DE2548427A1 - Als einheit ausgebildete immunoanalysenausruestung in fester phase und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Als einheit ausgebildete immunoanalysenausruestung in fester phase und verfahren zu ihrer herstellung

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DE2548427A1 DE19752548427 DE2548427A DE2548427A1 DE 2548427 A1 DE2548427 A1 DE 2548427A1 DE 19752548427 DE19752548427 DE 19752548427 DE 2548427 A DE2548427 A DE 2548427A DE 2548427 A1 DE2548427 A1 DE 2548427A1
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Description

DR. BERG DIPL.-TNG. STAPF DIPL.-ING. SCHWABE DR. DR. Γ. 4NDM^ IR
8 MÜNCHEN 86, POSTFACH 86 02 45
Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf und Partner, 8 München 86, P.O. Box 860245
Ihr Zeichen Unser Zeichen 8 MÜNCHEN 80
Yourrcf. Ourref. Mauerkircherstraße 45 OQ Γ\\(Ύ
Anwaltsakte 26 412
Be/Sch
Monsanto Company St. Louis, Missouri / USA
"Als Einheit ausgebildete Immunoanalysenausrüstung in fester Phase und Verfahren zu ihrer Herstellung"
Die Radioimmunanalyse (ebenso RIA. bezeichnet) ist ein sehr empfindliches Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern. So ge-
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ringe Mengen wie 10 g können festgestellt werden. Das Verfahren beruht auf der Konkurrenz zwischen radiomarkiertem und nicht markiertem Antigen für eine fixierte und limi-
11-21-O24-3A GW . -2-
9 (089) 988272 Telegramme: BERGSTAPFPATENT München Banken: Bayerische Vereinsbank München 453lOO
^ TELEX: 0524560 BERGd Hypo-Bank München 3892623
Postscheck München 653 43 - 808
§09819/0009
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tierte Menge Antikörper, wie von R. Yalow u.a. in J. Clin. Invest., 39, 1157 (1960) beschrieben. Die Menge des nicht markierten Antigens beeinflußt die Verteilung des markierten Antigens in Antikörper-gebundenes und Antikörper-freies markiertes Antigen. Das heißt, daß je mehr nicht markiertes Antigen vorliegt, um so weniger markiertes Antigen die Möglichkeit hat, sich mit Antikörpern zu verbinden.
In den begleitenden Zeichnungen stellen die Figuren 1 bis Standardkurven dar, die durch Messen von Standardkonzentrationen bestimmter Antigene nach der vorliegenden Erfindung erhalten wurden. In den Figuren 4 und 5 ist ein Untersuchungsrohrchen der Untersuchungsausstattung nach der vorliegenden Erfindung erläutert.
Unter der Bezeichnung "Ausrüstung", wie sie hier verwendet wird, ist eine Zusammenstellung aller oder einiger chemischer Mittel, einschließlich der Untersuchungsrohrchen und der erforderlichen Anweisungen zur Durchführung einer Radioimmunanalyse zu verstehen.
Die Bezeichnung "Antikörper" wird hier so verwendet, daß darunter eine Gruppe von Serumproteinen zu verstehen ist, die ebenso als gamma-Globuline oder Immunoglobuline bezeichnet werden, die spezifisch mit einem Antigen oder Hapten reagieren können. Die meisten dieser Antikörper gehören zu der IgG-Klasse, während die anderen Klassen als IgA, IgM, IgD und IgE bezeichnet werden. Die hier verwendete Bezeich-
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nung beinhaltet ebenso bestimmte Bindeproteine, die bestimmte Antigene kenntlich machen, beispielsweise Proteine für cyclisches AIiP und für Cortison.
Die Bezeichnung "Antigen" wird hier so verwendet, daß darunter eine Substanz zu verstehen ist, die mit einem Antikörper reagieren kann. Antigene sind häufig dadurch gekennzeichnet, daß sie die Bildung eines Antikörpers einleiten und mit diesem Antikörper reagieren. Es ist jedoch im Falle von "Haptenen" notwendig, daß diese mit einem Träger gekuppelt sind, wie beispielsweise inerten adsorbierenden Partikeln, synthetischen Peptiden oder natürlichen Protein— molekülen, um die Antikörperbildung einzuleiten. Zu Materialien, die herkömmlicherweise als Träger verwendet werden, gehören beispielsweise die Albumine (Humaa-, Rinder- oder Kaninchen-), synthetische Peptide (beispielsweise Polylysin), inerte adsorbierende Partikel (beispielsweise Dextran-beschichtete Holzkohle) und Polymerisate (beispielsweise PoIyvinylpyrollidon). Es können jedoch die Haptene auch ohne einen Träger mit Antikörpern reagieren und sie können in den Antigen-Antikörperreaktionsanalysen der vorliegenden Erfindung entweder mit oder ohne Träger verwendet werden.
Ein wesentliches Erfordernis für schlüssige Ergebnisse des Radioimmunanalysenverfahrens ist die Trennung des Antikörpergebundenen und Antikörper-freien Antigens. Durch die Entwicklung verschiedener fester-Phasen-Verfahren ist eine schnelle und wirksame Trennung möglich. Bei der Analyse des
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festen Phasentyps ist der Antikörper oder das Antigen an ein Adsorbens gebunden oder fixiert, das die Abtrennung oder Ausfällung gebundener oder freier Fraktionen erleichtert. Siehe beispielsweise K.J. Catt, U.S.-Patentschrift 3 64-6 34-6 und K. Catt u.a., Science, 158, 1570 (1967).
Die Antikörperverfahren in fester Phase verwenden Antikörper, die kovalent verbunden oder fixiert sind mit unlöslichen Polymerisaten, kovalent vernetzt oder physikalisch adsorbiert art einem Material, wie beispielsweise Kunststoffen, Glas oder frisch ausgefällten Metallen. Zu unlöslichen Trägern oder Immunoadsorbentien gehören Bentonitpartikel, Bromäthylcellulose, vernetzte Dextrane (Sephadex) und geperlte Agarose (Sepharose).
Obgleich große Mengen an Antikörpern bei den Antikörpersystemen in der festen Phase erforderlich sind, haben sie doch bestimmte Vorteile. Die Bindung des Antigens erfolgt schnell, ist tatsächlich nicht umkehrbar und die beiden Phasen können durch einfaches Dekantieren oder durch Zentrifugieren bei niederer Geschwindigkeit voneinander getrennt werden. In vielen Fällen können Antikörperlösungen zur Adsorption wiederverwendet werden.
Polymerisierte Antikörper, kovalent vernetzt mit Äthylchlorformiat oder Glutaraldehyd, ermöglichen ein praktisches und genaues Verfahren für Analysen. Das Verfahrei>beinhaltet jedoch das Zentrifugieren mir hoher Geschwindigkeit
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zur Ausfällung des Antigen-Antikörperkomplexes.
Das Antikörperverfahren in fester Phase durch Bindungsadsorption beinhaltet die Verwendung von Poly-(tetrafluoräthylen-g-aminostyrol)-("Protapol")-Pulver, Poly-(tetrafluoräthylen-g-isothiocyanatstyrol)-Pulver ("Protapol DI/1") oder Polypropylen-beschichtete Scheiben und Polypropylenoder Polystyrol-Kunststoffröhren. Die Herstellung von Antikörper-beschichteten Scheiben oder Röhren kann durch den PH-Wert , die Molarität, Temperatur und die Proteinkonzentration der Inkubationslösung beeinträchtigt werden. Jedoch ermöglicht dieses Verfahren viele Bestimmungen schnell durchzuführen und es ist sehr empfindlich und leicht reproduzierbar.
Bei einer Modifizierung des festen Phasenverfahrens, wie von T. Goodfriend u.a., Immunochemistry, 6, 484· (1969) beschrieben, verwendet man ein Acrylamidgel, das die Antikörper einzuschließen scheint, aber die Diffusion von Antigenen mit niederem Molekulargewicht ermöglicht.
