanden ist, die Vorrichtung dazu
verwendet werden, Antigen in einer Probe zu bestimmen unter Verteilung des markierten Antikörpers selbst zwischen
gebundenem Antigen und freiem Antigen, wobei die oben beschriebenen Trenn- U.Meßverfahren verwendet werden. Der markierte
Antikörper wird in einer Menge verwendet, die nicht ausreichend ist, um mit dem gesamten Antigen, das in gebundener
und freier Form vorliegt, zu reagieren.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet weiterhin Verfahren,
bei denen eine gebundene Komponente mit der gleichen markierten aber ungebundenen Komponente kombiniert wird und
das verwendet wird, die Oppositionskomponente in einer Probe zu messen. Beispielsweise kann Antikörper auf ein Untersuchungsröhrchen
als Schicht aufgetragen und der gleiche radioaktiv markierte Antikörper kann dann durch Schnellgefrier-
und Lyophilisierungsverfahren, wie hier beschrieben,
zugegeben werden. Eine Serumprobe, die das entsprechende Antigen enthält, kann dann eingeführt werden und
es wird dann das Antigen sowohl mit dem gebundenen Antikörper als auch mit dem markierten Antikörper reagieren,
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wodurch ein Teil des markierten Antikörpers durch unmittelbare Bindung desselben an die Oberfläche des Untersuchungsröhrchens
immobilisiert und dadurch die übliche Abtrennung der festen und flüssigen Phasen und Bestimmung der markierten
Antikörper in einer oder beiden ermöglicht wird. Diese Verfahrensweise kann dann besonders brauchbar sein, wenn
ein Antigen nicht einfach isoliert und radioaktiv markiert werden kann und es findet Verwendung bei Analysen solcher
Antigene, wie dem Hepatitisantigen, usw. In ähnlicher Weise kann dieses Verfahren mit gebundenem Antigen und freiem
markiertem Antigen verwendet werden, um die Antigenmenge in einer Probe zu messen. Bei solchen Verfahren sollten
sowohl die gebundenen als auch die markierten Komponenten der Analysenvorrichtung gegenüber den Mengen im Überschuß
sein, die zur Umsetzung mit der Komponente in der Probe erforderlich sind.
Für die Aufbereitungen und Analysen der vorliegenden Erfindung wird es zweckmäßig sein, wäßrige Medien, die die
angegebenen Komponenten enthalten, zu verwenden und zwar aus Loslichkeitserwagungen und der Tatsache, daß biologische
Probenflüssigkeiten und dergleichen im allgemeinen wäßrig sind. Es können jedoch auch andere Flüssigkeiten
verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Komponenten darin löslich sind und daß sie nicht mit den Komponenten
reagieren oder sie beeinflussen.
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In der vorliegenden Erfindung ist eine der Komponenten
der Antigen-Antikörperreaktion an die Oberfläche eines unlöslichen Feststoffs gebunden, der gewöhnlich ein wasserunlöslicher
Feststoff ist, sofern wäßrige Medien im allgemeinen verwendet werden. Die Bindung kann chemischer, physiialisch-chemischer
oder physikalischer Art sein und sie kann mittels covalenter chemischer Bindungen oder durch
Adsorption erfolgen und es kann jedes unlösliche feste Material, das zu einer solchen Bindung geeignet ist, verwendet
werden, wobei beispielsweise solche Oberflächen verwendet werden wie frisch ausgefällte Metalle wie Chrom und
Tantal, Glas und polymere Kunststoffe, einschließlich Kohlenwasserstoffpolymerisaten
und Polyolefinen wie Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen und Polymerisaten wie
Nitrocellulose, Mischpolymerisaten von Acrylnitril mit Styrol wie Poly-(styrol-co-Acrylnitril), Poly-tetrafluoräthylen,
Polytetrafluoräthylen-Styrol, Polytetrafluoräthylen-Isothiocyanatstyrol,
usw. Es wurde festgestellt, daß
einfache polymere Kunststoffröhrchen, wie Polystyrolröhrchen,
eine ausreichende Bindung ermöglichen und andere · Kunststoffe in ähnlicher Weise Antikörper adsorbieren, sodaß
es im allgemeinen nicht erforderlich ist, Materialien mit reaktionsfähigen Gruppen zu verwenden, wie -NCS-Gruppen
an Isothiocyanat-Styrol-gepfropftem Polytetrafluorathylen,
wobei jedoch derartige Materialien mit reaktionsfähigen Gruppen, wenn gewünscht, verwendet werden können. Metalle
liefern schwache Ergebnisse, wenn die Oberfläche mit einem
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Oxidfilm abgedeckt ist. Glasmaterialien können eine Spezialbehandlung
oder Selektion, wie bei Verwendung von Quarzglas, oder die Verwendung von Kupplungsmittel oder dergleichen
erforderlich machen, um eine geeignete Bindung zu erzielen.