Weitere Informationen hinsichtlich der Radioimmunanalyse sind bei D.S. Shelley u.a. Clin. Chem., 19, 146 (1973) zu finden.
Während die Radioimmunanalyse ein wertvolles Verfahren in der klinischen Praxis darstellt, ist ihre Verwendung relativ eingeschränkt. Ein Grund besteht dafür möglicherweise
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darin, daß es schwierig ist, sie durchzuführen, besonders bei einer Nicht-Routineuntersuchung. Weiterhin sind die im Handel erhältlichen Ausrüstungen häufig unzuverlässig, haben geringe Stabilität und kurze Lagerdauer, sind schwierig durchzuführen und benötigen für ihre Durchführung ein fachlich geeignetes Personal.
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, daß sie eine geeignete Vorrichtung für die Immunanalyse einer Komponente der Antikörper-Antigenreaktion zur Verfügung stellt. Ein weiterer- Gegenstand der Erfindung ist eine verbesserte Ausrüstung für das Radioimmunanalysenverfahren, das nicht die Nachteile der oben erwähnten bisherigen Verfahren aufweist.
Es wurde überraschend gefunden, daß man dies vorzugsweise dadurch erreichen kann, daß man alle zur Radioimmunanalyse erforderlichen Reagentien in ein einziges Röhrchen in der Weise einbringt, daß der Antikörper an wenigstens einen Teil der Oberfläche gebunden und das Antigen in fester Form über wenigstens einen Teil der Oberfläche dispergiert, jedoch nicht damit, noch mit dem Antikörper verbunden ist.
Die als Einheit ausgebildete Radioimmunanalysen-Ausrüstung in fester Phase hat verschiedene Vorteile gegenüber den anderen Radioimmunanalysen-Ausrüstungen. Hierzu gehört, daß (1) der Techniker nicht mehr das radioaktive Material zum Kombinieren der Komponenten in dem Analysenverfahren ver-
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dünnen oder pipettieren muß, woraus sich eine erhöhte Sicherheit für das Untersuchungspersonal ergibt, (2) dieses nicht mehr irgendein Material, ausgenommen die Probe des Patienten,verdünnen oder pipettieren muß, wodurch die Irrtumsmöglichkeit verringert und die Untersuchungszeit verkürzt wird und (3) die Stabilität und Lagerdauer erhöht ist. Es ermöglicht daher die als Einheit ausgebildete Radioimmunanalysen-Ausrüstung in fester Phase der vorliegenden Erfindung wesentliche Einsparungen an Zeit für das Laboratoriumpersonal, an Ausrüstungskosten für das Laboratorium und Untersuchungskosten für den Patienten.
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Immunanalyse einer Komponente der Antigen-Antikörperreaktion, bei der eine der Komponenten an eine feste Oberfläche gebunden und eine der Komponenten markiert und in fester Phase aber ungebunden vorhanden ist. Eine der Komponenten kann an eine Kunststoffoberfläche adsorbiert sein, während die andere markierte Komponente in fester Phase an der Oberfläche, aber nicht mit dieser, noch mit den anderen Komponenten, gebunden oder verbunden, dispergiert ist. In einer Hinsicht betrifft die Erfindung die Lagerung der Vorrichtung unter einer inerten Atmosphäre vor ihrer Verwendung zum Erreichen einer guten Stabilität. In spezifischer Hinsicht ist ein Antikörper an die feste Oberfläche adsorbiert und markiertes Antigen ist in fester Phase, aber nicht gebunden, mit der Oberfläche vorhanden. Die Erfindung betrifft wei-
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terhin ein Verfahren zur Herstellung einer Analysenvorrichtung, wozu man eine Komponente an wenigstens einem Teil einer Oberfläche aufträgt und bindet und dann die Oberfläche mit der markierten Komponente so in Kontakt bringt, daß eine Dispersion der markierten Komponente in fester Phase übe:ijwenigstens einen Teil der Oberfläche gebildet wird. In noch spezifischerer Hinsicht besteht das Verfahren darin, daß man eine Komponente aus einer Lösung auf die Oberfläche als Schicht aufträgt und eine Lösung einer anderen Komponente in markierter Form einbringt und die Lösung einer schnellen Gefriertrocknung unterwirft. Die Erfindung beinhaltet weiterhin ein Verfahren zur Analyse von Antigen oder Antikörpern, bei dem man eine Oberfläche verwendet, die ausgestattet ist mit einer der Komponenten, die damit verbunden sind, und einer markierten Komponente, die in fester Phase, jedoch ungebunden, vorhanden ist, wozu man die Oberfläche mit einer Lösung, die die zur Bestimmung vorgesehene Komponente enthält, in Kontakt bringt, die Lösung von der Oberfläche abtrennt und die markierte Komponente an der Oberfläche oder in der Lösung mißt. Das Verfahren beinhaltet in einer noch spezifischeren Hinsicht, daß man ein Kunststoffuntersuchungsröhrchen (Schale oder Cuvette) vorsieht, bei dem an einem Teil seiner Innenfläche Antikörper adsorbiert sind und radioaktiv markiertes Antigen in fester Form, jedoch nicht verbunden, mit dessen Oberfläche oder mit den Antikörpern vorhanden ist und daß man die Innenoberfläche mit einer Lösung, die die zur Bestimmung vorge-
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sehene Komponente enthält, in Kontakt bringt unter Bildung eines Zweiphasensystems, das eine feste Phase (Untersuchungsröhrchen und damit verbundenes Material) und eine flüssige Phase umfaßt, die beiden Phasen voneinander abtrennt und die Strahlung von wenigstens einer dieser Phasen mißt. In diesem Verfahren, wie es gewöhnlich verwendet wird, wird die Probe Antigen enthalten, sodaß die Menge der markierten, mit dem Feststoff verbundenen Komponente durch die Konkurrenz zwischen dem markierten Antigen und dem Antigen in der Probe bestimmt wird. In weiterer Hinsicht kann das Analysenverfahren so angesehen werden, daß es die Stufen, der Herstellung der Analysenvorrichtung, wie oben beschrieben, umfaßt.
Die Erfindung beinhaltet die Verwendung einer gebundenen Komponente und einer nicht gebundenen festen markierten Komponente in Nachbarschaft als Teile einer Analysenvorrichtung, jedoch unter Vermeidung einer vorzeitigen Reaktion zwischen den Komponenten. Die Analyse hängt natürlich von der Tatsache ab, daß die Komponenten, d.h. ein gebundener Antikörper und ein markiertes Antigen, reagieren können. Es wurde festgestellt, daß es erreichbar ist, das markierte Antigen in festem Zustand an der gleichen Oberfläche wie den gebundenen Antikörper vorhanden zu haben, ohne daß eine Bindung oder Reaktion eintritt, die eine geeignete Analyse verhindern würde. Die Tatsache, daß derartige Komponenten zusammen in einer Analysenvorrichtung vorverpackt
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werden können, erhöht wesentlich die Zweckmäßigkeit der Verwendung einer derartigen Analysenvorrichtung. Zur Verwendung ist es nur notwendig, die Probe des Patienten, die die zur Bestimmung vorgesehene Komponente enthält, zuzugeben. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer kann eine vollständige und schnelle Abtrennung der gebundenen Komponente, sowohl der markierten als auch nicht markierten, von der freien Komponente durch Dekantieren und Waschen erzielt werden, sodaß die Aktivität der festen Phase gemessen werden kann, wobei der Wert der Aktivität eine Funktion der Konzentration der zur Bestimmung vorgesehenen Komponente in der Probe ist.