Die als Einheit ausgebildete Radioimmunanalysen-Ausrüstung
in fester Phase der vorliegenden Erfindung kann so modifiziert werden, daß ein vollständig automatisches Modell hergestellt
wird. Beispielsweise kann anstelle der einzelnen Röhrchen ein kontinuierliches Kunststoffband zur Aufnahme
der Analysenreagentien in eingepreßten Flecken auf dem Band verwendet werden, wobei die Proben und Standardlösungen
automatisch auf den Gurt aufgetragen und der Gurt durch eine Bebrütungs-, Wasch- und Zählvorrichtung mit automatischem
Ausdrucken der Ergebnisse geleitet wird.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Herstellung
und des VerwendungsVerfahrens der als Einheit ausgebildeten
Radioimmunanalysen-Ausrüstung in fester Phase
der vorliegenden Erfindung.
Einheits-Radioimmunanalysen-Ausrüstung in fester Phase für Digoxin
Verwendet wurde Digoxinantiserum von dem Collaborative
Research, Waltham Massachusetts; kodiertes Digoxinderivat
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von Schwartz-Mann, Qrangeburg, New Jersey; und Polystyrol-Versuchsröhrchen
(#2052) von Falcon Plastics, Los Angeles, California.
Ein kleiner Teil der Innenseite der Polystyrolrohrchen
wurde durch Einführung von 200 Mikroliter Digoxinantiserum
(Verdünnung 1:5000 mit einer Lösung von 0,05 Molar iSiatriumbicarbonat,
p„ 9,6) am Boden beschichtet und 1 bis 3 Stunden
bei einer Temperatur zwischen etwa 200C und etwa JO0C
bebrütet. Nach Absaugen der Flüssigkeit werden die Röhrchen nacheinander mit Bicarbonatpuffer, einem 0,05 Molar Natriumphosphat,
0,02 Molar Dinatriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure
(Na2EDTA)-Lösung, die Λ% Rinderserumalbumin
zur Verringerung der nicht spezifischen Bindung des Antigens enthält, und schließlich mit 0,05 Molar Natriumphosphatpuffer
allein gewaschen. Das kodierte Digoxinderivat wurde 1:5 in Phosphatpuffer verdünnt und 100 Mikroliter
(7200 Impulse pro Minute (c/Min.)) wurden den Röhren zugegeben, wobei sie vorausgehend auf etwa O0C in einem Eisbad
gekühlt wurden. Der Inhalt wurde sofort (innerhalb 5 bis 15 Sekunden) in festem Kohlendioxid gefroren. Die Röhrchen
wurden 8 bis 16 Stunden lyophilisiert und schließlich ohne Luft und Wasser unter Phosphorpentoxid und Stickstoff in
kleinen Trocknern gelagert,ein Satz bei 4-0C und ein weiterer
bei 25°C, wobei keiner dieser Sätze einen bedeutenden Verlust an Brauchbarkeit nach acht Wochen aufwies, wie
dies durch den Verlauf der Standardkurve und Reproduzier-
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barkeit einer Vergleichsprobe während dieser Dauer festgestellt wurde.
Zum Zeitpunkt der Verwendung wurden, soweit erforderlich,
die Röhrchen auf Raumtemperatur gebracht. Standard-Digoxinproben (nicht markiert) und Standard-Referenzproben, die
3,3 Nanogramm Digoxin pro ml enthielten, wurden den Röhrchen
zugegeben. Die Röhrchen wurden dann bei etwa 25 C_ etwa
eine Stunde bebrütet, mit Phosphatpuffer gewaschen und zuletzt in einem analytischen gamma-Spektrometer hinsichtlich
ihrer Impulse gezählt.
Die begleitende Zeichnung Figur 1 zeigt eine Standardkurve, die unmittelbar nach dem Trocknen der Röhren auf der Lyophilisiervorrichtung
erhalten wurde. Die Anzahl der Impulse pro Zeit der Standardröhren wurde bestimmt und in Prozent
gebundenes (#B) Digoxin-J , bezogen auf die Gesamtmenge
125
Digoxin-J , die den Röhren zugegeben wurde, umgewandelt. Die erhaltenen Prozentsätze wurden an der Ordinate gegenüber dem Logarithmus der Konzentration von Digoxin in Standardlösungen an der Abszisse zur Bildung der Kurve aufgetragen. Aus dieser Standardkurve kann die Konzentration von Digoxin in einer unbekannten Probe leicht bestimmt werden.
Digoxin-J , die den Röhren zugegeben wurde, umgewandelt. Die erhaltenen Prozentsätze wurden an der Ordinate gegenüber dem Logarithmus der Konzentration von Digoxin in Standardlösungen an der Abszisse zur Bildung der Kurve aufgetragen. Aus dieser Standardkurve kann die Konzentration von Digoxin in einer unbekannten Probe leicht bestimmt werden.
Eine 3,3 ng/ml Probe Digoxin wurde wöchentlich acht Wochen
analysiert. Der Durchschnitt der bestimmten Werte war 3,1 ng/ml bei einer Standardabweichung von 0,3.
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cyclisches Adenosinmonophosphat (c-AMP)
Sowohl das c-AMP-Antiserum als auch kodiertes c-AMP wurden
von der Biotek Co., St. Louis, Missouri bezogen.
Es wurden die gleichen Verfahren und Bedingungen wie im Beispiel 1 verwendet, ausgenommen daß als Analysenpuffer
0,02 Molar Natriumacetat, p„ 6,4 verwendet wurde. Das System
wurde drei Monate ohne wesentlichen Verlust an Brauchbarkeit gelagert. Eine 1/100 verdünnte Urinprobe wurde wöchentlich
während 10 Wochen analysiert. Das Mittel war 7,26 ng/ml mit einem Standardfehler von 0,4$.
Die in Figur 2 gezeigte Standardkurve wurde in der Weise wie in Figur 1 angegeben erhalten, außer daß die Konzentration
von c-AMP an der Abszisse in Picomol pro ml angegeben ist.
Einheits-Radioimmunanalysen-Ausrüstunp; in fester Phase für
Human-Wuchshormon (HGH)
Das HGH-Antiserum wurde von Biotek Co., St*. Louis, Missouri erhalten. Die Jodierung von HGH wurde nach Standardverfahren
bewirkt. Siehe beispielsweise W.M. Hunter und F.C.
Greenwood, Nature, 194, 495 (1962).
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Es wurden die Verfahren und Bedingungen von Beispiel 1 wiederholt, die Ausrüstung für HGH hergestellt und fünf
Monate ohne bedeutenden Verlust an Brauchbarkeit gelagert. Figur 3 zeigt eine Standardkurve, die in Analogie mit Figur
1 erhalten wurde. Eine einzelne Humanserumprobe wurde wöchentlich 8 Wochen lang analysiert. Der Durchschnittswert
war 2,24- mit einem Standardfehler von 0,14.
Radioimmunanalyse von Humanwachstumshormon auf einer Quarzoberfläche
Geschmolzene Quarzstäbchen (1 χ 20 mm) wurden in heißer 50^iger Salpetersäure zwei Stunden gereinigt. Die überschüssige
Säure wurde mit entionisiertem Wasser abgewaschen und an der Luft getrocknet. Jedes Stäbchen wurde in eine
6 χ 50 mm Glasreagenzröhre gegeben, wozu man verdünntes
(1/500 mit 0,05 M Natriumbicarbonat, p^ 9»6) Antihuman-Wachstumshormonserum
zur Abdeckung der Stäbchen gab. Die Inkubation wurde zwei Stunden bei 25°C ermöglicht. Das
Antiserum wurde dann abgesaugt und die Stäbchen gründlich mit Bicarbonatpuffer gewaschen und mit Rinderserumalbumin
wie im Beispiel 1 beschichtet. Die witere Analyse wurde wie im Beispiel 3 unter Verwendung von Polystyrolröhrchen
durchgeführt. Das Quarzstäbchen wurde in das Röhrchen zusammen
mit kodiertem HGH gegeben und der HGH-Gehalt in den Proben und Standardlösungen gemessen. Man erhielt eine geeignete
Standardkurve aus de2?graphischen Darstellung Pro-
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ζent gebundenes markiertes Wuchshormon gegenüber dem Logarithmus
der Konzentration der Wuchshormon-Standardlösungen. Während aus Zweckmäßigkeitsgründen in diesem Falle ein
Quarzstab verwendet wurde, erläutert das Verfahren, daß Quarzstäbe ebenso zum Binden der Antikörper verwendet werden
können und das markierte Antigen dann in das Röhrchen in fester Form durch die ßeschichtungs- und Lyophilisierungs·
verfahren, wie sie hier beschrieben wurden, eingebracht werden können und dann die Röhrchen gelagert und danach für
Analysen, wie hier beschrieben, verwendet werden können.