Es wurde gefunden, daß eine gewöhnliche relativ glatte und undurchdringliche feste Oberfläche beider Analysenvorrichtung verwendet werden kann, wie (unter Druck) geformte KunststoffOberfläche, beispielsweise Oberflächen, wie sie in gewöhnlichen Kunststoff-Laboratoriums-Untersuchungsröhrchen anzutreffen sind, und daß eine Flüssigkeit in zweckmäßiger Weise von der Oberfläche durch einfaches Dekantieren abgetrennt werden kann, ohne daß man Zentrifugieren, Absaugen oder ähnliche Verfahren anwenden muß. Die zur Herstellung der Analysenvorrichtung verwendeten Verfahren machen es möglich, die markierte Komponente in fester Form auf der Oberfläche anzubringen, ohne daß eine Reaktion eintritt, besonders durch Verfahren, bei denen die Oberfläche auf niedere Temperaturen, die nahe dem Gefrierpunkt liegen,
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vorgekühlt wird, bevor man den Kontakt mit der Lösung der markierten Komponente herstellt, und bei dem die Lösung dann schnell gefroren wird, wie beispielsweise durch schnelles Abkühlen auf Temperaturen von -50°C oder darunter. Sowohl die niedere Temperatur als auch die schnelle Umwandlung in die feste Form tragen zum Vermeiden der Reaktion bei. Nach Lyophilisieren ist die markierte Komponente als Feststoff, dispergiert über die Oberfläche des Untersuchungsröhrchens, vorhanden. Es kann eine gewisse Anziehung zwischen der Oberfläche und der markierten Komponente vorliegen, die markierte Komponente ist aber in dem Sinne ungebunden, daß sie leicht von der Oberfläche unter Anwendung von Flüssigkeiten, wie Probenlösungen, entfernt werden kann.
Die als Einheit ausgebildete Radioimmunanalysen-Ausrüstung in fester Phase der vorliegenden Erfindung ist besonders geeignet zur Bestimmung jeder Komponente der Antigen-Antikörperreaktion. Während die Erfindung aus Zweckmäßigkeitsgründen in besonderer Weise im Hinblick auf die Bestimmung der Antigenkomponente erläutert wird, ist darauf hinzuweisen, daß das Verfahren in ähnlicher Weise anwendbar ist zur Bestimmung von Antikörpern. In ähnlicher Weise wird das Untersuchungsröhrchen für die Zwecke der beispielhaften Beschreibung der festen Oberflächen des Bindematerials verwendet, wobei jedoch andere Formgebungen der Oberflächen verwendet werden können.
Bei der Durchführung des Herstellungsablaufs der vorliegen-
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den Erfindung kann das nachfolgende Verfahren verwendet werden. Die innere Oberfläche eines Untersuchungsröhrchens aus einem Material, das geeignet ist, Antikörper gegen das zu bestimmende Antigen zu binden, wird mit einer verdünnten Lösung von Antikörpern (Antiserum) in Kontakt gebracht. Die Flüssigkeit wird durch Absaugen entfernt und die Röhrchen nacheinander mit einer verdünnten Lösung von Natriumbicarbonatpuffer, einer verdünnten Lösung, die Natriumphosphat und eine geringe Menge reines Protein enthält, um die nicht spezifische Bindung des Antigens zu verringern, und schließlich einer verdünnten Lösung von Natriumphosphatpuffer gewaschen.
Die Bezeichnung "reines Protein" oder vereinfachend "Protein" wird hier so verwendet, daß darunter Proteine und Polypeptide zu verstehen sind, die frei sind von Verunreinigungen und es ist bei der Durchführung zweckmäßig, derartige reine Materialien zu verwenden, um unnötige beeinträchtigende Faktoren zu vermeiden.
Nach der Beendigung der Waschvorgänge werden die Röhrchen auf eine Temperatur zwischen etwa -100G und etwa 5°C gekühlt und hierzu eine verdünnte Lösung des radioaktiven Antigens zugegeben. Der Inhalt wird bei einer festen Kohlendioxidtemperatur, etwa -780C, sehr schnell, vorzugsweise innerhalb von 5 bis 15 Sekunden, gefroren. Die Lyophilisierung der Röhren während etwa 8 bis 16 Stunden beendet
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den Herstellungsablauf. Die Röhrchen können sicher in einer inerten und feuchtigkeitsfreien Atmosphäre, wie beispielsweise in Stickstoff, mehrere Monate oder mehr ohne einen bedeutenden Verlust an Aktivität gelagert werden. Die Temperatur, bei der die Röhren sicher gelagert werden können, liegt im Bereich von unter O0C bis etwa 400C oder sogar höher. Ein zweckmäßiger Temperaturbereich ist jedoch etwa 40C bis etwa 25°C.
Die als Einheit ausgebildete Radioimmunanalysen-Ausrüstung in fester Phase der vorliegenden Erfindung ist wenigstens fünf Monate stabil, wie sich dies aus dem Verlauf der Standardkurve bei Zeituntersuchungen ergibt, die dann abgebrochen wurden. Der Verlauf der Standardkurve senkt sich während lang dauernder Lagerung, aber niemals auf einen Punkt, daß die Röhrchen nicht weiterhin für eine gute Analyse geeignet wären. Beispielsweise wurde im Falle von Digoxin eine Standardserumreferenzprobe von 3i3 Nanogramm pro ml jede Woche über zwei Monate lang untersucht. Der während dieser Zeit erreichte Durchschnittswert betrug 3,1 Nanogramm pro ml mit einer Standardabweichung von 0,3 und einem Schwankungskoeffizienten von 9,6$. Natürlich müssen Toleranzen für den normalen radioaktiven Zerfall vorgesehen werden. Das Antigen kann iijnerkömmlicher Weise mit irgendeinem Markierungsmaterial, das für Immunanalysen geeignet ist, beispielsweise mit radioaktiven Isotopen, Enzymen, fluoreszierenden Gruppen und Spin. -Markierungsgruppen mar-
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kiert werden. Zu den häufig für diesen Zweck verwendeten Isotopen gehören Jod-125 (J125), Jod-131 (J151)» Kohlenstoff-14 (C ), und Wasserstoff-3 (H*), allgemein als
Tritium bekannt. Eine besonders geeignete radioaktive Iso-
12S
topenmarkierung ist J .Es hat eine Halbwertzeit von etwa 60 Tagen und reagiert leicht mit den meisten Antigenen. Es
3 hat weiterhin eine höhere spezifische Aktivität als H , C oder J . Weiterhin hat es eine geringere gamma-Ener-
AZ,A
gie als J^ und das Fehlen von beta-Strahlung verringert das Potential zur Selbstkennzeichnung des markierten Antigens.
Einige Analysen von erwiesenem klinischem Viert, die typisch sind für solche Untersuchungen, für die das Einstufensystem in fester Phase mit Einzelröhre nach der vorliegenden Erfindung geeignet ist, sind in der Tabelle I angegeben.
Tabelle I Einige AisLysen von nachgewiesenem klinischem Wert
Peptid- und Proteinhormone Hypophysenvorderlappen Luteinisierungshormon (LH);
Reifungshormon (FSH) ; ThyroieL-stimulierendes Hormon (TSH); Wachstumshormon (HGH); Prolactin; Corticotrophin (ACTH)
Hyp ophysenhinterlappen Arginin-vasopressin (AVP) Parathyroid Parathyroidhormon (PTH)
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Pankreas Placenta
Andere
Insulin
Humanpiacentares Lactogen (HPL); Humanchoriongonatropin (HGG) Angiotensin I und II; Renin; Gastrin
Plasmaprot eine Mikrobenantigene
Spezifische Tumorantigene
Andere Peptide und Proteine
Immunoglobulin (IgE); Fibrinogen; andere Gerinnungsfaktoren
Mit Hepatitis in Verbindung stehende Antigene
alpha-Fetoprotein; Carcinoembryonantigen
Thyroid Adrenal
Gonadal
Arzneimittel Andere
Haptenhormone
Thyroxin (T^); Trijodthyromin (T^) Cortison-deoxycorticosteron; Aldosteron;
Testosteron; Progesteron; verschiedene Oestrogene
Weitere Haptene
Digoxin; Morphin; Cannabis (Hanf); Diphenylhydant oin
Folsäure; cyclisches Adenosinmonophosphat (G-AMP); Vitamin Vitamin D
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609619/0909
Die vorliegende Erfindung beinhaltet ebenso ein Verwendungsverfahren. Dieses Verfahren besteht darin, daß man die nicht markierten Antigenkomplexlosungen und die Standard-Referenzprobenlösungen in die Analysenröhrchen gibt, sie gewünscht lange bei der gewünschten Temperatur bebrütet, wäscht, die Lösungen entfernt und die Radioaktivität der gebundenen markierten Antigenprobe in einem analytischen gamma-Spektrometer zählt. Wahlweise wird die Aktivität der Lösung gezählt. Die Anzahl der Zählungen pro Zeit der Standardröhrchen wird umgewandelt in Prozent gebundenes (#B) Antigen-
125
J J bezogen auf die Gesamtmenge den Röhrchen zugeführtes
125
Antigen - J . Die erhaltenen Prozentsätze werden zur Bildung der Standardkurve aufgetragen, wie dies in den Figuren 1,2 und 3 dargestellt ist. Aus der Standardkurve kann die Antigenkonzentratxon in der unbekannten Probe leicht durch unmittelbaren Vergleich bestimmt werden.
In den begleitenden Zeichnungen sind Beispiele von Standardkurven gezeigt, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung bestimmt wurden. Es folgt eine kurze Beschreibung der verschiedenen Figuren:
Figur 1 zeigt eine Standardkurve, die man dadurch erhält, daß man den Prozentsatz gebundenes Digoxin-J ^ an der Ordinate gegen den Logarithmus der Konzentration von Digoxin in Nanogramm pro ml an der Abszisse aufträgt (siehe nachfolgendes Beispiel 1);
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Figur 2 zeigt eine Standardkurve, die man dadurch erhält, daß man den Prozentsatz gebundenes (cyclisches Adenosinmonophosphat)-J12^ /Cc-AMP)-^ _7 an der Ordinate gegen den Logarithmus der Konzentration von C-AMP in Picomol pro ml an der Abszisse aufträgt (siehe nachfolgendes Beispiel 2) und
Figur 3 zeigt eine Standardkurve, die man dadurch erhält, daß man den- Prozentsatz gebundenes (Humanwachstumshormon)-J^ /CHGH)-J _7 an der Ordinate gegen den Logarithmus der Konzentration von HGH in Nanogramm pro ml an der Abszisse aufträgt (siehe Beispiel $).
Im allgemeinen beruht die Analysenvorrichtung der vorliegenden Erfindung auf der Konkurrenz zwischen einer markierten Komponente und einer Komponente der Probe, die durch eine Komponente gebunden werden sollen, die mit der festen Oberfläche verbunden ist. Es ist daher die gebundene Kom-
• ponente in einer zur Bindung der Probenpomponente und markierten Komponente nicht ausreichenden Menge vorhanden.
Die geeigneten Mengen der Komponenten für ein solches Verhältnis können leicht durch Versuche und Ermitteln der Fehlergrenzen bestimmt werden. Für eine zweckmäs-
125 sige Ablesung ist besonders bei J ^ eine Strahlung mit einer Zählrate im Bereich von 2000 bis 60 000 Impulsen pro Minute (Counts/Min^' (C/Min.) geeignet. Die Menge der markierten Komponente von 10 000 C/Min. bei Beginn der üntersuchung sorgt für eine geeignete Flexibilität, und es isir
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oftmals wünschenswert sein, viel Höhere Mengen zu verwenden, um Analysenröhrchen herzustellen, die den radioaktiven Zerfall während einer längeren Lagerzeit erlauben. Die radic aktiv markierte Komponente in Lösung kann so verdünnt werden, daß etwa 1/10 ml die geeignete Menge für die gewünschte Zählrate C/Min. enthält, und der 1/10 ml kann dann dem Untersuchungsrohrchen zum Zwecke der Beschichtung zugeführt werden. Die Menge der gebundenen Komponente in dem Untersuchungsrohrchen kann so eingestellt werden, daß eine wesentliche Fraktion der markierten Komponente, etwa 40 bis 60$, gebunden werden kann, obgleich andere Mengen, wie Mengen von 20 bis 80$ oder sogar breitere Bereiche, verwendet v/erden können. Eine Menge, die zur Bindung von etwa 5C$ äer markierten Komponente führt, ermöglicht das Analysenverfah— ren flexibel durchzuführen. Beispielsweise ist für Digoxinbestimmungen etwa 1 Picogramm Digoxin-Antikörper, gebunden in dem Untersuchungsrohrchen, eine zweckmäßige Menge. Das Analysenverfahren wird dann gewöhnlich für Analysen von Proben verwendet, die Konzentrationen der unbekannten Komponente enthalten, sodaß man Prozentsätze der gebundenen markierten Komponente im Bereich von 10 bis 20 bis zu 50 oder etwa' % erhält, je nach der besonderen unbekannten Komponente und der Breite des Bereichs, in dem sie gewöhnlich in der biologischen oder anderen, zur Analyse aiEbehenden Flüssigkeit auftritt. Wenn gewünscht, kann die zur Analyse vorgesehene Flüssigkeit verdünnt oder konzentriert werden, um die Konzentration für eine geeignete Bestimmung einzu-
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stellen. Jedoch liegt beispielsweise der normale Serumbereich für Digoxin bei digitalisierten Patienten im Bereich von 0,8 bis 2,4 Nanogramm pro ml und der toxische Bereich von 2,4 bis 8,5 Nanogramm pro ml, sodaß ein wirksamer Analysenbereich von 0,2 bis 10 Nanogramm pro ml geeignet ist.
Zur Herstellung der hier vorgesehenen Analysenvorrichtung sollten bestimmte fixierte Mengen der Komponenten verwendet werden, wobei es erwünscht ist, Standardverfahren für Aufbereitungen zu verwenden, um Analysenergebnisse zu erhalten, die sich zu Vergleichszwecken mit Bezugssystemen, usw. eignen, wie dies dem Fachmann bekannt ist. Nachdem daher geeignete Mengen bestimmt sind, sollten die gleichen bestimmten Mengen für einen jeweiligen Satz Untersuchungsröhrchen vorgesehen werden. Solche Aufbereitungen können nach den hier erläuterten Verfahren hergestellt werden. Es ist nicht notwendig, die Mengen numerisch, wie beispielsweise durch Analyse, zu bestimmen, da solche Mengen unter Verwendung besonderer Aufbereitungsverfahren festgelegt werden können. Beispielsweise können geeignet identische Mengen an Antikörpern in einem Satz von Röhrchen dadurch erhalten werden, daß man die gleiche Menge verdünntes Antikörperserum einführt, eine Standardzeit bebrütet, absaugt und wäscht. Das Absaugen des Serums hinterläßt einen Film und die Menge der auf diese Weise adsorbierten Antikörper ist gewöhnlich so gering, daß ein Antikörperserum von aus-
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reichender Konzentration so verwendet werden kann, daß das abgesaugte Serum zur Beschichtung weiterer Röhrchen verwendet werden kann. Die markierte Komponente, wenn sie in einer geringen Menge Flüssigkeit zugeführt wird, wird gewöhnlich so eingeführt, daß sie auf den Teil des Röhrchens beschränkt wird, der vorausgehend mit Antikörpern beschichtet wurde. Es kann jedoch die markierte Komponente auch an einem anderen Teil des Röhrchens oder an irgendeiner anderen Oberfläche vorhanden sein, solange sie für den Kontakt mit der Probenlösung vorhanden ist und zur Verfügung steht, wenn diese in das Röhrchen eingeführt wird.