Radioimmunanalyse von Humanwachstumshormon unter Verwendung von Sandwich-Verfahren
Antihuinanwuchshormonserum (verdünnt 1/500 mit O,O5M Natriumbicarbonat,
p„ 9,6) wurde in den Boden eines Polystyrolkunst
st of fr öhrchens 12 χ 75 ™ pipettiert. Den Antikörper
ließ man sich an der Oberfläche des Röhrchens etwa zwei Stunden bei 24° adsorbieren. Radiojodiertes (J )
gereinigtes Anti-Humanwuchshormon (100/ul, 10 800 c/Min)
wurde in den Boden des Röhrchens bei 0° pipettiert, sofort bei -70° gefroren und lyophilisiert. Die Röhrchen waren
dann zur Analysen von Humanwachstumshormon in Humanserum geeignet.
Zu diesen Röhrchen gab man dann Humanwachstumshormon-Standardlösungen,
die Humanserum mit 100, 10 und 1 ng ent-
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€09819/0909
hielten. Die Antigen-Antikörperreaktion ließ man 18 Stunden
bei 24° ablaufen. Die Röhrchen wurden dreimal mit Wasser gewaschen und in einem gamma-Spektrometer gezählt. Es
wurde eine geeignete Standardkurve gebildet. Die Hormonkonzentration ist eine logarithmische Funktion des in den
Röhrchen gebundenen radiokodierten Hormons.
Ein Untersuchungsröhrchen, wie in der vorliegenden Erfindung
verwendet, ist in Figur 4 abgebildet. Die Erläuterung zeigt das Röhrchen, wie es vorliegt, bevor die Probe zugegeben
wird, wobei es den Antikörper und das markierte Antigen in festem Zustand enthält. Das Röhrchen 1 hat Wandungen
2 und weist einen Pfropf 3 und eine Reaktionszone 4 auf. Wenn gewünscht, kann der Pfropfen, wie hier beschrieben,
geschlitzt sein (nicht erläutert). Die Reaktionszone wird im vergrößerten Maßstab, Figur 5» erläutert, wobei
die Kreise 5 Antikörper darstellen, die an die Wandung 2
gebunden sind, und die festen Punkte 6 kennzeichnen markierte Antigene, die im allgemeinen in der Reaktionszone
verteilt aber nicht mit den Wandungen des Röhrchens verbunden sind. Es kann aber auch das Antigen mit der Oberfläche
verbunden sein und markiertes Antigen in ungebundener Form in dem Röhrchen verteilt sein. In einer weiteren Kombination
kann gebundenes Antigen vorhanden sein mit markierten ungebundenen Antikörpern, oder gebundenes Antigen mit markiertem
ungebundenen Antigen. Es ist ebenso möglich, daß die vorhandenen Komponenten an verschiedenen Stellen in dem
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609819/0309
Röhrchen vorhanden sind, daß beispielsweise die Antikörper gebunden an den Seitenwanden des Röhrchens und das Markierte
Antigen an dem Boden des Röhrchens vorliegen, aber es besteht keine Notwendigkeit für getrennte Lagerungen und
das Röhrchen kann leicht wie erläutert hergestellt werden. Das Röhrchen enthält bei Lagerung trockenen Stickstoff oder
ein anderes inertes trockenes Gas oder befindet sich unter Vakuum.
Während die Erfindung im Hinblick auf verschiedene spezifische
Beispiele und Ausführungsformen beschrieben wurde, ist darauf hinzuweisen, daß sie dadurch nicht eingeschränkt
wird und daß sie im Rahmen der folgenden Ansprüche in verschiedener Weise durchgeführt werden kann.