In den hier beschriebenen Verfahren werden puffernde Proteinbeschichtungslösungen und andere dem Fachmann bekannte Hilfsmittel verwendet, wobei deren Definition in dieser Hinsicht für die Erfindung nicht wesentlich ist. Geeignete puffernde und ähnliche Lösungen werden sich mit dem jeweiligen Antikörper-Antigensystem, wie dies dem Fachmann bekannt ist, ändern. Der Zweck der Verwendung von Protexnbeschichtungen, wie beispielsweise von Serumalbumin, ist die nicht-spezifische Bindung von ungebundenen Komponenten während der Analyse zu begrenzen, wobei jedoch dieser individuelle Gegenstand als solcher alt und dem Fachmann bekannt ist. Darüberhinaus können jedoch Toleranzen für nicht-spezifische Bindungen beim Eichen der Analysen vorgesehen werden. Weiterhin haben einige Komponenten, wie beispielsweise Digoxin, nur sehr geringe Neigung an Kunststofflächen zu adsorbieren
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und es bringt daher in solchen Fällen die Verwendung von Beschichtungen zum Vermeiden nicht-spezifischer Bindungen nur wenig Nutzen. Protein oder andere verwendete maskierende Beschichtungen können im wesentlichen die in Betracht kommenden Oberflächen abdecken, jedoch ist dies nicht wesentlich, da nur die nicht-spezifische Bindung verringert werden soll und es nicht notwendig ist, sie vollkommen zu eliminieren. Darüberhinaus ist, wenn hier in allgemeiner Weise Materialien angesprochen werden, die mit Oberflächen von Untersuchungsrohrchen oder anderen Substraten verbunden sind oder mit diesen in Kontakt stehen, dies so zu verstehen, daß intermediäre Schichten oder Teile derselben oder Partikel zwischen der Oberfläche und den in Betracht kommenden Materialien vorliegen können und es wird eine blanke Oberfläche oder eine solche, die verschiedene Schichten enthält, in gleicher Weise hier als Oberfläche bezeichnet.
Die hier verwendeten Puffer, Waschlösungen usw. werden als biologisch geeignete Träger und dergleichen verwendet, die die Wirksamkeit und die Eigenschaften der in Betracht kommenden Komponenten erhalten. In ähnlicher Weise sind häufig pharmazeutisch verträgliche Träger und mild basische Puffer im allgemeinen für die hier vorgesehenen Zwecke geeignet.
Die markierte Komponente der vorliegenden Erfindung wird im allgemeinen durch das hier beschriebene schnelle Ge-
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frier- und Lyophilisierungsverfahren eingeführt. Es ist
dies ein sehr geeignetes Verfahren, um die markierte Komponente, ohne daß eine Reaktion derselben eintritt, einzuführen. Jedoch können auch andere Verfahren verwendet werden, die sicherstellen, daß die markierte Komponente in fester ungebundener und nicht reagierter Form vorliegt. Theoretisch könnte die Komponente als festes Pulver zugegeben werden, jedoch wäre dies nicht praktisch, weil Probleme hinsichtlich des Messens der sehr geringen Mengen eintreten wurden. Weiterhin kann die markierte Komponente gelöst in einem nieder siedenden Lösungsmittel, das dann schnell verdampft wird, eingeführt werden. In Abhängigkeit von der Aktivität der jeweiligen Antikörper-Antigenreaktion kann die Verdampfung schnell genug erfolgen, um eine wesentliche Reaktion zu vermeiden. Vakuum kann zweckmäßigerweise verwendet werden, um die Verdampfung zu unterstützen. Alkohole können als Lösungsmittel in solchen Verfahren dienen, vorausgesetzt daß die Löslichkeit ausreichend ist und keine Denaturierung erfolgt. Im allgemeinen können nieder siedende Lösungsmittel, die die markierte Komponente ohne Änderung ihrer Eigenschaften lösen, verwendet werden. Jedoch ist es gewöhnlich zweckmäßiger und zufriedenstellender, Schnellgefrier- und Lyophilisierungsverfahren, wie hier beschrieben, zu verwenden.
Es wurde gefunden, daß die hier beschriebenen Analysenvorrichtungen, bei denen sowohl Antikörper als auch Antigen
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in festen Zustand vorhanden -und eines von diesen markiert ist, nicht nur zur Verwendung und Vorausaufbereitung geeignet und fähig, sondern auch erstaunlich bei Lagerung über längere Zeit stabil sind. Es ist möglich, diese Vorrichtungen bis zu drei oder sechs Monate oder mehr in einer inerten Atmosphäre, zum Beispiel unter Stickstoff, und ohne Feuchtigkeit zu lagern. Es wurde weiterhin gefunden, daß niedere Temperaturen für eine solche Stabilität nicht notweidLg sind, da Temperaturen wie 25°C und 37°C zur Lagerung als geeignet befunden wurden. Es ist daher möglich durch Vakuumverpackung, hermetischem Verschluß, usw. die Analysenvorrichtungen der vorliegenden Erfindung in ungekühlten Packungen zu versenden und ihre Wirksamkeit trotz möglicherweise langer Beförderungsverzögerungen, usw. beizubehalten. Als Vorsichtsmaßnahme kann es wünschenswert sein, die Analysenvorrichtungen gekühlt zu halten, möglicherweise nahe dem Gefrierpunkt oder etwa 40C, jedoch ist die Stabilität bei gewöhnlichen Temperaturen noch vorteilhaft, da die Analysenvorrichtungen möglicherweise solchen Temperaturen vor der Verwendung ausgesetzt sein können oder wegen des wirtschaftlichen Vorteils, daß sie ohne Kühlung zum Versand gebracht werden können. Die Untersuchungsröhrchen können einzeln unter Vakuum oder Stickstoff verschlossen werden, wozu man Abdicht- oder Verschlußvorrichtungen verwendet, die üblicherweise verwendet werden, um den Inhalt von Untersuchungsröhrchen oder Ampullen gegenüber der Atmosphäre zu schützen. Die einzelnen Röhrchen können dann
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in geeigneter Weise in einem geschlossenen Behälter verpackt werden, der zusätzlich zu den Analysenrohrchen Antigen- oder Antikörper-Standardlösungen und Anweisungen zur Verwendung enthalten kann. Gummi oder ähnliche Verschlußmittel können beispielsweise zum hermetischen Abschließen der Röhrchen verwendet werden. Ein zweckmäßiges Verschlußmittel ist ein geschlitzter Gummipfropfen, der so in das Röhrchen eingefügt werden kann, daß der Schlitz oder die Schlitze Zugang zum Inneren ermöglichen. Ein Satz von Röhrchen, die solche Pfropfen aufweisen, kann in Behältern unter Stickstoff angeordnet werden und es verschließt dann eine Druckleiste die Pfropfen vollständig unter Bildung eines hermetischen Abschlußes und der Behälter kann weiterhin unter Stickstoff verschlossen werden.
Der größte Teil der Beschreibung betrifft in besonderer Weise ein System, bei dem der Antikörper an eine unlösliche Oberfläche gebunden, das Antigen markiert ist und die Antigenmenge in einer unbekannten Probe bestimmt wird. Es beinhaltet jedoch die Erfindung ebenso Vorrichtungen und Verfahren für andere Bestimmungen, beispielsweise Vorrichtungen, bei denen Antigen an eine Oberfläche gebunden und markierte Antikörper in fester Form aber ungebunden vorliegen, sowie die Verwendung derartiger Vorrichtungen zur Analyse von Antikörpern in einer Probe. Beispielsweise kann Human-Wachstumshormon (HGH) als Schicht auf ein Polystyrolröhrchen aus einer Lösung nach den hier beschriebenen Ver-
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fahren, zur Beschichtung mit Antikörpern, aufgetragen werden und Antikörper, die man aus HGH-Antiserum erhalten hat, können radiojodiert und in das Untersuchungsröhrchen nach den Schnellgefrier- und Lyophilisierungsverfahren, wie sie hier beschrieben wurden, eingeführt werden und es wird dann das Untersuchungsröhrchen HGH gebunden an die Oberfläche des Röhrchens und die festen markierten Antikörper ungebunden enthalten.