-Patentansprüche-
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S09819/Q909
Claims (1)
- Patentansprüche :' 1,JM i t t e 1 zur Verwendung bei der Immunanalyse einer Komponente der Antigen-Antikörperreaktion, gekennzeichnet durch eine Oberfläche, wobei an wenigstens einem Teil derselben eine der Komponenten in fester Form gebunden und eine der Komponenten markiert und in fester Form?, aber ungebunden, vorliegt.2. M i t t e 1 gemäß Anspruch 1, dadurch g e kennzeich ne t , daß ein Antikörper an die Oberfläche gebunden und Antigen markiert und in ungebundener Form vorliegt.3.Mit'tel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Oberfläche einen Antikörper in fester Form, gebunden an wenigstens einem Teil derselben, und radioaktiv markiertes Antigen in fester Form, dispergiert über einen Teil derselben, Jedoch damit nicht gebunden, aufweist.4-. Mittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche ein Kunststoff analysenröhrchen umfaßt, das eine relativ undurchdringliche glatte Oberfläche hat und Antikörper in festem Zustand, gebunden an einem Teil seiner inneren Oberfläche aufweist und radioaktiv markiertes Antigen in festem Zu--38-609819/0909stand, aber rieht gebunden an die Oberfläche, enthält.5. M i t t e 1. gemäß Anspruch 4·, dadurch gekennzeichnet , daß die Antikörper in einer Menge vorhanden sind, die ausreichend ist, 40 bis 60^ markiertes Antigen zu binden.6. M i t t e 1 gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Röhrchen eine inerte, Feuchtigkeits-freie Atmosphäre enthält und hermetisch verschlossen ist.7.Mi t t e 1 gemäß Anspruch 2, dadurch -gekennzeichnet, daß die Antikörper an eine polymere Kunststoffoberfläche adsorbiert sind«8.Mittel gemäß Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet , daß die Oberfläche eine relativ undurchdringliche glatte Polyolefinoberflache ist.9· M i t t e 1 gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß die Oberfläche eine Polystyroloberfläche ist.10. M i t ΐ e. 1 gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Antigen-Antikörperreaktion die von Digoxin und dessen Antikörper ist.-39-609819/090911. M i t t e 1 gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Antigen-Antikörperreaktion Human-Wachstumshormon und sein Antikörper ist.12. M i t t e I1 gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Antigen-Antikörperreaktion cyclisches Adenosinmonophosphat und sein Antikörper ist.13. Mi t t el gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Beschichten und Binden einer der Komponenten einer Antigen-Antikörperreaktion an wenigstens einen Teil einer Oberfläche und Inkontaktbringen der Oberfläche mit der anderen Komponente in markierter Form derart, daß eine Dispersion der Komponente in fester Form über wenigstens einem Teil der Oberfläche, aber nicht gebunden damit, noch mit der anderen Komponente, vorliegt.. Mittel gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Beschichten und Binden einer der Komponenten an wenigstens einem Teil einer Oberfläche, die geeignet ist, die Komponente zu binden und durch Inkontaktbringen der Oberfläche mit einer der Komponenten in markierter Form in einer V/eise, daß diese über die Oberfläche dispergiert, aber nicht damit gebunden, vorliegt, danach Inkontaktbringen der Oberfläche mit einer Probenlösung, die eine der Komponenten enthält und dadurch Herstellen eines-40-809813/0909Zweiphasensystems und Ermöglichen der Reaktion zwischen den Komponenten, wobei ein Teil der markierten Komponente indirekt mit der Oberfläche gebunden wird, Trennen der beiden Phasen und Messen des markierten Gehalts von einer der Phasen, der eine Funktion der Konzentration der Komponente in der Probenlösung ist.15· Mittel, gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß die markierte Komponente in Lösung nach Kontakt mit der Oberfläche einem Schnellgefrierverfahren unter nachfolgender Lyophilisation unterworfen wird, wodurch die markierte Komponente als fester Rückstand ander Oberfläche verbleibt.16. Mittel, gemäß Anspruch 14·, dadurch gekennzeichnet , daß ein Teil der Innenfläche eines Untersuchungsröhrchens aus wasserunlöslichen undurchdringlichem polymerem Material mit Antikörpern aus wäßriger Lösung zur Bindung der Antikörper an die Oberfläche beschichtet ist unter nachfolgendem Absaugen und Waschen, und daß eine wäßrige Lösung von markiertem Antigen dann eingeführt und mit der Oberfläche bei niederen Temperaturen, nicht höher als etwa der Gefriertemperatur, in Kontakt kommt unter nachfolgendem Lyophilisieren, um Wasser zu entfernen und Lagerung unter inerter Atmosphäre vor Verwendung.-41-609819/090917· Mittel gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , daß das Untersuchungsröhrchen mit Protein vor der Einführung des markierten Antigens
beschichtet ist.18. Mittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die nicht gebundene Komponente mit .einem radioaktiven Atom, einem Sizym oder einer fluoreszierenden Gruppe markiert ist.609819/0909
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