Die Analysenvorrichtung der vorliegenden Erfindung wird im allgemeinen verwendet, um die Komponente der Antigen-Antikörperreaktion, die markiert ist, zu bestimmen, sie kann aber auch zum Messen der anderen Komponente verwendet v/erden. Beispielsweise kann bei gebundenen Antikörpern und markiertem Antigen eine Probe unbekannter Antikörper eingeführt werden und das markierte Antigen wird sich dann als solches über den gebundenen Antikörper und den freien Antikörper verteilen und es können dann die festen und^flüssigen Phasen getrennt und die Markierung von wenigstens einer derselben gemessen werden. Bei diesem Verfahren werden sich die Konzentrationen insoweit unterscheiden, als die Menge an markiertem Antigen nicht ausreichend sein sollte, um mit den gesamten Antikörpern zu reagieren. Wenn die Analysenvorrichtung so hergestellt wurde, daß die Antikörper ausreichend sind, um 50$ des markierten Antigens zu binden, können die Antikörperproben bei einer solchen Verdünnung verwendet werden, daß ihre Antikörper im Überschuß gegen-
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über den gebundenen Antikörpern der Analysenvorrichtung vorliegen und das markierte Antigen wird dann nicht ausreichend sein, mit allen Antikörpern zu reagieren, was man zu erreichen wünscht.
In ähnlicher Weise kann, wenn das Antigen gebunden und markierter Antikörper vorhanden ist, die Vorrichtung dazu verwendet werden, Antigen in einer Probe zu bestimmen unter Verteilung des markierten Antikörpers selbst zwischen gebundenem Antigen und freiem Antigen, wobei die oben beschriebenen Trenn- U.Meßverfahren verwendet werden. Der markierte Antikörper wird in einer Menge verwendet, die nicht ausreichend ist, um mit dem gesamten Antigen, das in gebundener und freier Form vorliegt, zu reagieren.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet weiterhin Verfahren, bei denen eine gebundene Komponente mit der gleichen markierten aber ungebundenen Komponente kombiniert wird und das verwendet wird, die Oppositionskomponente in einer Probe zu messen. Beispielsweise kann Antikörper auf ein Untersuchungsröhrchen als Schicht aufgetragen und der gleiche radioaktiv markierte Antikörper kann dann durch Schnellgefrier- und Lyophilisierungsverfahren, wie hier beschrieben, zugegeben werden. Eine Serumprobe, die das entsprechende Antigen enthält, kann dann eingeführt werden und es wird dann das Antigen sowohl mit dem gebundenen Antikörper als auch mit dem markierten Antikörper reagieren,
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wodurch ein Teil des markierten Antikörpers durch unmittelbare Bindung desselben an die Oberfläche des Untersuchungsröhrchens immobilisiert und dadurch die übliche Abtrennung der festen und flüssigen Phasen und Bestimmung der markierten Antikörper in einer oder beiden ermöglicht wird. Diese Verfahrensweise kann dann besonders brauchbar sein, wenn ein Antigen nicht einfach isoliert und radioaktiv markiert werden kann und es findet Verwendung bei Analysen solcher Antigene, wie dem Hepatitisantigen, usw. In ähnlicher Weise kann dieses Verfahren mit gebundenem Antigen und freiem markiertem Antigen verwendet werden, um die Antigenmenge in einer Probe zu messen. Bei solchen Verfahren sollten sowohl die gebundenen als auch die markierten Komponenten der Analysenvorrichtung gegenüber den Mengen im Überschuß sein, die zur Umsetzung mit der Komponente in der Probe erforderlich sind.
Für die Aufbereitungen und Analysen der vorliegenden Erfindung wird es zweckmäßig sein, wäßrige Medien, die die angegebenen Komponenten enthalten, zu verwenden und zwar aus Loslichkeitserwagungen und der Tatsache, daß biologische Probenflüssigkeiten und dergleichen im allgemeinen wäßrig sind. Es können jedoch auch andere Flüssigkeiten verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Komponenten darin löslich sind und daß sie nicht mit den Komponenten reagieren oder sie beeinflussen.
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In der vorliegenden Erfindung ist eine der Komponenten der Antigen-Antikörperreaktion an die Oberfläche eines unlöslichen Feststoffs gebunden, der gewöhnlich ein wasserunlöslicher Feststoff ist, sofern wäßrige Medien im allgemeinen verwendet werden. Die Bindung kann chemischer, physiialisch-chemischer oder physikalischer Art sein und sie kann mittels covalenter chemischer Bindungen oder durch Adsorption erfolgen und es kann jedes unlösliche feste Material, das zu einer solchen Bindung geeignet ist, verwendet werden, wobei beispielsweise solche Oberflächen verwendet werden wie frisch ausgefällte Metalle wie Chrom und Tantal, Glas und polymere Kunststoffe, einschließlich Kohlenwasserstoffpolymerisaten und Polyolefinen wie Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen und Polymerisaten wie Nitrocellulose, Mischpolymerisaten von Acrylnitril mit Styrol wie Poly-(styrol-co-Acrylnitril), Poly-tetrafluoräthylen, Polytetrafluoräthylen-Styrol, Polytetrafluoräthylen-Isothiocyanatstyrol, usw. Es wurde festgestellt, daß
einfache polymere Kunststoffröhrchen, wie Polystyrolröhrchen, eine ausreichende Bindung ermöglichen und andere · Kunststoffe in ähnlicher Weise Antikörper adsorbieren, sodaß es im allgemeinen nicht erforderlich ist, Materialien mit reaktionsfähigen Gruppen zu verwenden, wie -NCS-Gruppen an Isothiocyanat-Styrol-gepfropftem Polytetrafluorathylen, wobei jedoch derartige Materialien mit reaktionsfähigen Gruppen, wenn gewünscht, verwendet werden können. Metalle liefern schwache Ergebnisse, wenn die Oberfläche mit einem
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Oxidfilm abgedeckt ist. Glasmaterialien können eine Spezialbehandlung oder Selektion, wie bei Verwendung von Quarzglas, oder die Verwendung von Kupplungsmittel oder dergleichen erforderlich machen, um eine geeignete Bindung zu erzielen.
Die als Einheit ausgebildete Radioimmunanalysen-Ausrüstung in fester Phase der vorliegenden Erfindung kann so modifiziert werden, daß ein vollständig automatisches Modell hergestellt wird. Beispielsweise kann anstelle der einzelnen Röhrchen ein kontinuierliches Kunststoffband zur Aufnahme der Analysenreagentien in eingepreßten Flecken auf dem Band verwendet werden, wobei die Proben und Standardlösungen automatisch auf den Gurt aufgetragen und der Gurt durch eine Bebrütungs-, Wasch- und Zählvorrichtung mit automatischem Ausdrucken der Ergebnisse geleitet wird.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Herstellung und des VerwendungsVerfahrens der als Einheit ausgebildeten Radioimmunanalysen-Ausrüstung in fester Phase der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1
Einheits-Radioimmunanalysen-Ausrüstung in fester Phase für Digoxin
Verwendet wurde Digoxinantiserum von dem Collaborative Research, Waltham Massachusetts; kodiertes Digoxinderivat
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von Schwartz-Mann, Qrangeburg, New Jersey; und Polystyrol-Versuchsröhrchen (#2052) von Falcon Plastics, Los Angeles, California.
Ein kleiner Teil der Innenseite der Polystyrolrohrchen wurde durch Einführung von 200 Mikroliter Digoxinantiserum (Verdünnung 1:5000 mit einer Lösung von 0,05 Molar iSiatriumbicarbonat, p„ 9,6) am Boden beschichtet und 1 bis 3 Stunden bei einer Temperatur zwischen etwa 200C und etwa JO0C bebrütet. Nach Absaugen der Flüssigkeit werden die Röhrchen nacheinander mit Bicarbonatpuffer, einem 0,05 Molar Natriumphosphat, 0,02 Molar Dinatriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure (Na2EDTA)-Lösung, die Λ% Rinderserumalbumin zur Verringerung der nicht spezifischen Bindung des Antigens enthält, und schließlich mit 0,05 Molar Natriumphosphatpuffer allein gewaschen. Das kodierte Digoxinderivat wurde 1:5 in Phosphatpuffer verdünnt und 100 Mikroliter (7200 Impulse pro Minute (c/Min.)) wurden den Röhren zugegeben, wobei sie vorausgehend auf etwa O0C in einem Eisbad gekühlt wurden. Der Inhalt wurde sofort (innerhalb 5 bis 15 Sekunden) in festem Kohlendioxid gefroren. Die Röhrchen wurden 8 bis 16 Stunden lyophilisiert und schließlich ohne Luft und Wasser unter Phosphorpentoxid und Stickstoff in kleinen Trocknern gelagert,ein Satz bei 4-0C und ein weiterer bei 25°C, wobei keiner dieser Sätze einen bedeutenden Verlust an Brauchbarkeit nach acht Wochen aufwies, wie dies durch den Verlauf der Standardkurve und Reproduzier-
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barkeit einer Vergleichsprobe während dieser Dauer festgestellt wurde.
Zum Zeitpunkt der Verwendung wurden, soweit erforderlich, die Röhrchen auf Raumtemperatur gebracht. Standard-Digoxinproben (nicht markiert) und Standard-Referenzproben, die 3,3 Nanogramm Digoxin pro ml enthielten, wurden den Röhrchen zugegeben. Die Röhrchen wurden dann bei etwa 25 C_ etwa eine Stunde bebrütet, mit Phosphatpuffer gewaschen und zuletzt in einem analytischen gamma-Spektrometer hinsichtlich ihrer Impulse gezählt.
Die begleitende Zeichnung Figur 1 zeigt eine Standardkurve, die unmittelbar nach dem Trocknen der Röhren auf der Lyophilisiervorrichtung erhalten wurde. Die Anzahl der Impulse pro Zeit der Standardröhren wurde bestimmt und in Prozent gebundenes (#B) Digoxin-J , bezogen auf die Gesamtmenge
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Digoxin-J , die den Röhren zugegeben wurde, umgewandelt. Die erhaltenen Prozentsätze wurden an der Ordinate gegenüber dem Logarithmus der Konzentration von Digoxin in Standardlösungen an der Abszisse zur Bildung der Kurve aufgetragen. Aus dieser Standardkurve kann die Konzentration von Digoxin in einer unbekannten Probe leicht bestimmt werden.
Eine 3,3 ng/ml Probe Digoxin wurde wöchentlich acht Wochen analysiert. Der Durchschnitt der bestimmten Werte war 3,1 ng/ml bei einer Standardabweichung von 0,3.
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Beispiel 2 Einheits-Radioimmunanalysen-Ausrüstung in fester Phase für
cyclisches Adenosinmonophosphat (c-AMP) Sowohl das c-AMP-Antiserum als auch kodiertes c-AMP wurden von der Biotek Co., St. Louis, Missouri bezogen.
Es wurden die gleichen Verfahren und Bedingungen wie im Beispiel 1 verwendet, ausgenommen daß als Analysenpuffer 0,02 Molar Natriumacetat, p„ 6,4 verwendet wurde. Das System wurde drei Monate ohne wesentlichen Verlust an Brauchbarkeit gelagert. Eine 1/100 verdünnte Urinprobe wurde wöchentlich während 10 Wochen analysiert. Das Mittel war 7,26 ng/ml mit einem Standardfehler von 0,4$.
Die in Figur 2 gezeigte Standardkurve wurde in der Weise wie in Figur 1 angegeben erhalten, außer daß die Konzentration von c-AMP an der Abszisse in Picomol pro ml angegeben ist.
Beispiel 3
Einheits-Radioimmunanalysen-Ausrüstunp; in fester Phase für Human-Wuchshormon (HGH)
Das HGH-Antiserum wurde von Biotek Co., St*. Louis, Missouri erhalten. Die Jodierung von HGH wurde nach Standardverfahren bewirkt. Siehe beispielsweise W.M. Hunter und F.C. Greenwood, Nature, 194, 495 (1962).
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Es wurden die Verfahren und Bedingungen von Beispiel 1 wiederholt, die Ausrüstung für HGH hergestellt und fünf Monate ohne bedeutenden Verlust an Brauchbarkeit gelagert. Figur 3 zeigt eine Standardkurve, die in Analogie mit Figur 1 erhalten wurde. Eine einzelne Humanserumprobe wurde wöchentlich 8 Wochen lang analysiert. Der Durchschnittswert war 2,24- mit einem Standardfehler von 0,14.
Beispiel 4-
Radioimmunanalyse von Humanwachstumshormon auf einer Quarzoberfläche
Geschmolzene Quarzstäbchen (1 χ 20 mm) wurden in heißer 50^iger Salpetersäure zwei Stunden gereinigt. Die überschüssige Säure wurde mit entionisiertem Wasser abgewaschen und an der Luft getrocknet. Jedes Stäbchen wurde in eine 6 χ 50 mm Glasreagenzröhre gegeben, wozu man verdünntes (1/500 mit 0,05 M Natriumbicarbonat, p^ 9»6) Antihuman-Wachstumshormonserum zur Abdeckung der Stäbchen gab. Die Inkubation wurde zwei Stunden bei 25°C ermöglicht. Das Antiserum wurde dann abgesaugt und die Stäbchen gründlich mit Bicarbonatpuffer gewaschen und mit Rinderserumalbumin wie im Beispiel 1 beschichtet. Die witere Analyse wurde wie im Beispiel 3 unter Verwendung von Polystyrolröhrchen durchgeführt. Das Quarzstäbchen wurde in das Röhrchen zusammen mit kodiertem HGH gegeben und der HGH-Gehalt in den Proben und Standardlösungen gemessen. Man erhielt eine geeignete Standardkurve aus de2?graphischen Darstellung Pro-
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ζent gebundenes markiertes Wuchshormon gegenüber dem Logarithmus der Konzentration der Wuchshormon-Standardlösungen. Während aus Zweckmäßigkeitsgründen in diesem Falle ein Quarzstab verwendet wurde, erläutert das Verfahren, daß Quarzstäbe ebenso zum Binden der Antikörper verwendet werden können und das markierte Antigen dann in das Röhrchen in fester Form durch die ßeschichtungs- und Lyophilisierungs· verfahren, wie sie hier beschrieben wurden, eingebracht werden können und dann die Röhrchen gelagert und danach für Analysen, wie hier beschrieben, verwendet werden können.
Beispiel 5
Radioimmunanalyse von Humanwachstumshormon unter Verwendung von Sandwich-Verfahren
Antihuinanwuchshormonserum (verdünnt 1/500 mit O,O5M Natriumbicarbonat, p„ 9,6) wurde in den Boden eines Polystyrolkunst st of fr öhrchens 12 χ 75 ™ pipettiert. Den Antikörper ließ man sich an der Oberfläche des Röhrchens etwa zwei Stunden bei 24° adsorbieren. Radiojodiertes (J ) gereinigtes Anti-Humanwuchshormon (100/ul, 10 800 c/Min) wurde in den Boden des Röhrchens bei 0° pipettiert, sofort bei -70° gefroren und lyophilisiert. Die Röhrchen waren dann zur Analysen von Humanwachstumshormon in Humanserum geeignet.
Zu diesen Röhrchen gab man dann Humanwachstumshormon-Standardlösungen, die Humanserum mit 100, 10 und 1 ng ent-
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hielten. Die Antigen-Antikörperreaktion ließ man 18 Stunden bei 24° ablaufen. Die Röhrchen wurden dreimal mit Wasser gewaschen und in einem gamma-Spektrometer gezählt. Es wurde eine geeignete Standardkurve gebildet. Die Hormonkonzentration ist eine logarithmische Funktion des in den Röhrchen gebundenen radiokodierten Hormons.
Ein Untersuchungsröhrchen, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, ist in Figur 4 abgebildet. Die Erläuterung zeigt das Röhrchen, wie es vorliegt, bevor die Probe zugegeben wird, wobei es den Antikörper und das markierte Antigen in festem Zustand enthält. Das Röhrchen 1 hat Wandungen 2 und weist einen Pfropf 3 und eine Reaktionszone 4 auf. Wenn gewünscht, kann der Pfropfen, wie hier beschrieben, geschlitzt sein (nicht erläutert). Die Reaktionszone wird im vergrößerten Maßstab, Figur 5» erläutert, wobei die Kreise 5 Antikörper darstellen, die an die Wandung 2 gebunden sind, und die festen Punkte 6 kennzeichnen markierte Antigene, die im allgemeinen in der Reaktionszone verteilt aber nicht mit den Wandungen des Röhrchens verbunden sind. Es kann aber auch das Antigen mit der Oberfläche verbunden sein und markiertes Antigen in ungebundener Form in dem Röhrchen verteilt sein. In einer weiteren Kombination kann gebundenes Antigen vorhanden sein mit markierten ungebundenen Antikörpern, oder gebundenes Antigen mit markiertem ungebundenen Antigen. Es ist ebenso möglich, daß die vorhandenen Komponenten an verschiedenen Stellen in dem
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Röhrchen vorhanden sind, daß beispielsweise die Antikörper gebunden an den Seitenwanden des Röhrchens und das Markierte Antigen an dem Boden des Röhrchens vorliegen, aber es besteht keine Notwendigkeit für getrennte Lagerungen und das Röhrchen kann leicht wie erläutert hergestellt werden. Das Röhrchen enthält bei Lagerung trockenen Stickstoff oder ein anderes inertes trockenes Gas oder befindet sich unter Vakuum.
Während die Erfindung im Hinblick auf verschiedene spezifische Beispiele und Ausführungsformen beschrieben wurde, ist darauf hinzuweisen, daß sie dadurch nicht eingeschränkt wird und daß sie im Rahmen der folgenden Ansprüche in verschiedener Weise durchgeführt werden kann.
-Patentansprüche-
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Claims (1)

  1. Patentansprüche :
    ' 1,JM i t t e 1 zur Verwendung bei der Immunanalyse einer Komponente der Antigen-Antikörperreaktion, gekennzeichnet durch eine Oberfläche, wobei an wenigstens einem Teil derselben eine der Komponenten in fester Form gebunden und eine der Komponenten markiert und in fester Form?, aber ungebunden, vorliegt.
    2. M i t t e 1 gemäß Anspruch 1, dadurch g e kennzeich ne t , daß ein Antikörper an die Oberfläche gebunden und Antigen markiert und in ungebundener Form vorliegt.
    3.Mit'tel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Oberfläche einen Antikörper in fester Form, gebunden an wenigstens einem Teil derselben, und radioaktiv markiertes Antigen in fester Form, dispergiert über einen Teil derselben, Jedoch damit nicht gebunden, aufweist.
    4-. Mittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche ein Kunststoff analysenröhrchen umfaßt, das eine relativ undurchdringliche glatte Oberfläche hat und Antikörper in festem Zustand, gebunden an einem Teil seiner inneren Oberfläche aufweist und radioaktiv markiertes Antigen in festem Zu-
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    stand, aber rieht gebunden an die Oberfläche, enthält.
    5. M i t t e 1. gemäß Anspruch 4·, dadurch gekennzeichnet , daß die Antikörper in einer Menge vorhanden sind, die ausreichend ist, 40 bis 60^ markiertes Antigen zu binden.
    6. M i t t e 1 gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Röhrchen eine inerte, Feuchtigkeits-freie Atmosphäre enthält und hermetisch verschlossen ist.
    7.Mi t t e 1 gemäß Anspruch 2, dadurch -gekennzeichnet, daß die Antikörper an eine polymere Kunststoffoberfläche adsorbiert sind«
    8.Mittel gemäß Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet , daß die Oberfläche eine relativ undurchdringliche glatte Polyolefinoberflache ist.
    9· M i t t e 1 gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß die Oberfläche eine Polystyroloberfläche ist.
    10. M i t ΐ e. 1 gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Antigen-Antikörperreaktion die von Digoxin und dessen Antikörper ist.
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    11. M i t t e 1 gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Antigen-Antikörperreaktion Human-Wachstumshormon und sein Antikörper ist.
    12. M i t t e I1 gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Antigen-Antikörperreaktion cyclisches Adenosinmonophosphat und sein Antikörper ist.
    13. Mi t t el gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Beschichten und Binden einer der Komponenten einer Antigen-Antikörperreaktion an wenigstens einen Teil einer Oberfläche und Inkontaktbringen der Oberfläche mit der anderen Komponente in markierter Form derart, daß eine Dispersion der Komponente in fester Form über wenigstens einem Teil der Oberfläche, aber nicht gebunden damit, noch mit der anderen Komponente, vorliegt.
    . Mittel gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Beschichten und Binden einer der Komponenten an wenigstens einem Teil einer Oberfläche, die geeignet ist, die Komponente zu binden und durch Inkontaktbringen der Oberfläche mit einer der Komponenten in markierter Form in einer V/eise, daß diese über die Oberfläche dispergiert, aber nicht damit gebunden, vorliegt, danach Inkontaktbringen der Oberfläche mit einer Probenlösung, die eine der Komponenten enthält und dadurch Herstellen eines
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    Zweiphasensystems und Ermöglichen der Reaktion zwischen den Komponenten, wobei ein Teil der markierten Komponente indirekt mit der Oberfläche gebunden wird, Trennen der beiden Phasen und Messen des markierten Gehalts von einer der Phasen, der eine Funktion der Konzentration der Komponente in der Probenlösung ist.
    15· Mittel, gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß die markierte Komponente in Lösung nach Kontakt mit der Oberfläche einem Schnellgefrierverfahren unter nachfolgender Lyophilisation unterworfen wird, wodurch die markierte Komponente als fester Rückstand ander Oberfläche verbleibt.
    16. Mittel, gemäß Anspruch 14·, dadurch gekennzeichnet , daß ein Teil der Innenfläche eines Untersuchungsröhrchens aus wasserunlöslichen undurchdringlichem polymerem Material mit Antikörpern aus wäßriger Lösung zur Bindung der Antikörper an die Oberfläche beschichtet ist unter nachfolgendem Absaugen und Waschen, und daß eine wäßrige Lösung von markiertem Antigen dann eingeführt und mit der Oberfläche bei niederen Temperaturen, nicht höher als etwa der Gefriertemperatur, in Kontakt kommt unter nachfolgendem Lyophilisieren, um Wasser zu entfernen und Lagerung unter inerter Atmosphäre vor Verwendung.
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    17· Mittel gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , daß das Untersuchungsröhrchen mit Protein vor der Einführung des markierten Antigens
    beschichtet ist.
    18. Mittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die nicht gebundene Komponente mit .einem radioaktiven Atom, einem Sizym oder einer fluoreszierenden Gruppe markiert ist.
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DE2548427A 1974-10-30 1975-10-29 Einrichtung zur Verwendung bei der Festphasen-Immunanalyse einer Komponente einer Antigen-Antikörper-Reaktion und Verfahren zu ihrer Herstellung Expired DE2548427C2 (de)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
US05/519,317 US4017597A (en) 1974-10-30 1974-10-30 Unitized solid phase immunoassay kit and method

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DE2548427A1 true DE2548427A1 (de) 1976-05-06
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DE2548427A Expired DE2548427C2 (de) 1974-10-30 1975-10-29 Einrichtung zur Verwendung bei der Festphasen-Immunanalyse einer Komponente einer Antigen-Antikörper-Reaktion und Verfahren zu ihrer Herstellung

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